CN116478276A

CN116478276A - 一种多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN116478276A
Application number: CN202310579445.9A
Authority: CN
Inventors: 陈贝; 刘智禹; 崔路路; 许旻; 蔡水淋; 苏永昌; 乔琨
Original assignee: Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Current assignee: Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Priority date: 2023-05-22
Filing date: 2023-05-22
Publication date: 2023-07-25

Abstract

本发明公开了一种多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用，属于生物活性肽领域，其氨基酸序列为FPGGPGAK，还公开了其制备方法以及在化妆品领域的应用。本发明公开的多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用，通过对河鲀鱼皮进行处理，提取纯化并筛选其中起到光保护作用的中心肽段，该中心肽段可用于化妆品中。

Description

一种多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物活性肽领域，特别是涉及一种多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是先天免疫系统的重要组成部分，是保护人体内部器官免受外界环境损伤的第一道防线。皮肤主要由真皮、表皮和皮下组织构成，此外还包含了毛发以及汗腺等皮肤附属物，其中皮肤的外观特征可以直接反映人体的衰老程度。皮肤老化分为内在老化和外在老化，也称内源性老化和外源性老化。内源性老化是指人随年龄增长而发生的生理和遗传性皮肤老化；外源性老化是指太阳光照、温度、灰尘、空气污染、化学因素以及细菌侵染等因素对皮肤的刺激而导致的皮肤老化。由UV造成的皮肤老化定义为皮肤光老化。UV包含3种射线，分别为UVA、UVB和UVC，UVA的波长范围为320-400nm，UVB的波长范围为280-320nm，UVC的波长范围为100-280nm。UVC射线由于其波长较短，大部分都被臭氧层吸收；UVB射线部分被臭氧层吸收，部分被皮肤的表皮层吸收，还会渗透到皮肤真皮的上层，破坏皮肤真皮层胶原蛋白以及弹性蛋白的降解，与UVC和UVB相比而言，UVA的波长最长，故UVA射线会被皮肤的内部的真皮层吸收，从而对皮肤真皮层和表皮层的结构和细胞造成损伤。UV致皮肤老化的作用机制有：UV诱导皮肤氧化应激、UV对皮肤细胞外基质(ECM)的影响、UV损伤DNA、UV诱导皮肤炎症。

海洋生物特殊的生存坏境造就了有别于陆生生物的独特的新陈代谢途径和适应机制，从而产生了大量结构新颖、功能独特的活性化合物。海洋生物活性肽是其中一类重要的天然产物，具有分子量小、易于吸收和生物利用率高等特点，在海洋化妆品和功能食品领域都是极具发展前景的功能因子。海洋生物活性肽是源于海洋生物的具有调节生物体生理功能的肽类，分子量一般小于6kDa。与蛋白质相比，海洋生物活性肽具有分子量小，易消化，低毒性，生物利用率高等特点，成为了生物医药，化妆品和食品领域的研究热点。大量研究表明，海洋生物活性肽具有良好的抗光老化功效，其作用机制包括抗氧化、促进胶原合成、抑制胶原降解、抗炎、促进伤口愈合和缓解细胞凋亡。

MMPs是一类能够降解皮肤真皮层胶原蛋白且含有Zn²⁺和Ca²⁺的内肽酶，MMPs主要由成纤维细胞分泌，在皮肤真皮层胶原合成和胶原降解起到平衡的作用。UV辐射皮肤会上调MMPs表达，继而加速皮肤胶原蛋白的降解，导致胶原合成和胶原降解失衡，使皮肤出现皱纹，造成皮肤衰老。因此MMPs是导致皮肤光老化的关键酶。养殖双斑东方鲀鱼皮为无毒级别，富含胶原蛋白，是胶原蛋白及其胶原肽的理想来源。不同分子量大小的双斑东方鲀鱼皮胶原肽(TBSCH)具有抗光老化的功效，其中分子量＜1kDa的肽的光保护的效果最佳。现有河鲀鱼皮中发挥光保护作用的中心活性肽段序列仍未知。

此外，目前多肽的分离纯化技术已经成熟，包括膜分离、色谱分离和电泳法等，但这些分离纯化技术存在耗时长、成本高和损失率高等特点。虚拟筛选可从大量化合物快速筛选出苗头化合物，但长期以来一直受到假阳性率高的困扰。

发明内容

本发明提供了一种多肽、以河鲀为原料的多肽提取纯化方法及其应用，目的是得到可以发挥光保护作用的活性肽的中心肽段，得到该中心肽段的分离筛选提纯方法以及该中心肽段在行业的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

本发明提供的一种多肽，其氨基酸序列为：FPGGPGAK。

本发明提供的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，包括如下步骤：

S1、将河鲀鱼皮切块，对鱼皮进行杂质、内源性蛋白酶、脂质物质的去除，处理后的鱼皮进行冷冻干燥后真空保存；

S2、将经过步骤S1处理后的鱼皮加入到酸溶液中进行搅拌，离心后得到的沉淀物再次加入到酸溶液中进行搅拌离心，合并两次搅拌离心后的上清液，收集沉淀物；

S3、取步骤S2所得上清液，加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酸溶性胶原蛋白；

S4、取步骤S2所得沉淀物，加入酸溶液和胃蛋白酶，酶解后离心得到上清液，向上清液中加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酶溶性胶原蛋白；

S5、将步骤S3和步骤S4所得的酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白合并得到胶原蛋白；

S6、将步骤S5获得的胶原蛋白通过木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原肽；

S7、将步骤S6得到的胶原肽经过分离纯化，获得上述的多肽。

可选地，在步骤S7中，胶原肽分离纯化的步骤包括：

S71.超滤

将步骤S6得到的胶原肽经超滤获得分子量＜1kDa的数条小分子多肽；

S72.凝胶过滤层析分离

将步骤S71得到的多肽经过滤胶过滤层析处理，洗脱得到数条纯化的小份子多肽；

S73.分子虚拟筛选

将步骤S72得到的纯化的小分子多肽进行测试，经过分子虚拟筛选获得苗头多肽；测定苗头多肽的活性，获得具有活性的目标多肽。

可选地，步骤S71中胶原肽经过陶瓷膜和超滤膜，获得小于1kDa的小分子多肽，真空冷冻干燥；

步骤S72中，将小分子多肽溶于去离子水中，配制成浓度为10～15mg/mL的多肽溶液，经0.2～0.3μm滤膜进行过滤，洗脱液用0.4～0.5μm滤膜进行过滤，并且采用超声波超声除去洗脱液内的气泡；将多肽溶液注射到凝胶过滤层析柱内，使用PBS缓冲液以1～5mL/min的流速进行洗脱，洗脱液在波长为215nm处检测，室温下收集洗脱峰溶液，将洗脱峰溶液用透析袋脱盐，并真空冷冻干燥，得到纯化的小分子多肽；

步骤S73中，将纯化的小分子多肽进行是高效液相色谱与质谱分析，筛选出可信度高的多肽与MMP-1受体蛋白进行虚拟分子对接，筛选得到苗头多肽；将得到的苗头多肽进行细胞活性测试，获得具有活性的目标多肽。

可选地，步骤S73中筛选可信度-10lgP＞20且氨基酸的个数＜10的苗头多肽，进行固相合成并测定其对UVB诱导L929细胞的细胞活性的影响，筛选出具有抗光老化功效的肽段为目标多肽。

可选地，在步骤S1中，去除杂质包括如下过程：按照固液比为1:15-1:25的比例将鱼皮加入到0.6-1.0mol/L的NaCl溶液中搅拌后冲洗。

可选地，在步骤S1中，去除内源性蛋白酶包括如下过程：去除杂质后，按照固液比为1:35-1:45的比例将鱼皮浸入到0.05-0.15mol/L的NaOH溶液后进行搅拌。

可选地，在步骤S1中，去除脂类物质包括如下过程：去除内源性蛋白酶后，按照固液比为1:15-1:25的比例将鱼皮浸入到8％-12％正丁醇的溶液中进行搅拌后冲洗。

可选地，在步骤S2中，所述酸溶液具体为醋酸溶液，鱼皮与醋酸溶液的固液比为1:10-1:20，醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，离心时间为10-20min。

可选地，在步骤S3中，所述缓冲液为NaCl的Tris-HCl缓冲液，加入的NaCl溶液与Tris-HCl缓冲液的浓度分别为3-7mol/L、0.03-0.07mol/L；所述酸溶液为醋酸溶液，溶解沉淀的醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；透析液为醋酸与水组合的胶体，透析液中醋酸的浓度为0.05-0.15mol/L。

可选地，在步骤S4中，溶解沉淀物的酸溶液为醋酸溶液，醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，所述缓冲液为NaCl的Tris-HCl缓冲液，加入的NaCl溶液与Tris-HCl缓冲液的浓度分别为3-7mol/L、0.03-0.07mol/L；溶解沉淀的醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；透析液为醋酸与水组合的胶体，透析液中醋酸的浓度为0.05-0.15mol/L。

可选地，在步骤S4中，胃蛋白酶的酶解条件为：在0.3-0.7mol/L的醋酸溶液的条件下，胃蛋白酶的酶活力为20U/g，温度为4℃，酶解时间为48h。

可选地，在步骤S5中，木瓜蛋白酶酶解条件为：料液比为1:200-1:300，温度为48℃，pH值为5.35，木瓜蛋白酶量为51000U/g，酶解时间为4h。

可选地，所述河鲀为双斑东方鲀。

本发明提供的一种多肽或以河鲀为原料的多肽提取纯化筛选方法制备得到的多肽在制备抗光老化的化妆品中的应用。

可选地，所述多肽以12.5-400μM的浓度范围存在于所述化妆品中。

可选地，所述多肽以25-200μM的浓度范围存在于所述化妆品中。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明多肽活性高，与MMP-1对接的Score为-8.1749，对接活性较高。

2、本发明多肽通过河鲀鱼皮进行提取纯化并筛选得到，属于海洋生物活性肽，具有分子量小、易于吸收、低毒性和生物利用率高的特点。

3、本发明多肽具有良好的抗光老化功效，其作用机制包括抗氧化、促进胶原合成、抑制胶原降解、抗炎、促进伤口愈合和缓解细胞凋亡等等。

4、本发明采用酸-酶复合法提取胶原蛋白，然后基于凝胶过滤层析方法对超滤分离获得的分子量<1kDa的TBAPP进行分离纯化，筛选出具有光保护功效的组分；质谱鉴定获得该组分的氨基酸序列，以MMP-1为靶点，利用分子对接虚拟筛选，获得与MMP-1互作的苗头多肽序列，进行固相合成并测定其对UVB辐照小鼠L929细胞的细胞活性的影响，筛选出具有抗光老化功效的肽段。筛选得到的多肽对MMP-1的活性具有抑制效果，抑制率高达29.03％。

附图说明

图1是海洋生物ASC和PSC的提取方法流程图。

图2是多个苗头多肽对UVB诱导的光老化L929细胞活性的影响

图3是Superdex凝胶柱分离纯化TSSCH-L的洗脱图。

图4是抗光老化肽的二维结构示意图和MMP-1的3D结构示意图，其中(a)为FPGGPGAK的二维结构示意图；(b)为MMP-1(PDB：966C)的三维结构示意图。

图5是抗光老化肽与MMP-1分子对接结果示意图，其中FPGGPGAK和MMP-1分子对接的三维结构图(a)和二维结构图(b)。

图6是FPGGPGAK的色谱图。

图7是FPGGPGAK的质谱图。

图8是FPGGPGAK对L929细胞存活率的影响。

图9是FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞存活率的影响。

图10是FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞中ROS含量的影响。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例

本申请提出的一种多肽，其氨基酸序列为：FPGGPGAK。

该多肽可由河鲀鱼皮中提取得到，如图1所示，具体的提取过程包括如下步骤：

将双斑东方鲀鱼皮用切肉机切成小块，对鱼皮进行冷冻干燥处理以脱去鱼皮中水分，真空包装保存。按照固液比为1:20的比例将干鱼皮加入到0.8mol/L的NaCl溶液中，搅拌30min，每隔10min换一次液体，用冷蒸馏水冲洗，目的除去鱼皮中的杂质。再按照固液比为1:40的比将鱼皮浸入到0.1mol/L的NaOH溶液，在低温中搅拌48h，每12h换一次溶液，用冷蒸馏水冲洗干净，目的是除去鱼皮中的非胶原蛋白并防止内源性蛋白酶对胶原的影响。之后按照固液比为1:20的比例将鱼皮浸入到10％正丁醇的溶液中，在4℃的条件下搅拌48h，每隔12h更换一次溶液，用冷蒸馏水冲洗干净，目的除去鱼皮中的脂质物质，将处理过的鱼皮冷冻干燥，真空包装保存。

将已经去除了非胶原蛋白和脂质的鱼皮按照固液比为1:15的比例加入到0.5mol/L的醋酸溶液中，在4℃的条件下搅拌48h，在10000×g，4℃的条件下离心15min后，沉淀用同样的条件处理一次，合并两次的上清液，收集沉淀物。上清液用于酸溶性胶原的提取，沉淀物用于酶溶性胶原的提取。

利用酸法提取和酶法提取两种方法得到酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，合并酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白为TBSC。

将以上获得的TBSC用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件：料液比为1:250，温度48℃，pH为5.35，加木瓜蛋白酶量为51000U/g，酶解时间为4h，获得TBSCH。将TBSCH过陶瓷膜和超滤膜，获得小于1kDa的TSSCH-L，真空冷冻干燥后保存于-20℃。

将冷冻干燥后得到的多肽溶于去离子水中，配制成浓度为12mg/mL的多肽溶液，0.22μm滤膜进行过滤，实验之前，洗脱液用0.45μm滤膜进行过滤，并且超声波超声20min除去洗脱液内的气泡；实验前后凝胶柱都要用去离子水平衡，使基线保持平稳状态。用注射器注入1.2mL的多肽溶液到HiLoad 16/600Superdex 30pg柱子，使用PBS缓冲液以1mL/min的流速进行洗脱，洗脱液用AKTA purifier在波长为215nm处检测，室温下收集洗脱峰到离心管内，电脑软件(UNICORN)自动制图。之后用透析袋脱盐24h，脱盐后的洗脱峰溶液真空冷冻干燥，储存于-20℃或-80℃。各洗脱组分分别在1mg/mL和0.5mg/mL的浓度下对UVB诱导L929细胞活性的影响，筛选具有抗光老化的肽组分。

将得到的具有抗光老化的肽组分先用C18柱进行除盐处理，采用Q Exactive^TMPlus质谱仪对样品进行分析，Acclaim PepMap C18分析柱子分离样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的有B相起始，在47min内以非线性梯度升高到35％，1分钟内升高到100％，维持12min。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：MS参数设置如下：扫描范围(m/z)：200-1800；分辨率：70,000；AGC target：3e6；最大注入时间：50ms；HCD-MS/MS参数设置如下：分辨率:17,500；AGC target：1e5；最大注入时间45ms；碰撞能量28；动态排除时间30s。

根据质谱的分析结果，通过谱图鉴定的可信度-10lgP，和氨基酸的个数对肽进行初步的筛选，MMP-1(PDB：966C)作为受体蛋白，从RCSBPDB数据库下载其3D结构。在进行模拟筛选之前，使用MOE 2015软件去除受体蛋白无用的水分子，加氢，加电荷，能量优化；将多肽使用Discovery Studio 2019Client软件绘制小分子作为配体，确定MMP-1的活性口袋，S1′活性口袋为Tyr240，Ala182，His218，Thr241，Ala234，Val215和Arg214；S3′活性口袋包含残基Tyr240，Tyr210；S1活性口袋包含残基Phe185，Gln186，利用DOCK 6.9进行分子模拟筛选，根据Grid Score分值和结合模式筛选出苗头多肽。

使用Superdex预装柱，根据分子量大小的不同，对TBAPP进行分离纯化。分离结果如图2所示，经过Superdex洗脱后出现3个峰。

采用nano-HPLC-MS/MS鉴定组分的多肽序列，肽段结果中，-10lgP指标为对应谱图鉴定的可信度，值越大表明匹配结果越好，根据质谱的分析结果，筛选谱图鉴定的可信度-10lgP＞20且氨基酸的个数＜10的肽，最终筛选出178个多肽序列。进一步将这178个肽与MMP-1(PDB：966C)受体蛋白进行分子对接，根据Grid Score和结合模式从这178个肽中筛选出12个苗头肽序列。

经过上述方法筛选的12个苗头多肽对UVB诱导L929细胞活性的影响如图2所示，正常的细胞经UVB辐照后，细胞活性显著降低；与模型对照组相比，加入200μM的FPGGPGAK、GPAGPRGA、FPGGPGAK和RGFPGGDGAA后，显著提高了细胞的存活率，对UVB诱导的L929细胞具有一定的保护作用。其中FPGGPGAK和GPAGPRGA对UVB诱导的L929细胞活性分别提升了13.86％和13.90％，而FPGGPGAK以及RGFPGGDGAA对L929细胞的活性分别提升了8.48％和6.97％，其他肽对细胞活性无明显的效果。基于上述结果，初步筛选获得FPGGPGAK、GPAGPRGA、FPGGPGAK和RGFPGGDGAA这4个抗光老化肽。

表1-1抗光老化肽与MMP-1对接结果相关参数

表1-1为对接结果的相关参数，受体与配体对接的Score值越低，说明活性越高。由表1-1可知，MMP-1与抗光老化肽对接的Score为-8.1749，对接活性较高。RMSD参数描述了对接前后晶体结构中蛋白质-配体相互作用的变化情况，RMSD值越低，对接配体的构象就越接近目标蛋白结合点的位置，MMP-1与抗光老化肽对接的RMSD值都比较低，说明对接的肽构象接近目标蛋白结合点的位置。

由图4(a)和图4(b)可知，FPGGPGAK与MMP-1蛋白的活性口袋的残基Arg214，Gly233，Leu181，Tyr240，Thr241形成氢键。由上述结果可以看出，TBAPP与MMP-1主要是通过氢键相结合。

MMP-1是一种涉及降解基质金属蛋白的酶，MMP-1在皮肤光老化中起非常重要的作用，MMP-1抑制剂的本实验通过对不同浓度的TBAPP体外抑制MMP-1活性的研究，结果如表1-2所示：FPGGPGAK对MMP-1的活性有抑制作用。

表1-2TBAPP体外对MMP-1的抑制率

肽序列	50(μM)	100(μM)	200(μM)
				FPGGPGAK	27.09％±3.11％	28.22％±3.72％	29.03％±3.54％

(1)FPGGPGAK对L929细胞的毒性作用

L929细胞是小鼠成纤维细胞，许多研究已经使用L929细胞系作为UVB诱导的光老化和光损伤的体外模型。本研究采用MTS法测定L929细胞活性，通过细胞活性评估FPGGPGAK的光保护作用。FPGGPGAK对L929细胞毒性的影响如图8所示。

(2)FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞活性的影响

FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞活性的影响如图9所示，与无UVB照射组相比，L929细胞经40mJ/cm²的UVB照射后，细胞存活率降低了40％左右(p＜0.0001)，说明UVB照射对细胞造成了一定程度的光损伤，当加入含有25-200μM的FPGGPGAK的培养液后，细胞存活率相比模型对照组显著上升，说明FPGGPGAK对UVB诱导的L929细胞的光损伤具有保护作用。

(3)FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞中ROS含量的影响

本研究通过荧光探针DCFH-DA进行细胞内ROS的测定，DCFH-DA可以自由进入细胞膜，进入细胞内由本身无荧光的DCFH-DA被水解生成无荧光的DCFH，进一步由细胞内的ROS氧化生成有荧光的DCF，通过用光酶标仪检测荧光强度，而荧光强度可以衡量细胞内ROS的含量。

FPGGPGAK对UVB诱导L929细胞中ROS含量的影响如图10所示，与正常对照组相比，L929细胞经UVB照射后，荧光强度显著增强(p＜0.0001)。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：

FPGGPGAK。

2.一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S7、将步骤S6得到的胶原肽经过分离纯化，获得如权利要求1或2所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于：

在步骤S7中，胶原肽分离纯化的步骤包括：

S71.超滤

S72.凝胶过滤层析分离

S73.分子虚拟筛选

4.根据权利要求3所述的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于：

步骤S71中胶原肽经过陶瓷膜和超滤膜，获得小于1kDa的小分子多肽，真空冷冻干燥；

5.根据权利要求4所述的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于：

步骤S73中筛选可信度-10lgP＞20且氨基酸的个数＜10的苗头多肽，进行固相合成并测定其对UVB诱导L929细胞的细胞活性的影响，筛选出具有抗光老化功效的肽段为目标多肽。

6.根据权利要求2所述的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于：

在步骤S1中：

去除杂质包括如下过程：按照固液比为1:15-1:25的比例将鱼皮加入到0.6-1.0mol/L的NaCl溶液中搅拌后冲洗；

去除内源性蛋白酶包括如下过程：去除杂质后，按照固液比为1:35-1:45的比例将鱼皮浸入到0.05-0.15mol/L的NaOH溶液后进行搅拌；

去除脂类物质包括如下过程：去除内源性蛋白酶后，按照固液比为1:15-1:25的比例将鱼皮浸入到8％-12％正丁醇的溶液中进行搅拌后冲洗。

在步骤S2中，所述酸溶液具体为醋酸溶液，鱼皮与醋酸溶液的固液比为1:10-1:20，醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L，离心时间为10-20min；

在步骤S3中，所述缓冲液为NaCl的Tris-HCl缓冲液，加入的NaCl溶液与Tris-HCl缓冲液的浓度分别为3-7mol/L、0.03-0.07mol/L；所述酸溶液为醋酸溶液，溶解沉淀的醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；透析液为醋酸与水组合的胶体，透析液中醋酸的浓度为0.05-0.15mol/L；

在步骤S4中，溶解沉淀物的酸溶液为醋酸溶液，醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；胃蛋白酶的酶解条件为：在0.3-0.7mol/L的醋酸溶液的条件下，胃蛋白酶的酶活力为20U/g，温度为4℃，酶解时间为48h；所述缓冲液为NaCl的Tris-HCl缓冲液，加入的NaCl溶液与Tris-HCl缓冲液的浓度分别为3-7mol/L、0.03-0.07mol/L；溶解沉淀的醋酸溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；透析液为醋酸与水组合的胶体，透析液中醋酸的浓度为0.05-0.15mol/L；

在步骤S6中，木瓜蛋白酶酶解条件为：料液比为1:200-1:300，温度为48℃，pH值为5.35，木瓜蛋白酶量为51000U/g，酶解时间为4h。

7.根据权利要求2～6任一项所述的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化方法，其特征在于：所述河鲀为双斑东方鲀。

8.权利要求1所述的多肽，或者权利要求2～6中任一项所述的以河鲀为原料的多肽提取纯化方法制备得到的多肽在制备抗光老化的化妆品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述多肽以12.5-400μM的浓度范围存在于所述化妆品中。

10.根据权利要求8所述的一种化妆品，其特征在于：

所述多肽以25-200μM的浓度范围存在于所述化妆品中。