CH678815A5

CH678815A5 -

Info

Publication number: CH678815A5
Application number: CH936/88A
Authority: CH
Inventors: Ian Farquhar Campbell Mckenzie; Geoffrey Allan Pietersz; Mark John Smyth
Original assignee: Erba Carlo Spa; Univ Melbourne
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1991-11-15
Also published as: FR2612074A1; SE503402C2; IE880701L; HUT46547A; HU205266B; IE64781B1; FI881158A0; JPS63301832A; RU2106147C1; YU46858B; DE3808166A1; AT395375B; IL85688A0; NO881105D0; US5798097A; AU1288188A; FR2612074B1; FI98706B; IT8819746A0; FI881158L

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft Immunglobulinkonjugate, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Mittel, die diese enthalten.

Das allgemeine Konzept zum direkten Anpeilen von Tumoren mit antineoplastischen Agentien unter Verwendung monoklonaler Antikörper (MoAbs) ist bekannt, und die therapeutische Bedeutung wird derzeit einer Untersuchung unterzogen, im allgemeinen geht man dabei so vor, dass man Konjugate aus einem Antikörper und einem toxischen Agens, die in der Lage sind, sich selektiv an den Tumorzellen zu lokalisieren und diese zu zerstören, herstellt. Ein besonderes Augenmerk galt der Konstruktion von Im-muntoxinen aus den A-Ketten pflanzlicher und bakterieller Toxine und Antikörpern, und zwar so, dass es bei der Bindung des Antigens und bei der Einverleibung desselben zum Zelltod kommt. In der Praxis hat sich gezeigt, dass viele MoAbs, von denen man glaubte, dass sie tumor-spezifisch sind, auch mit Sub-popuiationen normaler Zeilen reagieren, so dass es folglich unrealistisch ist, derart potente Toxine einzusetzen, da sie auch normale Gewebe in nennenswerter Weise schädigen. Eine sicherere Alternative zu Pfianzentoxinen stellt die Kopplung von Antikörpern an konventionelle Anti-Krebsmittel, wie Doxorubicin, Vindesin, Chlorambucil, Melphalan und Methotrexat, dar. Aufgrund der nicht-spezifischen toxischen Wirkung der derzeit verwendeten antineoplastischen Agenzien hat man versucht, deren therapeutischen Index zu erhöhen, indem man sie an MoAbs auf Tumorantigene koppelte.

Versuche zur Unterdrückung der Transplantatabstossung durch T-Zellen aus dem Thymus haben sich häufig darauf fokussiert, die T-Zellenaktivität durch Einsatz von Antithymocyten-Globulin zu reduzieren. In letzter Zeit ist es durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper möglich geworden, T-Zellen-untergruppen entsprechend ihrer Funktion in vitro und das Vorliegen spezifischer Oberflächenantige-ne, wie sie durch MoAb definiert werden, zu bestimmen. Dies hat die Suche nach einem Mechanismus stimuliert, mit dem T-Zellen die Transplantatabstossung kontrollieren, wobei man sich auf die hauptsächliche Unterteilung in Helfer/Induktions- und cytotoxische/Suppressor-Untergruppen, wie sie durch die L3T4 und Ly-2-Maus-Antigene definiert werden, konzentriert. Obwohl sich OKT3 MoAb, ein Anti-Pan-T-Zellenreagens, in vivo als wirksam gezeigt hat, haben wir bei einer kürzlichen Untersuchung festgestellt, dass 20 MoAbs auf 20 verschiedene Maus-Lymphocytenantigene in vivo in Mäusen ohne Wirkung waren und daher fur in vivo-Studien nicht von Nutzen sind. Es ist deshalb angezeigt, nach Mitteln zu suchen, mit deren Hilfe diese hochspezifischen MoAbs wirksamer gemacht werden können, so dass eine vollständige Entfernung der target-Zellen erfolgt. Eine Methode besteht dabei in der Verwendung cytotoxischer Arzneimittel, die an MoAbs gekoppelt sind.

Das klinische Potential von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten umfasst die Immunchemotherapie von Krebs sowie die Erleichterung verschiedener immunregulativer Störungen und die allo-TranspIantatab-stossung. In vielen Untersuchungen konnte die spezifische Cytotoxizität von Toxinen und Arzneimitteln auf Tumorzellen gezeigt werden, wenn diese mit MoAb auf tumor-assoziierte Antigene gekoppelt werden. Weniger Bedeutung hat man auf die in vivo-Verwendung von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten angewendet, um T-Zellen zu zerstören und die T-Zellen-Immunregulierung bei der Transplantatabstossung zu untersuchen, obwohl Toxin-Antikörper-Konjugate in vitro in grossem Ausmass eingesetzt werden, um T-Zellen vor der Knochenmarkstransplantation zu zerstören.

Anthracyciine stellen eine wichtige Gruppe antineoplastische Agenzien, die in der Krebschemotherapie verwendet werden, dar, wobei sich Doxorubicin und Daunorubicin gegen feste Tumore als wirksam erwiesen. Eine Kopplung von Daunorubicin und Doxorubicin an Antikörper führt jedoch zu einem wesentlichen Verlust der Wirksamkeit der Pharmaka, wenn die Kopplung über die Aminogruppe erfolgt. In letzter Zeit hat man Daunorubicin an MoAbs über das Kohlenstoffatom 14 unter Venwendung von Bromdau-norubicin gekoppelt. Diese Konjugate zeigten sich in vitro als wirksam. Es wurde jedoch von keinen in vi-vo-Untersuchungen berichtet (Gallego et al, Int. J. Cancer, 1984 33 737-744). Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Daunorubicin-MoAb-Konjugate eine nicht-spezifische Toxizität bei Konzentrationen > 10 pg/ml besitzen.

Es wurde nun gefunden, dass Idarubicin (4-Demethoxy-daunorubïcin, Ida) an MoAbs gekoppelt werden kann, und dass die Konjugate eine selektive und potente in vitro- und in vivo-Anti-Tumoraktivität besitzen. In vivo war von den Ida-MoAb-Konjugaten bei Dosen von < 8,0 mg/kg eine unspezifische Toxizität nicht zu beobachten. Die Ida-MoAb-Konjugate weisen in vitro und in vivo eine grössere Wirksamkeit als Daunorubicin-MoAb-Konjugate auf.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung Immunglobulinkonjugate zur Verfügung, welche Ida, im C-14-Stellung konjugiert mit einem für ein menschliches Neoplasma spezifischen monoklonalen Antikörper oder mit einem Fragment davon, welches mindestens eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers aufweist, umfasst.

Ida wird in US-A 4 077 988 beschrieben. Vorzugsweise werden zwei bis acht Ida-Moleküle kovalent an jeden Antikörper oder jedes Antikörperfragmentmolekül gebunden, besonders bevorzugt zwei bis sechs. Die Ida-Moleküle werden in der 14-Stellung an den monoklonalen Antikörper oder das Antikörperfragment konjugiert. Vorzugsweise sind sie direkt gebunden, obwohl es auch möglich ist, einen inerten Träger oder Linker dazwischenzuschieben.

Typischerweise ist jeder Antikörper oder jedes Antikörperfragment spezifisch für ein Antigen auf der Zelloberfläche, welche als Ziel von Ida angepeilt werden soll. Der Antikörper oder das Antikörper-

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fragment ist spezifisch für menschliches Neoplasma. Beispiele menschlicher Neoplasmen, die mit Ida angepeilt werden sollen, sind Brustkrebs, Colonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Thy-muskrebs und andere Krebsarten, Sarkomata und Leukämien. Es kann ein Antikörper oder Antikörperfragment eingesetzt werden, das spezifisch für human-Transferrin-Rezeptor (TFR) ist, der auf sich teilenden Zellen, erythroiden Prekursorzellen und den Zellen einer Vielzahl von Tumoren vorliegt. Ein geeigneter anti-TFR-monokionaler Antikörper ist z.B. ein Antikörper auf Transferrin-Rezeptor auf LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2)-Zellen.

Vorzugsweise stellt der monoklonale Antikörper oder das Antikörperfragment die gleiche Spezies dar, gegen die das Immunglobulinkonjugat verabreicht wird. Ein Human- oder Maus-monoklonaler Antikörper oder ein entsprechendes Antikörperfragment werden deshalb typischerweise dann eingesetzt, wenn eine Verabreichung des Konjugats am Menschen beabsichtigt ist. Ausserdem gehört der Antikörper oder das Antikörperfragment vorzugsweise der IgG-Klasse an. Das Antikörperfragment kann das Fab, Fab' oder F(ab')2-Fragment darstellen. Eingesetzt werden kann auch das IgM-Monomer, das sich durch die abbauende Wirkung proteolytischer Enzyme aus IgM-Antikörper gewinnen lässt.

Die Immunglobulinkonjugate werden gemäss der Erfindung nach einem Verfahren hergestellt, welches die Umsetzung eines 14-HaIogen-Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon umfasst. Der Substituent in 14-Position kann Fluor, Chlor, Brom oder Jod darstellen, vorzugsweise Brom. 14-Brom-lda wird in US-A 4 125 607 beschrieben. Die Konjugation kann somit durch ein Verfahren erzielt werden, das folgende Schritte umfasst:

(a) Vermischen des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon mit einem molaren Über-schuss von 14-Haiogen-lda,

(b) Umsetzen des Gemisches bei 18 bis 37°C,

(c) Entfernen jeglichen Niederschlages,

(d) Entfernen von nicht-umgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration, und

(e) Entfernen (Gewinnen) des adsorbierten Arzneimittels (Ida) durch Adsorptionschromatographie oder lonenaustauschchromatographie.

Schritt (a) wird typischerweise in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie N,N-Dime-thylformamid, durchgeführt. Vorzugsweise beträgt der molare Überschuss von 14-Halo-lda in Schritt (a) das 0- bis 50-fache. In Schritt (b) wird die Reaktion vorzugsweise in einem Zeitraum von 1 bis 8 h durchgeführt. Typischerweise ist die Reaktionstemperatur die Raumtemperatur.

Es können jedoch auch andere Methoden der Konjugation angewendet werden. Wenn ein Konjugal gewünscht wird, das einen inerten Träger oder Linker, eingeschoben zwischen Ida und dem monoklonalen Antikörper oder dem Antikörperfragment, aufweist, so wird der Träger oder Linker typischerweise zunächst an das C-14-Kohlenstoffatom von Ida angebracht und wird dann an den Antikörper oder das Antikörperfragment gebunden.

Die Immunglobulinkonjugate gemäss der Erfindung können zur humanen Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Dazu wird eine therapeutisch wirksame Menge des Konjugats verabreicht. Der Krebs kann einen festen Tumor, einen Ascitestumor oder eine Leukämie darstellen. Die zu behandelnden Neoplasmen sind die vorstehend genannten. Es können zwei oder mehrere Konjugate, in denen der monoklonale Antikörper oder das Antikörperfragment jeweils eine unterschiedliche Spezifität aufweisen, verabreicht werden.

Das Konjugat kann durch Injektion verabreicht werden. Es kann parenteral, z.B. intravenös, gegeben werden. Es kann lokal oder direkt in den Tumor verabreicht werden. Die an einen Patienten zu verabreichende Konjugatmenge ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, wie z.B. dem zu behandelnden Tumor und dem Zustand des Patienten. Typischerweise wird eine Dosis von 10 bis 200 mg Konjugat pro m2 Körperoberfläche des Patienten verabreicht. Die Konjugate können mit anderen chemotherapeutischen Agenzien oder mit Agenzien verabreicht werden, die die Aktivität der Konjugate verstärkt, wie z.B. vasoaktive Agenzien oderTumor-Necrose-Faktor.

Die Immunglobulinkonjugate werden mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zu pharmazeutischen Mitteln formuliert. Dazu kann jeder geeignete Träger bzw. Verdünnungsmittel verwendet werden. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen physiologische Kochsalzlösung und Ringer'sche-Dextroselösung.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. In den beiliegenden Zeichnungen betreffen Fig. 1 bis 12 Beispiel 1, Fig. 13 betrifft Beispiel 2 und Rg. 14 betrifft Beispiel 3. Das Beispiel 1 enthält zur Information eine Beschreibung von Experimenten unter Verwendung von anti-Ly-2.1 MoAb mit Mäuse-Ly-2.1-Spezifität und dem Mäuse-Thymom ITT(1) 75 NS-Modellsystem. Insbesondere stellt

Fig. 1 die Struktur von Anthracyclinderivaten dar;

Fig. 2 stellt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an anti-Ly-2.1 (0,5 mg) dar: Mol Ida inkorporiert pro Mol anti-Ly-2.1 (■) (linke Ordinate) und Proteinanteil (•) (rechte Ordinate) sind als Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse) dargestellt;

Fig. 3 stellt den Antikörpertiter dar, bestimmt als % rosettenbildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikörperverdünnung (x 10-1) (Abszisse) von anti-Ly-2.1-Konjugaten auf !TT(1) 75 NS E3 target-Zeilen.

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Serienmässige Verdünnungen wurden mit einer 0,5 mg/ml-Lösung von entweder anti-Ly-2.1 (A) oder an-ti-Ly-2.1 mit 2 (• ) oder 8 (o) Mol Ida/Mol Antikörper durchgeführt.

Fig. 4 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida (■) oder lda-anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper, (•) auf E3-Zellen in einem 24-stündigen Assay, wobei die prozentuale Inhibierung der [3H] Thymidininkorpo-rierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 5 gibt die inhibierende Wirkung von Ida (■), lda-anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (•) oder Ida-anti-TFR, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (o) auf (Ly-2+) E3-Zellen in einem 30minütigen Inhibierungsas-say wieder, wobei die prozentuale Inhibierung der [3H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 6 zeigt die inhibierende Wirkung von lda-anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (o) und Konjugat plus anti-Ly-2.1 (•) auf E3-target-Zellen in einem 30minütigen Spezifitätsassay, wobei die prozentuale Inhibterung der [3H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 7 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBFt-Mäusen, subkutan injiziert mit 2 x 106 Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie dies durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (□), Ida (■), anti-Ly-2.1 (A), Ida-anti-TFR (o) oder lda-anti-Ly-2.1 (•). Mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die eingetragenen Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar;

Fig. 8 zeigt einzelne Tumorwachstumskurven von CBFi-Mäusen, subkutan injiziert mit 2,0 x 106 E3-Tumorzellen und intravenös an den Tagen 4 und 5 mit lda-anti-Ly-2.1-Konjugat behandelt. Die Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen;

Fig. 9 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBFi-Mäusen, subkutan injiziert mit 3,0 x 106 Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie dies durch einen Pfeil angegeben ist; PBS (□); anti-Ly-2.1 (A), Ida («) oder lda-anti-Ly-2.1-Konjugat (•). Die mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar; und

Fig. 10 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBFi-Mäusen, subkutan injiziert mit 3,0 x 1Ö6 Zellen. An Gruppen von 10 Mäusen wurde eine Intratumorbehandlung durchgeführt, wie dies durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (n); anti-Ly-2.1 (A), Ida (■) oder Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat (•). Die mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar;

Fig. 11 zeigt das Wachstum von COLO 205 Human-Tumor-Xenotransplantat in nackten Mäusen, subkutan injiziert mit 2 x 10® Zellen, Gruppen von 10 Mäusen erhielten die folgende intravenöse Behandlung, die durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (a), freies Ida (♦), Ida-250-30.6-Konjugat (•), Gemisch von Ida und 250-30.6 (0) und 250-30.6 (A). Die mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler der Tumorgrösse dar;

Fig. 12 gibt einzelne Tumorwachstumskurven von nackten Mäusen mit Fremdtransplantat wieder, wobei die Mäuse i.v. (Pfeil) mit Ida-250-30.6-Konjugat behandelt wurden. Die gestrichelte Linie gibt die mittlere Tumorgrösse in PBS-behandelten Mäusen wieder. Die Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen;

Fig. 13 zeigt das Wachstum von COLO 205 (30.6+, 17.1+) Xenotransplantat in nackten Mäusen, injiziert mit 8x106 Zellen/Maus. Gruppen von 10 Mäusen wurden intraperitoneal behandelt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (□); 17.1-Ida (o); 30.6-lda (A) oder einem Gemisch aus 30.6-ida und 17.1-Ida (•). Die mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen, Dre Fehlerkreuze geben den mittleren ± Standardfehler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 200 jig;

Fig. 14 zeigt das Wachstum von LIM 2210 Human-Colon-Tumor-Xenotransplantat in nackten Mäusen, die mit einem Tumorfragment (1-5 mg) implantiert waren. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (□); 17.1-lda (♦); JGT-13-lda (A); 27.1-Ida (•), 30,6-Ida (o). Mittlere Tumorgrösse (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze geben den ± mittleren Standardfehler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 80 (ig.

Beispiel 1

Materialien und Methoden Tumorzellen

Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfassen (Ly-2+) Mäuse-Thymom ITT(1) 75NS E3 Variante (E3) (Smyth et al, J. National Cancer Inst. 1986,76,503-510), (Ly-2-, TFR-) Lyphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968,160,533-535), TFR+) Human-Zellinie CEM (Foley et al, Cancer 1965,18,522-529) und die (250-30.6+) Human-Zellinie COLO 205 (Semple et al, Cancer Res. 1978, 38,1344-1355).

Die Zellen wurden in vitro in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DME) oder RPMl 1640-Medium

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(Flow Laboratories, Sydney, Australien), ergänzt mit 10% hitze-inaktiviertem Serum von neugeborenen Kälbern (Flow), 2 mM Glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australien); 100 ng/ml Streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australien) und 100 I.E./mI Penicillin (Commonwealth Serum Laboratories), gehalten. Der E3-Tumor wurde in vivo mittels Serienpassage in (C57BL/6 x BALB/c)Fi-Mäusen (CBFi-Mäuse) gehalten. Zellen aus Ascites-Flüssigkeit wurden zweimal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen und zentrifugiert (400 g x 5 min), in PBS resuspendiert und subkutan (s.c.) in die Abdomenwand von Mäusen injiziert; diese entwickelten sich vor der Behandlung zu fühlbaren Tumoren. Die Mäuse wurden einer Reihe von intravenösen (i.v.) oder intratumor (i.t)-Behandlungen unterworfen; die Grösse der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumore gemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgrösse (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler) registriert.

Mäuse

CBA und (C57BL/6 x BALB/c) Mäuse (CBFi-Mäuse) und nackte (nu/nu) Mäuse wurden vom Department of Pathology, Universität von Melbourne, zur Verfügung gestellt. Experimentelle Gruppen von 8 bis 10 Mäusen, alle vom selben Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment verwendet.

Monoklonale Antikörper

Verwendete MoAbs: (i) anti-Ly-2.1 (IgGi), reaktiv auf Mäuse-Ly-2.1-Spezifizität (Hogarth et al, Im-munology 1982, 46, 135-144) und (ii) A3C6 (anti-TFR) (lgG1), reaktiv auf human-Transferrinrezeptor (TFR) (Panaccio et al, Immunology and Cell Biology 1987, 65,461-472); und (iii) ein Antikörper, bezeichnet als 250-30.6, reaktiv auf ein Antigen, welches auf human-CoIon-Karzinomzellen vorkommt.

Die MoAbs wurden aus Ascites-Flüssigkeit durch Präzipitation mit 40%igem Ammoniumsulfat isoliert, aufgelöst in PBS und dialysiert gegen den gleichen Puffer. Diese rohen Präparationen wurden entweder an Protein-A-Sepharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) absorbiert, eingehend mit PBS (pH 7,3) gewaschen und mit 0,2 M Glycin/HCl (pH 2.8) eluiert, oder über eine Affigel-Blau-Säule (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney) gegeben. Nach Neutralisierung wurden die MoAbs gegen PBS dialysiert, in Teile aufgeteilt und bei -70°C gelagert. A3C6 wurde durch Immunisierung von CBA-Mäusen, intraperitoneal in wöchentlichen Intervallen über drei Wochen mit 2 x 106 LiCR-LON-HMy-2(HMy-2) Zellen (OKT9+ve), Entfernen der Milz drei Tage nach der letzten Injektion und Verschmelzen mit P3-NSI-AG4-1 (NS-l)-Zellen erhalten.

Herstellung und Quantifizierung von Koniuoaten

Intakte anti-Ly-2.1, anti-TFR-MoAb oder 250-30.6 (1-2 mg/ml in Boratpuffer, pH 8,0) wurden mit einem molaren Überschuss (1-50) 14-Brom-4-demethoxydaunorubicîn (Br-Ida) in (N,N)-DimethyIformamid (DMF) zu 10 mg/ml aufgelöst. Die Reaktion wurde 4 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, dann wurde zentrifugiert (400 g x 5 min), um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Freies Br-Ida und andere nicht-umgesetzte Ausgangsmaterialien wurden durch Gelfiltrierungschromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-25-SäuIe (PD-10; Pharmacia) entfernt; die Konjugate wurden dann über eine Säuie von Porapak Q (Millipore) zur Entfernung von jeglichem adsorbiertem Arzneimittel gegeben (Niederwieser et al, J. Chromatog. 1971,54, 215-223). Die Menge an Ida, die in den Arzneimittel-MoAb-Konjugaten inkorporiert war, wurde durch Extinktionsspektrophotometrie bei 483 mm (E498 = 3,4 x 103M_1 cm~i) und durch Proteinbestimmung (Bradford, Anal. Biöchem. 1976,72,248-253), bestimmt.

Antikörperaktivität

Ein Rosettenbildungs-Assay unter Verwendung von Schaf-anti-Maus-lmmunglobulin (SAMG) diente zur Bestimmung der Antikörperaktivität von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem MoAb, das den gleichen Verfahren, wie sie bei der Kopplungsmethode angewendet werden, unterzogen worden war (Parish and McKenzie, J. Immunol. Methods 1978,20,173-183).

Arzneimittelaktivität

(a) 24-stündiges Inhibierungsassay: 100 jxl Zellen (2-5 x 106/mi) wurden in eine Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben und 1 h bei 37°C inkubiert. Freies Idarubicin (Ida) (aufgelöst in PBS) und Ida-MoAb-Konjugate wuden aseptisch filtriert und Verdünnungen wurden in sterilem PBS hergestellt; 50 ftl freies Ida oder Konjugat wurden zu den Zellen gegeben, wobei für jede Probe zwei Ansätze verwendet wurden; Kontrollansätze erhielten 50 |il PBS; die Zellen wurden bei 37°C, 7% CO2,24 h lang kultiviert.

(b) 30-minütiges Inhibierungsassay: 200 nl Zellen (2—5 x 106/ml) wurden in sterilen Eppendorf-Röhrchen gesammelt, in sterilem Arzneimittel oder Konjugat resuspendiert und 30 min bei 37ÇC vermischt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert (400 g x 5 min), in Wachstumsmedium resuspendiert; 100 (xl aliquote Teile wurden in eine Mikrotiterplatte unter Verwendung von doppelten Ansätzen für jede Probe gegeben

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und dann 16 bis 24 h inkubiert. Nach der Inkubationspenode wurden zu beiden Assays 50 nl Wachstumsmedium, welches 1 p.Ci [3H]-Thymidin enthielt (spezifische Aktivität = 5 Ci/mMol; Amersham) zugegeben und die Platten 2 bis 4 h inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und getrocknet; einzelne Proben wurden getrennt und auf einem beta-Szintillationszähler gezählt. Die Inkorporierung von PHj-Thymidin wurde als Prozentsatz der Inhibierung der Inkorporierung von Kontrollproben ausgedrückt. Der Standardfehler für jeden Punkt wurde durch Doppelbestimmungen ermittelt und überstieg für jeden gegebenen experimentellen Punkt nicht 5%.

Toxizität

Gruppen von 10 bis 20 CBA-Mäusen wurde eine einzige i.v.-Injektion verschiedener Dosen Ida oder lda-anti-Ly-2.1 verabreicht und das Überleben der Mäuse gegen die Dosis des verabreichten Arzneimittels in mg/kg aufgetragen. Die Organe dieser Mäuse wurden entfernt und vor Formalinfixierung ausgewogen und mit Hämatoxilin und Eosin angefärbt.

Ergebnisse

Br-Ida (Fig. 1) wurde kovalent an verschiedene MoAbs gekoppelt: MoAbs auf human-TFR, auf ein Antigen, welches auf human-Colonkrebszellen vorkommt (Antikörper 250-30.6) und auf das Mäuse-Ly-2-Alloantigen, Die Reaktionsbedingungen für die Konjugation variierten im Hinblick auf den molaren Überschuss an Br-Ida, der zu den MoAbs zugegeben wurde, wobei ein Kompromiss zwischen höherer Ida-Inkorporierung und geringerer Proteinmenge (Proteinanteil) getroffen wurde. lda-anti-Ly-2.1 (Fig. 2), Ida-anti-TFR und ida-250-30.6 (Daten nicht gezeigt) haben 3 bis 5 Moleküle Ida bei Proteinanteilen von über 50% inkorporiert. Die Umsetzung von Br-Ida mit MoAbs könnte zu zwei Bindungstypen führen (Fig. IC und D). Um zu bestimmen, welcher Bindungstyp vorlag, wurden die Konjugate 48 h lang einem pH von 4,5 oder 9,0 ausgesetzt; das freigesetzte Arzneimittel wurde an Porapak Q absorbiert und die Proben wurden erneut durch Spektrophotometrie quantifiziert. 50% des gebundenen Arzneimittels wurde bei Einwirkung der Base (pH 9,0) freigesetzt, während sich bei pH 4,5 kein Verlust zeigte. Dies ist ein Hinweis dafür, dass mindestens 50% des Arzneimittels eine Esterbindung aufweist (Fig. 1D), da die Esterbindung gegenüber basischen Bedingungen empfindlich ist, während die Aminbindung stabil ist,

AntikÖroeraktivität

Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden nach der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden bestimmt als die Verdünnung, bei der 50% der Zielzellen Rosetten zeigten. lda-anti-Ly-2.1-Konjugate, die 2 und 8 Moleküle Ida enthielten, wiesen Antikörpertiter gegen E3-Zellen von jeweils 1:56 000 und 1:33 000 auf, während der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1:80 000 betrug (Fig. 3). Ida-250-30.6-Konjugate, die 2 und 6 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter gegen CÖLO 205-Zellen von jeweils 1:16 000 und 1:11 000, während der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1:33 000 betrug, Somit ergibt sich aufgrund des Konjugationsverfahrens ein Verlust der Antikörperaktivität; Konjugale mit weniger als 6 Molekülen Ida pro MoAb wurden für in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass die Löslichkeit und Antikörperaktivität von lda-anti-Ly-2.1 -Konjugalen über diese Niveaus der Ida-Inkorporierung hinaus deutlich abnahm (Daten nicht wiedergegeben). Die maximale Anzahl an Ida-Molekülen, die eingebaut werden kann, variiert in Abhängigkeit von dem jeweiligen Antikörper.

in vitro Aktivität von Idarubicin und Idarubicin-MoAb-Koniuaaten

Die in vitro Cytotoxizität von Ida und zwei Ida-MoAb-Konjugaten auf Mäuse-iTT(1) 75 NS E3-Zellinie (Ly-2+TFR-) und die menschliche CEM-Zeilinie (Ly-2~TFR+) wurde in einem 24stündigen Inhibierungsassay gemessen und die Werte für I.D.50 (50%ige Inhibierung der pHj-Thymidin-Inkorporierung der Kon-trollproben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 und Tabelle 1 wiedergegeben. I.D.50 für Ida lag im Bereich von 1,0 bis 2,5 x 10-7 M für beide der untersuchten Zellinien (Fig. 4, Tabelle 1). I.D.50 für lda-anti-Ly-2.1 auf Ê3 war viermal grösser (Fig. 4); für Ida-anti-TFR auf CEM waren die I.D.sa-Werte 1-2 mal grösser als die für freies Ida (Tabelle 1). Somit ist freies Ida toxischer sowohl auf E3 als auch auf CEM äs jeweils Ida anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR. Diese Ida-MoAb-Konjugate zeigen jedoch eine zehnfach niedrigere Cytotoxizität als nicht-reaktive Zellinien (Tabelle 1) und geben damit an, dass ihre cytotoxi-sche Wirkung spezifisch war und sich aus der Beibehaltung der Antikörperaktivität ergab (Fig. 3),

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Tabelle 1

Wirkung von Idarübidn-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf Tumorzellen1

Tumor-Zellinie

Mittlere l.D.so-Werte bestimmt für

Ida lda-anti-Ly-2.1

Ida-anti-TFR

E3

1,2x10~7

4,3x10~7

2,3x10"®

(5f

(3)

(2)

CEM

2,2 x 10-7

2,0x10"®

3,0x10~7

(5)

. (2)

(3)

1 = I.D.50=50%ige Inhibierung der ^Hj-Thymidin-Inkorporierung von Kontrollproben. 2=Anzahl der untersuchten Präparaöorien.

Die Ida-250-30.6-Konjugate waren etwas weniger aktiv als freies Ida. Freies Ida zeigte einen I.D.50-Wert von 6 x 10-8 M, während das Konjugat ein I.D.50 von 3,5 x 10-7 M auf die target-Zellinie COLO 205 ergab.

Zur Bestimmung, ob die Konjugate eine Selektivität in ihrer cytotoxischen Wirkung auf target-Zellen ausüben, wurden lda-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR 30 min lang mit E3 (Ly-2+)-ZelIen inkubiert und dann das nicht-gebundene Konjugat weggewaschen und die Cytotoxizität bestimmt. Das lda-anti-Ly-2.1-Konju-gat hatte ein I.D.50 von 6,2 x 10-7 m im Vergleich zu einem I.D.50 von 5,2 x 10-7 m für freies Ida (Fig. 5). Im Gegensatz dazu zeigte das nichtreaktive Ida-anti-TFR-Konjugat ein I.D.50 von 5,0 x 10-6 M, i.e. zehnmal grösser als das für freies Ida, wobei gezeigt wird, dass die Antikörper-bindende Aktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat in einer selektiven Cytotoxizität resultiert. In gleicher Weise wurden lda-250-30.6-Konjugat und freies Arzneimittel 30 min mit COLO 205 (250-30 +ve) und E3 (250-30.6 -ve)-ZelIini-en inkubiert und dann gewaschen, sowie anschliessend ein Cytotoxizifätsassay durchgeführt. Beide Zellinien zeigten eine ähnliche Dosisresponse auf freies Arzneimittel, i.e. 9,2 x 10-7 M für COLO 205 und 9,8 x 10-7 M für E3. Das Ida-250-30.6-Konjugat war viermal toxischer auf COLO 205 als die Antikörper-nicht-reaktive E3-Zellinie. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung der CEM-Zeilinie und Ida-anti-Ly-2.1 als eine nicht-reaktive Kontrolle erhalten (Daten nicht gezeigt). Um im weiteren sicherzustellen, dass die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten auf target-Zellen spezifisch war und an der Antikörper-Bindungsstelle erfolgte, haben wir Untersuchungen zur Inhibierung der Konjugat-Cytotoxizität unter Verwendung von freiem MoAb durchgeführt. Bei einer Ida-Konzentration von 4,0 x 10-6 M (2 (ig anti-Ly-2.1) war die Cytotoxizität von anti-Ly-2.1-Konjugal auf E3-Zellen durch Zugabe von 50 (ig (250 ng/ml) anti-Ly-2.1 um 70% reduziert (Fig. 6), was darauf hinweist, dass die Cytotoxizität des lda-an-ti-Ly-2.1-Konjugats in direktem Zusammenhang zu dessen Antikörper-Bindungsfähigkeit steht. Ähnliche Kontrollergebnisse wurden mit 250-30.6 erhalten. Es ist darauf hinzuweisen, dass in sämtlichen Assays freies anti-Ly-2.1, anti-TFR und 250-30.6 nicht-cytotoxisch waren (Daten nicht gezeigt).

in vivo Behandlung von Mäusethvmom ITTdi 75 NS E3

Zur Ermittlung der Wachstumsinhibierung von festen Tumoren wurden Gruppen von CBFi-Mäusen (10 pro Gruppe), die mit 2,0 x 106 E3-Zellen im Abdominalbereich inokuliert waren, mit einer der folgenden i.v.-Injektionen behandelt: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; oder (v) Ida-anti-Ly-2.1. Die Mäuse erhielten jeweils 20 (ig Ida und/oder 1.200 (ig anti-Ly-2.1 an den Tagen 4 und 5 (Tumorgrösse = 0,1 cm2) nach der Tumorinokulation.

Innerhalb 24 h der ersten Behandlung wiesen die mit lda-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse eine mittlere Tumorgrösse von 20% derjenigen Mäuse auf, die mit PBS behandelt wurden (i.e. eine 80%ige Abnahme der Tumormasse (Fig 7)); es war offensichtlich, dass anti-Ly-2.1 allein und Ida, welches kovalent an nicht-spezifischen anti-TFR-MoAb gebunden war, nicht das E3-Tumorwachstum beeinflusste. Die Tumoren von Mäusen, die nur Ida erhielten, waren bis zu 50% reduziert; drei von diesen Mäusen starben jedoch und die anderen zeigten eine 25%ige Verringerung des Körpergewichts. Die einzelnen Tumorwachstumskurven von Mäusen, die Ida-anti-Ly-2.1 erhielten, zeigten eine Regression bei 9 aus 10 Tumoren im Laufe der Behandlung (Fig. 8); in der Tat gingen 5 von 10 Tumoren vollständig zurück und traten auch nicht wieder auf (> 200 Tage); die Tumoren, die nach Abschluss der Behandlung weiterwuchsen (5 von 10), wuchsen mit langsameren Geschwindigkeiten als die Tumoren der mit PBS und Ida-anti-TFR behandelten Mäuse. Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, um die i.v. Behandlung von grösseren Tumoren mit Hilfe von lda-antl-Ly-2.1 zu beurteilen. Gruppen von CBFi-Mäusen (10 pro Gruppe) wurden mit 3,0 x 1Q6 E3-Zellen inokuliert; die Mäuse erhielten dann jeweils 15 (ig und 900 (ig Ida und anti-Ly-2.1 an den Tagen 6 (Tumorgrösse = 0,2 cm2) und 7 nach Tumorinokulation (Fig. 9). Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse hatten eine mittlere Tumorgrösse von 50% derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse und 66% derjenigen mit Ida behandelten Mäuse am Tag 7; dieser Trend setzte sich bis zum Abschluss der Studie fort (Tag 18). Die einzelnen Tumorwachstumskurven der 10 CBFi-Mäuse, die lda-an-

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ti-Ly-2.1 erhielten, zeigten, dass vier Regressionen und eine vollständige Entfernung der Tumormasse (> 200 Tage; Daten nicht gezeigt) vorlag. Somit war Ida-anti-Ly-2.1 wirksam gegen grosse Tumoren; in beiden Experimenten war die anti-Tumoraktivität von Ida merklich verbessert, wenn dieses an anti-Ly-2.1-MoAb gekoppelt war.

in vivo Behandlung von menschlichem Colontumor COLO 205

Die Wirkung von lda-anti-250-30.6-Konjugat wurde in nackten (nu/nu) Mäusen mit Xenotransplanta-ten, untersucht.

Die subkutane Injektion von 2 x 106 Zellen in die Abdominalwand ergab innerhalb von 4 Tagen einen fühlbaren Klumpen (ca. 0,1 cm2). Gruppen von 10 Mäusen wurden dann mit einer der folgenden i.v.-lnjek-tìonen behandelt: (i) PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30.6 (nicht-konjugiert); (iv) Ida; (v) Ida-250-30.6-Konjugat Insgesamt wurden 275 jxg Ida in einer Reihe von 5 intravenösen Injektionen an den Tagen 4,5,6,10 und 12 nach Tumorinokulation gegeben.

In den Gruppen von Mäusen, die mit PBS oder mit nichtkonjugierten 250-30.6 behandelt worden waren, zeigte sich kein therapeutischer Effekt. Mit Ida allein überlebten 2 von 10 Mäusen, während sämtliche Mäuse der Gruppe, die nicht-konjugiertes Ida plus 250-30.6 erhielten, am siebten Tage tot waren, wobei sie vorher Toxiziiätssymptome zeigten, wie z.B. Gewichtsverlust. Die Mäuse, die lda-250-30.6-Konjugat erhielten, zeigten eine dramatische Reaktion der Tumorgrösse. Diese Ergebnisse sind in Fig. 11 wiedergegeben. Tumorwachstumskurven für die einzelnen Mäuse (Fig. 12) zeigten, dass 5 von 7 Mäusen Tumoren aufwiesen, die am siebten Tag zurückgegangen waren; diese Tumoren wuchsen weiter fort, wobei 2 von 10 Mäusen ohne Tumoren verblieben. Diese Mäuse zeigten keine Toxizitätseffekte.

Intratumor-Behandluno

Die Intratumor-Therapie hat sich als eine nützliche Methode der Immuntherapie von tierischen und menschlichen Tumoren erwiesen. Im folgenden wurden Untersuchungen durchgeführt, um die anti-Tu-moraktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugaten, wenn diese direkt in den festen E3-Tumor verabreicht wurden, zu charakterisieren. Gruppen von 10 CBFi-Mäusen, denen s.c. 3,0 x 106 E3-Zellen implantiert worden waren, entwickelten 5 Tage nach der Tumorinokulation Tumoren (0,1 bis 0,2 cm2). Die Behandlungen bestanden aus 2 Injektionen an den Tagen 5 und 6 nach der Tumorimplantation, wobei die Mäuse eine der folgenden Behandlungen erhielten: (1) PBS; (2) Ida; (3) anti-Ly-2.1; oder (4) Ida-anti-Ly-2.1 (Gesamt-Ida s 30 jig). Ida-anti-Ly-2.1 zeigte die grösste anti-Tumoraktivität; freies Ida und anti-Ly-2.1 allein beein-flussten das Tumorwachstum nicht, wenn sie direkt in den Tumor verabreicht wurden. Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse wiesen eine mittlere Tumorgrösse von 60% derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 8 auf, und 30% derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 13 (Fig. 10). Die einzelnen Tumorwachstumskurven (Daten nicht gezeigt) von lda-anti-Ly-2.1-behandelten Mäusen ergaben eine vollständige Regression, während sich bei den restlichen Mäusen eine verzögerte Reduktion des Tu-morwachstums 3 Tage nach Abschluss der Behandlung zeigte.

Toxizität

In den Experimenten zur akuten Toxizität wurde Gruppen von 10 CBA (Ly2.1+)-Mäusen eine einzige Injektion verschiedener Dosen von entweder Ida, Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-TFR verabreicht Alle Mäuse, die mit Ida injiziert wurden, zeigten anfangs einen Gewichtsverlust von bis zu 25% des ursprünglichen Gewichtes; bei den mit Ida-MoAb-Konjugat behandelten Mäusen wurde kein Gewichtsverlust beobachtet. Tabelle 2 gibt die Toxizität von Ida und Ida-MoAb-Konjugaten als LD50- und LDio-Wer-te wieder. Wie gezeigt, beträgt LD10 von Ida-anti-Ly-2.1 10,0 mg/kg, bezogen auf Ida, im Vergleich zu nur 0,75 mg/kg für freies Ida. Ausserdem zeigte das Ida-anti-TFR-Konjugat ein LD10 von 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-Konjugate wurden nicht im Hinblick auf die LDso-Dosis getestet. Diese Ergebnisse zeigen den grösseren therapeutischen Index von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem Ida.

Tabelle 2

Wirkung von Idarubicin-monoklonale Antikörper-Konjugate auf CBA Mäuse

Ida (mg/kg) LD.10

LD.50

Ida

0,75

3,00

Ida-ant-Ly-2.1

10,00

n.b.

Ida-anti-TFR

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Histopatholoaische Ergebnisse

Akute Wirkung: Die intravenöse Verabreichung von freiem Ida (1,0 mg/kg) führte zu einer Atrophie der weissen Pulpa der Milz 15 Tage nach Behandlung und einer gewissen Hypertrophie der Herzmuskelfasern (Daten nicht angegeben). Im Gegensatz dazu ergab eine einzelne Dosis von Ida-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) keine nicht-spezifische Gewebetoxizität nach 15 und 30 Tagen, obwohl eine geringe Schwellung der Hepatocyten am Tag 15 beobachtet wurde.

Beispiel 2

Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem Antikörper 17.1 (Thompson et al, Proc. Nati. Cancer Inst. 1983, 70, 409-419; Maus-lgG2A) und aus Ida und monoklonalem Antikörper 30.6 (Thompson et al, Br. J. Cancer 1983, 47, 595-605; Maus-lgG2B). Menschliche Colonkarzinom Colo 205-Zellen (30.6+, 17.1+) wurden s.c. in nackte Mäuse mit 8 x 106 Zellen/Maus inokuliert. Die inokulierten Mäuse wurden dann einer Reihe von i.p.-Be-handlungen unterzogen. Die Grösse der Tumoren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgrösse registriert (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 13 wiedergegeben.

Beispiel 3

Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem Antikörper 17.1, aus Ida und monoklonalem Antikörper JGT-13 (Maus-!gGi, reaktiv mit carcinoembryonalem Antigen auf Coloncarcinom, nicht aber mit normalen Geweben), aus Ida und monoklonalem Antikörper 27.1 (Maus-lgGi, reaktiv mit dem Antigen der Fettkügelchen von Humanmilch auf eine Anzahl von Colontumoren) und aus Ida und monoklonalem Antikörper 30.6. Ein LIM2210 menschliches Colontumor-Xenotransplantat (1-4 mg) wurde in nackte Mäuse subcutan implantiert. Die implantierten Mäuse wurden dann einer Reihe von i.v.-Behandlungen unterzogen. Die Grösse der Tumoren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgrösse registriert (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 14 wiedergegeben.

Claims

Patentansprüche

1. Immunglobulinkonjugat, gekennzeichnet durch Idarubicin, das in C-14-Stellung konjugiert ist mit einem monoklonalen Antikörper, der für menschliches Neoplasma spezifisch ist, oder einem Fragment davon, das mindestens eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers umfasst.

2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 2 bis 8 Idarubicin-Moleküle kovalent an jedes Antikörpermolekül gebunden sind.

3. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper oder das Fragment spezifisch für human-Transferrin-Rezeptor ist.

4. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für ein Neoplasma der Brust, des Colons, der Lunge, der Prostata oder der Eierstöcke ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulinkonjugates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein 14-Halogen-ldarubicin mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon umgesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das 14-Halogen-ldarubicin 14-Brom-Idarubicin ist.

7. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel und, als Wirkstoff, ein Immunglobulinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

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