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CN104379601B - 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途 - Google Patents

双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双特异性(单克隆)抗体分子，其具有与CD8+T‑细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T‑细胞之中和/或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤‑特异性抗原结合的第二结合结构域。所述的双特异性(单克隆)抗体分子在与转导的CD8+T‑细胞，和/或T‑细胞受体的结合特别有用，所述转导的CD8+T‑细胞包含非天然地存在于所述CD8+T‑细胞之中和/或之上的抗原。本发明提供应用所述(双特异性)抗体分子作为药物，所述(双特异性)抗体分子用于具体疾病的治疗，以及用于包含所述(双特异性)抗体分子的药物组合物/药物，其中，在特定的治疗方案中，所述的(双特异性)抗体分子与转导的CD8+T‑细胞，和/或T‑细胞受体结合施用，所述的CD8+T‑细胞包含非天然地存在于所述CD8+T‑细胞之中和/或之上的抗原。本发明的另外的方面还涉及编码所述双特异性(单克隆)抗体分子的核酸，载体，宿主细胞，制备所述(双特异性)抗体分子的方法，以及包含本发明的(双特异性)抗体分子的试剂盒。

Description

双特异性抗体分子和抗原-转染的T-细胞以及它们在医药中 的用途
本发明涉及双特异性(单克隆)抗体分子，其具有与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域。此外，还提供了编码本发明的(单克隆)双特异性抗体分子的核酸。本发明的另外方面还提供包含所述核酸序列的载体和宿主细胞，生产本发明的双特异性抗体分子的方法，以及包含所述(双特异性)抗体分子的药物/组合物。再有，本发明还涉及经转导的CD8+T-细胞，其包含非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原，和/或T-细胞受体。本发明还提供所述双特异性抗体分子在制备用于治疗具体疾病以及在包含所述(双特异性)抗体分子的药物组合物/药物中的用途，其中，在特定的治疗方案中，所述的(双特异性)抗体分子与经转导的CD8+T-细胞，和/或T-细胞受体结合施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原。本发明还提供治疗具体疾病的方法和包含本发明的(双特异性)抗体分子的试剂盒。
发明背景
T-细胞(即T淋巴细胞)输入(transfusion)，称为过继T-细胞疗法,已经过测试用于癌症和慢性感染的治疗。过继T-细胞疗法具有增强抗肿瘤免疫,提高疫苗效力以及限制移植物-抗-宿主疾病的潜力。过继T-细胞疗法用作细胞源，尤其是,细胞毒性T-细胞(CTLs),或肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。双特异性抗体可用于“武装(arm)”(活化的)T-细胞以形成它们和肿瘤细胞表面抗原之间的桥梁。双特异性抗体在一侧靶向肿瘤细胞上的表面标记/抗原，在另一侧靶向另一种天然地/内源性地在细胞中或细胞上表达的标记/抗原，例如在下述文献中所描述的，如Glorius等,Blood116(2010),1173；Rothe等,Blood118(2011),1585；Zhengxing等,Blood111(2007),2211-2219,Herrmann等,Cancer Research68(2008),1221-1227；Singer等,Journal of Immunotherapy33(2010),599-608；Brandl等,Experimental Hematology27(1999),1264-1270；James等,European Journal ofCancer35(1999),S343-S344；Chen等,Clinical Cancer Research1(1995),1319-1325；Valera等,Molecular Cancer Therapeutics9(2010),1872-1883；Gelderman等,EuropeanJournal of Immunology36(2006),977-984；Schweizer等,Cancer ImmunologyImmunotherapy51(2002),621-629；Friedman等,Biotechnology and AppliedBiochemistry54(2009),121-131；Schaefer等,Cancer Cell20(2011),472-486andKazuhiko等,International Journal of Molecular Medicine25(2010),209-215。
已知抗原特异性的细胞毒性T-细胞(CTLs)具有杀死人癌细胞的能力,如向患有黑素瘤的患者过继转移先体外后体内(ex-vivo)扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TILs)或T-细胞受体基因-转染的T-细胞后所显示的肿瘤阻抑(regression)那样(Leen等,Annu.Rev.Immunol.115(2007),98-104)。一种已知的替代途径是利用双特异性抗体重新定向大量的内源T-细胞。这些双特异性抗体，其中的一些设计形式(formats)称作BiTE(指“双特异性T-细胞衔接器(engager)”)是以如下方式构建的，即在一侧靶向表面标记CD3(其天然地存在于/内源性地表达于T-细胞之上)，在另一侧靶向肿瘤细胞上的表面抗原(其天然地/内源性地表达于肿瘤细胞表面)。此外，在之前的工作中已表明，这一具体设计的抗-CD3抗-靶抗原双特异性抗体具有异常高的效力并可以衔接(engage)CD8+T-细胞和CD4+T-细胞，以极低的效应物对靶标(E:T)比率裂解癌细胞。两种BiTE抗体目前处于临床试验中：Blinatumomab(又名MT103)是对CD3和CD19具有双特异性。其正在患有晚期复发性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)(Bargou等,Science321(2008),974-977)的患者中进行I期临床试验，并在患B-前体急性成淋巴细胞白血病(B-precusor acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)(Topp等,Blood112(2008),1926)的患者中进行II期临床试验。所述的第二种、处于I期临床试验阶段的BiTE抗体是MT-110(Micromet Inc)，其靶向泛-癌-相关-抗原(pan-carcinoma-related antigen),上皮细胞黏附分子(EpCAM或CD326)和CD3(Brischwein等,Mol.Immunol.43(2006),1129-1143)。双特异性抗体(catumaxumab[
Figure BDA0000576357890000021
]；抗CD3和人EpCAM双特异性)已于2009年在欧洲获准面世。
体外(In vitro)和小鼠模型系统中，双特异性抗体能通过同时结合CD3和靶抗原连接T-细胞和癌细胞触发包括细胞毒性颗粒融合以及瞬时细胞因子和粒酶释放在内的T-细胞活化。但是，在利用此类双特异性抗体,例如作为用于人的治疗方案的一部分时，大量T-细胞的活化(不依赖于T-细胞抗原特异性)和/或肿瘤细胞裂解的旁观者效应，导致严重的问题。
一种此类的问题是所谓的“细胞因子释放综合症(cytokine release syndrome，CRS)”，其在小鼠模型系统中通常不产生什么效果，但在人中具有灾难性的影响(Suntharalingam等,The New England Journal of Medicine355(2006),1018-1028)。CRS包括头痛，肌肉疼痛，恶心，腹泻，红斑，血管扩张和低血压。最严重的形式导致肺浸润，肺损伤，肾衰竭和弥漫性血管内凝血(Suntharalingam等,The New England Journal ofMedicine355(2006),1018-1028)。即使CRS与双特异性抗体的应用无关，也已观察到施用双特异性抗体后的大量其他副作用(超过80％的三级或更高的毒性)(Topp等,Journal ofClinical Oncology29(2011),2093–2098)。这样的副作用也归因于T-细胞衔接作用(engagment)，包括淋巴细胞减少症，血液化学变化和eurologic症状。
鉴于双特异性抗体这种副作用严重的状况，不可能使用长半寿期的抗体设计形式，因为假如出现CRS，长半寿期是不理想的。
因此，本发明的技术问题为提供通过诱导T-细胞介导的免疫应答用于治疗恶性疾病，如起源于上皮、内皮或间皮的癌以及血液癌症的手段和方法。
发明简述
上述通过诱导T-细胞介导的免疫应答治疗恶性疾病，如起源于上皮、内皮或间皮的癌以及血液癌的手段和方法，应当克服已知的基于双特异性抗体的疗法的不利之处。
所述技术问题的解决方案通过权利要求中所描述的具体实施方案实现。
因此，本发明涉及以非天然地存在于CD8+T-细胞中和/或CD8+T-细胞的表面的标记蛋白对CD8+T-细胞的转导，以及它们通过双特异性抗体分子向肿瘤的靶向募集(参见图7和21)。在本发明中，所述CD8+T-细胞的转导可通过下述的反转录病毒系统进行。本发明涉及双特异性抗体分子，其包含与CD8+T-细胞上、非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原特异结合的第一结合结构域；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，其中，所述的CD8+T-细胞已用非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原转导。在本发明的内容中，所述的双特异性抗体分子包含与CD8+T-细胞上的抗原特异结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，其中，所述的双特异性抗体分子是(单克隆)抗体分子。如所附加的实施例所示，作为本发明构思(inventive concept)的证据，构建了双特异性抗体，其中，所述的第一结合结构域与(人)EGFR(代表非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中或之上的抗原)相互作用/结合，所述的第二结合结构域与EpCAM(代表天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原)相互作用/结合。与对照试验相比，通过这种双特异性抗体和表达del-(人)hEGFR蛋白的经转导的肿瘤特异性T-细胞(CD8+T-细胞)结合治疗肿瘤，显著地延长了小鼠的存活期(参见图12和14)。因此，出人意料地发现了用非天然地存在于这些细胞之中和/或表面的抗原(如在所附加的实施例(作为所述构思的证据)中，通过如SEQ ID NO:12(如由SEQ ID NO:11中所示的cDNA序列编码))中所示的del-(人)hEGFR蛋白序列转导的T-细胞(CD8+T-细胞)，可利用双特异性抗体分子特异性地募集，所述的双特异性抗体分子通过其第一结构域((人)hEGFR)与已被引入到所述T-细胞(CD8T-细胞)的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或表面的抗原结合，通过其第二结合结构域与天然地存在于肿瘤细胞表面上的、肿瘤-特异性抗原(EpCAM)结合。
上下文中，所用的术语“双特异性结合构建体”特指双特异性抗体分子，其能够结合非天然地/内源性地在CD8+T-细胞之中或之上表达的抗原、并能够诱导靶细胞的排除/裂解(经由与，天然地存在于(其是内源性表达的)肿瘤细胞表面的肿瘤-特异性抗原，结合的第二结合结构域)。通过所述的双特异性结合构建体(双特异性抗体分子)与非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原结合(例如抗体，抗体衍生物或抗体片段)使肿瘤特异性T-细胞(CD8+T-细胞)与肿瘤细胞实际接触(参见图7和21)。非-转导的或内源T-细胞(CD8+T-细胞)不受所述双特异性结合构建体(双特异性抗体分子)的影响。因此，本发明的双特异性抗体分子具有在体内和/或体外裂解靶细胞的能力。相应的靶细胞包含表达表面分子的细胞，其被本发明的双特异性抗体分子的第二(Ig-衍生的)结合结构域所识别。此类表面分子在下文中进行描述。
可利用本领域已知的方法检测靶细胞的裂解。因此，此类方法包括，特别是体外生理学测定。此类生理学测定可以是检测细胞死亡，例如通过丧失细胞膜的完整性(例如基于FACS的碘化丙锭测定，台盼蓝灌注测定，酶释放光度测定(LDH)，51Cr释放辐射测定，荧光铕释放和CalceinAM释放测定)。此外的测定包括细胞生存力监控，例如通过光度MTT,XTT,WST-1和alamarBlue测定，放射性3H-Thd掺入测定，测量细胞分裂活性的产克隆测定，测量线粒体跨膜梯度的罗丹明123测定。此外，通过例如基于FACS的磷脂酰丝氨酸曝光(phosphatidylserin exposure)测定，基于ELISA的TUNEL试验，胱冬酶活性测定(基于光度、荧光或ELISA)或者分析细胞形态变化(缩小，膜气泡(membrane blebbing))。
在本发明的内容中所用的术语“与……结合”定义至少两个“抗原-相互作用-位点”彼此之间的结合(相互作用)。根据本发明，术语“抗原-相互作用-位点”定义与特异性抗原或特异性抗原组表现出特异相互作用的能力的多肽基序。所述的结合/相互作用也可以理解为定义“特异性识别”。根据本发明，术语“特异性识别”指所述的抗体构建体能够特异性地相互作用于(interacting with)和/或结合于本申请所定义的每一人靶分子的至少两个氨基酸。抗体可以识别，相互作用和/或结合相同靶分子上的不同表位。这一术语涉及抗体分子的特异性，即，涉及其在本申请所定义的人靶分子的特异性区域间进行辨别的能力。所述抗原-相互作用-位点与其特异性抗原之间的特异性相互作用可能导致信号引发,例如由于所述抗原的构象改变的诱导,所述抗原的寡聚化等。由此，抗原-相互作用-位点的氨基酸序列中的特异性基序与抗原彼此结合形成其初级，二级或四级结构，并导致所述构建体二级修饰。
本发明中所使用的术语“特异性相互作用”指本发明的双特异性结合构建体(双特异性抗体分子)不与或基本上不与类似结构的(多)肽交叉反应。因此，本发明所述的双特异性构建体特异性地结合于/相互作用于肿瘤标记、细胞表面标记,非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原，并能基于其第二(Ig-衍生的)结构域与特异性的、所选择的其他化合物、抗原、细胞-表面标记,天然地存在于肿瘤细胞表面的肿瘤标记等相互作用。下文中给出所述第一，第二，Ig-衍生的结构域所定向针对的此类分子的具体示例。
可以对在研究中的构建体组(panel)的交叉反应性进行测定，例如，通过评估在常规条件(参见，例如Harlow and Lane,抗体:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,(1988)and Using抗体:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,(1999))下,所述双特异性抗体构建体组与所述所关注的(多)肽以及一些或多或少在(结构和/或功能)密切相关的(多)肽之间的结合。只有那些与所关注的(多)肽/蛋白质结合、但不与或基本上不与任何与所关注的(多)肽相同的组织，例如由肿瘤组织的细胞，表达的其他(多)肽结合的构建体(即，抗体，(双特异性)scFvs等等)被认为是特异于所关注的(多)肽/蛋白质，其被选择出来用于在本申请所提供的方法中进一步研究。这些方法可以包括，特别是，与结构和/或功能密切相关的分子的结合研究，阻断以及竞争研究。这些结合研究还包括FACS分析,表面等离振子共振(SPR,例如与BIAcore),分析超速离心,等温线滴定量热学,荧光各向异性,荧光光谱学或通过放射性同位素标记的配体结合测定。此外，也可以应用生理学测定，如细胞毒性测定以及上述提及的测定。因此，抗原-相互作用-位点与特异性抗原的特异性相互作用示例可以包括所述配体对于其受体的特异性。所述的定义特别地包括配体一旦与其特异性受体结合诱导信号的相互作用。相应的配体的示例包括细胞因子，其与特异性的细胞因子-受体相互作用/与与特异性的细胞因子-受体结合/结合于其特异性的细胞因子-受体。还特别地包含于所述定义中的是抗原-相互作用-位点与抗原，如选凝素家族,整联蛋白以及EGF之类的生长因子家族的抗原，之间的结合。所述相互作用的另一示例，其也特别包含于所述定义中，是抗原决定簇(表位)与抗体的抗原性结合位点之间的相互作用。
术语“结合于”并不仅仅涉及线性表位，也涉及构象表位，结构表位，或由人靶分子或其部分的两个区域组成的不连续的表位。在本发明的内容中，构象表位是由在初级结构中相分离的两个或以上分立的(discrete)、在所述多肽折叠成其天然的蛋白质时聚拢(come together)在所述分子表面的氨基酸序列定义的(Sela,Science166(1969),1365andLaver,Cell61(1990),553-536)。再有，术语“结合于”在本发明的内容中可以与术语与……相互作用”互换使用。
因此，特异性可通过本领域已知的方法以及本申请中所描述的方法实验确定。此类方法包括，但不限于，Western Blots,ELISA-,RIA-,ECL-,IRMA-试验，以及肽扫描。
术语(Ig-衍生的)“第一结合结构域”涉及“免疫球蛋白-衍生的结构域”,具体涉及抗体或其片段，单链抗体，合成抗体，抗体片段，如Fab，F(ab2)’，Fv或scFv片段等，或上述任何抗体或片段经化学修饰的衍生物。这些抗体分子可由不同的种类衍生，或者可以是嵌合来源的。在本发明的内容中(如所附加的实施例所示例性描述的)，所述的(Ig-衍生的)、包含在本发明的双特异性抗体分子中的第一结构域可以是，与第二(Ig-衍生的)“结合结构域”融合的(单克隆)抗体。
术语(Ig-衍生的)“第二结合结构域”涉及免疫球蛋白-衍生的结构域。具体涉及抗体或其片段，单链抗体，合成抗体，抗体片段，如Fab，F(ab2)’,Fv或scFv片段等，或上述任何抗体或片段经化学修饰的衍生物。这些抗体分子可由不同的种类衍生，或者可以是嵌合来源的。在本发明的内容中(如所附加的实施例所示例性描述的)，所述的(Ig-衍生的)、包含在本发明的双特异性抗体分子中的第二结构域可以是scFv。
本发明的双特异性抗体分子是(单克隆)双特异性抗体，其对至少两个不同的位点具有结合特异性，并可以是任何涉及形式。不久之前，已经开发出了多种多样的重组抗体设计形式，例如二价的、三价的或四价的双特异性抗体。示例包括，IgG抗体设计形式和单链结构域(针对不同的设计形式，参见例如Coloma,M.J.,等,Nature Biotech15(1997),159-163；WO2001/077342；Morrison,S.L.,Nature Biotech25(2007),1233-1234；Holliger,P.,et.al,Nature Biotech.23(2005),1126-1136；Fischer,N.,and Léger,O.,Pathobiology74(2007),3-14；Shen,J.,et.al.,J.Immunol.Methods318(2007),65-74；Wu,C.,等,Nature Biotech.25(2007),1290-1297)的融合。此处所述的双特异性抗体或片段还包括WO 2009/080251；WO 2009/080252；WO 2009/080253；WO 2009/080254；WO 2010/112193；WO 2010/115589；WO 2010/136172；WO 2010/145792；WO 2010/145793以及WO2011/117330中所描述的二价的、三价、或四价的双特异性抗体。
本发明的“抗体”具有两个或以上的结合结构域并且是双特异性的。也就是说，所述的抗体可能是双特异性，即使在有两个以上结合结构域的情况下(即，所述的抗体是三价的或多价的)。本发明的双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体，双抗体，三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域的抗体，其中抗原-结合结构域(例如单链Fv,a VH结构域和/或VL结构域,Fab,或(Fab)2,)通过一个或以上的肽接头与所述全长抗体的恒定区结构域连接。所述的抗体可以是来自单一种类的全长的，或嵌合的或人源化的抗体。对于具有两个或以上抗原结合结构域的抗体，一些结合结构域可以是同一的，只要所述的蛋白质具有针对两个不同抗原的结合结构域即可。
本申请中所用的术语“价”代表在抗体分子中存在的结合结构域的具体数量。例如，术语“二价”,“四价”，和“六价”分别代表在抗体分子中存在两个结合结构域,四个结合结构域，和六个结合结构域。本发明所述的双特异性抗体至少是“二价的”，也可以是“三价的”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。优选地，本发明的双特异性抗体是二价的,三价的，或四价的。据此，在本发明的内容中，所述的双特异性抗体是二价的。在本发明的内容中，所述双特异性抗体是三价的。在本发明的内容中，所述的双特异性抗体是四价的。
如上所述(以及在图1中示例性描述的)，本发明的双特异性抗体分子，最优选地，包含(Ig-衍生的)第二结构域，其可以是scFv。由此，在本发明的示例性具体实施方案中，作为构思的证据，提供了双特异性抗体分子，其具有一个针对(人)EGFR(经由第一结合结构域)的特异性，并且还有另一个特异性，该特异性通过第二scFv介导、定向针对另外的分子/化合物或能够与之相互作用。这些另外的分子/化合物可包括细胞表面分子,肿瘤标记,肿瘤抗原等等。此类另外的分子/化合物在下文中举例说明。
因此，在本发明的内容中，双特异性结合分子可能涉及包含两个抗体衍生的结合结构域的抗体分子，其中，一个结合结构域可以是scFv。所述的结合结构域之一由抗体的可变区(或其部分)，抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结合于/相互作用于非天然地存在于CD8+T-细胞(如下文中所定义的)之中和/或之上的(人)靶分子1。所述第二结合结构域由抗体的可变区(或其部分)，抗体片段或其衍生物组成，能特异性地结合于/相互作用于如下文中所定义的另外的(人)抗原(靶分子2)。因此根据本发明，所述的第二结合结构域是如上所述的(Ig-衍生的)第二结构域，其包含对天然地存在于肿瘤细胞表面上的细胞表面分子或天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性标记(抗原)具有特异性的、特异性抗原-相互作用-位点。所述双特异性抗体分子中的两个结构域/区域，优选地彼此间共价相连。这种连接可以是直接的作用(结构域1[对于非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的(人)靶分子1具有特异性，其包含上述定义的CDR-区或CDR-区和框架区]–结构域2[对细胞表面分子和/或肿瘤特异性标记具有特异性]或结构域1[对于细胞表面分子和/或肿瘤特异性标记具有特异性]–结构域2[对非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的(人)靶分子1具有特异性，其包含如上述定义的CDR-区或CDR-区和框架区])，或者是通过附加的多肽接头序列(结构域1–接头序列–结构域2)。在使用接头的情况下，在本发明的内容中，接头的长度和序列要足以保证所述第一和第二结构域中的每一个，彼此间独立地保持它们不同的结合特异性。在本发明的内容中，所述附加的多肽接头序列也可以是抗体自身的片段，其可以是，例如Fc部分，或者一个或以上的抗体恒定区结构域。
在本发明的内容中，结合结构域1也可以是抗体臂1的一部分，结合结构域2也可以是抗体臂2的一部分，反之亦然，其中所述的两个抗体臂通过界面(interface)相连。所述的抗体臂1由抗体的可变区(或其部分)，抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结合于/相互作用于非天然地存在于如下述定义的CD8+T-细胞之中或之上的(人)靶分子1。所述的抗体臂2由抗体的可变区(或其部分)，抗体片段或其衍生物组成，能够特异性地结合于/相互作用于天然地存在于肿瘤细胞表面上的细胞表面分子或天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原。所述的“界面”包含第一抗体臂中的那些接触氨基酸残基(或其他非-氨基酸基团，例如碳水化合物基团)，其与所述第二抗体臂中的一个或以上“接触”氨基酸残基(或其他非-氨基酸基团)相互作用。优选的界面是免疫球蛋白结构域，如抗体重链的恒定结构域(或其中的区域)，其中，所述经由界面的结合/相互作用使得所述的两个抗体臂异源二聚体化(参见例如Ridgway,J.B.,等,Protein Eng.9(1996),617-621；WO 96/027011；Merchant,A.M.,等,Nature Biotech.16(1998),677-681；Atwell,S.,等,J.Mol.Biol.270(1997),26–35；EP 1 870 459 A1；WO 2007/147901；WO 2009/089004(A1)和WO 2010/129304)。
应用于本发明的抗体，抗体构建体,双特异性抗体分子，抗体片段，抗体衍生物(均由Ig-衍生)，或它们相应的免疫球蛋白链，可通过本领域已知的常规技术进行修饰，例如，利用氨基酸缺失,插入,取代,添加,和/或重组和/或任何本领域已知的其他单独的或组合的修饰方式。向免疫球蛋白氨基酸序列的相应DNA序列中引入此类修饰方法是本领域普通技术人员公知的；参见，例如以上所引用的Sambrook(1989)。术语“Ig-衍生的结构域”，具体涉及包含至少一个CDR的(多)肽构建体。所述的Ig-衍生的结构域的片段或衍生物界定(多)肽，其是上述抗体分子的部分和/或它们通过化学/生物化学或分子生物学方法修饰的形式。所述的方法是本领域已知的特别是在实验室操作手册中有描述(参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ndedition(1989)and3rd edition(2001)；Gerhardt等,Methods for General andMolecular Bacteriology ASM Press(1994)；Lefkovits,Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press(1997)；Golemis,Protein-Protein interactions:A Molecular Cloning Manual Cold Spring HarborLaboratory Press(2002))。
本申请所用的术语“CDR”指“互补决定区”，其是本领域公知的。所述的CDR是免疫球蛋白的部分，其决定所述分子的特异性，并与特异性的配体相接触。CDR是所述分子中可变性最高的区域，是这些分子多样性的基础。在每个V结构域中有三种CDR区，CDR1,CDR2和CDR3。CDR-H表示可变重链的CDR区，CDR-L指可变轻链的CDR区。VH指可变重链，VL指可变轻链。Ig-衍生区域的CDR区可如Kabat“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,5th edit.NIH Publication no.91-3242U.S.Department of Health andHuman Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917or Chothia Nature342(1989),877-883中所描述的进行确定。
因此，在本发明的内容中，所述的抗体分子，诸如上述的双特异性抗体，选自：完全抗体(免疫球蛋白，诸如IgG1，IgG2，IgG2b，IgG3，IgG4，IgA，IgM，IgD或IgE),F(ab)-,Fab’-SH-,Fv-,Fab’-,F(ab’)2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，完全人抗体，二价抗体-构建体，抗体-融合蛋白，合成抗体,二价单链抗体，三价单链抗体和多价单链抗体。
本申请中所用的术语“完全-人抗体”指仅包含人免疫球蛋白的蛋白质序列的抗体。如果是在小鼠中，或在小鼠细胞中，或衍生自小鼠细胞的杂交瘤中制备的完全人抗体，可能包含鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“鼠抗体”指仅包含小鼠(鼠)免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。另外，如果是在大鼠中，在大鼠细胞中，或在衍生自大鼠细胞的杂交瘤中制备的“完全人抗体”，可能包含大鼠碳水化合物链。类似地，术语“大鼠抗体”指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。制备完全-人抗体可通过,例如，噬菌体展示，其是被广泛应用的筛选技术，能用来生产以及筛选完全人抗体。噬菌体抗体也可以用于本发明。噬菌体展示方法在，例如US 5,403,484,US 5,969,108和US 5,885,793中有描述。另一种能研发完全-人抗体的技术涉及对小鼠杂交瘤技术的修饰。通过转基因制备包含人免疫球蛋白基因组，以替代其自身的小鼠基因的小鼠(参见，例如，US 5,877,397)。
本申请所用的术语抗体也包含嵌合抗体。术语“嵌合抗体”指包含与来自另一种人或非-人种(例如小鼠,马，兔，狗，牛，鸡)的抗体区域(例如恒定区)融合或嵌合的人或非-人种的可变区的抗体。
术语抗体也指重组的人抗体，异种抗体和异杂合抗体。术语“重组的人抗体”包括通过重组的手段制备、表达、创建或分离的全部人序列抗体，如由人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体；利用转染进入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，由重组组合人抗体文库分离的抗体，通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组的人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在的话)。但是，可以对此类抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，由此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然是衍生自人种系VH和VL序列且与其相关，但是并非天然地存在于人抗体种系体内所有组成成分(repertoire)之中。
“异种抗体”是相对于涉及生产所述抗体的转基因非-人生物体定义的。该术语指具有不是在所述转基因非-人动物生物体中的，而通常是来自所述转基因非-人动物之外的种类的氨基酸序列或其编码核酸序列的抗体。
术语“异杂合抗体”指具有不同的生物来源的轻链和重链的抗体，例如，具有与鼠轻链相关联的人重链的抗体是异杂合抗体。异杂合抗体的示例包括嵌合的和人源化的抗体。
术语抗体还指人源化抗体。非-人(例如鼠或兔)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或抗体的其他抗原-结合序列)，其包含最低限度的衍生自非-人免疫球蛋白的序列。常见地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性，亲和力以及能力的、来自非-人种类(供体抗体)如小鼠,大鼠或兔的CDR的残基替代。有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非-人残基替代。此外，人源化抗体可包括既不是受体抗体中的残基，也不是被引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰使得抗体的性能被进一步地改善并优化。一般而言，所述的人源化抗体基本上包含至少一个，典型地是两个可变结构域的全部，全部或基本上全部的CDR区相应于非-人免疫球蛋白中的那些区域，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些区域。所述人源化抗体还可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，特别是人免疫球蛋白的恒定区。更详细的内容请参见:JonesNature321(1986),522-525；Reichmann Nature332(1998),323-327和Presta CurrOp Struct Biol2(1992),593-596。
通常使用的抗体人源化方法包括CDR移植(grafting)，其中，来自非-人‘供体’抗体的功能性抗原-结合位点被移植到人‘受体’抗体。CDR移植方法是本领域已知的，并在例如US 5,225,539,US 5,693,761和US 6,407,213中有描述。另一种相关的方法是由转基因动物生产人源化抗体，所述的转基因动物经遗传工程化以包含一个或以上能够进行基因重排和基因转变的人源化免疫球蛋白基因座(参见，例如US 7,129,084)。
因此，在本发明的内容中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子以及这种免疫球蛋白分子的部分。另外，如上所述，该术语涉及经修饰的和/或经改变的抗体分子。该术语也涉及通过重组或合成的方式产生/合成的抗体。这一术语也指完整抗体(intactantibody)以及其抗体片段，诸如经分离的轻链和重链,Fab,Fab/c,Fv,Fab’,F(ab’)2。术语“抗体”也包含双功能抗体，三功能抗体，完全-人抗体,嵌合抗体，人源化抗体和抗体构建体，诸如单链Fvs(scFv)或抗体-融合蛋白。
在本发明的内容中,“单链Fvs”或“scFv”抗体片段具有抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单一的多肽链中。一般而言，scFv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成抗原结合所需的结构。生产单链抗体的技术在，例如Plückthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，Rosenburg和Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.113(1994),269-315中有描述。
本发明中所使用的“Fab片段”包含一条轻链以及重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fc”区包含抗体CH2和CH3结构域的两个重链片段。所述的两个重链片段通过两个或以上的二硫键以及CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab'片段”包含一条轻链以及一条重链的一部分，所述重链部分包含VH结构域，CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，由此，可以在Fab'片段的两重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，其中的重链包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，由此在上述两条重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，所述两个Fab'片段通过两条重链间的二硫键保持在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
值得注意的是，本发明的双特异性抗体分子可能包含，除此处所定义的第一(Ig-衍生的)结构域和(Ig-衍生的)第二结构域之外的附加的结构域，例如用于通过重组方式生产的构建体的分离和/或制备。
应当注意的是，根据本发明，不仅是以上描述的本发明的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)的第一结构域可以被修饰，所述第一结构域特异性地与CD8+T-细胞上的、非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上(人)的抗原相互作用/结合。也可以预计，(Ig-衍生的)第一结构域,(Ig-衍生的)第二结构域和/或连接接头-区，被修饰，例如人源化抗体，CDR移植抗体或完全人抗体。
“人源化方式”是本领域公知的，特别是有关抗体分子,例如Ig-衍生的分子的描述。术语“人源化的”指非-人(例如鼠)抗体的、或其片段(如Fv,Fab,Fab’,F(ab’),scFvs或抗体的其他抗原-结合部分序列)的人源化形式，所述的片段包含有衍生自非-人抗体的序列的一些部分。人源化抗体包括人免疫球蛋白，其中来自人免疫球蛋白互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性，亲和力以及能力的、来自非-人种如小鼠,大鼠或兔的CDR的残基替代。通常，人源化抗体基本上包含至少一个，通常是两个可变结构域的全部，其中，全部或基本上全部的CDR区相应于非-人免疫球蛋白中的那些区域，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些区域。所述人源化抗体还可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，最佳地，人免疫球蛋白的恒定区；具体参见，尤其是,Jones等,Nature321(1986),522-525,Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992),593-596。非-人抗体的人源化方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有一个或以上被引入其中的非-人来源的氨基酸，但其仍然保持其固有的抗体结合活性。有关抗体/抗体分子人源化的方法，在Jones等,Nature321(1986),522-525；Reichmann等,Nature332(1988),323-327；和Verhoeyen等,Science239(1988),1534-1536中有更详细的描述。人源化抗体的具体示例,例如定向针对EpCAM的抗体是本领域已知的,参见例如(LoBuglio,Proceedings of the American Society ofClinical Oncology Abstract(1997),1562and Khor,Proceedings of the AmericanSociety of Clinical Oncology Abstract(1997),847)。
在本发明的内容中特别提供了双特异性抗体分子，其是人源化的并可以被成功地应用于药物组合物。在本发明的内容中，所述的(人源化的)双特异性抗体分子可应用于下述的试剂盒中。
在本发明的内容中，所述双特异性抗体分子的(Ig-衍生的)第一结构域包含对非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原具有特异性的抗原-相互作用-位点。
所用的术语“非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原”指掺入到CD8+T-细胞中的分子，其天然状态下不存在于CD8+T-细胞之中和/或CD8+T-细胞表面上，并且非(内源性地)在(非-转导的)CD8+T-细胞之中或之上表达。因此，非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记是通过人工的方式引入到CD8+T细胞中的。在本发明的内容中，所述的CD8+T-细胞是由本申请所定义的待治疗的受试者分离/获取的。在本发明的内容中,天然地存在于/内源性地表达于CD8+T-细胞的T-细胞受体的抗原肽从上述术语“非天然地存在于CD8+T-细胞上的抗原”中被排除。因此，这些通过人工方式引入并随后呈现于所述CD8+T-细胞之中和/或所述CD8+T-细胞表面上的分子包含能够接近(体外或体内)(Ig-衍生的)结合结构域，优选抗体，抗体的片段或衍生物的结构域或表位，其非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上。在本发明的内容中,如下文中所述，这些人工方式引入的分子是在(反转录病毒)转导后呈现在CD8+T-细胞之中和/或CD8+T-细胞表面上的。
在本发明的内容中,术语“非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原”指具有高于500,550,600,650,700,750,800,850,900,950或1000抗原分子/每个CD8+T-细胞的、非天然地存在于/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记。由此，所述的抗原/标记不以高于1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9或2.00/00(promille)存在于/内源性地表达于正常的(非-转导的)CD8+T-细胞群细胞之中和/或之上。所述天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记的存在和数量可通过本领域已知的方法,如FACS分析,ELISA,共焦显微术,分析HPLC等等，监控。
这些分子的示例包括非-免疫源性的蛋白质,优选人来源的。换言之，所述的分子可能或者其本身是功能上惰性的蛋白质分子，或将通过本领域已知的基因重组技术成为功能上惰性的(示例可以是缺失了细胞内信号结构域的蛋白质分子(如所附加的实施例中所说明的，通过没有细胞内信号结构域的(人)EGFR，指本申请中所述的del-hEGFR构建体(SEQID NOs:11和12))或胞外结构域的失活点突变使得所述的分子成为功能上惰性的)。突变的(人)EGFR形式(version)的另一个示例是所附加的实施例中所使用的del-hGFRvIII构建体(SEQ ID NO:17所示的DNA，SEQ ID NO:18所示的(编码的)氨基酸序列)。hEGFRvIII是在胶质母细胞瘤和乳腺癌，卵巢癌和肺癌中发现的人表皮生长因子受体的突变体。所述突变体的受体在其胞外结构域中有缺失(Lorimer等,Proc.Natl.Acad.Sci USA93:14815-14820(1996))。
下文中给出了符合上述标准的标记的示例，其包括但不限于cripto(隐蔽家族蛋白(cryptic family protein)),CD(分化簇(cluster of differentiation))-家族(非T-细胞)的成员,EGFR或TSH-R。
在本发明的内容中所描述的双特异性抗体分子与非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原结合，所述抗原选自cripto(隐蔽家族蛋白)，CD(分化簇)-家族(非T-细胞)的成员，EGFR和TSH-R。由此本申请所述的双特异性抗体分子与(排他地)不是天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)(如术语“非T-细胞”所称的)之中和/或之上CD-家族的成员，cripto,EGFR或TSH-R(排他地)相互作用/结合。在本发明的内容中，所述的双特异性抗体分子与非内源性的在T-细胞(CD8+T-细胞)(如术语“非T-细胞”所称的)之中和/或之上表达的CD-家族的成员，cripto,EGFR或TSH-R相互作用/结合。
(人)cripto(隐蔽家族蛋白)成员，CD(分化簇)-家族(非T-细胞)家族成员，EGFR或TSH-R的氨基酸序列可获自UniProtKB/Swiss-Prot数据库并可在http:// www.uniprot.org/uniprot/？query＝reviewed％3Ayes找到。这些(蛋白质)序列也涉及经注释的修饰序列。本发明还提供技术和方法，其中用到本申请中的简明序列(concisesequences)的同源序列、遗传等位基因变体(genetic allelic variants)等等。优选地，使用所述简明序列的“变体”等等。优选地，此类“变体”是遗传变体。本领域技术人员能够容易地推断出这些数据库条目(entries)中的这些(蛋白质)序列的相关编码区，所述的数据库还可能包括基因组DNA以及mRNA/cDNA的条目。
本申请中所用的、与“非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地在CD8+T-细胞之中和/或之上表达的抗原”相关的术语“CD(分化簇)-家族(非T-细胞)”指选自下组的任一CD序列：CD9,CD10,CD11,CD12,CD13,CD14,CD15,CD16,CD17,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD39,CD40,CD41,CD43,CD46,CD48,CD49,CD50,CD51,CD54,CD55,CD56,CD57,CD59,CD61,CD63,CD64,CD66,CD67,CD68,CD70,CD72,CD74,CD75,CD76,CD77,CD79,CD81,CD82,CD83,CD84,CD87,CD88,CD89,CD90,CD91,CD92,CD93,CD94,CD95,CD97,CD98,CD99,CD100,CD101,CD102,CD103,CD104,CD105,CD106,CD107,CD108,CD109,CD110,CD111,CD112,CD113,CD114,CD115,CD116,CD117,CD118,CD119,CD121,CD123,CD124,CD125,CD126,CD130,CD131,CD133,CD134,CD135,CD136,CD137,CD138,CD140,CD141,CD142,CD143,CD144,CD146,CD147,CD148,CD151,CD153,CD155,CD156,CD157,CD158,CD159,CD160,CD161,CD162,CD163,CD164,CD166,CD167,CD168,CD169,CD170,CD171,CD172,CD177,CD178,CD179,CD180,CD181,CD182,CD183,CD184,CD185,CD186,CD191,CD192,CD193,CD200,CD201,CD204,CD206,CD207,CD208,CD209,CD217,CD218,CD220,CD221,CD222,CD223,CD224,CD225,CD226,CD227,CD228,CD230,CD231,CD232,CD233,CD234,CD236,CD238,CD239,CD241,CD242,CD243,CD244,CD246,CD248,CD249,CD252,CD253,CD254,CD256,CD257,CD258,CD261,CD262,CD263,CD264,CD265,CD266,CD267,CD268,CD269,CD270,CD271,CD276,CD277,CD280,CD281,CD282,CD283,CD284,CD286,CD288,CD289,CD290,CD292,CD294,CD295,CD296,CD297,CD298,CD299,CD300,CD301,CD302,CD303,CD304,CD305,CD306,CD309,CD312,CD314,CD315,CD316,CD317,CD318,CD319,CD320,CD321,CD322,CD324,CD325,CD326,CD327,CD328,CD329,CD331,CD332,CD333,CD334,CD335,CD336,CD337,CD338,CD339,CD340,CD344,CD349,CD350,CD351,CD352,CD353,CD354,CD355,CD357,CD358,CD360,CD361,CD362和CD363。
(人)CD9(CD9抗原)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目(database entry)P21926(条目版本(entry version)123,序列版本(sequence version)4)；(人)CD10(中性溶酶)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P08473(条目版本151,序列版本2)；(人)CD11(整联蛋白α-D)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q13349(条目版本110,序列版本2)；(人)CD13(氨肽酶N)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P15144(条目版本145，序列版本4)；(人)CD14(单核细胞分化抗原CD14)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P08571(条目版本131,序列版本2)；(人)CD16(Fc-γ受体IIIb)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9ULV2(条目版本51,序列版本1)；(人)CD18(整联蛋白β-2)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P05107(条目版本162,序列版本2)；(人)CD19(B-淋巴细胞抗原CD19)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P15391(条目版本128,序列版本6)；(人)CD20(B-淋巴细胞抗原CD20)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P11836(条目版本118,序列版本1)；(人)CD21(2型补体受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P20023(条目版本128,序列版本2)；(人)CD22(B-细胞受体CD22)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P20273(条目版本136,序列版本2)；(人)CD23(低亲和力ε免疫球蛋白Fc受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P06734(条目版本133,序列版本1)；(人)CD24(信号转导物CD24)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P25063(条目版本106,序列版本2)；(人)CD26(二肽基肽酶4)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P27487(条目版本140,序列版本2)；(人)CD27(CD27抗原)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P26842(条目版本119,序列版本2)；(人)CD29(整联蛋白β-1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P05556(条目版本154,序列版本2)；(人)CD30(肿瘤坏死因子受体超家族成员8)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P28908(条目版本129；序列版本1)；(人)CD31(血小板内皮细胞粘附分子)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P16284(条目版本146,序列版本1)；(人)CD32(低亲和力γ免疫球蛋白Fc区受体II-b)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P31994(条目版本138,序列版本2)；(人)CD33(骨髓细胞表面抗原CD33)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P20138(条目版本130,序列版本2)；(人)CD34(造血祖细胞抗原CD34)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P28906(条目版本108,序列版本2)；(人)CD35(1型补体受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P17927(条目版本131,序列版本3)；(人)CD36(血小板糖蛋白4)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P16671(条目版本133,序列版本2)；(人)CD38(ADP-核糖基环化酶1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P28907(条目版本126,序列版本2)；(人)CD39(胞外核苷酶三磷酸二磷酸水解酶1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P49961(条目版本114,序列版本1)；(人)CD40(肿瘤坏死因子受体超家族成员5)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P25942(条目版本147,序列版本1)；(人)CD41(整联蛋白α-IIb)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P08514(条目版本158,序列版本3)；(人)CD43(白涎蛋白(Leukosialin))的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P16150(条目版本110,序列版本1)；(人)CD46(细胞膜辅因子蛋白)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P15529(条目版本145,序列版本3)；(人)CD48(CD48抗原)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P09326(条目版本137,序列版本2)；(人)CD49(整联蛋白α-4)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P13612(条目版本128,序列版本3)；(人)CD50(胞间黏附分子3)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P32942(条目版本128,序列版本2)；(人)CD51(整联蛋白α-V)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P06756(条目版本149,序列版本2)；(人)CD54(胞间黏附分子1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P05362(条目版本160,序列版本2)；(人)CD55(补体衰退加速因子)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P08174(条目版本143,序列版本4)；(人)CD56(神经细胞黏附分子1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P13591(条目版本132,序列版本3)；(人)CD57(杀伤细胞植物凝集素样受体亚家族G成员1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q96E93(条目版本72,序列版本1)；(人)CD59(CD59糖蛋白)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P13987(条目版本139,序列信息1)；(人)CD61(整联蛋白β-3)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P05106(条目版本175,序列版本2)；(人)CD63(CD63抗原)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P08962(条目版本122,序列版本2)；(人)CD64(高亲和力免疫球蛋白γFc受体I)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P12314(条目版本128,序列版本2)；(人)CD66(癌胚抗原-相关细胞黏附分子1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P13688(条目版本133,序列版本2)；(人)CD67(癌胚抗原-相关细胞黏附分子8)的序列可获自Swiss-type 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Fc受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q8WWV6(条目版本65,序列版本1)；(人)CD352(SLAM家族成员6)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q96DU3(条目版本93,序列版本3)；(人)CD353(SLAM家族成员8)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9P0V8(条目版本80,序列版本1)；(人)CD354(在骨髓细胞1上表达的触发受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9NP99(条目版本93,序列版本1)；(人)CD355(细胞毒性和调节T-细胞分子)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目O95727(条目版本81,序列版本2)；(人)CD357(肿瘤坏死因子受体超家族成员18)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9Y5U5(条目版本103,序列版本1)；(人)CD358(肿瘤坏死因子受体超家族成员21)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目O75509(条目版本110，序列版本1)；(人)CD360(白介素-21受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9HBE5(条目版本104,序列版本1)；(人)CD361(蛋白EVI2B)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P34910(条目版本87,序列版本2)；(人)CD362(黏结蛋白聚糖-2)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P34741(条目版本105，序列版本2)；(人)CD363(鞘氨醇1-磷酸受体1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P21453(条目版本116,序列版本2)；(人)Criptic家族蛋白(Criptic family protein 1-B)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P0CG36(条目版本12,序列版本1)；(人)促甲状腺素受体(TSHR)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P16473(条目版本152,序列版本2)；或(人)表皮生长因子受体(EGFR)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P00533(条目版本178,序列版本2)。
如上所述，上文中的双特异性抗体分子的(Ig-衍生的)第二结构域可包括与天然地存在于肿瘤细胞上的细胞表面分子具有特异性的抗原-相互作用-位点。
本申请中所用的术语“天然地存在于肿瘤细胞上的细胞表面分子”也代表被呈递到(presented)肿瘤细胞表面的分子。术语“天然地存在”指内源性地在肿瘤细胞表面表达的分子。术语“细胞表面分子”指(天然地/内源性地)表达/呈现在细胞表面上的分子，包含能够接近(体外或体内)(Ig-衍生的)结合结构域，优选抗体，抗体的片段或衍生物的结构域或表位。如上所述，所述Ig-衍生的第二结合结构域可以是scFv。所述细胞表面分子的示例是膜蛋白和跨膜蛋白，适合于(adapted to)所述蛋白质或细胞表面的分子等。因此，本发明的内容中所述的细胞表面分子是肿瘤特异性标记。本发明的内容中所述的肿瘤特异性标记指通常是内源性地在肿瘤细胞表面表达的标记。
在本发明的内容中，术语“肿瘤特异性标记”指天然地/内源性地呈递到和/或位于肿瘤细胞表面的分子，或者其是遍在表达的，但是仅在肿瘤细胞表面上可接近并结合抗体，抗体片段或抗体衍生物。此处所述的“肿瘤特异性标记”描述的是优先地或排他性地表达于肿瘤细胞上的蛋白质。所谓优先地，是指与正常的体细胞相比，在肿瘤细胞上相对更高地表达，所谓排他地，是指通过本领域专家已知的蛋白质表达检测方法，没有在体细胞上发现的、在肿瘤细胞上的蛋白质表达。符合这些标准的蛋白质可以，例如通过本领域所公知的消减(subtractive)或差异表达筛选进行鉴定。需要通过本发明的治疗方法进行探索的肿瘤细胞特异性表达的程度可通过细胞测定来评估，其中，表达所关注的抗原的细胞与对所述抗原具有特异性T-细胞一起培养，确定经诱导的杀伤特异性。
“优先表达”指由于基因扩增、转录上调或mRNA稳定化所介导的蛋白质过表达，或者是影响所述蛋白质更新(turnover)的突变使得，与正常的体细胞相比，蛋白质在肿瘤细胞上相对更高地表达。优先也定义了那些既在肿瘤细胞上表达也在正常细胞上表达的蛋白质，但是正常细胞通常不能接近T-细胞或抗体，如人体的免疫特权(immune-privileged)区域。此外，在肿瘤细胞上表达但不在治疗范围内的正常细胞上表达的蛋白质也落入这一定义的范围，如只在胚胎发育期间表达的蛋白质。
“排他表达”指在治疗过程中唯独在肿瘤细胞上发现的蛋白质。优选地，此类蛋白质展示在细胞表面并在其胞外部分带有未在正常细胞上发现的点突变或缺失。类似地，由肿瘤-特异性的脱落酶(sheddases)活性引起的新-表位属于这一类别。排他表达也包括仅在肿瘤细胞上发现而不在正常细胞上的异常的糖结构(glycostructures)。
在本发明的内容中，所述的双特异性抗体分子的第一结合结构域和第二结合结构域与不同的抗原结合。
下文中给出天然存在于肿瘤细胞表面的肿瘤标记的示例，其包括，但不限于EpCAM,HER-1,HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,CA-12-5,HLA-DR,MUC-1(黏蛋白),A33-抗原,PSMA(前列腺特异性膜抗原),运铁蛋白-受体,生腱蛋白或CA-IX。
因此，在本发明的内容中，所述的双特异性抗体分子包含选自下组的天然存在于肿瘤细胞表面的抗原/标记，即：EpCAM,HER-1,HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,CA-12-5,HLA-DR,MUC-1(黏蛋白),A33-抗原,PSMA(前列腺特异性膜抗原),运铁蛋白-受体,生腱蛋白和CA-IX。在本发明的内容中，所描述的双特异性抗体分子包含选自下组的、在肿瘤细胞表面内源性表达的抗原/标记，即：EpCAM,HER-1,HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,CA-12-5,HLA-DR,MUC-1(黏蛋白),A33-抗原,PSMA(前列腺特异性膜抗原),运铁蛋白-受体,生腱蛋白和CA-IX。
EpCAM,HER-1,HER-2,HER-3,CD20,CD22,CD33,CD52,CA-12-5,HLA-DR,MUC-1(黏蛋白),A33-抗原,PSMA(前列腺特异性膜抗原),运铁蛋白-受体,生腱蛋白或CA-IX的(人)成员的序列可获自UniProtKB/Swiss-Prot数据库并可在http://www.uniprot.org/uniprot/？ query＝reviewed％3Ayes找到。这些(蛋白质)序列也涉及经注释的修饰序列。本发明还提供技术和方法，其中用到本申请中的简明序列的同源序列、遗传等位基因变体等等。优选地，使用所述简明序列的“变体”等等。优选地，此类“变体”是遗传变体。本领域技术人员能够容易地推断出这些数据库条目(entries)中的这些(蛋白质)序列的相关编码区，所述的数据库还可能包括基因组DNA以及mRNA/cDNA的条目。
(人)EpCAM(上皮细胞黏附分子)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P16422(条目版本117,序列版本2)；(人)HER-1(表皮生长因子受体)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P00533(条目版本177,序列版本2)；(人)HER-2(受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P04626(条目版本161,序列版本1)；(人)HER-3(受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P21860(条目版本140,序列版本1)；(人)CD20(B-淋巴细胞抗原CD20)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P11836(条目版本117,序列版本1)；(人)CD22(B-淋巴细胞抗原CD22)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P20273(条目版本135,序列版本2)；(人)CD33(B-淋巴细胞抗原CD33)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P20138(条目版本129,序列版本2)；(人)CA-12-5(黏蛋白16)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q8WXI7(条目版本66,序列版本2)；(人)HLA-DR的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q29900(条目版本59,序列版本1)；(人)MUC-1(黏蛋白-1)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P15941(条目版本135,序列版本3)；(人)A33(细胞表面A33抗原)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q99795(条目版本104,序列版本1)；(人)PSMA(谷氨酸羧肽酶2)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q04609(条目版本133,序列版本1),(人)运铁蛋白受体的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q9UP52(条目版本99,序列版本1)和P02786(条目版本152,序列版本2)；(人)生腱蛋白的序列可获自Swiss-Prot数据库条目P24821(条目版本141,序列版本3)；或者(人)CA-IX(碳酸酐酶9)的序列可获自Swiss-Prot数据库条目Q16790(条目版本115,序列版本2)。
在本发明的内容中描述了，包含结合于(人)Cripto/定向针对(人)Cripto/与(人)Cripto相互作用的第一结合结构域，和结合于(人)EpCAM/定向针对(人)EpCAM/与(人)EpCAM相互作用的第二结构域的双特异性抗体。
本申请所提供的分子或构建体(即，此处描述的双特异性抗体分子)在医学环境下特别有用。例如可以利用本申请所描述的双特异性构建体治疗恶性疾病。在本发明的内容中，所述的恶性疾病可能是癌症(cancer)/起源于上皮细胞，内皮细胞或间皮细胞的癌(carcinoma)或者是血液癌症。在本发明的内容中所述的癌症/癌选自：胃肠癌，胰腺癌，胆管细胞癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮肤癌，口腔癌，胃癌，子宫颈癌，B和T-细胞淋巴瘤，骨髓性白血病，卵巢癌，白血病，淋巴细胞性白血病，鼻咽癌，结肠癌，前列腺癌，肾细胞癌的，头颈癌，皮肤癌(黑素瘤)，生殖器-尿路癌，例如睾丸癌，卵巢癌，内皮细胞癌宫颈癌和肾癌，胆管癌，食道癌，唾液腺癌，和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病样血液肿瘤，神经胶质瘤，肉瘤或骨肉瘤肿瘤。
本申请所提供的分子或构建体(即，此处描述的双特异性抗体分子)在医学环境下特别有用。例如肿瘤性疾病和/或淋巴瘤，可应用针对这些医学适应症(indication)的双特异性构建体进行治疗。双特异性抗体(分子)的适应症由肿瘤抗原的表达给出。在实体中表达的肿瘤抗原实际上可以与任何上述的T-细胞标记(代表天然地存在于肿瘤细胞上/在肿瘤细胞的表面内源性地表达的抗原)结合。例如，胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌可以用，经由第二结合结构域定向针对(人)EpCAM(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请中所定义的非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。因此，在本发明中，定向针对(人)EpCAM(作为第二结合结构域)，并包含定向针对/结合于/相互作用于Cripto的第一结合结构域的双特异性抗体构建体可用于治疗胃肠癌,例如胃肠起源的腺癌。胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)HER1(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。胃癌,乳腺癌和/或宫颈癌可利用，经由第二结合结构域定向针对(人)HER2(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。胃癌和/或肺癌可利用经由第二结合结构域定向针对(人)HER3(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)并包含经由第二结合结构域定向针对(人)HER3(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。B-细胞淋巴瘤和/或T-细胞淋巴瘤可利用，经由第二结合结构域定向针对(人)CD20(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。B-细胞淋巴瘤和/或T-细胞淋巴瘤可利用，经由第二结合结构域定向针对(人)CD22(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。骨髓性白血病可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)CD33(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性构建体进行治疗。卵巢癌,肺癌,乳腺癌和/或胃肠癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)CA12-5(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。胃肠癌,白血病和/或鼻咽癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)HLA-DR(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。结肠癌,乳腺癌,卵巢癌,肺癌和/或胰腺癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)MUC-1(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。结肠癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)A33(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。前列腺癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)PSMA(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)运铁蛋白受体(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。胰腺癌,朗格癌(lunger cancer)和/或乳腺癌可利用，经由第二结合结构域定向针对(人)运铁蛋白受体(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。肾癌可以利用，经由第二结合结构域定向针对(人)CA-IX(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含定向针对/结合于/相互作用于本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的第一结合结构域的双特异性分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)进行治疗。
如所附加的实施例所示，作为本发明的构思的证据，特异性的、本发明的双特异性抗体分子包含上述定义的、结合(人)EGFR/定向针对(人)EGFR/与(人)EGFR相互作用的第一(Ig-衍生的)结构域，以及结合(人)EpCAM/定向针对(人)EpCAM/与(人)EpCAM相互作用的第二(Ig-衍生的)结构域。
上皮细胞黏附分子(EpCAM,也称为17-1A抗原,KSA,EGP40,GA733-2,ks1-4或esa)是具有314个氨基酸的40-kDa膜整合糖蛋白，在某些上皮细胞和多种人类癌细胞上特异性表达(参见综述：Balzar,J.Mol.Med.(1999),77,699-712)。通过鼠单克隆抗体17-1A/edrecolomab的识别发现了EpCAM并对其进行了克隆(Goettlinger,Int J Cancer38(1986),47-53，和Simon,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990),2755-2759)。EpCAM以定向的且高度有序的方式黏附上皮细胞(Litvinov,J Cell Biol.139(1997),1337-1348)。一旦恶性转化上皮细胞，迅速生长的肿瘤细胞废弃上皮细胞高度的细胞秩序。结果EpCAM的表面分布很少受到限制，使得所述分子更多地暴露于肿瘤细胞表面，易于结合肿瘤细胞表面的抗体，抗体片段或抗体衍生物。鉴于它们起源于上皮细胞，源于大多数癌的肿瘤细胞仍然在其表面表达EpCAM。
在体内，EpCAM的表达与上皮细胞增殖提高相关，并与细胞分化负相关(综述参见Balzar,J.Mol.Med.77(1999),699-712)。EpCAM的表达基本上可见于全部主要的癌(参见综述Balzar,J.Mol.Med.77(1999),699-712或记载于尤其是De Bree,Nucl Med Commun.15(1994),613-27；Zhang,Clin Cancer Res.4(1998),295-302中的内容)。由于其广泛地表达，EpCAM又被称作“泛-癌(pan-carcinoma)”抗原。在许多情况下，可以观察到，与亲本上皮细胞或所述癌症的较弱攻击形式相比，肿瘤细胞更高水平地表达EpCAM。例如，升高的EpCAM表达代表前列腺癌发展的早期事件(Poczatek,J.Urol.162(1999),1462-1644)。此外，在大多数的宫颈鳞状癌和宫颈腺癌中，强烈的EpCAM表达与增殖提高和终末分化标记消失相关(Litvinov,Am.J.Pathol.148(1996),865-75)。在乳腺癌中，EpCAM在肿瘤细胞上过表达是一种存活预报(Gastl,Lancet356(2000),1981-1982)。EpCAM是患有头、颈和肺部鳞状细胞癌的患者中肿瘤细胞播散的检测标记(Chaubal,Anticancer Res.19(1999),2237-2242andPiyathilake,Hum.Pathol.31(2000),482-487)。在表皮，口腔，会厌，咽，喉和食管中发现的正常的鳞状上皮细胞无明显表达EpCAM(Quak,Hybridoma9(1990),377-387)。已证明EpCAM在大多数的原发性、转移性和播散性的NSCLC(非小细胞肺癌细胞(Passlick,Int JCancer87(2000),548-552))上表达，在胃和胃-食道连接处腺癌上表达(Martin,J.Clin.Pathol.52(1999),701-4)并在衍生自结肠直肠癌，胰腺癌和乳腺癌的细胞系中表达(Szala,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990),3542-6and Packeisen,Hybridoma18(1999),37-40)。
如所附加的实施例中所示，作为本发明的构思的证据，(人)抗-EGFR抗体与(鼠)抗-EpCAM(G8.8)结合以形成双特异性构建体MAb225_scFv_G8.8。所述(人)抗-EGFR抗体的轻链氨基酸序列如下所示(指SEQ ID NO:1):
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro GlyAla Ile Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro GlyGlu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His TrpTyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu SerIle Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuSer Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn AsnAsn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp AlaAla Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly AlaSer Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp LysIle Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp SerLys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr GluArg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile ValLys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
(人)抗-EGFR抗体重链氨基酸序列如下所示(指SEQ ID NO:2):
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys ValLeu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln SerLeu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His TrpVal Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly GlyAsn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn SerLys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile TyrTyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln GlyThr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu AlaPro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys GlyTyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly ValHis Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val ThrVal Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro AlaSer Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro CysPro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile PhePro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys ValVal Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn AsnVal Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr LeuArg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu PheLys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser LysPro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu GluMet Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu AspIle Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr GluPro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu LysLys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu HisAsn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
(鼠)抗-EpCAM(G8.8)抗体轻链氨基酸序列如下所示(指SEQ ID NO:3):
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro GlyAla Ile Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu GlyGlu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp Leu Ala TrpTyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Arg LeuGln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser LeuLys Ile Ser Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser TyrLys Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp AlaAla Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly AlaSer Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp LysIle Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp SerLys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr GluArg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile ValLys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
(鼠)抗-EpCAM(G8.8)抗体重链氨基酸序列如下所示(指SEQ ID NO:4):
Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly ValGln Cys Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg SerMet Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Pro Met Ala TrpVal Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Thr Ser GlyGly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AsnAla Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala ThrTyr Tyr Cys Thr Arg Thr Leu Tyr Ile Leu Arg Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp GlyGln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr ProLeu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu ValLys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser SerGly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser SerVal Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala HisPro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile LysPro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val PheIle Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val ThrCys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe ValAsn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn SerThr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly LysGlu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr IleSer Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro GluGlu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met ProGlu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys AsnThr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg ValGlu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu GlyLeu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
双特异性产品(MAb225_scFv_G8.8)的轻链氨基酸序列如下所示(指SEQ ID NO:5):
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro GlyAla Ile Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro GlyGlu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His TrpTyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu SerIle Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuSer Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn AsnAsn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp AlaAla Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly AlaSer Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp LysIle Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp SerLys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr GluArg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile ValLys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
所述双特异性产品(MAb225_scFv_G8.8)的重链氨基酸序列如下所示(指SEQ IDNO:6):
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys ValLeu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln SerLeu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His TrpVal Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly GlyAsn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn SerLys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile TyrTyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln GlyThr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu AlaPro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys GlyTyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly ValHis Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val ThrVal Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro AlaSer Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro CysPro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile PhePro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys ValVal Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn AsnVal Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr LeuArg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu PheLys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser LysPro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu GluMet Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu AspIle Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr GluPro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu LysLys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu HisAsn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln ProGly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe ProMet Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile SerThr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile SerArg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu AspThr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Leu Tyr Ile Leu Arg Val Phe Tyr Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser LeuSer Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile SerAsn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile TyrAla Thr Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr PheCys Gln Gln Ser Tyr Lys Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys
此外，如图20和21中所示，作为本发明的构思的进一步的证据，构建了在一个臂上具有针对del-(人)hEGFRvIII的抗原结合位点，在另一个臂上具有针对(鼠)EpCAM的抗原结合位点的双特异性抗体(BiAb)“BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1”；参见实施例4。双特异性产品的轻链氨基酸序列(BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1)如图23A中所示(指SEQ ID NO:15)。双特异性产品(BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1)重链氨基酸序列如图23B中所示(指SEQ ID NO:16)。
本发明还提供编码本发明的双特异性抗体分子的核酸序列。
可以将调节序列添加于本发明的核酸分子对于本领域技术人员是显而易见的。例如，可以应用可诱导本发明的多核苷酸表达的启动子,转录增强子和/或序列。合适的诱导系统是，例如Gossen和Bujard Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551，以及Gossen等Trends Biotech.12(1994),58-62所述的四环素-调节的基因表达，或者如Crook EMBOJ.8(1989),513-519所述的地塞米松诱导的基因表达。
此外，可预期为了另外的目的，所述核酸分子可能包含，例如硫酯键和/或核苷酸类似物。所述的修饰可用于使所述核酸分子相对于细胞内的内切和/或外切核酸酶稳定。可通过包含，允许所述核酸分子在所述细胞中转录的嵌合基因的、合适载体，转录所述核酸分子。在这一方面，也可以理解，此类多核苷酸可用于“基因靶定”或“基因治疗”方法。在另外的具体实施方案中，所述核酸分子是经标记的。用于检测核酸的方法是本领域公知的,例如Southern和Northern印迹，PCR或引物延伸。这一具体实施方案可用于证明上述的核酸分子在基因治疗过程中被成功地引入的筛选方法。
所述核酸分子可以是通过重组的方式产生的嵌合核酸分子，其单独地或以组合的方式包含上述的任意核酸分子。在本发明的内容中，所述的核酸分子是载体的一部分。
本发明还涉及包含本发明中所述的核酸分子的载体。
许多合适的载体是分子生物学领域的普通技术人员所熟知的，根据所需的功能对载体进行选择，其包括质粒，黏粒，病毒，噬菌体以及其他遗传工程领域常用的载体。可利用本领域普通技术人员公知的方法构建多种质粒和载体，参见，例如，在Sambrook等(loccit.)和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中所描述的技术。或者，本发明的多核苷酸和载体可被重构(reconstituted)进脂质体以递送至靶细胞。如下文中进一步详细讨论的，利用克隆载体分离DNA的单独(individual)序列。将相关的序列转移到表达具体的多肽所需的表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK,pGEM,pUC9,pBR322,pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE,pCAL-n-EK,pESP-1,pOP13CAT。
本发明还涉及载体，其包含与本申请所定义的编码双特异性抗体构建体(分子)的核酸序列可操作连接的、作为调节序列的核酸序列。
此类调节序列(控制元件)是本领域普通技术人员公知的，其可包括启动子，剪接盒，翻译起始密码子，用于将插入物引入所述载体的翻译和插入位点。在本发明的内容中,所述核酸分子与允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。
可预期所述的载体是表达载体，其包含本申请所定义的编码所述双特异性抗体构建体(分子)的核酸分子。
术语“调节序列”指实现与之相连的编码序列的表达所必需的DNA序列。此类控制序列的性质根据宿主生物而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子,核糖体结合位点和终止子。在真核生物中通常控制序列包括启动子,终止子，以及有些情况下包括增强子，反式激活蛋白或转录因子。术语“控制序列”旨在包括，至少是表达所需要的全部组分，也可以包含其他的有益组分。
术语“可操作地连接”指并置(juxtaposition)，其中所描述的组分处于使得它们以所预期的方式行使功能的关系中。控制序列与编码序列“可操作地连接”是以所述编码序列的表达在适合于所述控制序列的条件下实现的方式进行的连接。当控制序列是启动子时，本领域技术人员显然了解，优选地使用双链核酸。
在本发明的内容中，所述的载体是表达载体。“表达载体”是一种构建体，其能够用于转化所选择的宿主并在所选择的宿主中提供编码序列的表达。表达载体可以是，例如克隆载体，二元载体或整合载体。表达包括核酸分子的转录，优选地转录成可翻译的mRNA。在原核生物和/或真核细胞中保证表达的调节元件是本领域普通技术人员所公知的。对于真核细胞，它们包含保证转录起始的正常启动子以及任选的，保证转录终止以及使转录物稳定的poly-A信号。使得在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包含，例如大肠杆菌中的PL,lac,trp或tac启动子。使得在真核宿主细胞中表达的可能的调节元件的示例是酵母中的AOX1或GAL1启动子，或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-，SV40，RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)，CMV-增强子,SV40-增强子或球蛋白内含子。
除了那些负责转录起始的元件之外，此类调节元件还可能包括多核苷酸下游的转录终止信号，如所述SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，根据所使用的表达系统，还可以向所述核酸序列的编码序列添加，能够引导所述编码序列到细胞区室或将其分泌到介质中的前导序列，这是本领域公知的；还可参见,例如后附的实施例。
前导序列是在合适的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起的，优选地，是能够指导翻译后的蛋白或其部分，分泌到周质空间或胞外介质中的前导序列。任选地，所述的异源序列可以编码包含赋予所需特性，例如所表达的重组产品的稳定或简化其纯化，的N-末端鉴定肽的融合蛋白；参见上述。这一方面，所述的表达载体是本领域已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia),pCDM8,pRc/CMV,pcDNA1,pcDNA3(In-vitrogene),pEF-DHFR,pEF-ADA或pEF-neo(Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
在本发明的内容中，所述的表达控制序列是能转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但是也可以使用原核宿主的控制序列。一旦所述的载体被整合到合适的宿主中，宿主被保持在适合于所述核苷酸序列高水平表达的条件下，如所期望的，接下来收集并纯化本发明的多肽，参见，例如所附加的实施例。
一种作为替代的、可用于表达细胞周期相互作用蛋白的表达系统是昆虫系统。在一个此类系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中用作表达外源基因的载体。可将所引述的核酸分子的编码序列克隆到所述病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。所述编码序列的成功插入将造成所述多角体蛋白基因失活，产生缺乏外壳蛋白包被的重组病毒。所述的重组病毒用于感染草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中表达本发明的蛋白质(Smith,J.Virol.46(1983),584；Engelhard,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(1994),3224-3227)。
其他的调节元件可包括转录以及翻译增强子。有益地，本发明的上述载体包含可选择的和/或可评分的(scorable)标记。
可用于选择经转化的细胞以及，例如植物组织和植物的，可选择的标记基因是本领域技术人员已知的，其包含例如，基于抗代谢物抗性作为dhfr选择的基础，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149),npt,其赋予对氨基糖苷，新霉素,卡那霉素和巴龙霉素(paromycin)的抗性(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995)以及hygro,其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene32(1984),481-485)。已描述的另外的可选择的基因称为trpB，其使得细胞利用吲哚替代色氨酸；hisD,其使得细胞利用组氨醇(histinol)替代组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其使得细胞利用甘露糖(WO94/20627)，和ODC(鸟氨酸脱羧酶)其赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂,2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸,DFMO抗性(McConlogue,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratoryed.)或者来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
有用的可评分的标记是本领域技术人员已知的，并且是可通过商业途径获得的。有益地，所述标记是编码荧光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact.178(1996),121),绿荧光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47)或β-葡糖苷酸酶(Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907)的基因。这一实施方案对于简单快速地筛选包含所引述的载体的细胞、组织或生物特别有用。
如上所述，所引述的核酸分子可以单独使用，或者作为载体的一部分以在细胞中表达所编码的双特异性构建体，例如用于纯化或基因治疗目的，优选地与转导的CD8+T-细胞结合。所述的核酸分子或包含编码上述任一双特异性构建体的DNA序列的载体被引入到细胞中，其随后产生所关注的多肽。基于通过先体外后体内或体内技术将治疗性基因引入细胞的基因疗法，是基因转移的最重要的应用之一。用于体外或体内基因疗法的合适的载体，方法或所述方法中所用的基因-递送系统，或基因-递送系统已在本领域技术人员已知的文献中进行了描述；参见，例如Giordano,Nature Medicine2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science256(1992),808-813；Verma,Nature389(1994),239；Isner,Lancet348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood91(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang,Nature Medicine2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；US 5,580,859；US5,589,466；或Schaper,Current Opinion in Biotechnology7(1996),635-640。可将所引述的核酸分子和载体直接引入或通过脂质体，或病毒载体(例如腺病毒，反转录病毒)到所述细胞中。在本发明的内容中，所述的细胞是生殖细胞，胚细胞，卵细胞，或它们的衍生物，最优选地所述的细胞是干细胞。胚胎干细胞的示例可以是，具体而言，在Nagy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993),8424-8428中所述的干细胞。
根据上述，本发明涉及包含编码本申请所定义的双特异性抗体构建体的多肽序列的核酸分子的、基因工程中所常用的载体，尤其是质粒，黏粒和噬菌体，的方法。在本发明的内容中，所述的载体是表达载体和/或基因转移或靶定载体。衍生自病毒的表达载体，如反转录病毒，痘苗病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，或牛乳头状瘤病毒可用于将所述的多核苷酸或载体递送到靶定细胞群中。
重组载体可利用本领域普通技术人员已知的方法构建；参见，例如在Sambrook等(loc cit.),Ausubel(1989,loc cit.)或其他标准的教科书中所描述的技术。或者，所述的核酸分子和载体可以重组到脂质体中以向靶细胞递送。包含本发明的核酸分子的载体可以通过已知的方法转移到宿主细胞中，所述的方法随细胞宿主类型的不同而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主；参见Sambrook,同上。具体而言，所述的载体可以是pEF-DHFR,pEF-ADA或pEF-neo。所述载体pEF-DHFR,pEF-ADA和pEF-neo在本领域的文献，例如Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995),7021-7025和Raum等Cancer Immunol Immunother50(2001),141-150中已由描述。
本发明还提供经上述的载体转化或转染的宿主。所述的宿主可通过向宿主细胞中引入至少一个上述的载体或至少一个上述的核酸分子制备。宿主中存在至少一个上述的载体或至少一个上述的核酸分子可介导编码上述双特异性抗体分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)的基因的表达。
被引入到所述宿主中的所述核酸或载体可以整合到宿主的基因组中，也可以以染色体外形式保持。
所述的宿主可以是任意原核或真核细胞。
术语“原核生物”指包括全部可用表达本发明的蛋白质的DNA、或是DNA或RNA分子，转化、转导或转染的细菌。所述的原核宿主可包括革兰氏阴性和革兰氏阳性的细菌，例如，大肠杆菌(E.coli),鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium),粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核生物”指包括酵母，高等植物，昆虫和优选的哺乳动物细胞。根据用于重组生产过程的宿主的不同，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质可以是糖基化的或非糖基化的。特别优选的是利用包含本发明的多肽的编码序列以及通过遗传工程融合于所述序列的N-末端FLAG-标签和/和C-末端His-标签的质粒或病毒。优选地，所述FLAG-标签的长度是约4-8个氨基酸，最优选8个氨基酸。可通过本领域普通技术人员公知的任何技术用上述的多核苷酸转化或转染宿主。此外，制备融合的、可操作地连接的基因，并使它们在例如哺乳动物和细菌中表达的技术是本领域公知的(Sambrook,loc cit.)。
在本发明的内容中，所述的宿主(细胞)是细菌，昆虫，真菌，植物或动物细胞。
具体而言，可以预计所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞，更优选地是人细胞或人细胞系。
特别优选的宿主细胞包括HEK293,CHO细胞,COS细胞，骨髓瘤细胞系样SP2/0或NS/0。如所附加的实施例中所示，特别优选的是HEK293细胞作为宿主。
在另外的具体实施方案中，本发明涉及制备上述的双特异性抗体分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)的方法，其包括在允许所述的双特异性抗体分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)表达的条件下培养(接种)本发明的细胞和/或宿主细胞，并从所述的细胞和/或培养基中回收所述的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)。
所述经转化的宿主可在发酵器(fermentators)内生长并根据本领域已知的技术培养以获得最佳的细胞生长。然后从生长培养基中分离本发明的多肽。分离和纯化，例如微生物表达的本发明的多肽，可通过任何常规方式，例如，制备层析(preparativechromotagraphie)分离以及如使用针对本发明多肽的标签的单克隆或多克隆抗体的免疫分离，或如所附加的实施例中所描述的方式。
此外，本发明提供组合物(药物)，其包含通过上述的方法制备的、包含本申请所定义的双特异性(单克隆)抗体分子或(人)双特异性抗体分子，本发明的核酸分子，载体或宿主细胞，经转导的CD8+T-细胞。在本发明的内容中,所述的组合物是药物组合物，其还任选地包括，适当的载体，稳定剂和/或赋形剂组分。
再有，本发明提供本申请所定义的双特异性抗体分子用作药物，其中，所述的双特异性抗体分子，在施用包含非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，之前、同时或之后施用，其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
在本发明的内容中，提供药物组合物/药物，其包含本申请上述内容中定义的双特异性抗体分子，其与包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，结合施用，其中，所述的双特异性抗体分子在施用包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
在本发明的内容中，T-细胞是经非天然地存在于本申请所定义的T-细胞之中和/或之上，或非内源性地表达于本申请所定义的T-细胞之中和/或之上的抗原转导的。本发明还涉及经非天然地存在于本申请以上所定义的T-细胞之中和/或之上，或非内源性地表达于本申请以上所定义的T-细胞之中和/或之上的抗原转导的CD8+T-细胞。在本发明的内容中，这些转导的T-细胞(CD8+T-细胞)还包括T-细胞受体(TCR)。这些转导的T-细胞(CD8+T-细胞)是肿瘤特异性的，或由于这些T-细胞是由天然的自体T-细胞池(pool)分离并能够溶解肿瘤细胞，或是由于这些T-细胞已与肿瘤特异性T-细胞受体(TCR)共-转导。包含在本发明的内容中的T-细胞(CD8+T-细胞)还包括那些能够通过T-细胞受体识别复合物的，所述的复合物是主要组织相容性基因复合体(下文中简称作“MHC”)-编码的主要组织相容性抗原分子(MHC分子；对于人，称作“人白细胞抗原”(HLA))和T-细胞受体特异性抗原肽(其(结构上)不同于本申请以上定义的非天然地存在于CD8+T-细胞之中的抗原)的偶联物。因此，在本发明的内容中,为建立细胞毒性反应，可能需要(i)存在对靶细胞(指待治疗的受试者肿瘤细胞)的HLA-型具有特异性的T-细胞受体的T-细胞(CD8+T-细胞)和(ii)存在抗原肽，以便通过结合HLA分子所形成的复合物能够被TCR所识别。
本申请中所用的术语“T-细胞受体”指任意T-细胞受体,只要符合下述的三项标准即可，(i)肿瘤特异性，(ii)识别(大多数)肿瘤细胞，这意味着靶抗原应在(大多数)肿瘤细胞中表达，和(iii)所述的TCR与待治疗的受试者的HLA-型匹配。
在本申请中，符合上述三项标准的合适的T-细胞受体是本领域已知的，如WT1(Wilms肿瘤特异性抗原1；相关序列信息参见，例如Sugiyama H.,Japanese Journal ofClinical Oncology 40(2010),377-87),MAGE(序列参见，例如WO 2007/032255和PCT/US2011/57272),SSX(U.S.Provisional Application No.61/388,983),NY-ESO-1(相关序列信息参见，例如PCT/GB2005/001924)和/或HER2neu(相关序列信息参见WO 2011/0280894)。
在本发明的内容中,T-细胞(CD8+T-细胞)由受试者分离/获得。由患者分离/获得T-细胞(CD8+T-细胞)的方法本领域公知的，包括但不限于，以白细胞提取法，通过FACSort设备由患者分离/获取细胞，以手或通过显微操作器从含活细胞的新鲜的活检标本中挑出活细胞使其与死细胞分开(Dudley等,J.Immunother.26(2003),332-342；Robbins等,J.Clin.Oncol.29(2011),917-924和Leisegang,J.Mol.Med.86(2008),573-58)。术语“新鲜的患者活检”指通过外科手术的或其他任意已知的方法由受试者移出的肿瘤组织，以及肿瘤细胞系或来自肿瘤组织/肿瘤细胞的(经分离的)细胞。接下来对所述经分离/经获取的T-细胞进行培养，并利用抗-CD3抗体，利用抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体和/或利用抗-CD3抗体，抗-CD28抗体和IL-2扩增(Dudley等,J.Immunother.26(2003),332-342；Dudley等,J.Clin.Oncol.26(2008),5233-5239)。
在本发明的内容中，这些经分离/获得的T-细胞是CD8+T-细胞。用于鉴定在表面上天然存在的/内源性表达的抗原/标记的方法是本领域已知的，包括但不限于流式细胞术(Koch等,Immunity&Ageing5(2008),6),聚合酶链式反应(Fernandes S.,Clinical andDiagnostic Laboratory Immunology12(2005),477-483)和共焦显微术(Kenny E.等,Immunology101(2000),178-184)。
在接下来的步骤中，所述的T-细胞通过本领域已知的方法人工地/遗传工程化地修饰/转导(Francois M.Lemoine等,J Gene Med6(2004),374–386)。用于转导T-细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于，对于转导核酸或重组的核酸的情况，例如，电穿孔法，磷酸钙法，阳离子脂质法或脂质体法。利用可通过商业途径获得的转导试剂，例如Lipofectamine(Invitrogene制)可对核酸进行方便且高效的转导。对于应用载体的情况，只要是质粒载体，可以用与上述核酸相同的方式进行转导所述载体。在本发明的内容中，转导T-细胞的方法包括反转录病毒或慢病毒T-细胞转导以及mRNA转染。
在本申请中，用于(人)T-细胞转导的(反转录病毒)载体是本领域已知的，如SAMENCMV/SRa(Clay等,J.Immunol.163(1999),507-513),LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等,J.Exp.Med.186(1997),1597-1602),FeLV(Neil等,Nature308(1984),814-820),SAX(Kantoff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986),6563-6567),pDOL(Desiderio,J.Exp.Med.167(1988),372-388),N2(Kasid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),473-477),LNL6(Tiberghien等,Blood84(1994),1333-1341),pZipNEO(Chen等,J.Immunol.153(1994),3630-3638),LASN(Mullen等,Hum.Gene Ther.7(1996),1123-1129),pG1XsNa(Taylor等,J.Exp.Med.184(1996),2031-2036),LCNX和LXSN(Sun等,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048),SFG(Gallardo等,Blood90(1997),952-957),HMB-Hb-Hu(Vieillard等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997),11595-11600),pMV7(Cochlovius等,CancerImmunol.Immunother.46(1998),61-66),pSTITCH(Weitjens等,Gene Ther5(1998),1195-1203),pLZR(Yang等,Hum.Gene Ther.10(1999),123-132),pBAG(Wu等,Hum.Gene Ther.10(1999),977-982),rKat.43.267bn(Gilham等,J.Immunother.25(2002),139-151),pLGSN(Engels等,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168),pMP71(Engels等,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168),pGCSAM(Morgan等,J.Immunol.171(2003),3287-3295),pMSGV(Zhao等,J.Immunol.174(2005),4415-4423),pMX(de Witte等,J.Immunol.181(2008),5128-5136)。
根据本发明,术语“药物(medicament)”可以与术语“药物组合物”互换使用，其涉及施用于患者，优选人患者的组合物。在本发明的内容中，所述的药物/药物组合物施用于患者，其中所述的CD8+T-细胞分离自/获得自所述患者。在本发明的内容中，所述的患者指人患者。此外，在本发明的内容中，所述患者患有疾病，其中，所述的疾病是恶性疾病，特别是起源于上皮细胞，内皮细胞或间皮细胞的或者是血液的癌症/癌。在本发明的内容中，所述的癌症/癌选自：胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌,口腔癌,胃癌,宫颈癌,B和T-细胞淋巴瘤,骨髓性白血病,卵巢癌,白血病,淋巴细胞白血病,鼻咽癌,结肠癌,前列腺癌,肾细胞癌,头颈癌,皮肤癌(黑素瘤),生殖器-尿道的癌症,例如睾丸癌,内皮细胞癌,宫颈癌和肾癌,胆管癌,食道癌,唾液腺癌和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病样血液肿瘤血液肿瘤,神经胶质瘤,肉瘤或骨肉瘤。
在优选的具体实施方案中，所述的药物组合物/药物包含本申请所定义的双特异性抗体分子，用以肠外的，经皮的，管腔内的，动脉内的，鞘内的的方式施用或直接注射到组织或肿瘤中。在本发明的内容中所述的组合物/药物包含本申请所定义的双特异性抗体分子，在施用包含非内源性地表达/非天然地存在于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，之前、同时或之后施用，其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
使用术语“与……结合(in combination)”并非限定治疗方案中的组分施用于受试者的顺序。因此，本申请所述的药物组合物/药物包括在施用包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，之前、同时或之后施用本申请所定义的双特异性抗体分子。本申请所使用的“与……结合”也并非限定使用本申请所定义的双特异性抗体分子和包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞之间的时间。由此，当两种组分并非同时/一并(concurrently)施用时，所述的施用可间隔,1分钟,5分钟,15分钟,30分钟,45分钟,1小时,2小时,4小时,6小时,12小时,24小时,48小时或72小时或本领域技术人员容易确定的和/或本申请中描述的任何适当的时间差。
在本发明的内容中，术语“与……结合”还包括本申请所定义的双特异性抗体分子和包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞在施用于受试者之前一起预先温育的情况。因此，所述的两种组分可以在施用前预温育例如，1分钟,5分钟,10分钟,15分钟,30分钟,45分钟或1小时，或本领域技术人员容易确定的任意时间。在另一个优选的具体实施方案中，涉及治疗方案，其中本申请所定义的双特异性抗体分子和包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原/标记的、转导的CD8+T-细胞同时/一并施用。在本发明的内容中，申请所定义的双特异性抗体分子可在已经施用了包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞之后施用。
此外，本申请所使用的“与……结合”也并非将所公开的治疗方案限定到本申请所定义的双特异性抗体分子与包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞以紧邻的顺序(in immediate sequence)施用(即，施用了两组分中的一个之后(一段具体时间间隔后)即施用另一组分，其间不施用和/或实施任何其他的治疗。因此，本发明的治疗方案还包括分别施用本申请所定义的双特异性抗体分子与包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，其中，其两者的施用被一种或以上治疗和/或预防疾病或其症状所必需的治疗间隔开。此类间隔治疗包括但不限于疼痛药物的施用；化疗剂的施用，疾病或其症状的外科手术处理。本申请所公开的治疗方案包括仅施用申请所定义的双特异性抗体分子和包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，以及施用申请所定义的双特异性抗体分子和包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞，并连同一种或以上本申请所描述的或本领域已知的、适合于治疗或预防疾病或其症状的治疗方案一起施用。
特别地可以预计待施用的所述药物组合物/药物通过输注(infusion)或注射施用。在本发明中，包含非天然地存在于/非内源性地表达于T-细胞之中和/或之上的抗原的、转导的CD8+T-细胞通过输注或注射施用于患者。适当的组合物/药物可通过不同的方式施用，静脉内的，腹内的，皮下的，肌内的，局部的或真皮内的施用。
本发明的药物组合物/药物还可以包括药学上可接受的载体。合适的药学上的载体的示例是本领域公知的，包括磷酸缓冲的盐溶液，水，乳状液，如油/水乳状液，各种湿润剂，无菌溶液，等等。包含此类载体的组合物可以利用本领域已知的常规方法配制。这些药物组合物可以适当的剂量施用于受试者。所述剂量方案由主治医师结合临床因素确定。在医药领域公知，对于某一个患者的施用剂量依赖于很多因素，包括患者的体量，体表面积，年龄，待施用的具体化合物，性别，时间，给药途径，总体健康情况，及其他一并施用的药物。通常，作为所述药物组合物的常规施用方案，应当在每天1μg-5g单位的范围，但是优选的连续输注剂量可以在每公斤体重每小时0.01g-2mg,优选0.01g-1mg,更优选0.01g-100g,更加优选0.01g-50g，且最优选0.01g-10g单位的范围。具体而言，优选的剂量如下文中所述。通过定期评估监控发展进程。剂量可以是多种多样的，但优选的静脉内DNA施用剂量是约106-1012拷贝的所述DNA分子。本发明的组合物可局部或全身施用。一般为肠外施用,例如静脉内；DNA也可以直接施用于靶位点，例如通过生物射弹递送到靶位点的内部或外部，或通过导管到动脉内的位点。肠外制剂包括无菌水或非水、溶液、悬浮液和乳状液。非水的溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，乙醇/水溶液，乳状液，或悬浮液，包括含盐的或缓冲的介质。肠外载体包括氯化钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸化的Ringer试剂(lactated Ringer's)，或不挥发油(fixed oils)。静脉内载体包括液体和营养素显影液再生剂(fluid and nutrientreplenishes)，电解液(electrolyte replenishers)(如那些基于Ringer右旋糖的),等等。也可以含防腐剂及其他添加剂，如抗微生物剂，抗-氧化剂，螯合剂和惰性气体等等。此外，本发明的药物组合物还可能包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人来源的。可预期本发明的所述药物组合物，除了蛋白质双特异性抗体构建体或核酸分子或其编码载体(如本发明中所述的)，根据所述药物组合物的既定用途还可以包括生物活性试剂。所述的试剂可以是作用于胃肠系统的药物，用作细胞抑制药(cytostatica)的药物，预防高尿酸血症的药物，抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)，作用于循环系统的药物和/或试剂，如本领域已知的T-细胞共刺激分子或细胞因子。
施用本发明的组合物/药物的可能的指征是恶性疾病，尤其是上皮细胞癌症/癌，如乳腺癌,结肠癌,前列腺癌,头颈癌,皮肤癌(黑素瘤),生殖器-尿道的癌症,例如卵巢癌，睾丸癌,内皮细胞癌,宫颈癌和肾癌,肺癌,胃癌,胆管癌,食道癌,唾液腺癌和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病样血液肿瘤血液肿瘤,神经胶质瘤,肉瘤和骨肉瘤。
本发明还预计与其他化合物，例如能提供免疫效应细胞活化信号，细胞增殖活化信号，或细胞刺激活化信号的分子的共施用方案。所述的分子可以是，例如另外的T-细胞初级活化信号(例如另外的共刺激分子:B7家族的分子，Ox40L,4.1BBL,CD40L,抗-CTLA-4,抗-PD-1)或另外的细胞因子白介素(例如IL-2)。
如上所述的本发明的组合物也可以是诊断组合物，其还包括，任选地，用于检测的手段和方法。
本申请所提供的双特异性结合分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)也适合用于免疫测定，其中，它们可被用于液相中或固定于固相载体上。可以应用本发明的多肽的免疫测定的示例是直接或间接的形式竞争性或非竞争性的免疫测定。此类免疫测定的示例是酶联免疫吸附测定(ELISA),酶免疫测定(EIA)，放射免疫测定(RIA)，夹层(免疫测定)以及Western印迹测定。
本发明的双特异性结合分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可与多种不同的载体结合，用于分离特异性地结合于所述多肽的细胞。已知载体的示例包括玻璃，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚碳酸酯，右旋糖酐，尼龙，直链淀粉，天然的或经修饰的纤维素，聚丙烯酰胺，琼脂糖和磁铁矿。所述载体的性质可以是可溶的或不可溶的，例如用于本发明的目的的珠子。
本领域普通技术人员已知有多种标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的示例包括酶，放射性同位素，胶态金属，荧光化合物，化学发光化合物，和生物发光化合物。
在本发明最优选的具体实施方案中，预期本发明的双特异性抗体构建体/分子用作药物。在本发明的内容中,描述了所述双特异性抗体分子用作药物，其中，所述的双特异性抗体分子在施用转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原，且其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。所述的药物可以在治疗恶性疾病尤其是起源于上皮细胞,内皮细胞或间皮细胞的，或是血液的癌症/癌的方法中施用。在本发明的内容中，所述的癌症/癌选自胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌,口腔癌,胃癌,宫颈癌,B和T-细胞淋巴瘤,骨髓性白血病,卵巢癌,白血病,淋巴细胞白血病,鼻咽癌,结肠癌,前列腺癌,肾细胞癌,头颈癌,皮肤癌(黑素瘤),生殖器-尿道的癌症,例如睾丸癌,卵巢癌,内皮细胞癌,宫颈癌和肾癌,胆管癌,食道癌,唾液腺癌和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病样血液肿瘤血液肿瘤,神经胶质瘤,肉瘤或骨肉瘤。
此外,在本发明的内容中，预期所述的双特异性抗体分子用于治疗恶性疾病的方法，所述的双特异性抗体分子包含(i)第一结合结构域，其与CD8+T-细胞上的抗原结合，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和(ii)第二结合结构域，其与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合，其中，所述的双特异性抗体分子在施用转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原，且其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。
此外，在本发明的内容中，恶性疾病治疗方法，该方法包括向有需要的患者施用本发明的双特异性抗体分子，所述的双特异性抗体分子(i)第一结合结构域，其与CD8+T-细胞上的抗原结合，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和(ii)第二结合结构域，其与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合；其中，所述的双特异性抗体分子在施用转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原，且其中，所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得。在本发明的内容中，所述癌症/癌选自胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌,口腔癌,胃癌,宫颈癌,B和T-细胞淋巴瘤,骨髓性白血病,卵巢癌,白血病,淋巴细胞白血病,鼻咽癌,结肠癌,前列腺癌,肾细胞癌,头颈癌,皮肤癌(黑素瘤),生殖器-尿道的癌症,例如睾丸癌,卵巢癌,内皮细胞癌,宫颈癌和肾癌,胆管癌,食道癌,唾液腺癌和甲状腺癌或其他肿瘤性疾病样血液肿瘤血液肿瘤,神经胶质瘤,肉瘤或骨肉瘤。
再有，根据本发明，包含(人)EpCAM(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可用于治疗胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌的方法。在本发明的内容中，包含定向针对(人)EpCAM(作为第二结合结构域)和定向针对/结合于/相互作用于Cripto的第一结合结构域的双特异性抗体分子可用于胃肠癌,例如胃肠起源的腺癌，的治疗。包含(人)HER1(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌的方法中使用。包含(人)HER2(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗胃癌,乳腺癌和/或宫颈癌的方法中使用。包含(人)HER3(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗胃癌和/或肺癌的方法中使用。包含(人)CD20作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗B-细胞淋巴瘤和/或T-细胞淋巴瘤的方法中使用。包含(人)CD22(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗B-细胞淋巴瘤和/或T-细胞淋巴瘤的方法中使用。包含(人)CD33(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗骨髓性白血病的方法中使用。包含(人)CA12-5(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗卵巢癌,肺癌,乳腺癌和/或胃肠癌的方法中使用。包含(人)HLA-DR(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗胃肠癌,白血病和/或鼻咽癌的方法中使用。包含(人)MUC-1(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗结肠癌,乳腺癌,卵巢癌,肺癌和/或胰腺癌的方法中使用。包含(人)A33(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗结肠癌的方法中使用。包含(人)PSMA(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗前列腺癌的方法中使用。包含(人)运铁蛋白受体(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗胃肠癌,胰腺癌,胆管细胞癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,皮肤癌和/或口腔癌的方法中使用。包含(人)CA-IX(作为天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原)，并包含本申请所定义的、非天然地存在于T-细胞(CD8+T-细胞)之中和/或之上的抗原之一的分子或构建体(即，本申请所述的双特异性抗体分子)可在治疗肾癌的方法中使用。
本发明还涉及治疗疾病，恶性疾病如起源于上皮细胞,内皮细胞或间皮的恶性疾病和/或血液癌症的方法。此类包含向受试者施用所述经转导的CD8+T-细胞的疾病尤其是：食管癌，胃癌，结肠癌，小肠癌，肝脏癌，胰腺癌，乳房癌，肺癌，脑癌，肾癌，睾丸癌，皮肤癌,白血病和/或淋巴瘤(lymphonas)，等。在本发明的内容中，所述的受试者是人。
在本发明的内容中所描述的治疗疾病的方法，包括下述步骤：
(a)由受试者分离CD8+T-细胞；
(b)如上所述的，用非天然地存在于CD8+T-细胞之中的抗原转导所述经分离的CD8+T-细胞；和
(c)将经转导的CD8+T-细胞施用于所述患者。
在本发明的内容中，通过静脉输注将所述转导的CD8+T-细胞施用于所述受试者。
另外，本发明所提供的治疗疾病的方法，包括下述步骤：
(a)由受试者分离CD8+T-细胞；
(b)如上所述的，用非天然地存在于CD8+T-细胞之中的抗原转导所述经分离的CD8+T-细胞；和
(c)用T-细胞受体共-转导所述经分离的CD8+T-细胞；
(d)通过抗-CD3和抗-CD28抗体扩增(expanding)所述CD8+T-细胞；和
(e)将经转导的CD8+T-细胞施用于所述患者。
本发明涉及经分离的CD8+T-细胞，其通过方法分析以确认天然地存在于所述经分离的CD8+T-细胞上的(肿瘤)抗原与本申请所述的双特异性抗体经由其第二结合结构域结合的肿瘤抗原一致。在本发明的内容中，所述经分离/经获取的CD8+T-细胞(包含天然地存在于所述经分离的CD8+T-细胞表面的抗原)是通过引入非天然存在于CD8+T-细胞/非天然的表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原/标记人工修饰的。在本发明的内容中，所述经分离/经获取的CD8+T-细胞的人工修饰涉及本申请所述的转导方法。因此，在本发明的内容中，所述待治疗的受试者涉及具有下述其特征为患有下述疾病的患者，所述疾病的特征在于具有如上所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原。在本发明的内容中，通过静脉输注施用由待治疗的受试者获得/分离的所述经转导的CD8+T-细胞。
在另外的具体实施方案中，本发明涉及疾病的治疗方法，
(a)由从患者切除的肿瘤分离肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)；
(b)培养，并如上所述的用非天然地存在于CD8+T-细胞之中的抗原转导TIL；
(c)基于功能性肿瘤识别测定选择TIL培养物；
(d)通过抗-CD3和/或抗-CD28抗体扩增所述的TIL；和
(e)向所述受试者施用CD8+T-细胞。
术语“功能性肿瘤识别”测定指TIL与自体,例如患者的，肿瘤细胞，或同一HLA-型的细胞系共培养。所读出(read out)的是肿瘤细胞(LDH,钙荧光素-释放)的细胞毒性活性。进一步的读出可能是细胞因子分泌，用于胞内细胞因子存在的T-细胞流式细胞术，ELISPOT测定。
上述的步骤(d)(指通过抗-CD3和/或抗-CD28抗体的TIL扩增步骤)也可以在细胞因子，如白介素-2和/或白介素-15(IL-15)的存在(刺激)下进行。在本发明的内容中，上述的步骤(d)(指通过抗-CD3和/或抗-CD28抗体的TIL扩增步骤)也可以在细胞因子，如白介素-12(IL-12),白介素-7(IL-7)和/或白介素-21(IL-21)的存在下进行。
此外，所述的治疗方法也可以包含施用本发明的双特异性(单克隆)抗体。所述的双特异性(单克隆)抗体可以在待施用的转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用。在本发明的内容中，所述转导的CD8+T-细胞的施用通过静脉输注进行。在本发明的内容中，所述转导的CD8+T-细胞是由待治疗的受试者分离/经获取的。
本发明提供试剂盒，其包含本发明的双特异性(单克隆)抗体，核酸分子，载体或宿主。所述的试剂盒在本发明的药物组合物的制备中特别有用，特别是由用于注射或输注的容器组成。有益地，本发明的试剂盒还包含，任选地，(a)缓冲液，储液和/或为医药和科学目的所需的其他试剂或材料。本发明涉及试剂盒，其包含(A)双特异性抗体分子，其包含(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，和(B)用非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中、或所述CD8+T-细胞之上的抗原转导由待治疗的受试者分离/经获取的CD8+T-细胞所需的材料。
在本发明的内容中由待治疗的受试者分离/经获取的“转导CD8+T-细胞所需的材料”至少是编码非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸。所述非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的核酸可能可操作地连接于(a)通常存在于载体(例如质粒或病毒DNA)中的调节序列，所述载体包括体外选择和在细菌中扩增所述载体所需的序列。允许非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中的抗原表达的载体，在本申请中称作“表达载体”。由此，另一种有用的由待治疗的受试者分离/经获取的“转导CD8+T-细胞所需的材料”可能是，包含编码非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸的载体/表达载体。在本申请中，适用于T-细胞/CD8+T-细胞转导包括选自下述的载体：SAMEN CMV/SRa(Clay等,J.Immunol.163(1999),507-513),LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等,J.Exp.Med.186(1997),1597-1602),FeLV(Neil等,Nature308(1984),814-820),SAX(Kantoff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986),6563-6567),pDOL(Desiderio,J.Exp.Med.167(1988),372-388),N2(Kasid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990),473-477),LNL6(Tiberghien等,Blood84(1994),1333-1341),pZipNEO(Chen等,J.Immunol.153(1994),3630-3638),LASN(Mullen等,Hum.Gene Ther.7(1996),1123-1129),pG1XsNa(Taylor等,J.Exp.Med.184(1996),2031-2036),LCNX和LXSN(Sun等,Hum.Gene Ther.8(1997),1041-1048),SFG(Gallardo等,Blood90(1997),952-957),HMB-Hb-Hu(Vieillard等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997),11595-11600),pMV7(Cochlovius等,CancerImmunol.Immunother.46(1998),61-66),pSTITCH(Weitjens等,Gene Ther5(1998),1195-1203),pLZR(Yang等,Hum.Gene Ther.10(1999),123-132),pBAG(Wu等,Hum.Gene Ther.10(1999),977-982),rKat.43.267bn(Gilham等,J.Immunother.25(2002),139-151),pLGSN(Engels等,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168),pMP71(Engels等,Hum.Gene Ther.14(2003),1155-1168),pGCSAM(Morgan等,J.Immunol.171(2003),3287-3295),pMSGV(Zhao等,J.Immunol.174(2005),4415-4423)和pMX(de Witte等,J.Immunol.181(2008),5128-5136)。“转导CD8+T-细胞所需的材料”还可以包含经作为表达非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的工具的载体转化或转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以通过，将上述至少一种的载体或至少编码非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸引入所述宿主细胞来制备。在宿主细胞中存在所述的至少一种载体或至少一种核酸可介导本申请所述的编码非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的表达。
转导CD8+T-细胞所需的材料还可以包括遗传/人工修饰/转导经分离/经获取的CD8+T-细胞所必需的详细资料和/或设备。如果编码非天然地存在于CD8+T-细胞/非内源性地表达于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸或重组的核酸用于CD8+T-细胞的转导，电穿孔法，磷酸钙法，阳离子脂质法,脂质体法等所需的信息和/或设备与转染试剂，缓冲液和/或其他转导所需试剂可于所述试剂盒中提供。
转导CD8+T-细胞所需的材料还可以包括与经分离/经获取的CD8+T细胞的温育和扩增(cultivation and expansion)相关联的信息和/或设备，如抗-CD3抗体，抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体和/或抗-CD3抗体，抗-CD28抗体和IL-2。
总之，由待治疗的受试者分离/经获取的“转导CD8+T-细胞所需的材料”，至少是编码非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸，至少包含编码非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的核酸的载体/表达载体，转染试剂，缓冲液，和/或用于对由待治疗的受试者分离/获取的、具有非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原的CD8+T-细胞进行转导和/或温育所需的材料。
此外，本发明的试剂盒中的一些部分可以单独包装于小瓶(vials)或瓶(bottles)中，组合在容器中或多容器单元(multicontainer units)中。而且，本发明的试剂盒包含(封闭的)袋式细胞培养系统，其中患者的细胞，优选上述T-细胞可以在GMP(良好生产规范(good manufacturing practice)，如欧洲委员会出版的良好生产规范指南http:// ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm)条件下转导和温育。本发明的试剂盒包含(封闭的)袋式细胞培养系统，其中，经分离/经获取的患者CD8+T细胞可以在GMP下进行转导和温育。此外，在本发明的内容中，所述的试剂盒还包括编码上述非天然地存在于CD8+T-细胞之中的抗原的核酸分子和/或编码上述T-细胞受体的核酸分子。有益地，本发明的试剂盒可以被用于，尤其是实施本发明的方法，并可被用于本申请所述的多种仪器设备，例如研究工具或医药工具。所述试剂盒的制造，优选地根据本领域技术人员已知的标准程序进行。
这些以及其他具体实施方案公开并包含于在本申请的描述和实施例中。关于本发明所应用的相关抗体，方法，应用以及化合物的其他文献，可利用例如电子设备，从公共图书馆和数据库获得。例如可以施用互联网上的公共数据库"Medline"，http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其他的数据库和地址，如http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.infobiogen.fr/，http://www.fmi.ch/biology/ research_tools.html，http://www.tigr.org/是本领域技术人员已知的，并可利用例如http://www.lycos.com获得。
附图简述
图1:包含对人EGFR和对鼠EpCAM具有特异性的代表性双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8)
具有鼠IgG2a骨架的MAb225在其重链的C-末端融合了单链(sc)Fv片段。
图2:人EGFR-特异性的抗体MAb225的代表性SEC和SDS-PAGE图
蛋白质A纯化的抗体进行大小排阻层析。(A)由HiLoad Superdex200柱的洗脱图谱。集中(pooled)峰组分并通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度。(B)双特异性抗体的非还原的(NR)和还原的(R)SDS-PAGE。
图3:小鼠EpCAM-特异性的抗体G8.8代表性的SEC和SDS-PAGE图
蛋白质A纯化的抗体进行大小排阻层析。(A)由HiLoad Superdex200柱的洗脱图谱。集中峰组分并通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度。(B)双特异性抗体的非还原的(NR)和还原的(R)SDS-PAGE。
图4:双特异性抗体MAb225_scFv_G8.8代表性的SEC和SDS-PAGE图
(A)由HiLoad Superdex200柱的洗脱图谱。所示的数字指双特异性抗体组分(1)，和凝聚组分(2)。集中聚集峰组分(1)并通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度。(B)双特异性抗体的非还原的(NR)和还原的(R)SDS-PAGE。
图5:鼠EpCAM ECD的亲和层析和SDS-PAGE
利用Ni-螯合层析纯化含带有C-末端组氨酸表位标记的鼠EpCAM的细胞培养上清。(A)由HisTrap FF柱的洗脱组分。(B)在还原条件下透析蛋白质的SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝染料染色。
图6:重组的鼠EpCAM ECD与EpCAM-特异性的抗体的相互作用
重组的鼠EpCAM与G8.8或双特异性抗体MAB225_scFv_G8.8相互作用。(A)重组的EpCAM与G8.8免疫沉淀。星号代表EpCAM。(B)重组的EpCAM与MAB225_scFv_G8.8免疫沉淀。星号代表EpCAM。
图7:利用通过双特异性抗体向肿瘤募集肿瘤特异性T-细胞的新治疗原理的图解说明
通过双特异性抗体向肿瘤募集T-细胞。T-细胞(此处指转基因鼠TCR-I T-细胞；TCR tg T-细胞)带有针对大T抗原优势免疫表位1的T-细胞受体(TCR T spec.)。这些T-细胞是另外经标记物抗原(del-hEGFR；SEQ ID NOs:11和12)转导的。所述的靶肿瘤细胞天然地表达所述大T抗原，其存在于主要组织相容性复合体(MHC)和所述肿瘤抗原(EpCAM)的范围。所述一个臂带有针对del-hEGFR的抗原结合位点，另一个臂上带有(鼠)EpCAM的抗原结合位点的双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8)将两种细胞类型聚拢在一起。所述肿瘤肽特异性的TCR，所述的肿瘤肽和所述MHC形成“免疫突触”。
图8:带有del-hEGFR的初级T-细胞的转导效率
通过反转录病毒的方式用del-hEGFR(SEQ ID NOs:11和12)转导初级鼠T-细胞。流式细胞分析揭示相比于非转导的T-细胞(浅色曲线)，用del-hEGFR的有效转导(深色曲线)。
图9:转导的T-细胞与肿瘤细胞通过双特异性抗体交联
接种表达EpCAM的4T1细胞并使其生长至铺满(confluency)。Del-hEGFR-转导的B3Z T-细胞(永久细胞系,荧光标记的)预先加载了双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8)，接下来在平板中与黏附4T1一起温育。充分洗涤后，将所余的细胞裂解，测定所余的荧光。添加针对EpCAM和hEFGR的双特异性抗体或单特异性的抗体(抗-EpCAM和抗-hEGFR作为对照)。在烧瓶中，与任何对照相比，所述双特异性抗体显著地保留有更多的经转导的细胞。对于所有的比较，**表示p<0.01。
图10:双特异性抗体-再靶定的(retargeted)T-细胞-介导的肿瘤细胞裂解
用del-hEGFR(SEQ ID NOs:11和12)转导肿瘤特异性T-细胞(TCR-I,识别大T抗原的优势免疫表位的T-细胞受体转基因T-细胞)，并与双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8(SEQID NOs:5和6))预温育。表达EpCAM和所述大T抗原的mGC8肿瘤细胞(永久细胞系)或不表达以上两者的B16肿瘤细胞进行荧光标记(用钙荧光素)。以所示的肿瘤对T-细胞比率(T:E)培养细胞，过夜，通过测定荧光释放定量细胞的裂解。在mGC8细胞中诱导靶对效应物比率依赖性的裂解，不对B16细胞进行所述诱导。
图11:通过双特异性抗体和转导的肿瘤特异性T-细胞的结合治疗所建立的肿瘤
用皮下肿瘤(mGC8细胞系)攻击小鼠。在所示的时间点，用PBS、仅抗-EpCAM单-特异性的抗体(EpCAM G8.8(SEQ ID NOs:3和4))、用转导的T-细胞(CD8+T-细胞)和抗-EpCAM单-特异性的抗体(EpCAM G8.8(SEQ ID NOs:3和4))以及抗-EGFR单-特异性的抗体(EGFRMAb225(SEQ ID NOs:1和2))、或用双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8；对EpCAM和EGFR(SEQID NOs:5和6)具有特异性)转导的T-细胞(CD8+T-细胞)，对小鼠进行治疗(i.v.进行细胞施用；i.v.和i.p.进行抗体施用)。与任意其他治疗组相比，结合治疗诱导显著的肿瘤生长减弱或延迟。组1相比于组4从第31天开始，组2相比于组4从第40天开始，组3相比于组4从第50天开始，肿瘤体积的差异明显(对所有的比较p<0.001)。
图12:通过双特异性抗体与肿瘤特异性转导的T-细胞结合治疗已建立的肿瘤使存活显著延长
小鼠治疗组存活曲线如图11所示。所述研究的终止点预定为第72天。相比于全部三种对照治疗，所述结合治疗使小鼠的存活显著延长。组1相对于组4，组2相对于组4，组3相对于组4存活差异显著。
图13:通过双特异性抗体和转导的肿瘤特异性T-细胞相结合治疗已建立的肿瘤(确认性研究)
在图11所示的研究中用皮下肿瘤(mGC8)攻击小鼠。在所示的时间点以两种不同的浓度用PBS，仅用抗-EpCAM单-特异性的抗体(EpCAM G8.8(SEQ ID NOs:3和4))，双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8；对EpCAM和EGFR(SEQ ID NOs:5和6)具有特异性)，经抗-EpCAM单-特异性的抗体(EpCAM G8.8(SEQ ID NOs:3和4))加上抗-EGFR单-特异性的抗体(MAb 225(SEQID NOs:1和2))转导的T-细胞(CD8+T-细胞)，或经双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8；对EpCAM和EGFR(SEQ ID NOs:5和6)具有特异性)转导的T-细胞(CD8+T-细胞)治疗小鼠。与任意其他治疗组相比，结合治疗诱导显著的肿瘤生长减弱或延迟。组1相比于组5从第36天开始，组2相比于组5从第47天开始，组3相比于组5从第54天开始，组4相比于组5从第63天开始，肿瘤体积的差异明显(对所有的比较p<0.001)。
图14:通过双特异性抗体和转导的肿瘤特异性T-细胞相结合治疗已建立的肿瘤(确认性研究)
小鼠治疗组存活曲线如图13所示。另外三组无肿瘤小鼠接受了所述的结合治疗(作为毒性对照，标记为“7-无肿瘤”)。相比于任意的对照治疗，所述结合治疗使小鼠的存活显著延长。组1相对于组5，组2相对于组5，组3相对于组5，组4相对于组5，存活差异显著。
图15:鼠EpCAM His-Avitag蛋白序列
由SEQ ID NO:9中所示的拷贝DNA(cDNA)序列编码的胞外结构域C-末端表位标记的(His-Avi)EpCAM的蛋白序列(相应于SEQ ID NO:10)。
图16:鼠EpCAM cDNA序列
胞外结构域C-末端表位标记的(His-Avi)EpCAM的拷贝DNA(cDNA)序列(SEQ IDNO:7)。
图17:EpCAM ECD载体图谱
含EpCAM胞外结构域(ECD)的真核表达载体的质粒图谱图示。
图18:轻链MAB225载体图谱
含MAB225(SEQ ID NO:1)的轻链真核表达载体图谱图示。
图19:与G8.8scFv融合的MAB225的重链的载体图谱
含与C-末端G8.8scFv融合的MAB225的重链的真核表达载体(SEQ ID NO:6)的质粒图谱图示。
图20:双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的代表性SEC和SDS-PAGE图
(A)靶向(人)EGFRvIII和(鼠)EpCAM的双特异性抗体,即，BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的分析大小排阻层析。(B)所述双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的非还原(NR)和还原(R)SDS-PAGE分析。考马斯蓝染色。
图21:利用通过双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1向肿瘤募集肿瘤特异性T-细胞的新治疗原理的图解说明
利用通过双特异性抗体:T-细胞(此处指转基因鼠OT-I T-细胞)带有对卵白蛋白(OVA)具有特异性的T-细胞受体，向肿瘤募集肿瘤特异性T-细胞的新治疗原理的图解说明。这些T-细胞是另外经标记物抗原(del-hEGFRvIII；SEQ ID NOs:17和18)转导的。所述的靶肿瘤细胞(例如表达卵白蛋白(OVA)的黑素瘤B16细胞)天然地表达所述大T抗原，其存在于主要组织相容性复合体(MHC)和所述肿瘤抗原(EpCAM)的范围。靶肿瘤细胞上的MHC在这一示例中呈递OVA的SIINFEKL肽片段。所述一个臂带有针对del-hEGFRvIII(SEQ ID NOs:17和18)的抗原结合位点，另一个臂上带有(鼠)EpCAM的抗原结合位点的双特异性抗体(BsAbEpCAM-EGFRvIII,MR1.1)将两种细胞类型聚拢在一起。所述肿瘤肽特异性的TCR，所述的肿瘤肽和所述MHC形成“免疫突触”。
图22:转导的T-细胞与肿瘤细胞通过双特异性抗体交联
接种表达EpCAM的B16黑素瘤细胞(GFP-标记)并使其生长至铺满(confluency)。Del-hEGFRvIII-转导的B3Z T-细胞(永久细胞系)预先加载了双特异性抗体(BiAb)(BsAbEpCAM-EGFRvIII,MR1.1)接下来在平板中与黏附B16(柱号:5)一起温育。充分洗涤后(柱号:1-4)，所余细胞经胰蛋白酶作用并测定发荧光的和不-发荧光的细胞。烧瓶中，与任意经洗涤的对照(柱号:2-4)相比，所述的双特异性抗体(BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1)保留有更多的经转导的细胞(柱号:1)。
图23:双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的氨基酸序列
(A)双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1轻链(无前导区序列)的氨基酸序列，SEQ ID NO:15。(B)双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1重链(无前导区序列)的氨基酸序列，SEQ ID NO:16。
图24:del-hEGFRvIII的序列
(A)如SEQ ID NO:17中所示的，del-hEGFRvIII(编码图24(B)的蛋白序列)的DNA序列。(B)del-hEGFRvIII的蛋白序列；相应于SEQ ID NO:18。
下述的实施例对本发明进行说明:
说明性质地，作为本发明构思(concept)的证据，在下述的实施例中，人抗-EGFR抗体(MAb225；SEQ ID NOs:1和2)与鼠抗-EpCAM(G8.8；SEQ ID NOs:3和4)以形成双特异性产品(MAb225_scFv_G8.8；SEQ ID NOs:5和6)。此外，如在图20和21中所说明的，构建了一个臂带有针对del-hEGFRvIII(SEQ ID NOs:17和18)的抗原结合位点，另一个臂上带有(鼠)EpCAM的抗原结合位点的双特异性抗体“BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1”(SEQ ID NOs:15和16)；参见实施例4。
实施例1:双特异性抗体MAb225_scFv_G8.8的克隆和表达
重组DNA技术
如Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所描述的标准方法操作DNA。根据制造商的使用说明使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析以及序列数据库管理
在Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of ImmunoglobulinsInterest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242中给出了有关人免疫球蛋白轻链和重链核苷酸序列的一般信息。抗体链的氨基酸根据EU编号(Edelman,G.M.,等,PNAS63(1969)78-85；Kabat,E.A.,等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242)来编号。GCG’s(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)软件包10.2版和Infomax’s Vector NTI Advance suite11.5版用于序列创建、作图、分析、注释和说明。
DNA测序
由SequiServe(Vaterstetten,Germany)和Geneart AG(Regensburg,Germany)进行双链测序确定DNA序列。
基因合成
由Geneart AG(Regensburg,Germany)由合成的寡核苷酸制备所需的DNA节段，通过自动基因合成PCR产物。侧翼为单个限制性内切酶酶切位点的所述基因节段被克隆到pGA18(ampR)质粒中。由经转化的细菌中纯化所述的质粒DNA，通过UV光谱确定其浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。编码轻链的DNA序列被安排为包含带有位于侧翼的5’NarI和3’NheI限制性内切酶位点可变和恒定轻链区。编码可变重链区域加CH1区域的DNA序列被安排为包含带有侧翼的5’KpnI和3’BamHI酶切位点。编码scFv构建体的DNA序列被安排为包含带有5’BsrGI和3’XbaI限制性内切酶位点CH3结构域的片段。编码鼠EpCAM(SEQ ID NOs:7(cDNA序列)和8(氨基酸序列))第1-267位氨基酸的DNA序列被安排为带有5’BamHI和3’NotI位点的基因合成物。所有的构建体均设计为带有编码前导肽的5’-末端DNA序列，所述前导肽针对蛋白质在真核细胞中的分泌。
1.1表达质粒的构建
表达载体用于所有抗体链的构建。所述的载体包含下述元件(图18中示例性的示出MAb225(SEQ ID NO:1)的轻链)：
-Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点,oriP，
-来自pUC18的复制起点用于在大肠杆菌中复制该质粒
-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的即时早期增强子和启动子，
-牛生长激素聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和
-独特的(unique)KpnI,BamHI,BsrGI和XbaI限制性内切酶位点(重链载体),或
-独特的NarI和NheI限制性内切酶位点(轻链)。
编码用于生产所述重链构建体的表达载体包含下述附加的元件(如在图19中图示说明的重链MAb225与G8.8scFv的融合体(SEQ ID NO:6)):
-新霉素抗性盒(neor)，
-猿病毒40早期启动子，和
-猿病毒40聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
消化带有编码所述合成的抗体的DNA节段的pG18(ampR)质粒和所述的表达载体，对于重链表达载体用KpnI和BamHI，或对于轻链载体用NarI和NheI限制酶。类似地，用BsrGI和XbaI切割作为重链载体的、带有scFv片段的pG18质粒。将所获得的全部片段进行琼脂糖凝胶电泳。经纯化的DNA节段与经分离的表达载体KpnI/BamHI，NarI/NheI，或BsrGI/XbaI片段连接，获得最终表达载体。将所述的最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离(Miniprep)表达质粒DNA进行限制性酶切分析和DNA测序。使正确的克隆在150mlLB-Amp培养基中生长，再此分离(Maxiprep)质粒DNA用于后续试验。
表达载体用于重组的鼠EpCAM胞外结构域(指SEQ ID NO:10(由SEQ ID NO:9中所示的cDNA序列编码)的氨基酸序列，而源序列来自PubMed entry NM_008532(NM_008532.2,GI:112293274)的构建。所述的载体(参见图17)包含下述元件：
-Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点,oriP，
-来自pUC18的复制起点用于在大肠杆菌中复制该质粒
-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性
-潮霉素-b-磷酸转移酶盒
-猿病毒40早期启动子
-猿病毒40聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的即时早期增强子和启动子
-PreScission Plus位点以及之后的His Avitag，用于所关注的cDNA的N-末端融合
-牛生长激素聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和
-独特BamHI和NotI限制性内切酶位点。
用BamHI和NotI消化带有编码所述合成的EpCAM胞外结构域DNA节段的pG18(ampR)质粒和所述的表达载体(参见图17)。将所获得的全部片段进行琼脂糖凝胶电泳。经纯化的DNA节段与经分离的表达载体BamHI/NotI片段连接，获得最终表达载体。将所述的最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离(Miniprep)表达质粒DNA进行限制性酶切分析和DNA测序。使正确的克隆在150ml LB-Amp培养基中生长，再此分离(Maxiprep)质粒DNA用于后续试验。
实施例2:呈现高结合亲和力的EpCAM胞外结构域的表达与纯化
2.1在人胚肾293(HEK293)细胞中瞬时表达免疫球蛋白变体
利用FreeStyleTM293表达系统根据制造商的建议(Invitrogen,USA)通过瞬时转染人胚肾293-F细胞表达重组的免疫球蛋白变体(MAB225,MAB225_scFv_G8.8和G8,8)。简要地，FreeStyleTM293-F细胞悬浮液在FreeStyleTM293表达培养基中，于37℃/8％CO2下温育。在转染的前一天，将细胞以1x106活细胞/ml的密度接种于新鲜培养基中。在
Figure BDA0000576357890000671
I培养基(Invitrogen,USA)，利用665μl的293-FreeTM转染试剂(Novagen,EMD,USA)和500μg总DNA(包括1：1摩尔比的轻链质粒DNA和重链质粒DNA)以500ml终转染体积，制备DNA-293fectinTM复合物。在转染后6天，通过在室温(RT)下3500rpm，离心15分钟收集含抗体的细胞培养物上清液，通过无菌过滤器(0.22μm)过滤。在纯化前上清液储存于-80℃之下。鼠EpCAM胞外结构域的制备过程类似于所述免疫球蛋白变体的制备过程，500μg的DNA用于500ml终转染体积。
2.2抗体的纯化
通过利用蛋白质A-SepharoseTM(GE Healthcare,Sweden)的亲和层析和Superdex200大小排阻层析从细胞培养物上清液中纯化抗体。简要地，将无菌过滤的细胞培养物上清液施加于经PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH7.4)平衡的5ml MabSelect Xtra(GE Healthcare)柱。用平衡缓冲液将未结合的蛋白质洗去。用0.1M柠檬酸缓冲液,pH3.0洗脱抗体以及抗体变体，用0.2M Tris,pH9.0中和含蛋白质的组分。然后将洗脱出来的蛋白质组分集中起来，利用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO:30K,Millipore)浓缩至3ml体积并上样至经20mM Histidin,140mM NaCl,pH6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml16/60或26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare,Sweden)。将含具有少于5％高分子量凝集体的纯化抗体组分集中起来，以约1.0mg/ml小份(aliquots)储存于-80℃之下。
通过利用Ni-螯合层析的亲和层析从细胞培养物上清液中纯化鼠EpCAM胞外结构域(SEQ ID NO:9)。简要地，将无菌过滤的细胞培养物上清液用于用20mM“NaPO4”,0.5MNaCl,20mM咪唑,pH7.40平衡的HisTrap FF(GE Healthcare,Sweden)柱。用平衡缓冲液将未结合的蛋白质洗去。用含20mM“NaPO4”,0.5M NaCl,500mM咪唑,pH7.40的缓冲液将EpCAM胞外结构域(SEQ ID NO:9)洗脱出来。将峰组分集中起来以含20mM组氨酸,140mM NaCl,pH6.70的缓冲液透析过夜。所述蛋白质以17.5mg/ml的小份，于-80℃下储存。
2.3经纯化的蛋白质的分析
通过测定280nm下的光密度(OD)，利用基于氨基酸序列计算出的摩尔消光系数确定经纯化的蛋白质样品的浓度。通过存在或不存在还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)的SDS-PAGE并经考马斯亮蓝染色分析抗体的纯度和分子量。根据制造商的建议(4-12％Bis-Tris-gels)使用所述的
Figure BDA0000576357890000681
Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen,USA)。通过高效SEC利用TSKgel G3000SW柱(TOSOH Bioscience,USA)在50mM“KPO4”,pH7.5,300mM NaCl运行缓冲液中，于25℃下分析抗体样品的凝集物含量。将25μg的蛋白质以0.8ml/min的流速注射到所述的柱子等度洗脱20分钟以上。用Peptide-N-Glycosidase F(Roche MolecularBiochemicals)去除了N-聚糖后通过质谱分析法确认经还原的免疫球蛋白变体链的氨基酸主链的完整性。
2.4鼠重组的EpCAM的免疫沉淀
通过进行IP检验抗体G8.8(SEQ ID NOs:3和4)和所述双特异性MAB225_G8.8抗体(SEQ ID NOs:5和6)是否与鼠EpCAM重组的胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO:10)结合。将约15μg EpCAM ECD和10μg抗体用TBS Tween0.1％稀释至总体积1.5mL，于室温下温育10min。平行制备无EpCAM的抗体作为阴性对照以区分重链和轻链带。加入50μL的50％蛋白质A浆液(slurry)，在搅拌下使样品于室温温育40min，用TBS-T洗，用柠檬酸缓冲液，pH3.0洗脱，上样到4-12％Bis-Tris-凝胶。上样4μg的重组EpCAM ECD作为对照。所述凝胶用考马斯亮蓝染色。
2.5质谱分析
确定总的去糖基化的抗体质量，并经电喷射离子化质谱分析(ESI-MS)确认。简要地，在37℃下，12-24h，用100mM KH2PO4/K2HPO4,pH7中的50mU N-Glycosidase F(PNGaseF,ProZyme)，在上至2mg/ml的蛋白质浓度时，使100μg纯化的抗体去糖基化，接下来在Sephadex G25柱(GE Healthcare)经HPLC脱盐。在去糖基化并还原后通过ESI-MS确定各抗体链的质量。简要地，115μl中的50μg抗体与60μl1M TCEP和50μl8M盐酸胍温育，然后脱盐。经由ESI-MS在配备NanoMate源(source)的Q-Star Elite MS上确定总的质量和经还原的抗体链的质量。根据样品分子量记录所述的质量范围。总体而言，经还原的抗体的质量范围在600-2000m/z，非还原抗体的质量范围在1000-3600m/z。
2.6表面等离振子共振
利用Biacore仪器(Biacore,GE-Healthcare,Uppsala)通过表面等离振子共振(SPR)技术分析EGFR-特异性的MAb225(SEQ ID NOs:1和2)，EpCAM-特异性的G8.8抗体(SEQID NOs:3和4)以及所述双特异性MAb225_scFv_G8.8抗体的结合特性。这是用于分子相互作用研究的成熟系统。其可以连续地实时监控配体/分析物结合，并在多种设定下确定缔合常数(association rate constants，ka)，解离常数(dissociation rate constants，kd)和平衡常数(equilibrium constants，KD)。SPR-技术是基于对近金包被的生物传感器表面折射率的测定。折射率的变化表示由于固定的配体与注射到溶液中的分析物之间的相互作用引起的表面上质量的变化。如果分子与表面上的配体结合则所述质量升高，在解离时所述质量下降。利用胺-偶联化学，根据制造商的建议，山羊抗-小鼠IgG抗体固定于CM5生物传感器表面用于捕获。用0.1M N-盐酸羟基琥珀酰亚胺和0.4M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的1：1混合物，以5μl/min的流速，在25℃下活化流动的细胞(Flow cells)。抗-小鼠IgG抗体在10mM pH4.5的醋酸钠中以10μg/mL注射。用载体缓冲液而非捕获抗体，以相同的方式处理参考对照流动细胞。用1M乙醇胺/HCl pH8.5的注射剂将表面封闭。所述的评估抗体在PBS-T+0.1％BSA(dilution buffer)中稀释(30nM MAb225_scFv_G8.8,5nM MAb225,8nM G8.8)，在单独的循环(separate cycles)通过以5μl/min注射60sec作为配体捕获。所有的相互作用在37℃下，利用PBS-T作为运行缓冲液来进行。所述分析物以一系列的三倍递增浓度(在PBS-T+0.1％BSA中的EGFR ECD4.12-1000nM和EpCAM ECD0.91-2000nM)以50μl/min的流速注射，180sec缔合,1200sec解离。所述捕获抗体在每一循环之后用pH2.0的10mM甘氨酸以30μl/min的流速再生60sec。以每秒一个信号的速度进行信号检测。
表1中给出说明性的双特异性抗体MAb225_scFv_G8.8以及各自的亲本抗体MAb225和G8.8的生化特征总结显示，所有的抗体均以高亲和力与它们各自的靶结合。
配体 分析物 k<sub>a</sub>[M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>] k<sub>d</sub>[s<sup>-1</sup>] t(1/2)[min] K<sub>D</sub>[M]
MAB225_scFv_G8.8 mu EpCAM 2.0E+05 2.5E-03 4.6 1.2E-08
G8.8 mu EpCAM 2.2E+05 1.3E-02 0.9 6.1E-08
MAB225_scFv_G8.8 hu Her1 1.1E+06 5.7E-03 2.0 5.5E-09
MAB225 hu Her1 1.3E+06 5.7E-03 2.0 4.3E-09
实施例3:CD8+T-细胞的转导和细胞毒性杀伤测定
3.1细胞培养
如下述3.2节中所述由鼠获得脾。经磨碎脾通过40μM细胞滤器(strainer)(BDFalcon,Germany)获得单细胞悬液。用简单T-细胞培养基洗滤器3次，通过erilysis溶液(BDPharmingen,Germany)作用90sec使得所述细胞沉淀中无红细胞。原代鼠T-细胞保持在由RPMI,1％L-谷胺酰胺(Glutamin),1％青霉素和链霉素,1％丙酮酸钠(Natrium Pyruvat),1mM HEPES(均PAA,Germany)和10％FBS(Gibco,USA)组成的T-细胞培养基中。在相同的培养基中保持T-细胞系B3Z(Leisegang等,J Mol Med(2008),86(5),573-583)。PlatE包装细胞系(Cell Biolabs,Inc,USA(www.cellbiolabs.com))保持在DMEM,1％L-谷胺酰胺,1％青霉素-链霉素(均PAA,Germany),10μg/ml嘌呤霉素和1μg/ml杀稻瘟素(Sigma,Germany)。所述的鼠胃癌细胞系由W.Zimmermann,Munich惠赠，培养在DMEM,1％L-嘌谷胺酰胺,1％青霉素和链霉素,1％丙酮酸钠,1％非必需氨基酸和10％FBS中。鼠乳腺癌(mammary carcinoma)细胞系4T1(ATCC NO:℃RL-2539)在RPMI,1％L-嘌谷胺酰胺,1％青霉素和链霉素,1％丙酮酸钠,1％非必需氨基酸和10％FBS中传代。鼠黑素瘤细胞系B16(ATCC NO℃RL-6322)在DMEM,1％L-嘌谷胺酰胺,1％青霉素和链霉素(Steptomycin)和10％FBS中保持。
3.2小鼠
野生型C57Bl/6小鼠购自Harlan实验室(The Netherlands)。大T-抗原优势免疫表位I特异性T-细胞受体转基因小鼠购自Jackson Laboratory,USA(B6.Cg-Tg(TcraY1,TcrbY1)416Tev/J),USA)。OVA(卵白蛋白)特异性T-细胞受体转基因小鼠购自JacksonLaboratory,USA(C57Bl/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/j)。
3.3T-细胞:转导载体和克隆
用于T-细胞转导的载体是pMP71(Schambach等，Mol Ther(2000),2(5),435-45)。截短的人表皮-生长-因子-受体(del EGFR，作为插入到细胞膜中的免疫惰性蛋白原型实例,cDNA序列参见SEQ ID NO 11，(编码的)氨基酸序列参见SEQ ID NO:12)通过基因合成使其侧翼为酶切位点NotI和EcoRI。利用这两个重组位点，通过连接反应(T4-连接酶,Thermoscientific,Germany)将del EGFR克隆进pMP71。Del EGFR-pMP71在大肠杆菌(DH5α)中扩增，利用下述引物：正向引物:CAGCATCGTTCTGTGTTGTCT(SEQ ID NO:13),反向引物:CATTTAAATGTATACCCAAATCAA(SEQ ID NO:14)序列通过测序确认序列。利用Qiagen plasmidmaxi试剂盒(Qiagen,Germany)提取DNA。所有步骤根据制造商的建议进行。
3.4原代T-细胞和T-细胞系转导
转导根据进行了微小修饰的Leisegang等(J Mol Med,(2008)86,573-83)所描述的方法进行。简要地，包装细胞系Plat E(如Morita等,Gene Ther(2000).7,1063-6中所描述的)接种到6-孔板中，生长过夜至70–80％铺满。第一天，16μg的DNA与100mM CaCl2(Merck,Germany)和126.7μM氯喹(Chloroquin)(Sigma,USA)混合。Plat-E在低血清培养基(3％)中饥饿30min，然后与沉淀的DNA一起温育6h。去除培养基，更换为培养培养基。第二天，由C57Bl/6小鼠(Harlan Laboratories,The Netherlands)收获原代脾细胞。用T-细胞培养基中的抗-CD3(克隆145-2c11BD Pharmingen,USA),抗-CD28(克隆37.51,BDPharmingen,USA)和重组的鼠IL-2(Peprotech,Germany)刺激脾细胞的单细胞悬液，过夜。第3天，24-孔板用12,5μg/ml重组的倒裂碱(retronectin)(Takara Biotech,Japan)于室温下包被2h，用2％牛血清白蛋白(Roth,Germany)在37℃下封闭30min，用PBS洗。收获Plat E上清，通过过滤器(40μm,Milipore,USA)。将新鲜的T-细胞培养基添加到Plat E。将1ml经过滤的上清液分配到每一孔中，4℃下自旋接种(spinoculated)2h。从所述的24-孔板去除上清。106T-细胞接种到每孔添加了10U IL-2和400000抗-CD3和抗-CD28小珠(Invitrogen,Germany)的1ml T-细胞培养基中，32℃下以800g自旋接种30min。第4天再次收获Plat E上清并过滤。24-孔的每一孔中添加1ml，32℃下以800g自旋接种90min。接下来于37℃将细胞另外温育6小时。1ml的上清替换为具有IL-2的T-细胞培养基。第5天，收获细胞，计数，以106细胞/ml的密度再接种到添加了10ng IL-15/ml的T-细胞培养基(Peprotech,Germany)中。T-细胞保持在此密度直至第10天进行细胞分析或功能测定。
3.5抗体交联测定
表达EpCAM的4T1接种到6-孔板，生长至铺满。根据制造商的建议，用钙荧光素(Invitrogen,Germany)标记Del EGFR转导的T-细胞，37℃下与20μg/ml EpCAM x EGFR双特异性抗体(MAb225_scFv_G8.8)预加载30min。37℃下将细胞添加至4T1培养物2h。完全去除上清并用PBS彻底洗所述培养板。通过荧光显微镜目测检查所述的细胞，或裂解并用多标记读板器(Berthold,Germany)测定钙荧光素的保留。
3.6杀伤测定
mGC8细胞(
Figure BDA0000576357890000721
等,BMC(2006),14,6:57)或B16用钙荧光素根据制造商的建议进行标记。Del EGFR转导的T-细胞(来自野生型,OT-1或TCR-I小鼠)37℃下，与20μg.ml-1抗体(双特异性或对照抗体)预加载30min。37℃下，T-细胞与靶细胞以不同的靶对效应细胞比率温育，过夜。通过添加6％Triton X(Firma)诱导靶细胞总裂解。根据下述公式计算裂解百分比：
(MFI所关注的-MFI背景)/(MFI总裂解-MFI背景)*100
3.7体内疗法
用5x106细胞皮下接种mGC8野生型C57Bl/6。当肿瘤可触摸到时(经过15天)，开始T-细胞转导，10天后通过腹膜内地(10mg/kg抗体)或静脉内地(T-细胞或与加载的T-细胞，以每只小鼠5x106细胞的剂量)方式进行治疗。一周后，重复治疗。通过每2-3天测定皮下肿瘤对小鼠进行监控。根据规程在预先确定的时间点或根据GV SOLAS(Morton,Vet Rec(1985)116,431-436)出版的标准处死小鼠。
3.8.统计分析
为进行组间比较，进行了非配对T检验(unpaired T tests)。利用log-等级检验(log-rank test)通过双向ANOVA和存活率差异评估肿瘤体积。全部的统计分析均利用GraphPad Prism软件(GraphPad software inc.)进行。当p<0.05时，结果被认为具有显著性。
实施例4:双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的克隆和表达
类似于实施例1和2，(A)制备、纯化和表征靶向(人)EGFRvIII和(鼠)EpCAM的双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1的分析大小排阻层析(参见图20(A)分析大小排阻层析(B)所述双特异性抗体非还原(NR)和还原(R)SDS-PAGE分析。考马斯蓝染色)。
实施例5:转导的T-细胞与B16黑素瘤细胞通过双特异性抗体BsAbEpCAM-EGFRvIII,MR1.1的交联(参见图21的图示说明)
表达EpCAM的B16黑素瘤细胞(GFP-标记的)(B16-OVA-mEpCAM细胞)(接种到12-孔-板过夜生长至铺满。转天，del-hEGFRvIII转导的(插入了del-hEGFRvIII的；参见SEQ IDNO:17的DNA序列和SEQ ID NO:18(编码的)氨基酸序列)B3Z T-细胞(永久细胞系)与双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII,MR1.1(20μg)在37℃下预温育1小时。然后洗去所余下的未结合的双特异性抗体。双特异性抗体(BiAb)预加载的B3Z T细胞与黏附B16肿瘤细胞在37℃下温育(柱号:5)。用PBS(柱号:1-4)充分洗过4次以后，剩余的细胞经胰蛋白酶作用，通过流式细胞仪检测发荧光的和不-发荧光的细胞。作为对照B16黑素瘤细胞仅用delEGFRvIII转导的B3Z T-细胞(无抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII；参见柱号:2)处理，仅用非转导的B3Z T-细胞处理(无抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII参见柱号:3)经洗涤和未经洗涤，用非转导的B3Z T-细胞和双特异性抗体BsAb EpCAM-EGFRvIII(柱号:4)处理。与任何经洗涤的对照(柱号:2-4)相比，在烧瓶中，所述的双特异性抗体(BiAb)BsAb EpCAM-EGFRvIII保留了更多的转导的细胞(柱号:1)。结果如图22所示。
Figure IDA0000576357940000011
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Figure IDA0000576357940000251

Claims (48)

1.试剂盒，其包括：
(A)双特异性抗体分子，其包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域；和
(B)用非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中或之上的抗原转导获自待治疗的受试者的CD8+T-细胞所需的材料，
其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原是EGFR，
其中所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的抗原是EpCAM。
2.权利要求1的试剂盒，其中，所述转导CD8+T-细胞所需的材料是编码非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中或之上的抗原的核酸。
3.双特异性抗体分子，其包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域
用作药物(medicament)，其中，所述的双特异性抗体分子在施用来自所述受试者的、经转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原，
其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原是EGFR，
其中所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的抗原是EpCAM。
4.药物组合物，其包含双特异性抗体分子，所述的双特异性抗体分子包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，
其与包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、经转导的CD8+T-细胞结合施用，其中，所述的双特异性抗体分子在施用所述经转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，并且所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得，
其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原是EGFR，
其中所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的抗原是EpCAM。
5.双特异性抗体分子，其包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域
用于治疗恶性疾病(malignant disease)的方法，其中，所述的双特异性抗体分子在施用包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原的、经转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，并且所述的CD8+T-细胞由待治疗的受试者获得，
其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原是EGFR，
其中所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的抗原是EpCAM，
其中所述的恶性疾病是黑素瘤。
6.下述双特异性抗体分子在制备用于恶性疾病治疗的药物中的用途，所述治疗包括向所需受试者施用双特异性抗体分子，所述的双特异性抗体分子包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，
其中，所述的双特异性抗体分子在施用来自所述受试者的经转导的CD8+T-细胞之前、同时或之后施用，所述的CD8+T-细胞包含非天然地存在于CD8+T细胞之中或之上的抗原，
其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原是EGFR，
其中所述的天然地存在于肿瘤细胞表面上的抗原是EpCAM，
其中所述的恶性疾病是黑素瘤。
7.权利要求1的试剂盒，其中，所述的双特异性抗体分子选自下组：完全抗体，F(ab)-，Fab’-SH-，Fv-，Fab’-，F(ab’)2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，二价抗体，三价抗体，四价抗体和多价单链抗体。
8.权利要求7的试剂盒，其中，所述的完全抗体是完全人抗体。
9.权利要求7的试剂盒，其中，所述的二价抗体是二价单链抗体。
10.权利要求7的试剂盒，其中，所述的三价抗体是三价单链抗体。
11.权利要求7的试剂盒，其中，所述的多价单链抗体是二价单链抗体或三价单链抗体。
12.权利要求4的药物组合物，其中，所述的双特异性抗体分子选自下组：完全抗体，F(ab)-，Fab’-SH-，Fv-，Fab’-，F(ab’)2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，二价抗体，三价抗体，四价抗体和多价单链抗体。
13.权利要求12的药物组合物，其中，所述的完全抗体是完全人抗体。
14.权利要求12的药物组合物，其中，所述的二价抗体是二价单链抗体。
15.权利要求12的药物组合物，其中，所述的三价抗体是三价单链抗体。
16.权利要求12的药物组合物，其中，所述的多价单链抗体是二价单链抗体或三价单链抗体。
17.权利要求3或5的双特异性抗体分子，其中，所述的双特异性抗体分子选自下组：完全抗体，F(ab)-，Fab’-SH-，Fv-，Fab’-，F(ab’)2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，二价抗体，三价抗体，四价抗体和多价单链抗体。
18.权利要求17的双特异性抗体分子，其中，所述的完全抗体是完全人抗体。
19.权利要求17的双特异性抗体分子，其中，所述的二价抗体是二价单链抗体。
20.权利要求17的双特异性抗体分子，其中，所述的三价抗体是三价单链抗体。
21.权利要求17的双特异性抗体分子，其中，所述的多价单链抗体是二价单链抗体或三价单链抗体。
22.权利要求6的用途，其中，所述的双特异性抗体分子选自下组：完全抗体，F(ab)-，Fab’-SH-，Fv-，Fab’-，F(ab’)2-片段，嵌合抗体，CDR-移植抗体，二价抗体，三价抗体，四价抗体和多价单链抗体。
23.权利要求22的用途，其中，所述的完全抗体是完全人抗体。
24.权利要求22的用途，其中，所述的二价抗体是二价单链抗体。
25.权利要求22的用途，其中，所述的三价抗体是三价单链抗体。
26.权利要求22的用途，其中，所述的多价单链抗体是二价单链抗体或三价单链抗体。
27.权利要求1的试剂盒，其中，所述的第一结构域和/或第二结合结构域是人的和/或人源化的。
28.权利要求4的药物组合物，其中，所述的第一结构域和/或第二结合结构域是人的和/或人源化的。
29.权利要求3或5的双特异性抗体分子，其中，所述的第一结构域和/或第二结合结构域是人的和/或人源化的。
30.权利要求6的用途，其中，所述的第一结构域和/或第二结合结构域是人的和/或人源化的。
31.权利要求1的试剂盒，其中，所述经转导的CD8+T-细胞还包括天然地存在于所述T-细胞上的T-细胞受体和/或通过基因工程引入所述T-细胞的T-细胞受体。
32.权利要求4的药物组合物，其中，所述经转导的CD8+T-细胞还包括天然地存在于所述T-细胞上的T-细胞受体和/或通过基因工程引入所述T-细胞的T-细胞受体。
33.权利要求3或5的双特异性抗体分子，其中，所述经转导的CD8+T-细胞还包括天然地存在于所述T-细胞上的T-细胞受体和/或通过基因工程引入所述T-细胞的T-细胞受体。
34.权利要求6的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞还包括天然地存在于所述T-细胞上的T-细胞受体和/或通过基因工程引入所述T-细胞的T-细胞受体。
35.核酸序列，其编码权利要求3、5、17、29和33中任一项所定义的双特异性抗体分子。
36.载体，其包含权利要求35的核酸序列。
37.权利要求36的载体，其中，所述的载体还包括与权利要求35的核酸序列可操作连接的调节序列。
38.权利要求36或权利要求37的载体，其中，所述的载体是表达载体。
39.用权利要求36-38中任一项所定义的载体转化的宿主细胞。
40.用于生产权利要求3、5、17和29中任一项所定义的双特异性抗体分子的方法，所述方法包括：
(a)在允许如权利要求3、5、17和29中任一项所定义的双特异性抗体分子表达的条件下，培养权利要求39所定义的宿主细胞；和
(b)从所述的培养物中回收所产生的双特异性抗体分子。
41.权利要求3、5、17和29中任一项所定义的双特异性抗体分子，其包含：
(i)与CD8+T-细胞上的抗原结合的第一结合结构域，所述的抗原非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上；和
(ii)与天然地存在于肿瘤细胞表面上的肿瘤-特异性抗原结合的第二结合结构域，
其中，所述的抗体分子由权利要求40的方法生产。
42.(1)用非天然地存在于CD8+T-细胞之中或之上的抗原转导CD8+T-细胞所需的材料和(2)权利要求3、5、17、29和41中任一项所定义的双特异性抗体分子在制备用于在受试者中治疗疾病的试剂或试剂盒中的用途，其中所述治疗包括下述步骤：
(a)由受试者分离CD8+T-细胞；
(b)用非天然地存在于所述CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原转导上述分离的CD8+T-细胞，其中所述的非天然地存在于CD8+T-细胞之中和/或之上的抗原是EGFR；
(c)将所述经转导的CD8+T-细胞施用于所述受试者；和
(d)将权利要求3、5、17、29和41中任一项所定义的双特异性抗体分子施用于所述受试者，
其中所述的疾病是黑素瘤。
43.权利要求42的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞通过静脉输注施用于所述受试者。
44.权利要求42的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞与T-细胞受体共-转导。
45.权利要求42的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞通过抗-CD3和抗-CD28抗体扩增。
46.权利要求45的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞的扩增在细胞因子存在下进行。
47.权利要求46的用途，其中，所述经转导的CD8+T-细胞的扩增在白介素-2(IL-2)和/或白介素-15(IL-15)存在下进行。
48.权利要求42-47中任一项的用途，其中，所述的双特异性抗体在所述经转导的CD8+T-细胞施用之前、同时或之后施用。
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