CN105384826A - 表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)以及相关的核酸、表达载体、脐血有核细胞、注射液。本发明所述的表达CAR的脐血有核细胞可通过CAR靶向EGFRvIII抗原，高效杀伤EGFRvIII阳性肿瘤细胞，可用于制备预防和治疗多种EGFRvIII阳性肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等的药物。

Description

表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对表达EGFRvIII阳性肿瘤的转基因细胞治疗领域。

背景技术

过继免疫治疗是将自体或异体抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外用IL-2、抗CD3单抗等诱导、激活和扩增，然后转输给患者，以达到治疗和预防复发的目的。目前已经开发出CTL、NKT、γδT、TIL、CIK、DC-CIK、CAR-T等多种过继免疫疗法，然而这些过继免疫疗法在疗效及副作用上仍具有较大的挑战。CAR-T免疫疗法为最新技术，移植细胞可在体内扩增近千倍且存活长达6个月并持续表达抗原受体。在临床上显示出很好的疗效，在血系肿瘤，有47项相关报道，均取得了显著的治疗效果。然而，CAR-T在治疗实体瘤上并未取得理想的临床疗效。另外，目前发现的肿瘤特异性抗原(TSA)较少，CAR-T细胞治疗大多数靶向肿瘤相关抗原(TAA)，肿瘤相关抗原在其它正常组织中也表达，因此，CAR-T治疗常常伴随着严重的脱靶细胞会攻击正常细胞而给患者带来新的损伤。此治疗常常伴随着严重的脱靶效应，CAR-T细胞攻击正常细胞而给患者带来新的损伤。

EGFRvIII是一种表皮生长因子受体的突变型，该突变体在细胞表面表达，是肿瘤特异性抗原(TSA)，其可在50％-60％的胶质母细胞瘤，70％-80％的乳腺及卵巢癌及大约16％肺癌中表达(Wikstrand等，CancerRes.55:3140-3148(1995))，是肿瘤治疗中极富吸引力的靶部位。

目前，诸多学者已经制备出针对EGFRvIII的CAR-T细胞，在体外杀伤试验及动物试验中取得了一定的疗效，然而，其在临床试验中并未取得理想的疗效。原因可能有以下几点，首先，恶性肿瘤细胞存在高度的异质性，同一患者中的肿瘤细胞并非都表达此抗原，灭杀单一类型的细胞并不能够根治肿瘤；其次，肿瘤患者体内T细胞长期受肿瘤细胞逃避机制的影响，其在遗传学上可能存在一定的缺陷，其杀伤作用可能降低；再次，肿瘤患者免疫功能低下，单一的CAR-T细胞移植虽然能够杀伤特异性肿瘤细胞，然而其未必能够重建患者免疫功能，提高患者对肿瘤的免疫功能。

CAR-T细胞治疗在血系肿瘤良好的治疗效果也预示着其治疗实体瘤的潜能，诸多学者不断地对CAR-T细胞进行改进以期在实体瘤治疗中取得突破。本发明使用脐血有核细胞作为宿主细胞，通过慢病毒转染使其表达CAR，在对野生型EGFRvIII阳性细胞的体外杀伤及EGFRvIII阳性胶质瘤动物肿瘤治疗中取得了良好的效果。脐带血中淋巴细胞相对不成熟，抗原性较弱，而且脐血中还富含造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞等多种原始细胞，在肿瘤治疗中可能具有更长期持久的疗效。另外脐带血是废弃的血源，对供体没有负担，来源广泛，易于收集和保存；将有望成为通用型肿瘤治疗产品。

发明内容

本发明的目的首先是构建一种嵌合抗原受体(CAR)。

本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)为一段融合多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；所述CAR包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域；所述抗原识别结构域包括针对表皮生长因子受体3号突变体(EGFRvIII)的单克隆抗体或其可变区或其抗原的结合区域。

根据本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述抗原识别结构域包括：IgGκ信号肽、以连接肽连接重、轻链形成的单链抗体片段(scFv)；所述抗原识别结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:2；所述IgGκ信号肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3；所述单链抗体片段(scFv)的氨基酸序列为SEQIDNO:4。

根据本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述跨膜结构域包括：铰链结构以及跨膜区；所述跨膜结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:5；所述铰链结构的氨基酸序列为SEQIDNO:6；所述跨膜区的氨基酸序列为SEQIDNO:7。

根据本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)的进一步特征，所述细胞内T细胞信号传导结构域包含CD137和CD247；所述细胞内T细胞信号传导结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:8；所述CD137的氨基酸序列为SEQIDNO:9；所述CD247的氨基酸序列为SEQIDNO:10。

本发明还提供了一种核酸分子。所述核酸分子编码本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)。

本发明还提供了一种表达载体。所述表达载体含有本发明所述的核酸分子。此载体能够高效转导脐血有核细胞并在其中稳定表达。

本发明设计了编码靶向EGFRvIII抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核酸MD1-1-CD8α-CD137-CD247(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，其中MD1-1编码高亲和结合EGFRvIII的单链抗体(scFv)，其由MD1突变形成。CD8α编码铰链及跨膜结构，CD137、CD247编码T细胞激活及信号传导结构。然后，将此核酸连接到Fuw载体(Fuw空载体由中国科学院广州生物医药与健康研究院惠赠)构建了慢病毒表达载体Fuw-IgGk-MD1-1-CD8α-CD137-CD247及其同型对照载体Fuw-EGFP，将该载体转染293T细胞包装病毒，在本发明的一个实施方案中，每一个10cm皿的293T细胞可包装滴度为2×10⁸TU的病毒，病毒可进行冻存，复苏后细胞滴度将下降为原来的50％左右。

本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞。

本发明所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞含有本发明所述的核酸分子，或者含有本发明所述的载体，所述核酸分子通过病毒、脂质体、电转染或转座子系统转染至脐血有核细胞，在靶细胞表达为嵌合抗原受体(CAR)。

优选地，所述脐血有核细胞来源于人或动物脐血，是通过梯度密度离心、流式分选、免疫磁珠分选方法分离获得的有核细胞群，包括：T细胞、杀伤细胞、造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞。

本发明还提供了所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞的用途。

本发明所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞可用于制备治疗或预防神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的药物，该药物能通过CAR靶向EGFRvIII抗原，高效杀伤肿瘤细胞的细胞群，例如靶向杀伤EGFRvIII阳性肿瘤细胞，并以其为主要成份制备一种可预防和治疗多种EGFRvIII阳性肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤的药品。

本发明还提供了一种细胞注射液。

本发明所述的细胞注射液包括本发明所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞。

附图说明

图1显示的是针对EGFRvIII抗原的嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒表达载体Fuw-CAR(A)及其同型对照载体Fuw-EGFP(B)结构图。其中Fuw-EGFP由中国科学院广州生物医院与健康研究院惠赠，Fuw-CAR为将核酸MD1-1-CD8α-CD137-CD247(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)连接至Fuw空表达载体上形成。

图2显示的是EcoR1和BamH1双酶切鉴定慢病毒质粒的核酸电泳图，其中1-6泳道分别为六个Fuw-CAR质粒样品酶切后及原质粒电泳图，7-8为Fuw-EGFP酶切后及其原质粒电泳图。表明本实施方案构建的载体大小与设计相符。

图3显示的是使用PEI转染293T细胞包装慢病毒的转染效率，转染效率在90％以上。

图4显示的是单独使用T细胞激活因子CD3的使用方法及浓度与T细胞增殖效果关系图：结果显示在培养基中直接添加80ng/mlCD3激活时，细胞增殖最快。

图5显示的是Fuw-CAR及同型对照Fuw-EGFP慢病毒感染脐血有核细胞后EGFP表达效率。

图6显示的是转染的脐血有核细胞流式鉴定图，细胞群中大部分为CD3阳性细胞。

图7显示的是从患者肿瘤组织中提取基因组EGFRvIII表达概况，1泳道为阳性，2泳道为阴性，阳性者适合本发明细胞治疗。

图8显示的是本发明表达CAR的细胞及其同型对照细胞对从患者肿瘤组织中分离的EGFRvIII阳性及阴性神经胶质瘤细胞的杀伤能力。表达CAR的细胞对EGFRvIII阳性神经胶质瘤细胞具有显著的杀伤作用，并且随着细胞用量的增加而增高。对EGFRvIII阴性神经胶质瘤细胞杀伤能力与对照相比没有显著差异。

图9显示的是本发明表达CAR的细胞及其同型对照细胞对从患者肿瘤组织中分离的EGFRvIII阳性及阴性乳腺癌细胞的杀伤能力。表达CAR的细胞对EGFRvIII阳性乳腺癌细胞具有显著的杀伤作用，并且随着细胞用量的增加而增高。对EGFRvIII阴性乳腺癌细胞杀伤能力与对照相比没有显著差异。

图10显示的是本发明表达CAR的细胞及其同型对照细胞对从患者肿瘤组织中分离的EGFRvIII阳性及阴性卵巢癌细胞的杀伤能力。表达CAR的细胞对EGFRvIII阳性卵巢癌细胞具有显著的杀伤作用，并且随着细胞用量的增加而增高。对EGFRvIII阴性卵巢癌细胞杀伤能力与对照相比没有显著差异。

图11显示的是将表达CAR的脐血有核细胞及其同型对照细胞与EGFRvIII阳性及阴性的神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞共培养后上清中INF-γ的表达量。表达CAR的细胞与EGFRvIII阳性细胞共培养后INF-γ的表达显著高于与EGFRvIII阴性细胞共培养，而其同型对照细胞与EGFRvIII阳性及阴性细胞共培养后其INF-γ的表达较低，未见有显著差异。

图12显示的是表达CAR的脐血有核细胞对人脑胶质瘤移植瘤免疫缺陷小鼠模型的影响。移植表达CAR的脐血有核细胞对免疫缺陷小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。在第10天移植细胞，之后10天左右其肿瘤生长速度显著变慢，再往后其体积呈减小趋势，表明表达CAR的脐血有核细胞具有良好的抑制肿瘤生长效果并能有效减小杀伤肿瘤细胞，减小肿瘤体积。移植其同型对照细胞组与PBS组肿瘤仍持续增长，两者之间没有显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中如未注明具体条件的实验，则按照常规条件进行，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书是，则按照说明书所建议条件进行。

实施例1：表达本发明嵌抗原受体及其表达EGFP同型载体质粒的设计与构建。

1.CAR结构设计

本发明的嵌合抗原受体(CAR)，其包含人抗体EGFRvIII的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的融合蛋白或多肽，它们利用单克隆抗体的抗原结合性质以非MHC限制的方式改变T细胞对选定靶标的特异性和反应性的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。

本发明的CAR对表皮生长因子受体变体III(EGFRvII1)具有抗原特异性。EGFRvIII是表皮生长因子受体(EGFR)的变体，是在人神经胶质瘤中发现的几种EGFR突变中的最普遍的，且在约30％至约50％的多形性成胶质细胞瘤(GBM)中表达。EGFRvIII的表达源自消除EGFR外显子2-7并造成编码序列的外显子1和8的连接的基因内缺失重排。EGFRvIII由不同癌症的肿瘤细胞表达，例如：成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌；头颈鳞状细胞癌；髓母细胞瘤、结直肠癌、前列腺癌和膀肮癌等。据信，通过引起针对EGFRvIII的抗原一特异性反应，本发明的CAR能够靶向和破坏表达EGFRvIII的肿瘤细胞，减少或消除肿瘤，促进免疫细胞向肿瘤部位的渗入，增强和延长抗肿瘤反应。因为EGFRvIII不在正常的组织中表达，本发明的CAR基本上避免破坏正常的组织和细胞。

本发明中所述的特异性地结合EGFRvIIL的scFv名为MD1-1，其序列公开于专利CN01807175.9，所述文献通过引用结合于此。MD1-1为MD1的CDR3重链及轻链突变而来，轻链可变区和重链可变区之间由接头肽连接，对EGFRvIII具有更高的结合力。其氨基酸序列包含SEQIDNO:4，由其组成或基本上由其组成。

本发明中所述抗原结合结构域包含前导序列IgGκ。所述前导序列可以位于轻链可变区的氨基端。其氨基酸序列包含SEQIDNO:3，由其组成或基本上由其组成。

本发明中所述CAR包含的铰链结构域、跨膜结构域包含CD8α，其氨基酸序列包含有SEQIDNO:5，由其组成或基本上由其组成。

本发明中所述CAR包含的胞内T细胞信号传导结构域包含有CD137和CD3ζ。CD137会将有效的共剌激信号传导至T细胞，从而促进分化和增强T淋巴细胞的长期存活。CD3ζ与TCR结合以产生信号，且含有基于免疫受体酷氨酸的活化基序(ITAM)。其氨基酸序列包含SEQIDNO:9(CD137)、SEQIDNO:10(CD3ζ)，基本上由其组成或由其组成。

2.慢病毒表达载体Fuw-GFP及Fuw-CAR的构建。

委托上海捷瑞生物科技有限公司合成基因序列BamHI-IgGκ-MD1-1-CD8α-CD137-CD247-EcoR1，获得载体pUC57-IgGκ-MD1-1-CD8α-CD137-CD247(以下简称CAR)。慢病毒表达载体Fuw-EGFP由本实验室构建保存。

图1显示的是针对EGFRvIII抗原的嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒表达载体Fuw-CAR(A)及其同型对照载体Fuw-EGFP(B)结构图。其中Fuw-EGFP由中国科学院广州生物医院与健康研究院惠赠，Fuw-CAR为将核酸MD1-1-CD8α-CD137-CD247(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)连接至Fuw空表达载体上形成。

用BamHI和EcoRI分别对质粒Fuw-GFP及pUC57-CAR进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后胶回收Fuw-GFP的大片段及pUC57-CAR的大小在1400bp左右的片段，使用SolutionI连接后将连接片段转化至感受态大肠杆菌，扩增后鉴定结果正确(图2)，从而获得慢病毒表达载体Fuw-GFP及Fuw-CAR。

3.质粒转染293T包装慢病毒

将生长状态良好的293T细胞传代至10cm培养皿，等细胞增殖至约为80-90％时候更换新鲜培养基并进行转染。

取15mL离心管，加入1mLOpti-MEM，再加入8μg质粒Fuw-EGFP/Fuw-CAR，2.5μg包膜质粒pMD2G，5.5μg包装质粒PSPAX2，摇匀静置5分钟。加入64μgPEI转染试剂，用力摇匀，静置12-15分钟。将上述试剂滴加至293T细胞表面，摇匀37℃培养12h后换液，再培养36h后观察荧光表达(图3)并收获上清，用0.45μm滤器过滤去除细胞碎片，超速离心25000rpm，2.5h。弃上清，加T细胞培养基重悬病毒，过滤除菌-80℃保存。

4.慢病毒滴度测定

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×10⁵/ml，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备10个孔。准备10个1.5mLEP管，每管加入90μL培养液，往第一个管中加入10μL病毒原液，混匀后，吸取10μL加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度(10-10^-8)。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。24h后加液100μL。转染48h后观察结果并计算滴度：在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。

本发明一个实施例中每个10cm皿293T细胞包装病毒滴度约为2×10⁸TU，冻存复苏后滴度约为1×10⁸TU。

实施例2：重组病毒感染脐血有核细胞。

1.单独使用CD3mAb激活脐血单个核细胞的条件摸索

目前常用的激活淋巴细胞方法为CD3/CD28磁珠激活法，然而此法在细胞中引入有磁珠，后续分离磁珠操作繁琐，增加了污染的风险，并且磁珠价格高昂，不利于临床规模使用。因此，我们摸索了仅使用CD3dmAb激活脐血有核细胞的方法，通过对其使用浓度和使用方法的筛选，最终确定为直接往培养基中添加80ng/mL的CD3mAb时脐血有核细胞增殖较快见图4。

2.慢病毒感染脐血单个核细胞及其扩增

用梯度密度离心法从健康人脐血中分离有核细胞。以1×10⁶细胞/mL的密度加入含300IU/mlIL-2(北京双鹭制药有限公司)的GT-T551(Takara)T淋巴细胞培养基培养，并加入5％的同一脐血的血浆，以及80ng/mL的CD3mAb(上海微科生物科技有限公司)激活T细胞刺激培养48h，然后以MOI＝5用上述重组慢病毒感染脐血有核细胞，感染后的细胞第二天换液，每隔2-3天传代。

细胞培养至10天左右收获细胞，细胞可扩增30-80倍，且细胞再激活后仍能扩增。在荧光显微镜下可观察到同型对照细胞高表达绿色荧光蛋白(图5)。并通过流式检测技术分析转染的脐血有核细胞中各类细胞(T细胞、NK细胞、CIK细胞等)比例以及CAR表达效率(图6)，可见大部分细胞为CD3阳性T淋巴细胞，包含有部分CIK和少量NK细胞，另外也有CD34阳性的造血干细胞等(数据未显示)。

实施例3：神经胶质瘤细胞系的建立及其EGFRvIII表达检测

1.神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞及卵巢癌细胞的分离培养与传代

术中取无坏死、无囊性变标本，浸入DMEM/F12保鲜，于30分钟内进行分离、培养。去除周围坏死组织，DMEM/F12冲洗3遍，组织块剪成直径0.5mm大小，巴氏吸管反复吹打成单细胞悬液70μm孔径筛网过滤，200g离心5分钟，保留1ml培养基按比例1：5加入37℃预热红细胞裂解液作用2分钟，200g离心5分钟，弃上清。完全培养基重悬细胞，胎盘蓝染色计数活细胞，以2×10⁵细胞/mL接种于培养瓶，在含有10％胎牛血清的DMEM/F12中培养。

刚分离的原代细胞大约4小时开始贴壁，24小时伸展开，48小时完全伸展开，原代培养的细胞第3天开始增殖，第6天可传代。传代1-2代后，细胞生长加快，约3-4天传代一次。传代7-8代后原代细胞生长变慢，约7-8天传代一次，部分细胞皱缩，后出现衰老、死亡，此时再并瓶培养，坚持每3天换液一次，1-2周后细胞开始增殖，然后每3天换一次液，每周传一代，至第15代细胞恢复生长加快，约3-4天传代一次。

细胞生长曲线呈形S接种后第1-2天为潜伏适应期，从第3天细胞开始增殖加速并进入对数生长期，第8天达到高峰，以后进入平台期。群体倍增时间约为60h。克隆形成率为4％左右。

2.肿瘤细胞EGFRvIII表达鉴定

合成引物(上海捷瑞生物工程有限公司)

EGFRvIII-R：5’-GATCCAGAGGAGGAGTATGTGTG-3’

EGFRvIII-F：5’-GTCCAGTATTGATCGGGAGAGC-3’

试剂盒法提取神经胶质瘤细胞RNA(详细操作见天根动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)使用说明书)，反转录成cDNA(详细操作见FormentasRevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesiskit(K1622)使用说明书)。以上述引物及cDNA进行PCR，其反应体系如下：

反应程序如下(32循环)：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，EGFRvIII阳性细胞在700bp左右和/或2800bp左右出现有条带，EGFRvIII阴性细胞无条带或2800bp左右出现有条带，如图7。

因此，本发明可建立一种检测癌症患者是否适合用本发明的表达嵌合抗原受体脐血有核细胞治疗的检测方法：提取患者肿瘤组织DNA(或者RNA反转录成cDNA)，以此为模板设计引物进行PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳法检测组织中是否表达EGFRvIII，如果为阳性，则适合于采用本发明所述的脐血有核细胞制备的药物进行治疗。

实施例4：表达CAR的脐血有核细胞对野生型EGFRvIII阳性肿瘤细胞的体外杀伤作用

取长至对数期的EGFRvIII阳性及阴性肿瘤细胞，用0.25％的胰酶消化，分别收集至15ml离心管中，用高糖DMEM培养基洗涤后加细胞培养基重悬并调整细胞密度为10⁵细胞/mL。接种至96孔板，100uL/孔，培养24小时。

按以下设计(A：EGFRvIII+细胞+表达CAR的脐血有核细胞(A1：1:5，A2：1:10，A3：1:20，A4：1:40)；B：EGFRvIII+细胞+同型对照细胞(B1：1:5，B2：1:10，B3：1:20，B4：1:40)；C：EGFRvIII+细胞；D：表达CAR的脐血有核细胞；E：同型对照细胞；F：培养基；G：EGFRvIII-细胞+表达CAR的脐血有核细胞(G1：1:5，G2：1:10，G3：1:20，G4：1:40)；H：EGFRvIII+细胞+同型对照细胞(H1：1:5，H2：1:10，H3：1:20，H4：1:40)；I：EGFRvIII-细胞)；加入后所有孔培养基量调整一致，共培养20小时。

每孔加入10uLCCK-8试剂，混匀。继续培养1-4小时后酶标仪上，450nm和630nm双波长下测定OD值。

表达CAR的脐血有核细胞杀伤EGFRvIII+细胞效率＝[OD(A)-OD(D)]/[OD(C)-OD(F)]×100％。

同型对照细胞杀伤EGFRvIII+细胞效率＝[OD(B)-OD(E)]/[OD(C)-OD(F)]×100％。

表达CAR的脐血有核细胞杀伤EGFRvIII-细胞效率＝[OD(G)-OD(D)]/[OD(I)-OD(F)]×100％。

同型对照细胞杀伤EGFRvIII-细胞效率＝[OD(H)-OD(E)]/[OD(I)-OD(F)]×100％。

根据以上检测方法没得表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞对EGFRvIII阳性及阴性细胞的杀伤活性，其结果见图8(神经胶质瘤细胞)、图9(乳腺癌细胞)、图10(卵巢癌细胞)。由图可见，达嵌合抗原受体的脐血有核细胞对EGFRvIII阳性的三种肿瘤细胞均有较高的杀伤活性，且随细胞使用量的增加而增加，与对照相比具有显著性差异。而其对EGFRvIII阴性细胞的杀伤活性与对照相比差异不显著。

实施例5：ELISA法检测本发明细胞与靶细胞共培养后细胞因子IFN-γ的分泌

将EGFRvIII阳性及阴性神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞和卵巢癌细胞分别以2×10⁵个/孔加入2个24孔培养板中培养，37℃、5％CO₂培养箱中培养。次日待肿瘤细胞贴壁后每孔分别加入2×10⁶个表达CAR的脐血有核细胞或及其同型对照细胞，继续在培养箱共培养24小时。取上清500ul，4000r/min离心10min，去除颗粒和聚合物。用人γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒(上海逸峰生物科技有限公司)检测IFN–γ的释放水平。具体操作步骤如下：

用标准品稀释液稀释标准品，使浓度依次为800、400、200、100、50、25pg/mL。从室温放置20分钟的铝箔袋中取出微孔酶标板，剩余密封后放回4℃。旋转标准品孔和样本孔，标准品孔中加不同浓度的标准品50uL。待测样本各孔做好相应标记。每种样品设3复孔，先加待测样本10uL，再加样本稀释液40ul。向标准孔和样本孔每孔加入100ul用HRP标记的检测抗体，封住反应孔，置37℃水浴1h左右。弃尽液体，每孔中满洗涤液，静置1分钟，再次弃尽液体，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50ul，15分钟内，在450nm波长处测定各孔OD值。在Excel表中，以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准品的线性回归曲线，按曲线方程计算样本中IFN-γ的浓度值。其结果如图11，表达CAR的脐血单个核细胞与EGFRvIII阳性细胞共培养后INF-γ的表达显著高于与EGFRvIII阴性细胞共培养，而其同型对照细胞与EGFRvIII阳性及阴性细胞共培养后其INF-γ的表达较低，未见有显著差异。

实施例6：表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞对人脑胶质瘤移植瘤免疫缺陷小鼠模型的影响

1.建立免疫缺陷小鼠人脑胶质瘤移植瘤模型

将长到对数期的EGFRvIII阳性及阴性细胞消化收集到15ml离心管，用DMEM洗涤，弃上清。加PBS重悬调整细胞密度为5×10⁷/ml。和碘酊和乙醇消毒免疫缺陷小鼠北部皮肤，抽取100ul细胞接种于小鼠右侧背部皮肤皮下，拔针后压迫针孔片刻，接种后送回SPF饲养室饲养。接种后每天观察小鼠饮食，排便及精神状况并称重，观察各注射点有无红肿破溃并用游标卡尺测量肿块的长度和宽度。肿瘤体积评估按V＝0.5×a×b2(a为长度，b为宽度)计算。

2.细胞输注

当肿瘤体积达到约500mm³时，将裸鼠按每组5只随机分成3组。从尾静脉移植细胞或PBS至小鼠体内。A组移植1×10⁷表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞，B组移植相同数量的EGFP对照细胞，C组移植PBS。输注后，继续观察小鼠，称重并测量评估肿瘤体积，共观察2个月。当肿瘤体积达到2000mm³时，处死小鼠。统计各组数据，绘制图表。

3.实验结果：移植表达CAR的脐血有核细胞对免疫缺陷小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用(图12)。在第10天移植细胞，之后10天左右其肿瘤生长速度显著变慢，再往后其体积呈减小趋势，表明表达CAR的脐血有核细胞具有良好的抑制肿瘤生长效果并能有效减小杀伤肿瘤细胞，减小肿瘤体积。移植其同型对照细胞组与PBS组肿瘤仍持续增长，两者之间没有显著差异。

实施例7：细胞注射液的制备

通过密度梯度离心方法从脐血中分离出脐血有核细胞，使用红细胞裂解液裂解其中红细胞后使用无血清T淋巴细胞培养基GT-T551(Takara)添加IL-2进行培养，以单独CD3mAb进行激活，避免了免疫磁珠激活的繁琐步骤及磁珠污染，能够更安全的用于临床。

激活后第2天，用包装的病毒感染细胞(参见实施例1和2)，感染后48-72h可见对照细胞表达绿色荧光。每2-3天可进行扩大培养，10-14天收获细胞质量检测合格品冻存。

使用时复苏洗涤后添加生理盐水注射液制成表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞混悬液。

本实施例所述的细胞注射液包括本发明所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞，可用于制备治疗或预防神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于：所述CAR为一段融合多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；所述CAR包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域；所述抗原识别结构域包括针对表皮生长因子受体3号突变体(EGFRvIII)的单克隆抗体或其可变区或其抗原的结合区域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述抗原识别结构域包括：IgGκ信号肽、以连接肽连接重、轻链形成的单链抗体片段(scFv)；所述抗原识别结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:2；所述IgGκ信号肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3；所述单链抗体片段(scFv)的氨基酸序列为SEQIDNO:4。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述跨膜结构域包括：铰链结构以及跨膜区；所述跨膜结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:5；所述铰链结构的氨基酸序列为SEQIDNO:6；所述跨膜区的氨基酸序列为SEQIDNO:7。

4.根据权利要求1所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞，其特征在于：所述细胞内T细胞信号传导结构域包含CD137和CD247；所述细胞内T细胞信号传导结构域的氨基酸序列为SEQIDNO:8；所述CD137的氨基酸序列为SEQIDNO:9；所述CD247的氨基酸序列为SEQIDNO:10。

5.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

6.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求5所述的核酸分子。

7.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞，其特征在于：其含有权利要求5所述的核酸分子，或者含有权利要求6所述的载体，所述核酸分子通过病毒介导、脂质体介导、电转染或转座子系统等方法转染至脐血有核细胞，在靶细胞表达为嵌合抗原受体(CAR)。

8.根据权利要求7所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞，其特征在于：所述脐血有核细胞来源于人或动物脐血，是通过梯度密度离心、流式分选、免疫磁珠分选方法分离获得的有核细胞群，包括：T细胞、杀伤细胞、造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞。

9.如权利要求7所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞用于制备治疗或预防神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的药物的用途。

10.一种细胞注射液，其特征在于，包括如权利要求7所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的脐血有核细胞。