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CN106456588A - 使用辣椒素合酶用于辣椒素类物质微生物生产的方法 - Google Patents

使用辣椒素合酶用于辣椒素类物质微生物生产的方法 Download PDF

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CN106456588A CN201580014311.6A CN201580014311A CN106456588A CN 106456588 A CN106456588 A CN 106456588A CN 201580014311 A CN201580014311 A CN 201580014311A CN 106456588 A CN106456588 A CN 106456588A
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Abstract

制造辣椒素类物质的生物合成方法，所述方法包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物，在培养基中培养细胞系统，以及收集所述辣椒素类物质。所述生物合成方法进一步包括在所述细胞系统中表达ACS1的第二基因产物，以及表达pAMT的第三基因产物。

Description

使用辣椒素合酶用于辣椒素类物质微生物生产的方法
相关申请的交叉引用
本公开内容是名称为使用辣椒素合酶用于辣椒素类物质微生物生产的方法的PCT专利申请。本申请要求于2014年1月17日提交的美国临时专利申请第61/928,803号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用全文并入本文。
技术领域
本公开内容通常涉及尤其是使用酰基辅酶A合成酶(ACS)、转氨酶(PAMT)和辣椒素合酶(CS)的用于辣椒素和相关辣椒素类物质的生物合成生产的方法。
背景技术
红辣椒是茄科(Solanaceae)成员辣椒(Capsicum)属植物的果实。红辣椒由于其辛辣的本质，已被广泛用作辛辣菜肴中的食品添加剂。辣椒素类物质是对红辣椒的辛辣感觉负有主要责任的物质，并且如前文所述，它们的产生限于辣椒属。辣椒素(CP，8-甲基-N-香草基-反式-6-壬烯酰胺)和二氢辣椒素(DHCP，8-甲基-N-香草基壬酰胺)是两个主要的辣椒素类物质，其对红辣椒中大约多达90％的辛辣性负责(Garcés-Claver等人，2007)。
除主要作为用于辛辣感觉和辛辣调味品的食品添加剂外，辣椒素类物质具有许多药物和医疗用途。已发现它们发挥一系列生理学和药理学作用，包括镇痛、抗癌、抗炎、抗氧化和抗肥胖活性，并且被用作软膏、贴剂、油和乳膏的主要成分，旨在缓解由若干疾病例如血管舒缩性鼻炎、骨关节炎和类风湿关节炎引起的疼痛(Aza-González等人，2011)。目前辣椒素类物质也被用作出售的自我保护喷雾剂(即辣椒喷雾)中的主要活性成分(Reilly等人，2001)。最近有报道辣椒素类物质降低仓鼠的血浆胆固醇并改善内皮功能(Liang等人，2013)。
辣椒素被认为由CS合成，CS是将8-甲基壬烯酰基部分从8-甲基壬烯酰基辅酶A转移至香草胺以形成酰胺共轭物(conjugate)的酰基转移酶(图1)。香草胺由苯丙素类途径形成，其中支链脂肪酸来源于支链氨基酸，例如缬氨酸(Curry等人，1999；Mazourek等人，2009)。转氨酶(pAMT)催化由香草醛形成香草胺。申请人已克隆了来源于鬼红椒(ghostchili pepper)的pAMT。另一个底物，8-甲基壬烯酰基辅酶A，通过酰基辅酶A合成酶(ACS)的活性来源于8-甲基-反式-6-壬烯酸。
在本公开内容中，申请人已使用CS的基因产物通过微生物合成生产辣椒素类物质。申请人是最先实现辣椒素类物质，尤其是辣椒素的微生物生产的。此外，本发明解决了工业中通过微生物生物合成生产辣椒素的长期感受到的但未满足的需要。
发明内容
本公开内容是制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括在混合物中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物，向所述混合物中提供第一底物，以及收集辣椒素类物质。
本公开内容另一方面是制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物，在培养基中培养所述细胞系统，以及收集辣椒素类物质。
本公开内容另一方面是制造多种辣椒素类物质的生物转化方法，包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的基因产物，提供8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A，提供香草胺，在培养基中培养所述细胞系统，以及收集多种辣椒素类物质，其中，按数量比或摩尔比，所述多种辣椒素类物质多于约90％的辣椒素和少于约5％的二氢辣椒素。
本公开内容另一方面是制造多种辣椒素类物质的生物转化方法，包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的基因产物，提供8-甲基-6-壬酰基辅酶A，提供香草胺，在培养基中培养所述细胞系统，以及收集多种辣椒素类物质，其中，所述多种辣椒素类物质按比例多于约90％的二氢辣椒素和少于约5％的辣椒素。
本公开内容另一方面是制造辣椒素类物质的生物合成方法，包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的基因产物，提供脂肪酸辅酶A(脂肪酸的活性形式)，提供香草胺，使所述细胞系统在培养基中生长，以及收集辣椒素类物质。
附图说明
为了更好地理解本发明的内容，可参考附图，其中：
图1显示了辣椒素生物合成途径。改绘自Stewart等人(2007)。
图2显示了在加入底物后从过表达ACS1和CS/AT3/Pun1基因的大肠杆菌(E.Coli)BL21细胞中提取的产物的HPLC图谱。1：辣椒素(CP)及2：二氢辣椒素(DHCP)。(A)来自Sigma的CP和DHCP标准物的混合物；(B)未加入底物的对照；(C)加入香草胺(VN)和8-甲基-6-壬烯酸(6E)；(D)加入VN和8-甲基壬酸(8M)；(E)加入VN、6E和8M。
图3显示了从Sigma获得的辣椒素和二氢辣椒素标准物(商品目录号：360376Sigma，CP和DHCP的混合物)的GC/MS图谱。
图4显示了来自于过表达ACS1和CS/AT3/Pun1的BL21培养基的产物的GC/MS图谱，其中所述BL21培养基加入了不同底物(例如VN、6E和8M)。使用耦合有GCMS-QP2010S检测器的Shimadzu GC-2010系统进行GC/MS分析。使用柱Rtx-5MS(厚0.25u；长30m；直径0.25mm)进行分离。注射温度：265℃；注射模式：分流；箱温：140℃。温度梯度：0-1min，140℃；1-11.25min，140℃-263℃，速率12；11.25-21.25min，263℃。
图5显示了与辣椒素(CP)和二氢辣椒素(DHCP)对照图谱相比，加入底物(6E和8M)的产品的MS。
图6显示了在BL21(DE3)细胞中His-SUMO-Pun1表达的SDS-PAGE分析。0，20：在IPTG诱导后之时的总蛋白；C，可溶粗蛋白提取物；E1至E3，从Ni-NTA柱洗脱的组分。Pun1的分子量为约49Kd，His-SUMO标记物的分子量为约12Kd。
图7显示了当使用VN和6E作为底物时，ACS1和Pun1耦合反应产物的HPLC图谱。#1，推定CP。
图8显示了经GC/MC分析的由ACS1-Pun1耦合酶系统体外形成CP(图7的峰#1)。
图9显示了当使用辛酰基辅酶A或癸酰基辅酶A作为底物时，Pun1体外活性的HPLC分析。#1，推定的N-香草基辛酰胺；#2，推定的N-香草基癸酰胺。
图10显示了当使用辛酰基辅酶A或癸酰基辅酶A作为底物时，Pun1体外活性的GC/MS分析。#1，推定的N-香草基辛酰胺；#2，推定的N-香草基癸酰胺。
图11显示了图10的峰#1和#2的MS图谱。#1，N-香草基辛酰胺；#2，N-香草基癸酰胺。
图12显示了培养基对生产辣椒素(CP)的影响，所述辣椒素来自于过表达pCDFDuet-ACS1和pETite N-His SUMO-ghost Pun1的、加入50mg/L的香草胺(VN)和50mg/L的8-甲基-6-壬烯酸(6E)的BL21(DE3)培养物。LB，LB培养基；TB，TB培养基；M9，M9基本培养基。实验以一式三份进行，使用平均值绘制图表。
虽然本公开内容容易有多种修改和可替代形式，但是其具体的实施方案通过示例方式在附图中示出并且将在本文中详细描述。但是，应当理解，附图和本文所列的详细描述不旨在将公开内容限制于所公开的特定实施方案，相反，其意图是覆盖属于由所附权利要求限定的本公开内容的精神与范围内的所有修改、等同方案和可替代方案。
具体实施方式
定义
细胞系统
细胞系统是提供异位蛋白表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞。它也包括使用细胞成分(例如核糖体)的蛋白质体外表达。
培养细胞系统
培养包括提供能使细胞增殖和分化的培养基。它也包括提供原料，以使细胞或细胞成分能翻译和制造重组蛋白。
蛋白质表达
蛋白质生成可在基因表达后发生。其由DNA已被转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后mRNA被翻译为多肽链，多肽链最终折叠为蛋白。DNA通过转染存在于细胞中，所述转染是有意将核酸引入细胞的过程。所述术语常用于真核细胞的非病毒方法中。它也可指其他的方法和细胞类型，虽然其他术语是优选的：“转化”更常被用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中非病毒DNA的转移。转导常被用于描述病毒介导的DNA转移。对于本申请，转化、转导和病毒感染包括在转染的定义下。此外，蛋白质表达包括体外翻译，其中使用细胞外的细胞器表达蛋白质。
生物转化
术语生物转化(bioconversion)，又名生物转化(biotransformation)，指使用活的有机体(常为微生物，例如细菌和酵母)进行更昂贵或非生物可行的化学反应。这些有机体将物质转化为化学修饰型。
混合物
混合物指两种或更多种物质的物理组合，其中所述物质的特性被保留，并以溶液、悬浮液或胶体的形式混合。
基因产物
基因产物是生物化学材料，来源于基因的表达，为RNA或蛋白质。
本发明公开内容是制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括在混合物中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物，向混合物提供第一底物，以及收集辣椒素类物质。CS/AT3/Pun1的第一基因产物基于DNA序列SEQ ID No.1。在进一步的公开内容中，CS/AT3/Pun1的第一基因产物基于与SEQ ID No.1具有至少约95％同一性的DNA序列。在另一个实施方案中，CS/AT3/Pun1的第一基因产物来源于鬼红椒。此外，所述第一底物是选自由以下组成的组的有活性的脂肪酸：8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A、8-甲基壬酰基辅酶A、辛酰基辅酶A、癸酰基辅酶A及其组合。
另一公开内容包括向混合物提供第一底物，进一步包括：在混合物中表达ACS(尤其是ACS1)的第二基因产物，以及提供第二底物。在一个实施方案中，ACS1的第二基因产物来源于鬼红椒。所述第二底物是选自由以下组成的组的脂肪酸：8-甲基-6-壬烯酸、8-甲基壬酸、辛酸、癸酸及其组合。此外，在另一公开内容中，表达任意基因通过体外翻译发生。在另一公开内容中，表达任意基因进一步通过在细胞系统中表达基因发生。所述细胞系统基于选自由细菌、酵母及其组合组成的组的微生物。将任意基因的表达产物纯化为重组蛋白。在进一步的公开内容中，提供第三底物香草胺。
另一公开内容包括在混合物中表达pAMT的第三基因产物，以及提供第四底物香草醛。在一个实施方案中，pAMT的第三基因产物来源于鬼红椒。在公开内容中，通过体外翻译表达任意基因。在另一公开内容中，在细胞系统中表达任意基因。所述细胞系统基于选自由细菌、酵母及其组合组成的组的微生物。可将任意基因的表达产物纯化为重组蛋白。
另一公开内容包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物，在培养基中培养所述细胞系统，以及收集辣椒素类物质。在一个公开内容中，所述辣椒素类物质是辣椒素。另一个实施方案进一步包括提供8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A和提供香草胺。提供8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A包括在细胞系统中表达ACS1的第二基因产物，以及提供底物8-甲基-6-壬烯酸。提供香草胺包括在细胞系统中表达pAMT的第三基因产物，以及提供底物香草醛。在另一公开内容中，所述辣椒素类物质是辣椒素。可替代选择地或额外地，所述辣椒素类物质是二氢辣椒素。在生产二氢辣椒素的情况下，所述公开内容进一步包括提供8-甲基-壬酰基辅酶A，以及提供香草胺。对于提供8-甲基-壬酰基辅酶A，它包括在细胞系统中表达ACS(尤其是ACS1)的第二基因产物，以及提供8-甲基壬酸。所述公开内容进一步包括在细胞系统中表达pAMT的第三基因产物，以及提供底物香草醛。所述第一基因产物从克隆自鬼红椒的CS/AT3/Pun1表达。在一种实施方案中，所述基因产物从CS/AT3/Pun1表达，所述CS/AT3/Pun1与克隆自鬼红椒的CS/AT3/Pun1共享至少约95％的序列同一性。所述细胞系统选自由细菌、酵母及其组合组成的组。
另一公开内容是制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的基因产物，提供脂肪酸辅酶A，提供香草胺，在培养基中培养细胞系统，以及收集辣椒素类物质。在一个公开内容中，所述脂肪酸辅酶A是8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A，所述辣椒素类物质按数量比是多于约90％的辣椒素。在另一公开内容中，所述脂肪酸辅酶A是8-甲基-壬酰基辅酶A，所述辣椒素类物质按数量比是多于约90％的二氢辣椒素。在另一公开内容中，提供的脂肪酸辅酶A是辛酰基辅酶A，所述辣椒素类物质产物是N-香草基辛酰胺，更具体地说是多于约90％的N-香草基辛酰胺。在另一公开内容中，所述脂肪酸辅酶A是癸酰基辅酶A，所述辣椒素类物质产物是N-香草基癸酰胺，更具体地说是多于约90％的N-香草基癸酰胺。
对于各种实施方案中使用的细胞系统，其选自由细菌、酵母及其组合组成的组。提供能进行生物合成生产的任何细胞系统。
辣椒的辛辣性由Pun1基因座控制是长久以来便已知的，相应的基因目前已被确定为AT3，其编码推定的酰基转移酶(Stewart等人，2005)。AT3是BAHD酰基转移酶超家族中的一员，并已被认为是推定的CS/AT3/Pun1(Kim等人，2009)。然而，CS/AT3/Pun1基因产物的生物化学活性到目前为止还未被报道。该生物化学活性证据的缺失主要源于以下事实：用于CS/AT3/Pun1基因产物的酰基辅酶A底物不是可商购的，并且由于所述蛋白质的极端不溶性，CS/AT3/Pun1的重组表达是困难的(Stewart等人，2005)。也已推测CS可能属于非BAHD家族的酰基转移酶家族(Stewart等人，2005)。申请人是首个表明CS/AT3/Pun1的基因产物在生物转化反应中具有CS功能的。申请人已解决在生物转化方法中制造辣椒素类物质，尤其是辣椒素的长期感到但未满足的需要。
此外，由于辣椒素类物质在食品、药品和防卫物(例如辣椒喷雾)中的广泛使用，对辣椒素类物质已存在增长的需求。迄今为止，辣椒是辣椒素类物质唯一的天然来源。然而，辣椒中辣椒素类物质的含量通常是低的，并且受到环境和生长条件的影响。例如，已报道每克辣椒(干重)含有0.22-20mg范围内的总辣椒素类物质(Thomas等人，1998)。天然辣椒素类物质供应的不足导致天然辣椒素类物质极高的价格，例如US$2,000-3,000/kg(http:// www.alibaba.com/product-gs/810894171/Natural Capsaicin Capsaicine Powder97 16.html？s＝p)。拥有能满足需求的辣椒素类物质的另一来源在工业中已是长期未满足的需求。
对于从可再生资源中生产药物、化学品和生物燃料，基因工程微生物已成为越来越重要的平台(Du等人，2011)。当用于食品时，这些生物技术产物，可根据现行规章在食品工业中被标记为“天然的”(和Münch，1997)。微生物生产平台发展的先决条件是生物转化途径中相应基因的克隆和表征。由于辣椒素类物质的重要性，对于编码辣椒素合酶的基因的克隆已有长久的兴趣。例如，100多年以前，Webber报道PUN1基因座是辣椒辛辣性的控制体(Webber，1911)。相应的基因被克隆，其编码AT3的基因产物，所述AT3的基因产物是BAHD超家族中的一种酰基转移酶(Stewart等人，2005)。然而，直到近期由申请人表明，还没有任何生化活性归因于该推定的酰基转移酶，且声称CS/AT3/Pun1的基因产物为推定辣椒素合酶是存疑的。此外，由于缺少CS/AT3/Pun1基因产物的酰基辅酶A底物，永远不能在生物转化机制中有效捕获来自于CS/AT3/Pun1基因产物的活性以制造辣椒素和其他辣椒素类物质。之后，在另一研究中，使用酶至基因方法，Prasad等人(2006)报道了将csyl确认为隐蔽的辣椒素合酶基因。然而，两年之后，该工作被撤回(Prasad等人，2008)，CS基因仍是未确认和未确定的。因此，不仅仅是真正辣椒素合酶的生化特性和确认已是工业中的长期目标，而且已长期期望开发在生物转化机制中的利用CS基因以制造辣椒素和其他辣椒素类物质。
依据申请人对ACS1基因产物活性的确认，申请人能制造酰基辅酶A底物，因此他们能证明CS/PUN1/AT3在体外和体内均具有CS活性。这代表异源生物合成辣椒素类物质的第一个实例，其为生产“天然”辣椒素类物质的微生物发酵法的发展和最优化铺平了道路。此外，在开发该方法中，申请人已证明，通过加入不同的脂肪酸底物，他们也能制造可能不存在于自然中的不同种的辣椒素类物质。
实施例1
CS/Pun1/AT3基因产物在体内具有CS活性。
根据申请人近期的辣椒中的ACS活性的发现(Chen H,Wang H和Yu O,US 61/898944)，ACS1和CS/AT3/Pun1的基因产物在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中过表达。申请人发现ACS1的基因产物通过加入辅酶A具有激活脂肪酸、制造高能形式脂肪酸的能力。通过IPTG诱导蛋白质表达以及加入香草胺(VN)和8-甲基-6-壬烯酸(6E)/8-甲基壬酸(8M)后，生成推定CP/DHCP(图2)。在自然(即，来自于辣椒)中，辣椒素和二氢辣椒素被一起制造，而在生物合成反应中，申请人已发现他们可以通过加入特定的有活性的脂肪酸(例如6E-辅酶A、8M-辅酶A、辛酰基辅酶A和癸酰基辅酶A)控制生产辣椒素、二氢辣椒素和其他辣椒素类物质。
克隆CS/Pun1/AT3
申请人是首个在细胞系统中从CS/AT3/Pun1基因的基因产物和底物的生物转化中生化地表明CS活性的。特别是，申请人表明了催化有活性的脂肪酸向辣椒素类物质转化的能力。将CS/AT3/Pun1基因初始克隆至pENTR/D_TOPO载体。CS的克隆需要以下引物。使用引物309-pentr-F：CACCATGGCTTTTGCATTACCATC和309-pentr-R：TTAGGCAATGAACTCAAGGAG以扩增鬼红椒的绿色果实的cDNA中的CS/AT3/Pun1基因，并将所得PCR产物克隆至pENTR/D_TOPO载体，然后通过LR反应交换至pDEST17载体(Invitrogen)。然后在细菌系统(例如BL21(DE3))中表达CS/AT3/Pun1的基因产物，然后通过提供需要的底物，检测到CP和DHCP。以使用120Cl8反相柱(Thermo Scientific；3μ，，150×3mm)的3000LC系统(Thermo Scientific)进行HPLC。流动相由溶剂A(0.1％三氟乙酸)和溶剂B(乙腈)组成。梯度洗脱步骤如以下：0-5min，5％的B；5-9min，5-80％的B线性梯度；9-11min，80％的B；11-12min，5％的B。流速为0.6ml/min。二极管矩阵检测器收集200-至400-nm范围内的数据。在280nm测量峰面积，用于底物和产物的检测和定量。
CP/DHCP同一性确认
CP/DHCP同一性通过进一步的GC/MS分析确认。如图3所示(GC/MS图谱)，Sigma的CP标准物实际是约60:40比例的CP和DHCP的混合物。CP和DHCP的保留时间分别为13.80和14.04min。GC/MS机器中的MS库含有CP和DHCP的标准谱，其与来自于Sigma标准物的谱吻合。如图4所示，向表达有ACS1和CS/AT3/Pun1的基因产物的培养基加入6E和8M分别导致生成CP和DHCP。在并排比较中，产物的谱图与标准物的谱图吻合的非常好(图5)。
CS/Pun1/AT3基因产物具有体外CS活性。
为了确定体外活性，申请人使用引物309-sumo-F：CGC GAA CAG ATT GGA GGTGCTTTTGCATTACCATC和309-sumo-R：GTG GCG GCC GCT CTA TTA TTAGGCAATGAACTCAAGGAG扩增来源于鬼红椒绿色果实的cDNA的CS/Pun1/AT3基因。将所得PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化，并与线性pETite N-His SUMO Kan表达载体(Lucigen，Middleton，WI)组合。所述DNA混合物用于通过热休克转化HI-控制10G化学感受态细胞(Lucigen)。然后将基因插入物完全测序，该序列与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)的Pun1基因(GenBank:AY819027)的序列一致。
SEQ ID No.1：来自于鬼红椒CS/Pun1/AT3的序列
ATGGCTTTTGCATTACCATCATCACTTGTTTCAGTTTGTGACAAATCTTTTATCAAACCTTCCTCTCTCACCCCCTCTAAACTTAGATTTCACAAGCTATCTTTCATCGATCAATCTTTAAGTAATATGTATATCCCTTGTGCATTTTTTTACCCTAAAGTACAACAAAGACTAGAAGACTCCAAAAATTCTGATGAGCTTTCCCATATAGCCCACTTGCTACAAACATCTCTATCACAAACTCTAGTCTCTTACTATCCTTATGCAGGAAAGTTGAAGGACAATGCTACTGTTGACTGTAACGATATGGGAGCTGAGTTCTTGAGTGTTCGAATAAAATGTTCCATGTCTGAAATTCTTGATCATCCTCATGCATCTCTTGCAGAGAGCATAGTTTTGCCCAAGGATTTGCCTTGGGCGAATAATTGTGAAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTCAAGTAAGTAAGTTTGATTGTGGGGGAATAGCCATCAGTGTATGCTTTTCGCACAAGATTGGTGATGGTTGCTCTCTGCTTAATTTCCTTAATGATTGGTCTAGCGTTACTCGTGATCATACGACAACAGCTTTAGTTCCATCTCCTAGATTTGTAGGAGATTCTGTCTTCTCTACAAAAAAATATGGTTCTCTTATTACGCCACAAATTTTGTCCGATCTCAACGAGTGCGTACAGAAAAGACTCATTTTTCCTACAGATAAGTTAGATGCACTTCGAGCTAAGGTGGCAGAAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGGGCAGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTTTTCAAATGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTAAACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTACCACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCTATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTGGTTCGTAATTTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATCCTAGAAGTAGTAGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTATGAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCAAATATCCGTACTACACTGTAGATTTTGGATGGGGAAGACCTGAAAGAGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCCTTCTTCTTGAAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTTGCACAAGCAACAAATGTCTGAATTTGAACGCAATGAGGAACTCCTTGAGTTCATTGCCTAA
申请人使用pETite N-His SUMO-ghost Pun1以转化HI-控制BL21(DE3)细胞(Lucigen)，通过0.5mM IPTG在16℃诱导His-SUMO-Pun1表达20个小时。通过Ni-NTA柱纯化融合蛋白(图6)。Pun1的基因产物具有约49Kd的分子量，His-SUMO标记的大小为大约12Kd。SDS-PAGE上的His-SUMO-CS融合蛋白迁移接近预测大小(约61Kd)(图6)。
申请人使用ACS1和CS/Pun1/AT3耦合的酶系统检测CS/Pun1/AT3的基因产物的活性。ACS1基因产物促进CS/Pun1/AT3基因产物的底物的生成。所述系统包括100mM Tris pH8.5、5mM ATP、0.5mM辅酶A、10mM MgCl2、100mg/L VN和1mM 6E。通过同时加入纯化的SUMO-ACS1和SUMO-Pun1开始反应。所述反应持续1小时，然后通过加入醋酸终止。反应产物首先通过HPLC分析(图7)。与对照相比，形成了两种产物，一种为早先通过MS/MS确认(Chen H,WangH和Yu O,2013)的8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A，另一种产物(#1)与CP的保留时间吻合。
为了进一步确认峰#1的身份，将乙酸乙酯萃取物于N2气上干燥，并由MSTFA(N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-Sigma)衍生化。通过GC/MS分析产物(图8)。如图8所示，酶反应产生的CP与CP标准物具有相同的MS图谱。
此外，申请人还使用其他底物检测了活性。申请人从Sigma购买了辛酰基辅酶A和癸酰基辅酶A。当这些酰基辅酶A和VN一同作为底物使用时，形成相应的辣椒素类物质(对N-香草基辛酰胺和N-香草基癸酰胺分别为#1和#2)，确认了Pun1的酶活性(图9和10)。使用乙酸乙酯萃取酶产物，并于N2气中干燥。通过GC/MS分析MSTFA衍生物。图11显示了图10的峰#1和#2的MS图谱。
实施例2
克隆
使用引物ACS1-Bgl ll-F：GAAGATCTATGGCAACAGATAAATTTA和ACS1-XhoI-R：CCGCTCGAGTCACTTGGTACCCTTGTAC从pETite N-His SUMO-ghostACSl模板PCR扩增ACS1基因，并将其连接至pCDFDuet-1载体(Novagen)的MCS2位点。使用所得质粒pCDFDuet-ACS1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在含有100mg/L壮观霉素的LB板中挑选转化的细胞。将所得的含有pCDFDuet-ACSl的BL2l(DE3)细胞用于pETite N-His SUMO-ghost Pun1载体的第二转化。在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L的壮观霉素的LB板上挑选转化子。
不同的培养基
在加入VN(香草胺)和6E(8-甲基-6-壬烯酸)的共同过表达ACS1和Pun1的BL21(DE3)培养物中检测不同培养基对于CP(辣椒素)生产的作用。简言之，使用隔夜培养物接种含有50mg/L卡那霉素和100mg/L壮观霉素的液体LB、TB或M9培养基(2％)。使所述培养物首先在37℃生长至0.6的OD600，冷却至16℃。然后加入1mM IPTG以诱导ACS1和Pun1的表达。在16℃培养1h后，向培养物中加入50mg/L的VN和50mg/L的6E，然后将培养物继续在16℃培养。在加入底物后于0、18、22、26、42和48h取样。通过乙酸乙酯萃取CP，并通过HPLC分析。图12显示了在三个测试培养基中，对于从VN和6E生产CP，TB是最好的。
同一性和相似性
同一性是序列比对后一对序列间相同的氨基酸部分(可仅使用序列信息或结构信息或一些其他信息实现序列比对，但通常其仅基于序列信息)，相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对所分配的分数。相似性指数可以是以下任意之一：BLOSUM62、PAM250或GONNET或本领域普通技术人员为了蛋白质序列比对所使用的任何矩阵。
同一性是两个亚-序列(序列间没有间隔)间的对应程度。25％或更高的同一性意味功能的相似性，而18-25％意味着结构或功能的相似性。记住，两个完全不相关或随机的序列(多于100个残基)可具有高于20％的同一性。相似性是当两个序列相比，它们之间的相似程度。这取决于它们的同一性。
如从以上描述明显可知的是，本公开内容的某些方面不限于本文所说明实例的特定细节，因此预期的是本领域普通技术人员将会想到其他修改和应用或其等效物。因此旨在使权利要求覆盖不脱离本公开内容精神和范围的所有的修改和应用。
此外，除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员普遍理解的相同的意思。虽然在实践或试验本公开内容时可使用与本文描述的那些相似或等同的方法或材料，但优选的方法和材料是如上所述的。
可从附图、公开内容和所附权利要求的研究中得到本公开内容的其他方面、目的和优势。
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Claims (36)

1.一种制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括：
在混合物中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物；
向所述混合物中提供第一底物；以及
收集所述辣椒素类物质。
2.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物基于DNA序列SEQ ID No.1。
3.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物基于与SEQ ID No.1具有至少约95％同一性的DNA序列。
4.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物来源于鬼红椒。
5.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述第一底物是选自由以下组成的组的有活性的脂肪酸：8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A、8-甲基壬酰基辅酶A、辛酰基辅酶A、癸酰基辅酶A、其他中链至长链酰基辅酶A及其组合。
6.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中向所述混合物提供所述第一底物包括在混合物中表达ACS1的第二基因产物以及提供第二底物。
7.权利要求6的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达ACS1的第二基因产物来源于鬼红椒。
8.权利要求6的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述第二底物是选自由以下组成的组的脂肪酸：8-甲基-6-壬烯酸、8-甲基壬酸、辛酸、癸酸、其他中链至长链脂肪酸及其组合。
9.权利要求6的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达任何基因进一步包括通过体外翻译表达所述基因。
10.权利要求6的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达任何基因进一步包括在细胞系统中表达所述基因。
11.权利要求9的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述细胞系统基于选自由细菌、酵母及其组合组成的组的微生物。
12.权利要求9的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中将任何所述基因的表达产物纯化为重组蛋白。
13.权利要求1的制造辣椒素类物质的生物转化方法，进一步包括提供第三底物香草胺。
14.权利要求13的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中提供所述第三底物香草胺进一步包括在混合物中表达pAMT的第三基因产物，以及提供第四底物香草醛。
15.权利要求14的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达所述pAMT的第三基因产物来自于鬼红椒。
16.权利要求14的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达任何基因进一步包括通过体外翻译表达所述基因。
17.权利要求14的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中表达任何基因进一步包括在细胞系统中表达所述基因。
18.权利要求17的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述细胞系统基于选自由细菌、酵母及其组合组成的组的微生物。
19.权利要求9的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中将任何所述基因的表达产物纯化为重组蛋白。
20.一种制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括：
在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的第一基因产物；
在培养基中培养细胞系统；以及
收集所述辣椒素类物质。
21.权利要求20的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述辣椒素类物质是辣椒素。
22.权利要求21的制造辣椒素类物质的生物转化方法，进一步包括：
提供8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A；以及
提供香草胺。
23.权利要求22的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中提供8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A包括：
在所述细胞系统中表达ACS1的第二基因产物；以及
提供8-甲基-6-壬烯酸。
24.权利要求22的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中提供香草胺包括：
在所述细胞系统中表达pAMT的第三基因产物；以及
提供香草醛。
25.权利要求20的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述辣椒素类物质是二氢辣椒素。
26.权利要求25的制造辣椒素类物质的生物转化方法，进一步包括：
提供8-甲基-壬酰基辅酶A；以及
提供香草胺。
27.权利要求26的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中提供8-甲基-6-壬酰基辅酶A包括：
在所述细胞系统中表达ACS1的第二基因产物；以及
提供8-甲基壬酸。
28.权利要求26的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中提供香草胺包括：
在所述细胞系统中表达pAMT的第三基因产物；以及
提供香草醛。
29.权利要求20的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述基因产物由克隆自鬼红椒的CS/AT3/Pun1表达。
30.权利要求20的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述基因产物由与克隆自鬼红椒的CS/AT3/Pun1享有至少约95％的序列同一性的CS/AT3/Pun1表达。
31.权利要求20的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述细胞系统选自由细菌、酵母及其组合组成的组。
32.一种制造辣椒素类物质的生物转化方法，包括：
在细胞系统中表达CS/AT3/Pun1的基因产物；
提供脂肪酸辅酶A；
提供香草胺；
在培养基中培养所述细胞系统；以及
收集所述辣椒素类物质。
33.权利要求32的制造辣椒素类物质的生物转化方法包括，其中所述脂肪酸辅酶A是8-甲基-6-壬烯酰基辅酶A；所述辣椒素类物质为按数量比多于约90％的辣椒素。
34.权利要求32的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述脂肪酸辅酶A是8-甲基-壬酰基辅酶A；所述辣椒素类物质为按数量比多于约90％的二氢辣椒素。
35.权利要求32的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述脂肪酸辅酶A是辛酰基辅酶A。
36.权利要求32的制造辣椒素类物质的生物转化方法，其中所述脂肪酸辅酶A是癸酰基辅酶A。
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