MX2011009390A

MX2011009390A - Moleculas de anticuerpo que tienen especificidad de union para interleucina-13 (il-13) humana.

Info

Publication number: MX2011009390A
Application number: MX2011009390A
Authority: MX
Inventors: Alastair David Griffiths Lawson; Kerry Louise Tyson; Neil Gozzard; Daniel John Lightwood; Roger Thomas Palframan; Bryan John Smith
Original assignee: Ucb Pharma Sa
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2011-10-11
Also published as: US9957320B2; CA2754539A1; EP2406283A1; SI2406283T1; EP3168235A1; IL215014A; PT2406283T; RS55734B1; UY32489A; US8691233B2; TW201036636A; HUE031923T2; AR075849A1; AU2010222693A1; ES2615978T3; CY1118640T1; TWI476004B; GB0904214D0; CN102388066A; CN102388066B

Abstract

Moléculas de anticuerpo que tienen especificidad para determinantes antigénicos de IL-13 humana, o usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpo y métodos para producir estas moléculas de anticuerpo.

Description

MOLECULAS DE ANTICUERPO QUE TIENEN ESPECIFICIDAD DE UNION PARA INTERLEUCINA- 13 (IL-13) HUMANA Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos de IL-13 y fragmentos de los mismos, tal como fragmentos de unión de los mismos, a composiciones que comprenden los mismos, y de manera específica a su uso en la prevención y/o tratamiento de varias enfermedades incluyendo asma, alergia, COPD, fibrosis y/o cáncer.

Antecedentes de la Invención La IL-13 es una citocina de cadena corta que comparte 25 % de identidad de secuencia con IL-4. Comprende aproximadamente 132 aminoácidos, que forman una estructura secundaria de cuatro hélices que abarca los residuos 10-21 (hélice A), 43-52 (hélice B) , 61-69 (hélice C) , y 92-110 (hélice D) , junto con dos ß -hebras que abarcan los residuos 33-36 y 87-90. La estructura de solución de IL-13 se ha resuelto, revelando la conformación de paquete de cuatro hélices hacia arriba-hacia arriba-hacia abajo-hacia abajo también observado con IL-4 (Eisenmesser 2001) .

La IL-13 humana es una glicoproteína de 17-kDa clonada de células T activadas (Zurawski y de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26) , y se produce por células T activadas del linaje de Th2, aunque las células T CD4 + ThO y Thl, las Ref.: 223484 células T CD8+, y varias poblaciones no de células T tal como células cebadas también producen IL-13 (Zurawski y de Vries 1994 Immunol loday 13 19-26) .

La función de IL-13 incluye: - cambio de isotipo de inmunoglobulina a IgE en células B humanas (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Nati Acad Sci EUA 90 3730-4) y supresión de la producción de citocinas inflamatorias tanto en humanos como en ratones (de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370- 81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60) .

La IL-13 se une a sus receptores de superficie celular, IL-13-Ralfal y IL-13-Ralfa2. El IL-13-Ralfal interactúa con IL-13 con baja afinidad (KD-10nM) , seguido por el reclutamiento de IL-4Ra para formar el complejo de receptor heterodímico de señalización de alta afinidad (KD ~ 0.4 nM) (Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Nati Acad Sci E U A 93 497-501) .

El complejo IL-4R/IL-13Ralfal se expresa en muchos tipos de células tal como células B, monocitos/macrófagos , células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales de las vías respiratorias, y células del músculo liso de las vías respiratorias (Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al . 2001 Cytokine 13 75-84) .

La ligadura del complejo de receptores IL-13Ralfal/IL-4R da por resultado la activación de una variedad de rutas de transducción de señales incluyendo las rutas del transductor de señal y activador de transcripción y (ST AT6) y del substrato-2 de receptor de insulina (IRS-2) (Wang, Michieli et al. 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Imraunol 157 3220-2) .

La cadena de IL-13Ralfa2 sola tiene una alta afinidad (KD ~ 0.25-0.4 nM) para IL-13, y funciona tanto como un receptor de señuelo que regula negativamente la unión de IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24) , y un receptor de señalización que induce la síntesis de TGF-b y la fibrosis mediante la ruta AP-I en macrófagos y posiblemente otros tipos de células (Fichtner-Feigl , Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

Varios estudios llevados a cabo en modelos preclínicos en animales para asma indican que IL-13 juega un papel importante en el asma. Estos datos incluyen la resistencia a asma en los ratones con supresión de IL-13 así como la inhibición del fenotipo de asma con antagonistas de IL-13 (receptores solubles de IL-13, mAbs anti-IL-13, etc.) en varios modelos de ratón (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills-Karp y Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90) . Múltiples estudios han demostrado que la administración farmacológica de IL-13 recombinante a los pulmones de ratones así como de cobayos induce hipersecreción de moco de las vías respiratorias, eosinofilia y AHR (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig y Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig y Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9) .

Estos efectos de IL-13 se reproducen en sistemas de ratones transgénicos con ya sea expresión constitutiva o inducible de IL-13 (Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110463-74) . La sobreexpresión transgénica crónica de IL-13 también induce fibrosis subepitelial y enfisema. Los ratones deficientes en la molécula de señalización de IL-13 (y de IL-4) STAT6 fallan en desarrollar AHR inducida por alérgeno y sobreproducción de moco (Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9) . Los estudios usando la proteína de fusión de receptor soluble de IL-13 (sDL-l3Ralfa2Fc) han demostrado el papel central de esta citocina en la enfermedad de las vías respiratorias inducida por el alérgeno experimental, ovalbúmiria, (OVA) (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al . 2002 J Imraunol 169 6482-9) .

También se demostró la eficiencia del tratamiento anti-IL-13 en un modelo crónico de asma murino . Además de exhibir características de hipersecreción de moco y AHR, este modelo de asma crónica demuestra varios distintivos de la enfermedad humana que están carentes en los modelos más agudos. Estos incluyen eosinofilia de tejido de pulmón localizada en espacios inter-epiteliales así como fibrosis de músculo liso como se mide por incrementos en depósito de colágeno. El modelo de asma crónica se induce con estimulaciones repetidas en aerosol con OVA en ratones sensibilizados a OVA lx/semana durante un total de 4 semanas. El anticuerpo anti-IL-13 administrado durante las 2 semanas finales de las estimulaciones con OVA (desde el día 36 con lecturas de eficiencia valoradas en el día 53 de estudio) inhibió significativamente la AHR, la inflamación pulmonar, la hiperplasia de células caliciformes, la hipersecreción de moco, y la fibrosis de las vías respiratorias (Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther) .

También se demostró el efecto terapéutico del antagonista de IL-13 para inhibir AHR en un modelo de asma en primates, (American Thoracic Society, San Diego 2005) .

La IL-13 está implicada en la patogénesis del asma humana puesto que se han detectado niveles elevados de ARNm y proteína de IL-13 en los pulmones de pacientes asmáticos, que correlaciona con la severidad de la enfermedad (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94) . Además, se han identificado polimorfismos genéticos de IL-13 de humano, que conducen a niveles elevados de IL-13, y se han asociado con asma y reacción alérgica (Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 549-59; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest) , y se han detectado niveles elevados de IL-13 en el pulmón de pacientes con asma (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 1106-9) . También se ha demostrado un linaje genético entre IL-13 y asma puesto que los individuos con un polimorfismo en el gen de IL-13 que provoca mayores niveles en plasma de IL-13 tienen un riesgo incrementado de reacción alérgica y asma ( ills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23) .

Debido al papel de la IL-13 de humano en una variedad de trastornos humanos, se han diseñado estrategias terapéuticas para inhibir o contrarrestar la actividad de IL-13. En particular, se han buscado anticuerpos que se unan a, y que neutralicen, IL-13 como un medio para inhibir la actividad de IL-13. Sin embargo, existe la necesidad en la técnica de anticuerpos adecuados y/o mejorados capaces de unirse a IL-13, específicamente IL-13 humana. En particular, los anticuerpos son capaces de neutralizar IL-13 humana. La presente invención proporciona una nueva familia de proteínas de unión, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados, y fragmentos de los mismos, capaces de unirse a L-13 humana, de unirse de alta afinidad y de unirse y neutralizar IL-13 humana.

Breve Descripción de la Invención Esta invención se refiere a un nuevo anticuerpo específico de IL-13 y fragmentos, por ejemplo, fragmentos de unión a IL-13 del mismo, en particular anticuerpos y fragmentos neutralizantes.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos para cada uno de CDR 1, 2, 3 de la cadena pesada (CDR H) y CDR 1, 2, 3 de la cadena ligera (CDR L) ; la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena ligera de anticuerpo de rata; la secuencia de ADN para la región variable de cadena ligera de anticuerpo de rata; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; La Figura 2 muestra la secuencia de ADN para la región variable de cadena ligera de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo de rata; la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo de rata; la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; La Figura 3 muestra la secuencia de ADN para la cadena ligera de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena pesada de anticuerpo de rata; la secuencia de ADN para la región variable de cadena pesada de anticuerpo de rata; la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena pesada de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; La Figura 4 muestra la secuencia de ADN para la región variable de cadena pesada de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo de rata; La Figura 5 muestra la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo de rata; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; La Figura 6 muestra la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo de rata con la secuencia de señal; La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena ligera de anticuerpo humanizado; la secuencia de ADN para la región variable de cadena ligera de anticuerpo humanizado; la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena ligera de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de ADN para la región variable de cadena ligera de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo humanizado; La Figura 8 muestra la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo humanizado; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena ligera de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena pesada de anticuerpo humanizado; la secuencia de ADN para la región variable de cadena pesada de anticuerpo humanizado; la secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena pesada de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de ADN para la región variable de cadena pesada de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo humanizado; La Figura 10 muestra la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo humanizado; la secuencia de aminoácidos para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo humanizado con la secuencia de señal; la secuencia de ADN para la región variable y constante de cadena pesada de anticuerpo humanizado; La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN para la región menos variable aceptadora VK 1 2-1-(1)02 JK4 y la región menos variable aceptadora VH2 3-1 2-26 JH4 ; La Figura 12 muestra una alineación de las cadenas ligeras para la región menos variable aceptadora de rata y las cadenas ligeras humanizadas y también cadenas pesadas. Las CDR están en negritas y subrayadas. Los residuos donadores G49 y R71 están en negritas, cursivas y resaltados; La Figura 13 muestra el efecto de Ab652 en la eotaxina-3 de BAL medida 24h después de estimulación con alérgeno. Los datos se expresan como media + SE , n=4-8 por grupo .

La Figura 14 muestra el efecto de Ab652 en la cuenta de eosinófilos de BAL medido 24h después de estimulación con alérgeno. Los datos se normalizan a la cuenta de eosinófilos de BAL medida en la fase de examen del estudio. Media + SEM, n=4-8 por grupo.

La Figura 15 muestra el efecto de Ab652 en la resistencia pico de las vías respiratorias medida hasta 15 minutos después de la estimulación con alérgeno. Los datos se expresan como media + SEM, n=4-8 por grupo.

La Figura 16 muestra el efecto de Ab652 en la resistencia de vías respiratorias medida 24 h después de estimulación con alérgeno. Los datos se normalizan a resistencia de vías respiratorias medida antes de la exposición alérgeno. Media ± SEM, n=4- 8 por grupo.

Descripción Detallada de la Invención Los residuos en los dominios variables de anticuerpos se numeran de manera convencional de acuerdo a un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EUA (posteriormente "Kabat et al. (supra)") . Este sistema de numeración se usa en la presente especificación excepto donde se indique de otro modo.

Las designaciones de residuos de Kabat no corresponden siempre de forma directa con la numeración lineal de los residuos de aminoácido. La secuencia de aminoácidos, lineal, real puede contener menos o adicionales aminoácidos que en la numeración estricta de Kabat que corresponde a un acortamiento de, o una inserción en, un componente estructural, ya sea región menos variable o región determinante de complementariedad (CDR) , de la estructura de domino variable básico. La numeración Kabat correcta de residuos se puede determinar para un anticuerpo determinado por la alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "normal" .

Las CDR del dominio variable de cadena pesada se localizan en los residuos 31-35 (CDR-H1) , residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo al sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, de acuerdo a Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. . J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), la asa equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. De esta manera, "CDR-H" , como se usa en la presente comprende los residuos 26 a 35, como se describe por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de asa topológica de Chothia.

La CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24 a 34 (CDR-L1) , residuos 50 a 56 (CDR-L2) y residuos 89 a 97 (CDR-L3) de acuerdo al sistema de numeración de Kabat.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo antagonist .

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo - antagonista" describe un anticuerpo que es capaz de inhibir y/o neutralizar la actividad de señalización biológica de IL-13, por ejemplo al bloquear la unión o al reducir sustancialmente la unión de IL-13 al receptor de IL-13 y de esta manera al inhibir la activación del receptor.

Los anticuerpos para el uso en la presente invención se pueden obtener usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. El polipéptido de IL-13, que incluye un polipéptido de fusión que contiene IL-13, o células que expresan (de manera recombinante) el polipéptido se puede usar para producir anticuerpos que reconocen de manera específica IL-13. El polipéptido de IL-13 puede ser el polipéptido "maduro" o un fragmento biológicamente activo o derivado del mismo. Se pueden preparar polipéptidos de IL-13 por procesos bien conocidos en la técnica a partir de células hospedadoras genéticamente manejadas que comprenden sistemas de expresión o se pueden recuperar de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Esto se usa de manera indistinta a menos que se especifique de otro modo. El polipéptido de IL-13 puede ser en algunos casos parte de proteína más grande tal como una proteína de fusión, fusionada por ejemplo a una marca de afinidad.

Se pueden obtener anticuerpos generados contra el polipéptido de IL-13, donde es necesaria la inmunización de un animal, al administrar a los polipéptidos a un animal, preferentemente a un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y de rutina, ver, por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986) . Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tal como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, en general son más adecuados los ratones, conejos, cerdos y ratas.

Los anticuerpos para el uso en la presente invención incluyen anticuerpos enteros y fragmentos funcionalmente activos o derivados de los mismos y pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales , humanizados, completamente humanos o quiméricos.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales por cualquier método conocido en la técnica tal como la técnica de hibridoma. (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

También, se pueden generar anticuerpos para el uso en la invención usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales al clonar y expresar los ADNc de región variable de inmunoglobulina generados de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos, por ejemplo, por los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93 (15) : 7843-78481; O92/02551; O2004/051268 y la Solicitud de Patente Internacional número W02004/106377.

Se puede realizar el examen de anticuerpos usando ensayos para medir la unión a IL-13 y/o ensayos para medir la capacidad para bloquear la unión de IL-13 a uno o más de sus receptores. Un ejemplo de un ensayo de unión es un ELISA, por ejemplo, usando una proteína de fusión de IL-13, que se inmoviliza en placas, y empleando un anticuerpo secundario conjugado para detectar el anticuerpo anti-IL-13 unido a la IL-13. Un ejemplo de un ensayo de bloqueo es un ensayo basado en citometría de flujo que mide el bloqueo de la proteína de ligando de IL-13 que se une a IL-13R. Se usa un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente para detectar la cantidad de proteína de ligando de IL-13 que se une al IL-13R.

Los anticuerpos humanizados (que incluyen anticuerpos injertados con CDR) son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región menos variable de una molécula de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, US 5,585,089; O91/09967) . Se apreciará que sólo puede ser necesario transferir los residuos determinantes de especificidad de la CDR en lugar de la CDR completa (ver, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) . Opcionalmente , los anticuerpos humanizados pueden comprender además uno o más residuos de región menos variable derivados de la especie no humana de la cual se derivaron las CDR.

Los anticuerpos quiméricos están compuestos de elementos derivados de dos diferentes especies tal que el elemento retenga las características de la especies de la cual se deriva. En general, un anticuerpo quimérico comprenderá una región variable de una especie, por ejemplo un ratón, rata, conejo o similar y una región constante de otra especies tal como un humano.

Los anticuerpos para el uso en la presente invención también se pueden generar usando varios métodos de visualización en fago conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos por Brinkman et al. (en J. Immunol . Methods, 1995, 182: 41-50)., Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y O 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.

Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los cuales las regiones variables y las regiones constantes (donde están presentes) tanto de las cadenas pesadas como ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a las secuencias de origen humano, pero no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo por los métodos de visualización en fago descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los cuales los genes de región variable de inmunoglobulina murina y opcionalmente de región constante se han reemplazado por sus contrapartes humanas, por ejemplo como se describe en términos generales en EP 0546073, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 y EP 0463151.

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en la Figura 1, SEQ ID NO:l para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y/o una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena pesada, en donde al menos dos de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 del dominio variable de la cadena pesada se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en SEQ ID N0:1 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-Hl tiene la secuencia dada en SEQ ID N0:1 y CDR-H2 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 2. De manera alternativa, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-Hl tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:l y CDR-H3 donde la secuencia dada en SEQ ID NO: 3, o el anticuerpo pueden comprender una cadena pesada en donde CDR-H2 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 3. Para evitar la duda, se entiende que se incluyen todas las permutaciones.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID N0:1 para CDR-Hl, la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una CDR que tiene la secuencia dada en Figura 1, SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y/o una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena ligera, en donde al menos dos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 del dominio variable de la cadena ligera se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L1 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 y CDR-L2 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 5. De manera alternativa, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L1 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO : 6 , o el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-L2 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 6. Para evitar la duda, se entiende que se incluyen todas las permutaciones.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención comprenden de manera adecuada una cadena ligera complementaria o una cadena pesada complementaria, respectivamente .

Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo de acuerdo a la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID N0:1 para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y/o la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y/o la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

Se apreciará que se pueden hacer una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido a las CDR provistas por la presente invención sin alterar de forma signif cativa la capacidad del anticuerpo para unirse a IL-13 y para neutralizar la actividad de IL-13. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos se puede probar fácilmente por el experto en la técnica, por ejemplo, al usar los métodos descritos en la presente, particularmente aquellos ilustrados en los ejemplos, para determinar la unión de IL-13 y la inhibición de la interacción de IL-13/receptor de IL-13.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para IL-13 humana que comprende una o más CDR seleccionadas de CDRH-1 (SEQ ID N0:1), CDRH-2 (SEQ ID N0:2), CDRH-3 (SEQ ID NO : 3 ) , CDRL-1 (SEQ ID N0:4), CDRL-2 (SEQ ID N0:5) y CDRL-3 (SEQ ID N0:6) en las cuales se ha sustituido uno o más aminoácidos en una o más de las CDR con otro aminoácidos, por ejemplo, un aminoácido similar como se define en la presente más adelante .

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para IL-13 humana que comprende CDRH-1 (SEQ ID N0:1), CDRH-2 (SEQ ID N0:2 o SEQ ID NO:20), CDRH-3 (SEQ ID NO : 3 ) , CDRL-1 (SEQ ID N0:4), CDRL-2 (SEQ ID N0:5) y CDRL-3 (SEQ ID NO: 6), por ejemplo en las cuales se han sustituido uno o más aminoácidos en una o más de las CDR con otro aminoácido, tal como un aminoácido similar como se define más adelante en la presente.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDR donde la secuencia de CDRH-1 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID N0:1, CDRH-2 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 y/o CDRH-3 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDR en donde la secuencia de la CDRH-1 tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO:l, CDRH-2 tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 y/o CDRH-3 tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud la a secuencia dada en SEQ ID NO: 3.

"Identidad", como se usa en la presente, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácidos es idéntico entre las secuencias "similitud", como se usa en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, se puede sustituir leucina por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que frecuentemente se pueden sustituir por otros incluyen, pero no se limitan a: - fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas) ; - lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen las cadenas laterales básicas) ; - aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales acidas) ; - asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida) ; y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contiene azufre) . Se pueden calcular fácilmente los grados de identidad y similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing . Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed . , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., y Griffin, H. G.( eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BLASTMR disponible de NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, . & States, DJ. 1993, Nature Genet . 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR en donde la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 4, CDRL-2 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 y/o CDRL-3 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR en donde la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 4, CDRL-2 tiene al menos 70 , 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 y/o CDRL-3 tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 6.

En una modalidad, el anticuerpo proporcionado por la presente invención es un anticuerpo monoclonal.

En una modalidad, el anticuerpo proporcionado por la presente invención es un anticuerpo quimérico.

En una modalidad, el anticuerpo proporcionado por la presente invención es una molécula de anticuerpo injertado con CDR que comprende una o más de las CDR provistas en SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 o variantes de las mismas. Como se usa en la presente, el término "molécula de anticuerpo injertada con CDR" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (que incluyen, si se desea, una o más CDR modificada) de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o de rata) injertado en una región menos variable de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptador (por ejemplo, un anticuerpo humano) . Para una revisión, ver Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16^, 535-539, 1998. En una modalidad, en lugar de la CDR completa que se transfiere, sólo se transfieren uno o más de los residuos determinantes de especificidad de cualquiera de las CDR descritas en la presente anteriormente a la región menos variable de anticuerpo humano (ver, por ejemplo, Kashmiri efc al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una modalidad, sólo los residuos determinantes de especificidad de una o más de las CDR descritas en la presente anteriormente se transfieren a la región menos variable de anticuerpo humano. En otra modalidad, sólo los residuos determinantes de especificidad de cada una de las CDR descritas en la presente anteriormente se transfieren a una región menos variable de anticuerpo humano .

Cuando la CDR o residuos determinantes de especificidad se injertan, se puede usar cualquier secuencia de región menos variable de región variable aceptadora apropiada habiendo considerado la clase/tipo del anticuerpo donador del cual se derivan las CDR, incluyendo regiones menos variables de ratón, primate y humano. De manera adecuada, el anticuerpo injertado con CDR de acuerdo a la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones menos variables aceptadoras de humano así como una o más de las CDR o residuos determinantes de especificidad descritos anteriormente. De esta manera, provisto en una modalidad está un anticuerpo neutralizante injertado con CDR en donde el dominio variable comprende regiones menos variables de aceptador humano y CDR de donador no humano.

Los ejemplos de regiones menos variables de humano que se pueden usar en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., supra) . Por ejemplo, se puede usar KOL y NEWM para la cadena pesada, se puede usar REI para la cadena ligera y se pueden usar EU, LAY y POM tanto para la cadena ligera como para la cadena pesada. De manera alternativa, se pueden usar secuencias de línea germinal humana; están disponibles en http : //vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ .

En un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las cadenas pesada y ligera de aceptador no necesitan ser' derivadas necesariamente del mismo anticuerpo y si se desea pueden comprender cadenas compuestas que tienen regiones menos variables derivadas de diferentes cadenas.

La región menos variable adecuada para la cadena pesada del anticuerpo injertado con CDR de la presente invención se deriva de la secuencia 3-1 2-26 de VH2 de sub- grupo humano con JH4 (SEQ ID N0:41). Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado con CDR que comprende al menos una CDR de donador no humano en donde la región menos variable de cadena pesada se deriva de la secuencia 3-1 2-26 de VH2 de sub-grupo humano junto con JH4. La secuencia de JH4 de humano es como sigue: (YFDY) WGQGTLVTVS (Seq ID No: 43) . El motivo YFDY es parte de CDR-H3 y no es parte de la región menos variable 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591) .

La región menos variable adecuada para la cadena ligera del anticuerpo injertado con CDR de la presente invención se deriva de la secuencia 2-1 1-02 de VH1 de sub-grupo de línea germinal humana junto con JK4 (SEQ ID NO: 39) . Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo neutralizante injertado con CDR que comprende al menos una CDR de donador no humano en donde la región menos variable de cadena ligera se deriva de la secuencia 2-1 1-02 de sub-grupo humano junto con JK4. La secuencia de JK4 es como sigue: (LT) FGGGTKVEIK (Seq ID No: 44) . El motivo LT es parte de CDR-L3 y no es parte de la región menos variable 4 (Hieter, PA. , et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).

En una modalidad se selecciona una región menos variable ligera y/o pesada de una secuencia como se muestra en SEQ ID No: 39 a 42.

También, en un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las regiones menos variables no necesitan tener exactamente la misma secuencia como aquellas del anticuerpo aceptador. Por ejemplo, se pueden cambiar los residuos inusuales a residuos que se presentan de forma más frecuente para esa clase o tipo de cadena aceptadora. De manera alternativa, se pueden cambiar los residuos seleccionados en las regiones menos variables aceptadoras de modo que correspondan al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324) . Estos cambios se deben mantener al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donador. Un protocolo para seleccionar los residuos en las regiones menos variables aceptadoras que se puede necesitar cambiar se expone en O 91/09967.

De manera adecuada, en una molécula de anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, si la cadena pesada aceptadora tiene la secuencia 3-12-26 de VH2 de humano junto con JH4 , entonces las regiones menos variables aceptadoras de la cadena pesada comprenden, además de una o más CDR donadoras, un residuo donador en al menos uno de las posiciones 49 y 71 (de acuerdo a Kabat et al., (supra) ) (Ver Figura 12) .

Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado con CDR, en donde al menos los residuos en las posiciones 49 y 71 del dominio variable de la cadena pesada son residuos donadores.

Los residuos donadores son residuos del anticuerpo donador, es decir, el anticuerpo del cual se derivaron originalmente las CDR. De manera preferente, los residuos son glicina y arginina en las posiciones 49 y 71, respectivamente .

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID No: 31.

Se apreciará que se pueden hacer una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido a los dominios variables de anticuerpo, proporcionados por la presente invención, sin alterar de manera significativa la capacidad del anticuerpo para unirse a IL-13 y para neutralizar la actividad de IL-13. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido se puede probar fácilmente por el experto en la técnica, por ejemplo al usar los métodos descritos en los ejemplo para determinar la unión de IL-13 y/o el bloqueo del ligando/receptor .

En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 31. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70 , 80 ¾, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No:31.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID No: 23.

En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 23. En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 23.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID No: 31 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 31 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 23. De manera adecuada, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 31 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 23.

Las moléculas de anticuerpo de . la presente invención pueden comprender una molécula completa de anticuerpo que tiene cadenas pesada y ligera de longitud completa, o un fragmento de la misma, y puede ser, pero no se limita a Fab, Fab modificado, Fab' , Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio individual (por ejemplo, VH o VL o VHH) , scFv, anticuerpos bi, tri- o tetra—valentes , Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de cualquiera de los anteriores (ver, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y producir estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) . Otros fragmentos de anticuerpo para el uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab 1 descritos en las solicitudes de patente Internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 y O 2005/003171 y los fragmentos Fab-dAb descritos en la solicitud de patente Internacional WO2009/040562. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecífieos (ver, por ejemplo WO 92/22853 y WO 05/113605) .

Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si está presente, se pueden seleccionar habiendo considerado la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que se pueden requerir. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM de humano. En particular, se pueden usar dominios de región constante de IgG de humano, especialmente de los isotipos IgGl e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo se propone para usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. De manera alternativa, se pueden usar los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo se propone para propósitos terapéuticos y no se requieren funciones efectoras del anticuerpo, por ejemplo, para bloquear simplemente la actividad de IL-13. Se apreciará que también se pueden usar variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, se pueden usar moléculas de IgG4 en las cuales se ha cambiado la serina en la posición 241 a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immünology, 1993, 30 (1), 105-108. También se entenderá por el experto en la técnica que los anticuerpos pueden sufrir una variedad de modificaciones post-transduccionales . El tipo y grado de estas modificaciones depende frecuentemente de la línea de célula hospedadora usada para expresar el anticuerpo así como de las condiciones de cultivo. Estas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desaminación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Sin embargo, no hay Lisina C-terminal ni en cadena pesada o ligera de la modalidad de Ab652 de la invención.

En una modalidad, la cadena pesada de anticuerpo comprende un dominio de CHl y la cadena ligera de anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.

En una modalidad, el anticuerpo proporcionado por la presente invención es un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 en el cual la región constante de cadena pesada comprende una región de articulación, modificada. Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada comprende o consiste de la secuencia dada en SEQ ID No: 35.

Se apreciará se pueden hacer una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido a los dominios variable y/o constante de anticuerpo proporcionados por la presente invención sin alterar de forma significativa la capacidad del anticuerpo para unirse a IL-13 y para neutralizar la actividad IL-13. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido se puede probar fácilmente por el experto en la técnica, por ejemplo al usar los métodos descritos en la presente, particularmente aquellos ilustrados en los Ejemplos, para determinar la unión de IL-13 y el bloqueo de la interacción de IL-13/receptor de IL13.

En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 35. De manera adecuada, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No:35.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención comprende una cadena ligera, comprende la secuencia dada en SEQ ID No:27.

En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 27. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 27.

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada, comprende o consiste de la secuencia dada en SEQ ID No: 35 y la cadena ligera comprende o consiste de la secuencia dada en SEQ ID No: 27.

En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 35 y la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 27. En general, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 35 y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID No: 27.

Las moléculas biológicas, tal como los anticuerpos o fragmentos, que contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, dan de este modo a la molécula una carga positiva o negativa neta. _. La cantidad de carga total "observada" dependerá de la secuencia de aminoácidos absoluta de la entidad, del ambiente local de los grupos cargados en la estructura 3D y de las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pl) es el pH al cual una molécula o superficie particular no tiene carga eléctrica neta. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de acuerdo a la presente descripción tiene un punto isoeléctrico (pl) del al menos 7. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento tiene un punto isoeléctrico de al menos 8, tal como 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 o 9. En una modalidad, el pl del anticuerpo es- 8.

El anticuerpo de IL-13 y fragmentos de la invención se puede manejar para tener un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede conducir a anticuerpos y/o fragmentos con propiedades más fuertes, en particular perfiles adecuados de solubilidad y/o estabilidad.

De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de IL-13 humanizado, manejado para tener un punto isoeléctrico diferente de aquel del anticuerpo originalmente identificado. El anticuerpo se puede manejar, por ejemplo, al reemplazar un residuo de aminoácido tal como reemplazando un residuo de aminoácido ácido con uno o más residuos de aminoácido básicos. De manera alternativa, se pueden adicionar residuos de aminoácido básicos o se pueden remover residuos de aminoácido ácidos. De manera alternativa, si la molécula tiene un valor de pl inaceptablemente alto, se pueden introducir residuos ácidos para disminuir el pH, como se requiera. El pl del anticuerpo manejado o fragmento puede ser por ejemplo de 8 o superior, tal como 8.5 o 9. Es importante que cuando se manipule el pl, entonces se debe tomar cuidado de retener la actividad deseable del anticuerpo o fragmento. De esta manera, en una modalidad, el anticuerpo manejado, o fragmento, tiene la misma o sustancialmente la misma actividad como el anticuerpo "no modificado" , o fragmento.

Se pueden usar programas tal como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, y http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento.

En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para distribución inalada, por ejemplo, por nebulización. En un ejemplo, las propiedades físicas de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, la afinidad y potencia de unión no se alteran de forma sustancial por nebulización. En un ejemplo, los anticuerpos de la presente invención son altamente estables. Una medida de estabilidad de anticuerpo es la temperatura de fusión (Tm) . Se puede determinar la temperatura de fusión por cualquier método adecuado conocido en la técnica, usando por ejemplo Thermofluor (Ericsson et al, Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298) o DSC (calorimetría de exploración diferencial) . De manera preferente, los anticuerpos proporcionados por la presente invención tienen una temperatura de fusión (Tm) alta, típicamente de al menos 75 °C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 75°C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 80°C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 83 °C.

También se proporciona por la presente invención una región o epítopo específico de IL-13 humana que se une por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada (SED ID No: 35) y/o la secuencia de cadena ligera (SEQ ID No: 27) .

Esta región o epítopo específico del polipéptido de IL-13 de humano se puede identificar por cualquier método adecuado de correlación de epítopos, conocido en la técnica, en combinación con cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de estos métodos incluyen examinar los anticuerpos de longitudes variables derivados de IL-13 para la unión al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que se pueda unir de manera específica al anticuerpo que contiene la secuencia del epítopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de IL-13 se pueden producir de manera sintética o por digestión proteolítica del polipéptido de IL-13. Los péptidos que se unen al anticuerpo se pueden identificar, por ejemplo, por análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo, se puede usar espectroscopia de RMN o cristalografía de rayos X para identificar el epítopo unido por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención, se puede usar, si se requiere, como un inmunógeno para obtener anticuerpo antagonistas adicionales que se unen al mismo epítopo.

Los anticuerpos que bloquean de forma cruzada la unión de un anticuerpo de acuerdo a la presente invención, en particular, un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada (SEQ ID No: 31) y la secuencia de cadena ligera (SEQ ID No: 27) pueden ser similarmente útiles en la actividad antagonista de IL-13. Por consiguiente, la presente invención proporciona también un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que bloquea de forma cruzada la unión de cualquiera de los anticuerpo descritos anteriormente a IL-13 humana y/o se bloquea de forma cruzada de a unión de IL-13 por cualquiera de estos anticuerpos. En una modalidad, este anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad, el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado se une a un epítopo que está al borde y/o se traslapa con el epítopo unido por un anticuerpo descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad, el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado de este aspecto de la invención no se une al mismo epítopo como un anticuerpo de la presente invención o un epítopo que está al borde y/o se traslapa con el epítopo.

Los anticuerpos de bloqueo cruzado se pueden identificar usando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo, al usar ensayos de BIAcore o ELISA de competición donde la unión del anticuerpo de bloque cruzado a IL-13 humana impide la unión de un anticuerpo de la presente invención o viceversa.

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13, que bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No: 35 y cuya cadena ligera comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No:27 a IL- 13 humana. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención inhiben la unión de un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en SEQ ID No: 35 y la secuencia de cadena ligera mostrada en SEQ ID No:27 por más de 80 %, por ejemplo por más de 85 %, tal como por más de 90 %, en particular por más de 95 %.

De manera alternativa o adicionalmente, los anticuerpos antagonistas de acuerdo a este aspecto de la invención se pueden bloquear de forma cruzada de la unión a IL-13 humana por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en SEQ ID No: 35 y la secuencia de cadena ligera mostrada en SEQ ID No: 27. Por lo tanto, también se proporciona una molécula de anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana que se bloquea de forma cruzada de la unión a IL-13 humana por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en SEQ ID No: 35 y la secuencia de cadena ligera mostrada en SEQ ID No:27. En una modalidad, los anticuerpos antagonistas proporcionados por este aspecto de la invención se inhiben de la unión a IL-13 humana por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en SEQ ID No -.35 y la secuencia de cadena ligera mostrada en SEQ ID No: 27 por más de 80 , por ejemplo por más de 85 %, tal como por más de 90 %, en particular por más de 95 %.

En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención son. completamente humanos. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención están humanizados. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención tienen una afinidad para IL-13 humana de ????? o mejor. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención tienen una afinidad para IL-13 humana de 50 pM o mejor.

En una modalidad, el anticuerpo de bloqueo cruzado tiene un punto isoeléctrico de al menos 7, por ejemplo, al menos 8 , tal como 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 o 9.0.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen de manera adecuada una alta afinidad de unión, en particular afinidad picomolar. Se puede medir la afinidad usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye por resonancia de plasmón superficial, incluyendo BIAcore como se describe en los ejemplos de la presente usando IL-13 natural o recombinante . En un ejemplo, se mide la afinidad usando IL-13 humana recombinante como se describe en los ejemplos de la presente. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente ????? o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50pM o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 40pM o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30pM o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 20pM o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención es completamente humana o está humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente ????? o mejor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención es completamente humana o está humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30pM o mejor.

Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención se puede alterar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada para IL-13. Estas variantes se pueden obtener por varios protocolos de maduración por afinidad incluyendo la maduración de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), trasposición de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10 , 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., 1. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), trasposición de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), visualización en fago (Thompson et al., 1. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) analiza estos métodos de maduración por afinidad.

En una modalidad, las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la interacción entre IL-13 y un receptor de IL-13, en particular las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la interacción entre IL-13 e IL-13Ral y la interacción entre IL-13 e IL-12 Rcc2. En los ejemplos de la presente se describen numerosos ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear esta interacción. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-13 humana. En una modalidad, el receptor de IL-13 humana usado en el ensayo es IL-13 Ral humano natural o IL-13 Rcc2 humano natural. En una modalidad, el receptor de IL-13 de humano usado en el ensayo es IL-13 Ra humano, recombinante o IL-13 Ra2 humano, recombinante . En una modalidad, la IL-13 humana usada en el ensayo es IL-13 humana recombinante. En una modalidad, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o completamente humano, o fragmento del mismo.

Si se desea, se puede conjugar un anticuerpo para el uso en la presente invención a una o más moléculas efectoras . Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora individual o dos o más de estas moléculas enlazadas para formar una porción individual que se puede unir a los anticuerpos de la presente invención. Donde se desee obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molécula efectora, esto se puede preparar por procedimientos de ADN recombinante , o químicos, normales, en los cuales se enlaza un fragmento de anticuerpo ya sea de forma directa o mediante un agente acoplador a la molécula efectora. En la técnica son bien conocidas las técnicas para conjugar estas moléculas efectoras a los anticuerpos (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed. , Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol . Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics , 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03031581. De manera alternativa, donde la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en WO 86/01533 y EP 0392745.

El término molécula efectora como se usa en la presente incluye, por ejemplo, agentes antineoplásticos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, polímeros sintéticos o que se presentan de forma natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmento de los mismos, radionúclidos , particularmente radioyoduro, radioisótipos , metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tal como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por espectroscopia de ESR o R N.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que es perjudicial a (por ejemplo aniquila) las células. Los ejemplos incluyen combrestatinas , dolastatinas , epotilonas, estaurosporina, maitansinosidos , espongistatinas , rizoxina, halicondrinas , roridinas, hemiasterlinas , taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromic na y análogos u homólogos de estos.

Las moléculas efectoras también incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil-descarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina-platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC) , caliceamicinas o duocarmicinas) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) .

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tal como ?111? y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188 ; o fármacos tal como pero no limitado a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteolíticas , hidrolasas, liasas, isomerasas, transíerasas . Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, toxinas tal como abrina, ricino A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, oc-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina, o, un modificador de respuesta biológica tal como linfocina, interleucina-i (IL-1) , interleucina-2 (IL-2) , factor estimulador de colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor de crecimiento de nervios (NGF) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo en la diagnosis. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para el uso en tomografxa de emisión de positrones) , e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Ver en general, Patente de los Estados Unidos No. 4,741,900 para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para el uso como diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados, incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina- fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y acuomarina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, U1ln y 99Tc .

En otro ejemplo, la molécula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar la distribución de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tal como aquellos descritos en WO 05/117984.

Donde la molécula efectora es un polímero puede ser, en general, un polímero sintético o uno que se presenta de forma natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada, opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo, un homo- o hetero-polisacárido .

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi .

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol) , poli (vinilalcohol) de cadena . recta o ramificada, opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente poli (etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol) o derivados de estos.

Los polímeros específicos que se presentan de forma natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de estos.

"Derivados" como se usa en la presente se propone que incluya derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos tiol-selectivos tal como maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede enlazar directamente o a través de un segmento ligador al polímero. Se apreciará que el residuo de este grupo formará algunas veces parte del producto como el grupo de enlace entre el fragmento de anticuerpo y el polímero .

El tamaño del polímero se puede variar como se desee, pero en general estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500Da a 50000Da, por ejemplo de 5000 a 40000Da tal como de 20000 a 40000Da. El tamaño de polímero se puede seleccionar en particular en base al uso propuesto del producto por ejemplo capacidad para localizarse en ciertos tejidos tal como tumores o para prolongar la vida media en circulación (para revisión ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). De esta manera, por ejemplo, donde el producto se propone para dejar la circulación y penetrar el tejido puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000Da. Para aplicaciones donde el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tiene un peso molecular en el intervalo de 20000Da a 40000Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como poli (etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli (etilenglicol) o un derivado' de estos, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000Da a aproximadamente 40000Da.

En un ejemplo, los anticuerpo para el uso en la presente invención se unen a porciones de poli (etilenglicol) (PEG) . En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG se pueden unir a través de cualquier cadena lateral de aminoácidos, disponible o cualquier grupo funcional terminal de aminoácidos, localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo, libre. Estos aminoácidos pueden presentarse de forma natural en el fragmento de anticuerpo o se pueden manejar en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (por ejemplo ver US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. De manera adecuada, los aminoácidos adicionales forman una región de articulación, modificada, que contiene uno o más residuos de cisteína a los cuales, se puede unir la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

De manera adecuada, las moléculas de PEG se pueden enlazar de manera covalente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado se puede enlazar de manera covalente al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. El enlace covalente será en general un enlace de disulfuro, o en particular, un enlace de azufre-carbono. Donde se usa un grupo tiol como el punto de unión, se pueden usar moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos de tiol tal como maléimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como el material de inicio en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se describe anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol-reactivo tal como un éster o ácido a-halocarboxílico, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo maleimida, una vinil-sulfona o un disulfuro. Estos materiales se inicio se pueden obtener de manera comercial (por ejemplo, de Nektar, formerly Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EUA) o se pueden preparar de materiales de inicio comercialmente disponibles usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (obtenible de Nektar, formerly Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater) .

En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento de Fab modificado o diFab que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol) ) unido covalentemente a este, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en EP 0948544 o EP 1090037 [ver también "Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York, "Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds) , American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545] . En un ejemplo, se une PEG a una cisteína en la región de articulación. En un ejemplo, un fragmento de Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida covalentemente enlazado a un grupo tiol individual en una región de articulación, modificada. Se puede enlazar covalentemente a un residuo de lisina al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el residuo de lisina se puede unir un polímero de metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento de Fab por lo tanto puede ser de aproximadamente 0000Da.

En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humano, que es un fragmento de Fab' modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SED ID No.35 y cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID No. 27 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de articulación modificada que contiene al menos un residuo de cisteína a la cual se une una molécula efectora. De manera adecuada, la molécula efectora es PEG y se une usando los métodos descritos en (WO 98/25971 y O 2004072116 o en WO 2007/003898. Las moléculas efectoras se pueden unir a fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en las solicitudes de patente Internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 y WO 2005/003171.

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento no se une a una molécula efectora.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para las cadenas pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, la secuencia de ADN codifica para la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, producido por ejemplo por procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de estos.

Por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden obtener secuencias de ADN que codifican para una molécula de anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, se pueden sintetizar secuencias de ADN que codifican para parte o todas las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, como se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o en base a las secuencias correspondientes de aminoácidos .

El ADN que codifica para las secuencias de regiones menos variables aceptadoras está ampliamente disponible para los expertos en la técnica y se puede sintetizar fácilmente en base a sus secuencias conocidas de aminoácidos.

Se pueden usar técnicas normales de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos . Como sea apropiado se pueden usar técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

Los ejemplos de secuencias adecuadas se proporcionan en la presente. Un péptido de señal adecuado para la cadena pesada se puede codificar en la presente tal como el péptido de señal murina MEWSWVFLFF LSVTTGVHS (SEQ ID NO: 45) . Un péptido de señal adecuado para la cadena ligera se puede codificar en la presente tal como el péptido de señal murina MSVPTQVLGL LLLWLTDARC (SEQ ID NO: 46) que se escinde para dar una molécula de anticuerpo antagonista de la presente invención. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención que comprende SEQ ID NO: 32, 34 o 36 o 38. La presente invención también proporciona una secuencia aislada de ADN que codifica para la cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención que comprende SEQ ID NO: 24, 26, 28 o 30.

Los métodos generales por los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience , New York y the Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores dé clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican para un anticuerpo de la presente invención. Se puede usar cualquier célula hospedadora/sistema vector adecuado para la expresión de la secuencia de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo de E. coli y otros microbianos o por ejemplo también se pueden usar sistemas eucarióticos , por ejemplo mamíferos, sistemas de expresión de células hospedadoras . Las células hospedadoras mamíferas adecuadas incluyen células CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de la proteína de ADN que codifica para la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, caso en el cual sólo se necesita usar una secuencia codificadora de polipéptido de cadena pesada o de cadena ligera para transfectar las células hospedadoras. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica para un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica para un polipéptido de cadena pesada. De manera alternativa, se puede usar un vector individual, el vector que incluye secuencias que codifican para polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Los anticuerpos y fragmentos de acuerdo a la presente descripción se expresan a buenos niveles se células hospedadoras . De esta manera, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos parece que se optimizan y son propicias a procesamiento comercial.

Puesto que los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una condición patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la elaboración de un medicamento. La composición se suministrará usualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un . adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende adicionar y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable .

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o se puede acompañar por otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, anti-IL-?ß, anti-célula T, anti-IFNy o anti-LPS, o ingredientes no de anticuerpo tal como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una modalidad adicional, el anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo a la descripción se emplea en combinación con un agente adicional farmacéuticamente activo, por ejemplo un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un beta- 2 -agonista (tal como sulbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores de proliferación y crecimiento celular (tal colmo rapamicina, ciclosfosfamida, metotrexato) o de manera alternativa un inhibidor de CD28 y/o CD40. En una modalidad, el inhibidor es una molécula pequeña. En otra modalidad, el inhibidor es un anticuerpo específico al objetivo.

Las composiciones farmacéuticas comprenden de manera adecuada una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una condición o enfermedad que se busca como objetivo, o exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar de manera inicial ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos de animales, usualmente en roedores, conejos, perro, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo apropiado de concentraciones y la ruta de administración. Esta información entonces se puede usar para determinar las dosis y rutas útiles para administración en humanos.

La cantidad precisa terapéuticamente efectiva para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, de la edad, el peso y género del sujeto, dietas, tiempo y frecuencia de administración, combinación de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia a la respuesta a terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación de rutina y está dentro del juicio del facultativo. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo de 0.1 mg/kg a 20 mg/kg. De manera alternativa, la dosis puede ser de 1 a 500 mg por día tal como 10 a 100, 200, 300 o 400mg por día. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar de manera conveniente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención.

Las composiciones se pueden administrar de manera individual a un paciente o se pueden administrar en combinación (por ejemplo, de forma simultánea, secuencialmente o de forma separada) con otros agentes, f rmacos u hormonas .

La dosis a la cual se administra a la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la condición que se va a tratar, del grado de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está usando de forma profiláctica o para tratar una condición existente .

La frecuencia de dosis dependerá de la vida media de molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo de 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis por día. De manera alternativa, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media prolongada (por ejemplo de 2 a 15 días) sólo puede ser necesario dar una dosis una vez por día, una vez por semana o aún una vez cada 1 o 2 meses.

El portador farmacéuticamente aceptable no debe inducir a sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos al individuo que recibe la composición y no debe ser' tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tal como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas inactivas de virus.

Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden usar, por ejemplo sales de ácidos minerales, tal como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tal como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos .

Los portadores farmacéuticamente aceptables en la composición terapéutica . pueden contener adicionalmente líquidos tal como agua, solución salina, glicerol y etanol . Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras de pH, pueden estar presentes en estas composiciones. Estos portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para la ingestión por el paciente.

Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo por inyección de bolo o infusión continua. Donde el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso acuoso y puede contener agentes de formulación, tal como agente de suspensión, de conservación, de estabilización y/o de dispersión. De manera alternativa, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más modalidades las composiciones se adaptan para administración a sujetos humanos.

En una modalidad, en las formulaciones de acuerdo a la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, pero si el pH de las formulaciones es 7 entonces puede ser apropiado un pl de 8-9 o superior. En tanto que no se desea que se una a ninguna teoría, se piensa que esto puede proporcionar finalmente una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en solución.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de rutas incluyendo, pero no limitado a, rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial , intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, ver WO98/20734) , subcutáneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipoaspersiones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar. De manera preferente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención se administran de manera subcutánea, por inhalación o de forma tópica.

La administración directa de las composiciones se logrará en general por inyección, de manera subcutánea, intraperitonealmente , de forma intravenosa o intramuscularmente , o administradas al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en un tejido específico de interés. El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis individuales o un programa de múltiples dosis.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible a degradación en el tracto gastrointestinal. De esta manera, si la composición se va a administrar por una ruta usando el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protegen al anticuerpo de la degradación pero que liberan el anticuerpo una vez que se ha adsorbido del tracto gastrointestinal.

Está disponible un análisis completo de los portadores farmacéuticamente aceptables en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991) .

En una modalidad, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas incluyendo inhalación .

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificables que contienen gases propulsores o soluciones inhalables libres de gases propulsores (tal como soluciones o suspensiones nebulizables) . Los polvos inhalables de acuerdo a la descripción que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente de las sustancias activas mencionadas anteriormente o de una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable .

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa) disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa) , oligo- y poli-sacáridos (por ejemplo, dextrano) , polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol) , sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos con otros. Se usan de manera adecuada mono- y di-sacáridos , el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero de forma no exclusiva en la forma de sus hidratos.

Las partículas para depósito en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor de 10 micrones, tal como 1-9 micrones por ejemplo- de 0.1 a 5 µ??, en particular de 1 a 5 m. El tamaño de partícula del activo (tal como el anticuerpo o fragmento es de importancia primaria) .

Los gases propulsores que se pueden usar para preparar los aerosoles inhalables se conocen en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan de entre hidrocarburos tal como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tal como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente se pueden usar en si mismos o en mezclas de los mismos .

Los gases propulsores particularmente adecuados son derivados halogenados de alcano seleccionados de entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, son particularmente adecuados TG134a (1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de estos.

Los aerosoles inhalables que contienen gases propulsores también pueden contener otros ingredientes tal como co-solventes , estabilizadores, agentes activos en la superficie (agentes tensioactivos) , antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes se conocen en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gases propulsores de acuerdo a la invención pueden contener hasta 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo a la invención contienen, por ejemplo, de 0.002 a 5 % en peso, de 0.01 a 3 % en peso, de 0.015 a 2 % en peso, de 0.1 a 2 % en peso, de 0.5 a 2 % en peso o de 0.5 a 1 % en peso de producto activo .

De manera alternativa, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser por la administración de una formulación de solución o suspensión líquida, por ejemplo, empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari aster(R) producido por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

En una modalidad, la formulación se proporciona como ampolletas discretas que contienen una dosis unitaria para administración por nebulización.

En una modalidad, el anticuerpo se suministra en forma liofilizada, para reconstituciones o de manera alternativa como una formulación de suspensión.

El anticuerpo de la invención se puede administrar en un solvente, por ejemplo, en la forma de una solución o una suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución salina fisiológica, un solvente farmacológicamente aceptable o una solución amortiguada. Las soluciones amortiguadas conocidas en la técnica pueden contener de 0.05 mg a 0.15 mg de edetato de disodio, de 8.0 mg a 9.0 mg de NaCl, de 0.15 mg a 0.25 mg de polisorbato, de 0.25 mg a 0.30 mg de ácido cítrico anhidro, y de 0.45 mg a 0.55 mg de citrato de sodio por 1 mi de agua para lograr un pH de aproximadamente 4.0 a 5.0. Como se menciona supra, una suspensión puede producir, por ejemplo, de anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones o formulaciones de solución, terapéuticas, también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato y amortiguador de bicarbonato) , aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica) , EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables . La formulación se proporcionará en general en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de manufactura estéril .

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la solución amortiguada de solvente usada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución amortiguada, estéril, en solvente, y la dispersión de la formulación en receptáculos estériles por métodos familiares a los expertos en la técnica.

Se puede proporcionar formulación nebulizable de acuerdo a la presente descripción, por ejemplo, como unidades de dosis unitarias (por ejemplo, frascos o recipientes plásticos sellados) envasados en envolturas de hoja. Cada frasco contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, de 2 mi, de amortiguador de solvente/solución .

Los anticuerpos de la presente descripción se piensa que son adecuados para la administración vía nebulización .

También se contempla que el anticuerpo de la presente invención se puede administrar por el uso de terapia génica. A fin de lograr esto, se introducen en un paciente las secuencias de ADN que codifican para las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes apropiados de ADN, tal que las cadenas del anticuerpo se expresen de las secuencias de ADN y se monten in situ.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo (o composiciones que comprenden la misma) para el uso en el control de enfermedades inflamatorias, por ejemplo, enfermedad inflamatoria aguada o crónica. De manera adecuada, se puede usar la molécula de anticuerpo (o las composiciones que la comprenden) para reducir el proceso inflamatorio o para impedir el proceso inflamatorio. En una modalidad, se proporciona una reducción in vivo de células T activadas, en particular aquellas comprendidas en respuestas inmunitarias inflamatorias inapropiadas , por ejemplo, reclutadas a la vecindad y/o ubicación de esta respuesta.

La reducción de células T activadas, como se emplea en la presente, puede ser una reducción, de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más por ciento en comparación a antes del tratamiento o sin el tratamiento.

De manera ventajosa, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo a la presente invención, puede permitir la reducción en el nivel de células T activadas, sin reducir el nivel general de células T (células T inactivadas) en los pacientes. Esto puede dar por resultado menos efectos secundarios, y posiblemente impedir el agotamiento de células T en el paciente.

La presente invención también proporciona la molécula de anticuerpo de la presente invención para el uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por IL-13 o se asocia con un nivel incrementado de IL-13.

El trastorno o condición patológica se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de infecciones (viral, bacteriana, fungoidea y parásita), choque endotóxico asociado con infección, artritis tal como artritis reumatoide, asma tal como asma severa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celiaca, enfermedad de vesícula biliar, enfermedad Pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adhesiones quirúrgicas, ataque, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis , uveitis autoinmunitaria, trastornos inflamatorios inmuno-mediados del sistema nervioso central y periférico tal como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barr, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por igA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, penfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, escleroderma, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunitarios , pancreatitis, trauma (cirugía) , enfermedad de injerto versus hospedador, rechazo de trasplante, enfermedad cardíaca que incluye enfermedades isquémicas tal como infarto miocardíaco así como aterosclerosis , coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis , osteoartritis , periodontitis e hipoclorhidria .

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención para el uso en el tratamiento o profilaxis de dolor, particularmente dolor asociado con inflamación.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención reduce la resistencia a tratamiento de inflamación, particularmente resistencia pulmonar a tratamiento de inflamación.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención reduce los niveles de proteína IL-13 en tejido bronquial, por ejemplo, en comparación a los niveles antes del tratamiento. La reducción puede se 5, 10, 20, 30, 40 % o más .

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención reduce los niveles de proteína IL-13 en fluido de lavado nasal y/o fluido broncoalveolar, por ejemplo en comparación a los niveles antes del tratamiento. La reducción puede ser 5, 10, 20, 30, 40 % o más.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención reduce el influjo de eosinófilos, por ejemplo en comparación a los niveles antes del tratamiento. La reducción puede ser 5, 10, 20, 30, 40 % o más, por ejemplo cuando se trata durante 1, 2, 3, 4 , 5, 6 o más semanas .

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención es adecuado para reducir los niveles inapropiados de células calisiformes , por ejemplo en el tratamiento de hiperplasia de células calisiformes , tal como hiperplasia crónica de células calisiformes . La reducción se puede observar después del tratamiento durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más semanas .

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención es adecuado para reducir los niveles de óxido nítrico (FeNO) , exhalado, en comparación a los niveles antes del tratamiento. Se piensa que el óxido nítrico exhalado es un factor de riesgo o un marcador para la inflamación pulmonar.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención es adecuado para la prevención de depósito inapropiado de colágeno asociado con respuestas inflamatorias, en particular depósito de colágeno peribronquial .

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención es adecuado para prevenir angiogénesis inapropiada asociada con respuestas inflamatorias.

De esta manera, se proporciona un anticuerpo de acuerdo a la invención para el uso en el tratamiento y métodos de tratamiento que emplean el mismo.

El anticuerpo de acuerdo a la invención como se emplea en la presente también se refiere a fragmentos y derivados descritos en la especificación.

La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo a la presente invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se medía por IL-13 o se asocia con un nivel incrementado de IL-13, por ejemplo como se describe en la presente, en particular el trastorno patológico es artritis reumatoide, asma o COPD.

La presente invención proporciona además el uso de una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo a la presente invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una o más indicaciones médicas descritas en la presente.

Se puede utilizar una molécula de anticuerpo, fragmento o composición de la presente invención en cualquier terapia donde se desee reducir los efectos de IL-13 en el cuerpo humano o animal. La IL-13 puede estar en circulación en el cuerpo o puede estar presente a un nivel indeseablemente alto localizada en un sitio particular en el cuerpo, por ejemplo un sitio de inflamación.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención o una composición que comprende la misma se usa para el control de enfermedad inflamatoria, por ejemplo como se describe en la presente.

La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen de, o están en riesgo de, un trastorno mediado por IL-13, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo de la presente invención, o una composición que comprende la misma. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo se administra por inhalación.

En un ejemplo, el trastorno se selecciona de cualquier de las indicaciones médicas proporcionadas anteriormente. En un ejemplo, el trastorno se selecciona del grupo que consiste de: trastornos asmáticos, trastornos atópicos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , condiciones que comprenden inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, condiciones inflamatorias, condiciones autoinmunitarias , tumores o cánceres, infección viral y supresión de expresión de respuestas inmunitarias tipo 1 protectoras .

En una modalidad, se proporciona un proceso para purificar un anticuerpo (en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la invención) .

En una modalidad, se proporciona un proceso para purificar un anticuerpo (en particular un anticuerpo fragmento de acuerdo a la invención) que comprende los pasos de: realizar una cromatografía de intercambio aniónico en el modo de no unión tal que las impurezas se retengan en la columna y el anticuerpo se mantenga en la fracción no unida. El paso se puede realizar, por ejemplo a un pH de aproximadamente 6-8.

El proceso puede comprender además un paso inicial de captura que emplea cromatografía de intercambio catiónico, realizada por ejemplo a un pH de aproximadamente 4 a 5.

El proceso puede comprender además los pasos adicionales de cromatografía para asegurar que se separen de forma apropiada de la corriente de producto las impurezas relacionadas al proceso y al producto.

El proceso de purificación también puede comprender uno o más pasos de ultrafiltración, tal como un paso de concentración y diafiltración.

De esta manera, en una modalidad, se proporciona un anticuerpo purificado de IL-13 o fragmento, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o fragmento, en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la invención, en forma sustancialmente purificada, en particular, libre o sustancialmente libre de endotoxinas y/o ADN o proteínas de las células hospedadoras . Habiendo dicho esto, los anticuerpos de acuerdo a la presente invención se prepararán en general en células mamlferas, y de esta manera en general no es un problema el contenido de endotoxinas . En realidad, el contenido de endotoxinas es más una consideración cuando los anticuerpos se preparan en células bacterianas.

La forma purificada como se usa supra se propone para referirse al menos 90 % de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p o más pura.

En general, se propone que sustancialmente libre de endotoxinas se refiere a un contenido de endotoxinas de 1 EU por mg de producto de anticuerpo o menos tal como 0.5 o 0.1 EU por mg de producto .

En general se propone que sustancialmente libre de ADN o proteínas de células hospedadoras se refiera a un contenido de ADN y/o proteínas de célula hospedadora de 400 µg por mg de producto de anticuerpo o menos tal como 100 yg por mg o menos, en particular 20 pg por mg, como es apropiado .

La molécula de anticuerpo de la presente invención también se puede usar en la diagnosis, por ejemplo en la diagnosis in vivo y en la formación de imágenes de los estados de enfermedad que comprenden IL-13.

Los ensayos adecuados in vivo para probar las propiedades de los anticuerpos de acuerdo a la invención incluyen: el modelo crónico de acaro doméstico, hipersensibilidad a metacolina y/o el modelo de ovalbúmina de inflamación pulmonar alérgica.

Se propone que "que comprende" en el contexto de la presente especificación significa "que incluye" .

Donde se pueden combinar las modalidades técnicamente apropiadas de la invención.

Las modalidades se describen en la presente como que comprenden ciertas características/elementos. La descripción también se extiende a modalidades separadas que consisten o consisten esencialmente de las características/elementos.

Ejemplos 1. Generación/Selección de Anticuerpos Terapéuticos Se inmunizaron ratas con ya sea IL-13 humana purificada (Peprotech) o fibroblastos de rata que expresan IL-13 humana (que expresan aproximadamente 1 ug/ml en sobrenadante de cultivo), o en algunos casos, una combinación de los dos. Después de 3 a 6 inyecciones, los animales se sacrificaron y se recolectaron las PBMC, el bazo, la médula ósea y los nodulos linfáticos. Se monitorizaron los sueros para la unión a IL-13 humana en ELISA y también para la capacidad para neutralizar hIL-13 en el ensayo de células indicadoras HEK-293 STAT-6 (ensayo HEK-Blue, Invivogen) .

Se prepararon cultivos de SLAM (cultivos de células B) por un método similar a aquel descrito por Zubler et al. (J. Immunol. 1985). De forma breve, se cultivaron 500-5000 esplenocitos o PBMC de un animal inmunizado en lotes de cien placas de 96 concavidades con 200 µ?/concavidad de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) complementado con 10 % de FCS (PAA laboratories ltd) , 2 % de HEPES (Sigma Aldrich) , 1 % de L-glutamina (Gibco BRL) , 1 % de solución de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL), 0.1 % de ß-mercaptoetanol (Gibco BRL) , 3 % de sobrenadante de cultivo de esplenocitos activados de conejo y células de timoma murino EL-4-B5 gamma-irradiadas (5xl0^4/concavidad) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de 5 % de C02. Se probaron los sobrenadantes de cultivo de células B en ensayos de examen y los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas principales; se congelaron las células B cultivadas a -80°C en 100 µ? DMSO al 10 % en FCS.

Primero se examinaron los sobrenadantes de cultivo de SLAM para su capacidad para unirse a hIL-13 en un ensayo basado en cuentas en el F AT. Esto fue un ensayo homogéneo que usa IL-13 humana biotinilada revestida sobre cuentas de estreptavidina y un con jugado de Fc-Cy5 anti-rata de cabra. Los positivos de este ensayo se alimentaron entonces en el ensayo de células indicadoras HEK-293 IL-13R-STAT-6 (ensayo HEK-Blue, Invivogen) para identificar neutralizadores . Los sobrenadantes neutralizantes entonces se perfilaron en el Biacore para estimar la constante de disociación y también para caracterizar el modo de acción de la neutralización. Se categoriza la neutralización ya sea como bin 1 o bin 2. Bin 1 representó un anticuerpo que se une a IL-13 humana e impide la unión de IL-13Ral y como resultado también bloquea la unión de IL-4R. Bin 2 representó un anticuerpo que se une a hIL-13 de una manera tal que permite la unión a IL-13Ral pero impide el reclutamiento de IL-4R en el complejo. Se seleccionaron anticuerpos que operaron mediante bin 1.

Se identificaron aproximadamente 7500 positivos específicos de IL-13 en el examen de FMAT primario y un total de 27 x 100 placas de experimentos de SLAM. 800 concavidades demostraron neutralización en el ensayo de HEK-blue. 170 concavidades tuvieron perfiles deseables de Biacore, es decir, los anticuerpos de bin 1 con constantes de disociación de < 5x 10-4 s-1. La región variable que se clona de estas 170 concavidades se intentaron y 160 produjeron exitosamente sitios fluorescentes. 100 concavidades generaron pares de genes de región variable de cadena pesada y ligera después de la transcripción inversa (RT) -PCR. Estos genes de región V se clonaron como anticuerpos de longitud completa de IgGl de ratón y se re-expresaron en un sistema de expresión transciente de HEK-293. El análisis de secuencia reveló que hubo 27 familias únicas de anticuerpo anti-IL-13 humana. Estos anticuerpos recombinantes entonces se volvieron a probar para su capacidad para bloquear hIL-13 recombinante (derivada de E.coli y derivada de mamífero), hIL-13 variante recombinante (R130Q) (derivada de E. coli) , hIL-13 variante y tipo silvestre natural (derivada de donador humano) y IL-13 de cynomolgus (derivada de mamífero) en el ensayo basado en células. Los anticuerpos recombinantes también se probaron para su capacidad para unirse a IL-13 humana variante (R130Q) e IL-13 de cynomolgus en el Biacore. Después de esta caracterización, 5 familias de anticuerpo cumplieron con los criterios, es decir, anticuerpo sub-100 pM con disminución mínima de potencia y afinidad para todas las preparaciones de IL-13 de humano y de cynomolgus.

Se realizó la humanización de las 5 familias. En base a la potencia de neutralización, para el progreso adicional se seleccionó la afinidad y el contenido de donador en injertos humanizados, CA154_652 humanizado (ver más adelante) . 1.1 Humanización El anticuerpo humanizado ejemplificado en la presente (Ab652) se preparó al injertar la CDR de las regiones V de anticuerpo de rata (SEQ ID NOs 7 y 15) (CDR descritas en la presente en secuencias 1 a 6) en regiones menos variables de región V de anticuerpo de línea germinal humana. Las alineaciones de las secuencias de región V (donadora) de anticuerpo de rata con las secuencias de región V (aceptadora) de anticuerpo de línea germinal humana se muestran en la Figura 12, junto con la secuencia humanizada designada. La CDR injertadas de la secuencia donadora a la secuencia aceptadora son como se definen por Kabat (Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987) . Bethesda MD, National Institutes of Health, US) , con la excepción de CDR-H1 donde se usa la definición combinada de Chothia/Kabat (ver Adair et al. (1991) Humanised antibodies O 91/09967) . Se eligieron la región V humana VH2 3-12-26 más la región J de JH4 (V BASE, http : //vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ ) como el aceptador para las CDR de cadena pesada. Los residuos de la región menos variable de cadena pesada son todos del gen de línea germinal humana, con la excepción de los residuos 49 y 71 (numeración de Kabat) , donde los residuos donadores Glicina (G49) y Arginina (R71) se retuvieron, respectivamente. La retención de estos dos residuos donadores fue esencial para la actividad completa del anticuerpo humanizado. Se eligió la región V humana VK1 2-1- (1) 02 más la legión J de JK4 (V BASE, htt : //vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ ) el aceptador para las CDR de cadena ligera. Los residuos de región menos variable de cadena ligera son todos del gen de línea germinal humana.

Los genes que codifican para las secuencias iniciales de la región V se diseñaron y construyeron por un planteamiento de síntesis automatizada por Entelechon GmbH. Se crearon varias variantes diferentes de la cadena pesada al modificar el gen VH por mutagénesis dirigida por oligonucleótido . La secuencia del gen de gLl se clonó en el vector pKHlO.l de expresión de cadena ligera de humano, que contiene ADN que codifica para la región constante de cadena Kappa humana (alotipo Km3); ver SEQ ID No: 26 y SEQ ID NO: 30. Los ocho genes de VH injertados (gHl a gH8) se clonaron en el vector pVhy4P FL de expresión de cadena pesada gamma-4 de humano de UCB-Celltech, que contiene ADN que codifica para la región constante de cadena pesada gamma-4 de humano con la mutación estabilizadora de articulación S241P (Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30 (1) : 105-8) . El gen de VH de gH2 se seleccionó como el injerto óptimo de cadena pesada para las características de potencia biofísicas (descritas más adelante en la presente) ( y entonces se subclonó en el vector pVhylF3 de Fab gamma-1 de humano de UCB-Celltech, que contiene ADN que codifica para el dominio CH1 gamma-1 de humano (alotipo Glml7) (SEQ ID NO:38) . La co-transíección del plásmido de cadena pesadas resultante con el plásmido de cadena ligera, en células CHO-L761h dio por resultado la expresión del anticuerpo humanizado en el formato Fab requerido. Este anticuerpo se refiere en la presente como Ab652 (también referido como Ab652 Fab) .

Para facilitar la generación de una línea de células estable que exprese el anticuerpo Ab652, se generó un ADN que contiene plásmido individual que codifica para los casetes de expresión tanto de cadena pesadas como ligera y un marcador de selección de glutamina-sintetasa (GS) . El gen de GS permite la selección células CHO recombinantes al permitir el crecimiento en medios complementados con el inhibidor de GS metionina-sulofoximina (Bebbington et al., Biotechnol . 1992, 10 (2) : 169-175) . 1.2 Mediciones de Afinidad De Unión La tecnología BIAcore monitoriza la unión entre biomoléculas en tiempo real y sin el requisito de marcación. Uno de los interactuantes , llamado el ligando, ya sea se inmoviliza directamente o se captura en la superficie inmovilizada en tanto que el otro, llamado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturadas. El sensor detecta el cambio en la masa en la superficie del sensor conforme el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. La disociación del analito del ligando se monitoriza cuando el analito se reemplaza por amortiguador. En el ensayo BIAcore de afinidad, el ligando es Ab652 y el analito es IL-13. 1.3 Ensayo de Bloqueo Cruzado de Receptor El ensayo de bloqueo cruzado de receptor Biacore requiere la captura de Fab anti-IL-13 seguido por IL-13 (como el primer analito) hecho fluir sobre el ligando capturado para formar un complejo estable en la superficie del sensor. Entonces se hace fluir un segundo analito (receptor de IL-13 soluble, recombinante) sobre este complejo estable. se monitoriza la cantidad de unión del segundo analito al complejo estable. Los anticuerpos anti-IL-13 que no permiten que el segundo analito se una al complejo estable de anticuerpo: IL-13 se clasifican como competidores de sitio 1. Estos anticuerpos anti-IL-13 que permiten que el segundo analito se una al complejo estable de anticuerpo: IL-13. se clasifican como competidores de sitio 2.

Materiales Instrumento BiacoreMR 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia Chip Sensor CM5 (grado de investigación) Número de Catalogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Los chips se almacenaron a 4°C.

Equipo de Acoplamiento de Amina Número de Catalogo: BR- 1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Clorhidrato de etil-3-(3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) . Producido hasta 75 mg/mL en agua destiladas y almacenado en alícuotas de 200 pL a -70°C. N-Hidroxisuccinimida (NHS) . Producida hasta 11.5 mg/mL en agua destilada y almacenada en alícuotas de 200 L a -70°C. Clorhidrato de etanolamina-NaOH 1M pH 8.5. Almacenado en alícuotas de 200 a -70°C.

Amortiguadores Amortiguador de corrida: HBS-EP (que es HEPES 0.01 M H 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 al 0.005 %) . Número de Catalogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Amortiguador almacenado a 4°C.

Amortiguador de inmovilización: Acetato 5.0 (que es acetato de sodio 10 mM pH 5.0). Número de Catalogo: BR- 1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Amortiguador almacenado a 4°C.

Captura de Ligando IgG anti-humano de cabra, fragmento F(ab' )2, fragmento F(ab' )2 específico. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, EUA) Número de Catalogo: 109-006-097. Reactivo almacenado a 4°C.

Ligando Ab652 (2.51, 21.7 y 3.86 mg/ml Fab) , almacenado a 4°C. mlgG anti-hIL-13 (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de Catalogo MAB-213, Número de Lote RL04) .

Analitos IL-13 humana recombinante (0.2 mg/ml de D . Lightwood; R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de Catalogo 213-IL-050) , almacenadas a -70°C y descongelada una vez para cada ensayo.

Receptor 1 hFc de IL-13 humana recombinante (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de Catalogo 146-IL-100) . Almacenado a -70°C y descongelado una vez para cada ensayo .

Receptor 2 hFc de IL-13 humana recombinante (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de Catalogo 614-IL-100) . Almacenado a -70°C y descongelado una vez a cada ensayo.

Solución de Regeneración HC1 40 m preparado por disolución con agua destilada de una solución concentrada a 11.6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de Catalogo: 101254H) .

NaOH 5 mM preparado por disolución con agua destilada de una solución concentrada de 50 mM. Número de Catalogo: BR- 1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Equipo Clave Biosensor Biacore 3000, GE Healthcare Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire , HP7 9 A . El instrumento se mantiene de acuerdo a los protocolos de los fabricantes . 1.4 Mediciones de Afinidad de Unión de Ab652 El formato de ensayo fue la captura del Ab652 por F(ab' )2 anti-humano inmovilizado titulación de la hIL-13 humana sobre la superficie capturada.

Se realizó el BIA (Análisis de Interacción Biamolecular) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB) . Se inmovilizó IgG anti-humano de cabra, fragmento Affinipure F(ab' )2/ fragmento F(ab')2 específico (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizó en un Chip Sensor CM5 mediante química de acoplamiento de amina a un nivel de captura de ~4000 unidades de respuesta (RU) . Se preparó una superficie en blanco de una manera similar, omitiendo el fragmento F(ab' )2 del procedimiento. Se usó amortiguador HBS-EP (HEPES lOmM pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, agente tensoactivo P20 al 0.005 %, BIAcore AB) como el amortiguador de corrida con una velocidad de flujo de 10 µ?/min. Se usó una inyección de 10 µ? de Ab652 Fab a -0.2 µ?/????. para captura por el IgG-F(ab')2 anti-humano inmovilizado para permitir la unión suficiente de IL-13 pero también para reducir al mínimo los efectos de unión limitados por el trasporte de masa. La IL-13 humana se tituló sobre el Ab652 capturado a varias concentraciones (lOOnM a 0.31nM) a una velocidad de flujo de 30 µL/min. La superficie se regeneró por una inyección de 10 µL de HC1 40 mM, seguido por una inyección de 5 µL de NaOH 5 mM a una velocidad de flujo de 10 µL/min.

Se analizaron las curvas de unión por sustracción de fondo usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiente procedimientos normales. Se determinaron los parámetros cinéticos del algoritmo de ajuste.

Tabla 1 Muestra Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD KD pM Ab652 promedio de 3 4.5E+06 6.52E-05 1.52E-11 15 determinaciones 1.5 Estudios de Bloqueo Cruzado de Receptor de IL-13 El ensayo de bloqueo cruzado de receptor BIAcore requiere la captura de Fab anti-IL-13 seguido por IL-13 (como el primer analito) hecha fluir sobre el ligando capturado para formar un complejo estable en la superficie del sensor. Entonces se hace fluir un segundo analito (receptor de IL-13 soluble, recombinante) sobre este complejo estable. La cantidad de unión del segundo analito al complejo estable entonces se monitoriza. Los anticuerpos anti-IL-13 que no permiten que el segundo analito se una al complejo estable de anticuerpo : IL-13 se clasifican como competidores de Eje 1. Estos anticuerpos anti-IL-13 que permiten que el segundo analito se una al complejo estable de anticuerpo : IL- 13 se clasifican como competidores de Eje 2.

Todos los experimentos se realizaron usando un biosensor Biacore 3000 a 25°C. Se usó el amortiguador de HBS-EP como el amortiguador de corrida con una velocidad de flujo de 10 pL/minuto (min) . Las mismas superficies del sensor se usaron como se describe para las determinaciones de afinidad.

Se usó una inyección de 10 µ? de -0.2 g/ml del Fab anti-IL-13 humana para captura por F(ab' )2 IgG de cabra, superficie de sensor específica a fragmento F(ab' )2 antihumano. El Fab anti-IL-13 humana a 0.2 ug/ml dio suficiente unión anti-IL-13 humana. La IL-13 humana a 25 nM se inyectó sobre el anticuerpo capturado seguido inmediatamente por receptor de IL-13 humana, soluble a 100 n a una velocidad de flujo de 10 pL/min. La superficie se regeneró por dos inyecciones de 30 yL de HC1 40 mM, seguido por una inyección de 5 yL de NaOH 5 mM a una velocidad de flujo de 30 yL/min.

Se analizaron las curvas de unión sustraída de fondo usando el software BIAevaluation proporcionado por el fabricante (versión 3.2) siguiendo procedimientos normales.

Tabla 2. - resumen de bloqueo de Biacore interactúa con cualquiera de los dos receptores (IL-13Ral y IL-13Ra2) para formar un complejo. Solo el complejo hIL-13/hIL-13 l da señales. Por lo tanto, los anticuerpos anti-IL13 que inhiben la señalización dependiente de IL-13 pueden mediar este efecto al bloquear la interacción con hIL-13ofl. El sitio de interacción de Ab652 en IL-13 humana se va a determinar en ensayo BlAcore. Se capturó Ab652 por una superficie anti-F(ab' )2 humano inmovilizada y luego la hIL-13 se capturó a su vez por el Ab652. Se valoró la unión del IL-13Ral soluble al complejo capturado de IL-13/anticuerpo . El ensayo se repitió con hIL-13Ra2 sustituido por hIL-13Ral. IL-13 presentado por Ab652 no puede unirse a ninguno de los receptores de IL-13, pero un anticuerpo anti-IL-13 de control, comercial (mAb 213) fue capaz de presentar IL-13 al receptor soluble de IL-13. En conclusión, Ab652 inhibe la unión de IL-13 a ambas subunidades del receptor de hIL-13, definiéndolo como un competidor de Eje 1.

Tabla 3: Afinidad de Fab de Ab652 purificado para hIL-13 La afinidad de Ab652 para hIL-13 se determinó en un ensayo Biacore sobre tres ensayos separados. La afinidad estuvo en el intervalo de 9-24pM con una media de 13.4 (+4.8)pM 1.6 Potencia Basada en Células La potencia in vi tro de Fab de Ab652 para neutralizar IL-13 se investigó usando el ensayo HEK-BLUEMR STAT-6 (Invivogen) . Este ensayo comprende células HEK293 que expresan de forma estable STAT-6 humano y que expresan de manera estable fosfatada alcalina embriónica segregada (SEAP) bajo el control del promotor mínimo de IFN-ß fusionado a cuatros sitios de unión de STAT-6. La potencia de neutralización (IC50) de Ab652 se valoró usando diferentes tipos de IL-13 humana, usada en el ensayo a 250 pg/mL. Se valoró la potencia de neutralización contra IL-13 humana tipo silvestre, recombinante producida de células hospedadoras bacterianas (£. coli) y mamíferas (fibroblastos de rata) . Se valoró la potencia de neutralización contra IL-13 humana de la variante R130Q y tipo silvestre natural producida de linfocitos T humanos y contra IL-13 de mono Cynomolgus recombinante producida en células mamíferas. No se purificó la hlL-13 de R130Q y se determinó la concentración por ELISA de hlL-13. La IL-13 de Cynomolgus no se purificó y se usó una concentración que da una respuesta equivalente del ensayo como 250 pg/mL de hlL-13. Además, la potencia de neutralización del Fab CA154_652.g2 se midió después de la nebulización usando el nebulizador de malla PARI eFLOW" .

Tabla 4: valores de IC50 de Fab de Ab652 contra múltiples formas de IL-13 en el Ensayo HEK-Blue. Para la determinación de la afinidad funcional, se realizaron titulaciones de IL-13 en la presencia de concentraciones fijas de Ab652. Se aplicó el análisis de gráfica Schild a los datos para determinar valores de KD para neutralización de IL-13 tipo silvestre, humana, recombinante e IL-13 de monos Cynomolgus, recombinante . Tabla 5: valores de IC50 y KD de Fab de Ab652 contra múltiples formas de IL-13 en el Ensayo HEK-Blue.

Tabla 4 Fuente de IL-13 (250 pg/ml) IC50, Fab de Ab652 (ng/ml) Derivado de E. coli, tipo 1.05 silvestre Mamifera (fibroblastos de 0.57 rata) , tipo silvestre Célula T humana natural, tipo 1.12 silvestre Célula T humana natural, 1.66 variante R130Q Cynomolgus en receptor humano 1.61 (1/4,000 = 250pg/ml) Fab nebulizado 1.15 Tabla 5 Fuente de IL-13 IC50 ± SEM de Afinidad Ab652 funcional ¾ de Ab652 ng/ml pM ng/ml pM Recombinante, derivada 0.670 ± 14.267 - - de E. coli 0.235 ± 4.943 (purificada) (n=4) (n=4) Potencia Recombinante, derivada 0.611 ± 12.857 0.103 2.173 contra IL- de células mamiferas 0.039 ± 0.821 (n=l) (n=l) 13 humana (fibroblasto (n=2) (n=2) tipo transíectado de rata o silvestre sobrenadante de HEK293) Natural, derivado de 1.544 ± 32.503 - - donador tipo silvestre 0.140 + 2.949 homocigoto (n=9) (n=9) (sobrenadante de PBMC) Potencia Natural, derivada de 0.861 + 20.079 - - contra IL- donador variante R130Q 0.141 ± 3.082 13 humana homocigota (n=7) (n=7) variante (sobrenadante de PBMC) En conjunto, estos datos demuestran que Fab de Ab652 es similarmente potente en la neutralización de IL- 13 humana natural recombinante producida de fuentes bacterianas y mamíferas . La potencia de CA154_652 . g2 contra IL- 13 de cynomolgus en este ensayo no es más de 3 veces menos que contra IL-13 humana también generada de fibroblastos de rata. La potencia de CA154_652.g2 no se altera después de la nebulización usando el nebulizador PARI eFLOWMR. 1.7 Caracterización Física de Ab652 Como se describe anteriormente, se generaron 8 diferentes regiones variables injertadas de anticuerpo usando la CDR derivadas del anticuerpo de rata seleccionado (SEQ ID NOs: 1-6, Figura 1). La selección de Ab652 (gLlgH2) de estos 8 injertos se basó en la potencia como se describe anteriormente y en las características biofísicas. En base a los datos generados para todas las regiones variables injertadas probadas, se eligió el anticuerpo 652 debido a que : - Mantuvo la más alta afinidad contra hIL-13 e IL-13 variante Tiene la temperatura más alta de fusión, Tm (indicadora de mayor estabilidad) Mayor estabilidad de pH (por Dicroismo Circular) , es decir, mostró menos perturbación a pH menor No agregación en la agitación o cuando se nebuliza .

En contraste, algunos de los otros injertos probados mostraron una reducción en la afinidad de unión, pobre estabilidad de pH y agregación por agitación y/o nebulización. 1.7.1 Efecto de Nebulización Para determinar si Ab652 fue adecuado para nebulización, se usó el nebulizador PARI eFLOWMR. Se nebulizaron a temperatura ambiente (aproximadamente 21°C) volúmenes de 2.5 mL de solución de Ab652 en acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 125 mM pH 5 y se recolectaron al condensar el nebulizado en tubos enfriados de recolección. El análisis subsiguiente no indicó degradación aparente. El estudio también se repitió usando una solución en PBS, pH 7. Se incluyó un control positivo de IgG4 , a que se ha encontrado que se agrega durante la nebulización. El análisis de las muestras nebulizadas fue por exclusión de tamaño, SDS-PAGE, dispersión dinámica de luz y unión de ligando, con la finalidad particular de detectar material agregado presente. No fue evidente el cambio por ninguna de estas técnicas indicando que Ab652 fue resistente al daño durante la nebulización . 1.7.2 Resumen de Características Físicas de Ab652 pl (punto isoeléctrico) 8 (promedio de dos determinaciones) estabilidad térmica, Tm 84°C No se observó agregación de Ab652 cuando el anticuerpo se sometió a agitación/sacudida o nebulización. 2. Efecto de Ab652 en Modelo Primate no Humano de Asma Obj etivo El objetivo de este estudio fue valuar eficiencia de Ab652 en un modelo de primate no humano de asma. Los puntos finales primarios incluyeron el efecto en las cuentas de células de lavado broncoalveolar (BAL) , en los niveles de quimiocinas, y en los cambios de función pulmonar tardía y temprana como se valora por resistencia pulmonar (RL) .

Métodos Se administró Ab652 usando un nebulizador de malla. Se llevaron a cabo estudios de simulación de respiración usando parámetros típicos de ventilador y montaje de tubería usada en la instalación de estudio. Los resultados de los estudios de simulación de respiración indicaron que 40.4 % de la carga de material en el nebulizador se administraría al nivel del tubo endotraquial .

Se seleccionaron animales de estudio en base a valores históricos de la función pulmonar y las cuentas de eosinófilos de BAL. En la sesión de examen, los animales se sometieron a estimulación con antígeno de Ascaris suum (A. suum) antes de la asignación a los grupos de tratamiento a fin de caracterizar su respuesta normal (no tratada) a A. suum. Después de esta sesión de examen, los animales se asignaron a grupos de dosis en base a las cuentas de células de BAL y en base a los datos de función pulmonar de la sesión de examen. En la sesión de tratamiento, los animales recibieron ya sea vehículo nebulizador (PBS) , o Ab652 nebulizado a nivel de dosis en el nebulizador de ya sea 0.1, 1, 10, y 60 mg/animal/día . Las dosis se administraron mediante nebulizador en los días -2, -1, 1, 2, y 3. En los días 1 y 2, la administración del tratamiento se presentó aproximadamente 30 minutos antes con la estimulación con A. suum.

Los procedimientos de estimulación fueron idénticos en ambas sesiones. Cada animal se estimuló en los Días 1 y 2, y se registraron los valores de la función pulmonar (RL) durante al menos 15 minutos después de cada estimulación con antígeno y a 24 h después de cada estimulación con alérgeno. Se recolectó el fluido de BAL antes de la primera estimulación y aproximadamente 24 h después de la segunda estimulación para la evaluación de los números celulares totales, de la morfología y de las cuentas diferenciales a fin de valorar el grado de inflamación pulmonar. Las muestras del sobrenadante de BAL se recolectaron y analizaron para determinación de concentración de quimiocinas .

Resultados El Ab652 nebulizado inhibió significativamente el incremento en la eotaxina-3 de BAL a bajas dosis de mg/día (Figura 13) . El Ab652 nebulizado provocó una . inhibición dependiente de la dosis del incremento en los eosinófilos de BAL medidos entre las sesiones de examen y tratamiento (Figura 14) . El Ab652 nebulizado inhibió de forma significativa y dependiente de la dosis la respuesta pico de fase temprana en el día 2 medido hasta 15 minutos después de la estimulación con Ascaris en la sesión de tratamiento (Figura 15) . El Ab652 nebulizado inhibió de forma significativa dependiente de la dosis la respuesta de fase tardía medida 24 horas después de dos días de estimulación con alérgeno (Figura 16) .

Conclusiones Los datos generados con Ab652 nebulizado en el modelo de asma por Ascaris en monos cynomolgus demostró que la inflamación pulmonar alérgica activada por IL-13 es sensible a la modulación farmacológica por un fragmento Fab neutralizante anti-IL-13 administrado directamente a las vías respiratorias en un aerosol. Significativamente el Ab652 fue potente, demostrando eficacia a bajas dosis de mg/día.

Por supuesto, se entenderá que la presente invención se ha descrito a manera de ejemplo únicamente, y de ninguna manera se propone que se limite, y que las modificaciones de detalle se pueden hacer dentro del alcance de las reivindicaciones más adelante en la presente. Las características preferidas de cada modalidad de la invención son con respecto a cada una de las otras modalidades mutatis mutandis. Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitado a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia como si cada publicación individual se indicará de manera específica e individual para que se incorpore como referencia en la presente como si se expusiera completamente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana que comprende una cadena pesada, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:l para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.

2. Un anticuerpo antagonista de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO:l para CDR-H1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.

3. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana, que comprende una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, a CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

4. Un anticuerpo antagonista de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende adicionalmente una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y un a CDR que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

5. Un anticuerpo antagonista de conformidad con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.

6. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana, caracterizado porque el dominio variable de la caden . pesada comprende tres CDR y la secuencia de CDRH-1 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia · dada en SEQ ID NO:l, la secuencia de CDRH-2 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDRH-3 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 3.

7. Un anticuerpo antagonista de conformidad con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR y la secuencia de CDRL-1 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 4, la secuencia de CDRL-2 tiene al menos 6 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 5 y la secuencia de CDRL-3 tiene al menos 60 % de identidad o similitud a la secuencia dada en SEQ ID NO: 6.

8. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 31.

9. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 23.

10. Un anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la molécula de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: una molécula completa de anticuerpo que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de estas, tal como Fab, Fab' modificado, Fab' , F(ab' )2, F , VH, VL o scFv.

11. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 23.

12. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tienen al menos 80 % de identidad o similitud al dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11 y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 80 % de identidad o similitud al dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11.

13. Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 27.

14. Un anticuerpo neutralizante que se une a IL-13 humana, caracterizado porque las cadenas pesada y ligera son al menos 80 % idénticas o similares a las cadenas pesadas y ligeras correspondientes del anticuerpos de conformidad con la reivindicación 13.

15. Una molécula de anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque tiene un efector o una molécula indicadora unida a este.

16· Un anticuerpo antagonista, caracterizado porque tiene una afinidad de unión para IL-13 humana aisladas de 30 pM o mejor.

17. Una secuencia aislada de ADN, caracterizada porque codifica para las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Un vector de clonación o de expresión, caracterizado porque comprende una o más de las secuencias de ADN de conformidad con la reivindicación 17.

19. Un vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vector comprende las secuencias dadas en SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 28.

20. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 19.

21. Un proceso para la producción del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 20 y aislar el anticuerpo.

22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

23. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque adicionalmente comprende otros ingredientes activos .

24. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, caracterizados porque son para el uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por IL-13 o que se asocia con un nivel incrementado de IL-13.

25. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que se media por IL-13 o que se asocia con un nivel incrementado de IL-13.

26. Un método para el tratamiento de un sujeto humano que padece de, o está en riesgo de un trastorno patológico mediado por IL-13, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo anti-IL-13 por inhalación .

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el fragmento Fab o Fab' de anticuerpo es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque el trastorno patológico se selecciona del grupo que consiste de:' trastornos asmáticos, trastornos atópicos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , condiciones que comprenden inflamación en las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, condiciones inflamatorias, condiciones autoinmunitarias , tumores o cánceres, infección viral y supresión de expresión de respuestas inmunitarias tipo 1 protectoras.