CN105050606A

CN105050606A - 人工保存液置换血小板溶液的制造方法

Info

Publication number: CN105050606A
Application number: CN201380062439.0A
Authority: CN
Inventors: 岸川龙也; 长部真博; 上野良之; 岛垣昌明; 田中成宪; 林智也
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: US9446074B2; JP6211000B2; TW201427732A; JPWO2014084263A1; EP2926820A4; US20150313943A1; TWI603751B; WO2014084263A1; EP2926820B1; CN105050606B; CA2893039C; EP2926820A1; CA2893039A1

Abstract

公开了具有血小板的活化抑制性能、高的血小板回收性能和高的血浆除去性能的用于制造人工保存液置换血小板溶液的新方法。本发明的人工保存液置换血小板溶液的制造方法，其具备：在下述式1的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对前述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤；和将前述浓缩血小板溶液与人工保存液混合、得到人工保存液置换血小板溶液的混合步骤，1.0×10¹¹＜(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr？m²？Pa))式1，A？：血小板溶液中含有的血小板浓度(个/mL，其中，8.0×10⁷～200×10⁷个/mL)；B：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)；γ：入口壁面剪切速率(s^-1)；μ_P：血小板溶液的粘度(Pa？s)。

Description

人工保存液置换血小板溶液的制造方法

技术领域

本发明涉及人工保存液置换血小板溶液的制造方法。

背景技术

为了输血、血液制剂的制造而进行的献血大致分为全血献血和成分献血。将通过献血采集的血液分离成各成分，由此制造各种血液制剂。血小板制剂指的是被浓缩的血小板分散于血浆(主要成分为蛋白质和水分)而成的溶液。血小板制剂中的血小板的浓度由于比全血高3倍量以上，血小板之间有可能非常容易聚集。

血小板制剂，为了血小板减少症、血小板机能降低症中的出血的预防、治疗而用于输血。现有的血小板制剂，取决于患者会引起荨麻疹、发烧等变态反应而成为问题。作为变态反应的主要原因，可列举出血小板制剂中含有的蛋白质，期待除去含有蛋白质的血浆、置换为人工保存液而成的人工保存液置换血小板溶液。

上述人工保存液置换血小板溶液的制造方法，除了要求操作中血小板不会活化之外，还要求高的血小板回收率、高的蛋白质除去率。以往，作为除去血小板制剂的蛋白质的方法，通常为离心分离法。通过离心分离法除去了血小板制剂中的蛋白质的情况下，暗示了引起血小板活化的可能性，另外，利用离心法时，操作繁杂，需要相当长的时间。但是，现在的现状在于，除了离心法以外，利用其它方法时，不能实用化。

作为其它方法，考虑使用膜来分离的方法，作为膜分离的方法，存在血球(红血球、白血球、血小板)与血浆的分离(专利文献1～3)等中使用的公知技术。专利文献1，为了防止红血球的溶血而着眼于膜的溶胀性，公开了多孔膜使用不易溶胀的原材料的同时使多孔膜中湿润水分为极少量的技术。专利文献2为规定膜的原纤维结构或者使得血液流量加快的技术。进而，专利文献3，作为不易产生堵塞、污染的膜，着眼于亲水性高分子，公开了多孔膜中含有亲水性高分子3～30质量%而成的聚砜系树脂多孔膜。无论怎样，现有技术中进行过滤的对象为全血，没有将血小板制剂等容易聚集的溶液作为对象。进而，仅着眼于膜，没有关于分离方法的发现和暗示。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭62-290469号公报

专利文献2：日本特开昭54-15476号公报

专利文献3：日本特开昭61-238834号公报。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供具有血小板的活化抑制性能、高的血小板回收性能和高的血浆除去性能的用于制造人工保存液置换血小板溶液的新方法。

用于解决问题的方法

本申请发明人等进行了深入研究，结果发现，利用以往的透析治疗、分离性输血(apheresis)疗法用途的分离膜时，制造人工保存液置换血小板溶液是非常困难的。作为其原因，可列举出膜的结构设计不合适。以往的血液净化用途的膜，是为了从以红血球、白血球、血小板、蛋白质作为主要成分的全血除去尿素等低分子量物质和一部分蛋白质而制作的。因此，不能除去分子量大的蛋白质。

另外，若为了除去大量蛋白质而与本来的使用条件相比将过滤量提高则会在中途变得不能过滤。这是由于，在膜内部，蛋白质堵塞，在膜表面，形成血小板卷入蛋白质而成的堆积层(滤饼)，由此过滤受到阻碍。

形成堵塞、滤饼的原因在于，膜表面的孔小、分子量大的蛋白质未穿过膜而停留于膜表面、膜内部，以及过滤的流量设计不合适使得血小板大量堆积于膜表面。另外，若过滤受到阻碍则发现蛋白质的除去量的减少、血小板损失的增加、活化血小板的增加。

如此，本申请发明人等发现，需要使用符合血小板溶液、分离目的的结构的分离膜来设定分离条件。但是，用于除去血小板溶液中含有的蛋白质的膜设计和分离条件迄今没有研究。因此，进一步反复深入研究，成功发现能够在不活化血小板的情形下实现高的血小板回收性能和高的血浆除去性能的分离条件，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种人工保存液置换血小板溶液的制造方法，其具备：在下述式1所示的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对前述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤；和将前述浓缩血小板溶液与人工保存液混合、得到人工保存液置换血小板溶液的混合步骤，

1.0×10¹¹<(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr･m²･Pa)) ・・・・式1

A ：血小板溶液中所含的血小板浓度(个/mL，其中，8.0×10⁷～200×10⁷个/mL)

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。

另外，本发明提供一种人工保存液置换血小板溶液的制造方法，其具备：在下述式1所示的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对前述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤；使人工保存液与前述分离膜接触，将在前述过滤步骤中未回收于浓缩血小板溶液中的血小板回收于前述人工保存液中，得到含血小板的人工保存液的回收步骤；和将血小板的人工保存液与前述浓缩血小板溶液混合、由此得到人工保存液置换血小板溶液的混合步骤，

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。

通过上述制造方法得到的人工保存液置换血小板溶液，优选蛋白质除去率(原来的血小板溶液中的蛋白质浓度作为100)为60%以上且人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为60%以下，更优选蛋白质除去率为65%以上且人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为40%以下。在此，CD62P阳性血小板比率越高则表示血小板越活化。

另外，上述过滤步骤中的膜间压力差优选为5.0×10³ Pa以下，上述分离膜的透水性能优选为35～150mL/hr/m²/Pa。

进而，上述分离膜优选为中空纤维膜，上述错流过滤优选为内压式错流过滤，上述中空纤维膜的内径优选为100～500μm，上述中空纤维膜的有效长度优选为5～50cm，上述分离膜包含亲水性聚合物，对于前述分离膜的与血小板溶液接触的面、以90°测定角度通过X射线电子分光法测定而得到的前述亲水性聚合物存在量优选为30～60质量%。

进而，本发明提供一种浓缩血小板溶液的制造方法，其具备：在下述式1所示的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对前述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤，

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。

发明的效果

根据本发明的人工保存液置换血小板溶液的制造方法，即使并非全血、而是血小板制剂等容易聚集的血小板溶液，也可以抑制血小板的活化的同时实现高的血小板回收率和高的蛋白质除去率，可以制造品质良好的人工保存液置换血小板溶液。

附图说明

图1的A)为实施例中使用的中空纤维膜的内表面(血液接触面)的10000倍的扫描型电子显微镜图像的一例。图1的B)为将实施例中使用的中空纤维膜的内表面(血液接触面)的10000倍的扫描型电子显微镜图像填充（fill）并且二值化而得到的图像的一例。

具体实施方式

本发明中，“血小板溶液”指的是在含有血浆的介质中分散有血小板和蛋白质的、实质上不含有红血球和白血球的液体。介质典型地说为血浆，但是人工保存液等缓冲液也可以作为介质的一部分含有。本发明中使用的血小板溶液的血小板浓度为8.0×10⁷～200×10⁷个/mL。血小板溶液可以如下得到：通过将全血离心分离后、通入白血球除去过滤器等的方法，除去红血球和白血球，由此得到上述血小板溶液。通常作为血小板制剂已知的制剂，为将经过浓缩的血小板分散于血浆中而成的制剂，若血小板浓度处于上述范围内则可以直接作为“血小板溶液”供于本发明的方法。或者，本发明中，也可以使用血小板制剂中含有的血浆的一部分被人工保存液置换而成的血小板溶液、预先混合人工保存液进行稀释而成的血小板溶液来作为血小板溶液。需要说明的是，血浆如该领域中周知那样，指的是由全血通过离心分离等手法除去红血球、白血球、血小板而残留的成分，主要成分为蛋白质和水分。

本发明中，“人工保存液”指的是能够作为分散血小板的介质使用的人工的(非天然的)溶液。用于血小板的人工保存液是公知的，作为具体例，可列举出PASIII-M、M-sol、生理盐水、ビカネイト(注册商标)等通常作为输液使用的溶液、进而ACD-A液等含有柠檬酸的溶液。但是不限于它们，若为具有适于血小板的保存的性能的溶液，即与血小板接触时、不会造成聚集块的产生、渗透压等所导致的血小板的破坏的溶液，则任意溶液都能够用作本发明中的“人工保存液”。

“人工保存液置换血小板溶液”指的是血小板溶液的介质的大部分被人工保存液置换而成的溶液。主要是作为血浆的介质被置换为人工保存液，由此血小板溶液中的蛋白质质量大幅降低。根据上述人工保存液置换血小板溶液的制造方法，可以得到防止血小板的活化的同时如愿以偿地除去了蛋白质的人工保存液置换血小板溶液。另外，上述人工保存液置换血小板溶液的制造方法中，优选蛋白质除去率为60%以上并且人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为60%以下，更优选蛋白质除去率为65%以上并且人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为40%以下。在此，CD62P阳性血小板比率越高则表示血小板越活化。CD62P阳性血小板比率为60%以上时，血小板聚集，血小板机能容易降低，因此不活化的制造方法是重要的。另外，若CD62P阳性血小板比率过低则血小板的聚集机能有可能受损，因此人工保存液置换血小板溶液中的CD62P阳性血小板比率优选为1%以上，进一步优选为3%以上。另外，原来的血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为1时的人工保存液置换血小板溶液的CD62P血小板比率的增加比为3.0以下，优选为2.0以下，进一步优选为1.5以下。

本发明的人工保存液置换血小板溶液的制造方法中，使用与血小板溶液接触的膜表面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，在下述式1所示的条件下，使得入口壁面剪切速率为25～1500s^-1 ^来对血小板溶液进行错流过滤。通过在这种条件下浓缩血小板溶液，可以抑制血小板的活化的同时以高的效率达成蛋白质的除去。

1.0×10¹¹<(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr･m²･Pa))・・・・式1

A ：血小板溶液中所含的血小板浓度[个/mL]

(其中，8.0×10⁷～200×10⁷个/mL)

B ：单位面积的过滤流量[mL/hr/m²]

γ：入口壁面剪切速率[s^-1]

μ_P：血小板溶液的粘度[Pa･s]。

通过过滤血小板溶液、制作除去血浆的血小板溶液时的最大问题在于，蛋白质和血小板堵塞膜。膜表面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的情况下，堵塞的原因在于，血小板堆积于表面、形成还卷入有蛋白质的堆积层。将该堆积层称为滤饼。若形成滤饼则血浆的除去效率降低。进而，不能完全地回收存在于滤饼的血小板，因此血小板的回收率也降低。并且，滤饼中的血小板释放活化因子，因此还会产生所回收的血小板也被活化的问题。也就是说，过滤血小板溶液时抑制滤饼形成是重要的。作为血小板的回收率，优选为80%以上，更优选为85%以上，进一步优选为90%以上。

本申请发明人等发现，作为抑制滤饼形成的过滤方法，错流过滤最合适。错流过滤指的是仅过滤血小板溶液的一部分，剩余部分直接流动(不透过分离膜、而在分离膜表面流动)，由此存在相对于膜表面垂直的流动和相对于膜表面平行的流动的两种流动的过滤方法。若以中空纤维膜为例则形成由中空纤维膜的一侧进入血小板溶液，过滤其一部分，不过滤而残留的血小板溶液由另一侧排出的过滤方式。

垂直于膜的过滤流动促进滤饼的形成，与此相对，平行于膜表面的流动抑制滤饼的形成。本发明中，着眼于这两种流动发现，在满足式1的条件下设定分离膜，控制流量的同时进行过滤，由此能够抑制滤饼的形成。

式1中，分子(A×B)相当于形成滤饼的力，分母的(γ×μ_P)相当于抑制滤饼的力。(A×B)与(γ×μ_P)相比越小则越不易产生滤饼，不会进行血小板的活化，而可以以高的血小板回收率稳定地除去蛋白质。如上式1那样，形成滤饼的力与抑制的力之比((A×B)/( γ×μ_P))比1.0×10¹¹大并且为2.5×10¹³以下，由此可以抑制分离膜上的滤饼形成的同时进行过滤。另外，若(A×B)与(γ×μ_P)相比过小则不能充分进行蛋白质的过滤。因此，形成滤饼的力与抑制的力之比更优选比1.0×10¹¹大并且为2.0×10¹³以下，进一步优选比1.0×10¹¹大并且为1.5×10¹³以下。

若将使用中空纤维膜作为分离膜的情况作为例子进行说明，则入口壁面剪切速率γ的求出方法如下所述。

γ(s^-1)=4×C/D ・・・・式2

C：供给液线速度(m/s)

D：当量半径(m)。

式(2)中的C通过以下的式3提供。

C=(E/1000000)/(F×中空纤维根数) ・・・・式3

E：所供给的血小板溶液流量(mL/s)

F：与膜接触的血小板溶液的相对于没有过滤的血小板溶液流动方向为垂直方向的截面的面积(m²)。

F中的“与膜接触的血小板溶液”指的是在与血小板溶液接触一侧的膜表面的垂直方向连续存在的血小板溶液。中空纤维膜的情况下，F指的是中空纤维膜截面中的内腔部分的面积。

另外，式2中的D通过以下的式4提供。

D=2×(F/G) ・・・・式4

G：上述F所示的截面的外周中、与壁面接触的部分的总长度(m)。

中空纤维膜的情况下，G指的是截面中的内腔部分的圆周的长度。

供给到膜的血小板溶液的流量，以恒定速度送液或者以恒定压力送液哪一种都可以。使用泵等以恒定速度将血小板溶液送液的情况下，使得生理盐水流动1分钟时的液体量为上述式3的血小板溶液流量E即可。另一方面，以某恒定压力送液的情况的血小板溶液流量E可以通过下式求出。

E=H×(μ_P/μ_w) ・・・・式5

H：以某恒定压力，不实施过滤，将生理盐水送液1分钟时的液体量(mL/min)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)

μ_w：生理盐水的粘度(Pa･s)。

入口壁面剪切速率γ指的是由血小板溶液与膜最初接触的入口地点中的过滤之前的血小板溶液的流量算出的壁面剪切速率。壁面剪切速率指的是膜表面中的剪切速率。剪切速率表示与膜表面平行的方向的线速度的速度梯度，越远离流动的中心则越大，在膜表面中最大。由于滤饼形成于膜表面，因此对于滤饼抑制而言，壁面剪切速率也是重要的。其中，本申请发明人等发现入口壁面剪切速率是特别重要的。认为这是由于，在膜的入口附近将血小板、蛋白质活化的情况下，在下游容易产生对膜表面的附着，形成滤饼。另一方面，即使壁面剪切速率过高、血小板也活化。由以上可知，入口壁面剪切速率优选为25秒^-1以上，更优选为100秒^-1以上，更优选为600秒^-1以上。另外，优选为1500秒^-1以下，更优选为1000秒^-1以下。

另外，作为血小板溶液的粘度μ_P，高时抑制滤饼形成的力增大。另一方面，若粘度高则由于血小板、蛋白质的浓度高，而容易产生血小板的活化，容易形成滤饼。考虑以上的结果，作为血小板溶液的粘度，优选为1.0×10^-3 Pa･s以上，更优选为1.2×10^-3 Pa･s以上。另外，优选为2.5×10^-3 Pa･s以下，更优选为1.8×10^-3 Pa･s以下。需要说明的是，任意的溶液的粘度可以使用市售的测定仪器利用常规方法测定。

本发明中的单位面积的过滤流量B为设定过滤流量除以血小板溶液接触的膜的面积而得到的值。单位面积的过滤流量越小则形成滤饼的力越小。另一方面，血小板溶液中的血浆的除去效率(进而蛋白质的除去效率)降低。考虑到以上的结果，单位面积的过滤流量优选为4800mL/hr/m²～48000mL/hr/m²，进一步优选为14400mL/hr/m²～32000mL/hr/m²。

另外，若形成滤饼则与所设定的过滤流量相比，产生实际的过滤流量的减少、蛋白质除去量的降低。此时，膜间压力差(以下TMP)增大。特别是若形成滤饼一次则滤饼的形成会加速度地进行。因此，优选的是，在膜间压力差优选为5.0×10³ Pa以下、更优选为3.0×10³ Pa以下的条件下进行过滤。TMP可以通过下式求出。

TMP(Pa)=((Pi＋Po)/2)-PF ・・・・式6

Pi：所供给的血小板溶液的压力(Pa)

Po：不过滤而排出的血小板溶液的压力(Pa)

PF：过滤而排出的溶液的压力(Pa)。

适于上述条件的膜，为与血小板溶液接触的膜表面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm、优选为0.3μm以上且1.0μm以下的膜。由于需要尽可能除去蛋白质，因此膜表面的孔径尽可能大为宜。另一方面，膜表面的孔径需要比尺寸为2～4μm的血小板小。若考虑到蛋白质和血小板的两者的尺寸则为了不形成滤饼地过滤血小板溶液，上述孔径最适于由血小板溶液除去蛋白质。

另外，膜表面的开孔率越大则即使相同的孔径、向膜内部的进入路径也越多，因此不易形成滤饼层。膜表面的开孔率优选为10%以上，更优选为12%以上，进一步优选为15%以上。分离膜表面的开孔率不足10%的情况下，由于透水性能显著降低而膜间压力差升高，有可能导致血小板的活化以及血小板回收率的降低。另外，若开孔率过高则膜的强度不充分，因此优选开孔率为30%以下，更优选为20%以下。膜表面的孔径、开孔率的测定方法的详细如后文所述，可以通过对于用电子显微镜放大到1000倍的图像利用Matrox Inspector2.2(Matrox Electronic Systems Ltd.)等公知的软件进行图像处理来得到。

另外，越是透水性高的膜则越不易形成滤饼层，可以将膜间压力差控制得低。即，使用透水性能高的膜实现了血小板活化的抑制和血小板回收率的提高。若考虑到在高的剪切速率的范围内除去尽可能多的血浆则膜的透水性能优选为35mL/hr/m²/Pa以上，更优选为70mL/hr/m²/Pa以上。另外，优选为150mL/hr/m²/Pa以下。膜的透水性能的测定方法的详细如后文所述，可以测定恒定压力下每单位时间介由膜而流出的水的量来得到。

对本发明中使用的分离膜的形状没有特别限定。但是，为了达成上述记载的条件，以狭窄的流路流动血小板溶液是最有效的。作为分离膜的形状，中空纤维是最合适的，进而优选以内压式进行错流过滤。

使用中空纤维膜以外压式进行过滤也没有问题，但是此时，需要使得中空纤维膜之间的间隙尽可能狭窄。另外，从血小板滤饼形成的抑制、血小板溶液的流动性的保持的观点考虑，需要想办法使得中空纤维膜之间不接触。作为使得中空纤维膜之间不接触的方法，可列举出在纤维束加入间隔纤维、使得中空纤维外侧的截面形成星形等复杂形状、使得纤维方向的形状形成波形等。

本发明中，以内压式错流使用中空纤维膜的情况下，膜内径越小则越容易得到高的剪切速率。另一方面，若膜内径过小则膜内腔其本身堵塞的危险性也升高，因此对于膜内径需要加以注意。考虑到该点的结果，本发明中，中空纤维的膜内径优选为100～500μm，进一步优选为200～350μm。详细如后文所述，中空纤维膜内径可以通过测定中空纤维膜外径和膜厚来求出。

中空纤维膜以内压错流过滤使用的情况下，单位膜面积的过滤流量B根据膜的有效长度而改变。膜的有效长度越长则单位膜面积的过滤流量越低，因此可以进一步抑制滤饼形成。但是，从血小板活性的观点考虑的情况下，膜的有效长度越长则停留于中空纤维内腔的时间、即血小板与膜表面的接触时间越长，因此血小板越容易活化。考虑到此的结果，本发明中，中空纤维膜的有效长度为5～50cm，进一步优选为20～35cm。

本发明中的有效长度指的是作为分离膜有效地发挥功能的部分的长度。因此，填充膜而制成组件的情况下，不包括膜被封装剂等掩埋而不能过滤的部分。若将中空纤维膜作为例子则中空纤维膜中有效地发挥功能的部分的纤维的长度相当于有效长度。另外，若将平膜作为例子则存在长和宽的长度，但是与流动血小板溶液的方向相同方向的长度相当于有效长度。

对于分离膜的原材料，若满足上述条件则没有限制，即使与膜接触、也不会使血小板活化的具有所谓血液相容性的原材料是合适的。作为原材料的例子，可列举出血液透析膜、血浆分离膜中使用的纤维素乙酸酯作为代表的再生纤维素、乙烯乙烯醇共聚物和聚砜等合成聚合物。

上述膜原材料中，特别是已知以聚砜、聚醚砜等所谓聚砜系聚合物作为主要原料的分离膜，透水性能、分离性能优异。本发明中，作为所使用的原材料，最优选为聚砜系聚合物。在此，“聚砜系聚合物”指的是其主链具有芳香环、磺酰基和醚基的聚合物。

作为聚砜系聚合物，可列举出例如通式(I)所示的聚砜、通式(II)所示的聚砜、聚醚砜和聚烯丙基醚砜等，它们之中，优选为通式(I)所示的聚砜和通式(II)所示的聚砜，进而更优选n数为50～80的聚砜。需要说明的是，通式(I)或(II)所示的聚砜与其它的单体的嵌段共聚物、通式(I)或(II)所示的聚砜的改性体也包含于“聚砜系聚合物”。通式(I)或(II)所示的聚砜与其它单体的嵌段共聚物中的源自“其它单体”的结构优选相对于全部嵌段共聚物、为10质量%以下。

[化学式1]

[化学式2]

另外已知，通过在膜原材料的聚合物混炼亲水性聚合物或者对膜表面修饰亲水性聚合物，可以制作血液相容性优异的膜。本发明中，优选分离膜中含有亲水性聚合物。“亲水性聚合物”指的是水溶性的聚合物化合物或者即使是非水溶性、通过静电相互作用、氢键也与水分子相互作用的高分子。在此，作为亲水性聚合物，可列举出例如聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮(以下“PVP”)，其中，优选为PVP。

对于能够作为亲水性聚合物物质添加的PVP，存在重均分子量为约6000(相当于K-15)～1200000(相当于K-90)的PVP。本发明中使用的情况下，PVP的重均分子量，为了提高亲水性而优选为10000以上，更优选为40000以上。

使用以聚砜系聚合物和亲水性聚合物作为主要原料的分离膜的情况下，与血小板溶液接触侧的最表层部分的亲水性聚合物的存在量优选为30～60质量%，进一步优选为50～60质量%。血小板溶液的情况下，若分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量为30质量%以上则由于膜表面的亲水性提高、血液相容性变得良好，因此可以令人满意地防止分离膜表面的血小板聚集、防止分离膜的分离性能的降低。另外，若分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量为50质量%以上则由于亲水性进一步升高，不易产生聚集，因此更优选。另一方面，通过将分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量抑制于60质量%以下，可以抑制在血小板溶液中溶出的亲水性聚合物的量，因此可以降低所溶出的亲水性聚合物的影响。

分离膜的最表层部分指的是以90°测定角通过X射线电子分光法(XPS)测定的范围。该方法中，具体而言，能够测定从表面直至深度为10nm(100Å)左右为止的亲水性聚合物存在量。例如在中空纤维膜的内侧通过血小板溶液的情况下，“分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量”可以通过调查中空纤维膜的内表面中的碳原子、氮原子等元素的存在比率来算出，详细如后文所述。

“在膜表面存在亲水性聚合物”指的是亲水性聚合物以某些形式停留于聚砜系分离膜的与血小板溶液接触的膜表面、或者非接触侧的膜表面的状态。例如包含亲水性聚合物与聚砜系分离膜的与血小板溶液接触的膜表面或者非接触侧的膜表面共价键合的方式，制膜工艺中在与血小板溶液的接触侧通过使用亲水性聚合物溶液而形成亲水性聚合物含量高的层的方式，通过事后的涂覆而形成亲水性聚合物的覆膜的方式等各种方式，只要满足上述与血小板溶液接触侧的膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量则可以为任意方式。

作为在膜表面存在亲水性聚合物的方法的具体例，可列举出以下的方法。由制膜原液进行湿式制膜的情况下，具有在表面为了防止熵损失而高分子量的聚合物聚集、并且为了防止焓损失而亲水性聚合物聚集的倾向。因此例如聚砜膜的情况下，若制成包含聚砜和亲水性聚合物的两种成分聚合物的原液则可以在表面浓缩亲水性聚合物原液，因此通过进行聚合，可以在膜表面局部存在亲水性聚合物。另外，分离膜为中空纤维膜的情况下，由双层环状喷嘴排出时向内侧流动注入液，可以向该注入液添加亲水性聚合物。若如此则中空纤维膜进行相分离，在确定膜结构之前，注入液中的亲水性聚合物扩散至制膜原液侧，因此可以在内表面局部存在亲水性聚合物。或者，另外也可以在制造中空纤维膜后用亲水性聚合物涂覆分离膜的功能层表面，该方法可以简便且合适地使用。涂覆后，也可以通过放射线、热处理等将亲水性聚合物与分离膜交联，由此可以更令人满意地抑制亲水性聚合物的溶出。另外，还可以通过化学反应使得亲水性聚合物和中空纤维膜固定化。

本发明的过滤步骤中，在上述式1所示的条件下，在适当的血小板溶液用分离组件(具体而言，可列举出安装有上述中空纤维等分离膜的柱子)中流动血小板溶液，由此从血小板溶液过滤、除去介质(主要是血浆)的一部分。由此，得到血小板在液体中浓缩了的浓缩血小板溶液。只要满足式1的条件则对浓缩的程度没有限定，通常使得血小板溶液的体积减少至数分之一～数十分之一左右来除去介质。

该浓缩步骤，作为可以抑制血小板的活化的同时以高的效率除去蛋白质的浓缩血小板溶液的制造方法或者血小板溶液的浓缩方法也是有用的。

浓缩步骤后，进行加入人工保存液的混合步骤，得到人工保存液置换血小板溶液。对人工保存液的添加量没有特别限定，可以根据所得到的人工保存液置换血小板溶液作为血小板制剂使用时的使用目的，以达到适当的血小板浓度的方式进行适当选择。通常，以达到原来的血小板溶液的四分之一左右～同等程度的体积的方式添加人工保存液。

在混合步骤之前，可以进行回收残留于分离膜上的血小板的回收步骤。进行回收步骤的情况下，使得过滤步骤中使用的分离膜与人工保存液接触，将残留于分离膜上的血小板与人工保存液一起回收，将在该人工保存液中含有血小板的含血小板的人工保存液用作混合步骤中的人工保存液。通过导入回收步骤，可以回收残留于流入血小板溶液侧的分离膜上以及分离膜的孔内的血小板，从而可以提高血小板回收率。

回收步骤中，使得过滤步骤中使用的分离膜与人工保存液接触，对与膜接触的方法没有特别限定。例如存在使得人工保存液不过滤于分离膜，使得所流入的血小板溶液接触侧的分离膜表面与人工保存液接触，将残留于分离膜上的血小板含有、回收于人工保存液中的方法；利用分离膜过滤人工保存液，将残留于孔内部的血小板含有、回收于人工保存液中的方法；利用分离膜将人工保存液错流过滤，由此将残留于分离膜表面以及孔内部的血浆除去到膜之外的同时将血小板溶解、回收于人工保存液中的方法等，可以使用任意一种方法，另外也可以将这些方法适当组合来进行。其中，优选为将人工保存液错流过滤来回收的方法，根据该方法，特别可以提高血小板回收率。

另外，回收步骤也可以改变在分离膜流动的人工保存液的流量的同时回收。

回收步骤中的剪切速率，优选控制流量从而处于与式1相同的剪切速率的范围内。对于单位膜面积的过滤流量，优选设定于过滤步骤中进行的流量以下的流量。通过单位面积的过滤流量与过滤步骤中的过滤流量同等或者为少的流量，可以不促进血小板的活化地在回收步骤中回收残留于分离膜表面和孔内部的血小板。进而，可以将所得到的人工保存液置换血小板溶液作为原液、再次进行同样的操作。为了提高蛋白质的除去率，优选进行重复操作。但是，若进行重复操作则血小板回收率降低，因此作为重复操作的次数，优选直至5次为止、进一步优选直至3次为止。

供于本发明的方法的血小板溶液、过滤步骤中得到的浓缩血小板溶液和回收步骤中得到的含血小板的人工保存液中分别含有的血小板数，可以通过公知的全自动血球测定仪(例如日本光电工业株式会社制的Celltac α(MEC-6318)等)测定。另外，血小板回收率可以通过下式算出。

血小板回收率(%)=(I＋J)/K×100 ・・・・式7

I：浓缩血小板溶液中含有的血小板数

J：含血小板的人工保存液中含有的血小板数

K：血小板溶液中含有的血小板数。

作为表示血小板活化的指标，可列举出CD62P阳性血小板比率。若血小板被源自外部的刺激等活化则CD62P转移到血小板的细胞膜表面而表达，因此可以通过表达了CD62P的血小板的比率来评价血小板活化的程度。CD62P阳性血小板比率，详细如后文所述，可以通过流式细胞仪测定。

另外，作为可以简便且短时间内掌握供于本发明的方法的血小板溶液和通过本发明的方法得到的人工保存液置换血小板溶液的品质的有用的方法，可列出涡旋(Swirling)检查。涡旋指的是若用光照亮装有含有血小板的溶液的容器并缓慢搅拌则发现涡旋状的图案的现象。没有活化的血小板的形态为圆盘状，因此通过搅拌，圆盘状血小板使光同样折射而产生光散射现象，观察到涡旋。另一方面，若由于活化而血小板的形态变化则不会产生光散射现象，涡旋降低、消失。

蛋白质浓度的测定中，可以直接利用公知的总蛋白质浓度的测定方法。作为总蛋白质浓度的测定方法，存在以紫外吸收法为代表的各种方法，经常利用显色法。若将显色法大致分类则分为以考马斯亮兰法为代表的利用蛋白质和显色色素的化学键合的方法、以二喹啉甲酸(BCA)法为代表的利用蛋白质存在下产生的还原铜离子的螯合物的方法。关于蛋白质浓度的测定方法没有特别限定，但是从精度的观点考虑，BCA法最合适。BCA法的详细如后文所述。

蛋白质除去率可以通过下式算出。

蛋白质除去率(%)={(O×U)-(V×W)}×100/(O×U) ・・式8

O：血小板溶液的蛋白质浓度(mg/mL)

U：血小板溶液液体量(mL)

V：人工保存液置换血小板溶液的蛋白质浓度(mg/mL)

W：人工保存液置换血小板溶液的液体量(mL)。

以下对各种参数的测定方法进行详细说明。

(1)透水性能测定

“膜的透水性能”可以通过以下的方法测定以及算出。平膜或中空纤维膜基本上都可以同样地通过下式9求出。例如中空纤维膜的情况下，向塑料管插入中空纤维膜，将中空纤维膜的两端粘接固定于塑料管两端部的内壁，制作有效长度10cm的组件。对于该组件，在与本发明的方法的过滤步骤中使用的情况相同的过滤方向施加压力、使水流动、进行过滤。例如从中空纤维膜的内侧向外侧过滤的情况下，由内侧施加1.3×10⁴ Pa的水压，测定流出到中空纤维膜的外侧的单位时间的水的量，通过下式算出“分离膜的透水性能”。

透水性能(mL/hr/Pa/m²)=QW/(T×P×X) ・・・・式9

QW：流出到中空纤维膜的外侧的水的量(mL)

T：施加水压的时间(hr)

P：水压(Pa)

X：中空纤维膜的内表面的面积(m²)。

使用平膜等与中空纤维不同形状的膜的情况，也同样地在塑料等主体(case)设置入口和出口。此时，以用膜堵塞路径从而没有通过膜以外的路径的方式来制成组件。由膜的一侧的表面向着相反侧的方向，由入口侧与上述记载的条件同样地施加1.3×10⁴ Pa的水压，测定由膜的另一侧的表面流出的单位时间的水量，通过上式，可以算出“分离膜的透水性能”。此时，上式9中的X为路径内与水接触的部分的分离膜的表面积(m²)，通常可以认为为路径的截面积。

(2)中空纤维膜内径测定

中空纤维膜内径Ri可以通过下式求出。

Ri(μm)=Ro-2×Y ・・・・式10

Ro：中空纤维膜外径(μm)

Y：中空纤维膜厚(μm)。

“中空纤维膜外径”为对于随机选择的多根(例如16根)中空纤维膜的外径利用激光位移计(例如可以使用LS5040T(株式会社KEYENCE)等)分别测得的值的平均值。“中空纤维膜厚”为对于随机选择的多根(例如16根)的中空纤维膜的膜厚使用micro-watcher的1000倍透镜(例如可以使用VH-Z100(株式会社KEYENCE)等)分别测得的值的平均值。

(3)膜表面的孔径以及开孔率测定

“存在于表面的孔的平均孔径”可以通过以下的方法测定以及算出。首先利用扫描型电子显微镜(例如可以使用S-800(日立制作所)等)拍摄分离膜的表面的10000倍图像。此时，图像的亮度、对比度使用装置的自动功能。接着使用公知的软件(例如可以使用Microsoft Paint(Microsoft Ltd.)等)，将孔的部分填充黑。然后，进行二值化，使用公知的软件(例如可以使用Matrox Inspector2.2(Matrox Electronic Systems Ltd.)等)，进行孔的部分反转为白色、除此以外的部分反转为黑色的图像处理，求出白色孔的个数(以下“总开孔数”)和白色孔的部分的像素数的总和(以下“总开孔面积”)，通过以下的式11，算出每一张图像的平均孔径。这些测定操作，例如对于5根中空纤维，分别随机10个部位、重复总计50次，得到对于全部50张图像的平均值，可以将其作为“存在于内表面的孔的平均孔径”。需要说明的是，将白和黑的二值化了的图像与原来的照片进行比较，进行孔是否偏移的确认。扫描型电子显微镜图像中，孔的内部也经常发现孔(参照图1的A)，此时最表面的孔优先进行图像处理(参照图1的B)，算出“存在于表面的孔的平均孔径”。另外，没有照出全部孔、端部中断的情况下，将照出图像的部位作为计算对象。进而，孔径不足0.05μm的孔，由于存在噪音的可能性，不作为计算对象。

平均孔径(μm)=总开孔面积/总开孔数・・・・式11。

需要说明的是，上述10000倍图像的拍摄条件例如可以如下所述。

[拍摄条件]

图像尺寸：655×740像素

图像分辨率：0.0143μm/像素

图像面积：93.0μm²(长9.37μm×宽9.93μm方形)。

过滤血小板溶液时，透水性能劣化小为宜。作为对透水性能造成大的影响的要素之一，可列举出分离膜表面的开孔率。膜表面的开孔率，通过与上述“存在于表面的孔的平均孔径”相同的方法测定，通过以下的式12，算出每1张图像的开孔率。这些测定操作，例如对于5根中空纤维，分别随机10个部位、重复总计50次，得到对于全部50张图像的平均值，可以将其作为“表面的开孔率”。

开孔率(%)=总开孔面积/图像尺寸×100・・・・式12。

(4)亲水性聚合物的存在率测定

露出与血小板溶液接触侧的膜表面，用超纯水冲洗后，室温、0.5Torr下干燥10小时得到的干燥物作为测定样品。将样品安装于X射线光电子分光装置(例如可以使用サーモフィッシャーサイエンティフィック社制的ESCALAB220i-XL等)，调整相对于X射线的入射角的检测器的角度，使测定角度为90°来进行测定。由所得到的C1s、N1s和S2p各自的光谱的面积强度、以及装置附属的相对灵敏度系数，求出从中空纤维膜的外表面直至约10nm的深度为止中的碳原子、氮原子和硫原子的比率。

在此，例如“与血小板溶液接触侧的膜表面中的亲水性聚合物”为PVP的情况下，使得测定角为90°来通过XPS进行测定，调查分离膜的与血小板溶液接触侧的从膜表面直至约10nm的深度为止中的碳原子、氮原子和硫原子的存在比率，通过以下的式13，可以算出分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量。

分离膜最表层部分的亲水性聚合物的存在量(质量%)=N×111/(N×111＋S×442)・・・式13

N：氮原子的存在比率

S：硫原子的存在比率

111：PVP的重复单元数

442：聚砜系聚合物的重复单元数。

(5)CD62P阳性血小板比率测定

使用流式细胞仪进行的CD62P阳性血小板比率的测定中，对于人工保存液置换血小板溶液在制造后5分钟以内进行取样，使用1%低聚甲醛/PBS溶液进行固定化，将固定化后12小时以上且1周以内的固定化完了的血小板用于测定试样。通过PBS洗涤测定试样，调整血小板数后，准备(i)加入有作为针对活化非依赖性的血小板特异标记的抗体的CD61抗体和对照IgG的样品、和(ii)加入有CD61抗体和CD62P抗体的样品。(i)和(ii)的样品，加入抗体之后，在暗处静置20分钟。然后，在(i)和(ii)的样品分别加入作为固定试剂的ベクトンディッキンソン社制CellFix用纯水稀释10倍而成的稀释物，静置一晚。然后，向各样品加入PBS在2000×g、10分钟的条件下进行离心，进行洗涤。对于测定，首先使用(i)的样品，利用流式细胞仪，除了利用散射光图案得到的血小板门(gate)之外，使用CD61的荧光标记对于血小板设门。进而然后，用对照IgG的荧光标记，使得血小板的0.5%～1.0%为阳性来设定截止线。在固定门和截止线的状态下将样品改变为(ii)并同样地进行测定，将超过截止线的血小板数的比率作为CD62P阳性血小板比率。

(6)使用了BCA法的蛋白质浓度测定

使用了BCA法的蛋白质浓度，若使用由各公司市售的BCA试剂盒则可以简便地测定。在5分钟以内对血小板溶液和人工保存液置换血小板溶液进行取样，使用由取样24小时以内的样品。对于测定样品，将取样了的血小板溶液和人工保存液置换血小板溶液在2000×g、10分钟的条件下进行离心分离，将除去了血小板的上清液作为测定样品。测定样品保存于4℃，测定在取样1周以内进行。对于测定，首先制造BCA试剂和标准曲线用的样品。根据试剂盒的说明书，对于标准曲线用样品或测定样品加入BCA试剂，室温下使用微混合器搅拌30秒。然后，在37℃下培养30分钟，将样品温度降低至室温后，测定波长562nm下的样品的吸光度。测定吸光度的波长，可以不严密相同，处于其附近的波长±20nm左右的范围内即可。由标准曲线样品，制作蛋白质浓度和吸光度的标准曲线，在标准曲线的式子代入测定样品的吸光度，由此可以求出测定样品的蛋白质浓度。

实施例

以下列举出实施例对本发明进行详细说明，但是本发明不被它们所限定。需要说明的是，透水性能、中空纤维膜内径、膜表面的孔径及开孔率、亲水性聚合物存在量、CD62P阳性血小板比率、以及蛋白质浓度的测定通过上述(1)～(6)中记载那样的方法实施。

(中空纤维膜的制造)

将包含15份的ユーデル(注册商标)聚砜(P3500、ソルベイ社)、8份的PVP(K90、ISP公司)、75份的二甲基乙酰胺(以下“DMAc”)和2份的水的混合物在90℃下混合溶解后，保温于50℃得到混合液，将该混合液作为制膜原液。另外，向包含80份的DMAC和20份的水的混合溶液加入30份的PVP(K30、ISP公司)并进行混合溶解，将所得到的溶液作为芯液。

使用外径1.0mm/内径0.7mm的孔(orifice)型双层圆筒型喷嘴，同时分别由外侧的筒排出制膜原液，由内侧的筒排出芯液，通过设定于30℃的长度80mm的干式部后，浸渍于加入有包含90份的水和10份的DMAC的混合溶液的90℃的凝固浴进行凝固，进而利用80℃的温水浴进行温水洗涤后，卷取于绞纱架，得到湿润状态的中空纤维膜。需要说明的是，制膜速度为40m/分钟时，中空纤维膜内径为300μm，中空纤维膜的膜厚为80μm。对于该中空纤维内表面，使用电场放射型扫描型电子显微镜S-800(日立制作所)拍摄10000倍图像。此时，图像的亮度、对照度使用装置的自动功能。接着使用Microsoft Paint(Microsoft Ltd.)，将孔的部分填充黑。进行二值化后，使用Matrox Inspector2.2(Matrox Electronic Systems Ltd.)，进行孔的部分反转为白色、除此以外的部分反转为黑色的图像处理，求出白色孔的个数和白色孔的部分的总开孔面积，通过式11，算出每1张图像的平均孔径。这些测定操作，对于5根中空纤维，分别随机10个部位、重复总计50次，得到对于全部50张图像的平均值。图1的A示出代表性的电子显微镜观察图像、图1的B示出代表性的将电子显微镜观察图像进行二值化处理而得到的图像。

将所得到的湿润状态的中空纤维膜切断、细分为0.4m的长度，在90℃的温水浴浸渍30分钟，进行温水洗涤后，100℃下进行10小时的干燥处理，进而通过干热干燥机，在170℃下进行5小时的加热交联处理，得到中空纤维膜。

(实施例1)

作为分离膜，使用由聚砜和PVP形成的中空纤维膜。

由中空纤维膜如下所述制作中空纤维膜组件(血小板溶液用分离膜组件)。首先向φ18×310mm的筒状的塑料组件插入通过上述制膜操作得到的 528根中空纤维膜的束，将其浸渍于60质量%甘油水溶液后，50℃下干燥一昼夜。接着，在安装于离心器的塑料组件的两端分别注入聚氨酯树脂即封装材料5mL，以60G/15分钟旋转(第一次封装)。在这15分钟后，进而在塑料组件的两端分别注入封装材料10mL，再次以60G/15分钟旋转(第二次封装)，制作中空纤维膜组件。

中空纤维膜内径为300μm、膜面积为0.144m²、透水性能为75mL/hr/Pa/m²、存在于内表面的开孔率为17.3%、孔的平均孔径为0.90μm、存在于内表面的亲水性聚合物的存在量为54.2%。

使用所制作的中空纤维膜组件，进行血小板溶液的过滤。具体而言，首先，向テルモ社制Salacet F(注册商标)746.2mL加入大冢制药社制Meylon(注册商标) 52.2mL、テルモ社制ACD-A液126.8mL、大冢制药社制硫酸Mg补正液(1mEq/ml)3.2mL、大冢制药社制蒸馏水71.6mL，并进行混合，制造M-sol作为人工保存液。另外，预先测定原来的血小板溶液中的血小板数。

对于含有血小板2.0×10¹¹个的血小板溶液600mL(血小板浓度为33×10⁷个/mL)，使用血液泵并设定于67.2mL/min，施加内压进行错流过滤(过滤步骤)。血小板溶液的粘度为1.6mPa･s。另外，此时的过滤速度为60.5mL/min、入口壁面剪切速率为800秒^-1、单位面积的过滤流量为60.5×60(mL/hr)÷0.144(m²)=25208mL/hr/m²、TMP为3.0×10³Pa。

通过该处理，血小板溶液通过中空纤维内侧而被过滤，得到浓缩血小板溶液60mL(过滤步骤)。然后，在中空纤维内侧以67.2mL/min流动M-sol，回收溶解有血小板的人工保存液(回收步骤)。接着，将该人工保存液与浓缩血小板溶液混合，制造成200mL的人工保存液置换血小板溶液(混合步骤)。所得到的人工保存液置换血小板溶液，由原来的血小板溶液除去了87%的血浆蛋白质。血小板回收率为93%、人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为10%、还观察到了涡旋。

(实施例2)

作为分离膜，使用由聚砜和PVP形成的中空纤维膜。

由中空纤维膜如下所述制作中空纤维膜组件(血小板溶液用分离膜组件)。首先向φ10×220mm的筒状的塑料组件插入通过上述制膜操作得到的 50根中空纤维膜的束，将其浸渍于60质量%甘油水溶液后，50℃下干燥一昼夜。接着，在安装于离心器的塑料组件的两端分别注入聚氨酯树脂即封装材料0.5mL，以60G/15分钟旋转(第一次封装)。在这15分钟后，进而在塑料组件的两端分别注入封装材料1.7mL，再次以60G/15分钟旋转(第二次封装)，制作中空纤维膜组件。

中空纤维膜内径为300μm、膜面积为0.0094m²、透水性能为75mL/hr/Pa/m²、存在于内表面的开孔率为17.3%、孔的平均孔径为0.90μm、存在于内表面的亲水性聚合物的存在量为54.2%。

使用所制作的中空纤维膜组件，进行血小板溶液的过滤。具体而言，首先，向テルモ社制Salacet F 746.2mL加入大冢制药社制Meylon 52.2mL、テルモ社制ACD-A液126.8mL、大冢制药社制硫酸Mg补正液(1mEq/ml)3.2mL、大冢制药社制蒸馏水71.6mL，并进行混合，制造M-sol作为人工保存液。另外，预先测定原来的血小板溶液中的血小板数。

对于含有血小板1.78×10¹⁰个的血小板溶液16.2mL(血小板浓度为110×10⁷个/mL)，使用血液泵并设定于3.2mL/min，施加内压进行错流过滤(过滤步骤)。血小板溶液的粘度为1.9mPa･s。另外，此时的过滤速度为2.5mL/min、入口壁面剪切速率为400秒^-1、单位面积的过滤流量为2.5×60(mL/hr)÷0.0094(m²)=15957mL/hr/m²、TMP为4.5×10³Pa。

通过该处理，血小板溶液通过中空纤维内侧而被过滤，得到浓缩血小板溶液3.24mL。然后，在中空纤维内侧以3.2mL/min流动M-sol，回收溶解有血小板的人工保存液(回收步骤)。接着，将该人工保存液与浓缩血小板溶液混合，制造成16.2mL的人工保存液置换血小板溶液(混合步骤)。所得到的人工保存液置换血小板溶液，由原来的血小板溶液除去了73%的血浆蛋白质。血小板回收率为94%、人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为30%、还观察到了涡旋。

(实施例3)

作为分离膜，使用与实施例1相同的由聚砜和PVP形成的中空纤维膜。另外，与实施例1同样地制作中空纤维膜组件。

对于含有血小板2.0×10¹¹个的血小板溶液200mL(血小板浓度为100×10⁷个/mL)，使用血液泵并设定于7.5mL/min，施加内压进行错流过滤(过滤步骤)。血小板溶液的粘度为1.9mPa･s。另外，此时的过滤速度为6.0mL/min、入口壁面剪切速率为100秒^-1、单位面积的过滤流量为6.0×60(mL/hr)÷0.144(m²)=2500mL/hr/m²、TMP为5.0×10²Pa。

通过该处理，血小板溶液通过中空纤维内侧而被过滤，得到浓缩血小板溶液80mL(过滤步骤)。然后，在中空纤维内侧以7.5mL/min流动M-sol，回收溶解有血小板的人工保存液(回收步骤)。接着，将该人工保存液与浓缩血小板溶液混合，制造成200mL的人工保存液置换血小板溶液(混合步骤)。所得到的人工保存液置换血小板溶液，由原来的血小板溶液除去了76%的血浆蛋白质。血小板回收率为95%、人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为20%、还观察到了涡旋。

(比较例1)

作为分离膜，使用由聚砜和PVP形成的中空纤维膜。

对于含有血小板1.78×10¹⁰个的血小板溶液16.2mL(血小板浓度为110×10⁷个/mL)，使用血液泵并设定于15.9mL/min，施加内压进行错流过滤(过滤步骤)。血小板溶液的粘度为1.9mPa･s。另外，此时的过滤速度为12.7mL/min、入口壁面剪切速率为2000秒^-1、单位面积的过滤流量为12.7×60(mL/hr)÷0.0094(m²)=81063mL/hr/m²、TMP为7.0×10³Pa。

通过该处理，血小板溶液通过中空纤维内侧而被过滤，得到浓缩血小板溶液4.2mL。然后，在中空纤维内侧以15.9mL/min流动M-sol，回收溶解有血小板的人工保存液(回收步骤)。接着，将该人工保存液与浓缩血小板溶液混合，制造成16.2mL的人工保存液置换血小板溶液(混合步骤)。所得到的血小板制剂，由原来的血小板制剂除去了61%的血浆蛋白质。血小板回收率为86%、人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为65%、不能观察到涡旋。虽然(A×B)/(γ×μ_P)的值没有超过2.5×10¹³，但是入口壁面剪切速率超过，因此血小板的活性增大，结果血小板大量附着于膜，认为由于堵塞而蛋白质除去率降低。

(比较例2)

作为分离膜，使用由聚砜和PVP形成的中空纤维膜。

由中空纤维膜如下所述制作中空纤维膜组件(血小板溶液用分离膜组件)。首先向φ10×120mm的筒状的塑料组件插入通过上述制膜操作得到的 50根中空纤维膜的束，将其浸渍于60质量%甘油水溶液后，50℃下干燥一昼夜。接着，在安装于离心器的塑料组件的两端分别注入聚氨酯树脂即封装材料0.5mL，以60G/15分钟旋转(第一次封装)。在这15分钟后，进而在塑料组件的两端分别注入封装材料1.7mL，再次以60G/15分钟旋转(第二次封装)，制作中空纤维膜组件。

中空纤维膜内径为300μm、膜面积为0.0047m²、透水性能为75mL/hr/Pa/m²、存在于内表面的开孔率为17.3%、孔的平均孔径为0.90μm、存在于内表面的亲水性聚合物的存在量为54.2%。

对于含有血小板8.9×10⁹个的血小板溶液8.1mL(血小板浓度为110×10⁷个/mL)，使用血液泵并设定于5.6mL/min，施加内压进行错流过滤(过滤步骤)。血小板溶液的粘度为1.9mPa･s。另外，此时的过滤速度为3.9mL/min、入口壁面剪切速率为700秒^-1、单位面积的过滤流量为3.9×60(mL/hr)÷0.0047(m²)=49787mL/hr/m²、TMP为1.0×10⁴Pa。

通过该处理，血小板溶液通过中空纤维内侧而被过滤，得到浓缩血小板溶液4.1mL。然后，在中空纤维内侧以5.6mL/min流动M-sol，回收溶解有血小板的人工保存液(回收步骤)。接着，将该人工保存液与浓缩血小板溶液混合，制造成8.1mL的人工保存液置换血小板溶液(混合步骤)。所得到的血小板制剂，由原来的血小板制剂除去了40%的血浆蛋白质。血小板回收率为60%、人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为45%、不能观察到涡旋。可以推测这是由于，虽然入口壁面剪切速率低，但是(A×B)/(γ×μ_P)的值超过2.5×10¹³，因此形成滤饼层，蛋白质的除去率和血小板回收率降低。进而推测，由于形成滤饼层，血小板以某种程度活化。

上述实施例和比较例的各种数值数据汇总示于表1。

Claims

1.人工保存液置换血小板溶液的制造方法，其具备：

在下述式1的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对所述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤；和

将所述浓缩血小板溶液与人工保存液混合、得到人工保存液置换血小板溶液的混合步骤，

1.0×10¹¹<(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr･m²･Pa)) …式1

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。

2.人工保存液置换血小板溶液的制造方法，其具备：

在下述式1的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对所述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤；

使人工保存液与所述分离膜接触，将在所述过滤步骤中未回收于浓缩血小板溶液中的血小板回收于所述人工保存液中，得到含血小板的人工保存液的回收步骤；和

将所述浓缩血小板溶液与所述含血小板的人工保存液混合、得到人工保存液置换血小板溶液的混合步骤，

1.0×10¹¹<(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr･m²･Pa)) …式1

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。

3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，蛋白质除去率为60%以上，并且人工保存液置换血小板溶液的CD62P阳性血小板比率为60%以下。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述过滤步骤中的膜间压力差为5.0×10³ Pa以下。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述分离膜的透水性能为35～150mL/hr/m²/Pa。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述分离膜为中空纤维膜。

7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，所述错流过滤为内压式错流过滤。

8.根据权利要求6或7所述的制造方法，其中，所述中空纤维膜的内径为100～500μm。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的制造方法，其中，所述中空纤维膜的有效长度为5～50cm。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，所述分离膜含有亲水性聚合物，对所述分离膜与血小板溶液接触的面以测定角90°通过X射线电子分光法进行测定时的所述亲水性聚合物的存在量为30～60质量%。

11.浓缩血小板溶液的制造方法，其具备：

在下述式1的条件下，使用与血小板溶液接触的面的平均孔径为0.1μm以上且不足2.0μm的分离膜，以25～1500s^-1的入口壁面剪切速率对所述血小板溶液进行错流过滤，得到浓缩血小板溶液的过滤步骤，

1.0×10¹¹<(A×B)/(γ×μ_P)≤2.5×10¹³(个/(hr･m²･Pa)) …式1

A ：血小板溶液中含有的血小板浓度(个/mL，其中，8.0×10⁷～200×10⁷个/mL)

B ：单位面积的过滤流量(mL/hr/m²)

γ：入口壁面剪切速率(s^-1)

μ_P：血小板溶液的粘度(Pa･s)。