CN104404074A

CN104404074A - 口蹄疫病毒衣壳蛋白串联共表达和病毒样颗粒的制备方法

Info

Publication number: CN104404074A
Application number: CN201410609214.9A
Authority: CN
Inventors: 袁于人
Original assignee: Bio Technology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Bio Technology (suzhou) Co Ltd
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104404074B

Abstract

本发明涉及大肠杆菌来源的以单个质粒串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0(其为VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3，以及口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的制备方法。口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒可以用于口蹄疫疫苗的制备。本发明提供的方法，从多个方面对大肠杆菌可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白进行了研究，综合运用串联共表达和带SUMO标签的技术可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0(其为VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3，最终获得的目的蛋白占到菌体总蛋白的约20％，纯化获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白成功组装成病毒样颗粒。

Description

口蹄疫病毒衣壳蛋白串联共表达和病毒样颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒衣壳蛋白基因及载体、菌株及其表达方法，和含该病毒样颗粒的疫苗及其在预防口蹄疫感染的用途。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患病，个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。口蹄疫症状表现为蹄冠、趾间、蹄踵皮肤发生水泡和烂斑，部分动物口腔黏膜和鼻盘也有同样病变。口蹄疫的传染性极强，传播迅速，感染和发病率很高，可引起大量死亡，造成严重的经济损失，在国际上被划分为一类烈性传染病。在上世纪50-60年代英、法等国都曾爆发过大规模的口蹄疫疫情。在中国也出现过多次大规模流行，成为畜牧业的“头号杀手”。

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型(O、A、C、SAT1(南非1)、SAT2(南非2)、SAT3(南非3)和Asia1(亚洲1型)，65个亚型，各型之间无交叉保护反应，感染了一个血清型的口蹄疫的动物仍可感染另一血清型的口蹄疫病毒。FMDV基因组RNA全长约8.5kb，依次为5’UTR、ORF和3’UTR组成。期中ORF约6.5kb长，由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及其始密码子和终止密码子组成。口蹄疫病毒病毒外壳为对称的20面体，由衣壳蛋白VP1，VP2，VP3和VP4组成。这些衣壳蛋白决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力。

目前英美等发达国家都已全面消灭了口蹄疫。在中国，口蹄疫疫苗被列为强制免疫品种，执行严格的疫苗质量标准。在我国主要有三种口蹄疫病毒亚型流行：亚洲I型、A型、和O型。

目前，中国市场上占主导地位的是针对O型和亚洲I型的传统灭活苗。灭活疫苗等传统疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制口蹄疫的过程中发挥着重要作用。但由于灭活疫苗存在病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸等不安全因素，灭活疫苗中残存的活病毒有可能会造成口蹄疫病毒的泛滥。

理想的口蹄疫疫苗必须安全、有效、同时还应具备价廉、易于推广等优点。口蹄疫灭活疫苗除了存在潜在的不安全性影响其使用外，灭活疫苗的高制备成本限制了该疫苗的推广。因此研制生产保护性和安全性俱佳的口蹄疫基因工程疫苗，同时可以根据需要制备多价病毒疫苗，大幅度节约生产成本成为口蹄疫疫苗研发的主要方向。

基因工程技术为基础的以病毒样颗粒为主的基因工程疫苗已经成功运用于现代疫苗的研发与生产。但是基因工程疫苗通常采用真核表达系统。生产成本偏高，不适合大规模推广。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高的显著特点，因此被广泛应用于生物制药行业中。糖基化修饰是真核表达系统和原核表达系统的主要区别之一，但是没有报道提到口蹄疫病毒的衣壳蛋白，包括VP1，VP2，VP3和VP4，含有任何糖基化位点，因此用两种系统表达的衣壳蛋白在糖基化修饰方面并没有区别。口蹄疫病毒的外壳是由4个衣壳蛋白有规律的组装成的20面体。大量的研究表明，在大肠杆菌中单独表达口蹄疫病毒外壳蛋白或用不同质粒共转染大肠杆菌获得的基因工程菌，表达的口蹄疫病毒外壳蛋白表达量非常低而且常常不可溶，失去了大规模商业应用的可能。

综上所述，针对口蹄疫的防治需要，迫切需要建立一种生产周期短，生产成本低，蛋白产量高的大肠杆菌来源的口蹄疫病毒衣壳蛋白串联可溶共表达和病毒样颗粒的制备方法，本发明因此而来。

发明内容

本发明所要解决的第一方面的技术问题，在于克服现有技术中口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达量非常低而且不可溶的情况，提供一种在大肠杆菌中串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)，最终获得的目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的20％。

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种串联可溶共表达口蹄疫衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)和病毒样颗粒组装制备方法，包括如下步骤。

(1)将经过密码子优化的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0基因(VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3的全长基因分别克隆入质粒pETSUMO，分别获得pETSUMO-VP0，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP3三个质粒，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0核苷酸序列如Seq ID No.1a所示，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列如Seq ID No.1b所示，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3的核苷酸序列如Seq ID No.1c所示；

(2)用PCR方法从pETSUMO-VP3，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP0三个质粒中分别扩增出RBS-SUMO-VP3，RBS-SUMO-VP1和RBS-SUMO-VP0 DNA片段，按一定顺序克隆入同一个pET28b质粒，获得重组表达质粒pET-TRI-Asia1-VP310，其中RBS指核糖体结合位点；

(3)将所述重组表达质粒pET-TRI-Asia1-VP310转化大肠杆菌，获得基因工程菌；

(4)所述基因工程菌进行发酵培养，IPTG诱导串联可溶共表达带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)；

(5)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，色谱层析分离纯化带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0混合物，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0的氨基酸序列如Seq ID No.2a所示，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如Seq ID No.2b所示，口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3的氨基酸序列如Seq ID No.2c所示；

(6)酶切去除SUMO标签后，分子筛色谱层析分离纯化获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0组装成病毒样颗粒。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(2)所述重组表达质粒串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0，VP1和VP3。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(3)所述基因工程菌为BL21(DE3)/pET-TRI-Asia1-VP310。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(3)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(4)所述基因工程菌串联可溶共表达带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(5)所述分离纯化的蛋白是带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)的混合物。

本发明的另一方面，提供了一种含有权利要求1步骤(6)所述分离纯化的酶切去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)的混合物。

本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP0(VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3)组成的病毒样颗粒。

本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备用于预防口蹄疫感染的疫苗，其包括：前述组装得到的口蹄疫病毒样颗粒，及疫苗用赋形剂或载体。本发明的另一方面为使用本发明所述方法构建的基因工程菌，其特点在于，所述基因工程菌串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3基因，VP1基因和VP0基因(为VP4和VP2的基因融合)；VP0核苷酸序列如SeqID No.1a所示；VP1基因核苷酸序列如SeqID No.1b所示；VP3基因核苷酸序列如SeqID No.1c所示。

本发明提供一种基于大肠杆菌来源的串联可溶共表达在中国流行的口蹄疫病毒的衣壳蛋白的高效方法。基于本实验室的技术，从多个方面对大肠杆菌可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白进行了研究，综合运用串联共表达和带SUMO标签的技术可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)，最终获得的目的蛋白占到菌体总蛋白的约20％。然后通过色谱层析分离获得带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0，酶切去除SUMO标签后，色谱层析分离纯化获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0组装成病毒样颗粒。

色谱层析分离方法条件温和，没有使用诸如尿素等变性剂，目的蛋白的活性得到了最大程度的保护，对蛋白质的结构没造成破坏，这保证了纯化获得的口蹄疫衣壳蛋白保持了天然活性，各口蹄疫衣壳蛋白之间最大程度保持了天然的结合活性。而且，在色谱纯化过程中，整个工艺流程简单，无需进行缓冲液置换等步骤，不需要使用超离心等复杂工艺，并且两步色谱的回收接近30％，使得以工业化规模可溶性表达纯化口蹄疫病毒衣壳蛋白成为可能，而且整个工艺过程中，均未涉及到变性剂，纯化过程和组装过程均不会对蛋白的构象产生影响和破坏病毒样颗粒的中和表位，这样生产的病毒样颗粒具有高度的免疫原性，免疫机体后会诱导产生高滴度的中和抗体，对免疫动物起到很好的保护性效果。

本发明的技术方案为在大肠杆菌中串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)，并在此基础上，建立了一套高效、适宜放大的口蹄疫疫苗中试生产工艺。建立了一套口蹄疫疫苗质量研究体系，并通过动物实验对大肠杆菌来源的口蹄疫疫苗的有效性，稳定性进行了评价。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。优选BL21(DE3)。

根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“串联共表达”一词指的是把多个基因插入到同一个载体中共表达。串联共表达顺序包括但不限于VP3，VP1，VP0(为VP4和VP2的基因融合)之间的各种可能组合以及VP1,VP2，VP3，VP4之间的各种可能组合，例如可以是VP1-VP3-VP0的串联顺序，VP3-VP0-VP1的串联顺序，VP1-VP0-VP3的串联顺序，VP3-VP1-VP2-VP4的串联顺序，VP1-VP2-VP3-VP4的串联顺序等等，优选VP3-VP1-VP0的串联顺序。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于:Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。

根据本发明，在本发明获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现。

根据本发明，在本发明获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄中的一种或几种。优选NaCl。

根据本发明，口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒如下获得：将酶切去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)的蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的口蹄疫衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)的蛋白溶液。口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒组装的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。

根据本发明，本发明获得的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)包括来源于蛋白序列高度相似的不同口蹄疫病毒血清型，亚型，突变株的衣壳蛋白VP0(为VP4和VP2的基因融合)，VP1和VP3，以及这些蛋白的蛋白片段。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步描述：

图1为本发明带SUMO标签表达的口蹄疫衣壳蛋白VP3，VP1和VP0(VP4和VP2的基因融合)的SDS-PAGE结果。M:分子量Marker；1：诱导前全菌；2：诱导后裂解全菌后的上清；结果显示，口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中以带SUMO标签的方式可溶共表达，且目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的20％左右。

图2为带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白经过亲和色谱纯化后的SDS-PAGE结果。M:分子量Marker；1，经本发明纯化所得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白上样2μl；2，经本发明纯化所得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白上样3μl。结果显示，经过纯化的带SUMO标签的口蹄疫衣壳蛋白上样纯度达到了70％以上。

图3为带SUMO标签的口蹄疫衣壳蛋白，经酶切去除SUMO标签后分子筛色谱纯化的SDS-PAGE结果。1，经本发明纯化所得口蹄疫病毒衣壳蛋白上样1μl；2，经本发明纯化所得口蹄疫病毒衣壳蛋白上样2μl。结果显示，经过纯化的口蹄疫病毒衣壳蛋白纯度达到了90％以上。

图4为本发明所得的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒透射电镜观察结果。视野中可见大量均匀半径为15nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。

图5为本发明所得的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的水化分子动力学半径为23.37nm，颗粒组装百分比约为100％。

图6为本发明所得的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒接种小鼠后不同阶段血清总抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一月后，总抗滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到10⁷的高水平。

序列表说明：

Seq ID No.1a为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP0基因(VP4和VP2的基因融合)的核苷酸序列。

Seq ID No.1b为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP1基因的核苷酸序列。

Seq ID No.1c为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP3基因的核苷酸序列。

Seq ID No.2a为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP0基因(VP4和VP2的基因融合)对应的氨基酸序列。

Seq ID No.2b为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP1基因对应的氨基酸序列。

Seq ID No.2c为本发明口蹄疫衣壳蛋白VP3基因对应的氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

材料及试剂：本发明中涉及基因合成的由上海博亚生物技术有限公司合成，pETSUMO质粒购于Invitrogen公司，50L发酵罐购于上海保兴生物公司，其它试剂及药品为普通市售产品。pET28b质粒购自购于Novagen公司，大肠杆菌BL21(DE3)购自New England Biolabs。

实施例1：具有序列1(1a，1b，1c)的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0(VP4和VP2的基因融合)串联可溶共表达

1.1用做模板之口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1，VP0基因片段的制备

经过大肠杆菌密码子优化的口蹄疫病毒衣壳蛋白基因全长(VP3，VP1，VP0)由苏州金唯智生物科技有限公司合成。所合成的基因片段全长分别为909 bp(VP0)，657 bp(VP3)，627 bp(VP1)。在此人工合成的口蹄疫病毒衣壳蛋白基因片段的基础上制备本发明口蹄疫病毒衣壳蛋白的模板。

1.2带SUMO标签口蹄疫病毒衣壳蛋白基因(VP3，VP1，VP0)串联共表达载体的构建

以前一步骤所合成的口蹄疫病毒衣壳蛋白基因全长(VP3，VP1，VP0)基因片段分别用做PCR反应的模板。以Asia1-VP0F为正向引物，以Asia1-VP0R为反向引物，以VP0为PCR模板扩增获得口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0基因；以Asia1-VP1F为正向引物，以Asia1-VP1R为反向引物，以VP1为PCR模板扩增获得口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1基因；以Asia1-VP3F为正向引物，以Asia1-VP3R为反向引物，以VP3为PCR模板扩增获得口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3基因。正向引物的5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，其中BamHI位点序列为GGATCC；反向引物的5’端引入限制性内切酶Not I位点，两个终止密码子及保护性碱基，其中Not I位点序列为GCGGCCGC。在PCR仪按照如下条件进行PCR反应：

扩增得到的DNA片段，经BamH I/Not I酶切消化后得到的片段，与经过相同酶切的pETSUMO载体连接，分别得到插入口蹄疫病毒衣壳蛋白基因的阳性克隆pETSUMO-VP3，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP0。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的DH5a感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。

以Infusion-F：5’-CAATTCCCCTCTAGAAATA-3’为正向引物和Infusion-R：5’-CAGCCAACTCAGCTTCCTT-3’为反向引物，分别以pETSUMO-VP3，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP0作为PCR模板，扩增获得适合于In-fusion克隆技术的带核糖体结合位点的SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白RBS-SUMO-VP3，RBS-SUMO-VP1和RBS-SUMO-VP0 DNA片段。将上述片段以In-fusion克隆技术，按顺序克隆入同一个pET28b载体，得到阳性克隆pET-TRI-Asia1-VP310。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的DH5a感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。

将上述pET-TRI-Asia1-VP310质粒转化到40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃230转/分振荡培养12小时，从中取1mL菌液于-80℃冻干保存。

1.3口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)的串联共表达

从-80℃中取出带有重组质粒pET-TRI-Asia1-VP310的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，250rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃大量表达，等OD₆₀₀值达到0.8后，加入0.4mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。

主要仪器，上海保兴生物公司50升发酵罐

校正发酵罐pH电极，配制30升培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。

第二天将10瓶种子液5升接入发酵罐中，温度30℃，pH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。

流加补料，将50％葡萄糖和30％酪蛋白水解物按溶质质量比2：1的比例混合。

流加速度如下：

100％速度为25ml/min

第一小时：5％速度；

第二小时：10％速度；

第三小时：20％速度；

第四小时：40％速度；

第五小时以后60％速度。

培养至菌浓度达到OD₆₀₀大约10左右时将培养温度降至25℃加入16gIPTG诱导培养12小时。终浓度大约为45左右(OD₆₀₀)下罐，离心收集菌体大约3.0kg。

LB培养基配方如下(1升)：蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g。

实施例2：带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)的亲和色谱纯化制备

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬菌体，采用均质机以700bar压力破碎菌体4次。JA-14转头13500rpm(28000g)，离心35min，留取上清，通过15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)的纯度约为20％。上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用HisTrap FF柱子(GE Healthcare Life Sciences)做色谱纯化。

仪器系统：GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA纯化制备型液相色谱系统。

层析介质：Ni Sepharose。

柱体积：5ml。

缓冲液：20mM磷酸缓冲液pH8.0，0.2M NaCl；

洗脱液：20mM磷酸缓冲液pH8.0，0.2M NaCl+300mM咪唑。

流速：5 ml/min。

检测器波长：280nm。

样品为3L经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经匀浆机破碎后的大肠杆菌菌体上清。

洗脱程序为：穿透后，缓冲液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)产物，共获得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)样品900mL。

取经本实施例方法纯化的样品20μl，加入5×Loading Buffer 5μl混匀，于80℃水浴10min后取1μl和2μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以240V电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为2mg/ml，SDS-PAGE考染纯度约为70％。

实施例3：去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)的分子筛色谱纯化

收集实施例2获得共获得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)样品在4°酶切12小时后进行下一步的分子筛色谱纯化。

层析介质：HiLoad 26/60 Superdex 200。

柱体积：2.6×60 cm，318 ml。

洗脱液：20mM磷酸缓冲液pH8.0，0.2M NaCl。

流速：5 ml/min。

检测器波长：280nm。

样品为900mL去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)蛋白溶液。

洗脱程序为：穿透后，500mL洗脱液洗脱产物，共获得口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)纯化样品约50mL。

取经本实施例方法纯化的口蹄疫衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)样品20μl，加入5×Loading Buffer 5μl混匀，于80℃水浴10min后分别取1μl和2μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以240V电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图3。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为1.5mg/ml，SDS-PAGE考染纯度大于90％。

实施例4：口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的形态学检测及其免疫原性测定口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒透射电镜观察

仪器为FEI透射电镜，放大倍数为42,000倍。口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒用快速冷冻技术固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图4，可见实施例4所得样品大量半径约为15 nm左右的病毒样颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。

口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒颗粒动态光散射观察

仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器)，使用算法为Regulation算法。样品为实施例3所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图5。结果显示口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒颗粒的水化分子动力学半径为23.37nm。

实施例5 口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒疫苗免疫动物的免疫保护性评价

小鼠：普通级，雌性，6～8周龄。实施例3所制备的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100ug/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。测量结果见图6。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.口蹄疫病毒衣壳蛋白串联可溶共表达的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将经过密码子优化的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0基因，VP1和VP3的全长基因分别克隆入质粒pETSUMO，分别获得pETSUMO-VP0，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP3三个质粒，其中VP0基因为VP4和VP2的基因融合而成，其核苷酸序列如Seq ID No.1a所示，VP1基因的核苷酸序列如Seq ID No.1b所示，VP3基因的核苷酸序列如Seq ID No.1c所示；

(2)用PCR方法从pETSUMO-VP3，pETSUMO-VP1和pETSUMO-VP0三个质粒中分别扩增出RBS-SUMO-VP3，RBS-SUMO-VP1和RBS-SUMO-VP0DNA片段，按一定顺序克隆入同一个pET28b质粒，获得重组表达质粒pET-TRI-Asia1-VP310，其中RBS指核糖体结合位点；

(4)所述基因工程菌进行发酵培养，IPTG诱导串联可溶共表达带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0；

(5)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，亲和色谱层析分离纯化带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0蛋白混合物；

(6)酶切去除SUMO标签后，分子筛色谱层析分离纯化获得口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0蛋白混合物，并组装成病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)在所述重组表达质粒中串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白基因VP3，VP1和VP0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述基因工程菌为BL21(DE3)/pET-TRI-Asia1-VP310。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)在所述基因工程菌中串联可溶共表达带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白为VP3，VP1和VP0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述分离纯化获得的蛋白是带有SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0的蛋白混合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述分离纯化获得的蛋白是酶切去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3，VP1和VP0的蛋白混合物。

8.由权利要求1-7任意一项所述方法制备得到口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0，VP1和VP3组成的病毒样颗粒，所述VP0蛋白为VP4和VP2的基因融合表达产物，VP0氨基酸序列如SeqID No.2a2所示，VP1氨基酸序列如SeqID No.2b所示，VP3氨基酸序列如SeqID No.2c所示。

9.一种用于预防口蹄疫感染的疫苗，其包括：权利要求8的口蹄疫病毒样颗粒，及疫苗用赋形剂或载体。

10.一种由权利要求1-5任意一项所述方法构建得到的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌串联可溶共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP3基因，VP1基因和VP0基因；所述VP0基因为VP4和VP2的基因融合，其核苷酸序列如SeqID No.1a所示；VP1基因核苷酸序列如SeqID No.1b所示；VP3基因核苷酸序列如SeqID No.1c所示。