CN106148358A

CN106148358A - 一种利用大肠杆菌表达系统制备猪细小病毒病毒样颗粒亚单位疫苗的方法及应用

Info

Publication number: CN106148358A
Application number: CN201610557798.9A
Authority: CN
Inventors: 张改平; 刘运超; 王爱萍; 陈玉梅; 邢广旭; 姬鹏超; 刘文英; 王娟; 冯景; 刘东民; 邓瑞广
Original assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Zhongze Biological Engineering Co ltd; Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明公开了一种猪细小病毒VP2蛋白的编码基因、原核表达VP2蛋白病毒样颗粒的方法及其在疫苗制备中的应用。对序列进行优化，人工合成VP2基因，将合成的基因插入pET28a载体，然后和伴侣蛋白质粒共转入BL21(DE3)宿主菌中，使VP2蛋白和伴侣蛋白共表达，以促进VP2蛋白的正确折叠。实验证明，通过该重组菌表达的VP2蛋白能在体外实现自组装，且具有良好的免疫原性。使用由本发明表达的VP2蛋白制备的病毒样颗粒亚单位疫苗免疫小鼠和豚鼠能够诱导高水平的血凝抑制抗体和中和抗体产生，而且此疫苗能够预防豚鼠免受猪细小病毒强毒的感染。采用本发明的重组菌能够高效制备猪细小病毒病毒样颗粒，生产成本低、操作简单、具有更好的生物安全性。

Description

一种利用大肠杆菌表达系统制备猪细小病毒病毒样颗粒亚单位疫苗的方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种猪细小病毒VP2蛋白可溶性表达的方法、编码基因，还涉及一种猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，以及该病毒样颗粒作为亚单位疫苗的应用。

背景技术

猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）是引起猪繁殖障碍的主要病因之一，其主要特征为引起初产母猪发生流产、死胎、木乃伊胎以及引起新生仔猪的死亡。自1966年Mayr和Mahnel发现和证实PPV存在及其致病性以来，国内外学者对其进行了广泛深入的研究。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到了PPV。此后，在各地陆续分离到了数株PPV，虽然不同分离株均属于同一血清型，但可以引起多种临床症状，且都以造成繁殖障碍为主。另外，猪细小病毒经常与其它一些病毒，例如猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等混合感染，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎、呼吸道综合征等。目前，我国经产母猪及种公猪PPV阳性率高达80%以上。

PPV属于细小病毒科，细小病毒属，PPV的基因组为单股负链DNA，共编码3种结构蛋白：VP1、VP2和VP3，3种非结构蛋白：NS1、NS2和NS3。其中的VP2蛋白是该病毒主要的衣壳蛋白，具有自我组装为病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）的能力，是良好的抗原转运载体，同时也有很好的免疫原性，可有效诱导动物机体产生免疫反应。

许多研究和临床实践表明疫苗免疫是控制PPV流行的一个非常有效的方法，猪体免疫后主要通过体液免疫反应来抵抗PPV感染。我国用于预防PPV的疫苗主要为灭活疫苗，PPV灭活疫苗虽然可以有效的保护猪体免受PPV的感染，但存在生产成本高、病毒灭活不完全、且免疫效果不稳定等缺点；另外，灭活剂和残留病毒DNA可能对免疫猪体存在危险性。目前，新型PPV病毒样颗粒亚单位疫苗获得了广泛的研究，由VP2蛋白形成的病毒样颗粒具有与PPV病毒粒子相似的结构，且不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导猪体产生良好的免疫反应。

目前，研究报道的用于表达PPV病毒样颗粒的主要是昆虫细胞表达系统，但其生产成本较高。相比之下，原核表达系统蛋白表达量高、生产成本低，生产操作简单，但在实际操作中，多数蛋白由于不能正确折叠而形成包涵体，为后续的研究工作及应用带来障碍。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种人工修饰合成的猪细小病毒VP2基因的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二是提供一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，将该重组载体导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白在体外可自我组装，并具有类似于天然病毒的血凝性。

本发明的目的之三是提供一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，该重组菌含有VP2重组质粒和伴侣蛋白质粒，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，可以用于制备猪细小病毒疫苗。

本发明的目的之四是提供一种利用大肠杆菌可溶性表达猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法生产成本低，简单易行，适合大规模生产。

本发明的目的之五是提供一种猪细小病毒VP2蛋白在体外组装的条件，该条件下形成的病毒样颗粒具有类似于天然细小病毒的大小、形状和血凝性。

本发明的目的之六是提供一种猪细小病毒VP2蛋白在制备亚单位疫苗中的应用，将该疫苗免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，具备抗PPV强毒的特性。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

设计一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，通过以下主要步骤制备得到：

（1）VP2基因的人工修饰合成

参照猪细小病毒中国毒株的VP2基因序列（GenBank: AY583318），根据大肠杆菌密码子的偏爱性，人工合成完整的猪细小病毒 VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

（2）重组载体的构建

合成猪细小病毒VP2基因后对其进行PCR扩增，插入pET28a载体，将连接产物转化JM109细胞中，筛选卡那霉素抗性的单克隆，并对其进行PCR和酶切鉴定，获得重组pET28a-VP2载体。

（3）重组菌的构建

将pET28a-VP2载体转化入BL21(DE3)细胞中，筛选卡那霉素抗性的单克隆，并对其进行PCR鉴定，获得含有VP2表达载体的重组菌；然后（通过CaCl₂-MgCl₂方法）将该重组菌制成感受态，并将伴侣蛋白质粒转入，获得最终表达可溶性VP2蛋白的重组菌。

VP2蛋白体外组装条件的确定：诱导表达的VP2蛋白经亲和层析纯化后，在4℃进行透析以除去咪唑进而组装，通过改变透析液的盐离子浓度，来摸索VP2蛋白在体外组装的最佳条件，透析后的蛋白通过电镜，动态光散射和血凝实验进行检测。

上述猪细小病毒病毒样颗粒在制备亚单位疫苗中的应用，研究表明将该疫苗免疫动物后可诱导机体产生特异性的免疫反应，具有抗PPV强毒攻击的特性。具体方案详见具体实施方式。

本发明的有益技术效果是：

本发明首次提出采用伴侣蛋白和PPV VP2蛋白在大肠杆菌中共表达，所表达VP2蛋白的可溶性得到了明显提高，且该VP2蛋白能在适宜条件下自组装成VLP，用该VLP制成的疫苗免疫小鼠和豚鼠可诱导良好的特异性免疫反应，能用于生产预防猪细小病毒的疫苗。

（1）本发明根据大肠杆菌密码子的偏爱性，并结合大量的实践研究，人工修饰合成了猪细小病毒VP2基因的DNA序列，应用该序列表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性。

（2）本发明将猪细小病毒VP2基因插入pET28a载体，并与伴侣蛋白共表达，提高了可溶性VP2蛋白的表达量；所选择的该分子伴侣不仅可以防止蛋白质在折叠过程中形成聚集物或无活性结构，提高正确折叠率，而且还可能影响折叠路径。

（3）本发明所表达的猪细小病毒VP2基因可形成高质量的猪细小病毒病毒样颗粒。

（4）本发明所表达的猪细小病毒病毒样颗粒制备亚单位疫苗，免疫动物后可诱导机体产生针对猪细小病毒的特异性免疫反应。

附图说明

图1：为pET28a载体图谱；

pET28a载体由T7启动子启动，带有卡那霉素抗性基因。

图2：为原核表达载体pET28a-VP2的酶切鉴定图谱；

M：DL2000 DNA Marker；1&2：pET28a-VP2菌液PCR；3&4：pET28a-VP2双酶切。

图3：为SDS-PAGE分析VP2蛋白表达的示意图；

M：蛋白质marker；1：BL21(DE3)空菌诱导后；2：pET28a空载体诱导后；3：pET28a-VP2重组载体诱导后上清；4：pET28a-VP2重组载体诱导后沉淀；5：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；6：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后沉淀。

图4：为SDS-PAGE分析VP2蛋白纯化的示意图；

M：蛋白质marker；1：BL21(DE3)空菌诱导后；2：pET28a空载体诱导后；3：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；4：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后纯化产物。

图5：为Western-blot分析VP2蛋白纯化的示意图；

1：pET28a空载体诱导后；2：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；3：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后纯化产物。

图6：为VP2蛋白体外组装的电镜检测结果示意图；

纯化后的VP2蛋白对不同缓冲液透析后，经磷钨酸负染后用透射电镜进行观察。

图7：为VP2蛋白体外组装的动态光散射检测结果示意图；

纯化后的VP2蛋白对不同缓冲液透析后，用Malvern Nano-ZS纳米粒度仪进行检测。

图8：为VP2蛋白体外组装的血凝活性检测结果示意图；

纯化后的VP2蛋白对不同缓冲液透析后，应用0.8%小鼠红细胞检测其血凝活性。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1

一种原核表达猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法将PPV VP2蛋白与伴侣蛋白共表达，可以获得可溶性好、活性高的重组表达蛋白。其具体步骤如下：

1.1 重组载体pET28a-VP2的构建

1.1.1 PPV主要免疫原性基因VP2的人工修饰合成

参照PPV China株VP2基因序列（GenBank: AY583318），根据大肠杆菌的密码子偏爱性对序列进行优化，人工合成VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

1.1.2 pET28a-VP2载体的构建

用于扩增VP2蛋白编码基因的引物序列如下所示：

F：5’-GGATCCATGTCGGAAAATGTGGAACA-3’ (BamHI)

R：5’-AAGCTTATACAGTTTCCGTGGAATGA-3’ (HindIII)

其中，正向引物携带BamHI酶切位点；反向引物携带HindIII酶切位点。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

用上述引物，以合成的VP2基因为模板，进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min；共30个循环；72℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的基因片段，结果如图2所示，目的基因大小约为1700bp，与预期结果一致；将扩增片段用天根凝胶回收试剂盒回收，具体操作见说明书，回收产物和pET28a质粒分别经限制性内切酶BamHI 和HindIII 酶切消化，反应条件为37℃，4h。

随后分别回收pET28a载体和VP2基因的双酶切产物，再用T4连接酶16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌JM109（TaKaRa）感受态细胞，具体过程详见试剂盒说明书。由于pET28a载体上有卡那霉素抗性基因，将转化后的细胞涂布于含50µg/mL 卡那霉素抗性的LB琼脂平板。随机挑取平板上的单菌落，接种于具有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12h。经菌液PCR和酶切鉴定获得阳性克隆（结果如图2所示），阳性质粒命名为pET28a-VP2，将重组质粒pET28a-VP2送公司进行测序，结果表明插入片段序列正确，没有突变且插入方向正确。

1.2 PPV VP2大肠杆菌表达菌株的构建和表达

1.2.1 PPV VP2大肠杆菌表达菌株的构建

将上述1.1中获得的阳性pET28a-VP2质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)（TaKaRa）感受态细胞，转化产物涂布于含50µg/mL卡那霉素抗性的LB琼脂平板，挑取单菌落，经菌液PCR鉴定，筛选阳性克隆即为含有重组表达质粒的菌株。

为了实现VP2蛋白与伴侣蛋白的共表达，以增加可溶性VP2蛋白的表达量，将上述重组菌接种于50mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD值为0.6，然后4℃，5000rpm离心5min收集菌体沉淀，通过CaCl₂-MgCl₂法将其感受化，制备成感受态细胞，然后将伴侣蛋白质粒转入其中，使该BL21(DE3)细胞即含有pET28a-VP2表达质粒，又含有伴侣蛋白质粒，由于两种质粒为相容质粒，相互之间的转录和翻译不会影响，所以可实现VP2蛋白和伴侣蛋白的共表达，将转化产物涂布于含50µg/mL卡那霉素和25µg/mL氯霉素的LB琼脂平板，挑取单菌落，该菌落即为共表达VP2蛋白和伴侣蛋白的重组菌株。

1.2.2 原核表达菌株的表达及鉴定

将上述获得的PPV VP2表达菌株1：100接种至含50µg/mL卡那霉素和25µg/mL氯霉素的液体LB培养基中，同时加入50ng/mL四环素诱导伴侣蛋白的表达，37℃培养至OD值约0.6时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG（异丙基硫代半乳糖苷诱导），诱导VP2蛋白的表达，25℃诱导12h后离心收集菌体。

根据上述菌体的湿重，以1：10(W/V)的比例加缓冲液A(50mmol/L PB，250mmol/LNaCl，pH7.0)将菌体重悬，然后置冰上超声裂解，12000rpm离心20min，分离上清和沉淀，然后取样，用SDS-PAGE及Western-blot鉴定蛋白的表达及可溶性情况。结果如图3所示，根据该图结果，该表达菌株中有伴侣蛋白和VP2蛋白的可溶性表达。

实施例2 猪细小病毒病毒样颗粒的制备

2.1 VP2蛋白的纯化及VLP的测定

2.1.1 重组VP2蛋白的纯化

将超声裂解的上清通过Ni-NTA层析柱（Merck）进行纯化，具体过程为：Ni-NTA用缓冲液A平衡后，将样品缓慢流过层析柱，然后用至少10倍柱体积的缓冲液B(50mmol/L PB，250mmol/L NaCl，30mmol/L imidazole，pH7.0)过柱，清洗杂蛋白，最后用缓冲液C(50mmol/L PB，250mmol/L NaCl，300mmol/L imidazole，pH7.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱组分，并用SDS-PAGE和Western-blot检测，结果如图4，VP2蛋白经过亲和层析纯化后纯度可达95%以上，和His单抗有良好的反应。

2.1.2 蛋白在体外的组装及检测

将纯化后的蛋白装入透析袋中，在4℃进行透析，通过改变透析液的盐离子浓度来探索VP2蛋白在体外组装的最佳条件，所设盐离子浓度分别为：50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L。然后通过透射电镜观察所形成的VLP的形态，通过纳米粒度仪检测VLP的粒径分布，并通过血凝实验来检测VLP的血凝活性。结果如图5所示，根据结果可看出原核表达的VP2可以在体外组装成VLP，该VLP在形态、大小与血凝活性方面与天然的PPV病毒类似。进一步的，该VLP在50mmol/L NaCl，pH7.0时形成的质量较好，形成率较高。

具体检测方法如下所述：

透射电镜（TEM）检测：将上述纯化获得的PPV VLP，经2%磷钨酸负染，利用透射电镜观察VLP的形态，其直径约为24-25nm，大小均匀，呈现为空心形态，结果如图6所示。

动态光散射（DLS）检测：将上述纯化获得的PPV VLP通过纳米粒度仪进行检测，结果如图7，根据DLS结果显示，本发明中所获得的VLP纯度高，大小均一，结构完整。

血凝活性（HA）检测：取96孔V型微量反应板，每孔加入50μL PBS，第一列各孔加入50μL抗原，然后将抗原进行2倍系列稀释，直至第11孔弃去50μL。然后每孔加入0.8%小鼠红细胞悬液50μL，用微量震荡器混合均匀，置室温下作用1h。判定结果时，以100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。

实施例3 PPV病毒样颗粒免疫原性检测

3.1 VP2蛋白浓度的测定和内毒素含量的测定

用BCA蛋白含量测定试剂盒（Pierce Biotechnology）测定纯化的VP2蛋白的浓度，具体步骤参考其说明书。所测得的VP2蛋白的浓度为0.57mg/mL，表达量较高，能够满足工业化生产的要求。

用内毒素含量测定试剂盒（ToxinSensor^TM Endotoxin Detection System，GenScript）测定纯化蛋白的内毒素含量，具体步骤参考其说明书，所测得的VP2蛋白的内毒素含量小于0.3mU/mg。

3.2 动物免疫

参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例2中获得的VLP制备成疫苗。

3.2.1 小鼠的免疫

病毒样颗粒在弗氏佐剂的参与下，分5μg/只、10μg/只免疫3-4周龄的昆明鼠，同时设猪细小病毒灭活苗免疫组和磷酸盐缓冲液接种组作为参比对照，每组免疫5只小鼠。共免疫2次，第1次用弗氏完全佐剂，第2次用弗氏不完全佐剂，首免后每周进行尾静脉采血，分离血清并保存，以便后续检测小鼠血清中的血凝抑制抗体和中和抗体效价，结果表明，表达蛋白所形成的病毒样颗粒，可以刺激小鼠产生猪细小病毒的特异性抗体，且产生的抗体水平明显高于灭活苗免疫组。

3.2.2 豚鼠的免疫

24只体重为400-500g的雌性健康豚鼠，随机分为4组，每组6只，A组和B组用油佐剂，分别免疫50μg/只、25μg/只， C组免疫PPV灭活苗作为阳性对照，D组免疫PBS作为阴性对照。免疫分2次进行，间隔时间为两周，首次免疫后每14天进行心脏采血，分离血清检测血清抗体，并于64天致死后（每组2只）无菌摘取脾脏，分离脾脏淋巴细胞检测PBMC增殖与细胞因子的分泌情况，然后皮下注射PPV标准毒，攻毒后7天进行剖杀，采集心肝脾肺肾等组织，通过RT-PCR检测组织含毒量。结果表明所形成的病毒样颗粒能够诱导豚鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，可以有效的保护机体免受猪细小病毒强毒的攻击。

3.3 抗体水平检测

3.3.1 血凝抑制抗体检测

0.8%小鼠红细胞的制备：

用灭菌注射器吸取1mL新鲜小鼠血于含有1000U的肝素的灭菌离心管内中；向上述离心管中加入9mL PBS中以1500rpm离心5min，弃上清液；用10mL PBS重悬血球，2000rpm离心10min，弃上清，如此将红细胞洗涤三次；最后根据所需用量，用PBS配成0.8%(v/v)小鼠红细胞悬液，在5天之内使用。

HA确定4单位毒价：

在96孔微量血凝板上进行，自左至右各孔加50µL PBS；于左侧第1孔加50µL病毒液，混合均匀后，吸50µL至第2孔，如此依次倍比稀释至第10孔，吸弃50µL；第11、12孔为红细胞对照；稀释完毕后自右至左依次向各孔加入0.8%小鼠红细胞悬液50µL，在振荡器上振荡混匀，室温放置1h后观察结果，以红细胞100%凝集的病毒最高稀释度为终点，此稀释度的4倍即为4单位毒。

HI检测血清中的抗体：

在标准96孔V型反应板各孔中加入25µL PBS缓冲液，每行孔检测不同的样品，每行中的第1孔加入25µL的待检血清，混匀后取出25µL加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，弃25µL，第11孔加阳性血清做阳性对照，第12孔加阴性血清做阴性对照；然后每孔加入25µL的4单位毒，振荡混匀，室温孵育30min；后每孔加入50µL 0.8%的小鼠红细胞悬液，室温孵育2h观察结果，以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度作为该血清的血凝抑制效价。如图8所示，血凝抑制效价为1:5120。

3.3.2 中和抗体检测

猪细小病毒标准毒株毒价测定：

用于本试验方法的毒种为猪细小病毒标准毒株，购自中国兽药监察所，该毒株可在PK-15细胞上增殖，对猪的免疫原性好。病毒含量测定：PK-15细胞以2×10⁵/mL接种于96孔细胞培养板，待细胞长满80%孔底时，即可用于病毒接种；以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100µL加入上述96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置37℃、含5% CO₂培养箱中培养2h后，弃去病毒液，每孔加入100µL含有3% FBS的DMEM维持液，置37℃、含5% CO2培养箱中继续培养；逐日观察细胞病变，细胞固缩，聚集，颗粒增多，有的细胞融合、脱落、出现较多空隙则判为CPE。观察3日，记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。结果：每毫升病毒液不低于10^6.0TCID₅₀。

血清中和抗体的检测：

猪细小病毒中和抗体的检测参照《中华人民共和国药典》(2005年版)中的标准进行，具体实施方式为：样品血清于56℃灭活30min，然后在96孔细胞培养板中以1：10为起始浓度倍比稀释至第10孔，随后每孔加入7909株猪细小病毒100 TCID₅₀，混匀后置于37℃、含5% CO2培养箱中孵育2h，然后取100µL接种于事先准备的长有80% PK-15细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃、含5% CO2培养箱中培养2天后，观察细胞病变，以50%细胞发生病变的血清最高稀释度作为该血清中和抗体滴度。结果显示血清中和抗体滴度约为1：420。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种利用大肠杆菌表达系统制备猪细小病毒病毒样颗粒亚单位疫苗的方法及

应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcacgctt ctcgtctgat ccacctgaac atgccggaac acgaaaccta caaacgtatc 60

cacgttctga actctgaatc tggtgttgct ggtcagatgg ttcaggacga cgctcacacc 120

cagatggtta ccccgtggtc tctgatcgac gctaacgctt ggggtgtttg gttcaacccg 180

gctgactggc agctgatctc taacaacatg accgaaatca acctggtttc tttcgaacag 240

gaaatcttca acgttgttct gaaaaccatc accgaatctg ctacctctcc gccgaccaaa 300

atctacaaca acgacctgac cgcttctctg atggttgctc tggacaccaa caacaccctg 360

ccgtacaccc cggctgctcc gcgttctgaa accctgggtt tctacccgtg gctgccgacc 420

aaaccgaccc agtaccgtta ctacctgtct tgcatccgta acctgaaccc gccgacctac 480

accggtcagt ctcagcagat caccgactct atccagaccg gtctgcactc tgacatcatg 540

ttctacacca tcgaaaacgc tgttccgatc cacctgctgc gtaccggtga cgaattctct 600

accggtatct accacttcga caccaaaccg ctgaaactga cccactcttg gcagaccaac 660

cgttctctgg gtctgccgcc gaaactgctg accgaaccga ccaccgaagg tgaccagcac 720

ccgggtaccc tgccggctgc taacacccgt aaaggttacc accagaccat caacaactct 780

tacaccgaag ctaccgctat ccgtccggct caggttggtt acaacacccc gtacatgaac 840

ttcgaatact ctaacggtgg tccgttcctg accccgatcg ttccgaccgc tgacacccag 900

tactacgacg acgaaccgaa cggtgctatc cgtttcacca tgggttacca gcacggtcac 960

ctgaccacct cttctcagga actggaacgt tacaccttca acccgcagtc taaatgcggt 1020

cgtgctccga tgcagcagtt caaccagcag gctccgctga acctggaaaa caccaacaac 1080

ggtaccctgc tgccgtctga cccgatcggt ggtaaatcta acatgcactt catgaacacc 1140

ctgaacacct acggtccgct gaccgctctg aacaacaccg ctccggtttt cccgaacggt 1200

cagatctggg acaaagaact ggacaccgac ctgaaaccgc gtctgcacgt taccgctccg 1260

ttcgtttgca aaaacaaccc gccgggtcag ctgttcgtta aaatcgctcc gaacctgacc 1320

gacgacttca acgctgactc tccgcagcag ccgcgtatca tcacctactc taacttctgg 1380

tggaaaggta ccctgacctt caccgctaaa atgcgttctt ctaacatgtg gaacccgatc 1440

taa 1443

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatccatgt cggaaaatgt ggaaca 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcttatac agtttccgtg gaatga 26

Claims

1. 一种编码猪细小病毒VP2蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达载体，含有权利要求1所述的基因序列。

3.一种宿主细胞，含有权利要求2所述的表达载体，以及可与该表达载体共表达的伴侣蛋白表达载体。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述猪细小病毒VP2蛋白为可溶性表达。

5.一种猪细小病毒VP2蛋白的可溶性表达方法，其特征在于：将猪细小病毒VP2蛋白与伴侣蛋白共同表达。

6.如权利要求5所述猪细小病毒VP2蛋白的可溶性表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A．设计并合成密码子优化的猪细小病毒VP2基因，与pET28a载体进行连接，构建原核表达载体；

B．构建VP2、伴侣蛋白共表达的大肠杆菌重组菌株；

C．重组菌株在接种的同时加入四环素，37℃培养2～3h，至OD值达到0.6时，加入1.0mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷诱导VP2蛋白的表达。

7.一种猪细小病毒病毒样颗粒的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求6所得诱导菌株用超声裂解，裂解后的上清通过亲和层析纯化，将纯化的产物用缓冲液进行透析，即得。

8. 如权利要求7所述猪细小病毒病毒样颗粒的表达方法，其特征在于：所述透析的环境条件为：4℃，50mmol/L NaCl，pH7.0。

9.权利要求7所表达的猪细小病毒病毒样颗粒在制备亚单位疫苗中的应用。