DE2532589A1

DE2532589A1 - Polypeptid und verfahren zur herstellung desselben und mittel mit einem gehalt desselben

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Publication number: DE2532589A1
Application number: DE19752532589
Authority: DE
Inventors: Etsuko Furuichi; Chikako Hayashi; Tadashi Karasaki
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1974-07-22
Filing date: 1975-07-21
Publication date: 1976-05-26
Also published as: GB1475624A; FR2279416A1; FR2279416B1; US4016260A; NL7508663A; CH606429A5

Description

A981-o4
1A-848

Toyama Chemical Co., Ltd., Tokyo / Japan

Polypeptid und Verfahren zur Herstellung desselben und Mittel mit einem Gehalt desselben

Die Erfindung betrifft ein neues Polypeptid der Bezeichnung Gamba A, welches von einem Mikroorganismus gebildet wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben sowie ein Mittel mit einem Gehalt an demselben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit einer Antitumorwirkung. Dieses wird durch einen Mikroorganismus gebildet, welcher als Stamm vom Pseudomonas cruciviae identifiziert wurde. Bei dem Verfahren zur Herstellung des Polypeptide wird der Mikroorganismus kultiviert und das Polypeptid wird aus der Brühe isoliert.

Die Suche nach Mitteln zur Heilung von Krebserkrankungen spielt derzeit eine wichtige Rolle in der medizinischen Forschung, und es wurden bereits eine Vielzahl von heilend wirkenden Medikamenten untersucht und entwickelt, welche derzeit klnisch verwendet werden. Bei diesen sog. Antiturnorsubstanzen handelt es sich um synthetische Verbindungen, um Antibiotika und um Extrakte verschiedener natürlicher Materialien, welche eine Antitumoraktivität aufweisen. Keine dieser bekannten Substanzen zeigt Jedcch eine ähnlich herausragende Heilwirkung, wie man sie von den Antibiotika gegenüber Infektionserkrankenkungen kennt. Einigt.· die-

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ser bekannten Substanzen zeigen eine sehr geringe Wirksamkeit, während andere eine hohe Toxizität aufweisen. Befriedigende Wirkungen wurden daher bis heute noch nicht festgestellt. Es besteht daher ein erhebli ches Bedürfnis nach einem Medikament, welches gegenüber Tumorerkrankungen eine ausgezeichnete Heilwirkung hat.

Zur Auffindung eines Tumorheilmittels, welches die genannten Bedürfnisse befriedigt, haben die Erfinder verschiedenste Untersuchungen angestellt. Es wurde gefunden, dass ein zur Spezies Pseudomonas cruciviae gehörender Stamm, welcher aus dem Erdboden isoliert wurde, ein Polypeptid erzeugt, das einerseits eine geringe Toxizität aufweist und andererseits eine herausragende Antitumorwirksamkeit aufweist. Dieses Polypeptid wurde als "Gamba A" bezeichnet.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Polypeptid mit Antitumoraktivitäten zu schaffen, welches eine geringe Toxizität aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein Medikament mit einem Gehalt desselben.

Im folgenden soll die Erfindung in Verbindung mit einer Zeichnung näher erläutert werden, welche das Infrarotabsorptionsspektrum des erfindungsgemässen Polypeptids zeigt.

Erfindungsgemäss wird das neue Polypeptid durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus in Gegenwart von Nährstoffquellen erzeugt. Der Mikroorganismus wurde als Variante von Pseudomonas cruciviae identifiziert. Danach wird das gebildete Polypeptid aus der Brühe isoliert.

Bei der Variante Pseudomonas cruciviae, welche erfindungsgemäss eingesetzt wird, handelt es sich um einen Stamm von Pseudomonas sp. Nr. 22o5 (FERM*2132, ATCC 31155). Dieser Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche der Toyama Präfektur, Japan, entstammt. Dabei wurde eine normale Plattenkultur angewandt, wobei ein Glukose-Bouillon-Neutralagarmedium verwendet wurde. Dieser Mikroorganismus hat die nachfolgenden bakteriolo-

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gischen Eigenschaften.

(1) Morphologische Eigenschaften:

(1) Stäbchen mit der Abmessung 1x3 bis 4 Mikron.

(ii) Einzelnes oder paarweises Auftreten, in einigen Fällen

in Ketten.

(iii) Motil mit polaren Flagellen.

(iv) Keine Bildung von Sporen,

(v) Extinktionstemperatur: 9o C; 5 min.

(vi) Gram-negativ.

(vii) Nicht säureecht.

(2) Wuchsform auf verschiedenen Medien:

(i) Brühe-Agar-Plattenkultur: Die Kolonien sind zirkular-konvex,

glatt, durchscheinend, blass-rötlich/braun, (ii) Brühe-Agar-Schrägkultur: Glatt, blass-rötlich/braun, unduliert.

(iii) Brühe-Flüssigkultur: Trüb, Bildung einer Haut mit Sediment. (iv) Brühe-Gelatine-Stichkultur: Spärliches Wachstum in einer

Schicht, keine Gelatineverflüssigung, (v) Lackmusmilch: Leicht alkalisch nach 1o Tagen Kultivierung.

Weitere Änderungen werden nicht beobachtet.

(3) Physiologische Eigenschaften: (i) Nitrate werden nicht reduziert, (ii) Denitrifizierungsreaktion: Negativ, (iii) Methyl-Rottest: Negativ.

(iv) Voges-Proskauer-Test: Negativ.

(v) Indol wird nicht gebildet.

(vi) Schwefelwasserstoff wird gebildet.

(vii) Stärke wird nicht hydrolysiert, (viii) Zitronensäure wird verwertet.

(ix) Anorganische Stickstoffquellen werden spärlich verwertet, (x) Keine Pigmentbildung, (xi) Urease (+).
(xii) Oxidase (-).
(xiii)Catalase (+).

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(xiv) Wachstumsbereiche: Temperatur 2o bis 37°C; pH 6,0 bis 8,6; optimale Temperatur 34°C; optimaler pH 6,8 bis 7,o.

(xv) Aerob.

(xvi) Hugh-Leifson-Test (0 - F-Test): Negativ. ' (xvii) Weder Säure noch Gas werden von den nachstehenden Sacchariden gebildet: L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glyzerin und Stärke.

Im Hinblick auf die genannten Eigenschaften wurde diese Spezies daher im Hinblick auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7.Auflage, geprüft. Dabei wurde eine wesentliche Übereinstimmung zwischen diesem Stamm und Pseudomonas cruciviae (S. 114) festgestellt. Daher haben die Erfinder den vorliegenden Stamm mit dem Standardstamm Pseudomonas cruciviae IFO 12o47 verglichen, welcher am Institute for Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegt ist. Jeder der beiden Stämme wurde dabei einer Schüttelkultur bei 3o°C während 2o Stunden unterworfen, Dabei wurde ein Medium eingesetzt, welches durch Zugabe von jeweils o der in Tabelle 1 angegebenen organischen Verbindungen zu einer o,25%igen wässrigen Peptonlösung hergestellt wurde. Danach wurde der pH der erhaltenen Mischung auf 7,ο eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

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Tabelle 1: Wachstumsgrad in verschiedenen Medien

	Vorliegender	Stamm	Ps. cruciviae	pH
Zusatz			IFO 12o47	7,8
"atriumacetat	Wachstums- grad*	pH	Wachsturns- grad*	8,ο
natriumzitrat	o,8oo	7,8	o,472	7,4
Glucose	o,3oo	7,6	1 ,o4o	7,o
Glyzerin	o,o81	7,2	o,249	7,2
Alginsäure	o,12o	7,o	o, 638	7,4
Methylamin	o,195	7,4	o, 428	7,6
Athanolamin	o,215	7,6	o, 235	7,4
Äthanol	o,21o	7,6	0,282	7,4
Kontrolle (keine Zugabe)	o,o7o	7,2	0,241
o,o62	7,4	0,356

* Die Trübung der Brühe wurde mittels eines photoelektrischen Colorimeters gemessen, wobei ein 6io mu-Filter und eine 1 cm-Zelle verwendet wurden. Es wurde die Absorption festgestellt.

Aus Tabelle 1 ergibt sich klar, dass der vorliegende neue Stamm im Kontrollmedium einen extrem geringen Wachstumsgrad zeigt. Bei dem Kontrollmedium handelt es sich um ein Grundmedium, dem keine organische Verbindung einverleibt wurde. Andererseits zeigt dieser Stamm eine erhebliche Zunahme des Wachstumsgrades, wenn man dem Medium Natriumacetat, Natriumzitrat, Alginsäure, Methylamin und Athanolamin einverleibt. Dieser Mikroorganismenstamm kann daher die genanten organischen Verbindungen verwerten. Demgegenüber zeigt Ps. Cruciviae IFO 12o47 selbst in dem Kontrollmedium ein beträchtliches Wachstum und eine Zunahme des Wachstumsgrades wird nur in den Fällen der Zugabe von Natriumzitrat und Glyzerin beobachtet, was anzeigt, dass der bekannte Stamm unter den genannten organischen Verbindungen nur diese beiden verwerten kann. Somit besteht ein klarer Unterschied hinsichtlich der Verwertung von organischen Verbindungen zwischen dem vorliegenden Stamm und Pseudomonas cruciviae.

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Aufgrund dieser Befunde haben die Erfinder dem neuen Stamm die Bezeichnung Pseudomonas sp. Nr. 22o5 gegeben. Dieser Stamm wird als Variante von Pseudomonas cruciviae angesehen. Er wurde am 28. August 1973 am Fermentation Research Institute,;Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, und am 27. Mai 1975 im American Type Culture collection, 123o1 Parklawn Drive Rockville Maryland^o852, USA, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERlWI 32 bzw. ATCC 31155. Dieser Mirkoorganismus wird ab Offenlegung freigegeben.

Im folgenden wird .die Erfindung anhand der verschiedenen iStuf en der Kultivierung von Pseudomonas sp. Nr. 22o5 (FERM 2132?T ATCC 31155) und der Aufarbeitung erläutert. Die Aufarbeitungsstufe kann in zwei Stufen unterteilt werden, nämlich in eine Stufe der Extraktion von Gamba A aus der Brühe und die Stufe der Reinigung des Extrakts.

(1) Kultivierungsstufe

Bei dem Medium handelt es sich vorzugsweise um ein Bouillon-Medium, welches Fleischextrakt und Pepton enthält. Man kann jedoch auch jedes andere natürliche Medium verwenden, welches im allgemeinen zur Mikroorganismenkultivierung herangezeogen wird, zB ein Sojabohneninfusionsmedium, ein Fleischinfusionsmedium oder ein Organinfusionsmedium, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Malzextrakt, Kartoffelinfusionsmedium, Caseinhydrolysat oder Mischungen derselben. Es ist ferner bevorzugt, ein Wuchsförderungsmittel hinzuzugeben wie Essigsäure oder Zitronensäure, Äthylamin, Äthanolamin oder Alginsäure oder dergleichen. Der anfängliche pH des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 6,o bis 8,6 und insbesondere im Bereich von 6,8 bis 7,ο und die Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise bei 2o bis 37°C und insbesondere bei 3o bis 32°C. Die Kultivierung wird aerob nach Standardkultivierungsmethoden durchgeführt (während 1o bis 2o Tagen) oder als Schüttelkultur (während 16 bis 24 Stunden), oder als Submerskultur, zB als Tankkultur (während 24 bis 36 Stunden). Dabei wird Gamba A gebildet.

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(2) Extraktionsstufe

Das erfindungsgemässe Polypeptid liegt sowohl in den Zellen als auch im Kulturfiltrat vor und kann nach herkömmlichen Verfahren der Isolierung von Polypeptiden gewonnen werden. Das erfindungsgemässe Polypeptid wird somit dadurch isoliert, dass man das Polypeptid und die Proteine aus einer Lösung abtrennt, welche dieselben enthält. Diese Lösung wird durch Filtrieren der Kulturbrühe oder durch Extrahieren der im so erhaltenen Filtrat enthaltenen Zellen gewonnen. Danach wird das Poylpeptid von den Proteinen getrennt.

(i) Extraktion des KuIturfiltrats

Die Zellen werden von der Lösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren befreit, wobei ein Kulturfiltrat erhalten wird. Zu diesem Kulturfiltrat gibt man o,1 bis 5 Gew.% Aktivkohle bezogen auf das Gewicht des Kulturfiltrats, und die erhaltene Mischung wird bei einer Temperatur von unterhalb 4o°C stehengelassen oder gerührt, und zwar während 1 bis 4o Stunden, und dabei wird Gamba A an der Aktivkohle adsorbiert. Der in diesem Falle einzustellende pH-Wert liegt vorzugsweise bei 4 bis 9 und insbesondere im Bereich des Neutralpunktes bis leicht alkalisch. Die Aktivkohle wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und dann in Wasser, angesäuertem V/asser (pH 2,ο bis 6,o) oder alkalischem Wasser (pH 8,ο bis 12,o) oder in einem Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder 3o bis 9o% (V/V)-Azeton/Wasser suspendiert, und die erhaltene Suspension wird während einer bis 6 Stunden bei 5 bis 4o°C gerührt oder geschüttelt, wobei Gamba A in dem Wasser oder in dem Lösungsmittel aufgelöst wird. Nachfolgend wird die Aktivkohle durch Filtrieren abgetrennt, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45°C eingeengt, wobei ein Extrakt von Gamba A erhalten wird. Als Adsorptionsmittel kann man neben der genannten Aktivkohle jedes andere natürliche oder synthetische Adsorptionsmittel verwenden, welches im Hinblick auf die unten genannten chemischen Eigenschaften von Gamba A verwendbar ist.

Alternativ kann man zu dem Kulturfiltrat ein Proteinfällungsmittel geben, zB Gerbsäure oder Pikrinsäure, wobei ein Ad-

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sorptionsmittel nicht verwendet wird. Dabei fällt Gamba A zusammen mit den enthaltenen Proteinen aus. Der Niederschlag wird in alkalischem Wasser oder in einem wässrigen alkalischen Lösungsmittel aufgelöst, wobei ein Extrakt von Gamba A erhalten wird.

(ii) Extraktion aus den Zellen

Die Lösung wird zentrifugiert oder filtriert, um die Zellen abzutrennen. Die abgetrennten Zellen werden in Wasser, angesäuertem Wasser (pH 2,ο bis 6,o) oder alkalischem Wasser (pH 8,o bis 12,o) oder in einem Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder 3o bis 9o% (V/V)Azeton/Wasser suspendiert und die erhaltene Suspension wird während 2 bis 48 Stunden bei 5 bis 4o C stehengelassen,wobei Gamba A in dem Wasser oder in dem Lösungsmittel aufgelöst wird. Die Flüssigkeit wird von den unlöslichen Bestandteilen durch Zentrifugieren oder Filtrieren befreit und dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45 C eingeengt. Sodann gibt man Äthanol hinzu, bis zu einer Konzentration von 7o%, wobei ein Niederschlag ausgefällt wird. Der Niederschlag wird abgetrennt, und die überstehende Flüssigkeit wird in oben beschriebener Weise eingeengt, wobei ein Extrakt von Gamba A erhalten wird.

Alternativ werden die abgetrennten Zellen in einer kleinen Menge Wasser suspendiert und die erhaltene Zellsuspension wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen oder einer Gefrier-Schmelzbehandlung oder einer anderen geeigneten mechanischen Methode zur Zellzerstörung. Zu der Suspension der geborstenen Zellen gibt man sodann Äthanol bis zu einer Konzentration von 8o%, wobei ein Niederschlag ausgefällt wird. Der Niederschlag wird entfernt und die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Extrakt von Gamba A erhalten wird.

(iii) Reinigungsstufe

Der in obiger Weise erhaltene Extrakt wird entweder so, wie er ist, oder nach Entfernung eines darin etwa enthaltenen organischen Lösungsmittels einer AussalZungsbehandlung unterworfen. Dabei handelt es sich um eine normale Proteinfällungsmethode.

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Dabei gelangt Gamba A in der Hauptsache in die bei der Aussalzbehandlung gebildete überstehende Flüssigkeit. Die ausgeschiedenen Proteine werden durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat wird einer Dialysenbehandlung unterworfen oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel versetzt, um die anorganischen Salze zu entfernen, und dann mit n-Butanol gewaschen oder aber mit einem Kationenaustauschharz oder mit einem Anionenaustauschharz zur Entfernung der Aminosäuren behandelt. Der so gereinigte Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45°C eingeengt. Zu dem Konzentrat gibt man Methanol, Äthanol, n-Butanol oder Azeton bis zu einer Konzentration von 9o% oder mehr, wobei ein gelber bis rötlich-gelber Niederschlag ausgefällt wird. Der Niederschlag wird abfiltriert und - falls erforderlich - noch weiter durch Dialyse gereinigt und dann getrocknet. Auf diese V/eise erhält man das gewünschte Polypeptid Gamba A.

Im folgenden seien die physikochemisehen und biologischen Eigenschaften des so erhaltenen Polypeptids Gamba A angegeben,

(1 ) Physikochemische Eigenschaften

a) Ein Polypeptid.

b) Schmelzpunkt: 2o6°C (Zersetzung.)..

c) Spezifische Drehung: [pcJjT -54° (Konzentration o,3% in

Wasser.

d) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt keine spezifische Absorption.

e) Infrarot-Absorptionsspektrum: Es werden Absorptionsbanden bei 2,95; 3,4o; 6,o5; 6,55; 6,95; 7,2o; 8,15 und 9,oo ja beobachtet, wie in anliegender Zeichnung gezeigt.

f) Löslichkeit in Lösungsmitteln: Leicht löslich in Wasser; löslich in Methanol und Äthanol; schwach löslich in Butanol; unlöslich in Azeton, Benzol, Chloroform, Äthylazetat, Pyridin, Dioxan und Dimethylformamid.

g) Biuret-Reaktion: Positiv.
Ninhydrin-Reaktion: Negativ.
Orcin-Reaktion: Negativ,

Eisen-III-Chlorid-Reaktion: Negativ, Sakaguchi-Reaktion: Positiv.

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-1ο-

Silbernitrat-Reaktion: Negativ.

h) Saure Substanz.

i) Ein weisses bis blass-gelbes körniges Pulver. '

j) Konstitutive Aminosäuren: Durch Rückfluss ' der Substanz mit N-HCl während 24 Stunden erhält man ein Hydrolysat. Das Dunnschichtchromatogramm dieses Hydrolysats zeigt, dass das Pblypeptid als konstitutive Aminosäuren mindestens Alginin und Threonin enthält.

k) Da die vorliegende Substanz eine Verbindung mit einem hohen Molekulargewicht ist, kann man nach den gewöhnlichen Testmethoden keine signifikanten Elementaranalysenwerte oder Molekulargewichtswerte (nach der Methode der Gefrierpunktserniedrigung) erhalten.

(2) Biologische Eigenschaften

(i) Antitumoraktivität.

In die Peritonea von Mäusen (ddys-Stamm, männlich, 2o _ 1 g, 5 Wochen alt, fünf Mäuse pro Gruppe) impft man 1o Millionen Ehrlich's Ascites-Tumorzellen pro Maus. Eine Stunde nach der Impfung verabreicht man die in Tabelle 2 angegebene Dosis von Gamba A intraperitoneal. Danach wird die gleiche Dosis von Gamba A noch zweimal in Intervallen von einem Tag verabreicht. Somit erfolgt die Verabreichung des Mittels insgesamt dreimal. Während drei Monaten vom Impftag werden die Mäuse gefüttert und beobachtet, wobei die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse erhalten werden. Tabelle 2 zeigt klar, dass bei einer dreimaligen Verabreichung von Gamba A in einer Dosis von 2o mg/kg pro Verabreichung alle Mäuse überleben.

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Tabelle 2: Antitumoraktivitätstest,

	Tote	Mäuse	Wirksamkeit	1oo%
Dosis mg/kg/Verab- reichung	Sterb lich keit	Durchschnittl. Überlebenszeit (Tage)*	Überlebende Wirksam- Mäuse** keitsver- hältnis	4o%
2o	0/5	_	5/5	2o%
1o	3/5	29,ο	2/5	0%
5	4/5	28,2	1/5
Vergleichsver such (keine Ver abreichung)	5/5	26,4	0/5

* Errechnet nur für den Fall von toten Mäusen. ** Nachdem normales Wachstum festgestellt wurde, wurden die überlebenden Mäuse nach drei Monaten getötet.

(ii) Toxizität.

Gamba A wird intraperitoneal in den in Tabelle 3 angegebenen Dosen Mäusen verabreicht (ddys-Stamm,männlich, 2o 1g). Nach drei Tagen werden die Mäuse beobachtet, wobei die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse erhalten werden. Wie Tabelle 3 zeigt, liegt LD bei Gamba A bei mehr als 4oo mg/kg.

Tabelle 3: Toxizität (intraperitoneale Verabreichung),

Dosis mg/kg

Sterblichkeit

4oo

2oo

1oo

5o

1/5 0/5 0/5 0/5

(iii) Antimikrobielle Aktivität.

Gamba A wird einem antimikrobiellen Aktivitätstest unterworfen, wobei als Testmikroorganismen E. coli NIHJ, S. aureus FDA 2o9 und B. subtilis ATCC 6633 verwendet werden. Die Testergebnisse zeigen, dass Gamba A gegenüber diesen Test-

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mikroorganismen keine äntimikrobielle Aktivität aufweist, wenn man die Testmikroorganismen in einem neutralen Bouillon-Medium, welches 80 mcg/ml Gamba A enthält, bei einer Temperatur von 37°C impft und während 2o Stunden kultiviert.

Die Ergebnisse der Tabelle 3 zeigen, dass Gamba A selbst bei einer Verabreichung mit einer Dosis von weniger als 1/2o des LDc -Werts eine erhebliche Antitumorwirksamkeit zeigt. Viele der bekannten Antitumorsubstanzen haben zusätzlich noch eine äntimikrobielle Aktivität, und es handelt sich dabei also um sog. Cytotoxine. Demgegenüber hat Gamba A keine äntimikrobielle Aktivität, woraus man schliessen kann, dass Gamba A unter diesem Gesichtspunkt weniger toxisch ist.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Bei den %-Angaben handelt es sich um das Verhältnis (g) des Gelösten pro loo cm Lösung.

Beispiel 1

3oo ml eines Mediums (pH 7,o),enthaltend 1% Fleischextrakt und 1% Pepton, werden in einen 5oo ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. In diesem Medium unterwirft man Pseudomonas sp. Nr.22o5 einer aeroben, stationären Kultur bei 28°C während 15 Tagen. Dabei wird die Brühe trübe, bildet einen Film und setzt sich dann ab. Der pH erreicht 8,4. 24 Liter dieser Brühe werden bei 2o.ooo G während 1o Minuten zentrifugiert, wobei die Brühe in ein KuIturfiltrat und in die Zellen unterteilt wird.

(i) Extraktion aus dem KuIturfiltrat:

Zu dem Kulturfiltrat gibt man 3o g Aktivkohle und die erhaltene Mischung wird bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt und dann filtriert, um die Aktivkohle abzutrennen. Die erhaltene Aktivkohle suspendiert man in einem gemischten Lösungsmittel aus 5o ml Wasser, 24o ml Äthanol und 1,5 ml Essigsäure, und die erhaltene Suspension wird bei Zimmertemperatur während 12o Minuten geschüttelt, um Gamba A zu eluieren. Nach Abtrennung der Aktivkohle durch Filtrieren wird das Eluat un-

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ο ter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45 C auf ein Volumen von 5o ml eingeengt. In das so eingeengte Eluat gibt man etwa 35 g Ammoniumsulfat, wobei eine gesättigte Lösung erhalten wird. Diese wird sodann bei 5°C während Ί2ο Minuten stehen gelassen, wobei die darin enthaltenen Proteine ausgefällt werden. Die ausgeschiedenen Proteine werden durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat wird mit Wasser auf das 5-fache des ursprünglichen Volumens verdünnt und dann durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf pH 7,ο bis 7,4 eingestellt. Dann gibt man 5oo g Aktivkohle hinzu. Die erhaltene Mischung wird bei Zimmertemperatur während 6o Minuten gerührt und dann filtriert, um die Aktivkohle abzutrennen. Die abgetrennte Aktivkohle wird mit 4o ml n-Butanol gewaschen und dann in 6o ml 95%-Äthanol suspendiert. Die erhaltene Suspension wird bei Zimmertemperatur während 2o Minuten gerührt, um Gamba A zu eluieren. Dann wird die Suspension filtriert und in ein Eluat (a) und Aktivkohle (b) getrennt.

Eluat (a):

Das Eluat (a) wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45°C eingeengt, wobei etwa 1o ml einer wässrigen Lösung erhalten werden. Diese Lösung wird in einen Cellophanbeutel gegeben und während 18o Minuten gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nachfolgend wird die im Innern des Beutels enthaltene Flüssigkeit unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45 C auf ein Volumen von o,3 ml eingeengt und dann gibt man 2,7 ml Äthanol hinzu, wobei ein gelber Niederschlag ausgefällt wird. Der ausgefällte Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in o,2 ml Wasser aufgelöst und dann mit 1,8 ml Äthanol versetzt, wobei Gamba A in Form blass-gelber Körner ausgefällt wird. Die Ausfällung wird bei 5 C beendet und die ausgeschiedene körnige Substanz wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Azeton gewaschen und dann im Vakuumexsiccator getrocknet, wobei man 4 mg eines blassgelben Pulvers von Gamba A erhält.

Aktivkohle (b):

Die Aktivkohle (b) wird in einem gemischten Lösungs^ix-

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tel aus 2o ml Wasser und 80 ml Äthanol und o,5 ml Essigsäure suspendiert, und die erhaltene Suspension wird bei Zimmertemperatur während 12o Minuten gerührt, um Gamba A zu'eluieren. Nach Abtrennung der Aktivkohle durch Filtrieren wird das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man etwa 1o ml einer Yfässrigen Lösung erhält. Diese Lösung gibt man in einen Cellophanbeutel. Sie wird dann während I80 Minuten gegen das destillierte V/asser dialysiert, um die Essigsäure zu entfernen. Nachfolgend wird die Flüssigkeit des Beutelinneren unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 45 C auf ein Volumen von 3 ml eingeengt, und dann gibt man 7 ml Äthanol hinzu, wobei ein rötlich-brauner Niederschlag ausgeschieden wird. Der ausgeschiedene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von o,5 ml eingeengt und dann mit 3,5 ml Äthanol versetzt, wobei ein gelber Niederschlag ausgefällt wird. Der ausgefällte Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in o,2 ml Wasser aufgelöst und dann mit 1,8 ml Äthanol versetzt, wobei Gamba A in Form einer gelben körnigen Substanz ausgefällt wird. Die Ausfällung wird bei 5⁰C beendet. Die körnige Substanz wird zentrifugiert, mit Azeton gewaschen und im Vakuumexsiccator getrocknet. Man erhält 17 mg eines gelben Pulvers von Gamba A.

(ii) Extraktion der Zellen.

Die Zellen werden in 5oo ml Wasser suspendiert und die erhaltene Suspension wird einer Ultraschall-Zerstörungsbehandlung während 1o Minuten unterworfen. Dabei wird ein Ultraschallwellengenerator verwendet, welcher mit einer Frequenz von 9.000 Hertz arbeitet bei einer Oszillatorausgangsleistung von I80 Watt. Zu der so behandelten Suspension gibt man Essigsäure in einer Konzentration von o,5%, und die erhaltene Mischung wird bei 2o.ooo G während 1o Minuten zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit gibt man Amberlit IR-4B in einer Menge, welche Ι/Ιο der Menge der Flüssigkeit entspricht. Die erhaltene Mischung wird bei Zimmertemperatur während 3o Minuten geschüttelt, urn die Essigsäure zu entfernen. Dann wird Amberlit IR-4B durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck

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bei einer Temperatur unterhalb 45°C auf etwa i/2o des ursprünglichen Volumens eingeengt. Zu dem Konzentrat gibt man Äthanol bis zu einer Konzentration von 7o%, wobei ein ,Niederschlag ausgefällt wird. Der ausgeschiedene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das Äthanol zu entfernen. Dann gibt man Wasser bis zu einem Volumen von 5o ml hinzu. Die so erhaltene Flüssigkeit wird wie im Falle der oben beschriebenen Isolierung aus dem Kulturfiltrat einer Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat und einer Adsorptionsbehandlung der Aussalzflüssigkeit mit Aktivkohle unterworfen. Nachfolgend wird die Aktivkohle unter Verwendung von 5o ml des gleichen gemischten Äthanollösungsmittels, welches vorstehend bereits erwähnt wurde, eluiert und dann erfolgt die gleiche Behandlung wie unter (b). Man erhält 2o mg eines blass-gelben körnigen Pulvers von Gamba A. Insgesamt erhält man also 41 mg reines Gamba A, nämlich 21 mg aus dem Kulturfiltrat und 2o mg aus den Zellen, wobei 24 Liter Brühe eingesetzt werden. Alle pulvrigen Produkte zeigen die gleichen Eigenschaften, welche oben beschrieben wurden.

Beispiel 2

5 Liter des gleichen Mediums wie in Beispiel 1 werden in einen 1o 1-Tankfermentor gegeben. In diesem Medium unterwirft man Pseudomonas sp. Nr. 22o5 einer Tankkultur bei 3o C während 24 Stunden unter Rühren bei 4oo U/min., wobei Luft mit einer Geschwindigkeit von 6 l/min, eingeleitet wird. Dabei erreicht das Wachstum des Mikroorganismus ein Maximum. Der pH der Brühe erreicht einen Wert von 9,o. Aus dieser Brühe extrahiert man Gamba A in der in Beispiel 1 angegebenen Weise, wobei man eine Gesamtmenge von 4,5 mg eines blass-gelben reinen Pulvers von Gamba A erhält, nämlich 2 mg aus dem Kulturfiltrat und 2,5 mg aus den Zellen. Das pulvrige Gamba A hat die oben beschriebenen Eigenschaften.

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Claims

Patentansprüche

'1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Variante von Pseudomonas cruciviae in Gegenwart von Nährquellen aerob kultiviert und das gebildete Polypeptid aus der Brühe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Variante von Pseudomonas cruciviae den Mikroorganismus Pseudomonas sp. Nr. 22o5 (FERM^I 32, ATCC 31155) einsetzt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nährquellen Bouillon, Pepton, Sojabohneninfusion, Fleischextrakt, Fleischinfusion oder Organinfusion, Maisquellflüssigkeiti Hefeextrakt, Malzextrakt, Kartoffelinfusion, Caseinhydrolysat oder Mischungen derselben einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass man als Nährstoffquelle eine Mischung von Fleischextrakt und Pepton einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährstoffquelle ein wuchsförnderndes Mittel, nämlich Natriumacetat, Natriumzitrat, Alginsäure, Methylamin oder Äthanolamin enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zu Beginn der Kultivierung einen pH des Mediums von 6,ο bis 8,6 wählt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zu Beginn der Kultivierung einen pH des Mediums von 6,8 bis 7,o wählt.

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8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung bei 2o bis 37 C durchführt .
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung bei 3o bis 32°C durchführt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete Polypeptid aus dem Kulturfiltrat und aus den Zellen isoliert.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1o, dadufch gekennzeichnet, dass das Polypeptid durch Abtrennung des Polypeptids und der Proteine aus einer dieselben enthaltenden Lösung, welche durch Filtrieren der Brühe oder durch Extrahieren der in so erhaltenem Filtrat enthaltenen Zellen erhalten wurde, und nachfolgendes Abtrennen des Polypeptids von den Proteinen isoliert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abtrennung des Polypeptids von den Proteinen durch Adsorptionsbehandlung der wässrigen Lösung durchführt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man als Adsorptionsmittel Aktivkohle verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trennung des Polypeptids und der Proteine durch Ausfällung derselben mit einem Fällungsmittel durchführt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man als Fällungsmittel mit V/asser mischbare Alkohole, Pikrinsäure oder Gerbsäure verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abtrennung des Polypeptids und der Proteine durch Aussalzen der Proteine durchführt,

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17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrige, das Polypeptid und die Proteine enthaltende Lösung das Filtrat der Brühe einsetzt. . ,
18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrige, das Polypeptid und die Proteine enthaltende Lösung einen Extrakt der Zellen der Brühe einsetzt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Zellextrakt einsetzt, welcher durch Suspension der abgetrennten Zellen in Wasser, in saurem Wasser oder in alkalischem Wasser zum Zwecke der Extraktion des Polypeptids erhalten wurde.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Zellextrakt einsetzt, welcher durch Suspension der abgetrennten Zellen in Methanol, Äthanol oder wässrigem Azeton zum Zwecke der Extraktion des Polypeptids erhalten wurde.
21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Zellextrakt einsetzt, welcher durch Suspension der abgetrennten Zellen in einer kleinen Menge Wasser und nachfolgende Ultraschallbehandlung der Zellsuspension und nachfolgende Extraktion des Polypeptids aus der Suspension der zerstörten Zellen erhalten wird.
32. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Zellextrakt einsetzt, welcher durch Suspension der abgetrennten Zellen in einer kleinen Menge Wasser, durch Gefrier-Schmelz-Behandlung der erhaltenen Suspension und durch Extraktion des Polypeptids aus der Suspension der zerstörten Zellen erhalten wurde.
23. Neues Polypeptid, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
24. Neues Polypeptid, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2.

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25. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt einer wirksamen Menge des Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 23 oder 24 als aktivem Wirkstoff.

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