BRPI1009576B1

BRPI1009576B1 - anticorpo antagonístico que se liga a il-13 humana e uso deste, molécula de anticorpo neutralizadora, sequência de dna isolada, vetor de clonagem ou expressão, célula hospedeira, processo para a produção de anticorpo, composição famacêutica, e uso de fragmento fab ou fab` de anticorpo anti-il 13.

Info

Publication number: BRPI1009576B1
Application number: BRPI1009576-4A
Authority: BR
Inventors: Neil Gozzard; Alastair David Griffiths Lawson; Daniel John Lightwood; Roger Thomas Palframan; Bryan John Smith; Kerry Louise Tyson
Original assignee: Ucb Pharma Sa
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2020-04-07
Also published as: US9957320B2; CA2754539A1; EP2406283A1; SI2406283T1; EP3168235A1; IL215014A; PT2406283T; RS55734B1; UY32489A; US8691233B2; TW201036636A; HUE031923T2; AR075849A1; AU2010222693A1; ES2615978T3; CY1118640T1; TWI476004B; GB0904214D0; CN102388066A; CN102388066B

Abstract

anticorpo antagonístico que se liga a il-13 humana e uso deste, molécula de anticorpo neutralizadora, sequência de dna isolada, vetor de clonagem ou expressão, célula hospedeira, processo para a produção de anticorpo, composição farmacêutica, e uso de um fragmento fab ou fab de anticorpo anti-il13 as moléculas de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigênicos de il-13 humano, usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e métodos para a produção das ditas moléculas de anticorpo.

Description

“ANTICORPO ANTAGONÍSTICO QUE SE LIGA A IL-13 HUMANA E USO DESTE, MOLÉCULA DE ANTICORPO NEUTRALIZADORA, SEQUÊNCIA DE DNA ISOLADA, VETOR DE CLONAGEM OU EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E USO DE UM FRAGMENTO FAB OU FAB’ DE ANTICORPO ANTI-IL13” [0001] A presente invenção diz respeito a anticorpos de IL-3 e fragmentos destes tais como seus fragmentos de ligação, composições que compreendem os mesmos e especificamente a seu uso na prevenção e/ou tratamento de várias doenças incluindo asma, alergia, COPD, fibrose, e/ou câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0002] O IL-13 é uma citocina de cadeia curta que dividem 25 % de identidade de sequência com IL-4. Este compreende aproximadamente 132 aminoácidos que formam uma estrutura secundária de quatro resíduos que se estendem sobre as hélices 10-21 (hélice A), 43-52 (hélice B), 61-69 (hélice C) e 92-110 (hélice D), junto com dois resíduos que se estendem sobre os filamentos β 33-36 e 87-90. A estrutura da solução de IL-13 foi resolvida, revelando a conformação de feixe de quatro hélices acima-acima-abaixo-abaixo também observada como IL-4 (Eisenmesser2001).

[0003] O IL-13 humano é uma glicoproteína de 17 kDa de células T ativadas (Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26) e é produzido pelas células T ativadas da linhagem Th2, embora as células T ThO e Th1 CD4+ T, células CD8+ T e diversas populações que não de célula T, tais como mastócitos também produzem IL-13 (Zurawski and de Vries 1994 Immunol loday 13 19-26).

[0004] A função de IL-13 inclui:

isotipo de imunoglobulina que substitui para IgE em células B humanas (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sei USA 90 3730-4) e supressão da produção de citocina inflamatória tanto em seres humanos quanto camundongos (de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370- 81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60).

[0005] O IL-13 liga-se a seus receptores de superfície celular, IL-13 Ralfal e ILPetição 870190081433, de 21/08/2019, pág. 6/78

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Ralfa2. 0 IL-13Ralfa1 interage com IL-13 com uma afinidade baixa (KD ~10 nM), seguido pelo recrutamento de IL-4Ra para formar o complexo de receptor heterodimérico sinalizador de afinidade alta (KD ~0,4 nM) (Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 497-501).

[0006] O complexo de IL-4R/IL-13Ralfa1 é expressado em muitos tipos celulares tais como células B, monócito/macrófago, células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliais, células endoteliais das vias aéreas e células musculares lisas das vias aéreas (Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Cytokine 13 75-84).

[0007] A ligação do complexo de receptor de IL-13Ralfa1 /IL-4R resulta na ativação de uma variedade de caminhos de transdução de sinal incluindo o transdutor de sinal e ativador de transcrição (ST AT6) e os caminhos de substrato-2 receptor de insulina (IRS-2) (Wang, Michieli et al. 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2).

[0008] A cadeia IL-13Ralfa2 apenas tem uma afinidade alta (KD ~0,25 a 0,4 nM) para IL-13 e funções tanto que um receptor isca regula negativamente a ligação de IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24) e um receptor de sinalização que induz a síntese de TGF-b e a fibrose por intermédio do caminho de AP-I em macrófagos e possivelmente outros tipos celulares (Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

[0009] Diversos estudos conduzidos em modelos animais pré-clínicos para asma indicam que o IL-13 desempenha um papel importante na asma. Estes dados incluem a resistência à asma no camundongo de nocaute de IL-13 bem como a inibição do fenótipo de asma com antagonistas de IL-13 (os receptores de IL-13 solúveis, anti-IL-13 mAbs, etc.) em vários modelos de camundongo (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills- Karp and Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). Os estudos múltiplos demonstraram que a administração farmacológica de IL-13 recombinante aos pulmões de camundongo

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3/68 bem como porquinhos da índia induz a hiper-secreção de muco das vias aéreas, eosinofilia e AHR (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig and Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig and Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9).

[0010] Estes efeitos de IL-13 são reproduzidos em sistemas de camundongo transgênico com expressão constitutiva ou indutível de IL-13 (Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S6770; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110463-74). A super-expressão transgênica crônica de IL-13 também induz a fibrose subepitelial e enfisema. Os camundongos deficientes na molécula sinalizadora de IL-13 (e IL-4) falham em desenvolver AHR induzido por alergeno e super-produção de muco (Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9). Os estudos que usam a proteína de fusão de receptor de IL-13 solúvel (sDL-13Ralfa2Fc) demonstrou o papel pivotal desta citocina em doença das vias aéreas induzidas por ovalbumina de alergeno experimental (OVA) (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 169 6482-9).

[0011] A eficácia do tratamento anti-IL-13 também foi demonstrada em um modelo crônico de asma de murino. Além de apresentar as características de hipersecreção de muco e AHR, este modelo de asma crônica demonstra diversas indicações de doença humana que estão necessitando de modelos mais agudos. Estes incluem eosinofilia do tecido pulmonar localizado nos espaços inter-epiteliais bem como fibrose de músculo liso como medido pelos aumentos na deposição de colágeno. O modelo e asma crônico é induzido com desafios de aerossol repetidos com OVA em camundongos sensibilizados por OVA 1 x/semana por um total de 4 semanas. O anticorpo anti-IL-13 administrado nas 2 semanas finais de desafios de OVA (a partir do dia 36 com leituras de eficácia estimadas no dia 53 do estudo) inibiu significantemente o AHR, inflamação pulmonar, hiperplasia de célula cálice, hipersecreção de muco e fibrose das vias aéreas (Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol

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Exp Ther).

[0012] O efeito terapêutico de antagonista de IL-13 também demonstrou inibir AHR em um modelo primata de asma, (American Thoracic Society, San Diego 2005).

[0013] O IL-13 está implicado na patogênese de asma humano como níveis elevados de IL-13 mRNA e a proteína foi detectada nos pulmões de pacientes asmáticos, que correlacionam-se com a gravidade da doença (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94). Além disso, os polimorfismos genéticos de IL-13 humano, que levaram aos níveis de IL- 13 elevados, foram identificados e estão associados com asma e atopia (Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 54959; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest), e os níveis de IL-13 elevados foram detectados no pulmão de pacientes com asma (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 1106-9). Uma ligação genética entre IL-13 e asma também foi demonstrada como indivíduos como um polimorfismo no gene IL13 que causa níveis de IL-13 no plasma mais altos tiveram um risco aumentado para a atropia e asma (Wills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23).

[0014] Devido ao papel de IL-13 humano em uma variedade de distúrbios humanos, as estratégias terapêuticas foram projetadas para inibir ou contra-reagir a atividade de IL-13. Em particular, os anticorpos que ligam-se a e neutralizam, IL-13 foram procurados como um meio de inibir a atividade de IL-13. Entretanto, existe uma necessidade na técnica para anticorpos adequados e/ou melhorados capazes de ligar IL-13, especialmente IL-13 humano. Em particular, os anticorpos são capazes de neutralizar IL-13 humano. A presente invenção fornece uma nova família de proteínas de ligação, anticorpos enxertados com CDR, anticorpos humanizados e fragmentos destes, capazes de ligar IL-13 humano, ligação com afinidade alta e ligação e neutralização de IL-13 humano.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0015] Esta invenção diz respeito a um novo anticorpo específico de IL-13 e fragmentos, por exemplo, seus fragmentos de ligação de IL-13, em particular anticorpos e fragmentos neutralizadores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0016] Figura 1 mostra a sequência de aminoácido para cada um de CDR 1, 2, 3 da cadeia pesada (CDR H) e CDR 1,2, 3 da cadeia leve (CDR L);

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato;

a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato; e a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato com sequência sinalizadora.

[0017] Figura 2 mostra a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato com sequência sinalizadora, a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia leve de anticorpo de rato a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia leve de anticorpo de rato, a sequência de aminoácido para a cadeia leve de anticorpo de rato com sequência sinalizadora.

[0018] Figura 3 mostra a sequência de DNA para a cadeia leve de anticorpo de rato com sequência sinalizadora;

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato;

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato;

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de

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6/68 anticorpo de rato com sequência sinalizadora.

[0019] Figura 4 mostra a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência sinalizadora;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo de rato.

[0020] Figura 5 mostra a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo de rato;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência sinalizadora.

[0021] Figura 6 mostra a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência sinalizadora.

[0022] Figura 7 mostra a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado;

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia leve de anticorpo humanizado.

[0023] Figura 8 mostra a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia leve de anticorpo humanizado;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia leve de

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7/68 anticorpo humanizado com sequência sinalizadora.

[0024] Figura 9 mostra a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado;

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado;

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo humanizado.

[0025] Figura 10 mostra a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo humanizado;

a sequência de aminoácido para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência sinalizadora;

a sequência de DNA para a região variável e constante de cadeia pesada de anticorpo humanizado.

[0026] Figura 11 mostra sequências de aminoácido e de DNA para a estrutura receptora de VK 1 2-1(1)02 JK4 humana e estrutura receptora de VH2 3-1 2-26 JH4.

[0027] Figura 12 mostra um alinhamento das cadeia leves para o rato, estrutura receptora e as cadeias leves humanizadas e também cadeias pesadas. Os CDRs estão em negrito e sublinhados. Os resíduos doadores G49 e R71 estão em negrito, itálico e destacados.

[0028] Figura 13 Efeito de Ab652 em BAL eotaxin-3 medido 24h após o desafio de alergeno. Os dados são expressados como média ± SEM, n = 4 a 8 por grupo.

[0029] Figura 14. Efeito de Ab652 na contagem de eosinófilo BAL medido 24h

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8/68 após o desafio de alergeno. Os dados são normalizados para a contagem de BAL eosinófilo na fase de triagem do estudo. Média ± SEM, n = 4 a 8 por grupo.

[0030] Figura 15. Efeito de Ab652 em resistência de vias aéreas de pico medida até 15 minutos após o desafio de alergeno. os dados são expressados como média ± SEM, n = 4 a 8 por grupo.

[0031] Figura 16. Efeito de Ab652 na resistência das vias aéreas medida 24 h após o desafio de alergeno. Os dados são normalizados para a resistência das vias aéreas antes da exposição ao alergeno. Média ± SEM, n = 4 a 8 por grupo.

[0032] Os resíduos nos domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema inventado por Kabat et al. Este sistema é apresentado em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (aqui Kabat et al. (supra)). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo exceto onde indicado de outra maneira.

[0033] As designações de resíduo de Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais do que na numeração de estrita correspondente a um encurtamento de ou inserção em um componente estrutural, estrutura ou região determinadora de complementaridade (CDR), da estrutura de domínio variável básica. A numeração de Kabat correta de resíduos pode ser determinada por um dado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat padrão.

[0034] Os CDRs do domínio variável de cadeia pesada estão localizados nos resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Entretanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), o arco equivalente a CDR-H1 estende-se do resíduo 26 ao resíduo 32. Desta maneira ‘CDR-HT, como usado neste, compreende resíduos de 26 a 35, como descrito por uma combinação do Sistema de numeração de Kabat e definição de arco topológico de Chothia.

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9/68 [0035] Os CDRs do domínio variável de cadeia leve estão localizados nos resíduos 24 a 34 CDR-L1), resíduos 50 a 56 (CDR-L2) e resíduos 89 a 97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0036] Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo antagonístico.

[0037] Como usado neste, o termo ‘anticorpo antagonístico’ descreve um anticorpo que é capaz de inibir e/ou neutralizar a atividade sinalizadora biológica de IL-13, por exemplo, pelo bloqueio da ligação ou reduzindo substancialmente a ligação de IL-13 ao receptor de IL-13 e, desta maneira, inibindo a ativação do receptor.

[0038] Os anticorpos para o uso na presente invenção podem ser obtidos usando-se qualquer método adequado conhecido na técnica. O polipeptídeo de IL13, incluindo um peptídeo de fusão contendo IL-13 ou células que expressam (recombinantemente) o polipeptídeo podem ser usadas para a produção de anticorpos que reconhecem especificamente o IL-13. O polipeptídeo de IL-13 pode ser o polipeptídeo ‘maduro’ ou um fragmento biologicamente ativo ou derivado deste. Os polipeptídeos de IL-13 podem ser preparados por processos bem conhecidos na técnica de projetar geneticamente as células hospedeiras que compreendem os sistemas de expressão ou estes podem ser recuperados a partir de fontes biológicas naturais. No presente pedido, o termo polipeptídeos inclui peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Estes são usados de maneira intercambeável a não ser que especificados de outra maneira. O polipeptídeo de IL-13 pode, em alguns exemplos, ser parte de uma proteína maior, tal como uma proteína de fusão, por exemplo, fundida a um rótulo de afinidade.

[0039] Os anticorpos gerados contra o polipeptídeo IL-13 podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração dos polipeptídeos a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando-se protocolos bem conhecidos e de rotina, ver, por exemplo, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, vacas, camêlos ou porcos podem ser imunizados. Entretanto, camundongos, coelhos,

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10/68 porcos e ratos são, em geral, mais adequados.

[0040] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem os anticorpos totais e os fragmentos funcionalmente ativos ou derivados destes e podem ser, mas não limitam-se a, anticorpos monoclonais, humanizados, totalmente humanos ou quiméricos.

[0041] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica, tal como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) e a técnica de hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Anticorpos and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0042] Os anticorpos para o uso na invenção também podem ser gerados usando-se métodos de anticorpo de linfócito simples pela clonagem e expressão de cDNAs de região variável de imunoglobulina gerados a partir de linfócitos simples para a produção de anticorpos específicos, por exemplo, pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(15)7843-78481; WO92/02551; W02004/051268 e Pedido de Patente Internacional número W02004/106377.

[0043] A triagem quanto a anticorpos pode ser realizada usando-se ensaios para medir a ligação a IL-13 e/ou ensaios para medir a capacidade de bloquear a ligação de IL-13 a um ou mais de seus receptores. Um exemplo de um ensaio de ligação é um ELISA, por exemplo, usando-se uma proteína de fusão de IL-13, que é imobilizada nas placas e que utiliza um anticorpo conjugado secundário para detectar o anticorpo anti-IL-13 ligado ao IL-13. Um exemplo de um ensaio de bloqueio é um ensaio com base em citometria de fluxo que mede o bloqueio de proteína de ligante de IL-13 que liga-se a um IL-13R.

[0044] Um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado é usado para detectar a quantidade de proteína de ligante de IL-13 que liga-se ao IL-13R.

[0045] Os anticorpos humanizados (que incluem anticorpos enxertados com CDR) são moléculas de anticorpo tendo uma ou mais regiões determinadoras de

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11/68 complementaridade (CDRs) de uma espécie não humana e uma região de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, US 5,585,089; WO91/09967). Será estimado que pode ser necessário apenas transferir a especificidade que determina os resíduos dos CDRs em vez do CDR total (ver, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Os anticorpos humanizados ainda podem compreender opcionalmente um ou mais resíduos de estrutura derivados das espécies não humanas dos quais os CDRs foram derivados.

[0046] Os anticorpos quiméricos são compostos de elementos derivados de duas espécies tal que o elemento retenha as características das espécies da qual este é derivado. Em geral, um anticorpo quimérico compreenderá uma região variável e uma espécie, por exemplo, um camundongo, rato, coelho ou similar e região constante de uma outra espécie, tal como um ser humano.

[0047] Os anticorpos para o uso na presente invenção também podem ser gerados usando-se vários métodos de apresentação de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles divulgados por Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) e WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 e 5,969,108.

[0048] Os anticorpos totalmente humanos são aqueles anticorpos em que as regiões variáveis e as regiões constantes (quando presentes) tanto das cadeias pesadas quanto leves são todas de origem humana ou substancialmente idêntico às sequências de origem humana, mas não necessariamente do mesmo anticorpo. Os exemplos de anticorpos totalmente humanos podem incluir anticorpos produzidos, por exemplo, pelos métodos de apresentação de fago descritos acima e anticorpos produzidos pelos camundongos em que a variável de imunoglobulina de murino e opcionalmente os genes de região constante foram substituídos por suas contrapartes humanas, por exemplo, como descrito em termos gerais em EP

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0546073, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 e EP 0463151.

[0049] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos um CDR tendo a sequência da na Figura 1, SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, um CDR tendo a sequência dada na SEQ ID N°: 2 para CDR-H2 e/ou um CDR tendo a sequência dada na SEQ ID N°: 3 para CDR-H3.

[0050] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que pelo menos dois dos CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 do domínio variável da cadeia pesada são selecionados do seguinte: a sequência dada na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID 1 N°: 2 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 3 para CDR-H3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H1 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 1 e CDR-H2 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 2. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDRH1 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 1 e CDR-H3 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 3 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H2 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 2 e CDR-H3 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 3. Para evitar dúvidas, é entendido que todas as permutações estão incluídas.

[0051] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID N°: 2 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 3 para CDR-H3.

[0052] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos um CDR

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13/68 tendo a sequência da na Figura 1, SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, um CDR tendo a sequência dada na SEQ ID N°: 5 para CDR-L2 e/ou um CDR tendo a sequência dada na SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0053] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia leve, em que pelo menos dois dos CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do domínio variável da cadeia leve são selecionados do seguinte: a sequência dada na SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID N°: 5 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 6 para CDR-L3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L1 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 4 e CDR-L2 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 5. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L 1 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 4 e CDR-L3 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 6 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L2 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 5 e CDR-L3 tem uma sequência dada na SEQ ID N°: 6. Para evitar dúvidas, é entendido que todas as permutações estão incluídas.

[0054] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID N°: 5 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0055] As moléculas de anticorpo da presente invenção compreende adequadamente uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada complementar, respectivamente.

[0056] Em consequência, em uma forma de realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID N°: 2 para CDR-H2 e/ou a sequência dada na SEQ ID N°: 3 para CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, a

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14/68 sequência dada na SEQ ID N°: 5 para CDR-L2 e/ou a sequência dada na SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.

[0057] Será estimado que uma ou mais substituições, adições e/ou anulações de aminoácido possam ser feitas aos CDRs fornecidos pela presente invenção sem alterar significantemente a capacidade do anticorpo ligar ao IL-13 e neutralizar a atividade de IL-13. O efeito de quaisquer substituições, adições e/ou anulações de aminoácido podem ser facilmente testadas por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, usando-se os métodos descritos neste, particularmente aqueles ilustrados nos Exemplos, para determinar a ligação de IL-13 e a inibição da interação do receptor de IL-13/IL-13.

[0058] Consequentemente, a presente invenção fornece um anticorpo tendo especificidade para IL-13 humano que compreende um ou mais CDRs selecionados de CDRH-1 (SEQ ID N°: 1), CDRH-2 (SEQ ID N°: 2), CDRH-3 (SEQ ID N°: 3), CDRL-1 (SEQ ID N°: 4), CDRL-2 (SEQ ID N°: 5) e CDRL-3 (SEQ ID N°: 6) em que um ou mais aminoácidos em um ou mais dos CDRs foram substituídos por um outro aminoácido, por exemplo, um aminoácido similar como definido a seguir.

[0059] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo tendo especificidade para IL-13 humano que compreende CDRH-1 (SEQ ID N°: 1), CDRH-2 (SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 20), CDRH-3 (SEQ ID N°: 3), CDRL-1 (SEQ ID N°: 4), CDRL-2 (SEQ ID N°: 5) e CDRL-3 (SEQ ID N°: 6), por exemplo, em que um ou mais aminoácidos em um ou mais do CDRs foram substituídos por um outro aminoácido , tal como um aminoácido similar como definido a seguir.

[0060] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência do CDRH-1 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 1, CDRH-2 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 2 e/ou CDRH-3 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 3. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia

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15/68 pesada compreende três CDRs em que a sequência do CDRH-1 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 1, CDRH-2 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 2 e/ou CDRH-3 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 3.

[0061] Identidade, como usado neste, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. Similaridade, como usado neste, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, a leucina pode ser substituída no lugar de isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos no lugar de um outro incluem mas não limitam-se a:

-fenilalanina, tirosina e triptofamo (aminoácidos tendo cadeias secundárias aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias secundárias básicas);

-aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias secundárias ácidas);

-asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias secundárias de amida) e

- cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias secundárias contendo enxofre). Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991, o software BLAST™ disponível da NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272.

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Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

[0062] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende três CDRs em que a sequência do CDRL-1 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 4, CDRL-2 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 5 e/ou CDRL-3 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 6. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende três CDRs em que a sequência do CDRL-1 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 4, CDRL-2 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 5 e/ou CDRL-3 tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 6.

[0063] Em uma forma de realização, o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0064] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo quimérico.

[0065] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é uma molécula de anticorpo enxertada com CDR que compreende um ou mais dos CDRs fornecidos nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou variantes destas. Como usado neste, o termo ‘molécula de anticorpo enxertada com CDR’ refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contém um ou mais CDRs (incluindo, se desejado, um ou mais CDRs modificados) a partir de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino ou rato) enxertado em uma estrutura de região variável cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo receptor (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, ver Vaughan et al, Nature

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Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Em uma forma de realização em vez do CDR inteiro sendo transferido, apenas um ou mais dos resíduos que determina a especificidade de qualquer um dos CDRs descritos anteriormente são transferidos à estrutura de anticorpo humano (ver, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Em uma forma de realização, apenas os resíduos determinadores de especificidade de um ou mais dos CDRs descritos anteriormente são transferidos à estrutura de anticorpo humano. Em uma outra forma de realização apenas os resíduos que determinam a especificidade de cada um dos CDRs descritos anteriormente são transferidos à estrutura de anticorpo humano.

[0066] Quando os CDRs ou resíduos determinadores de especificidade são enxertados, qualquer sequência de estrutura de região variável receptora apropriada pode ser usada tendo consideração à classe/tipo do anticorpo doador dos quais os CDRs são derivados, incluindo regiões de estrutura de camundongo, primata e ser humano. Adequadamente, o anticorpo enxertado com CDR de acordo com a presente invenção tem um domínio variável que compreende regiões de estrutura de receptor humano bem como um ou mais dos CDRs ou resíduos determinadores de especificidade descritos acima. Desta maneira, fornecido em uma forma de realização é um anticorpo enxertado com CDR neutralizador em que o domínio variável compreende regiões de estrutura de receptor humano e CDRs doadores não humanos.

[0067] Os exemplos de estruturas humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usados tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve. Alternativamente, as sequências de linha germinativa humana podem ser usadas; que estão disponíveis em: http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/ [0068] Em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as cadeias pesadas e leves receptoras não necessitam ser necessariamente derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias de composite tendo

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18/68 regiões de estrutura derivadas de cadeias diferentes.

[0069] A região de estrutura adequada para a cadeia pesada do anticorpo enxertado com CDR da presente invenção é derivado da sequência VH2 de subgrupo humano 3-1 2-26 junto com JH4 (SEQ ID N°: 41). Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR neutralizador que compreende pelo menos um CDR doador não humano em que a região de estrutura de cadeia pesada é derivada da sequência VH2 de subgrupo humano 3-1 2-26 junto com JH4. A sequência de JH4 humano é como segue: (YFDY)WGQGTLVTVS (SEQ ID N°: 43). O motivo YFDY é parte do CDR-H3 e não é parte da estrutura 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).

[0070] A região de estrutura adequada para a cadeia leve do anticorpo enxertado com CDR da presente invenção é derivada da sequência de VK1 do subgrupo de linha germinativa humana 2-1 1-02 junto com JK4 (SEQ ID N°: 39). Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR neutralizador que compreende pelo menos um CDR doador não humano em que a região de estrutura de cadeia leve é derivada da sequência do subgrupo humano 2-1 1-02 junto com JK4. A sequência JK4 é como segue: (LT)FGGGTKVEIK (SEQ ID N°: 44). O motivo LT é parte do CDR-L3 e não é parte da estrutura 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).

[0071] Em uma forma de realização uma estrutura pesada e/ou leve é selecionada da sequência como segue em SEQ ID N°: 39 a 42.

[0072] Também, em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as regiões de estrutura não necessita ter exatamente a mesma sequência como aquelas do anticorpo receptor. Por exemplo, os resíduos não usuais podem ser mudados para resíduos de ocorrência mais frequente para aquela classe ou tipo de cadeia receptora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de estrutura receptora podem ser mudados de modo que estes correspondem ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tais mudanças devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para

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19/68 selecionar resíduos nas regiões de estrutura receptoras que podem necessitar ser mudadas é apresentado no WO 91/09967.

[0073] Adequadamente, em um anticorpo enxertado com molécula de CDR da presente invenção, se a cadeia pesada receptora tem a sequência VH2 humana 312-26 junto com JH4, então as regiões de estrutura receptora da cadeia pesada compreendem, além de um ou mais CDRs doadores, um resíduo doador em pelo menos uma das posições 49 e 71 (de acordo com Kabat et al., (supra)) (Ver a Figura 12).

[0074] Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR, em que pelo menos os resíduos na posição 49 e 71 do domínio variável da cadeia pesada são resíduos doadores.

[0075] Os resíduos doadores são resíduos do anticorpo doador, isto é, o anticorpo do qual os CDRs foram originalmente derivados. Preferivelmente os resíduos são Glicina e Arginina nas posições 49 e 71 respectivamente.

[0076] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 31 [0077] Será estimado que uma ou mais substituições, adições e/ou anulações de aminoácido podem ser feitas para os domínios variáveis de anticorpo, fornecidos pela presente invenção, sem alterar significantemente a capacidade do anticorpo ligar ao IL-13 e para neutralizar a atividade de IL-13. O efeito de quaisquer substituições, adições e/ou anulações de aminoácido podem ser facilmente testadas por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, usando-se os métodos descritos nos Exemplos para determinar a ligação de IL-13 e/ou bloqueio de ligante/receptor.

[0078] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 31. Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95

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20/68 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 31.

[0079] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 23.

[0080] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 23. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 23.

[0081] Em uma forma de realização um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 31 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 23.

[0082] Em uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 31 and o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 23. Adequadamente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 31 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 23.

[0083] As moléculas de anticorpo da presente invenção pode compreender uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesadas e leves de comprimento total ou um fragmento destas e podem ser, mas não são limitados a Fab, Fab modificado,

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Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticorpos de domínio simples (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, anticorpos bi, tri ou tetra-valentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação de epitopo de qualquer um acima (ver por exemplo, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Os métodos para criar e fabricar estes fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165181). Outros fragmentos de anticorpo para o uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab’ descritos nos Pedidos de patente internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 e WO 2005/003171 e fragmentos Fab-dAb descritos no Pedido de patente internacional W02009/040562. Os anticorpos multivalentes podem compreender as especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficas (ver, por exemplo, WO 92/22853 e WO 05/113605).

[0084] Os domínios de região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados tendo consideração com a função proposta da molécula de anticorpo e, em particular, as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios de região constante podem ser domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, os domínios de região constante de IgG humano podem ser usados, especialmente os isotipos de lgG1 e lgG3 quando a molécula de anticorpo é pretendida para is usos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo são requeridos. Alternativamente, os isotipos de lgG2 e lgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é pretendida para os propósitos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo não são requeridos, por exemplo, para simplesmente bloquear a atividade de IL-13. Será estimado que as variantes de sequência destes domínios de região constante também podem ser usados. Por exemplo, as moléculas de lgG4 em que a serina na posição 241 foram mudadas para prolina como descrito em Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108 podem ser usados. Também será entendido por uma pessoa habilitada na técnica que os anticorpos podem passar por uma variedade de modificações póstradução. O tipo e extensão destas modificações frequentemente depende da linha

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22/68 de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo bem como as condições de cultura. Tais modificações podem incluir as variações em glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carbóxi (tal como lisina ou arginina) devidoà ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Entretanto, não existe Lisina de terminal C na cadeia pesada ou leve da forma de realização Ab652 da invenção.

[0085] Em uma forma de realização a cadeia pesada de anticorpo compreende um domínio CH1 e a cadeia leve de anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lambda.

[0086] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano em que a região constante de cadeia pesada compreende uma região de junta modificada. Consequentemente, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste de uma sequência dada na SEQ ID N°: 35 [0087] Será estimado que uma ou mais substituições, adições e/ou anulações de aminoácido podem ser feitas aos domínios variáveis e/ou constantes de anticorpo fornecidos pela presente invenção sem alterar significantemente a capacidade do anticorpo para ligação ao IL-13 e para neutralizar a atividade de IL-13. O efeito de quaisquer substituições, adições e/ou anulações de aminoácido podem ser facilmente testadas por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, usando-se os métodos descritos neste, particularmente, aqueles ilustrados nos Exemplos, para determinar a ligação de IL-13 e o bloqueio da interação de receptor de IL-13/IL-13.

[0088] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 35. Adequadamente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 35.

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23/68 [0089] Em uma forma de realização uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 27.

[0090] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 27. Por exemplo, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 27.

[0091] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste de uma sequência dada na SEQ ID N°: 35 e a cadeia leve compreende ou consiste de uma sequência dada na SEQ ID N°: 27.

[0092] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 35 e a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 27. Em geral, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 35 e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade à sequência dada na SEQ ID N°: 27.

[0093] As moléculas biológicas, tais como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, desse modo, dando a molécula de uma carga positiva ou negativa de rede. A quantidade de carga observada total dependerá da sequência de aminoácido absoluta da entidade, o ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D e as condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pl) é o pH em que uma molécula ou superfície particular não carrega uma carga elétrica de rede. Em uma forma de realização, o anticorpo ou fragmento

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24/68 de acordo com a presente divulgação tem um ponto isoelétrico (pl) de pelo menos 7. Em uma forma de realização, o anticorpo ou fragmento tem um ponto isoelétrico de pelo menos 8, tal como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 ou 9. Em uma forma de realização, o pl do anticorpo é 8.

[0094] O anticorpo de IL-13 e os fragmentos da invenção podem ser projetados para ter um ponto isoelétrico apropriado. Isto pode levar a anticorpos e/ou fragmentos com propriedades mais robustas, em particular, solubilidade adequada e/ou perfis de estabilidade.

[0095] Desta maneira, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo IL-13 humanizado projetado para ter um ponto isoelétrico diferente daquele do anticorpo originalmente identificado. O anticorpo, por exemplo, pode ser projetado pela substituição de um resíduo de aminoácido, tal como substituição de um resíduo de aminoácido, tal como substituição de um resíduo de aminoácido ácido com um ou mais resíduos de aminoácido básicos. Alternativamente, os resíduos de aminoácidos básicos podem ser adicionados ou os resíduos de aminoácido ácidos podem ser removidos. Alternativamente, se a molécula tiver um valor de pl inaceitavelmente alto podem ser introduzidos para diminuir o pH, quando requerido. O pl do anticorpo ou fragmento projetados, por exemplo, pode ser de 8 ou acima, tal como 8,5 ou 9. É importante que quando manipula-se o pl, então cuidado deve ser tomado para reter a atividade desejável do anticorpo ou fragmento. Desta maneira, em uma forma de realização o anticorpo ou fragmento projetados têm a mesma ou substancialmente a mesma atividade como o anticorpo ou fragmento não modificados.

[0096] Os programas, tais como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi tool.html, and http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, pode ser usado para predizer o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.

[0097] Em uma forma de realização, os anticorpos da presente invenção são adequados para a liberação inalada, por exemplo, por nebulização. Em um exemplo, as propriedades físicas dos anticorpos da presente invenção, por exemplo, afinidade de ligação e potência não são substancialmente alterados por nebulização. Em um exemplo, os anticorpos da presente invenção são altamente estáveis. Uma medida

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25/68 de estabilidade de anticorpo é a temperatura de fusão (Tm). A temperatura de fusão pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, usando-se Thermofluor (Ericsson et al, Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298) ou DSC (calorimetria de varredura diferencial). Preferivelmente os anticorpos forneidos pela presente invenção têm uma temperatura de fusão (Tm), tipicamente de pelo menos 75° C. Em um exemplo, o anticorpo da presente invenção tem um Tm de pelo menos 75° C. Em um exemplo o anticorpo da presente invenção tem um Tm de pelo menos 80° C. Em um exemplo o anticorpo da presente invenção tem um Tm de pelo menos 83° C.

[0098] Também é fornecida pela presente invenção uma região específica ou epítopo de IL-13 humano que é ligado por um anticorpo fornecido pela presente invenção, em particular um anticorpo que compreende uma sequência de cadeia pesada (SEQ ID N°: 35) e/ou a sequência de cadeia leve (SEQ ID N°: 27).

[0099] Esta região específica ou epítopo do polipeptídeo humano IL-13 pode ser identificado por qualquer método de mapeamento de epítopo adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos métodos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Os exemplos de tais métodos incluem a triagem de peptídeos de comprimentos variantes derivados de IL-13 para a ligação ao anticorpo da presente invenção com o fragmento menor que pode ligar-se especificamente ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo. Os peptídeos de IL-13 podem ser produzidos sinteticamente ou pela digestão proteolítica do polipeptídeo IL-13. Os peptídeos que ligam o anticorpo podem ser identificados, por exemplo, pela análise espectrométrica de massa. Em um outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou cristalografia de raio X podem ser usados para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Uma vez identificado, o fragmento epitópico que liga um anticorpo da presente invenção pode ser usado, se requerido, como um imunogênio para obter anticorpos antagonísticos adicionais que ligam o mesmo epítopo.

[00100] Os anticorpos que bloqueiam a ligação de um anticorpo de acordo com a presente invenção em particular, um anticorpo que compreende a sequência de

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26/68 cadeia pesada (SEQ ID N°: 31) e a sequência de cadeia leve (SEQ ID N°: 27) pode ser similarmente útil na antagonização da atividade de IL-13. Consequentemente, a presente invenção também fornece um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que bloqueia a ligação de qualquer um dos anticorpos descrito acima ao IL-13 humano e/ou é bloqueado da ligação de IL-13 por qualquer um daqueles anticorpos. Em uma forma de realização, um tal anticorpo liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo descrito neste acima. Em uma outra forma de realização o anticorpo de neutralização de bloqueio liga-se a um epítopo que limita e/ou que se sobrepõe com o epítopo ligado por um anticorpo descrito acima. Em uma outra forma de realização, o anticorpo que neutraliza o bloqueio deste aspecto da invenção não liga ao mesmo epítopo como um anticorpo da presente invenção ou um epítopo que limita e/ou sobrepõem com o dito epítopo.

[00101] Os anticorpos de bloqueio podem ser identificados por qualquer método adequado na técnica, por exemplo, usando-se os ensaios ELISA ou BIAcore de competição onde a ligação do anticorpo de bloqueio ao IL-13 humano evita a ligação de um anticorpo da presente invenção ou vice versa.

[00102] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que bloqueia a ligação de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência mostrada na SEQ ID N°: 35 e cuja cadeia leve compreende a sequência mostrada na SEQ ID N°: 27 ao IL-13 humano. Em uma forma de realização os anticorpos de bloqueio forneidos pela presente invenção inibem a ligação de um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°: 35 e a sequência de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°: 27 por mais do que 80 %, por exemplo, por mais do que 85 %, tal como por mais do que 90 %, em particular por mais do que 95 %.

[00103] Alternativamente ou, além disso, os anticorpos antagonísticos de acordo com este aspecto da invenção podem ser bloqueados a partir da ligação ao IL-13 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°: 35 e a sequência de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°: 27. Portanto, também é fornecido, uma molécula de anticorpo antagonístico tendo

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27/68 especificidade para IL-13 humano que é reticulado a partir da ligação de IL-13 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°: 35 e a sequência de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°: 27. Em uma forma de realização os anticorpos antagonísticos forneidos por este aspecto da invenção são inibidos pela ligação de IL-13 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°: 35 e a sequência de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°: 27 por mais do que 80 %, por exemplo, por mais do que 85 %, tal como por mais do que 90 %, em particular por mais do que 95 %.

[00104] Em uma forma de realização, os anticorpos de bloqueio fornecidos pela presente invenção são totalmente humanos. Em uma forma de realização os anticorpos de bloqueio fornecidos pela presente invenção são humanizados. Em uma forma de realização, os anticorpos de bloqueio fornecidos pela presente invenção têm uma afinidade para IL-13 humano de 100 pM ou melhor. Em uma forma de realização, os anticorpos de bloqueio fornecidos pela presente invenção têm uma afinidade para IL-13 humano de 50 pM ou melhor.

[00105] Em uma forma de realização, o anticorpo de bloqueio tem um ponto isoelétrico de pelo menos 7, por exemplo, pelo menos 8, tal como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0.

[00106] As moléculas de anticorpo da presente invenção adequadamente têm uma afinidade de ligação alta, em particular afinidade picomolar. A afinidade pode ser medida usando-se qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo ressonância de Plasmon de superfície, incluindo BIAcore como descrito nos Exemplos neste usando-se IL-13 natural ou recombinante isolados. Em um exemplo, a afinidade é medida usando-se IL-13 humano recombinante como descrito no Exemplos neste. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 50 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca

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28/68 de 40 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 30 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção tern uma afinidade de ligação de cerca de 20 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção é totalmente humana ou humanizada e tem uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor. Em uma forma de realização, a molécula de anticorpo da presente invenção é totalmente humana ou humanizada e tem uma afinidade de ligação de 30 pM ou melhor.

[00107] Será estimado que a afinidade de anticorpos fornecida pela presente invenção possa ser alterada usando-se qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção, portanto, também diz respeito a variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, tendo uma afinidade melhorada para IL-13. Tais variantes podem ser obtidas por diversos protocolos de maturação por afinidade incluindo as mutações de CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mistura de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mistura de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), apresentação de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) debate estes métodos de maturação por afinidade.

[00108] Em uma forma de realização, as moléculas de anticorpo da presente invenção bloqueiam a interação entre IL-13 e um receptor de IL-13, em particular as moléculas de anticorpo da presente invenção bloqueiam a interação entre IL-13 e IL13Ra1 e a interação entre IL-13 e IL-13 Ra2. Os numerosos ensaios adequados para determinar a capacidade de um anticorpo em bloquear esta interação são descritos nos exemplos neste. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo neutralizador tendo especificidade para IL-13 humano. Em uma forma de realização o receptor de IL-13 humano usado no ensaio é IL-13 Ra1 humano natural ou IL-13 Ra2 humano natural. Em uma forma de realização, o receptor de IL-13 humano usado neste ensaio é IL-13 Ra1 humano recombinante ou

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IL-13 Ra2 humano recombinante. Em uma forma de realização, o IL-13 humano usado no ensaio é IL-13 humano recombinante. Em uma forma de realização, o anticorpo neutralizador é um anticorpo humanizado ou totalmente humanizado ou fragmento deste.

[00109] Se desejado, um anticorpo para o uso na presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais moléculas efetoras. Será estimado que a molécula efetora pode compreender uma molécula efetora simples ou duas ou mais tais moléculas ligadas desta maneira a fim de formar uma porção simples que pode ser ligada aos anticorpos da presente invenção. Quando é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, este pode ser preparado pelos procedimentos de DNA químicos ou recombinantes padrão em que o fragmento de anticorpo é ligado indiretamente ou por intermédio de um agente de ligação à molécula efetora. As técnicas para a conjugação de tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos no WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03031581. Alternativamente, quando a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo, a ligação pode ser atingida usando-se procedimentos de DNA recombinantes, por exemplo, como descrito em WO 86/01533 e EP 0392745.

[00110] O termo molécula efetora como usado neste inclui, por exemplo, agentes antineoplásticos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, polímeros de ocorrência sintéticas ou naturais, ácidos nucléicos e fragmentos destes, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos destes, radionuclídeos, particularmente, radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórteres, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR.

[00111] Os exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes

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30/68 citotóxicos incluindo qualquer agente que é nocivo às células (por exemplo, mortes). Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, diidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes.

[00112] As moléculas efetoras também incluem, mas não limitam-se a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamine, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[00113] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclíceos quelados tais como ¹¹¹ln e ⁹⁰Y, Lu¹⁷⁷, Bismuto²¹³, Californio²⁵², Irídio¹⁹² e Tungstênio¹⁸⁸/Rênio¹⁸⁸ ou medicamentos, tais como mas não limitados a, alquilfosfocolinas, inibidores de topoisomerase I, taxóides e suramina.

[00114] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não limitam-se a, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas, toxinas, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria, uma proteína, tal como insulina, fator de necrose de tumor, oc-interferon, β-interferon, fator de desenvolvimento de nervo, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti

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31/68 angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina ou um modificador de resposta biológica tal como um linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator estimualdor da colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator estimualdor da colônia de granulócito (G-CSF), fator de desenvolvimento de nervo (NGF) ou outro fator de desenvolvimento e imunoglobulinas.

[00115] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos proféticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais emissores de positron (para uso na tomografia emissora de positron) e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver, em geral, Patente U. S. N° 4,741,900 para íons metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para o uso como diagnóstico. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, betagalactosidase ou acetilcolinoesterase; os grupos proféticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; os materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; os materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais blioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina e nuclídeos radioativos adequados incluem ¹²⁵l, ¹³¹l, ¹¹¹lneTc.

[00116] Em um outro exemplo, a molécula efetora pode aumentar a vida média do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou intensificar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas ligantes de albumina ou compostos de ligação de albumina tais como aqueles descritos no WO 05/117984.

[00117] Quando a molécula efetora é um polímero, este, em geral, pode ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído, polialquenileno ou polímero de polioxialquileno ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um

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32/68 homo- ou hétero- polissacarídeo.

[00118] Os substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[00119] Os exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol), poli(propilenoglicol) poli(álcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos ou derivados destes, especialmente poli(etilenoglicol) opcionalmente substituído, tal como metoxipoli(etilenoglicol) ou derivados destes.

[00120] Os polímeros de ocorrência natural específicos incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados destes.

[00121] Derivados como usado neste é pretendido incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos de tiol, tais como maleimidas e outros. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento de ligante ao polímero. Será estimado que o resíduo de cada grupo, em alguns exemplos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[00122] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas será geralmente em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, por exemplo, de 5000 a 40000 Da tal como de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero pode ser em particular selecionado na base no uso pretendido do produto, por exemplo, capacidade de localizar certos tecidos tal como tumores ou estende-se da circulação da vida média (para resumo ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Deste modo, por exemplo, onde o produto é pretendido conduzir a circulação e penetrar o tecido e este pode ser vantajoso para usar um polímero de peso molecular menor, por exemplo, com um peso molecular em tomo de 5000 Da. Para as aplicações onde o produto permanece na circulação, este pode ser vantajoso para usar um polímero de peso molecular maior, por exemplo, tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.

[00123] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como

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33/68 um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um derivado destes e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

[00124] Em um exemplo os anticorpos para uso na presente invenção são ligados as porções de poli(etilenoglicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia secundária de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer amino livre, imino, tiol, grupo de hidroxila ou carboxila. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou pode ser projetado no fragmento usando métodos de DNA recombinantes (ver por exemplo, U.S. 5.219.996; U.S. 5.667.425; WO 98/25971). Em um exemplo uma molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição a extremidade de terminal C da uma cadeia pesada ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetiva. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de junta modificada contendo um ou mais resíduos de cisteínas em que a molécula efetiva pode ser ligada. Os locais múltiplos podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas PEG.

[00125] Adequadamente as moléculas PEG podem ser covalentemmente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligado ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação de bissulfeto ou, em particular, uma ligação de carbono-enxofre. Onde um grupo tiol é usado como o ponto de ligação apropriadamente as moléculas efetivas apropriadamente ativadas, por exemplo, derivados seletivos de tiol tal como maleimidas e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmento-polímero de anticorpo modificado como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo de tiol tal como um ácido ou éster ou ácido a

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34/68 halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um bissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polimers Inc., Huntsville, AL, USA) ou pode ser preparado a partir do material de partida comercialmente disponível usando procedimentos químicos convencionais. As moléculas PEG particulares incluem 20K metóxi-PEG-amina (obtido de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polimere; e SunBio) e M-PEG-SPA (obtido de Nektar, anteriormente Shearwater).

[00126] Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento Fab ou diFab modificado que é PEGilado, isto é tem PEG (poli(etilenoglicol)) covalentemente ligado deste, por exemplo, de acordo com o método divulgado em EP 0948544 ou EP 1090037 [ver também Poly(etileneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova Iorque, Poly(etileneglycol) Chemistry and Biological Applications, 1997, J. Milton Harris and

S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545], Em um exemplo PEG é ligado a uma cisteína na região de junta. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG tem um grupo de maleimida covalentemente ligado a um grupo de tiol simples em uma região de junta modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo de maleimida e a cada um dos grupos de amina no resíduo de lisina pode ser ligado ao polímero de metoxipoli(etilenoglicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab pode ser portanto aproximadamente 40.000 Da.

[00127] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo antagonístico tendo especificidade para IL-13 humano, que é um fragmento modificado Fab’ tem uma cadeia pesada que compreende uma sequência dada na SEQ ID N°: 35 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 27 e tendo na extremidade de terminal C desta cadeia pesada da região

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35/68 de junta modificada contendo pelo menos um resíduo de cisteína no qual uma molécula efetiva é ligada. Adequadamente a molécula efetiva é PEG e é ligada usando os métodos descritos em (WO 98/25971 e WO 2004072116 ou em WO 2007/003898. As moléculas efetivas podem ser ligadas aos fragmentos de anticorpos usando os métodos descritos nos Pedidos de Patente Internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 e WO 2005/003171.

[00128] Em uma forma de realização o anticorpo ou fragmento não é ligado a uma molécula efetiva.

[00129] A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica as cadeias pesadas e/ou leves de uma molécula de anticorpo da presente invenção. Adequadamente, a sequência de DNA codifica a cadeia leve ou pesada de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzido pelo procedimento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação deste.

[00130] As sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção pode ser obtido pelos métodos bem conhecidos por aquela pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, sequências de DNA codificadas por parte ou todos da cadeia leve e pesada de anticorpo pode ser sintetizado como desejado a partir das sequências de DNA determinadas ou na base das sequências de aminoácidos correspondentes.

[00131] O DNA codificado para as sequências de estrutura auxiliar é amplamente disponível àquela pessoa habilitada na técnica e pode ser prontamente sintetizado na base de suas sequências de aminoácidos conhecidas.

[00132] As técnicas padrão da biologia molecular podem ser usadas para preparar as sequências de DNA codificadas pela molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando as técnicas de oligonucleotídeos. As técnicas de mutagênese direcionada ao local e reação de cadeia de polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriadas.

[00133] Exemplos de sequências adequadas são fornecidos neste. Um peptídeo

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36/68 de sinal adequado para a cadeia pesada pode ser codificado neste tal como o peptídeo de sinal de murino MEWSWVFLFF LSVTTGVHS ( SEQ ID N°: 45). Um peptídeo de sinal adequado para a cadeia leve pode ser codificado neste tal como o peptídeo de sinal de murino MSVPTQVLGL LLLWLT DARC (SEQ ID N°: 46) que é clivado para dar uma molécula de anticorpo antagonístico da presente invenção. A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada codifica uma cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção que compreende SEQ ID N°: 32, 34 ou 36 ou 38. A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada codificada uma cadeia leve de um anticorpo da presente invenção que compreende SEQ ID N°: 24, 26, 28 ou 30.

[00134] Os métodos gerais pelos vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos àquela pessoa habilitada na técnica. Neste respeito, a referência é feita por Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova Iorque and the Maniatis Manual produzido pelo Cold Spring Harbor Publishing.

[00135] Também é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA codificando um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema de vetor/célula hospedeira adequada pode ser usado pela expressão das sequências de DNA que codificou uma molécula de anticorpo da presente invenção. Os sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli e outros sistemas microbianos podem ser usados ou eucariótico, por exemplo, mamífero, sistemas de expressão da célula hospedeira também podem ser usados. As células hospedeiras de mamíferos adequados incluem CHO, mieloma ou células de hibridoma.

[00136] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para conduzir a expressão da proteína a partir do DNA codificado de uma molécula de anticorpo da presente invenção e isolamento de uma molécula de anticorpo.

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37/68 [00137] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia leve ou pesado, em que caso apenas uma sequência que codifica o polipeptídeo de cadeia leve ou pesada necessita ser transfectado pelas células hospedeiras. Para a produção de produtos que compreendem as cadeias leves e pesadas, a linha celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um vetor simples pode ser usado, o vetor incluindo as sequências codificadas dos polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[00138] Os anticorpos e fragmentos de acordo com a presente divulgação são expressados nos bons níveis a partir das células hospedeiras. Deste modo as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos parecem otimizar e conduzir o processamento comercial.

[00139] Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição diagnostica ou farmacêutica que compreende uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. Consequentemente, fornecido é o uso de um anticorpo da invenção para a fabricação de um medicamento. A composição será usualmente fornecida como parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente incluirá um carreador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode adicionalmente compreender um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00140] A presente invenção também fornece um processo para uma preparação de uma composição diagnostica ou farmacêutica que compreende adição e mistura de uma molécula de anticorpo da presente invenção junto com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[00141] A molécula de anticorpo pode ser o ingrediente ativo único na composição diagnostica ou farmacêutica ou pode ser acompanhado por outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo, anti-TNF, anti- IL-1 β,

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38/68 anti-célula T, anti-IFNy ou anticorpos anti-LPS, ou não ingredientes de anticorpo tal como xantinas. Outros ingredientes ativos adequados incluem anticorpos capazes de induzir a tolerância, por exemplo, anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4.

[00142] Ainda em uma forma de realização o anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a descoberta é utilizado em combinação com um agente farmaceuticamente ativo adicional, por exemplo, um corticoesteróide (tal como propionato de fluticasona) e/ou um beta-2-agonista (tal como salbutamol, salmeterol ou formoterol) ou inibidores do desenvolvimeno celular e proliferação (tal como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) ou alternativamente um inibidor de CD28 e/ou CD40. Em uma forma de realização o inibidor é uma molécula menor. Em outra forma de realização o inibidor é um anticorpo específico ao alvo.

[00143] As composições farmacêuticas adequadamente compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo da invenção. O termo quantidade terapeuticamente efetiva como usado neste refere-se a uma quantidade do agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou evitar uma doença ou condição alvejada, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura celular ou em modelos de animais, usualmente em roedores, coelhos, porcos ou primatas. O modelo animal pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração. Tal informação pode ser então usada para determinar as dosagens úteis e vias de administração em humanos.

[00144] A quantidade terapeuticamente efetiva precisa para um paciente humano dependerá da gravidade do estado da doença, a saúde geral do paciente, a idade, peso e sexo do paciente, dieta, tempo e frequência de administração, combinação de medicamento, sensibilidade de reação e tolerância/resposta a terapia. Esta quantidade pode ser determinada pelo experimento de rotina e está dentro de um julgamento do médico. Geralmente, a quantidade terapeuticamente efetiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Alternativamente, a dosagem pode ser 1 a 500 mg por dia tal como 10 a 100, 200, 300 ou 400 mg por

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39/68 dia. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentados nas formas de dosagem unitária contendo uma quantidade pré-determinada de um agente ativo da invenção.

[00145] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo, simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormônios.

[00146] A dosagem em que a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada dependendo da natureza da condição a ser tratada, a extensão da inflamação presente e se molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.

[00147] A frequência da dosagem depende da vida média da molécula de anticorpo e a duração deste efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma vida média curta (por exemplo, 2 a 10 horas) pode ser necessário para dar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se uma molécula de anticorpo tem uma vida média longa (por exemplo, 2 a 15 dias) pode ser apenas necessário para dar uma dosagem uma vez por dia, uma vez pode semana ou ainda uma vez a cada 1 ou 2 meses.

[00148] O carreador farmaceuticamente aceitável não deve por si ó induzir a produção dos anticorpos nocivos ao indivíduo que recebe uma composição e não deve ser tóxico. Os carreadores adequados podem ser macromoléculas metabolizadas levemente amplas tal como proteínas, polipeptídeos, lipossomos, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inativos.

[00149] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácido mineral, tal como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tal como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00150] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos tal como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tal como agentes de umectação ou emulsificação ou substâncias de tamponação de pH, podem estar

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40/68 presentes em tais composições. Tais carreadores capazes das composições farmacêuticas a serem formulados como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para a ingestão pelo paciente.

[00151] As formas adequadas para a administração incluem as formas adequadas para a administração parenteral, por exemplo, pela injeção ou infusão, por exemplo, pela injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto é para a injeção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo aquoso ou oleoso e este pode conter os agentes formuladores, tal como agentes de suspensão, conservantes, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode ser na forma seca, para a reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.

[00152] Uma vez formulado, a composição da invenção pode ser administrada diretamente ao paciente. Os pacientes a serem tratados podem ser animais. Entretanto, em uma ou mais formas de realizações as composições são adaptadas para a administração aos pacientes humanos.

[00153] Em uma forma de realização, nas formulações de acordo com a presente divulgação, o pH da formulação final não é similar ao valor do ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento, se o pH da formulação for 7 então um pl de 8-9 ou acima pode ser apropriado. Enquanto não deseja ser ligado pela teoria este é considerado que este pode ultimamente fornecer uma formulação final com a estabilidade melhorada, por exemplo, o anticorpo ou fragmento permanece na solução.

[00154] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitado a, vias, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver WO98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser usadas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões. As formas sólidas adequadas para a solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também

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41/68 podem ser preparados. Preferivelmente as moléculas de anticorpo da presente invenção são administradas subcutaneamente, por inalação ou topicamente.

[00155] A liberação direta das composições será geralmente acompanhada pela injeção, subcutaneamente, intraperitoneamente, intravenosamente ou intramuscularmente, ou liberada ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas em um tecido específico de interesse. O tratamento de dosagem podem ser uma lista de dosagem simples ou uma lista de dosagem múltipla.

[00156] Será apreciado que o ingrediente ativo em uma composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será susceptível a degradação no trato gastrointestinal. Deste modo, se uma composição será administrada pela via usando o trato gastrointestinal, a composição necessitará para conter os agentes que protegerão o anticorpo da degradação mas que libera o anticorpo uma vez que este foi absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[00157] O debate completo do carreador farmaceuticamente aceitável está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

[00158] Em uma forma de realização a formulação é fornecida como uma formulação para a administração tópica incluindo inalação.

[00159] As preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis medidos contendo gases propelentes ou soluções inaláveis livres de gases propelentes (tal como soluções nebulisáveis ou suspensões). Os pós inaláveis de acordo com a divulgação contendo a substância ativa podem consistir unicamente das substâncias ativas anteriormente mencionadas ou de uma mistura das substâncias ativas mencionadas acima com excipiente fisiologicamente aceitáveis.

[00160] Os pós inaláveis podem incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo- e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), polialcoóis (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio) ou misturas destes com um outro. Mono- ou dissacarídeos são adequadamente usados, o uso de

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42/68 lactose ou glicose, particularmente, mas não exclusivamente na forma de seus hidratas.

[00161] As partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula menos do que 10 microns, tal como 1-9 microns por exemplo, de 0,1 a 5 pm, em particular de 1 a 5 pm. O tamanho particular do ativo (tal como o anticorpo ou fragmento é de importância primária).

[00162] Os gases propelentes que podem ser usados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Os gases propelentes adequados são selecionados entre os hidrocarbonetos tal como n-propano, n-butano ou isobutano e haloidrocarbonetos tal como derivados cloretados e/ou fluoretados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propelentes anteriormente mencionados podem ser usados em si próprios ou em misturas destes.

[00163] Os gases propelentes particularmente adequados são derivados de alcano halogenados selecionados de entre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarbonetos halogenados mencionados acima, TG134a (1,1,1,2tetrafluoroetano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) e misturas destes são particularmente adequados.

[00164] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelente também podem conter outros ingredientes tal como co-solventes, estabilizadores, agentes ativos de superfície (sobrenadantes), antioxidantes, lubrificantes e meios para o ajuste de pH. Todos estes ingredientes são conhecidos na técnica.

[00165] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelente de acordo com a invenção podem conter até 5 % em peso da substância ativa. Os aerossóis de acordo com a invenção contém, por exemplo, 0,002 a 5 % em peso, 0,01 a 3 % em peso, 0,015 a 2 % em peso, 0,1 a 2 % em peso, 0,5 a 2 % em peso ou 0,5 a 1 % em peso do ativo.

[00166] Alternativamente as administrações tópicas ao pulmão também podem ser pela administração de uma solução líquida ou formulações de suspensão, por exemplo, utilizando um dispositivo tal como um nebulizador, por exemplo, um

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43/68 nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[00167] Em uma forma de realização a formulação é fornecida como ampolas discretas contendo uma dosagem unitária para a liberação pela nebulização.

[00168] Em uma forma de realização o anticorpo é fornecido na forma liofilizada, para reconstituição ou alternativamente como uma formulação de suspensão.

[00169] O anticorpo da invenção pode ser liberado, dispersado em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão. Este pode ser recolocado em suspensão em uma solução fisiológica apropriada, por exemplo, solução salina fisiológica, um solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tamponadas conhecidas na técnica podem conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de disódio, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCI, 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro e 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água de modo como para atingir um pH de cerca de 4,0 a 5,0. Como supra mencionado, uma suspensão pode fabricar, por exemplo, a partir do anticorpo liofilizado.

[00170] As formulações de suspensões ou soluções terapêuticas também podem conter um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem os tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonate), aminoácidos, uréia, alcoóis, ácido ascórbico, fosfolipídeos, proteínas (por exemplo, albumina de soro), EDTA, cloreto de sódio, lipossomos, manitol, sorbitol e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsulados em lipossomos ou microesferas biodegradáveis. A formulação será geralmente fornecida em uma forma substancialmente estéril utilizando os processos de fabricação estéreis.

[00171] Este pode incluir a produção e esterilização pela filtração da solução de solvente tamponada usada pela formulação, suspensão asséptica do anticorpo na solução de solvente tamponado estéril e dispersão da formulação nos receptáculos estéreis pelos métodos familiares aquela pessoa com habilidade comum na técnica.

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44/68 [00172] A formulação nebulizável de acordo com a presente divulgação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dosagens simples (por exemplo, recipientes plásticos selados ou frascos) embalados nos envelopes de folha metálica. Cada frasco contendo uma dosagem unitária em um volume, por exemplo, 2 ml, de tampão de solvente/solução.

[00173] Os anticorpos da presente divulgação consideram ser adequados para a liberação por intermédio da nebulização.

[00174] Também é considerado que o anticorpo da presente invenção pode ser administrado pelo uso da terapia do gene. A fim de atingir este, sequências de DNA codificadas das cadeias pesadas e leves da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA apropriados são introduzidos em um paciente tal que as cadeias de anticorpo são expressados a partir da sequência de DNA e reunido in situ.

[00175] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo (ou composições que compreende o mesmo) para uso no controle das doenças inflamatóhas, por exemplo, doença inflamatória crônica ou aguda. Adequadamente, a molécula de anticorpo (ou composições que compreende o mesmo) pode ser usada para reduzir o processo inflamatóho ou para evitar o processo inflamatóho. Em uma forma de realização aqui é fornecido uma redução in vivo das células T ativadas, em particular aquelas envolvidas nas respostas imunes inflamatóhas inaprophadas, por exemplo, recrutadas à adjacência/localização de uma tal resposta.

[00176] A redução de células T ativadas, como utilizado neste, pode ser uma redução, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou mais por cento em comparação antes do tratamento ou sem tratamento.

[00177] Vantajosamente, o tratamento com um anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção, pode permitir a redução no nível de células T ativadas, sem reduzir o nível geral dos pacientes de células T (células T inativadas). Este pode resultar em poucos efeitos colaterais e possivelmente evitar a anulação de célula T no paciente.

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45/68 [00178] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo da presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado por IL-13 ou associado com um nível aumentado de IL-13.

[00179] A condição ou distúrbio patológico, pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consiste de infecções (virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas), choque endotóxico associado com infecção, artrite tal como artrite reumatóide, asma tal como asma grave, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença do intestino inflamatório, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Peyronie, doença celíaca, doença de vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, doença de lime, meningoencefalite, uveíte autoimune, distúrbios inflamatórios mediados imunes do sistema nervoso periférico e central tal como esclerose múltipla, lupus (tal como lúpus eritematoso sistêmico) e síndrome de Guillain-Barr, dermatite atópica, hepatite autoimune, alveolite fibrolar, doença de Grave, nefropatia IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Meniere, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, escleroderma, granulomatose de Wegener, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença hospedeira versos enxertos, rejeição de transplante, doença do coração incluindo as doenças tal como infarto do miocárdio bem como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipocloridia.

[00180] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia da dor, particularmente dor associada com a inflamação.

[00181] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção reduz a resistência ao tratamento da inflamação, particularmente resistência pulmonar ao tratamento da inflamação.

[00182] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção reduz os níveis de proteína IL-13 no tecido bronquial, por exemplo, em comparação aos níveis antes do tratamento. A redução pode ser 5, 10, 20, 30, 40 % ou mais.

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46/68 [00183] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção reduz os níveis de proteína IL-13 no fluido de lavagem nasal e/ou fluido broncoalveolar, por exemplo, em comparação aos níveis antes do tratamento. A redução pode ser 5, 10, 20, 30, 40 % ou mais.

[00184] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção reduz o influxo eosinofílico, por exemplo, em comparação aos níveis antes do tratamento. A redução pode ser 5, 10, 20, 30, 40 % ou mais, por exemplo, quando tratado por 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais semanas.

[00185] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é adequado para a redução dos níveis inapropriados das células cálice, por exemplo, no tratamento da hiperplasia da célula cálice, tal como hiperplasia da célula cálice. A redução pode ser observada após o tratamento por 1,2,3, 4, 5, 6 ou mais semanas.

[00186] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é adequada para a redução dos níveis do oxido nítrico exalado (FeNO), em comparação aos níveis antes do tratamento. O oxido nítrico exalado é considerado ser um fator de risco ou fabricante para a inflamação pulmonar.

[00187] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é adequado para a prevenção da deposição do colágeno inapropriado associado com as respostas inflamatórias, em particular deposição de colágeno peribronquial.

[00188] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a invenção é adequado para evitar a angiogênese inapropriada associada com as respostas inflamatórias.

[00189] Deste modo é fornecido um anticorpo de acordo com a invenção para uso no tratamento e método de tratamento utilizando o mesmo.

[00190] O anticorpo de acordo com a invenção como utilizado neste também refere-se aos fragmentos e derivados divulgados na especificação.

[00191] A presente invenção ainda fornece o uso de uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado por IL-13 ou associado com um nível aumentado de IL-13, por exemplo,

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47/68 como descrito neste, em particular o distúrbio patológico é artrite reumatóide, asma ou COPD.

[00192] A presente invenção ainda fornece o uso de uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma ou mais indicações médicas descritas neste.

[00193] Uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia onde este é desejado reduzir os efeitos de IL-13 no corpo humano ou animal. IL-13 pode ser circulado no corpo ou pode estar presente em um nível alto indesejado localizado em um tamanho particular no corpo, por exemplo, um local de inflamação.

[00194] Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção ou uma composição que compreende o mesmo é usado para o controle da doença inflamatória, por exemplo, como descrito neste.

[00195] A presente invenção também fornece um método de tratamento dos pacientes humanos ou animais que sofrem de ou em risco de um distúrbio mediado por IL-13, o método que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo da presente invenção, ou uma composição que compreende o mesmo. Em um exemplo a molécula de anticorpo é administrado por inalação.

[00196] Em um exemplo o distúrbio é selecionado de qualquer uma das indicações médicas fornecidas acima. Em um exemplo o distúrbio é selecionado do grupo que consiste de: distúrbios asmáticos, distúrbios atópicos, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), condições que envolvem a inflamação das vias aéreas, eosinofilia, fibrose e produção de muco em excesso, condições inflamatórias, condições autoimunes, tumores ou cânceres, infecção viral e supressão da expressão de respostas imunes tipo 1 protetoras.

[00197] Em uma forma de realização é fornecido um processo para a purificação de um anticorpo (em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção).

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48/68 [00198] Em uma forma de realização é fornecido um processo para a purificação de um anticorpo (em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção) que compreende as etapas:

[00199] Realização da cromatografia de troca de ânion no modo de não ligação tal que as impurezas são retidas na coluna e o anticorpo é mantido na fração não ligada. A etapa pode, por exemplo, ser realizada em um pH cerca de 6-8.

[00200] O processo ainda pode compreender uma etapa de captura inicial utilizando a cromatografia de troca de cátion, realizado por exemplo, em um pH de cerca de 4 a 5.

[00201] O processo ainda pode compreender as etapas de cromatografia adicionais para garantir o produto e processo relacionado as impurezas são apropriadamente resolvidos a partir da corrente do produto.

[00202] O processo de purificação também pode compreender uma ou mais ultrafiltração, tal como uma etapa de concentração e diafiltração.

[00203] Deste modo em uma forma de realização é fornecido um anticorpo IL-13 purificado ou fragmento, por exemplo, um anticorpo ou fragmento humanizado, em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, na forma substancialmente purificada de, em particular livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteína de célula hospedeira ou DNA. Tendo dito, os anticorpos de acordo com a presente invenção serão geralmente preparados nas células de mamíferos e deste modo o conteúdo de endotoxina não será geralmente uma questão. De fato, o conteúdo de endotoxina é mais uma consideração quando os anticorpos são preparados nas células bacterianas.

[00204] A forma purificada como usada supra é pretendida referir pelo menos 90 % de pureza, tal como 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p ou mais puro.

[00205] Substancialmente livre de endotoxinas é geralmente pretendido referir a um conteúdo de endotoxina de 1 EU por mg do produto de anticorpo ou menos tal como 0,5 ou 0,1 EU por mg de produto.

[00206] Substancialmente livre da proteína de célula hospedeira ou DNA é geralmente pretendido referir-se a proteína de célula hospedeira e/ou conteúdo de

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DNA 400 pg por mg do produto de anticorpo ou menos tal como 100 pg por mg ou menos, em particular 20 pg por mg, como apropriado.

[00207] A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser usada no diagnóstico, por exemplo, no diagnóstico in vivo e formação de imagem do estado da doença que envolve IL-13.

[00208] Os ensaios in vivo adequados para o teste das propriedades dos anticorpos de acordo com a invenção incluem: modelo de pequenos acarinos domésticos crônicos, hipersensibilidade ao modelo de ovalbumina e/ou metacolina da inflamação pulmonar alérgica.

[00209] Compreendendo no contexto da presente especificação é pretendido significar incluindo.

[00210] Onde as formas de realizações tecnicamente apropriadas da invenção podem ser combinadas.

[00211] As formas de realizações são descritas neste como compreendendo certas características/elementos. A divulgação também estende-se para separar as formas de realizações que consistem ou consistindo essencialmente dos ditos elementos/características.

[00212] A presente invenção é ainda descrita pela maneira da ilustração apenas nos seguintes exemplos, que refere-se as figuras anexas, em que:

[00213] Figura 1 mostra: a sequência de aminoácido para cada um dos CDR 1, 2, 3 a partir da cadeia pesada (CDR H) e CDR 1, 2, 3 a partir da cadeia leve (CDR L) (SEQ ID N°: 1-6);

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 7);

sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 8) e a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 9).

[00214] Figura 2 mostra a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de

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50/68 anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 10);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 11);

a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 12);

a sequência de aminoácido para a cadeia leve de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 13).

[00215] Figura 3 mostra a sequência de DNA para a cadeia leve de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 14);

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 15);

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 16) a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 17).

[00216] Figura 4 mostra a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 18);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 19).

[00217] Figura 5 mostra a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo de rato (SEQ ID N°: 20);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 21).

[00218] Figura 6 mostra a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo de rato com sequência de sinal (SEQ ID N°: 22).

[00219] Figura 7 mostra a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve

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51/68 de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 23);

a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 24);

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 25);

a sequência de DNA para a região variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 26);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 27).

[00220] Figura 8 mostra a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 28);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 29);

a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia leve de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 30).

[00221] Figura 9 mostra a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 31);

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 32);

a sequência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 33);

a sequência de DNA para a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 34);

a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 35).

[00222] Figura 10 mostra a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 36);

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52/68 a sequência de aminoácido para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado com sequência de sinal (SEQ ID N°: 37);

a sequência de DNA para a região constante e variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado (SEQ ID N°: 38).

[00223] Figura 11 mostra aminoácido e sequências de DNA para estrutura auxiliar VK 1 2-1(1)02 JK4 humano (SEQ ID N°: 39 e SEQ ID N°: 40) e estrutura auxiliar VH2 3-1 226 JH4 (SEQ ID N°: 41 e SEQ ID N°: 42).

[00224] Figura 12 mostra um alinhamento das cadeias leves para as cadeias leves humanizadas e as estruturas auxiliares de rato e também cadeias pesadas. CDRs estão em negrito e sublinhado. Resíduos de doadores G49 e R71 estão em negrito, itálico e destacados.

[00225] Figura 13 Efeito de Ab652 em BAL eotaxina-3 medido de 24 horas após o desafio de alérgeno em um modelo primata não humano de asma. Os dados são expressados como média + SEM, n=4-8 por grupo.

[00226] Figura 14. Efeito de Ab652 na contagem eosinofílica BAL medida de 24 horas após o desafio de alérgeno em um modelo primata não humano de asma. Os dados são normalizados pela contagem eosinofílica BAL medida na fase de triagem do estudo. Média + SEM, n=4-8 por grupo.

[00227] Figura 15. Efeito de Ab652 no pico de resistência de vias aéreas medindo até 15 minutes após o desafio de alérgeno em um modelo primata não humano de asma. Os dados são expressados como média ± SEM, n=4-8 por grupo.

[00228] Figura 16. Efeito de Ab652 na resistência de vias aéreas 24 horas após o desafio de alérgeno em um modelo primata não humano de asma. Os dados são normalizados a resistência de vias aéreas medido antes da exposição ao alérgeno. Média ± SEM, n=4-8 por grupo.

[00229] EXEMPLOS

1. Geração/seleção de anticorpo terapêutico [00230] Os ratos foram imunizados com IL-13 humano purificado (Peprotech) ou

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53/68 fibroblastos de rato que expressam IL-13 humano (expressando aproximadamente 1 ug/ml no sobrenadante de cultura), ou em alguns casos, uma combinação de dois. Seguindo 3 a 6 doses, os animais foram sacrificados e PBMC, baço, medula óssea e linfonodos coletados. O soro foi monitorado para ligação ao IL-13 humano em ELISA e também para a capacidade de neutralizar hlL-13 no ensaio celular repórter HEK293 STAT-6 (ensaio HEK-Blue, Invivogen).

[00231] As culturas SLAM (culturas celulares B) foram preparadas pelo método similar aquele descrito por Zubler et al. (J. Immunol. 1985). Brevemente, 500-5000 esplenócitos ou PBMC de um animal imunizado foram cultivados em bateladas de placas de 96 reservatórios com 200 μΙ/reservatório de meio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado com 10 % de FCS (PAA laboratories ltd), 2 % de HEPES (Sigma Aldrich), 1 % de L-glutamina (Gibco BRL), 1 % de solução de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL), 0,1 % de β-mercaptoetanol (Gibco BRL), 3 % de sobrenadante de cultura de esplenócito de coelho ativado e células de timona de murino EL-4-B5 irradiado por gama (5 x 10^A4/reservatório) por 7 dias a 37° C em uma atmosfera de 5 % de CO2. Os sobrenadantes de cultura de célula B foram testados nos ensaios de triagem e sobrenadantes positivos consolidados nas placas principais. As células B cultivadas foram congeladas a -80° C em 100 qL de 10 % de DMSO em FCS.

[00232] Os sobrenadantes de cultura SLAM foram primeiro triados por sua capacidade para ligar hlL-13 em um ensaio com base de pérola no FMAT. Este foi um ensaio homogêneo usando IL-13 humano biotinilado revestido nas pérolas de estreptavidina e um conjugado de Fc-Cy5 anti-rato de cabra. Os positivos deste ensaio foram então alimentados no ensaio de célula repórter HEK-293 IL-13R-STAT6 (ensaio HEK-Blue, Invivogen) para identificar os neutralizadores. Os sobrenadantes de neutralização foram então formados os perfis no Biacore para estimar taxa de dissociação e também para caracterizar o modo de ação de neutralização. A neutralização foi categorizada como depósito 1 ou depósito 2. depósito 1 representa um anticorpo que liga-se a IL-13 humano e evita a ligação de IL-13Roc1 e como um resultado também bloqueia IL-4R a partir da ligação, depósito

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54/68 representa um anticorpo que liga-se hll_-13 em uma tal maneira que permite a ligação a IL-13Roc1 mas evita o recrutamento de IL-4R no complexo. Foram selecionados os anticorpos que opera por intermédio de depósito 1.

[00233] Aproximadamente 7500 de positivos específicos por IL-13 foram identificados na triagem FMAT primária de um total de 27 x 100 placa de experimentos SLAM. 800 reservatórios demonstraram a neutralização no ensaio HEK-blue. Os reservatórios 170 tem perfis Biacore desejáveis, isto é os anticorpos depósito 1 com taxa de dissociaçãos < 5x 10-4 s-1. A clonagem de região variável destes 170 reservatórios foi experimentado e 160 sucessivamente produzidos no foco fluorescente. 100 reservatórios gerados dos pares dos genes de região variável de cadeia leve e pesada seguindo a transcrição reversa (RT)-PCR. Estes genes de região V foram clonados como anticorpos de comprimento total lgG1 de camundongo e expressado novamente em um sistema de expressão transitória HEK-293. A análise de sequência revele que foram 27 famílias únicas do anticorpo humano anti-IL-13. Estes anticorpos recombinantes foram então testados novamente por sua capacidade para bloquear o hll_-13 recombinante (derivado por E.coli e derivado de mamífero), variante hlL-13 recombinante (R130Q) (derivado por E.coli), tipo selvagem natural e variante hll_-13 (derivado por doador humano) e IL-13 cinomólgo (derivado de mamífero) no ensaio com base celular. Os anticorpos recombinantes também foram testados por sua capacidade de ligar-se o variante IL13 humano (R130Q) e IL-13 cinomólgo em Biacore. Seguindo esta caracterização, 5 famílias de anticorpo executoras de seu critério, isto é anticorpo sub-100 pM com saída mínima na potência e afinidade para todas as preparações de cinomolgos e humanos IL-13.

[00234] A humanização de todas as 5 famílias foi realizado. Com base na potência de neutralização, afinidade e conteúdo doador nos enxertos humanizados, CA154_652 humanizado (ver abaixo) foi selecionado para a progressão adicional.

1.1 Humanização [00235] O anticorpo humanizado exemplificado neste (Ab652) foi preparado pelo enxerto dos CDRs a partir das regiões V de anticorpo de rato (Seq ID N^os 7 e 15)

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55/68 (CDRs divulgado neste nas sequências 1 a 6) nas estruturas de região V de anticorpo de linha germinativa humana. Os alinhamentos das sequências da região V de anticorpo de rato (doador) com o anticorpo das sequências de região V de linha germinativa humana (auxiliar) são mostrados na Figura 12 , junto com a sequência humanizada projetada. Os CDRs enxertados a partir do doador a sequência auxiliar são como definidos por Kabat (Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, US), com a exceção de CDR-III onde a definição Chothia/Kabat combinada é usado (ver Adair et al. (1991) Humanised antibodies WO 91/09967). Região V humano VH2 3-12-26 mais região J JH4 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foi escolhido como o auxiliar para a cadeia pesada CDRs. Os resíduos de estrutura de cadeia pesada são todos os genes de linha germinativa humana, com a exceção dos resíduos 49 e 71 (numeração Kabat), onde os resíduos de doadores Glicina (G49) e Arginina (R71) foram retidos, respectivamente. A retenção destes dois resíduos de doadores foi essencial para a atividade total do anticorpo humanizado. A região V humana VK1 21-(1) 02 mais região J JK4 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foi escolhido como o auxiliar para a cadeia leve CDRs. Os resíduos de estrutura de cadeia leve são todos a partir do gene da linha germinativa humana.

[00236] As sequências de região V inicial que codifica os genes foram projetados e construídos por um método de síntese automática por Entelechon GmbH. Um número de variantes diferentes da cadeia pesada foram criados pela modificação do gene VH pela mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo. A sequência do gene gl_1 foi clonada no vetor de expressão da cadeia leve humana UCB-Celltech pKH10.1, que contém DNA codifica pela região constante de cadeia Capa humana (alotipo Km3) - ver SEQ ID N°: 26 e SEQ ID N°: 30. O oito genes VH enxertados (gH1 a gH8) foram clonados no vetor de expressão de cadeia pesada 4 de gama humano UCB-Celltech pVhy4P FL, que contém DNA que codifica a região constante de cadeia pesada 4 gama humana com a mutação de estabilização de junta S241P (Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8). O gene gH2 VH foi selecionado como o enxerto de cadeia pesada ótimo para a potência e características biofísicas

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56/68 (descritas neste abaixo) e foi então sub-clonado no vetor Fab de gama 1 humano pVhy1F3, que contém DNA que codifica o domínio CH1 de gama 1 humano (alotipo G1m17) (SEQ ID N°: 38). A co- transfecção do plasmídeo de cadeia resultante com um plasmídeo de cadeia leve, nas células CHO-L761h resulta na expressão do anticorpo humanizado no formato Fab requerido. Este anticorpo é referido neste como Ab652 (também referido como Ab652 Fab).

[00237] Para facilitar a geração de uma linha celular estável que expressa o anticorpo Ab652, um plasmídeo simples contendo DNA que codifica tanto os cassetes de expressão de cadeia leve quanto pesada e um marcador de seleção de sintetase de glutamina (GS) foi gerado. O gene GS permite para a seleção de células CHO recombinantes para permitir o desenvolvimento no meio suplementado com o inibidor GS de sulfoximina de metionina (Bebbington et al., Biotechnol. 1992, 10(2): 169-175).

1.2 Medições de afinidade de ligação [00238] A tecnologia BIAcore monitora a ligação entre as biomoléculas em tempo real e sem o requerimento para a rotulação. Um dos interagentes, denominados o ligante, é diretamente imobilizado ou capturado na superfície imobilizada enquanto o outro, denominado analito, flui em uma solução na superfície capturada. O sensor detecta a mudança na massa na superfície do sensor como o analito liga-se ao ligante para formar um complexo na superfície. Este corresponde ao processo de associação. A dissociação do analito a partir do ligante é monitorado quando o analito é substituído pelo tampão. No ensaio de afinidade BIAcore, o ligante é Ab652 e o analito é IL-13 humano.

1.3 Ensaio de bloqueio cruzado do receptor [00239] O ensaio de bloqueio cruzado do receptor Biacore requer a captura de anti IL-13 Fab seguido por IL-13 (como o primeiro analito) flui no ligante capturado para formar um complexo estável na superfície do sensor. Um segundo analito (receptor IL-13 solúvel recombinante) é então fluido neste complexo estável. A quantidade da ligação do segundo analito ao complexo estável é monitorado. Os anticorpos anti IL-13 que não permitem o segundo analito para ligar-se ao anticorpo

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57/68 estável: complexo IL-13 são classificados como competidores de local 1. Aqueles anticorpos anti IL-13 que permitem o segundo analito para ligar-se ao anticorpo estável: complexo IL-13 são classificados como os competidores de local 2.

[00240] Materiais [00241] Instrumento

Biacore ® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suécia [00242] Chip Sensor

CM5 (grau de pesquisa) Número de catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Chips foram armazenados a 4^o C.

[00243] Kit de ligação de amina [00244] Número de catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Cloridreto de Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Feitos até 75 mg/mL em água destilada e armazenado em 200 pL alíquotas a -70° C.

[00245] N-Hidroxissuccinimida (NHS). Feitos até 11,5 mg/mL em água destilada e armazenado em 200 pL de alíquotas a -70° C.

[00246] 1 M de cloridreto de Etanolamina -NaOH pH 8,5. armazenado em 200 pL de alíquotas a -70° C.

[00247] Tampões [00248] Tampão de realização: HBS-EP (sendo 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005 % de tensoativo P20). Número de catálogo: BR1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4^o C.

[00249] Tampão de imobilização: Acetato 5,0 (sendo 10 mM de acetato de sódio pH 5.0). Número de catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4^o C.

[00250] Captura de ligante [00251] O IgG anti-humano de cabra de fragmento Affinipure F(ab')2, fragmento F(ab')2 específico. Jackson ImmunoResearch Inc (Pensilvânia, USA) Número de catálogo: 109-006-097. Reagente armazenado a 4^o C.

[00252] Ligante [00253] Ab652 (2,51,21,7 e 3,86 mg/ml Fab), armazenado a 4^o C.

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58/68 [00254] Anti-hlL-13 mlgG (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo MAB-213, número de lote RL04).

[00255] Analitos [00256] O IL-13 humano recombinante (0,2 mg/ml de D.Lightwood; R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo 213-IL-050), armazenado a -70° C e descongelado uma vez para cada ensaio.

[00257] Receptor IL-13 humano recombinante 1hFc (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo 146-IL-100). Armazenado a -70° C e descongelado uma vez para cada ensaio. Receptor IL-13 humano recombinante 2hFc (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo 614-IL-100). Armazenado a -70° C e descongelado uma vez para cada ensaio.

[00258] Solução de regeneração [00259] 40 mM de HCI preparado pela solução com água destilada a partir de uma solução de estoque 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de catálogo: 101254H).

[00260] 5 mM de NaOH preparado pela diluição com água destilada a partir de uma solução de estoque 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suécia.

[00261] Equipamento chave [00262] Biacore 3000 Biosensor, GE Healthcare Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA. O instrumento é mantido de acordo com os protocolos do fabricante.

1.4 Medições de afinidade de ligação Ab652 [00263] O formato do ensaio foi capturado do Ab652 pelo F(ab')2 anti-humano imobilizado então a titulação do hlL-13 humano na superfície capturada.

[00264] BIA (Biamolecular Interaction Analysis) foi realizado usando um BIAcore 3000 (BIAcore AB). Fragmento Affinipure F(ab')2, IgG anti-humano de cabra, fragmento específico F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um Chip Sensor CM5 por intermédio de uma química de ligação de amina a um nível de captura de «4000 unidades de resposta (RUs). Uma superfície vazia foi preparada

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59/68 em uma maneira similar, omitindo o fragmento F(ab')2 a partir do procedimento. O tampão HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005 % de tensoativo P20, BIAcore AB) foi usado como o tampão de realização com a taxa de flux de 10 μΙ/min. Uma injeção 10 μΙ de Ab652 Fab a 0,2 μg/mL foi usado para capturar pelo lgG-F(ab')2 anti-humano imobilizado para permitir a ligação IL-13 suficiente mas também para minimizar os efeitos de ligação limitada de transporte de massa. O IL13 humano foi titulado no Ab652 capturado em várias concentrações (10 nM a 0,31 nM) em uma taxa de fluxo de 30 pL/min. A superfície foi regenerada por uma injeção de 10 pL de 40 mM de HCI, seguido pela injeção 5 pL de 5 mM de NaOH em uma taxa de fluxo de 10 pL/min.

[00265] As curvas de ligação de subtração do fundamento foram analisadas usando o software BIAevaluation (versão 3.2) seguindo os procedimentos padrão. Parâmetros cinéticos foram determinados a partir do ajuste de algoritmo.

[00266] TABELA 1

Amostra	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD	KD pM
Média Ab652 de 3 determinações	4,51 E+06	6,52E-05	1,52E-11	15

1.5 Estudos de bloqueio cruzado do receptor IL-13 [00267] O ensaio de bloqueio cruzado do receptor BIAcore requer a captura de anti-IL-13 Fab seguido por IL-13 (como o primeiro analito) fluido no ligante capturado para formar um complexo estável na superfície do sensor. Um segundo analito (receptor IL-13 solúvel recombinante) é então fluido neste complexo estável. A quantidade de ligação do segundo analito ao complexo estável é então monitorado. Os anticorpos anti-IL-13 que não permitiram o segundo analito para ligar-se ao anticorpo estável: complexo IL-13 são classificados como competidores de eixo 1. Aqueles anticorpos anti IL-13 que permitem o segundo analito ligar-se ao anticorpo estável: complexo IL-13 são classificados como competidores de eixo 2.

[00268] Todos os experimentos foram realizados usando um biossensor Biacore 3000 a 25° C. O tampão HBS-EP foi usado como o tampão de realização com uma

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60/68 taxa de fluxo de 10 pL/minuto (min). A mesma superfície do sensor foi usada como descrito pelas determinações por afinidade.

[00269] Uma injeção 10 pl de ~0,2 pg/ml de Fab IL-13 anti-humano foi usada para captura pelo IgG F(ab')2 de cabra, superfície de sensor específica do fragmento F(ab')2 anti-humano. O Fab IL-13 anti-humano a 0,2 ug/ml dá a ligação anti-IL-13 humano suficiente. IL-13 humano 25 nM foi injetado no anticorpo capturado seguido imediatamente pelo receptor IL-13 humano solúvel a 100 nM em uma taxa de fluxo de 10 pL/min. A superfície foi regenerada por 30 pL de injeções de 40 mM de HCI, seguido pela injeção 5 pL de 5 mM de NaOH em uma taxa de fluxo de 30pL/min.

[00270] As curvas de ligação subtraído do fundamento foram analisadas usando um software BIAevaluation fornecido pelo fabricante (versão 3.2) seguido pelos procedimentos padrão.

[00271] Tabela 2 Resumo de bloqueio Biacore

Anticorpo	Ligação Ab	Ligação hlL- 13	Ligação hlL- 13Ra1	Ligação hlL- 13Ra2
Ab652	103,1	22,4	-	1,5
Ab652	72,6	18,5	-0,4	-
Anticorpo de Controle	138,4	13,9	-	51,4
Anticorpo de controle	126	11,6	15,4	-

[00272] O IL-13 interage com dos dois receptores (IL-13Roc1 e IL-13Roc2) para formar um complexo. Apenas os sinais de complexo hlL-13/hlL-13oc1. Portanto, os anticorpos anti-IL13 que inibiram a sinalização dependente IL-13 pode mediar seu efeito pelo bloqueio da interação com hlL-13oc1. O local de interação de Ab652 em IL-13 humano será determinado em um ensaio BIAcore. O Ab652 foi capturado pela superfície F(ab')2 anti-humano imobilizado e então hlL-13 foi, por sua vez, capturado pelo Ab652. A ligação do IL-13 Roc1 solúvel ao complexo IL-13/anticorpo capturado foi avaliado. O ensaio foi repetido com hlL-13Roc2 substituído por hlL-13Roc1. IL-13 presente pelo Ab652 não deve liga-se dos receptores IL-13, mas um anticorpo anti

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IL-13 de controle comercial (mAb 213) foi capaz de apresentar IL-13 ao receptor IL13 solúvel. Na conclusão, Ab652 inibe a ligação IL-13 as ambas subunidades receptoras hlL-13, definindo como um competidor um eixo 1.

[00273] Tabela 3: Afinidade de Ab652 Fab purificado por hlL-13

	Ka (1/Ms)	kd (1/s) (taxa de suprimento)	KD (taxa de dissociação)	KD pM (KD medido por afinidade)
Ab652	4,83E+06	4,22E-05	8,73E-12	9
Ab652	5,09E+06 4,97E+06 5,60E+06 4,45E+06 5,11E+06 4,87E+06	6,64E-05 5,90E-05 6,70E-05 7,11E-05 4,67E-05 6,25E-05	1,30E-11 1,19E-11 1,20E-11 1,60E-11 9.14E-12 1,28E-11	13 12 12 16 9 13
Ab652	3,61 E+06	8,69E-05	2.40E-11	24
MÉDIA	4,82E+06	6,27E-05	1,34E-11	13
SD	5,84E+05	1.4E-05	4,84E-12

[00274] A afinidade de Ab652 para hlL-13 foi determinado Biacore nos três ensaios separados. A afinidade está na faixa 9-24pM com uma média de 13,4 (+4,8) pM

1.6 Potência com base celular [00275] A potência in vitro de Ab652 Fab para neutralizar IL-13 foi investigado usando o ensaio HEKBLUE™ STAT-6 (Invivogen). O ensaio compreende as células HEK293 estavelmente que expressam o STAT-6 humano e estavelmente expressando a fosfatase alcalina embriônica secretada (SEAP) sob o controle do promotor mínimo IFN-β fundido a quatro locais de ligação STAT-6. A potência de neutralização (ICso) de Ab652 foi avaliada usando os tipos diferentes de IL-13 humano, usado no ensaio a 250 pg/mL. A potência de neutralização foi avaliada contra o IL-13 humano de tipo selvagem recombinante produzido a partir de células hospedeiras bacterianas (E.coli) e mamíferas (fibroblastos de rato). A potência de

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62/68 neutralização foi avaliada contra o tipo selvagem natural e variante R130Q IL-13 humano produzido de linfócitos T humanos e contra IL-13 de macaco cinomólgo recombinante produzido nas células de mamíferos. R130Q hlL-13 não foi purificado e a concentração foi determinada por hlL-13 ELISA. O IL-13 cinomólgo não foi purificado e foi usado em uma concentração usando uma resposta equivalente no ensaio como 250 pg/mL hlL-13. Além disso, a potência de neutralização de CA154_652.g2 Fab foi medido seguindo a nebulização usando o nebulizador de trama PARI eFLOW®. Tabela 4: os valores ICso de Ab652 Fab contra as formas múltiplas de IL-13 no ensaio HEK Blue. Para a determinação de titulações IL-13 de afinidade funcional foram realizados na presença de concentrações fixas de Ab652. A análise de plotagem Schild foi aplicada aos dados para determinar os valores Kd para a neutralização de IL-13 tipo selvagem humano recombinante e IL-13 de macaco cinomólgo recombinante. Tabela 5: valores ICso e Kd de Ab652 Fab contra as formas múltiplas de IL-13 no ensaio HEK Blue.

[00276] Tabela 4

Fonte IL-13 (250 pg/ml)	ICso Ab652 Fab (ng/ml)
Derivado de E. coli, tipo selvagem	1,05
Mamífero (fibroblastos de rato), tipo selvagem	0,57
Célula T humana natural, tipo selvagem	2,12
Célula T humana natural, variante R130Q	1,66
Cinomólgo no receptor humano (1/4.000 = 250 pg/ml)	1,61
Fab nebulizado	1,15

[00277] Tabela 5

Fonte de IL-13

ICso ± SEMofAb652

Afinidade funcional de Kd de Ab652

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		ng/ml	pM	ng/ml	pM
Potência contra IL- 13 humano de tipo selvagem	Recombinante, derivado E. Coli (purificado)	0,670 ± 0,235 (n = 4)	14,267 ± 4,943 (n = 4)	—	—
Recombinante, derivado de célula de mamífero (fibroblasto de rato transfectado ou sobrenadante HEK293)	0,611 ± 0,039 (n = 2)	12,857 ± 0,821 (n = 2)	0,103 (n = 1)	2,173 (n = 1)
Natural, derivado de doador de tipo selvagem homozigoto (sobrenadante PBMC)	1,544 ± 0,140 (n = 9)	32,503 ± 2,949 (n = 9)	—	—
Potência contra IL13 humano variante	Natural, derivado de doador variante R130 Q homozigoto	0,861 ± 0,141 (n = 7)	20,079 ± 3,082 (n = 7)	—	—

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	(sobrenadante PBMC)
Potência contra IL13 de cinomólgo	Recombinante, derivado de célula de mamífero (fibroblasto de rato transfectado ou sobrenadante HEK293)	3,342 ± 0,431 (n = 13)	70,328 ± 9,072 (n = 13)	0,210 (n = 1)	4,414 (n = 1)
Potência contra IL13 de rato	Recombinante, derivado de célula de mamífero (sobrenadante HEK293 transfectado)	952,600 (n = 1)	20,046,300 (n = 1)	—	—
Potência contra IL13 de cachorro	Recombinante derivado de célula de mamífero (sobrenadante HEK293 transfectado)	Reativo não cruzado (n = 2)	Reativo não cruzado (n = 2)	—	—

[00278] Especialmente, estes dados demonstram que Ab652 Fab é similarmente potente na neutralização de IL-13 humano recombinante e natural produzido a partir

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65/68 das fontes bacterianas e de mamífero. A potência de CA154_652.g2 contra IL-13 cinomólgo neste ensaio não é mais do que 3 vezes menor do que contra IL-13 humano também gerado a partir dos fibroblastos de rato. A potência de CA154_652.g2 não é alterada seguindo a nebulização usando o nebulizador PARI eFLOW®.

1.7 Caracterização física de Ab652 [00279] Como descrito acima 8 as regiões variáveis enxertadas de anticorpo diferente foram geradas usando os CDRs derivados do anticorpo de rato selecionado (SEQ ID N^os: 1-6, Figura 1). Seleção de Ab652 (gLlgH2) a partir de 8 enxertos foi baseado na potência como descrito acima e característica biofísica.

[00280] Com base nos dados gerados para todas as regiões variáveis enxertadas testadas, o anticorpo 652 foi escolhido pela razão deste:

• Manter a afinidade mais alta contra hlL-13 e variante IL-13 • Ter a temperatura de fusão maior, Tm (indicador de estabilidade maior) • Estabilidade de pH maior (pelo dicroísmo circular) isto é mostrar menos distúrbio no pH baixo • Nenhuma agregação na agitação ou quando nebulizado [00281] Em contraste, alguns dos outros enxertos testados mostraram uma redução na afinidade de ligação, estabilidade de pH pobre e agregação pela agitação e/ou nebulização.

1.7.1 Efeito de nebulização [00282] Para determinar se Ab652 foi adequado para a nebulização, o nebulizador PART eFLOW® foi usado. Volumes de 2,5 mL de solução Ab652 em acetato de sódio 50 mM /125mM de cloreto de sódio pH5 foram nebulizados em temperatura ambiente (cerca de 21° C) e coletados pela condensação do nebulizado nos tubos de coleta esfriados. A análise subsequente indica nenhuma degradação aparente. O estudo também foi repetido usando uma solução em PBS, pH 7. Um controle positivo de lgG4 foi incluído, tendo observado para agregar durante a nebulização. A análise das amostras nebulizadoras foi por exclusão de tamanho, SDS-PAGE, dispersão de luz dinâmica e ligação de ligante, com o objetivo particular de detecção

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66/68 do material agregado presente. Nenhuma mudança foi aparente por qualquer uma daquelas técnicas indicando que Ab652 foi resistente para danificar durante a nebulização.

1.7.2 Resumo das características físicas de Ab652 pl (ponto isoelétrico) 8 (médio de duas determinações); estabilidade térmica Tm 84° C;

nenhuma agregação de Ab652 foi observada quando o anticorpo foi submetido a agitação ou nebulização.

2. Efeito de Ab652 em um modelo primata não humano de asma [00283] Objetivo [00284] O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de Ab652 em um modelo primata não humano de asma. Os pontos finais primatas incluem os efeitos nas contagens de célula de lavagem broncoalveolar (BAL), níveis de quimiocina e mudanças de função pulmonar precoce ou tardia como avaliado pela resistência pulmonar (Ri_).

[00285] Métodos [00286] O Ab652 foi liberado usando um nebulizador de trama. Estudos de simulação de respiração foram conduzidos usando parâmetros de ventilador típico e ajuste de tubulação usado na instalação de estudo. Os resultados dos estudos de simulação de respiração indicam que 40,4 % da carga do material no nebulizador deve ser liberado no nível do tubo endotraqueal.

[00287] Os animais de estudo foram selecionados na base dos valores de função pulmonar histórico e contagens eosinofílicas BAL. Na sessão de triagem, os animais experimentaram o desafio de antígeno Ascaris suum (A. suum) antes da indicação aos grupos de tratamento a fim de caracterizar sua resposta normal (não tratada) a A. suum. Após esta sessão de triagem, os animais foram projetados pelos grupos de dosagem na base de contagens de células BAL e dados de função pulmonar a partir da sessão de triagem. Nenhuma sessão de tratamento, os animais receberam o veículo nebulisado (PBS), ou Ab652 nebulisado no nível de dosagem no nebulizador de 0,1, 1, 10 e 60 mg/animal/dia. As dosagens foram administradas por intermédio

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67/68 do nebulizador nos dias -2, -1, 1, 2 e 3. Nos dias 1 e 2, a administração do tratamento ocorreu aproximadamente 30 minutos antes do desafio A. suum.

[00288] Os procedimentos do desafio foram idênticos para ambas as sessões. Cada animal foi desafiado nos dias 1 e 2 e valores de função pulmonar (Rl) foram registrados por pelo menos 15 minutos após cada desafio de antígeno e nas 24 horas após o desafio de alérgeno. O fluido BAL foi coletado antes do primeiro desafio e aproximadamente 24 horas após o segundo desafio para a triagem dos números celulares totais, morfologia ou contagens diferentes a fim de triar o grau de inflamação pulmonar. As amostras de sobrenadante BAL foram coletadas e analisadas para a determinação da concentração de quimiocina.

[00289] Resultados [00290] Ab652 nebulizado significantemente inibiu o aumento em BAL eotaxina-3 nas dosagens mg/dia baixas (Figura 13). Ab652 nebulizado causou uma inibição dependente da dosagem do aumento nos eosinófilos BAL medidos entre a triagem e sessões de tratamento (Figura 14). O Ab652 nebulisado significantemente e dependentemente da dosagem inibiu o pico da resposta de fase precoce no dia 2 medido até 15 minutos seguindo o desafio Ascaris na sessão de tratamento (Figura

15) . O Ab652 nebulisado significantemente e dependentemente da dosagem inibiu a resposta de fase tardia medida 24 horas após o dia 2 do desafio de alérgeno (Figura

16) .

[00291] Conclusões [00292] Os dados gerados com Ab652 nebulisado no modelo Ascaris de asma em macacos cinomólgos demonstram que a inflamação de pulmão alérgico conduzido por IL-13 é sensível à modulação farmacológica pela neutralização do fragmento anti-IL-13 Fab liberado diretamente às vias aéreas em um aerossol. Significantemente, o Ab652 foi potente, demonstrando a eficácia nas dosagens mg/dia baixas.

[00293] É claro, será entendido que a presente invenção foi descrita por meio apenas do exemplo, não deve ser entendido como limitante e que as modificações de detalhes podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações a seguir. As

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68/68 características preferidas de cada forma de realização da invenção são como para cada uma das outras formas de realizações mutatis mutandis. Todas as publicações, incluem mas não limitam-se a Patentes e Pedidos de Patentes, citados neste relatório descritivo são incorporados por referência neste como se cada publicação individual for especificamente e individualmente indicada ser incorporada por referência neste ainda que totalmente apresentado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo antagonístico que se liga a IL-13 humana, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 1 para CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID N°: 2 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 3 para CDRH3, e compreende adicionalmente uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 4 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID N°: 5 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID N°: 6 para CDR-L3.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 31.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 23.
4. Molécula de anticorpo neutralizadora como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é selecionada do grupo que consiste em: uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesadas e leves de comprimento total ou um fragmento destas, tal como um Fab, Fab' modificado, Fab', F(ab')2, Fv, VH, VL ou fragmento de scFv.
5. Anticorpo antagonístico que se liga a IL-13 humana, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 31 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 23.
6. Anticorpo antagonístico que se liga a IL-13 humana, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 35 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID N°: 27.
7. Molécula de anticorpo neutralizadora de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de ter um efetor ou uma molécula repórter ligada a mesma.
8. Anticorpo antagonístico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de ter uma afinidade de ligação com IL-13 humana isolada de 30 pM ou melhor.

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9. Sequência de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que codifica as cadeias pesadas e/ou leves de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a sequência de DNA que codifica a cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO:36 e a sequência de DNA que codifica a cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO:28.
10. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de DNA como definida(s) na reivindicação 9.
11. Célula hospedeira de E. coli, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão como definidos na reivindicação 10.
12. Processo para a produção do anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 11 e isolar o anticorpo.
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente outros ingredientes ativos.