BRPI0923863A2

BRPI0923863A2 - cevada com a atividade reduzida de lipoxigenase

Info

Publication number: BRPI0923863A2
Application number: BRPI0923863-8A
Authority: BR
Inventors: Birgitte Skadhauge; Finn Lok; Klaus Breddam; Ole Olsen; Lene Molskov Bech; Soren Knudsen
Original assignee: Carlsberg Breweries A/S; Heineken Supply Chain B.V.
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2020-08-11
Also published as: WO2010075860A3; SA109310019B1; JP2012513744A; AU2009335397A8; CN102333440A; NZ593962A; US20110318469A1; HK1162851A1; AU2009335397B2; WO2010075860A2; CN102333440B; CA2747225A1; AU2009335397A1; EA028532B1; MY155960A; AR074913A1; UY32372A; MX2011006588A; JP5670347B2; US9363959B2

Abstract

bebida preparada a partir de uma planta de cevada, ou uma parte da mesma, composição de mosto e método para produzir uma bebida, composição de malte, e uma planta com um nível muito baixo de potencial t2n de acordo com a invenção, é provida cevada com perda total de enzimas lipoxigenase (lox) -1 e lox-2 funcionais e produtos de planta produzidos das mesmas, tais como fabricados de malte usan-do grãos de cevada defeituosos na síntese dos ácidos graxos que dioxigenizam as enzimas lox-1 e lox-2. as enzimas levam em consideração as principais atividades relacionadas com dioxigenação de ácido linoléico em ácido octadecadienóico 9- e 13-hidroperóxido, respectivamente. ácido octade-cadienóico 9-hidroperóxido representa um metabólito de percurso lox, que - através de reações espontâneas ou enzimáticas adicionais - pode levar ao aparecimento de trans-2-nonenal (t2n). a invenção permite que fabricantes de cerveja produzam uma cerveja com níveis insignificantes de sabores ásperos de t2n específicos, mesmo após armazenamento prolongado da bebida.

Description

. “BEBIDA PREPARADA A PARTIR DE UMA PLANTA DE CEVADA, OU UMA PARTE DA MESMA, COMPOSIÇÃO DE MOSTO E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA BEBIDA, COMPOSIÇÃO DE MALTE, E UMA PLANTA COM UM NÍVEL MUITO BAIXO DE POTENCIAL T2N" Todas as referências de patente e não patentes citadas no pedido são incorporadas por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO - A presente invenção refere-se aos avanços na biotecnologia de plantas, permitindo a divulgação de plantas de cevada, e produtos derivados, que estão com defeito na síntese ' 10 de duas enzimas lipoxigenase (LOX), LOX-1 e LOX-2 - assim oferecendo novas matérias- primas para uma variedade de usos. As referidas matérias-primas, quando, por exemplo, exploradas na produção de bebidas, facilitam o desdobramento de novas capacidades para cervejas mais distintivas e de sabor estável que acumulam notavelmente baixos níveis do composto sabor insípido trans-2-nonenal (T2N) - com um benefício adicional de apenas contendo baixos níveis de potencial de T2N.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Uma grande fração de cerveja é produzida com base em cevada (Hordeum vulgare, L.), que é uma planta de colheita monocotiledônea cultivada em muitas partes do mundo. É propagada não só devido à sua importância econômica como fonte de produtos industriais, taléomoa cerveja, mas também como uma fonte de alimentação animal.

Métodos não são, infelizmente, disponíveis para preparar plantas de cevada trans- gênica que completamente faltam expressão de um determinado gene e proteína corres- pondente. Em geral, para a cevada, aplicação de técnicas de antissentido pode ser utilizada para gerar plantas transgênicas que ainda expressam algumas das proteínas (ver, por exemplo, Robbins et al., 1998; Stahl et al., 2004; Hansen et al., 2007). Além disso, métodos eficazes não têm sido desenvolvidos para preparação de mutações específicas usando RNA / DNA quimérico ou mutagênese dirigida a sítio em plantas de cevada. Na verdade, nem um único exemplo de alvo de gene dirigido a oligonucleotídeos bem sucedido visando cevada Fr foi publicado. lida e Terada (2005) observaram que alvo de gene dirigido a oligonucleotídeos tem sido persuadido no milho, tabaco, e arroz, mas não em cevada - e em todos os casos e com o gene ALS como um alvo. Parte da conclusão da investigação foi que ele continua a ser visto se a estratégia com as modificações apropriadas puderem ser aplicáveis a outros genes que não aqueles diretamente selecionáveis, tal como os genes ALS. Mutagênese alvo usando nucleases dedo de zinco representa outra ferramenta que poderia ser usada no —futuropara investigar biologia básica de planta ou para modificar plantas cultivadas (Durai et al., 2005; Tzfira e White, 2005; Kumar et al., 2006). Também neste caso, mutagênese não tenha sido persuadido ou aplicado com sucesso em cevada.

- 2 . Mutantes de cevada, no entanto, podem ser preparados por mutagênese aleatória utilizando tratamento químico ou irradiação, tal como pelo tratamento com azida de sódio (NaN;; FIG 1). Um exemplo é grãos de cevada mutagenizados com NaN; e selecionados para altos níveis de fosfato livre, com o objetivo de identificar mutantes de baixo fitato (Ras- —mussene Hatzack, 1998), um total de 10 mutantes de 2.000 grãos selecionados foram iden- tificados.

No entanto, a identificação de um mutante particular após tratamento NaN3 requer um método de peneiração eficaz e está longe de ser sempre bem sucedido. - Em 1970, a molécula que confere o sabor tipo papelão, como na cerveja foi isolada e identificada como T2N, uma alquenal volátil Cy (Jamieson e Gheluwe, 1970). Uma vez que 1 10 o nível limite de sabor para TAN em humanos é extremamente baixo, anteriormente deter- minado como sendo de cerca de 0,7 nM ou 0,1 ppb (Meilgaard, 1975), os produtos com mesmo com níveis em minutos do aldeído são considerados antigos, devido ao sabor sabor insípido do produto.

No entanto, o nível T2N é geralmente muito baixo em cerveja fresca (Lermusieau et al., 1999), por isso tem sido especulado que durante o armazenamento, T2N livre pode ser liberado de adutos de T2N (Nyborg et al., 1999). Esta noção foi apoiada por uma observação posterior de que o Potencial de TAN em mosto correlaciona-se com a for- mação de T2N após o armazenamento do produto (Kuroda et al., 2005). O grão de cevada contém três enzimas LOX conhecidas como LOX-1, LOX-2 e LOX-3 (van Mechelen et al., 1999). LOX-1 catalisa a formação de ácido 9-hidroperóxido oc- tadecadienóico (9-HPODE, ver FIG 2 para uma visão parcial de percurso LOX.) — um pre- cursor de ambos T2N e ácidos trihidróxi octadecenóicos (abreviado THAS) a partir do ácido linoléico.

LOX-2 principalmente catalisa a conversão de ácido linoléico e 13-HPODE, que é adicionalmente metabolizado para hexanal, um aldeído C6 com um limite de sabor elevado de 0,4 ppm (Meilgaard, supra). A ação de LOX-3 provavelmente não é de relevância no —quedizrespeito à aplicação imediata por duas razões: o nível de expressão do gene corres- pondente em grãos de cevada é muito baixo, e a especificidade do produto de LOX-3 per- manece indefinida.

Para suportar os dados acima mencionados, vários relatos foram notados que T2N ' é produzido através de um percurso bioquímico que envolve a conversão de ácido linoléico em 9-HPODE, inicialmente catalisado por LOX-1, e depois clivagem de ação de liase de 9- Í HPODE a 9-hidroperóxido (ver, por exemplo, Kuroda et al., 2003, 2005; Noodermeer et al., 2001). Parece não haver nenhuma correlação entre a atividade de LOX geral no malte e no mosto em potencial de nonenal do mosto.

No entanto, houve especulações sobre uma correlação significativa entre atividade de LOX-1 e potencial de TAN em mosto, principal- mente porque atividade de LOX-2 foi considerada inferior no que diz respeito à formação do potencial de T2N no mosto (Kuroda et al., 2005).

M 3 . Na FIG. 2 é, como mencionado acima, mostrado uma parte do percurso LOX, aqui focalizando reações bioquímicas de ácido linoléico para T2N. A principal atividade da enzi- ma LOX-1 diz respeito à conversão do ácido linoléico em 9-HPODE, que é um metabólito a montante do percurso bioquímico levando à formação de T2N. Em contraste, a principal ati- vidadedeLOX-2 refere-se à conversão do ácido linoléico em 13-HPODE, que é separado do percurso bioquímico acima mencionado para T2N. Deve ser notado que enzimas LOX-1 e LOX-2 podem utilizar o ácido linolênico como substrato, mas essa atividade está fora do . escopo do presente pedido assim como os percursos correspondentes não levam a forma- ção de T2N. 1 10 LOX-1 foi pensada para contribuir com a atividade de LOX importante no malte (ver, por exemplo, Kuroda et al., 2003).

Várias plantas de cevada diferentes foram desenvolvidas, as quais são caracteriza- das por reduções ou falta de atividade de LOX-1. Por exemplo, grãos de cevada e plantas de cevada, com uma atividade de LOX-1 baixa foram divulgados no pedido de PCT WO 02/053721 de Douma, A.C. et al. e em WO 2005/087934 de Breddam, K. et al., a atenção foi dada em dois diferentes mutantes de cevada deficientes em atividade de LOX-1 — um mu- tante dividido e um mutante com códon de parada translacional prematuro. Estes foram identificados seguintes a propagação e triagem de plantas mutantes, como ilustrado na FIG.

1. Enquanto os mutantes acima mencionados foram identificados por triagem de cevada mutagenizada em NaN,, Hirota, N. et al. descrita em EP 1609866 uma planta de cevada sem atividade de LOX-1, que foi identificada selecionado uma coleção de cultivares de ce- vada.

Vários exemplos em plantas mutantes que sintetizam baixos níveis de LOX são co- nhecidos. No entanto, nenhuma planta de cevada deficiente em várias atividades de lipoxi- —genase, por exemplo, nenhuma planta de cevada deficiente em atividades de ambas as LOX-1 e LOX-2 foram descritas. Métodos para permitir a manipulação genética de plantas são frequentemente específicos para um tipo de planta específico, e, assim, apesar de pou- cas plantas de arroz, plantas de soja, ou plantas de Arabidopsis serem conhecidas para . compreender baixos níveis de LOX — métodos para preparar tais plantas não podem ser usados na geração de plantas de cevada com baixa ou nenhuma atividade de LOX. Além Í disso, mutantes de LOX de uma espécie de planta podem ter propriedades diferentes em comparação com mutantes de LOX de outra espécie de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Mosto é um líquido complexo chave na produção de bebidas à base de malte, tal como cerveja (cf. FIG. 3 que provê uma visão geral sobre todo o processo de fabricação de cerveja). Mosto feito a partir de plantas de cevada deficientes em atividade de LOX-1 é re- almente caracterizado por compreender níveis significativos de potencial de T2N, embora

. 4 : este nível seja menor do que no mosto preparado a partir da cevada do tipo selvagem. Uma vez que o potencial em mosto se correlaciona com T2N formado na cerveja após o armaze- namento (Kuroda et al., 2005), existe, portanto, uma necessidade por plantas de cevada úteis na produção de mosto com um nível substancialmente reduzido de potencial de T2N.

Métodos para reduzir a atividade de LOX por tratamento térmico têm sido descritos. No entanto, o tratamento térmico foi realizado, geralmente, durante maltagem e/ou prepara- ção do mosto, e produtos de atividade de LOX foram, assim, permitidos acumularem na ce- . vada até a realização de tratamento térmico. Análise de cevada revelou que quantidades significativas de produtos da atividade de LOX estavam presentes em cevada, mesmo antes . 10 damaltagem (Wackerbauer e Meyna, 2002).

A presente invenção provê plantas de cevada deficientes em atividades de LOX-1 e LOX-2 e divulga as plantas de cevada têm muitas vantagens surpreendentes e profundas. Como aqui mencionado acima, Kuroda et al. (Supra) descreveu a falta de correlação entre a atividade de LOX no malte e o potencial TAN no mosto, e atribuiu isso à presença de ativi- dade deLOX-2.Kuroda et al. (2005), consequentemente propôs um papel insignificante de LOX-2 no que diz respeito à formação de potencial de T2N.

Pesquisadores da fabricação de cerveja têm lutado com a compreensão de que de- termina a formação de T2N livre e potencial T2N. É, portanto, inesperado, talvez perplexo, quando a presente invenção provê evidência experimental para divulgar o efeito benéfico do uso de plantas de cevada deficientes em ambas as atividades de LOX-1 e LOX-2 para a produção de mosto que apresenta níveis muito baixos de potencial T2N. E também o nível de T2N livre no mosto preparado a partir de plantas de cevada deficientes em ambas as atividades de LOX-1 e LOX-2 foi encontrado como sendo menor do que o preparado a partir de cevada de LOX-1 nula.

É um objetivo da presente invenção prover bebidas preparadas a partir de uma planta de cevada, ou uma parte dela, em que a bebida compreende níveis muito baixos de potencial T2N - e em que a planta de cevada, ou parte dela, compreende uma primeira mu- tação que resulta em uma perda total da função da atividade de LOX-1, tal como a perda total de uma enzima LOX-1 funcional, e uma segunda mutação resultando em uma perda totaldafunção de atividade de LOX-2, tal como a perda total da enzima LOX-2 ativa.

É A invenção também tem como objetivo prover plantas de cevada úteis na prepara- ção das bebidas da invenção. Assim, a invenção descreve a geração de plantas de cevada, e suas partes, compreendendo uma primeira mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-1, tal como a perda total da enzima LOX-1 funcional, e uma — segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, tal como a perda total da enzima LOX-2 funcional.

Além disso, a invenção provê produtos de planta que compreendem uma planta de

E 5 3 cevada processada, ou parte dela, em que a planta compreende uma primeira mutação que resulta em uma perda total da função de atividade de LOX-1, tal como a perda total da en- zima LOX-1 funcional, e uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, tal como uma perda total da enzima LOX-2 funcional. Sem limitações, os produtos de planta acima mencionados podem, por exemplo, ser uma composição de malte, ou uma composição de mosto, ou uma bebida (como uma base de malte, por exem- plo, cerveja ou cervejas a base de malte não alcoólicas), ou uma bebida a base de cevada, - ou uma bebida a base de uma mistura de malte e cevada e opcionalmente outros ingredien- tes. Os produtos de planta também podem ser xaropes de cevada, xaropes de malte, extra- . 10 tosde cevada, e extratos de malte.

Além disso, a invenção também se refere a métodos para produzir uma bebida ca- racterizada por um nível muito baixo de potencial T2N, os métodos compreendendo as eta- pas de: (i) preparar uma composição que compreende uma planta de cevada, ou suas par- tes, compreendendo uma primeira mutação que resulta em uma perda total da função de atividade de LOX-1 tal como a perda total de uma enzima LOX-1 funcional, e uma segunda mutação resultando em uma perda total de LOX-2 funcional, tal como a perda total da enzi- ma LOX-2 ativa; (ii) processar a composição de (i) em uma bebida; obtendo assim uma bebida caracterizada por um nível muito baixo de potencial T2N.

A invenção também se refere plantas de cevada, que — em adição a compreende- rem uma primeira mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-1, e uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, - compreendem uma ou mais mutações úteis adicionais.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra um exemplo de como grãos de cevada mutagenizados por NaN; podem ser propagados. Grãos de geração de crescimento MO em plantas que desenvolvem e grãos de geração M1. Estes podem ser semeados para o desenvolvimento em plantas M1, — que produzem novos grãos de geração M2. Em seguida, as plantas M2 crescem e produ- í zem grãos da geração M3. Grãos de geração M3 podem ser autorizados a germinar, por exemplo, para análise do coleóptilo das plantas M3 germinadas. Além disso, as flores deri- vadas de sementes de plantas M3 podem ser utilizadas em cruzamentos com linhagens de cevada ou para obter cultivares de plantas da geração M4. Uma figura semelhante é apre- sentada como figura 1A no pedido de patente PCT WO 2005/087934 de Breddam, K. et al. A figura 2 mostra uma ilustração esquemática de um percurso bioquímico para a conversão e degradação do ácido linoléico para T2N. LOX-1 principalmente catalisa a con-

. 6 versão de ácido linoléico em 9-HPODE, que é enzimaticamente degradado para cis- nonenal. Este composto sofre uma isomerização espontânea química para T2N. LOX-2 principalmente catalisa a conversão de ácido linoléico em 13-HPODE, que pode ser conver- tido em 2-E-hexanal (não mostrado).

A figura 3 mostra uma vista simplificada e esquemática de um processo de produ- ção de cerveja preferido, incluindo maceração de grãos de cevada (1), maltagem (2), seca- gem em estufa (3), moagem do malte seco (4), brassagem (5), filtração (6), ebulição do . mosto na presença de adição de lúpulo (7), fermentação na presença de levedura (8), matu- ração de cerveja (9), filtração de cerveja (10), embalagem, tal como a embalagem em garra- - 10 fas, latas, ou similar (11), e rotulagem (12). Os processos individuais podem ser agrupados em seções que compreendem a produção de malte (1-3), a produção de mosto (4-7), fer- mentação (8-9), e a preparação da cerveja final (10-12). Embora o método preferido seja ilustrado, outros métodos podem ser previstos os quais omitem algumas das etapas descri- tas (filtração pode, por exemplo, ser omitida, ou lúpulos não podem não ser adicionados - ou etapas adicionais podem ser adicionadas, tal como adição de adjuntos, açúcares, xaropes, ou carbonato).

A figura 4 mostra os resultados das comparações das atividades de LOX totais em sementes germinadas da geração M3 (A), Geração M4 (B), e Geração M5 (C). Tais ativida- des foram medidas em extratos de embriões que foram isolados de grãos germinados do mutante A689 de LOX nula dupla, mutante D112 de LOX-1 nula e linhagem de cultura de cerveja LOX-1 nula Ca211901. Alíquotas de extrato inativado pelo calor das mesmas amos- tras serviram como controles experimentais fem C: mutante bruto D112 de LOX-1 nula (*), linhagem de cultura de cerveja LOX-1 Ca211901 (**)]. Mostrados são também os genótipos de LOX-1 e LOX-2 das amostras de plantas analisadas (peso: tipo selvagem).

A figura 5 mostra os cromatogramas das análises de HPLC utilizadas para ensaio para a formação de 9- e 13-HPODEs em embriões de cevada germinados em 48-h. Os HPODESs foram detectados através da medição da absorvância a 234 nm, com os resulta- dos obtidos em unidades de absorvância relativa (UA). Picos dos perfis de eluição que cor- . respondem a 9- e 13-HPODEs são indicados por setas. (A) Cromatograma de padrões 9- e 13-HPODE. (B) Cromatograma de HPODEs formados em extratos preparados a partir de í embriões germinados de mutante D112 de LOX-1 nula. (C) Cromatograma de HPODESs for- mados em extratos preparados a partir de embriões germinados de mutante A689 de LOX nula dupla, geração M4.

A figura 6 mostra os cromatogramas das análises de HPLC utilizadas para ensaio paraaformação de 9-e13-HPODEs em embriões de micro grãos maltados em 72-h. HPO- DEs foram detectados através da medição da absorvância a 234 nm, com os resultados obtidos em unidades de absorvância relativa (UA). Picos dos perfis de eluição que corres-

, 7 : pondem a 9- e 13-HPODESs são indicados por setas. (A) Cromatograma de 9- e 13-HPODEs formados em cv. Barke do tipo selvagem. (B) Cromatograma de HPODEs formados em ex- tratos de embriões de mutante D112 de LOX-1 nula. (C) Cromatograma de HPODESs forma- dos em extratos de mutante A689 de LOX nula dupla, geração M5.

A figura 7 mostra os níveis de T2N livre formado em amostras micro-maltadas de cv de cevada de cv. Power do tipo selvagem, mutante D112 de LOX-1 nula, e três mutantes de linhagens de LOX nula dupla potencial A689, geração M5. Também estão incluídos os genó- - tipos de LOX-1 e LOX-2 das amostras de cevada analisadas (peso: tipo selvagem). A figura 8 mostra os níveis de T2N livre formado em amostras de grãos cozidos . 10 produzidos a partir de grãos micromaltados de cv. Power do tipo selvagem, mutante D112 de LOX-1 nula, e mutante A689 de LOX nula dupla, geração M5. Mostrados são também os Genótipos de LOX-1 e LOX-2 das amostras de cevada analisadas (peso: tipo selvagem). A figura 9 mostra os níveis dos precursores de T2N em amostras de grãos cozidos produzidos a partir de grãos micromaltados de cv. Power do tipo selvagem, mutante D112 deLOX1 nulae mutante A6S9 de LOX nula dupla, geração M5.

A figura 10 mostra os níveis de precursores de T2N em cervejas produzidas em um experimento de brassagem de cerveja de 200 | usando malte de cv. Power, mutante D112 de LOX-1 nula, mutante A689 de LOX nula dupla. Mostrados são os genótipos de LOX-1 e LOX-2 do maite utilizado (peso: tipo selvagem).

A figura 11 mostra uma comparação dos níveis de T2N livre em alíquotas das amostras indicadas tomadas de mostos cozidos de 200-l, produzidas por cevada para cerve- ja ou maltagem normal e brassagem. Mostrados são os genótipos de LOX-1 e LOX-2 de matérias-primas utilizadas (peso: tipo selvagem).

A figura 12 mostra uma comparação dos níveis de precursores de T2N nas alíquo- tasde amostra indicada tomadas de mostos cozidos de 200-l (cf. FIG. 11), seja produzido por cevada para cerveja ou malte usando maltagem normal e brassagem. Mostrados são também os genótipos de LOX-1 e LOX-2 de matérias-primas utilizadas (peso: tipo selva- gem).

. A figura 13 mostra aspectos de desenvolvimento de T2N em cervejas de triagens de cerveja de 200-l, utilizando o cultivar de cevada indicado e mutantes como matérias- f primas. (A) Análises de cerveja preparada com cevada apenas, com foco no desenvolvimen- to de T2N livre durante o envelhecimento forçado. O nível do limite do saber de T2N a 50 ppt é indicado por uma linhagem horizontal tracejada. Em uma experiência separada foram comparados os níveis de precursores de T2N em cervejas frescas de cervejas de cevada e —normais(B), em (C)é mostrado os níveis de T2N livre em cervejas frescas (barras brancas) em comparação com os níveis após duas semanas a 37 ºC (barras pretas). Mostrados são também os genótipos de LOX-1 e LOX-2 de matérias-primas utilizadas (peso: tipo selva-

R 8 . gem).

A figura 14 mostra uma comparação dos níveis de THA e proporções em ambas as cervejas de cevada (A), e em cervejas produzidas usando malte normal (B). 9,1213- e 9,10,13-THAs são gerados por reações parcialmente desconhecidas do percurso LOX-1 e LOX-2, respectivamente.

A figura 15 mostra uma ilustração sobre o desenvolvimento temporal de “folhas” de sabor insípido (A) e "envelhecidas" (B) em cerveja de cevada de 200 |, utilizando as maté- - rias-primas cv. Power (barras pretas), LOX-1 nula (barras cinzas), e LOX nula dupla (barras brancas). Um painel especializado de sabor de cerveja julgou as cervejas, usando uma es- - 10 calade0O (nenhum sabor insípido) a 5 (extremo sabor insípido).

A figura 16 mostra como a espuma se desenvolve em cervejas de cevada (A), e em cervejas a base de malte (B). Em ambos os experimentos, uma cerveja de fermentação bai- xa comercial serviu como referência (linha tracejada grossa), em comparação com a cerveja produzida com matérias-primas de cv. Power (linha tracejada fina), LOX-1 nula (linha contí- nuafina),eLOX nula dupla (linha ininterrupta grossa).

A figura 17 mostra um mapa da organização do gene de cevada genômico para LOX-2, com foco na região que abrange o códon de iniciação (ATG) e códon de parada (TAA). A sequência 3229-pb foi encontrada como consistindo em 6 éxons (caixas cheias), e 5 íntrons (linhas). A mutação identificada no gene para LOX-2 do mutante A689 de LOX nula —duplaé indiciada por uma seta vertical. Nomeadamente, mutante A689 de LOX nula dupla também contém um códon de parada prematuro translacional no gene para LOX-1 (cf. mu- tante D112 como ilustrado na FIG. 15 de Patente dos EUA nº 7420105).

Figura 18 mostra como a análise de genótipo pode ser usada para identificar mu- tantes de LOX nula. Focus se refere à detecção de SNP assistida de uma planta de cevada —deLOX nula dupla, isto é, uma forma para alcançar a detecção combinada de um de uma mutação GA na posição 3474 do gene LOX-1, e uma mutação G—>A na posição 2689 do gene LOX-2. (A) Diagrama de eletroforese em gel de agarose de fragmentos de PCR ampli- ficados forma o DNA modelo indicado utilizando os pares de iniciador indicado, isto é, o ge- r ne LOX-2 do tipo selvagem pode ser amplificado usando iniciadores FL1035 e FL1039, en- quantoo gene mutante de LOX-2 nula pode ser amplificado usando iniciadores FL1034 e f FL1039. (B) Diagrama para ilustrar como PCRs com pares de iniciadores FL820 e FL823 (contendo um 3' base complementar para a mutação de LOX-1 nula específica, como mos- trado por um asterisco), e um par de iniciador FL 1034 (contendo um 3' base complementar para a mutação de LOX-2 nula como ilustrado por um asterisco) e FL1039 pode gerar pro- dutosdePCR de 166 pb e 200 pb, respectivamente, proveu a presença de mutações de LOX nula. (C) Representação do seguinte resultado de eletroforese em gel de agarose de DNA marcador (faixas 1 e 4), e aquele do DNA amplificado por PCR de mutante A689 de

" 9 : LOX nula dupla utilizando as combinações de iniciador acima para a detecção das mutações LOX-1 nula e LOX-2 nula (faixa 2). As reações de PCR da cevada do tipo selvagem não resultaram em produtos de PCR correspondentes (faixa 3). A figura 19 mostra um exemplo de análise de SNP assistida de plantas descenden- tesde cruzamentos com cevada LOX nula dupla. (A) Uma representação esquemática utili- zando as combinações de iniciador detalhadas na legenda da FIG. 18 aqui acima, isto é, iniciadores para detecção baseada em PCR de mutações LOX-1 nula e LOX-2 nula. A pri- - meira faixa da esquerda — com padrão de banda "a", como observado abaixo da faixa — não contém nenhum produto PCR específico para a presença das duas mutações [isto é, ambas 7 10 asregiões modelo tiveram sequências do tipo selvagem (W)], enquanto a próxima faixa com o padrão de banda "b" destaca um produto PCR derivado de uma planta mutante de LOX-1 nula (M). A terceira faixa com padrão de banda "c" é derivada de uma planta LOX-2 nula, e aquela na quarta faixa com padrão de banda "d" é de uma planta LOX nula dupla. (B) Eletro- forese em gel de agarose em genótipos de cevada do tipo selvagem, LOX-1 nula, LOX-2 nula,eLOX nula dupla. Análise dos padrões de bandas, de acordo com o descrito acima em (A), revelaram que as faixas 2, 6, 10, 12, 18 e 22 continham produtos amplificados a partir de plantas portando a mutação de LOX-1 nula (marcada com "b" abaixo das faixas), en- quanto as faixas 1, 3, 9, 11, 19, 21, e 23 continham produtos a partir de plantas portando a mutação de LOX-2 nula (marcada com "c" abaixo das faixas ). Faixas 7, 15 e 17 continham produtos de PCR a partir de plantas LOX nula dupla portando as mutações do gene LOX-1 e LOX-2 (marcadas com "d" abaixo das faixas). E faixas 4, 5, 8, 13, 14, 16 e 20 não continham produtos de amplificação a partir de plantas portando um dos alelos de LOX nula (marcados com "a" abaixo das faixas), isto é, as plantas foram do tipo selvagem com respeito às se- quências testadas. DNA marcador é separado em faixas marcadas com "MW".

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Definições Na descrição, figuras e tabelas que se seguem, uma série de termos é usada. A fim de prover as especificações e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, T as definições a seguir são fornecidas: Como usado aqui, "um/uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto f em que ela for usada.

O termo "característica agronômica" descreve uma característica fenotípica ou ge- nética de uma planta que contribui para o desempenho ou valor econômico da planta. Tais características incluem resistência a doenças, resistência a insetos, resistência a vírus, re- sistência nematóide, tolerância à seca, tolerância à salinidade elevada, produção, altura de planta, dias para maturação, classificação de grão (isto é, fracionamento do tamanho do grão), teor de nitrogênio do grão e assim por diante.

p 10 a Por "sequência de nucleotídeos antissentido" destina-se uma sequência que está na orientação inversa à orientação 5'-para-3' da codificação normal daquela sequência de nucleotídeos.

Quando presente em uma célula de planta, a sequência de DNA antissentido de preferência reduz a expressão normal da sequência de nucleotídeos para o gene endó- geno,e pode interromper a produção da proteína nativa correspondente.

Em expressão de plantas de cevada de nucleotídeos antissentido, em geral, só reduz a expressão, mas não impede a expressão da referida proteína nativa. - O termo "cevada" em referência ao processo de fazer cerveja e bebidas a base de cevada, principalmente quando usado para descrever o processo de maltagem, significa . 10 grãos de cevada.

Nos demais casos, salvo disposição em contrário, "cevada" significa a planta de cevada (Hordeum vulgare, L.), incluindo qualquer linhagem ou cultivar ou varieda- de, enquanto parte de uma planta de cevada pode ser qualquer parte de uma planta de ce- vada, por exemplo qualquer tecido ou células.

Por "resistência a doenças" pretende-se que as plantas evitem os sintomas de do- ença,que são o resultado de interações planta-patógeno.

Desta forma, evita-se que patóge- nos causem doenças em plantas e os sintomas da doença associada.

Alternativamente, os sintomas da doença causados pelo patógeno são minimizados ou reduzidos, ou mesmo evitados.

Como usado aqui o termo "LOX nula dupla" refere-se a uma perda total da função da atividade de LOX-1e uma perda total da função de atividade de LOX-2. Assim, "LOX nula dupla" pode ser caracterizado por uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma perda total de enzima LOX-2 funcional.

Assim, uma "planta de cevada de LOX nula dupla”, é uma planta de cevada compreendendo uma primeira mutação resultando em uma perda total da função da atividade de LOX-1 e uma segunda mutação resultando em uma perda total de função de atividade de LOX-2. Uma "planta de cevada de LOX nula dupla" pode assim ser CARACTERIZADA por uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma perda total de enzima LOX-2 funcional.

Da mesma forma, "grãos de LOX nula dupla" são grãos compreendendo uma primeira mutação resultando em uma perda total de função de ativida- " de de LOX-1 e uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade deLOX-2,e assim por diante. "Grãos LOX nula dupla" podem assim ser caracterizados por ' uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma perda total de enzima LOX-2 funcional.

Uma planta de "cereal", como aqui definido, é um membro da família de plantas Graminae, cultivada principalmente pelas suas sementes ou grãos contendo amido.

Plantas de cereais incluem, mas não estão limitados a cevada (Hordeum), trigo (Triticum), arroz — (Oryza), milho (Zea), centeio (Secale), aveia (Avena), sorgo (Sorghum), e Triticale, um híbri- do de centeio-trigo.

Por "codificação" ou "codificado", no contexto de um ácido nucléico especificado,

- E " significa compreender as informações para translação para a proteína especificada. Um áci- do nucléico ou polinucleotídeo que codifica uma proteína pode incluir sequências não tradu- zidas, por exemplo, íntrons, dentro de regiões traduzidas do ácido nucléico, ou pode faltar tais sequências não-traduzidas, por exemplo, em cDNA. As informações pelas quais uma proteínaé codificada são especificadas pelo uso de códons.

Como usado aqui, "expressão" no contexto de ácidos nucléicos deve ser entendido como a transcrição e acúmulo de mRNA sentido ou RNA antissentido derivado de um frag- - mento de ácido nucléico. "Expressão" usada no contexto de proteínas refere-se à tradução de mRNA em um polipeptídeo.

: 10 O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia polipeptídica e inclui regiões anteriores e posteriores à região de codificação (promotor e terminador). Além disso, genes de plantas geralmente consistem em éxons interrompidos por íntrons. Após a transcrição em RNA, os íntrons são removidos por união para gerar um RNA mensageiro (mMRNA) maduro. Os "sítios de união" entre éxons e íntrons são tipicamen- tedeterminados por sequências de consenso agindo como sinais de união para o processo de união, consistindo em uma deleção do íntron a partir do RNA primário transcrito e uma junção ou fusão das extremidades do RNA restante em cada lado do íntron excisado. Em alguns casos, padrões alternativos ou diferentes de união podem gerar diferentes proteínas a partir do mesmo trecho de DNA. Um gene nativo pode ser referido como um "gene endó- geno".

Como usado aqui, "heterólogo" em referência a um ácido nucléico é um ácido nu- cléico que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, é substancial- mente modificado a partir de sua forma nativa na composição e/ou locus genômica por in- tervenção humana deliberada.

O termo "germinação" como aqui utilizado significa o início ou retomada do cresci- mento por um grão de cevada em várias composições, tal como solo normal, como encon- trado na natureza. Assim, um embrião germinado é um embrião submetido à germinação. Germinação pode também ocorrer no solo de vasos colocados em câmaras de crescimento f e semelhantes, ou por exemplo, ocorrer em papel de filtro molhado colocado em pratos de Petripadrão de laboratório ou durante maltagem (por exemplo, em tanques ou caixas de B germinação da fábrica de malte ). Germinação é geralmente entendida para incluir a hidra- tação dos grãos, inchaço dos grãos e induzir o crescimento do embrião. Fatores ambientais que afetam a germinação incluem temperatura, umidade e nível de oxigênio. Raiz e desen- volvimento do ramo é observado.

Como usado aqui, o termo "isolado" significa que o material é retirado do seu ambi- ente original. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que ocorre naturalmente pre- sente em um organismo vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo,

. 12 . separado de alguns ou de todos os materiais que coexistem no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos poderiam ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipepti- deos poderiam ser parte de uma composição, e ainda ser isolados por causa de vetores ou composição não faz parte do seu ambiente natural. O termo "grão" é definido para compreender o cariopse do cereal, também denota- do como semente interna, o lema e palea. Na maioria das variedades de cevada, o lema e palea aderem à cariopse e são uma parte do grão seguindo uma trilha. No entanto, varieda- - des de cevada nua também ocorrem. Nestes, a cariopse está livre do lema e palea e debu- lha para fora livre como em trigo. Os termos "grão" e "grãos" são usados indistintamente b 10 neste documento.

"Desenvolvimento de grão" refere-se ao período que se inicia com a fertilização do óvulo pelo de uma célula de pólen. Durante a fertilização, reservas metabólicas por exem- plo, açúcares, oligossacarídeos, fenólicos, aminoácidos e proteínas - são depositados com ou sem vacúolo alvo, em vários tecidos do endosperma do grão (grão), testa, aleurona e —escutelo, levando ao alargamento do grão (grão), enchimento do semente (grão), e termi- nando com dessecação do semente (grão).

O termo "perda total de função" refere-se à falta de determinada atividade enzimáti- ca. Assim, uma planta de cevada com uma "perda total de função" de atividade de LOX-1 e LOX-2 é uma planta de cevada sem atividades de LOX-1 e LOX-2 detectáveis. No contexto da presente invenção, Atividades de LOX-1 e LOX-2 são determinadas por um procedimen- to de ensaio que determina a formação de 9-HPODE e 13-HPODE de ácido linoléico, apesar de LOX-1 e LOX-2 poderem ter outras atividades. De preferência, a formação de 9-HPODE e 13-HPODE de ácido linoléico é determinada conforme descrito no Exemplo 4 aqui abaixo. A atividade deve ser determinada utilizando extratos de proteína de embriões germinados.

—Nocontexto da presente invenção, a geração de um pico de cromatograma correspondente a menos de 5%, de preferência menos de 3% do pico de 9-HPODE do padrão mostrado na FIG. 5A, e/ou um pico correspondente a menos de 5%, de preferência menos de 3% do pico 13-HPODE do padrão mostrado na FIG. 5A, ao usar o ácido linoléico como substrato, é . considerado como atividade de LOX-1 e LOX-2 não detectável, ao usar o ensaio descrito no Exemplo 4 Abordagens moleculares para obter uma perda total da função da atividade de . LOX compreendem mutações de gerações que causam uma total ausência de transcrições para a enzima, ausência total da enzima codificada correspondente, ou mutações que inati- vam totalmente a enzima codificada.

O termo "atividade de LOX-1" refere-se à atividade enzimática da enzima de ceva- — daLOX-1. Particularmente, no contexto da presente invenção, "atividade de LOX-1" é a dio- xigenação catalisada por enzimas de ácido linoléico para 9-HPODE, e em muito menor grau 13-HPODE. Mesmo que a enzima LOX seja capaz de catalisar outras reações, com a finali-

: 13 : dade de determinar a atividade de LOX-1 de acordo com a presente invenção, apenas 9- e 13-HPODE formando atividades devem ser considerados. A FIG. 2 descreve os percursos bioquímico em que o ácido linoléico é convertido em 9-HPODE.

O termo "atividade de LOX-2" refere-se à atividade enzimática da enzima de ceva- daLOX-2. Particularmente, no contexto da presente invenção, "atividade de LOX-2" é a dio- xigenação catalisada por enzimas de ácido linoléico para 13-HPODE e, em grau muito me- nor de 9-HPODE. Mesmo que a enzima LOX 2 seja capaz de catalisar outras reações, com - a finalidade de determinar a atividade de LOX-2 de acordo com a presente invenção, ape- nas a 13- e 9- HPODE formando atividades devem ser considerados. A FIG. 2 descreve o . 10 percurso bioquímico em que o ácido linoléico é convertido em 13-HPODE.

O termo "bebida de malte" ou o termo "bebida à base de malte" referem-se às bebi- das preparadas com malte, preferencialmente bebidas preparadas por um método incluindo uma etapa de incubação de malte com água quente. Bebidas de malte podem, por exemplo, ser cerveja ou maltinas.

O termo "bebidas de malte fermentadas" refere-se às bebidas de malte, que foram fermentadas, isto é, incubadas com leveduras.

"Maltagem" é uma forma especial de germinação de grãos de cevada que ocorrem em condições ambientais controladas incluindo, mas não limitadas a tanques íngremes e caixas de germinação da fábrica de malte. De acordo com o processo da presente invenção, malte começa a ocorrer durante e/ou após os grãos de cevada terem sido mergulhados. O processo de maltagem pode ser interrompido por secagem dos grãos de cevada, por exem- plo, em um processo de secagem em estufa. No caso em que o malte não foi seco em estu- fa, é denotado "malte verde". Uma composição de malte preparada a partir de cevada LOX nula dupla é entendida como incluindo o maite de LOX nula dupla, tal como malte de LOX nula dupla pura, ou qualquer mistura de malte compreendendo malte de LOX nula dupla. Maite pode ser processado, por exemplo, por moagem e, portanto, referido como "malte moído" ou "farinha".

"Brassagem" é a incubação de malte moído na água. Brassagem é preferencial- - mente realizada a uma temperatura específica, e em um volume específico de água. A tem- — peraturaeo volume de água são de importância, uma vez que estes afetam a taxa de dimi- ' nuição da atividade da enzima derivada do malte, e, portanto, especialmente a quantidade de hidrólise do amido que pode ocorrer; ação de protease também pode ser de importância. Brassagem pode ocorrer na presença de adjuntos, o que é entendido como incluindo qual- quer fonte de carboidratos diferente de malte, tais como, mas não limitados a, cevada (inclu- indo cevada LOX nula dupla), xaropes de cevada, ou milho, ou arroz — ou como grãos intei- ros ou produtos processados, como grãos ou amido. Todos os adjuntos acima mencionados podem ser utilizados principalmente como uma fonte adicional de extrato (xaropes são tipi-

. 14 . camente dosados durante a fervura do mosto). Os requisitos para o processamento do ad- junto na cervejaria dependem do estado e do tipo de adjunto utilizado, e em particular da gelatinização do amido ou temperaturas de liquefação. Se a temperatura de gelatinização estiver acima de sacarificação de malte normal, então o amido é gelatinizado e liquefeito antesde adicionado ao mosto. "Mutações" incluem deleções, inserções, substituições, transversões, e mutações pontuais nas regiões de codificação e não-codificação de um gene. Deleções podem ser do - gene inteiro, ou de apenas uma parte do gene, onde a região de não-codificação de prefe- rência é a região do promotor, ou a região do terminador, ou íntrons. Mutações pontuais - 10 podem se referiramudanças de uma base ou um par de base, e podem resultar em códons de parada, mutações de deslocamento de quadro ou substituições de aminoácidos. Muta- ções somáticas são aquelas que ocorrem apenas em determinadas células ou tecidos da planta e não são herdadas para a próxima geração. Mutações germinativas podem ser en- contradas em qualquer célula da planta e são herdadas. Com referência à FIG. 1 aqui que apresenta uma vista geral sobre como os grãos de cevada mutadas podem ser propagados em um programa de cervejaria — grãos de geração M3, e diretamente grãos propagados do mesmo, ou de qualquer geração posterior, incluindo as plantas do mesmo, podem ser cha- mados de "mutantes brutos". Além disso, ainda com referência a FIG. 1 aqui, o termo "linha- gem de cervejaria" se refere a grãos de geração M4, e qualquer geração posterior, incluindo asplantasdomesmo, que pode ser o resultado de um cruzamento para um cultivar de plan- ta, ou o resultado de um cruzamento com outra linhagem de reprodução com um traço sepa- rado específico.

O termo "LOX nula" refere-se à presença de uma mutação em um gene de codifi- cação de LOX, causando uma perda total da função da enzima LOX codificada (ou LOX-1 ouLOX-2). Mutações que geram códons de cessação prematura (não sentido) no gene que codifica um LOX representam apenas um mecanismo pelo qual a perda total da função da atividade de LOX pode ser obtida. Abordagens moleculares para obter a perda total da fun- ção de uma enzima LOX compreendem a geração Mutações que causam uma total ausên- " cia de transcrições para a referida enzima, ou mutações que causam a inativação total da enzima codificada. "LOX nula" com referência a uma planta refere-se a uma planta tendo í uma perda total da função da enzima LOX especificada.

"Operavelmente ligado" é um termo usado para se referir à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucléico em um polinucleotídeo único, de modo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operaveimente ligado a uma sequên- ciade codificação quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência de codificação, isto é, aquela sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. Se- quências de codificação podem ser operavelmente ligadas a sequências regulatórias em

D 15 . orientação sentido ou antissentido. "PCR" ou "reação em cadeia polimerase" é bem conhecido por aqueles versados na técnica como uma técnica utilizada para a amplificação de segmentos específicos de DNA (Pat. U.S. Nº 4,683,195 e 4,800,159 de Mullis, K.B. et al.). "Planta" ou "material de planta" incluem células de planta, protoplastos de plantas e culturas de tecido de células de planta das quais plantas de cevada podem ser regeneradas — incluindo caule de planta e células de planta que estão intactas em plantas, ou partes de - plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, flores, sementes, folhas, raízes, pontas das raí- zes, anteras, ou qualquer parte ou produto de uma planta.

. 10 Pelo termo "produto de planta" significa um produto resultante do processamento de planta ou parte da planta. Tal produto de planta pode assim, por exemplo, ser malte, mosto, uma bebida fermentada ou não fermentada, um alimento, ou um produto alimentar.

Como usado aqui, "recombinante", em referência a uma proteína é uma proteína que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa na composição por intervenção humana deliberada. Um "quadro de teste de especialistas em cerveja", na acepção do presente pedido é um painel de especialistas extensivamente treinados em degustação e descrição de sabo- res de cerveja, com foco especial em aldeídos, sabor de papel, e sabor de envelhecimento. Embora um número de ferramentas analíticas exista para avaliar os componentes de sabor, aimportância relativa dos componentes ativos de sabor são difíceis de avaliar analiticamen- te. No entanto, tais propriedades complexas podem ser avaliadas por especialistas em sa- bor. Sua formação contínua inclui degustação e avaliação de amostras de cerveja padrão. Pelo termo "sítio de união" significa as fronteiras entre éxons e íntrons de um gene. Assim, um sítio de união pode ser a fronteira indo do éxon para íntron (chamada de "sítio doador”), oua fronteira que separa o íntron do éxon (denotada "sítio aceitador"). Um sítio de união em plantas tipicamente compreende sequências de consenso. A extremidade 5' de um Íntron, em geral, consiste em um dinucleotídeo GT conservado (GU no mRNA), e a extremi- dade 3' de um íntron geralmente consiste em um dinucleotídeo AG conservado. O sítio de . união 5' de um íntron, portanto, compreende a extremidade 5' de um íntron, e o sítio de uni- ão3 compreende a extremidade 3' de um íntron. De preferência, dentro do contexto da pre- 7 sente invenção, o sítio de união de um íntron ou é o sítio de união 5' consistindo na maioria dos dinucleotídeos 5' do íntron (que em geral é GT), ou o sítio de união 3' que consiste na maioria dos dinucleotídeos 3' do íntron (que em geral é AG). Salvo disposição em contrário “T2N" significa trans-2-nonenal (T2N) na forma livre. T2Néàsvezestambém referido como 2-E-nonenal. Pelo termo "potencial T2N" é descrito as substâncias químicas que têm a capacida- de de libertar T2N, ou ser convertidas em T2N, em uma ou mais reações. No presente con-

, 16 > texto, potencial T2N é definido como a concentração de T2N liberado em uma solução, por exemplo, mosto ou cerveja, durante a incubação por 2 h a 100 ºC, pH 4.0. Em termos práti- cos, a concentração de T2N de partida é determinada, após a qual a solução é incubada por 2 horas a 100 ºC, pH 4,0, seguido por determinação da concentração de T2N. A diferença entrea concentração T2N de partida e final é indicada pelo potencial TAN. O tratamento térmico, ácido provoca a liberação de T2N do potencial T2N, por exemplo, de "adutos de T2N", o último termo usado para descrever T2N conjugado a uma ou mais substâncias, in- - cluindo, mas não limitadas a proteína, sulfito, restos celulares, paredes celulares, ou simila- res. Em geral, os adutos de T2N per se não são detectados por seres humanos como sabo- . 10 res insípidos. No entanto, T2N liberado dos adutos de T2N pode dar origem a um sabor in- sípido.

"Cultura de tecido" indica uma composição que compreende células isoladas de ti- pos iguais ou diferentes, ou uma coleção de tais células organizadas em partes de uma planta — incluindo, por exemplo, protoplastos, caules, embriões, pólen, anteras, e assim por diante.

"Transformação" significa a introdução de DNA em um organismo de forma que o DNA seja mantido, ou como um elemento extracromossômico (sem integração e herança estável), ou como um integrante cromossômico (herança genética estável). Salvo disposição em contrário, o método utilizado aqui para transformação de E. coli foi o método baseado em CaCl (Sambrook e Russel, supra). Para a transformação da cevada, transformação me- diada por Agrobacterium pode ser realizada preferencialmente como descrito por Tingay et al. (1997), ou Wang et al. (2001), exceto que cultivares alternativos podem ser usados como hospedeiros.

Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma de um processo de trans- formação.

Como usado aqui, "transgênico" inclui referência a uma célula que foi modificada pela introdução de um ácido nucléico heterólogo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células transgênicas expressam genes que não , são encontrados de forma idêntica dentro da forma nativa da célula, ou expressam genes nativos que são de outra forma anormalmente expressos, sub-expressos ou não expressos g em todos como resultado da intervenção humana deliberada. O termo "transgênico", como utilizado neste documento em referência às plantas, especialmente plantas de cevada, não abrange a alteração da célula por métodos das cervejarias tradicionais — por exemplo, mu- tagênese baseada em NahN,, ou por eventos que ocorrem naturalmente, sem invenção hu- manadeliberada.

"Cevada do tipo selvagem", Hordeum vulgare ssp. spontaneum, é considerada o progenitor de formas de cevada cultivadas contemporâneas. A transição de cevada de um

: 17 E tipo selvagem para um estado cultivado é pensada ter coincidido com a domesticação da planta em "raças de cevada". Estas são geneticamente mais intimamente relacionadas com cultivares modernos do que a cevada do tipo selvagem. O termo cevada do "tipo selvagem" se refere a uma planta de cevada gerada con- vencionalmente. De preferência, o termo refere-se à planta de cevada a partir da qual as plantas de cevada da presente invenção foram derivadas, isto é, as plantas mães. Grãos de cevada do tipo selvagem são geralmente disponíveis de, por exemplo, empresas de semen- - tes como, "cultivares" ou "variedades" — isto é aqueles grãos geneticamente semelhantes que são listados por organizações de cervejarias nacionais. Apesar da disponibilidade de . 10 vários cultivares de cevada LOX-1 nula (por exemplo, cvs. Chamonix e Charmay), mas com a finalidade de uma melhor compreensão da presente invenção, todas as plantas LOX-1 nula, LOX-2 nula e LOX nula dupla são aqui consideradas plantas mutantes, e não plantas do tipo selvagem. As notações "cultivar" e "variedade" são usadas indistintamente neste documento.

Pelo termo "mosto" significa um extrato líquido de malte, como o malte moído, ou malte verde, ou malte moído verde. Na fabricação de cerveja de cevada, o mosto também pode ser preparado através da incubação de um extrato de cevada não maltado com uma mistura de enzima que hidrolisa os componentes da cevada. Além disso, malte ou extratos derivados de cevada, o extrato líquido pode ser preparado a partir de malte e componentes adicionais, tal como o amido contendo material adicional, parcialmente convertido em açúca- res fermentáveis. O mosto é em geral obtido por brassagem, opcionalmente seguido de "pulverização", em um processo de extração de açúcares residuais e outros compostos a partir de grãos gastos após brassagem com água quente. Pulverização é geralmente reali- zada em uma cuba de filtro, um filtro de malha, ou outro aparelho para permitir a separação da água extraída dos grãos gastos. O mosto obtido após brassagem é geralmente referido como "primeiro mosto", enquanto o mosto obtido após a pulverização é geralmente referido como "segundo mosto". Se não for especificado, o termo mosto pode ser primeiro mosto, segundo mosto, ou uma combinação de ambos. Durante a produção de cerveja, o mosto é . geralmente cozido juntamente com lúpulo. Mosto, que não tenha sido fervido com lúpulo, - também pode ser referido como "mosto doce", enquanto que o mosto fervido com lúpulo f pode ser referido como "mosto cozido". Plantas de Cevada A cevada é uma família de plantas. "Cevada do Tipo Selvagem", Hordeum vulgare ssp. spontaneum, é considerada o progenitor das formas de cevada cultivadas atualmente.

A transição de cevada de um tipo selvagem para um estado cultivado é pensada para ter coincidido com uma mudança radical de frequências alélicas em numerosos loci. Alelos ra- ros e novos eventos mutacionais foram positivamente selecionados pelos agricultores que j 18 . rapidamente estabeleceram as novas características nas populações de plantas domestica- das, denotadas "raças de cevada”. Estas são geneticamente mais intimamente relacionadas com cultivares modernos do que a cevada do tipo selvagem. Até o final do século XIX, raças de cevada existiram como misturas altamente heterogêneas de linhagens puras e segrega- dos híbridos, incluindo algumas plantas derivadas de cruzamentos aleatórios em gerações anteriores. A maioria das raças foi deslocada em agriculturas avançadas por cultivares de linhagem pura. Níveis intermediários ou altos de diversidade genética caracterizam as raças - primitivas remanescentes. Inicialmente, cultivares de "cevada moderna" representaram sele- ções de variedades locais. Estas foram mais tarde derivadas de sucessivos ciclos de cru- . 10 zamentos entre linhagens puras estabelecidas, tal como aquelas de diversas origens geo- gráficas. Eventualmente, o resultado foi um estreitamento acentuado da base genética de muitas, provavelmente, todas, agricultoras avançadas. Comparado com raças, cultivares de cevada modernos têm inúmeras propriedades melhoradas (Nevo, 1992; von Bothmer et al.,

1992.), Por exemplo um ou mais, mas não limitado ao seguinte: (i) Grãos nus e revestidos; (ii) Dormência de semente; (iii) Resistência a doenças; (iv) Tolerância ambiental (por exemplo, à seca ou pH do solo); (V) Proporção de lisina e outros aminoácidos; (vi) Conteúdo de proteínas; (vii) Conteúdo de nitrogênio; (viii) Composição de carboidratos; (ix) Conteúdo e composição de hordeína; (x) Conteúdo de (1-3,1-4)-B-Glucano e arabinoxilano; (xi) Produção (xii) Rigidez de palha; (xiii) Altura da planta. Dentro da presente invenção, o termo "planta de cevada" compreende qualquer " planta de cevada. Assim, a invenção se refere a toda a planta de cevada compreendendo uma primeiramutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-1, e ' uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2. Assim, a invenção refere-se a qualquer planta de cevada compreendendo uma primeira mu- tação que resulta em uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma segunda mutação resultando em uma perda total de enzima LOX-2 funcional. No entanto, plantas de cevada preferidas para uso com a presente invenção são cultivares de cevada modernos ou linhagens puras. O cultivar de cevada a ser usado com a presente invenção pode, por exemplo, ser selecionado do grupo consistindo em Sebastian,

- 19 . Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clip- per, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin — choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, —Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett and Jersey preferably a partir do grupo consistindo em Haruna Nijo, Sebastian, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda and Power, preferably a partir do - grupo consistindo em Harrington, Klages, Mantey, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Ale- xis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derka- . 10 do, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin — choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scar- lett and Jersey preferably a partir do grupo consistindo em Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class e Vintage.

Em uma modalidade da invenção, a planta de cevada é, portanto, um cultivar de cevada moderno (de preferência um cultivar selecionado do grupo de cultivares de cevada aqui descritos acima) compreendendo uma primeira mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-1, como perda total da enzima LOX-1 funcional, e uma se- gunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, tal como a perda total da enzima LOX-2 funcional. Nesta modalidade, é, portanto, preferível que a plan- ta de cevada não seja uma raça de cevada.

A planta de cevada pode estar sob qualquer forma adequada. Por exemplo, a plan- ta de cevada de acordo com a invenção pode ser uma planta de cevada viável, uma planta seca, uma planta homogeneizada, ou um grão de cevada moído. A planta pode ser uma —plantamadura, um embrião, um grão germinado, um grão maltado, um grão maltado moído, ou semelhantes.

Partes de plantas de cevada podem ser qualquer parte apropriada da planta, tais como sementes, embriões, folhas, caules, raízes, flores, ou suas frações. Uma fração pode, " por exemplo, ser uma seção de um grão, embrião, folha, caule, raiz ou flor. Partes de plan- tasde cevada também podem ser uma fração de um material homogeneizado, ou uma fra- r ção de uma planta de cevada moída ou grão.

Em uma modalidade da invenção, partes de plantas de cevada podem ser células da planta de cevada, de preferência células viáveis que podem ser propagadas in vitro em culturas de tecidos. Em particular, tais células em uma modalidade podem ser células que — não são capazes de amadurecimento em uma planta de cevada inteira, isto é, células que não são um material reprodutivo.

Perda de função de atividade de LOX

: 20 . A presente invenção refere-se a plantas de cevada - ou partes dela, ou produtos de planta da mesma — tendo uma primeira e uma segunda mutação, onde a primeira mutação leva a uma perda total da função de atividade de LOX-1, e a segunda mutação leva a uma total perda da função de atividade de LOX-2. Assim, por exemplo, a primeira mutação leva a uma perda totalde enzima LOX-1 funcional, e a segunda mutação leva a uma perda total de enzima LOX-2 funcional.

A perda total da função de atividade de LOX-1 (como a perda total da enzima LOX- , 1 funcional, e a perda total da função de atividade de LOX-2 (como a perda total da enzima LOX-2 funcional), pode de forma independente basear-se em mecanismos diferentes.

Por . 10 exemplo, a perda total da função de uma ou ambas da atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2 pode ser causada por mau funcionamento de proteínas na planta de cevada, isto é, um mau funcionamento de proteína LOX-1 e/ou LOX- 2, tal como uma proteína LOX-1 mal- tada sem 9-HPODE detectável formando atividade (determinado conforme descrito no Exemplo 4), e/ou uma proteína LOX-2 mutada sem 13-HPODE detectável formando ativida- de(por exemplo, determinado conforme descrito no Exemplo 4). A perda total da função de uma ou ambas da atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2 pode ser causada pela falta de Proteínas LOX-1 e/ou LOX-2. É evidente que a falta de Proteina LOX-1 irá levar à perda de enzima LOX-1 funcional, e que a falta de Proteína LOX-2 irá levar à perda total da enzima LOX-2 funcional.

Assim, a planta de cevada pode, preferiveimente não compreender — ou apenas muito pouco — mais preferivelmente proteí- nas LOX-1 e/ou LOX-2. A proteína LOX-1 e/ou LOX-2 pode ser detectada por qualquer meio adequado conhecido pela pessoa versada na técnica.

De preferência, no entanto, a proteína é detectada através de técnicas onde proteína LOX-1 é detectada por anticorpos específicos para LOX-1 e LOX-2, tais como anticorpos policlonais para LOX-1 e LOX-2. Tais técnicas — podem, por exemplo, ser Western blot ou ELISA.

Tais anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais.

De preferência, no entanto, tais anticorpos são de natureza policlonal, reconhe- cendo vários epítopos na proteína LOX-1 e LOX-2, respectivamente.

Proteínas LOX-1 e/ou LOX-2 também podem ser detectadas indiretamente, por exemplo, por métodos de determi- . nação de atividade de LOX-1, ou por métodos de determinação de atividade de LOX-2. Em uma modalidade preferida da invenção, a proteína LOX-1 é detectada usando os métodos ' descritos no Exemplo 4 do pedido de patente internacional WO 2005/087934. Proteína LOX- 2 pode ser detectada de forma similar, usando anticorpos de ligação para LOX-2. A perda total da função de uma ou ambas da atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2 também pode ser um resultado de nenhuma, ou muito pouco, de preferência nenhu- ma expressãode uma Transcrição LOX-1 e/ou Transcrição LOX-2. O versado irá reconhe- cer que a ausência de uma transcrição LOX-1 ou LOX-2 também irá resultar na ausência de LOX-1 traduzido ou proteína LOX-2, respectivamente.

Alternativamente, a perda total da y 21 bp função de uma ou ambas de atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2 (por exemplo, a per- da total das enzimas LOX-1 e LOX-2 funcionais), também pode ser um resultado de uma expressão de uma transcrição LOX-1 aberrante e/ou uma transcrição LOX-2 aberrante. Uma transcrição LOX-1 e/ou LOX-2 aberrante pode ser causada por união aberrante da transcri- — ção,porexemplo, devido a uma mutação em um sítio de união. Assim, as plantas de cevada da invenção podem portar uma mutação no sítio de união 1, assim como no sítio de união 5' ou no sítio de união 3', por exemplo, em um ou os dois nucleotídeos 5' de um íntron, ou em . um dos nucleotídeos 3' de um íntron. Um exemplo de um mutante com uma união aberrante da transcrição LOX-1 é descrito como mutante A618 em WO 2005/087934. Expressão de . 10 transcritos codificando LOX-1 ou LOX-2 pode, por exemplo, ser detectada por experimentos Northern blotting ou RT-PCR.

A perda total de enzimas funcionais LOX-1 e LOX-2 das plantas de cevada da pre- sente invenção é causada por mutações. Assim, as plantas de cevada da presente inven- ção, em geral, portam uma mutação no gene LOX-1. Tal mutação pode ser nas regiões re- —guladoras, por exemplo, dentro do promotor ou íntrons, ou a mutação pode estar na região de codificação. Da mesma forma, as plantas de cevada da presente invenção, em geral, portam uma mutação no gene LOX-2. Tal mutação pode ser nas regiões reguladoras, por exemplo, dentro do promotor ou íntrons, ou a mutação pode estar na região de codificação. Assim, a causa da perda total de enzimas LOX-1 e/ou LOX-2 funcionais também pode ser detectada através da identificação de mutações no gene que codifica LOX-1, ou no gene que codifica LOX-2. Mutações no gene que codifica LOX-1 podem, por exemplo, ser detec- tadas por sequenciamento do gene. De preferência, após a identificação de uma mutação, a perda total da função é confirmada por testes de atividade de LOX-1 e/ou LOX-2.

O termo "proteina LOX-1" destina-se a cobrir o comprimento completo da proteína de cevada LOX-1 conforme apresentado em SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934, ou em SEQ ID NO:7 de WO 2005/087934, ou homólogo funcional da mesma. O sítio ativo de LOX- 1 está situado na parte C-terminal da enzima. Em particular, prevê-se que a região que abrange os resíduos de aminoácidos 520-862, e suas partes, são relevantes para a ativida- - de de LOX 1. Assim, em uma modalidade, cevada de LOX-1 nula de preferência compreen- deum gene que codifica uma forma mutante de LOX-1, faltando alguns ou todos os amino- ' ácidos 520-862 de LOX-1. Tal LOX-1 mutado pode também faltar outros resíduos de amino- ácidos, que estão presentes em LOX-1 do tipo selvagem.

' Assim, cevada LOX nula dupla da invenção pode compreender uma forma truncada de LOX-1, que não é funcional — tal como uma forma N- ou C-terminal truncada. Preferenci- almente, tal forma truncada compreende não mais que 800, mais preferivelmente não mais que 750, ainda mais preferivelmente não mais que 700, ainda mais preferivelmente não mais que 690, ainda mais preferivelmente não mais que 680, ainda mais preferivelmente

. 22 : não mais que 670 aminoácidos consecutivos de LOX-1, tal como não mais do que 665, por exemplo, não mais que 650, tal como não mais do que 600, por exemplo, não mais que 550, tal como não mais de 500, por exemplo, não mais que 450, tal como nada mais que 425, por exemplo, não mais que 399 aminoácidos consecutivos de LOX-1 de SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934. Preferencialmente, disse forma truncada compreende apenas um fragmento N-terminal de LOX-1, de preferência, no máximo 800, mais preferivelmente, no máximo 750, ainda mais, de preferência, no máximo 700, ainda mais, de preferência, no máximo 690, - ainda mais, de preferência, no máximo 680, ainda mais, de preferência, no máximo 670, ainda mais, de preferência, no máximo 665 N-terminal de aminoácidos de SEQ ID NO:3 de . 10 WO 2005/087934, tal como não mais do que 665, por exemplo, não mais que 650, tal como não mais que 600, por exemplo, no máximo, 550, tal como no máximo 500, por exemplo, no máximo 450, tal como no máximo 425, por exemplo, no máximo 399 aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934.

Em uma modalidade muito preferida, a forma truncada pode consistir em aminoáci- dos1-665deSEQID NO:3 de WO 2005/087934.

Em uma modalidade preferida da invenção, a planta de cevada da invenção com- preende um gene de codificação de LOX-1 que é transcrito em mMRNA, que compreende um códon sem sentido ou um códon de parada a montante do códon de parada de MRNA LOX- 1 do tipo selvagem. Tal um códon sem sentido é aqui denotado como um códon prematuro de não sentido. De preferência, todos os genes de codificação de LOX-1 transcritos em MRNA da planta compreendem um códon sem sentido prematuro ou um códon de parada. O códon sem sentido ou códon de parada está de preferência situado no máximo a 800, mais preferivelmente, no máximo 750, ainda mais, de preferência, no máximo 700, ainda mais, de preferência, no máximo 690, ainda mais, de preferência, no máximo 680, ainda mais, de preferência, no máximo 670, ainda mais, de preferência, no máximo 665 códons a jusante do códon de iniciação. A sequência do DNA genômico do tipo selvagem que codifica LOX-1 é dada em SEQ ID NO:1 de WO 2005/087934 ou SEQ ID NO:5 de WO 2005/087934.

Em uma modalidade preferida, a planta de cevada da invenção compreende uma , codificação de gene LOX 1, em que pré-mRNA transcrito do gene compreende a sequência correspondente a SEQ ID NO:2 de WO 2005/087934.

. Em uma modalidade muito preferida da invenção, o gene que codifica LOX-1 mu- tante da planta de cevada de LOX nula dupla de acordo com a invenção compreende uma mutação sem sentido, a mutação correspondente a uma substituição G —> A na posição 3574 de SEQ ID NO:1 de WO 2005/087934.

O termo "proteína LOX-2" é utilizado para cobrir o comprimento completo de proteí- na de cevada LOX-2 conforme estabelecido em SEQ ID NO:5 de publicação instantânea ou um homólogo funcional da mesma. O sítio ativo da LOX-2 está situado na parte C-terminal

' 23 : de LOX-2. Em particular, prevê-se que a região que abrange os resíduos de aminoácidos 515-717, e suas partes, são relevantes para a atividade de LOX 2. Com base no exame da estrutura de cristal LOX-1 da soja, os trechos de sequência antecipada do sítio ativo da fen- da da enzima de cevada LOX-2 são representadas por resíduos de aminoácidos 515-525 e 707-717.A proteina LOX-2 traduzida e mutada, isto é, uma forma de C-terminal truncada de LOX-2 de cevada de LOX nula dupla mutante A689 contém no máximo 684 resíduos, e, por- tanto, falta o trecho da segunda sequência da fenda de sítio ativo — tornando-a inativa.

De - acordo com uma modalidade da invenção, cevada LOX nula dupla da invenção compreende de preferência um gene que codifica uma forma mutante de LOX-2, que carece de algumas, . 10 —outodos,os aminoácidos 515-717 de LOX-2, de preferência faltam alguns ou todos os ami- noácidos 707-717, ainda mais, de preferência faltam todos os aminoácidos 707-717. Tal LOX-2 mutante pode também faltar outros resíduos de aminoácidos, que estão presentes em LOX-2 do tipo selvagem.

Assim, cevada LOX nula dupla pode incluir uma forma truncada de LOX-2, que não é funcional, tal como uma forma truncada de N-terminal ou C-terminal.

Preferencialmente, tal forma truncada compreende não mais que 800, mais preferivelmente não mais que 750, ainda mais preferivelmente não mais que 725, ainda mais preferivelmente não mais que 700, ainda mais preferivelmente não mais que 690, ainda mais preferivelmente não mais que 684 aminoácidos consecutivos de LOX-2 da SEQ ID NO:5 de publicação instantânea.

Preferencialmente, tal forma truncada compreende apenas um fragmento N-terminal de LOX-2. Por isso, de preferência tal forma truncada compreende no máximo 800, mais prefe- rivelmente, no máximo 750, ainda mais de preferência, no máximo 725, ainda mais de prefe- rência, no máximo 700, ainda mais, de preferência, no máximo 690, ainda mais de preferên- cia, no máximo 684 aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO:5 da publicação instantânea.

Em uma modalidade muito preferida, a forma truncada pode consistir em 1 - 684 aminoácidos de SEQ ID NO:5 da publicação instantânea.

Em uma modalidade preferida da invenção, a planta de cevada compreende um gene transcrito em mRNA para LOX-2, em que o MRNA compreende um códon sem sentido . ou um códon de parada a montante do códon de parada de MRNA LOX-2 do tipo selvagem.

Talum códon sem sentido é aqui designado um códon sem sentido prematuro.

De preferên- Ff cia todos os genes transcritos em mRNA que codifica LOX-2 da planta compreende um có- don sem sentido prematuro ou um códon de parada.

O códon sem sentido ou códon de pa- rada está de preferência situado no máximo a 800, mais preferivelmente, no máximo 750, ainda mais, de preferência, no máximo 725, ainda mais, de preferência, no máximo 700, aindamais, de preferência, no máximo 690, ainda mais de preferência, no máximo 684 có- dons a jusante do códon de iniciação.

A sequência de DNA genômico do tipo selvagem que codifica LOX-2 é dada em SEQ ID NO:1 da publicação instantânea.

. 24 . Em uma modalidade muito preferida da invenção, o gene que codifica LOX-2 muta- do da planta de cevada de LOX nula compreende uma mutação sem sentido, tal mutação correspondendo a substituição G —> A na posição 2689 de SEQ ID NO:1. A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser preparada por qualquer método adequado conhecido pela pessoa versada na técnica, de preferência por um dos métodos descritos aqui abaixo, na seção "Preparando cevada LOX nula dupla". Em uma modalidade da invenção, é preferível que a planta de cevada de LOX nula . dupla de acordo com a presente invenção tenha fisiologia de crescimento de planta e de- senvolvimento de grão semelhante à cevada do tipo selvagem.

É, portanto, preferível que a . 10 —plantade cevada de LOX-1 nula seja similar à cevada do tipo selvagem com relação à altura da planta, número de brotos por planta, início da floração, e/ou número de grãos por espiga.

Além disso, é preferível que a planta de cevada de LOX nula dupla de acordo com a presente invenção seja semelhante à cevada do tipo selvagem, em particular, semelhante à cv.

Barke com relação à altura da planta, data de desenvolvimento, resistência a doenças, acamação, quebra da espiga, tempo de maturação e produção.

No presente contexto, "simi- lar" deve ser entendido como os mesmos + 10% em caso de números.

Estes parâmetros podem ser determinados como a seguir descrito no Exemplo 5. Em uma modalidade muito preferida da invenção, a planta de cevada é a planta de cevada em que as sementes da mesma foram depositadas em 4 de dezembro de 2008 sob onome de "Barley, Hordeum vulgare L.; Line A6GB9" com American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, Estados Unidos (depósito número PTA-9640). Assim, a planta de cevada da invenção pode ser linhagem de cevada A689 (Designação de Depósito de Patentes ATCC: PTA-9640), ou qualquer planta de cevada progênie da mesma.

Preparando mutantes de cevada A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser preparada por qualquer método adequado conhecido pela pessoa versada na técnica.

De preferência, a planta de cevada da invenção é preparada por um método compreendendo as etapas de mutagenizar " as plantas de cevada ou partes da mesma, por exemplo, grãos de cevada exemplo, seguido detriageme seleção de plantas de cevada caracterizadas por uma perda total da função de T atividade de LOX-1 tal como a perda total da enzima LOX-1 funcional e uma perda total da função de atividade de LOX-2, tal como a perda total da enzima LOX-2 funcional.

Em uma modalidade preferida, a planta de cevada pode ser preparada por um método que envolve mutagenizar plantas de cevada, ou partes da mesma — por exemplo, grãos de cevada em queas plantasde cevada já portam uma mutação causando uma perda total de enzima LOX-1 funcional.

Tais plantas de cevada são, por exemplo, descritas no pedido de patente internacional WO 2005/087934.

: 25 . Em um aspecto interessante, a presente invenção se refere a um novo e muito efi- ciente método de triagem que permite a identificação de uma planta de cevada portando uma mutação, o que causa a perda total de atividade de LOX-2. O novo método de triagem reprodutível permite a identificação de plantas de cevada com nenhuma ou muito pouca atividade de LOX-2. Este novo método de triagem inclui o uso de embriões germinados co- mo matéria-prima.

Curiosamente, os presentes inventores descobriram que o uso de embri- ões maduros como matéria-prima para uma triagem para atividade de LOX-2 é menos prefe- . rível, baseado na triagem de até 21 mil embriões maduros, que não revelaram um único mutante de cevada LOX-2 nula. . 10 Assim, uma característica importante do novo método de triagem se refere à utiliza- ção de embriões germinados como matéria-prima para a detecção de atividade de LOX-2. Assim, é um objetivo da presente invenção prover métodos de preparação de uma planta de cevada de LOX nula dupla compreendendo as etapas de: (i) Prover de uma planta de cevada, e suas partes, com uma perda total da função deatividadede LOX-1 tal como a perda total de uma enzima LOX funcional, e (ii) Mutagenizar a planta de cevada, e/ou células de cevada, e/ou tecidos de cevada e/ou grãos de cevada, e/ou embriões de cevada da planta de cevada, obtendo assim a ce- vada de geração MO, e (iii) Reproduzir as plantas de cevada mutagenizadas, grãos, e/ou embriões por pelo menos 2 gerações, obtendo assim plantas de cevada de geração Mx, onde x é um número inteiro = 2; (iv) Obter embriões das plantas de cevada Mx; e (v) Germinar os embriões, e (vi) Determinar as atividades de LOX-1 e LOX-2 nos embriões germinados ou suas partese (vii) Selecionar plantas com uma perda total de atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2 nos embriões germinados e (viii) Analisar uma mutação no gene LOX-1 e no gene LOX-2 e . (ix) Selecionar plantas portando uma mutação no gene LOX-1 e no gene LOX-2; obtendo assim uma planta de cevada portando mutações nos genes de LOX-1 e . LOX-2, causando uma perda total de atividade de LOX-1 e uma perda total de atividade de LOX-2. A planta de cevada acima mencionada com uma perda total de atividade de LOX-1 pode, por exemplo, ser qualquer uma das plantas de cevada com uma perda total de ativi- dade de LOX-1 descritaem WO 2005/087934, de preferência mutante D112, ou plantas descendentes do mesmo.

Etapa (ii) na lista acima mencionada pode envolver mutagenizar material vivo sele-

. 26 ' cionado do grupo consistindo em plantas de cevada, células de cevada, tecidos de cevada, grãos de cevada, e embriões de cevada — de preferência selecionados do grupo consistindo em plantas de cevada, grãos de cevada e embriões de cevada, mais preferivelmente grãos de cevada.

Mutagênese pode ser realizada por qualquer método adequado. Em uma modali- dade, mutagênese é realizada incubando grãos de cavada, ou uma parte dos mesmos — por exemplo grãos de cevada ou células individuais da cevada — com um agente de mutageni- . zação. Tal agente é conhecido por uma pessoa versada na técnica, incluindo, por exemplo, mas não limitado a, azida de sódio (NaN;3), metanossulfonato de etila (EMS), azidoglicero! . 10 (AG, 3-azido-1,2-propanodiol), nitrosuréias de metila (MNU) e hidrazida maléica (MH).

Em outra modalidade, a mutagênese é realizada irradiando, por exemplo, por UV, uma planta de cevada ou parte dela, tal como o grão. Em modalidades preferidas da inven- ção, a mutagênese é realizada de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui abaixo, na seção "mutagênese química". Um exemplo não-limitante de um protocolo de mu- tagênese adequada é dado no Exemplo 2.

É preferível que a mutagênese é realizada de uma maneira tal que a frequência es- perada de mutantes desejadas é pelo menos 0,5, tal como na faixa de 0,5 a 5, por exemplo na faixa de 0,9 a 2,3 por 10 mil grãos, ao triar a cevada da geração M3. Em uma modalidade preferida, mutagênese é realizada em grãos de cevada. Os grãos aplicados ao agente mu- tagênico são designados como geração MO (ver também FIG. 1).

A atividade de LOX pode ser determinada em uma amostra de uma germinação de embrião de cevada, de preferência em um extrato líquido de uma germinação de embrião de cevada. A amostra, tal como o extrato pode ser preparada a partir de qualquer parte do pró- prio embrião germinado. Em geral, a amostra de cevada deve ser homogeneizada usando — qualquer método adequado antes da preparação de um extrato de amostra e determinação de atividade de LOX-2. Em particular, é preferível que um extrato de proteína seja preparado a partir do embrião germinado, ou parte deste, e que a atividade de LOX seja determinada utilizando o extrato de proteína. Homogeneização pode, por exemplo, ser executada usando . forças mecânicas, por exemplo, agitação ou mistura, tal como por agitação na presença de um talão, como um copo ou um talão de areia.

' Em uma modalidade preferida, o embrião germinado é da geração Mx, em que x é um inteiro 2 2; preferivelmente x é um inteiro na faixa de 2 a 10, mais preferivelmente na faixa de 3 a 8. Em uma modalidade muito preferida, a atividade de LOX é determinada em embriões germinados de geração M3, ou uma amostra derivada de tais embriões. Nesta — modalidade, é preferível que grãos de cevada mutagenizados de geração MO sejam cultiva- dos para obtenção de plantas de cevada, que são cruzadas para obter grãos de geração M1. O procedimento é repetido até que grãos da geração M3 estejam disponíveis (ver tam-

J 27 : bém FIG. 1). Determinação da atividade de LOX pode ser realizada usando qualquer ensaio adequado, de preferência por um dos métodos descritos a seguir.

Em particular, é preferível que o ensaio proveja dados sobre a dioxigenação de ácido linoléico em 9-HPODE e 13- —HPODE porLOX-1eLOX-2. Em geral, ensaiar irá, portanto, envolver as etapas de: (i) Prover um extrato de proteína preparado a partir de um embrião de cevada ger- minado ou parte dele, e - (ii) Prover ácido linoléico e (iii) Incubar o extrato de proteína com o ácido linoléico e . 10 (iv) Detectar dioxigenação de ácido linoléico em 9-HPODE e 13-HPODE.

Etapa (iv) do método de preferência compreende determinar o nível de 9-HPODE e 13-HPODE nos embriões germinados, de preferência em um extrato de proteína preparado a partir dos embriões germinados.

A etapa pode incluir uma determinação direta ou indireta dos níveis de 9-HPODE e 13-HPODE.

O nível total de todos os HPODEs pode ser determi- nado, caso em que é preferível que as medições específicas de 9-HPODE e 13-HPODE sejam realizadas para confirmação.

Um método poderia, por exemplo, ser um método em que extratos de proteína a partir de embriões germinados são incubados com ácido linoléico como substrato para a formação de 9-HPODE e 13-HPODE.

Tais HPODEs podem ser de- tectados por vários métodos.

Um método pode envolver a geração de um composto detec- tável, como um corante.

Por exemplo, o método pode ser o acoplamento oxidativo de ácido i 3 dimetilaminobenzóico e hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona na presença de hemoglo- bina, catalisada por HPODESs formada para formar o corante indamina, que pode ser medido em Asas usando um espectrofotômetro.

Um exemplo de tal um método é descrito nos exem- plos 1 e 2 adiante.

Com este ensaio, uma leitura de absorção menos de 0,2 Ass; unidade é considerada como um indicativo de ausência de LOX-1 e a ausência de atividade de LOX- 2s.

No entanto, um método mais preciso para determinar atividades de LOX-1 e LOX-2 é incubar um extrato de proteína a partir de embriões germinados com o ácido linoléico, se- guido por deliberação de conteúdo 9-HPODE e 13-HPODE.

Conteúdo 9-HPODE e 13- . HPODE pode, por exemplo, ser determinado usando análise baseada em HPLC.

Dioxigenação de ácido linoléico a 9-HPODE e 13-HPODESs pode ser medida direta ' ou indiretamente.

Qualquer método de detecção adequado pode ser utilizado com a presen- te invenção.

Em uma modalidade da invenção, hidroperóxidos de ácido linoléico são detec- tados. 9-HPODE e 13-HPODE podem ser detectados diretamente, por exemplo, por méto- dos cromatográficos, tal como HPLC, como descrito no Exemplo 4. A presente invenção revela que certos aspectos do procedimento de extração de proteína a partir do embrião germinado são de grande importância.

Assim, é preferível que a proteína seja extraída através de um tampão ácido, de preferência um tampão com um pH

- 28 : na faixa de 2 a 6, mais de preferência na faixa de 3 a 5, ainda mais de preferência na faixa de 3,5 a 5, ainda mais de preferência na faixa de 4 a 5, ainda mais preferivelmente um pH de 4,5. O tampão utilizado para a extração é de preferência com base em um ácido orgâni- co, mais preferivelmente um tampão de ácido láctico. Mais de preferência, o extrato de pro- teínaé preparado usando tampão de ácido láctico de 100-mM, pH 4.5. Certas modalidades da presente invenção divulgam métodos para a detecção de plantas LOX-1 nula e LOX-2 que envolvem reação de 9-HPODE e 13-HPODE com um co- . rante, por exemplo, 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona. Preferencialmente, o corante, por exemplo, 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona, é adicionado ao extrato de proteína após a . 10 adição de ácido linoléico. De preferência, o corante é adicionado pelo menos 1 min, mais preferivelmente pelo menos 5 min, ainda mais de preferência pelo menos 10 min, tal como na faixa de 1 a 60 min, por exemplo, na faixa de 5 a 30 min, tal como na faixa de 10 a 20 minutos após entrar em contato com o extrato de proteínas com o ácido linoléico. Métodos preferidos para a seleção de plantas de cevada de acordo com a invenção —sãodetalhados adiante no Exemplo 2.

O procedimento de seleção pode ser ajustado para os procedimentos de ensaio baseados em placa de microtitulação, ou outros formatos de ensaio repetitivos, de alta ca- pacidade de vazão conhecidos para permitir a detecção rápida de muitas amostras. É prefe- rível que pelo menos 5000, tal como, pelo menos, 7500, por exemplo, pelo menos, 10 mil, talcomo, pelo menos, 15 mil, por exemplo, pelo menos, 20 mil, tal como, pelo menos, 25 mil plantas de cevada mutagenizadas sejam analisadas para atividades de LOX-1 e LOX-2.

Determinação de uma mutação no gene que codifica LOX-1 pode ser efetuada por vários métodos diferentes. Por exemplo, o gene LOX-1 pode ser sequenciado completa ou parcialmente, e a sequência comparada com SEQ ID NO:1 de WO 2005/087934 ou SEQ ID —NO:5deWoO 2005/087934. Se buscar por uma mutação específica, análise de SNP pode ser aplicada. O versado será capaz de projetar iniciadores úteis para a detecção de uma dada mutação específica, tal como uma levando a um códon de parada prematuro na se- quência de codificação para LOX-1 (por exemplo, qualquer um dos códons de parada pre- r maturos descrito acima). Um exemplo de como realizar uma análise de SNP é descrito no Exemplo 10 a seguir, com iniciadores que são úteis para detectar mutação G—>A na posição M de nucleotídeo 3474 do gene LOX-1.

Determinação de uma mutação no gene que codifica LOX-2 pode ser realizada por vários métodos diferentes. Por exemplo, o gene LOX-2 pode ser sequenciado completa ou parcialmente, e a sequência comparada com SEQ ID NO:1 da publicação instantânea. Se —buscarpor uma mutação específica, análise de SNP pode ser usada. O versado será capaz de projetar iniciadores úteis para a detecção de uma dada mutação específica, tal como uma mutação que leva a um códon de parada prematuro na sequência de codificação LOX-

. 29 . 2 (por exemplo, qualquer um dos códons de parada prematuros descritos acima). Um exemplo de como realizar uma análise SNP é descrito no Exemplo 10 abaixo, assim como iniciadores úteis para detectar uma mutação G—>A na posição de nucleotídeo 2689 do gene LOX-2. É É também compreendido dentro da presente invenção que etapas (viii) e (ix) do mé- todo de preparação de uma planta de cevada de LOX nula dupla, conforme detalhado nesta seção acima, podem ser realizadas antes das etapas (vi) e (vii), caso em que o método . compreende as etapas (i), (ii), (iii), (iv), (v), (viii), (bo), (Vi), e (vii) nessa ordem.

Em particular, este poderia ser o caso na busca de uma mutação específica, por exemplo, em plantas da f 10 —progênie de plantas de cevada LOX nula dupla já identificadas.

Uma vez que uma planta de cevada de LOX nula dupla foi identificada, a qual con- tém uma mutação específica em um gene LOX-1 e uma mutação específica no gene LOX-2 (como qualquer uma das mutações acima mencionadas), plantas de cevada adicionais com mutações idênticas podem ser geradas por métodos de cultura convencionais, tal como aqueles bem conhecidos do versado.

Por exemplo, a planta de cevada de LOX nula dupla pode ser cruzada com outro cultivar de cevada.

Após a seleção de plantas de cevada úteis com perda total de funções LOX-1 e LOX-2, uma ou mais triagens adicionais podem, opcionalmente, ser realizadas.

Por exem- plo, os mutantes selecionados podem ser adicionalmente propagados, e as plantas de no- vasgerações podem ser testadas para a perda total de enzimas funcionais LOX-1 e LOX-2. Após a seleção de plantas de cevada úteis, estas podem ser submetidas à repro- dução, tal como reprodução convencional.

Métodos de reprodução são aqui descritos abaixo na seção "Reprodução de plantas". Produtos de planta A presente invenção refere a bebidas, ou a outros produtos de planta, com baixos níveis de potencial T2N, preparados a partir de plantas de cevada LOX nula dupla, ou suas partes.

A presente invenção refere-se, assim, a produtos de planta, que podem ser compo- . sições que compreendem as plantas de cevada acima descritas, ou suas partes, ou compo- sições preparadas a partir das plantas de cevada, e suas partes, tais como produtos de É planta preparados a partir de plantas de cevada, e suas partes.

Por que as plantas de ceva- da faltam atividades de LOX-1 e LOX-2, as composições, em geral, compreendem níveis muito baixos de potencial T2N.

Exemplos de composições úteis compreendendo, ou prepa- radas a partir de, plantas de cevada têm uma primeira mutação resultando em uma perda totalda função de atividade de LOX-1, tais como uma perda funcional total de enzima LOX- 1, e uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, tais como a perda total da enzima LOX-2 funcional, são aqui descritos abaixo.

. 30 E É preferível que as composições compreendam: (i) Menos de 60%, ainda mais de preferência menos de 50%, ainda mais preferi- velmente menos de 40%, ta! como menos de 30%, de preferência menos de 20%, mais pre- ferivelmente menos de 10%, de T2N livre e/ou; (ii) Menos de 60%, ainda mais de preferência menos de 50%, ainda mais preferi- velmente menos de 40%, tal como menos de 30%, de preferência menos de 25% de poten- cial de T2N; - em comparação com uma composição similar preparada da mesma forma a partir de plantas da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power. A redução específica . 10 no T2N pode diferir dependendo do tipo de composição. Reduções acima mencionadas no T2N são particularmente relevantes para as composições, em que a composição é selecio- nada do grupo consistindo em maite, mosto e bebidas envelhecidas.

Além disso, é preferível que as composições compreendam: (i) menos de 80%, de preferência menos de 70%, ainda mais de preferência menos de60%,talcomo menos de 50% de T2N livre e/ou; (ii) menos 80%, de preferência menos de 70%, ainda mais de preferência menos de 60%, tal como menos de 50% de potencial de T2N; em comparação com uma composição similar preparada da mesma forma a partir de D112 mutante de cevada descrito em WO 2005/087934.

A presente invenção refere em um aspecto a grãos de cevada tendo uma primeira mutação que resulta em uma perda total da função de atividade de LOX-1 (tal como a perda total da enzima LOX-1 funcional), e uma segunda mutação resultando em uma perda total de função de atividade de LOX-2 (tal como a perda total da enzima LOX-2 funcional). A pre- sente invenção também refere-se a composições compreendendo tais grãos, e composições preparadas a partir desses grãos, bem como a produtos de planta preparados a partir dos grãos.

Foi descrito que a atividade de lipoxigenase em grãos de cevada pode ser reduzida por um processo de imersão, onde a cevada pode ser submetida a altas temperaturas e/ou , tratamento com ácido láctico. Esse tratamento pode ter outros efeitos adversos, como a re- dução desejável de atividades enzimáticas, por exemplo, a atividade da fitase. Além disso, f esse tratamento só reduz a atividade de lipoxigenase a partir do ponto em que o tratamento térmico é realizado e, portanto, não afeta a acumulação pré-percurso de produtos lipoxige- nase. Assim, em uma modalidade os produtos de planta de acordo com a invenção são preparados usando um método, no qual os grãos de cevada não são submetidos a imersão a uma temperatura de pelo menos 70ºC. Também é preferível que os produtos de planta de acordo com a invenção sejam preparados usando um método, no qual os grãos de cevada

- 31 - não são submetidos a imersão a uma temperatura de pelo menos 57ºC na presença de áci- do láctico.

Em um aspecto, a invenção refere-se a composições de maite preparadas a partir de grãos de LOX nula dupla por maltagem.

Pelo termo "maltagem" deve ser entendido ger- —minaçãode grãos de cevada imersos ocorrendo sob condições ambientais controladas (por exemplo, conforme ilustrado na FIG. 3, etapas 2 e 3). Tais composições de malte de preferência compreendem menos de 30%, mais pre- . feriveimente menos de 20%, ainda mais de preferência menos de 10% de T2N livre em comparação com uma composição de malte preparada da mesma maneira a partir de uma . 10 cevada de tipo selvagem, de preferência de cv.

Power.

Mais preferivelmente, as composi- ções de malte têm menos de 60%, mais preferivelmente menos de 50% de T2N livre em comparação com uma composição de malte preparada da mesma forma a partir do mutante D112 LOX-1 nula de cevada descrito em WO 2005/087934. Além disso, é preferível que as composições de malte tenham menos de 60%, de preferência menos de 50%, mais preferi- velmente menos de 40%, ainda mais de preferência menos de 30%, mais preferivelmente menos de 20%, ainda mais de preferência menos de 10% de potencial de TAºN em compa- ração com uma composição de malte preparada da mesma maneira a partir de uma cevada de tipo selvagem, de preferência de cv.

Power.

Mais preferivelmente, as composições de malte têm menos de 60%, mais preferivelmente 50% de potencial TAN em comparação a uma composição de malte preparada da mesma forma a partir do mutante D112 LOX-1 nula de cevada descrito em WO 2005/087934. Maltagem é um processo de brassagem controla- do e de germinação, seguido de secagem do grão de cevada, de preferência de secagem em estufa do grão de cevada.

Antes da secagem, os grãos de cevada germinados e imersos são referidos como "malte verde", que também podem representar um produto de planta de —acordocoma presente invenção.

Essa sequência de eventos é importante para a síntese de várias enzimas que causam a modificação de grãos, os processos que principalmente des- polimeriza as paredes das células do endosperma morto para mobilizar os nutrientes de grãos e ativar outras depolimerases.

No processo de secagem subsequente, sabor e cor j: são produzidos devido a reações químicas para escurecer.

Embora o uso principal do malte sejaparaa produção de bebidas, também pode ser utilizado em outros processos industri- . ais, por exemplo, como uma fonte de enzima na indústria de panificação, ou como agente aromatizante e corantes na indústria de alimentos, como farinha de malte ou malte, ou indi- retamente, como um xarope de malte, etc.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a métodos de produção da compo- siçãodemalte.

Os métodos de preferência compreendem as etapas de: (i) Prover grãos de cevada LOX nula dupla; (ii) Imergir os grãos;

: 32 E (iii) Germinar os grãos imersos em condições predeterminadas; (iv) Secar os grãos germinados; produzindo assim uma composição de malte com uma perda total de atividade de LOX-1 e atividade de LOX-2. Por exemplo, o malte pode ser produzido por qualquer um dos métodos descritos por Briggs et al. (1981) e por Hough et al. (1982). No entanto, qualquer outro método adequado para a produção de malte também pode ser usado com a presente invenção, tal como métodos para a produção de maltes especiais, incluindo, mas não limita- . dos a, métodos de torrefação do malte. Exemplos não limitantes são descritos em Exemplos 6e8.

. 10 Malte pode ser adicionalmente processado, por exemplo, por moagem. Assim, o produto de planta de acordo com a invenção pode ser qualquer tipo de maite, tal como o malte não processado ou malte moído ou farinha do mesmo. Malte moído e farinha do mesmo compreendem componentes químicos do malte e células mortas que não têm capa- cidade para regerminar.

Em outro aspecto, os produtos de planta de acordo com a invenção compreendem ou mesmo consistem em xarope, tal como um xarope de cevada, ou um xarope de maite de cevada. O produto de planta também pode ser um extrato de malte ou cevada.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a tipos de produtos de planta, que são composições de mosto preparadas a partir de composições de malte derivadas de grãos de LOX nula dupla. Os maltes podem ser preparados a partir de apenas grãos de LOX nula dupla, ou misturas compreendendo outros grãos também. A invenção também refere-se a composições de mosto preparadas usando cevada LOX nula dupla, ou suas partes, isola- damente ou misturadas com outros componentes.

As composições de mosto preferencialmente têm menos de 30%, mais preferivel- —mentemenos de 20%, ainda mais de preferência menos de 10% de T2N livre em compara- ção com uma composição de mosto preparada da mesma forma a partir de uma cevada de tipo selvagem, de preferência de cv. Power. Mais preferivelmente, as composições de mosto têm menos de 60%, mais preferivelmente menos de 50% de T2N livre em comparação com . uma composição de mosto preparada da mesma forma a partir do mutante D112 de cevado descrito em WO 2005/087934. Além disso, é preferível que as composições de mosto prefe- - rencialmente têm menos de 40%, mais preferivelmente menos de 30%, ainda mais de prefe- rência menos de 25% de potencial de TAN em comparação com uma composição de mosto preparada da mesma forma a partir de uma cevada de tipo selvagem, de preferência de cv.

Power. Mais preferivelmente, as composições de mosto têm menos de 60%, mais preferi- velmente menos de 50% de potencial de TAN em comparação com uma composição de mosto preparada da mesma forma a partir de mutante D112 de cevado descrito em WO 2005/087934.

V 33 ' O mosto pode ser o primeiro, e/ou o segundo, e/ou mostos adicionais. A composi- ção de mosto pode ser mosto doce, mosto cozido, ou uma mistura dos mesmos. A composi- ção de mosto pode ser também o mosto de cevada. Em geral, uma composição de mosto contém um alto teor de nitrogênio amino e carboidratos fermentáveis, principalmente este últimosendo malitose. Na FIG. 3, as etapas 4 a 6 ilustram o método comum para a prepara- ção do mosto a partir de malte. Em geral, o mosto é preparado combinando e incubando malte e água isto é, em um processo de brassagem. Durante brassagem, a composição de - malte / líquida pode ser completada com composições de adjunto ricas em carboidratos, por exemplo, cevada moída, milho ou adjuntos de arroz. Adjuntos de cereais não maltados ge- . 10 ralmente contêm pouco ou nenhuma enzima ativa, tornando-a importante para suplemento com malte ou enzimas exógenas para prover as enzimas necessárias para a conversão de açúcar. Em geral, a produção de mosto é iniciada pela moagem de malte tal que água pode ter acesso a partículas de grãos na fase de brassagem. A brassagem é basicamente uma extensão do processo de maltagem, com despolimerização enzimática de substratos. Du- rante brassagem, malte moído é incubado com uma fração de líquido, tal como água. À temperatura de incubação é, em geral, ou mantida constante (brassagem isotérmica), ou aumentada gradualmente. Em ambos os casos, as substâncias solúveis produzidas em mal- tagem e brassagem são liberadas na fração líquida. A filtração subsequente confere separa- ção do mosto e partículas sólidas residuais, este último também denotado "grão gasto". O mosto também pode ser denotado "primeiro mosto". Depois de pulverização e filtração, um "segundo mosto" pode ser obtido. Mostos ainda podem ser preparados, repetindo o proce- dimento. Exemplos não limitantes de procedimentos adequados para a preparação do mos- to são descritos por Briggs et al. (Supra) e Hough et al. (Supra).

Foi descrito que a atividade de lipoxigenase pode ser reduzida por tratamento tér- mico das enzimas. Foi descrito que o mosto pode ser tratado termicamente para atividade lipxogenase reduzida e/ou que brassagem é realizada em altas temperaturas. No entanto, além de reduzir a atividade das lipoxigenases, tratamento térmico pode ter outros efeitos . adversos, como a redução de outras atividades enzimáticas. Além disso, o tratamento térmi- coapenas reduz a atividade de lipoxigenase a partir do ponto em que o tratamento térmico é Í realizado e, portanto, não afeta a acumulação prépercurso de produtos lipoxigenase.

Assim, em uma modalidade o mosto de acordo com a invenção é preparado usan- do um método em que a temperatura inicial de brassagem não excede 70ºC, de preferência não é superior a 69ºC, assim, por exemplo, a temperatura inicial de brassagem pode estar —nafaixade 50ºC a 69ºC, tal como na faixa de 55ºC a 69ºC, por exemplo, na faixa de 55ºC a 65ºC. Também é preferível que o mosto de acordo com a invenção não tenha sido submeti- do a temperaturas de 70ºC ou mais durante mais de 25 min, de preferência não mais de 20

: 34 . min, mais de preferência não mais de 15 min. durante a brassagem. Se as temperaturas de brassagem são muito elevadas, elas irão afetar a atividade enzimática na brassagem e po- dem reduzir, ou mesmo abolir, atividades enzimáticas desejáveis, o que resultará em uma alteração da qualidade do mosto.

Primeiro, segundo e mostos adicionais podem ser combinados e, posteriormente, submetidos à fervura. O mosto não fervido, ou um primeiro mosto puro ou um mosto combi- nado, também é referido como "mosto doce", após fervura ele pode ser referido como "mos- N to cozido”. Se o mosto deve ser usado na produção de cerveja, lúpulos são frequentemente adicionados antes da fervura.

. 10 A composição de mosto também pode ser preparada através da incubação de plan- tas de cevada LOX nula dupla, ou de partes das mesmas, tal como grãos de LOX nula dupla não maltados, em particular, grãos de LOX nula dupla moídos, não maltados, e suas partes, com uma ou mais enzimas adequadas, tais como composições de enzimas ou composições de mistura de enzimas, por exemplo Cereflo, Ultraflo, ou Ondea Pro (Novozymes). Um mé- todo para produzir uma bebida a partir do mosto assim preparado pode também ser referido como "cerveja de cevada", e uma composição de mosto da mesma como "mosto de ceva- da", ou mosto de "cevada fabricada". A composição de mosto também pode ser preparada com uma mistura de malte e plantas de cevada não maltada, e suas partes, ou cevada não maltada somente, opcionalmente, adicionando uma ou mais enzimas adequadas durante a preparação, em particular amilases, glucanases [de preferência (1-4) e/ou (1-3,1-4)-B- glucanase] e/ou xilanase (tal como arabinoxilanase), e/ou proteases, ou misturas de enzi- mas compreendendo uma ou mais das enzimas acima mencionadas, por exemplo, adicio- nando a mistura de enzima Ondea Pro (Novozymes).

Em uma modalidade específica da invenção a composição de mosto de acordo com apresente invenção é um mosto de cevada, tal como mosto de cevada cozido, isto é, mosto preparado através da incubação de grãos de LOX nula dupla (e de preferência moídos) não maltados com água, de preferência por brassagem e pulverização. O mosto de cevada é caracterizado por níveis extremamente baixos de T2N e potencial T2N. Assim, o mosto de '" cevada de preferência compreende menos de 50%, mais preferivelmente menos de 40%, aindamaisde preferência menos de 30% de T2N livre em comparação com uma composi- f ção de mosto de cevada preparada da mesma forma a partir de uma cevada do tipo selva- gem, de preferência de cv. Power. Mais preferivelmente, as composições de mosto têm me- nos de 70%, mais preferivelmente menos do que 60% de T2N livre em comparação com uma composição de mosto preparada da mesma forma a partir do mutante D112 de cevada —descritoem WO 2005/087934. Além disso, é preferível que o mosto de cevada compreenda, no máximo, mais 0,15 ppb de T2N livre, quando o mosto é ajustado para um ºp na faixa de 13 a 16, de preferência na faixa de 14 a 15, mais preferivelmente de 14.5 ºp. Além disso, é

. 35 . preferível que o mosto de cevada de preferência compreenda menos de 50%, mais preferi- velmente menos de 40%, ainda mais de preferência menos de 30% de potencial de TAN em comparação com uma composição de mosto de cevada preparada da mesma forma a partir de uma cevada de tipo selvagem, de preferência da cv. Power. Também é preferível que o mosto de cevada de preferência compreenda menos de 50%, mais preferivelmente menos de 40%, ainda mais de preferência menos de 30% de precursor TAN em comparação com uma composição de mosto de cevada preparada da mesma forma a partir de uma cevada - de tipo selvagem, de preferência da cv. Power. A presente invenção também se refere a produtos de planta, que podem ser com- - 10 posições de alimentos, composições de alimentação, e composições de fragrâncias de ma- térias-primas que compõem plantas de cevada LOX nula dupla, ou suas partes. Composi- ções de alimentos, por exemplo, podem ser, mas não estão limitadas a, grãos de cevada maitados e não maltados, refeições com cevada, pão, mingau de aveia, mistura de cereal compreendendo produtos de cevada, de saúde, tais como bebidas que incluem cevada, xa- —ropes de cevada, e em flocos, composições cevada moída ou extrudada. Composições de alimentação, por exemplo, incluem composições compreendendo grãos de cevada, e/ou refeições. Composições de fragrância de matéria-prima são aqui descritas abaixo.

A invenção também se refere a misturas de composições da invenção. Por exem- plo, a invenção em um aspecto se refere a uma composição preparada por uma mistura de: (i) uma composição que compreende uma planta de cevada, ou parte dela, com- preendendo uma primeira mutação que resulta em uma perda total da função de atividade de LOX-1, tal como uma perda funciona! total de Enzima LOX-1, e uma segunda mutação resultando em uma perda total da função de atividade de LOX-2, tal como a perda total de enzima LOX-2 funcional, e (ii) uma composição de malte preparada a partir de Grãos de LOX nula dupla.

Em um aspecto preferido, a presente invenção refere a bebidas, mais preferidas são bebidas de malte, ainda mais preferidas bebidas fermentadas, tai como bebidas fermen- tadas de malte, de preferência bebidas alcoólicas, como a cerveja tendo qualidades orga- . nolépticas estáveis, em que a bebida é preparada com cevada LOX nula dupla, ou suas par- tes. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, a bebida é preparada de preferência 5 por fermentação da cevada LOX nula dupla, ou suas partes, ou extratos da mesma, por exemplo, por fermentação do mosto a partir de malte de LOX nula dupla, sozinho ou em combinação com outros ingredientes.

Em outras modalidades da invenção, no entanto, a bebida é uma bebida não- fermentada, por exemplo, o mosto, de preferência mosto preparado a partir de malte de LOX nula dupla. Também está compreendido dentro da presente invenção que a bebida pode ser preparada a partir de plantas de cevada não maltada, ou suas partes.

: 36 . A bebida pode ser uma bebida não-alcoólica, tal como cerveja sem álcool ou outros tipos de bebidas não-alcoólicas, tais como bebidas não alcoólicas de malte, como Maltina.

De preferência, no entanto, a bebida é preparada a partir de uma composição de malte preparada a partir de grãos de cevada LOX nula dupla. Mais preferivelmente, a bebida é cerveja. lsto pode ser qualquer tipo de cerveja conhecida pela pessoa versada na técnica.

Em uma modalidade, a cerveja é, por exemplo, uma cerveja de baixa fermentação. A cerve- ja é fabricada de preferência usando uma composição de malte compreendendo cevada - germinada LOX nula dupla, mais preferivelmente a cerveja é feita usando uma composição de malte preparada exclusivamente a partir de cevada germinada LOX nula dupla. A com- - 10 posição de malte pode, no entanto, incluir igualmente outros componentes, por exemplo, outros cereais germinados ou não germinados, como cevada do tipo selvagem, cevada de LOX-1 nula, trigo e/ou centeio, ou matérias-primas não germinadas que compreendem açú- cares, ou composições derivadas matérias-primas maltadas ou não maltadas, incluindo composições de xarope. No entanto, de preferência toda a cevada, tal como todos toda a cevada maltada e/ou não maltada e/ou cevada germinada e/ou não-germinada usada para a preparação da referida cerveja é de preferência a cevada LOX nula dupla.

Em uma modalidade preferida, a bebida de acordo com a invenção é a cerveja que foi produzida a partir de mosto preparado a partir de malte dessecado, de preferência por brassagem e, opcionalmente, pulverização. Cerveja também pode ser referida como aqui "maltada". No entanto, a bebida de acordo com a invenção pode também ser cerveja prepa- rada a partir de mosto de cevada. Cerveja, também é referida como "cerveja de cevada”.

Em uma modalidade preferida, a bebida de acordo com a invenção compreende menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, tal co- mo menos de 30% de potencial TAN em comparação com o potencial TAN de uma bebida preparada da mesma maneira a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power. Também é preferível que a bebida de acordo com a invenção compreenda menos de 70%, de preferência menos de 60%, tal como menos de 50% de potencia! T2N em relação a uma bebida preparada da mesma forma a partir de um mutante de cevada LOX-1 nula, de . preferência a partir de mutante D112 de cevada descrito em WO 2005/087934. Também é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compreendam no máximo 2 ppb, mais * preferivelmente, no máximo, 1,5 ppb, tal como no máximo 1 ppb do potencial TAN se o ºp no extrato original em que a bebida se baseia é ajustado para a faixa de 10 a 12 ºp, mais prefe- rivelmente a 11 ºp.

Em uma modalidade preferida, a bebida de acordo com a invenção compreende menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, tal co- mo menos 30% de precursor TAN em comparação com o precursor T2N de uma bebida preparada da mesma maneira a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

p 37 Power.

Também é preferível que a bebida de acordo com a invenção compreenda menos de 70%, de preferência menos de 60%, tal como menos de 50% de precursor T2N comparado a uma bebida preparada da mesma forma a partir do mutante D112 de cevada descrito em WO 2005/087934. Também é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compre- endamno máximo 2 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 1,5 ppb, tal como no máximo 1 ppb de precursor T2N se o ºp no extrato original em que a bebida se baseia é ajustado para a faixa de 10 a 12 ºp, mais preferivelmente a 11 ºp. . Em uma modalidade específica da invenção, a bebida é cerveja de cevada, que compreende menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de . 10 35% de potencial de TAN em comparação com o potencial T2N de uma cerveja de cevada preparada da mesma forma que a cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power.

Nesta modalidade, também é preferível que a cerveja de cevada compreenda menos de 50%, de preferência menos de 40% de precursor T2N, mais preferivelmente menos de 35% em comparação com os precursores de T2N de uma cerveja de cevada preparada da mes- —maforma a partir cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power.

Nesta modalidade, também é preferível que a cerveja de cevada de acordo com a invenção compreenda no máximo 2 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 1,5 ppb, ainda mais de preferência 1,2 ppb de potencial T2N.

Nesta modalidade, é também preferível que a cerveja de cevada de acor- do com a invenção compreenda, no máximo 2 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 1,5 —ppb, ainda mais, de preferência, no máximo, 1,2 ppb do precursor T2N se o ºp no extrato original ao qual a bebida é baseada é ajustado para na faixa de 10 a 12 ºp, mais preferivel- mente a 11 ºp.

Em outra modalidade específica da invenção a bebida é cerveja preparada a partir de malte, em que a cerveja compreende menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferiveimente menos de 30% de potencial de TAN em comparação com o potencial T2N de uma cerveja preparada na mesmo maneira que cevada do tipo selvagem, de prefe- rência de cv.

Power.

Nesta modalidade, também é preferível que a cerveja compreenda me- nos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 30% de precur- . sor T2N em comparação com os precursores de T2N de uma cerveja preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência a partir cv.

Power.

Nesta modali- ' dade, também é preferível que a cerveja de acordo com a invenção compreenda, no máxi- mo 2 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 1,5 ppb, ainda mais, de preferência, no máxi- mo, 1 ppb de potencial T2N.

Nesta modalidade, é também preferível que a cerveja de acor- do com a invenção compreenda, no máximo 2 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 1,5 —ppb, ainda mais, de preferência, no máximo, 1 ppb de precursor T2N se o ºp no extrato ori- ginal sobre ao qual a bebida é baseada é ajustado para a faixa de 10 a 12 ºp, mais preferi- velmente a 11 ºp.

. 38 ' “Qualidades organolépticas" signífica qualidades atraentes aos sentidos olfativo e gustativo humanos. Estes são analisados, por exemplo, por um quadro de especialistas trei- nados. Preferencialmente, o quadro de especialista é treinado especificamente para reco- nhecer sabor áspero de aldeído, como T2N. Em geral, o quadro de sabor irá consistir na faixade3a30membros, por exemplo, na faixa de 5 a 15 membros, de preferência na faixa de 8 a 12 membros. O painel de sabor pode avaliar a presença de vários sabores, como sabores de sabor de papel, oxidados, envelhecidos e de pão, e. Em relação a presente in- ' venção, é preferível que sabores ásperos de papel e/ou envelhecidos sejam, nomeadamen- te, reduzidos. Um método para determinar as "qualidades organolépticas" de uma bebida é . 10 descritono Exemplo 6 em pedido de patente internacional WO 2005/087934. Outro método preferido de determinar "qualidades organolépticas" de uma bebida é descrito nos Exemplos 8 e 9 adiante. Em modalidades preferidas, as qualidades organolépticas estáveis são, pelo menos em parte, resultado dos baixos níveis de T2N ou potencial T2N.

É preferível que as bebidas de acordo com a presente invenção sejam caracteriza- dasporterem um sabor menos de papel em comparação com uma bebida similar preparada da mesma forma a partir de uma planta de cevada contendo atividade de LOX-1 e LOX-2 após o armazenamento durante pelo menos 10 meses em uma faixa de 15 a 25ºC tal como em torno de 20ºC. Preferencialmente, o sabor de papel é menos de 90%, mais preferivel- mente menos de 80%, tal como menos de 70%, como avaliado por um quadro de especialis- taemsabor.

Também é preferível que as bebidas de acordo com a presente invenção tenham sabor de papel reduzido em comparação com uma bebida similar preparada a partir da ce- vada do tipo selvagem após o armazenamento em temperaturas elevadas. Quando a pro- priedade "gosto tipo papel" é determinada por um quadro de especialistas de sabor, descrito acima,e pontuada em uma escala de O a 5, onde O é ausente e 5 é extremo - então é prefe- rível que as bebidas da invenção tenham um ou mais, de preferência pelo menos dois, tal como pelo menos três, por exemplo, todas as seguintes pontuações para o sabor de papel: (i) Uma pontuação para o sabor de papel pelo menos 0,5, de preferência, pelo me- - nos, 0.7, mais preferivelmente pelo menos 1,0 menor que a pontuação para o sabor de pa- —pelde uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de pre- 7 ferência de cv. Power após incubação a 37ºC por uma semana; (ii) Uma pontuação para o sabor de papel de pelo menos 0,5, de preferência, pelo menos, 0.7, mais preferivelmente pelo menos 1,0 menor que a pontuação para o sabor de papel de uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de —preferênciade cv. Power após incubação a 37ºC por duas semanas; (iii) Uma pontuação para o sabor de papel pelo menos 0,5, de preferência pelo me- nos 0,7, como, pelo menos, 1,0 menor que a pontuação para o sabor de papel de uma bebi-

' 39 : da preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power após incubação a 37ºC por três semanas; (iv) Uma pontuação para o sabor de papel no máximo de 90%, de preferência no máximo 80%, mais preferivelmente no máximo de 70%, ainda mais de preferência no máxi- mo60%, ainda mais de preferência, no máximo 50% da pontuação para sabor de papel de uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power após incubação a 37 ºC por uma semana; . (v) A pontuação para o sabor de papel no máximo de 90%, de preferência no má- ximo, 80%, mais preferivelmente no máximo de 70%, ainda mais de preferência no máximo . 10 60% da pontuação para o sabor de papel de uma bebida preparada da mesma maneira de cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power após incubação a 37ºC por duas se- manas;

(vi) Uma pontuação para o sabor de papel no máximo de 90%, de preferência no máximo, 80% da pontuação para o sabor de papel de uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power após incubação a 37ºC por três semanas;

A bebida é dita ter "qualidades organolépticas estáveis", quando a bebida compre- ende níveis muito baixos de T2N livre, mesmo após o armazenamento.

Assim, é um objetivo da presente invenção prover bebidas (como cerveja com qualidades organolépticas está-

veis), fabricadas usando uma planta de cevada de LOX nula dupla.

Bebidas, de preferência compreendem níveis muito baixos de potencial T2N - de preferência menos de 50%, de pre- ferência compreendem menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, tal como me- nos de 30%, por exemplo, menos de 20%, tal como menos de 10% de potencial de TAN em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selva-

—gem,de preferência de cv.

Power - após o armazenamento por pelo menos uma semana, de preferência, pelo menos, duas semanas, mais de preferência pelo menos 3 semanas, ainda mais de preferência pelo menos quatro semanas, tal como na faixa de 1 a 3 meses, por exemplo na faixa de 3 a 6 meses, tal como na faixa de 6 a 12 meses, por exemplo, por

" mais de um ano.

Além disso, é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compreendam r níveis muito baixos de T2N — de preferência menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, ainda mais de preferência menos de 30%, por exem- plo, menos de 25% de T2N livre em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Power - após o armazena-

— mento por pelo menos uma semana, de preferência, pelo menos, duas semanas, mais de preferência pelo menos 3 semanas, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 semanas a uma temperatura na faixa de 30 a 40ºC, de preferência a 37ºC, tal como na faixa de 1a 3 i 40 y meses, por exemplo na faixa de 3 a 6 meses, tal como na faixa de 6 a 12 meses, por exem- plo, por mais de um ano a uma temperatura na faixa de 20-30ºC.

Em particular, é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compreendam níveis muito baixos de T2N — de preferência menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferiveimente menos do que 35% de T2N livre em comparação com uma bebida preparada da mesma forma que a cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power - após o armazenamento por 2 semanas a 37ºC. Também é preferível que as bebidas de - acordo com a invenção compreendam menos de 50 ppt, ainda mais de preferência menos de 40 ppt, ainda mais de preferência menos de 30 ppt de T2N livre após o armazenamento . 10 por2semanas a 37ºC. Preferencialmente o armazenamento é realizado na presença de um nível de sulfito não superior a 10 ppm, de preferência um nível de sulfito na faixa de 1 a 10 ppm, mais preferivelmente na faixa de 1 a 8 ppm, mais preferivelmente na faixa de 2 a 6 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa de 3 a 5 ppm, tal como 4 ppm de suifito.

Também é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compreendam me- nos de 80%, de preferência menos de 75%, tal como menos de 60% de T2N livre em com- paração com uma bebida preparada da mesma forma a partir de cevada LOX 1 nulo, de preferência de mutante D112 de cevada descrito em WO 2005/087934 - após o armazena- mento por 2 semanas a 37 ºC. Preferencialmente o armazenamento é realizado na presença de um nível de sulfito não superior a 10 ppm, de preferência um nível de sulfito na faixa de 1 a10ppm, mais preferivelmente na faixa de 1 a 8 pom, mais preferivelmente na faixa de 2 a 6 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa de 2 a 4 ppm.

Também é particularmente preferido que as bebidas (como cerveja, por exemplo, cerveja de cevada) de acordo com invenção compreendam níveis muito baixos de T2N - de preferência menos de 50%, de preferência menos de 40%, mais preferivelmente menos de 35%, ainda mais de preferência menos de 30%, ainda mais preferivelmente menos de 25%, de T2N comparado a bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selva- gem, de preferência de cv. Power - após o armazenamento por 8 semanas a 37ºC. Além disso, é preferível que as bebidas (como cerveja, por exemplo, cerveja de cevada) compre- . endam, no máximo, 50 ppt, ainda mais, de preferência, no máximo, 40 ppt, ainda mais, de — preferência, no máximo, 30 ppt, ainda mais, de preferência, no máximo, 20 ppt de T2N livre após o armazenamento por 8 semanas a 37 ºC. Preferencialmente o armazenamento é rea- lizado na presença de um nível de sulfito não superior a 10 ppm, de preferência um nível de sulfito na faixa de 1 a 10 ppm, mais preferivelmente na faixa de 1 a 8 ppm, mais preferivel- mente na faixa de 1 a 6 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa de 2 a 4 ppm, tal como a 3 ppmdesulfito.

Também é preferível que as bebidas de acordo com a invenção compreendam me- nos de 70%, de preferência menos de 60%, ainda mais de preferência menos de 55% de

. 41 E T2N livre em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada LOX 1 nulo, de preferência do mutante D112 de cevada descrito em WO 2005/087934 - após o armazenamento por 8 semanas a 37ºC.

Preferencialmente o armazenamento é reali- zado na presença de um nível de sulfito não superior a 10 ppm, de preferência um nível de suífitonafaixade 1a 10 ppm, mais preferivelmente na faixa de 1-8 pom, mais preferivel- mente na faixa de 2 a 6 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa de 2 a 4 pom.

Além disso, é um objetivo da presente invenção prover bebidas, tal como cerveja . fabricada usando uma planta de cevada de LOX nula dupla — de preferência compreenden- do menos de 70%, de preferência menos de 60%, tal como menos de 50% de T2N e/ou Po- . 10 tencial de T2N, mais preferivelmente menos de 70%, de preferência menos de 60%, tal co- mo menos de 50% de T2N livre - em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir de mutante D112 de cevada, conforme descrito em WO 2005/087934, após o armazenamento por pelo menos uma semana, de preferência, pelo menos, duas semanas, mais de preferência pelo menos 3 semanas, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 se- —manasa uma temperatura na faixa de 30 a 40ºC, de preferência a 37ºC, tal como na faixa de 1 a 3 meses, por exemplo na faixa de 3 a 6 meses, tal como na faixa de 6 a 12 meses, por exemplo, por mais de um ano a uma temperatura na faixa de 20 a 30ºC.

Em particular, é preferível que as bebidas (como cerveja, por exemplo, cerveja de cevada) de acordo com a invenção compreendam níveis muito baixos de T2N - de preferên- ciamenos de 70%, de preferência menos de 60%, mais preferivelmente menos de 55%, mesmo mais de preferência menos de 52% de T2N livre - em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv.

Po- wer, após o armazenamento por 8 semanas a 37ºC, Preferencialmente o armazenamento é realizado na presença de um nível de sulfito não superior a 10 ppm, de preferência um nível desulfitonafaixade 1a10 ppm, mais preferivelmente na faixa de 1 a 8 ppm, mais preferi- velmente na faixa de 1 a 6 ppm, ainda mais preferivelmente na faixa de 2 a 4 ppm, tais co- mo a 3 ppm de sulfito.

De preferência, a bebida de acordo com a invenção também compreende na faixa . de 1 a 10 partes por milhão (ppm) de sulfito, mais preferivelmente na faixa de 2 a 8 ppm, mais preferivelmente na faixa de 3 a 7 ppm, de preferência ainda mais na faixa de 4 a 6 pom | de sulfito.

As bebidas da invenção compreendem, preferencialmente, no máximo, 0,07, de preferência, no máximo 0,06, mais preferivelmente, no máximo, 0,05, ainda mais, de prefe- rência, no máximo, 0,04, tal! como no máximo 0,03 partes por bilhão (ppb) de T2N livre após o armazenamento por pelo menos uma semana, de preferência, pelo menos, duas sema- nas, mais de preferência pelo menos 3 semanas, ainda mais de preferência pelo menos quatro semanas, tal como na faixa de 1 a 3 meses, por exemplo na faixa de 3 a 6 meses, tal como como na faixa de 6 a 12 meses, por exemplo, por mais de um ano após o armazena-

. 42 : mento a uma temperatura na faixa de 15ºC a 40ºC, de preferência na faixa de 30ºC a 37ºC, mais preferivelmente a 37ºC. Em uma modalidade preferida da invenção, as bebidas de acordo com a invenção compreendem, no máximo, 0,03 ppb, de preferência, no máximo 0,025 ppb, mais preferivelmente, no máximo, 0,02 ppb (partes por bilhão) de T2N livre após oarmazenamento por 4 semanas a 37ºC na presença de na faixa de 4 a 6 ppm de sulfito.

As bebidas com qualidades organolépticas estáveis de acordo com a invenção de preferência compreendem níveis baixos de potencial T2N, de preferência menos de 40%, - mais preferivelmente pelo menos 30%, ainda mais de preferência menos de 25% de poten- cial de TAN em comparação com uma bebida similar preparada da mesma maneira a partir - 10 deuma plantade cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power.

Em uma modalidade, a invenção refere a bebidas, tal como cerveja, com baixos ní- veis de certos ácidos trihidróxi octadecenóicos (também denotado como THAs), em especial para as bebidas com baixos níveis de 9,12,13-THA e 9,10,13-THA. THAs são caracterizados por um sabor amargo (Baur e Grosch, 1977; Baur et al., 1977), e por isso são considerados indesejáveis.

É, portanto, desejável que o nível de 9,12,13-THA e 9,10,13-THA seja tão baixo quanto possível, de preferência menos de 1,3 ppm, tal como menos de 1 ppm. No entanto, a concentração global de 9,12,13-THA e 9,10,13-THA em uma bebida derivada de malte tam- bém é dependente da quantidade de malte utilizado para a preparação da bebida específica.

Assim, em geral, uma cerveja forte irá compreender mais 9,12,13-THA e 9,10,13-THA do que uma cerveja mais leve, tornando um nível total mais elevado de 9,12,13-THA e 9,10 ,13- THA aceitável em um cerveja forte. Assim, é preferível que a bebida de acordo com a inven- ção compreenda um menor nível de 9,12,13-THA e 9,10,13-THA do que uma bebida prepa- rada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power. Em particular, uma bebida de acordo com a invenção de preferência tem um nível de 9,12,13 THA, que é no máximo de 50%, de preferência no máximo, 40%, mais preferencialmente no máximo 30% em relação ao nível de uma bebida preparada da mesma forma a partir de uma cevada de tipo selvagem, de preferência de cv. Power. Além disso, é preferível que . uma bebida de acordo com a invenção tenha um nível de 9,10,13 THA, que seja no máximo de70%, de preferência no máximo 60% em relação ao nível de uma bebida preparada da ' mesma forma a partir de um da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power. Tais bebidas podem ser preparadas usando cevada LOX nula dupla.

Em uma modalidade da invenção, nas bebidas tem-se melhorado a qualidade da espuma. Isto é especialmente importante quando a bebida é uma cerveja. Assim, é um obje- tivo da invenção prover bebidas, tal como cerveja, com a qualidade da espuma superior.

Preferencialmente, as bebidas da invenção produzem pelo menos 10% mais, de preferência pelo menos 20% mais, ainda mais de preferência, pelo menos, 25% a mais de espuma em

. 43 . 60 a 80 min, de preferência em 80 min. em comparação com uma bebida preparada da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem, de preferência de cv. Power. A produção da espuma é determinada como descrito no Exemplo 9 aqui abaixo. A invenção também se refere a métodos de produção da bebida. Os métodos de preferência compreendem as etapas de: (i) Prover uma composição de malte compreendendo grãos de LOX nula dupla germinados; - (ii) — Processar a composição de malte em uma bebida; obtendo assim uma bebida com qualidades organolépticas mais estáveeis.

- 10 Em uma modalidade preferida, a bebida é cerveja. Neste caso, a etapa de proces- samento de preferência compreende a preparação do mosto a partir da composição de mal- te, por exemplo, por qualquer um dos métodos descritos acima, e a fermentação do mosto.

Em termos gerais, bebidas alcoólicas — tal como a cerveja - podem ser fabricadas a partir de grãos de cevada maltados e/ou não maltados. Malte, além de lúpulos e levedura, contribui para dar sabor e cor à cerveja. Além disso, malte funciona como uma fonte de açú- cares fermentáveis e enzimas. Uma representação esquemática de um processo geral de produção de cerveja é mostrada na FIG. 3, enquanto descrições detalhadas de exemplos de métodos adequados para maltagem e brassagem podem ser encontradas, por exemplo, em publicações por Briggs et al. (1981) e Hough et al. (1982). Numerosos, métodos atualizados regularmente para análises de cevada, malte e produtos de cerveja estão disponíveis, por exemplo, mas não limitados em, Associação Americana de Químicos de Cereais (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998), e Ins- tituto f Brewing (1997). Reconhece-se que muitos procedimentos específicos são emprega- dos para uma dada cervejaria, com as variações mais significativas relacionadas com as preferências do consumidor local. Qualquer método de produzir tal cerveja pode ser usado com a presente invenção. Exemplos não-limitantes são descritos no Exemplo 8 e Exemplo

9.

A composição de malte da bebida acima mencionada — tal como cerveja, bebidas . de malte, ou mosto não fermentado — pode, por exemplo, ser obtida por qualquer dos méto- dos aquidescritos acima. Mosto pode ser preparado a partir da composição de malte como ' acima descrita.

A primeira etapa de produção de cerveja a partir de mosto de preferência envolve ferver o mosto. Durante a fervura, outros ingredientes podem ser adicionados — por exemplo lúpulo que provê as características aromáticas e amargas típicas da cerveja. Ebulição do mosto também causa agregação entre polifenóis e proteínas desnaturadas, que principal- mente se precipitam durante a fase subsequente de resfriamento do mosto. Após ser resfri- ado, o mosto é transferido para tanques de fermentação com levedura. Preferencialmente, a

. 44 . levedura é levedura de cerveja, Saccharomyces carlsbergensis. O mosto irá ser fermentado por qualquer período de tempo adequado, em geral na faixa de 1 a 100 dias. Durante o pro- cesso de fermentação de vários dias de duração, o açúcar é convertido em álcool e CO, concomitantemente com o desenvolvimento de algumas substâncias de sabor.

Posteriormente, a cerveja pode ser processada, por exemplo, refrigerada. Também pode ser filtrada e/ou sofrer baixa fermentação — um processo que desenvolve um aroma agradável e um sabor menos com gosto de levedura — fermentada. Também aditivos podem - ser adicionados. Além disso, o CO, pode ser adicionado. Finalmente, a cerveja pode ser pasteurizada e/ou filtrada, antes de ser embalada (por exemplo, garrafa ou lata).

- 10 Apesar dos avanços na área de produção de cerveja, seria benéfico reduzir os ní- veis de T2N e potencial T2N na cerveja. Assim, permanece a necessidade de novas maté- rias-primas, especialmente cevada e malte que contribuem com menos sabor áspero à cer- veja acabada. É, portanto, um objetivo da presente invenção prover plantas de cevada e malte.

Vários métodos são disponíveis para determinar se uma planta de cevada, ou um produto de planta, é preparada a partir de uma planta de cevada portando mutações nos genes de LOX-1 e LOX-2, causando uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma per- da total de enzima LOX 2 funcional. Produtos de planta irão, em geral, compreender pelo menos algum DNA genômico da planta utilizada para sua produção. Assim, malte irá conter grandes quantidades de DNA genômico, mas mesmo extratos de malte ou cevada, tal como mosto, podem incluir DNA genômico ou fragmentos do mesmo a partir de malte ou cevada. Também bebidas à base de cevada, tal como cerveja, pode incluir DNA genômico ou frag- mentos do mesmo a partir da planta. Por análise de DNA em um produto de planta, pode ser estabelecido se a planta, da qual o produto de planta é preparado, leva mutações nos genes LOX1eLOX-2, causando uma perda total de uma enzima LOX-1 funcional e perda total da enzima LOX-2 funcional. As mutações podem, por exemplo, ser qualquer uma das muta- ções nos genes LOX-1 e LOX-2 descritas acima na seção "Perda de função da atividade de LOX". O DNA genômico pode ser analisado por qualquer método útil, tal como sequencia- - mento ou por métodos baseados em amplificação, incluindo métodos baseados em PCR. Se asmutações particulares no gene LOX-1 e/ou gene LOX-2 forem assumidas, então a análi- í se de polimorfismo pode ser empregada, por exemplo, análise de SNP. Tal análise pode ser realizada como descrito adiante no Exemplo 10. O versado será capaz de adaptar a análise SNP específico descrita nestes exemplos para uso com outras mutações ou outras maté- rias-primas.

Se os produtos de planta acima mencionados apenas forem preparados a partir de plantas de cevada portando mutações nos genes de LOX-1 e LOX-2, causando uma perda total de enzima LOX-1 funcional e uma perda total de enzima LOX-2 funcional, então a pre-

p 45 P sença vs ausência MRNA LOX-1 e mRNA LOX-2 de cevada e/ou proteína LOX-1 e proteína LOX-2 também pode ser um indicativo de se o produto de planta é preparado a partir de uma planta de cevada de LOX nula dupla. Exame do produto de planta também pode ser realizado por western blot, ou outras análises de proteínas, ou por RT-PCR, ou por análise de Northern blot, ou por meio de outras análises de MRNA. Tais análises são particularmen- te úteis quando o produto de planta é de malte.

Mutagênese química - A fim de gerar plantas de cevada LOX nula dupla de acordo com a presente inven- ção - isto é, plantas compreendendo uma primeira mutação que resulta em uma perda total . 10 de enzima LOX-1 funcional e uma segunda mutação, que resulta em uma perda total de enzima LOX-2 funcional - um número muito grande de mutantes de cevada é preparado por qualquer método de mutagênese adequado, por exemplo, pelo uso de mutagênese química de grãos de cevada. Este método é conhecido por introduzir mutações aleatoriamente. Mu- tagênese de cevada pode ser realizada utilizando qualquer produto químico mutagenizado. No entanto, é de preferência realizado tratando sementes com NaN;, deixando os grãos sobreviventes germinarem, seguido por análise de plantas progênitas. A geração de planta que cresce dos caroços mutagenizados, referida como MO, contém quimeras heterozigóticas para qualquer mutação dada. Plantas de progênie coletadas após autopolinização são refe- ridas como a geração M1, em que uma determinada mutação segrega nos correspondentes heterozigotos e homozigotos (cf. FIG. 1).

Grãos de tratamento com NaN; não é equivalente ao tratamento de uma única célu- la, porque os grãos após o tratamento irão conter algumas células não-mutantes e uma va- riedade de células com mutações no DNA. Uma vez que mutações em linhagens de células que não levam à linhagem germinal irão ser perdidas, o objetivo é alcançar o agente muta- —gênicoparaas poucas células que se desenvolvem em tecidos reprodutivos, que contribu- em para o desenvolvimento da geração M1.

Para avaliar a eficiência global de mutação, quimeras albino albinas e plantas po- dem ser contadas nas gerações MO e M1. Número de pontuação de mutante como uma " função de plantas sobreviventes dá uma estimativa para a eficiência de mutação, ao marcar onúmerode mutante como uma função de sementes tratadas mede a combinação de efici- í ência de mutação e morte de grão matar.

É notável que as células tenham mecanismos de garantia de qualidade em prati- camente todas as etapas da expressão gênica, possivelmente para moderar os efeitos de mutações prejudiciais. Um exemplo bem estudado em eucariotos é decadência de MRNA mediada sem sentido, denotada NMD, que impede a síntese de proteínas prematuramente truncadas, potencialmente deletérias (Maquat e Carmichael, 2001; Wu et al., 2007). Em NMD, um códon de terminação é identificado como prematuro por sua posição em relação a

R 46 - elementos desestabilizadores à jusante. Mutações que geram códons de terminação prema- turos (sem sentido) (PTCs), por vezes, aumentam os níveis de transcrições alternativamente unidas que pulam as mutações reincidentes, assim potencialmente salvando função da pro- teina (Mendel! e Dietz, 2001). Cultura de plantas Em uma modalidade da invenção, o objetivo é prover plantas de cevada úteis agro- nômicas que compreendem o traço LOX nula dupla. Desenvolvimento da cultura é muitas - vezes um processo longo e difícil, que começa com a introdução do novo traço. A partir da perspectiva de um reprodutor de planta, no entanto, esta etapa quase sempre resulta em - 10 uma planta que tem um perfil geral menos desejável de traços agronômicos do que as atu- ais variedades comerciais.

Além do traço LOX nula dupla, existem fatores adicionais que também podem ser considerados na técnica de gerar uma variedade de cevada comercial de malte, por exem- plo, a produção do grão e tamanho, e outros parâmetros que se relacionam com o desem- penhoda maltagem ou desempenho de brassagem. Uma vez que muitos - se não todos — os traços foram mostrados como estando sob controle genético, a presente invenção tam- bém provê modernas cultivares de maltagem de alta produção, de homozigotos, modernos, que podem ser preparados a partir de cruzamentos com plantas de cevada LOX nula dupla que são divulgadas na presente publicação. Grãos de plantas de cevada que proveem uma nova matéria-prima com baixa capacidade de geração de potencial de T2N, isto é, malte produzido a partir de grãos de preferência têm menos de 50% de potencial de TAN em com- paração com o malte produzido da mesma forma a partir do mutante D112 LOX-1 nula de cevada descrito em WO 2005/087934. O criador de cevada qualificado será capaz de sele- cionar e desenvolver plantas de cevada, que — seguinte a cruzamentos com cevada LOX —nuladupla- resultará em cultivares superiores. Alternativamente, o criador de cevada pode utilizar as plantas da presente invenção para mutagênese adicional para gerar novas cultiva- res derivados de cevada LOX nula dupla.

Um método para garantir que o traço LOX nula dupla é mantido em linhagens des- . cendentes refere-se a análise SNP do gene LOX-1 e do gene LOX-2. De preferência, Ativi- dadesdeLOX-1eLOX-2 também são determinadas.

' As plantas de cevada de acordo com a presente invenção podem ser introduzidas em qualquer sistema de reprodução adequado.

Outro objetivo da presente invenção é prover plantas de cevada de elite agronômi- ca compreendendo traço LOX nula dupla. Assim, a presente invenção também é direciona- —daamétodos para a produção de uma nova planta de cevada de LOX nula dupla cruzando uma primeira planta de cevada parente com uma segunda planta de cevada parente, onde a primeira planta ou a segunda é uma cevada LOX nula dupla. Além disso, ambas as primeira

. 47 - e segunda plantas de cevada parentes podem vir de uma variedade de cevada LOX nula dupla. Assim, os métodos, utilizando as variedades de cevada LOX nula dupla fazem parte dessa invenção: autofecundação, retrocruzamento, cruzamento com a população, e assim por diante. Todas as plantas produzidas usando uma variedade de cevada LOX nula dupla como um parente estão dentro do escopo desta invenção, incluindo aquelas plantas desen- volvidas a partir de variedades derivadas de uma variedade de cevada LOX nula dupla. A cevada LOX nula dupla também pode ser utilizada para transformação genética, nesses - casos, onde o DNA exógeno é introduzido e expresso na planta LOX nula dupla ou tecido de planta.

- 10 Métodos de retrocruzamento podem ser usados com a presente invenção para in- troduzir em outro cultivar o traço LOX nula dupla de uma planta mutante de cevada, por exemplo, cv. Scarlett ou cv. Jersey, sendo que ambas são cultivares de cevada contempo- râneos, de alto rendimento. Em um protocolo padrão de retrocruzamento, a variedade origi- nal de interesse, isto é, a planta parente recorrente é cruzada com uma segunda variedade (planta parente não recorrente), portando os genes LOX mutantes de interesse a serem transferidos. As plantas descendentes LOX nula dupla resultantes deste cruzamento são posteriormente cruzadas para a planta parente recorrente, com o processo sendo repetido até que uma planta de cevada seja obtida em que essencialmente todas as características especificadas pela parente recorrente são recuperadas na planta gerada - além do traço LOX nula dupla da planta parente não recorrente. Eventualmente, a última planta, retrocru- zada gerada é autofecundada para produzir uma planta descendente de cultura LOX nula dupla puro.

Uma maneira de acelerar o processo de cultura de planta compreende a multiplica- ção inicial de mutantes gerados pela aplicação de técnicas de cultura de tecidos e regenera- ção. Assim, um outro aspecto da presente invenção é prover células, que ao crescer e dife- renciar produzem plantas de cevada tendo o traço LOX nula dupla. Por exemplo, a cultura pode envolver cruzamentos preparar plantas derivadas de antera fértil ou usando de cultura micrósporo.

. Produtos de Percurso LOX Em várias modalidades, a presente invenção refere-se a plantas de cevada, e pro- ' dutos derivados, compreendendo baixos níveis de potencial TAN. Enzimas LOX catalisam dioxigenação de ácidos graxos poliinsaturados com um sistema cis-1, cis-4 pentadieno. Em cevada, o C18 ácido linoléico de ácidos graxos poliinsaturados (18:2ºº*?) e ácido a-linolênico (18:3ºº2'5) são os principais substratos LOX. O percurso lipoxigenase do metabolismo do ácido graxo é iniciado pela adição de oxigênio molecular na posição C-9 (principalmente catalisado pela LOX-1) ou posição C-13 (principalmente catalisada por LOX-2) da cadeia acila, produzindo os 9- e 13-HPODEs correspondente [ácidos octadecatrienóicos 9- e 13-

' 48 hidroperóxido (HPOTEs) são produtos quando o substrato é ácido a-linolênico HPOTEs não funcionam como precursores de T2N]. Na ramificação hidroperóxido liase do percurso LOX, ambos 9- e 13-HPODEs podem ser clivados em oxiácidos de cadeia curta e aldeídos (cf.

FIG 2.). Em particular, 9-HPODE pode ser clivado para formar o cis-nonenal que é converti- 5 doparaT2N, enquanto 13-HPODE é o precursor de 2-E-hexenal.

Assim, 13-HPODE, o prin- cipal produto de dioxigenação catalisada por LOX-2 de ácido linoléico não estava previsto para ser um componente a montante no percurso que leva à formação do sabor rançoso de - T2N.

Reconhece-se que a presente invenção engloba a produção de metabólitos que in- - 10 fluenciam a jusante de catálise LOX-1 e LOX-2, que não são produzidos como um produto de reação catalisada por LOX-1 ou LOX-2, mas como um resultado de uma série subse- quente de reações.

Estes incluem isomerização e conversões espontâneas, induzidas por fator, ou catalisadas por enzima.

Assim, a produção desses metabólitos a jusante pode ser influenciada modulando a expressão de outros componentes do percurso, por exemplo, hi- —droperóxido liase (HPL). Potencial TAN Um objetivo importante da presente invenção é reduzir ou eliminar o potencial T2N.

Assim, é um objetivo da presente invenção reduzir a formação de precursores de T2N e adutos de aldeído.

Apesar de várias reações químicas relacionadas com a formação do gos- tode oxidação da cerveja permanecerem ainda desconhecidas, geração de T2N livre a par- tir de potencial T2N é reconhecida como uma das principais causas do desenvolvimento de sabor rançoso em produtos de cerveja (Kuroda et al., Supra). Assim, é um objetivo da pre- sente invenção prover bebidas com baixo nível de potencial de T2N, assim como bebidas com baixo nível de precursores de T2N.

A maioria do potencial de T2N é transferida do mosto para a cerveja finalizada, em que T2N livre pode ser liberado (Liegeois et al., 2002), com as condições de acidez e tempe- ratura sendo fatores importantes neste processo.

Com referência a presente invenção, o potencial T2N é definido como descrito acima nas definições.

Outros métodos para determi- . nação do nível de potencial T2N também estão disponíveis.

A fim de evitar confusão, o sig- nificado de "potencial de T2N" no presente contexto é como aqui descrito acima nas defini- í ções.

As substâncias químicas que têm a capacidade de libertar TAN ou serem convertida em T2N são denotadas "precursores de T2N" aqui, e precursores de T2N determinados ou medidos por métodos alternativos diferentes do método para determinar o potencial T2N são referidos como "precursores de T2N". Precursores de T2N podem nomeadamente ser de- terminados primeiro tratando uma amostra de tal forma que praticamente todas (de prefe- rência todas) as substâncias químicas, que têm a capacidade de liberar T2N ou ser conver- tidas em T2N realmente liberam T2N e/ou se convertem em T2N, respectivamente.

Depois

D 49 EL disso, o nível de T2N é determinado.

Grãos de cevada da invenção não compreendem atividades de LOX-1 e LOX-2. Curiosamente, tais grãos de cevada contêm muito pouco potencial de T2N.

As cervejas produzidas usando grãos de cevada LOX nula dupla irão, portanto, não apenas possuir um nível muito baixo de T2N, mas também um nível muito baixo de poten- cial T2N.

No âmbito da presente invenção estão grãos de cevada LOX nula dupla, que pro- duzem produtos de cerveja que contêm níveis muito baixos de potencial T2N, de preferência - menos de 40%, mais preferivelmente menos de 30%, ainda mais de preferência menos de 25% do nível de potencial de TAN de um produto de cerveja similar produzido da mesma . 10 formaa partir da cevada do tipo selvagem (de preferência cv Power). Assim, o referido pro- duto de cerveja de preferência compreende menos de 60%, mais preferivelmente menos do que 50% do potencial T2N de um produto de cerveja similar produzido da mesma forma a partir do mutante D112 de cevada descrito na WO 2005/087934. Além disso, é preferível que os produtos derivados de grãos de cevada LOX nula dupla possuam um nível muito baixo de precursores de T2N.

No âmbito da presente inven- ção são produtos de planta preparados a partir de grãos de cevada LOX nula dupla, os pro- dutos de planta contendo menos de 40%, mais preferivelmente menos de 30%, ainda mais de preferência menos de 25% do nível de precursores de T2N de um produto de planta simi- lar produzido da mesma forma a partir da cevada do tipo selvagem (de preferência cv.

Po- wer). Assim, o produto de planta de preferência compreende menos de 60%, mais preferi- velmente menos de 50% dos precursores de T2N de um produto de planta similar produzido da mesma forma a partir do mutante D112 de cevada descrito na WO 2005/087934. Deve ser notado que os valores de T2N medidos muitas vezes são mais elevados em amostras de, e em produtos de, uma matéria-prima micro-maltada do que de uma maté- ria-prima produzida em maior escala, por exemplo de uma de amostra piloto maltada de 30 kg.

No entanto, os valores experimentais relativos de T2N entre experimentos de grande e pequena escala são, em geral similares.

Da mesma forma, deve ser notado que potencial TAN medido (e precursores de . T2N) muitas vezes são mais elevados em amostras de, e em produtos de, uma matéria- — prima micro-maltada do que o em uma matéria-prima produzida em maior escala, por exem- f plo de uma amostra piloto maltada de de 30 kg.

No entanto, os valores experimentais relati- vos de potencial de T2N entre experimentos de grande e pequena escala são, em geral si- milares.

Exemplos Os exemplos aqui ilustram modalidades preferidas da invenção e não devem ser considerados como limitantes para a invenção.

Salvo indicação em contrário, técnicas de biologia molecular básicas foram realiza-

. 50 . das para a manipulação de ácidos nucléicos e bactérias, conforme descrito em Sambrook e Russel (2001).

Exemplo 1 Triagem para baixa atividade de LOX-2 em embriões maduros mutados de uma po- —pulaçãoLOX-1nulamutada, geração M3 LOX-1 e LOX-2 são sintetizados no embrião de cevada de maturação (com LOX-1 sendo a enzima predominante), e também no embrião em germinação (com níveis iguais de - ambas as enzimas). Para a determinação das atividades de LOX em milhares de amostras, ensaios utilizando extratos de embriões de cevada seriam mais convenientes. E em ensaios . 10 para níveis LOX-2, seria altamente vantajoso triar grãos de cevada LOX-1 nula mutageniza- da, cf. WO 2005/087934.

Grãos foram coletados de plantas de cevada de mutante D112 LOX-1 nula (descrito em WO 2005/087934 e depositado junto com ATCC sob o número de PTA-5487), e incuba- das com o NaN; mutagênico para induzir mutações pontuais no DNA genômico de cevada.

Os ajustes experimentais seguiram as recomendações fornecidas por Kleinhofs et al. (Su- pra).

Em seguida, grãos mutados de geração M1 foram propagados em gráficos de cam- po por duas gerações posteriores, eventualmente, provendo uma alta proporção de plantas homozigotas de geração M3 para fins de triagem (cf. FIG. 1 para uma visão de procedimen- to). Grãos mutados da geração M3 eram esperados conter mutações genéticas em uma frequência de 0,9-2,3 por 10.000 grãos (Kleinhofs et al., Supra).

Atividade de LOX-2 em embriões maduros do mutante de LOX-1 nula foi encontra- da para ser baixa, medida pelo ensaio de LOX-1 convencional. Aqui, as soluções estoque da mistura de reação são combinadas em simultâneo com o extrato (como descrito em WO —2005/087934). No aplicativo é detalhado um método que melhora a sensibilidade do ensaio, em que ambas as condições de extração da enzima, bem como a mistura das soluções es- toque de mistura de reação foram alteradas.

Para a extração de LOX, os presentes inventores acharam interessante que usar . um tampão de 100 mM de ácido láctico, pH 4,5, conferiu um nível de fundo significativamen- tereduzido de atividade de consumo HPODE, permitindo o acúmulo de HPODESs no tampão ' de ensaio. Além disso, os inventores descobriram que o teste poderia ser melhorado, permi- tindo que uma pequena fração dos HPODESs formados ativem LOX-2 através de oxidação Fe** > Fe*** de seus átomos de ferro ligados antes da adição dos reagentes de ensaio res- tantes, eventualmente formando um corante azul indamina. Em suma, enzima LOX-2 foi extraída de embriões maduros isolados, usando 200 ul de tampão de extração (100 mM de ácido láctico, pH 4,5). Extração foi realizada em placas de 96 poços em que cada poção de 1,2 ml continha uma borda de vidro de 5 mm circular.

" 51 " As placas foram incubadas em gelo por 10 min antes da transferência para um moinho de laboratório MM 300 (Retsch), ajustado eletronicamente para agitar a uma frequência de 27 sec” por 35 seg. Posteriormente, a placa foi centrifugada a 4000 rpm em uma centrífuga 6R Allegra (Beckman-Coulter) por 10 min a 4ºC para material precipitado insolúvel, e, posteri- ormente, mantido em gelo por no máximo 2 h antes de processamento adicional. A placa de 96 poços foi transferida para uma estação de trabalho de automação Laboratorial Biomek 2000 (Beckman-Coulter) para pipetagem adicional. Inicialmente, 96 x 40 ul de extratos de . embrião foram transferidos para uma placa de microtitulação padrão de 96 poços (Nunc), seguido pela adição de 90 ul de Reagente A [12,5 mm ácido 3-(dimetilamino) benzóico, áci- . 10 dolinoléicoa 0,625 mM], que foi feita primeiro misturando 155 ul de ácido linoléico, que cor- responde a 134 mg de ácido livre (Sigma, L-1376) e 257 mL de Tween-20, em seguida, HO foi adicionado a um volume de 5 ml, seguida pela adição de 600 ul de NaOH a 1M. A solu- ção limpa foi ajustada para 20 ml com HO. As misturas foram incubadas por 10 min antes de adicionar 20 ul de Reagente B (0,25 mM 3-metil-2-benzotiazolinahidrazona, 0,125 mg /

15. mlde hemoglobina). Após incubação adicional por 5 min, Asas foi medido em cada um dos 96 poços da placa usando um espectrofotômetro Flourostar Galaxy (Labtechnologies BMG), com a formação de cores que refletem a presença de HPODESs gerados por dioxigenação catalizada por LOX-2 (atividades são consequentemente dadas em unidades de Ass). Utilizando o procedimento acima descrito, um total de 21.000 linhagens de mutante de cevada foram analisadas para atividade de LOX-2, e 1.550 linhagens do mesmo selecio- nadas com base na baixa atividade de LOX-2. Estas linhagens foram adicionalmente propa- gadas no campo, com a atividade de LOX-2 depois medida nos grãos maduros. No entanto, nenhuma das linhagens foi encontrada transmitindo o baixo traço LOX-2 para a próxima geração. Exemplo 2 Triagem para baixa atividade de LOX-2 em embriões de cevada germinados Material de triagem melhorado. Grãos coletados de plantas de cevada de linhagem LOX-1 nula Ca211901 gerados pelos cruzamentos (mutante D112 de LOX-1 nula x Jersey) . foram incubados com o NaN; mutagênico de acordo com os detalhes providos por Kleinhofs etal (Supra). Este procedimento foi escolhido, pois é sabido que induz mutações pontuais i no DNA genômico de cevada, eventualmente conferindo substituições de resíduo de amino- ácidos ou truncamentos em proteínas codificadas pelo DNA mutagenizado. Nos experimen- tos de mutagênese da presente publicação, foi escolhido para propagar grãos mutantes da geração M1 em gráficos de campo por duas gerações posteriores, eventualmente gerando uma alta proporção de plantas homozigotas para fins de triagem (cf. FIG. 1). Enquanto os grãos de geração M2 não foram selecionados, principalmente porque se esperava que estes contivessem uma proporção relativamente alta de mutações pontuais heterozigotas, grãos

. 52 . mutantes de geração M3 foram usados como material de triagem, esperando 0,9-2,3 muta- ções por 10.000 grãos (Kleinhofs et al. supra). Surpreendentemente, os inventores descobriram que a análise instantânea de em- briões germinados apresentou resultados de ensaio muito melhores em comparação com a —análisede extratos de embriões maduros (como descrito acima no Exemplo 1). Um proce- dimento de triagem de alto rendimento foi estabelecido para medir a atividade de LOX-2 no embrião germinado, incluindo seu tecido de escutelo. . Dois embriões foram isolados de grãos maduros de 35.125 espigas de cevada (20.977 linhagens de geração M4 de mutante D112LOX-1 nula, e 14,148 linhagens de gera- . 10 çãoM3 de linhagens Ca211901 de linhagem LOX-1 nula), e transferidos para placas de ar- mazenamento de 96 poços (ABgene). Germinação do embrião foi iniciada na sequência de 20y! de água para cada poço, que estava coberto com um tecido Kimnett úmido e uma tam- pa de plástico.

As placas foram incubadas em sacos plásticos a 20ºC por 48 h.

Após a incu- bação, enzima LOX-2 foi extraída; para cada poço foi primeiro adicionado 5 mm de contas de vidroe 200 mL de tampão de extração (100 mM de solução de ácido láctico, pH 4,5), seguido por moagem por 35 segundos a uma frequência de 27 sec em um moinho de labo- ratório MM 300 (Retsch). Posteriormente, a placa foi centrifugada a 4.000 rom por 10 min a 4 ºC em uma centrífuga 6R Allegra (Beckman-Coulter), para precipitar material insolúvel.

Atividade de LOX-2 foi determinada basicamente como descrito para a análise de atividade deLOX-2 de extratos de embrião maduro (Exemplo 1), diferindo apenas no uso de apenas 30 ul extrato de por teste em vez de 40 ul.

Identificação de mutantes em potencial.

Como descrito acima, dois grãos cada um das 35.125 linhagens de cevada acima mencionadas foram analisados para atividade de LOX-2, com o objetivo de identificar grãos altamente reduzidos em tal atividade quando comparado com grãos de LOX nula e do tipo selvagem.

Um total de 7 mutantes brutos po- tenciais foram identificados na geração M3 da linhagem Ca211901. Estes foram adicional- mente propagados na estufa, coletados, e então re-selecionados para o caráter relacionado com a atividade de LOX muito baixa.

Eventualmente, apenas um mutante da linhagem . Ca211901, denotado mutante A689 (e aqui também indicado duas mutantes AGB9 LOX nula — dupla), foi mostrado não exibindo essencialmente nenhuma atividade de LOX-2. Medições ' detalhadas da atividade de LOX total foram realizadas com extratos de embriões germina- dos em que a atividade de LOX foi conferida quase exclusivamente por LOX-2 (Schmitt e van Mechelen, 1997). Para embriões germinados de grãos M3 de mutantes A689, a ativida- de de LOX total - tal como determinado pelo ensaio colorimétrico LOX (Exemplo 1; Tabela 1) -foio0163+5,5% Asss U/ embrião germinado, enquanto que para variedade LOX-1 nula mãe Ca211901 foi 1,224 + 3,8% A595 U / embrião germinado (o valor correspondente para mutante bruto D112 LOX-1 nula foi 1,215 + 6,0% A595 U / embrião germinado.

. 53 . Exemplo 3 Mutante de cevada A689 Foram realizadas análises para estabelecer se plantas LOX-2 nula de gerações M4 e M5 foram homozigotas para o fenótipo mutante correspondente. Este tipo de análise pode- riaajudara determinar se a mutação foi geneticamente dominante ou recessiva. Além disso, se as plantas de geração M3 foram heterozigotas para uma mutação dominante, então, indi- víduos de gerações subsequentes segregam para aquele fenótipo. - Atividade de LOX total foi medida em embriões de cevada de gerações M3, M4, e MB5 do mutante A689, e atividades não só foram comparadas com aquelas de embriões da . 10 linhagem materna Ca211901, mas também com mutante D112 LOX-1 nula. Determinação da atividade de LOX foi como descrita no Exemplo 1 da presente publicação. Em todos os experimentos, amostras de controle incluíram extratos padrão de embriões germinados da linhagem materna, bem como extratos padrão inativados por calor a partir de embriões de mutante de LOX-1 nula de linhagem Ca211901 e mutante D112. Para os embriões de gera- —çãoM4grãosde mutantes AGB9, a atividade de LOX média total foi de 0,151 + 2,6% Asos U (n = 24) e, para os embriões germinados de geração M5 de mutantes AG89 foi de 0,16 + 2,3% Asos U (n = 90). Para efeito de comparação, embriões germinados de linhagem Ca211901 LOX-1 nula e mutantes D112 produziram 1,210 + 3,0% Açsss U (n = 90; geração M4) e 1,199 + 4,6% Aços U (1 = 90; geração M5), respectivamente. Os resultados estão re- sumidos na Tabela 1, e na FIG. 4A - C. Em resumo, os dados experimentais confirmaram que os grãos das gerações M4 e M5 de mutante D112 foram homozigotos para o traço ge- nético especificando uma atividade de LOX total, muito baixa, refletindo um fenótipo LOX nula dupla. Tabela 1. Atividade de LOX total (média) em extratos preparados a partir de embri- ões de cevada germinados de mutantes brutos (geração M3) e progênies (gerações M4 e M5). Extratos Atividade de Linhagens Desvio padrão LOX total ensaiadas . TT Assundades —— No 0% Geração M3 ' Mutante A689 0.163 8 5.5 Ca211901 1.224 6 38 D112 1.215 6 6.0 Ca211901 (inativado por

0.099 10 13 calor) D112 (inativado por calor) 0.096 10 11

E: 54 Geração M4 (progênies) Mutante A689 0.151 24 26 Ca211901 1.223 6 23 D112 1.209 6 5.6 Ca211901 (inativado por

0.096 10 17 calor) D112 (inativado por calor) 0.101 10 1.0 Geração M5 (progênie) , Mutante A689 0.160 90 2.3 Ca211901 1.210 90 3.0 D112 1.199 90 4.6 Ca211901 (inativado por calor) 0.103 10 2.0 D112 (inativado por calor) 0.097 10 12 Exemplo 4 Análise baseada em HPLC de HPODEs em cevada germinada e micro-maitada Análise para HPODEs em cevada foi realizada essencialmente como descrita no Pedidode Patente Internacional WO 2005/087934, exceto utilizando embriões germinados em vez de maduros. Grãos de geração M4 foram germinados por 48 h, conforme descrito no Exemplo 2. Grãos de geração M5 foram submetidos a um procedimento de micro-maltagem realizado essencialmente como descrito no Exemplo 6 adiante, mas os níveis de HPODE específicos foram determinados após 72 h de germinação, bem como o procedimento de secagem em estufa foi omitido. Níveis de 9- e 13-HPODESs foram determinados deixando extratos de proteína bruta de embriões germinados de gerações M4 e M5 de mutante A689 e amostras de controle incubarem com o ácido linoléico de substrato. Produtos de reação foram analisados por HPLC. . Os embriões germinados foram dissecados a partir dos grãos de cevada utilizando um bisturi para cortar entre o escutelo e o endosperma. Cada amostra de 4 embriões de ' baixa fermentação foi então colocada entre duas folhas de papel de pesagem, e martelados suavemente para produzir uma farinha homogênea. Esta foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; 600 ul de um tampão de ácido lático a 200 mM, pH 4,5, foi adicio- nado e o tubo foi colocado em gelo por 10 min antes de homogeneização mais usando um pilãode plástico (Kontes). Posteriormente, 600 ul de HO foram adicionados a cada tubo, e as amostras foram centrifugadas por 2 min a 20.000 x g. Uma alíquota de 100 ul do sobre- nadante resultante foi transferida para um tubo de centrífuga de 15 mi (Cellstar; cat.

E 55 . No.188271), para preparar para a análise dos produtos de reação após a ação LOX. 2 ml de um tampão de fosfato de Na,a 100 mM, pH 6,5, contendo 260 UM de ácido linoléico [este substrato foi preparado misturando 10 ml! de um tampão de fosfato de Na a 100 mM, pH 6.5, com 100 ul de uma solução estoque de ácido linoléico a 24 mM.

O último foi feito primeiro misturando 155 ul de ácido linoléico (correspondente a 134 mg de ácido livre, L-1376, Sig- ma) e 257 ul de Tween-20, em seguida, adicionando HO a um volume de 5 ml, seguido pela adição de 600 ul de NaOH a 1M, e quando a solução se tornou clara, ajustando o vo- . lume para 20 ml! com H2O.

Após incubação de 15 min a - 30 rpm em um rotator de tubo de sangue, 2 ml! de acetato de etila foi adicionado, e o conteúdo de amostra misturado por agi- . 10 tação vigorosa por 5 segundos, a fim de extrair 9- e 13-HPODESs.

A amostra foi então centri- fugada por 10 min a 800 * g, e 1 mi de acetato de etila foi transferido para um tubo de mi- crocentrífuga de 1,5 ml, no qual o acetato de etila foi evaporado sob um fluxo de gás nitro- gênio.

Posteriormente, os HPODESs foram ressuspensos em 300 ul de metano! e filtrados através de uma membrana de 0,45 um (filtro Millex-HN, Millipore). Análise do conteúdo —HPODE foirealizada por HPLC.

Um total de 15 ul de cada amostra foi injetado em um apa- relho de HPLC (HP 100 Series, Hewlett Packard), equipado com uma coluna C18 Symmetry de 4,6 x 250 mm (Waters). A fase móvel utilizada foi uma mistura 16:12:12:10:0.5 (v:v:v:v:v) de água: metanol: acetonitrila: tetrahidrofurano: ácido trifluoroacético.

O fluxo da fase móvel foi de 1 ml min”, e a pressão medida na frente da coluna foi de 140 bars.

A separação foi realizada a 30 ºC.

Detecção de hidroperóxidos de ácido linoléico com ligações duplas conju- gadas foi realizada a 234 nm.

Na FIG. 5 é mostrada uma comparação dos perfis HPODE obtidos.

Um cromato- grama de uma amostra padrão que inclui uma mistura de 9- e 13-HPODEs é mostrado na FIG. 5A.

Comparações do cromatograma de um extrato preparado a partir de grãos germi- —nados por 48h de geração M4 D112 de mutante nulo LOX (Fig. 5B), com os do mutante A6B9 de LOX nula dupla (FIG. 5C, revelou acentuada formação de 13-HPODE por LOXs extraídos de embriões germinados de mutante D112 de LOX-1 nula, enquanto que apenas nenhum ou muito pouco de 9- e 13-HPODEs foram observados em extratos de mutante . A689 de LOX nula dupla.

Características semelhantes foram observadas ao analisar embriões micromaltados r por 72 h do tipo selvagem cv.

Barke (FIG. 6A), mutante D112 de LOX-1 nula (Fig. 6B), e mutante A689 de LOX nula dupla (FIG. 6C). Mais uma vez, níveis significativos de ambos os 9- e 13-HPODESs foram formados em extratos de embriões maduros da cv. do tipo selvagem Barke (FIG. 6A). Extratos de embriões de mutante D112 de LOX-1 nula formaram quantida- des muito baixas de 9-HPODE, mas grandes quantidades de 13-HPODE (Fig. 68), verifi- cando assim a falta de atividade de LOX-1. E, novamente, extratos de embrião mutante A689 de LOX nula dupla não formaram níveis significativos de 9- e 13-HPODESs (FIG. 6C),

. 56 . confirmando a total ausência de ambas as atividades de LOX-1 e LOX-2. Exemplo 5 Propriedades de mutante AG89 de LOX nula dupla de cevada, sua variedade ma- terna de LOX-1 nula Ca211901, e mutante D112 de LOX-1 nula Propagação de plantas em estufa.

Grãos de geração M4 e M5 de mutante A689 de LOX nula dupla e sua linhagem materna Ca211901 foram germinados em estufas, e cultiva- dos em ciclos diários com menos de 20 h de luz a 12ºC e umidade relativa de 65%. As ca- . racterísticas de crescimento da linhagem e Ca211901 e plantas de mutante A6G89 de LOX nula dupla foram semelhantes com relação à altura da planta, número de ramos por planta, - 10 oinícioda floração, e o número de grãos por espiga — enfatizando que a filosofia de desen- volvimento e crescimento de mutantes A689 é do tipo selvagem Desempenho agronômico de mutante A689 sob condições de campo.

Plantas de mutante A689 de LOX nula dupla e mutante D112 de LOX-1 nula, bem como plantas da li- nhagem Ca211901, foram comparadas em triagens de campo padrão — com o objetivo de identificar possíveis diferenças com relação à altura da planta, data da desramação, resis- tência a doenças, acamação, quebra da espiga, tempo de maturação e produção (cf.

Tabela 2). Assim, quantidades iguais dos grãos acima mencionados foram semeadas em parcelas de 7,88 m? em um único local, cada um com duas repetições.

Propriedades agronômicas, novamente com ênfase nas propriedades já citadas, foram cuidadosamente observadas — durantetodaa temporada de crescimento.

Nenhuma diferença com relação a características agronômicas foi observada em qualquer das plantas testadas.

Tabela 2. Comparação de desempenho agronômico.

R Linhagem ma- Propriedade Mutante A689 Mutante D112 terna Ca211901 CenótipodeLOXK — .LOXIinula — LOXInua — LOXinula LOX-2 nula LOX-2 em peso — LOX-2 em peso Data da sementeira 29 Março 29 Março 29 Março 2007 . Extensão em maturi- 68 69 74 dade(cm) 1 Data de desramação 14 Junho 14 Junho 12 Junho 2007 Míldio* o o o Manchas bacterianas* 3 3 2 Net blotch* 1 1 1 Ramularia* 3 3 2 Ferrugem* 1 1 2

: 57 ; Acamação* 2 2 4 Data da maturidade 1 Agosto 1 Agosto 1 Agosto 2007 Produção relativa 2007" 107 108 100 Produção relativa OIST* 104 103 99 - M *Em uma escala de O a 9, onde O representa nenhuma infecção ou acamação, e 9 representa infecção extrema ou acamação. - ** Desempenho de produção relativa em relação a cv. Barke, variedade materna de mutante D112 de LOX-1 nula. Exemplo 6 Análise de micro-maltes e mostos dos mesmos Micro-malteagem foi realizado com 100 g de amostras de mutantes de cevada AG689 e D112, bem como cvs. Barke e Power. As linhagens mutantes foram propagadas no campo por várias temporadas, a fim de obter material de grãos suficiente para maltagem e triagem de brassagem.

Imersão. As condições foram: 8 h molhado; 14 h seco; 8 h molhado; 10 h seco; 4 h molhado em água de imersão a 16 ºC.

Maltagem. As condições foram: 12 horas a 18ºC, 24 h a 16ºC, 24h a 14ºC, 60 h a 12ºC. Condições de secagem em estufa foram: 12 horas a 60ºC, 3 h a 68ºC, 4h a 74ºC, 3 h a80ºC. Os maltes finalizados foram submetidos a medições T2N.

Além disso, amostras de malte e cevada de mutantes A689 e D112, bem como cvs. Barke e Power, cevada e maite foram submetidas a análises por métodos padrão EBC (ver Tabela 3).

Preparação do mosto. Para testar as propriedades de mutantes A689 e D112 em comparação com cv. Power, amostras de malte de 25 a 225 g foram produzidas e usadas em um sistema de brassagem de laboratório que compreendida um agitador externo e um r banho de água equipados com um termostato capaz de colocar a temperatura em um pa- drão definido. Brassagem foi realizada em pequena escala, com o mosto final separado por f um filtro de papel para obter o mosto doce. Ebulição do mosto foi realizada em escala labo- ratorial usando um manto de aquecimento e um balão de fundo redondo conectado a um refrigerador de refluxo.

Mostos doces e cozidos foram submetidos a medições de T2N (cf. Figs. 7 a 9). Pa- ra amostras derivadas de grãos de geração M5 do mutante A689 de LOX nula dupla, foi observada uma diminuição acentuada -75% nos níveis de T2N (média de três linhagens de mutantes A689). Além disso, reduções significativas foram registradas nos níveis de ambos

- 58 : os T2N livre e precursores de T2N no mosto produzido a partir de amostras micro-maltadas (figs. 8a 9). Níveis de T2N foram determinados por cromatografia gasosa com detecção por es- pectrometria de massa (GC-MS), após derivatização de carbonilas com O-(2,3,4,5,6- —pentafluorobenzil)-hidroxilamina, essencialmente como descrito por Groenqvuist et al. (1993). Tabela 3. Análise de micromalte.

Amostra cv.

Power Mutante AG89 — Mutante D112 . TA AoXtem LOX-1 nula, Genótipo de LOX Ns LOXTnUa ox 2em . LOX-2 em LOX-2 nula peso peso Cevada Cponteúdo úmido — %* 9.3 9.5 10.5 Proteína %* 12 10.6 10.9 Amido %* 61.7 63.0 62.4 Germinação, 72h / % 100 95 95 Índice de germi- . 9.9 6.6 8.3 nação Triagem >2.5 mm 97 98.8 291.6 TKW G 48.6 55.8 37.5 B-Glucano %, seco 4.0 3.6 3.3 B-Amilase** U/g 1039 1458 1027 DP Previsto WK 385 538 381 Maite Tempo de malt- 124 148 124 agem H Rendimento de . mate % 95.1 95.9 95.3 Conteúdo únido — %* 4.8 5.6 4.6 ' Proteína, seca % 11.2 10.3 9.9 N, seco %* 1.72 1.65 1.58 N solúvel %* 0.67 0.62 0.64 Mosto Extrato %* 81.0 81.0 80.9 B-Glucano %*, seco 0.2 03 0.26

- 59 : Modificação de 95 95 o6 malte % Homogeneidade ” 7o n do malte % B-Amilase** ug 956 1235 937 DP previsto WK 385 478 379 a-Amilase*** U/g 242 234 264 ' “*Medidos por espectroscopia de transmissão infravermelha aproximada padrão. ** Atividade B-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produto K- ' BETA). *** Atividade a-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produto K-CERA). Exemplo 7 THAs em cerveja produzida a partir de malte de mutante A689 de LOX nula dupla THAs específico de cerveja são susceptíveis a serem derivados do ácido linoléico (Drost et al., 1974). Vários estudos têm verificado que o conteúdo total de THAs na cerveja varia de5,7a11,4ug/ml (Hamberg, 1991 e referências contidas no mesmo). Enquanto 9,12,13-THA normalmente constitui 75-85% dos THAs em cerveja, que de 9,10,13-THA é normalmente apenas 15-25%. Isômeros outros são encontrados em pequenas quantidades.

Na cerveja produzida a partir do mosto preparado a partir de malte de mutante A689 de LOX nula dupla de cevada (cf.

Exemplo 8, exceto que uma brassagem na tempera- turade60ºC foi utilizada), a concentração de 9,12,13-THA foi reduzida em 75 % em relação ao controle de cerveja de malte da cv.

Power, e reduzida em 45% em comparação com o mutante bruto D112 de LOX-1 nula (Tabela 4). Diferenças semelhantes foram observadas para o isômero 9,10,13-THA.

Essas medições foram realizadas usando análises padrão de espectrometria de massa HPLC (Hamberg, supra). Tabela 4. THAs em cervejas produzidas a partir de malte de cv.

Power, mutante de LOX-1 nulas D112, mutante A689 de LOX nula dupla (média de 3 medições). ' THA Tipodemate — 9,121 — 910173 912,13:91013 Fa ati cv.

Power 3.76 112 3.35 Mutante D112 1.72 0.94 1.80 Mutante A6G89 0.94 0.50 1.88 TO Example8 O O Maltagem e brassagem piloto Maltagem.

Os experimentos foram realizados com grãos de mutante A689 de LOX

. 60 . nula dupla, mutante D112 de LOX-1 nula, e cv.

Power (em todos os caso de coleta 2007). Maltagens em escalas de baixa fermentação 30-kg foram realizadas em uma casa de malte como segue: () Imersão a 16ºC: 8 h molhado; 14 h seco; 8 h molhado; 10 h seco; 4 h molha- do; (i) maltagem:12 h a 18ºC; 24 h a 16ºC; 24 h a 14ºC; 60 h a 12ºC; (ii) Secagem:12h a 60ºC; 3 h a 68ºC; 4 h a 74ºC; 3 h a 80ºC. - Propriedades da cevada e do malte são listadas na tabela 5. Exame dos resultados revelou as amostras completamente preenchidas com especificações de malte para uso da - 10 matéria-prima em brassagem.

Tabela 5. Dados Experimentais.

Mutante Mutante cv.

Power cv.

Barke Amostra A689 D112 FA LoXTem o OX-1nu- LOX-Tem LOX-1 nula Genótipo de LOX peso, LOX- laLOX-2 — peso LOX- LOX-2 nula 2 em peso empeso 2empeso Cevada Proteína %* 12.0 10.6 10.9 10.6 Amido %* 61.7 63.0 62.5 64.2 Germinação, 72 h % 100 95 85 100.0 Índice de germi- nação 110 9.9 6.6 8.3 9.6 Sensibilidade à água % 1 78 45 14 Calibragem >2.5mm % 97.0 98.8 91.6 88.3 TKW 9 48.6 55.8 37.5 49.5 B-Glucano %, seco 4.0 36 33 3.6 B-Amilase** U/g 1039 1458 1027 1093 . Maite Imersão e tempo de . 124 148 124 124.0 germinação h Extrato %* 81.0 80.7 80.9 82.5 Índice de Kolbach % 37.5 37.1 40.2 42.0 Modificação % 95 94 97 96 Homogeneidade % 81 61 81 83 B-Glucano %, seco 0.2 0.3 0.2 o1 B-Amilase** U/g 956 1261 928 985

V 61 - a-Amilase*** U/g 242 222 262 201 “ *Medido por espectroscopia de de transmissão infravermelha aproximada padrão. ** Atividade de B-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produto K-BETA). *** Atividade de a-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produ- toK-CERA) Brassagem piloto com malte. Um ensaio de inicial 200 |, com os principais resulta- 7 dos ilustrados na FIG. 10A, B, envolveu as seguintes etapas: (i) Preparação do mosto; " (ii) Separação do mosto; (iii) Ebulição do mosto; (iv) Fermentação; (v) Baixa fermentação; (vi) Filtração de cerveja filtrada, e (vii) Engarrafamento.

Mostos foram preparados utilizando 30 kg de amostras de malte de baixa fermenta- ção de cv. Power do tipo selvagem, mutante D112 de LOX-1 nula, e o LOX nula dupla. Em- pastagem foi a 48ºC por 20 min, seguida por 18 min de aquecimento em que a temperatura foi elevada de 48ºC a 67ºC. A pausa de sacarificação a 67ºC foi de 30 min, seguido por uma etapa de aquecimento a 72 ºC por 5 min, e um descanso de 15 min antes de terminar bras- sagema78ºC.As etapas de brassagem como referidas aqui acima — isto é, ebulição e filtra- ção do mosto, separação por “whirpool” fermentação, baixa fermentação e embalagem em garrafas de vidro verde — estavam de acordo com as especificações para a prática de fabri- cação de cerveja padrão.

Os precursores de T2N das cervejas finalizadas foram determinados (FIG. 10), utili- —zandoomesmo ajuste experimental, conforme descrito no Exemplo 6. Resultados do expe- rimento de grande escala instantânea mostraram a mesma tendência em níveis relativos dos precursores de T2N como aquela no mosto cozido de grãos micromaltados (compare as ' Figs. 9 e 10), mais uma vez revelando valores notavelmente mais baixos para ambos mu- tante D112 de LOX-1 nula e mutante de LOX nula dupla A876 em comparação com a da cv. ' 30 Power. Mais especificamente, os precursores de T2N foram reduzidos em -40% e -70% em amostras de cerveja de LOX-1 nula e LOX nula dupla, respectivamente, quando compara- dos à cerveja do malte cv. Power do tipo selvagem. Além disso, níveis de T2N livre foram medidos nas cervejas de brassagem piloto acima mencionadas, mais uma vez mostrando a mesma tendência como observado para o potencial TAN- a saber, as cervejas feitas de malte LOX-1 nula e LOX nula dupla foram notavelmente inferiores em T2N que brassadas com malte de cv. Power. Com relação aos

.: 62 . níveis T2N, cerveja de malte de LOX nula dupla foi, portanto, mais uma vez demonstrada ser superior ao LOX-1 nula.

Um objetivo separado foi estabelecer se as cervejas eram superiores em qualida- des de sabor após o envelhecimento forçado quando elas foram produzidas em 200 | escala usandouma matéria-prima LOX nula dupla.

O painel de sabor de cerveja especializado co- mo descrito no Exemplo 9, foi solicitado para avaliar cervejas normais, brassadas piloto para o sabor de sabor insípido de papel depois de envelhecimento forçado a 37ºC durante uma . semana, usando uma pontuação de O (ausente) a 5 (extremo). Enquanto a cerveja da cv.

Power foi encontrado produzindo uma pontuação de gosto de papel 1,6, aqueles de LOX-1 - 10 nulaeLOX nula dupla foi de 1,2. e 0,6, respectivamente.

Este resultado comprovou a supe- rioridade da matéria-prima LOX nula dupla para a produção de sabor estável de cerveja.

Exemplo 9 Comparações de cervejas normais e fabricadas com cevada Grãos de mutante A689 de LOX nula dupla não maltados, cevada de mutante D112 deLOX-1nula,e de cv.

Power do tipo selvagem foi aplicado a processos idênticos de cerve- ja de cevada, cada um utilizando 25 kg de cevada não maltada moída como matéria-prima para a produção de cerveja de 200 | (para fins comparativos, 30 kg de malte moído foi utili- zado para produzir 200 | de cerveja normal, em um experimento de execução paralelo). O objetivo era não só comparar as propriedades do mosto e cerveja a partir de cevada e cer- vejas derivadas de malte, mas também determinar se os mutantes acima mencionados po- deriam conferir melhor características de sabor áspero em ambas as cervejas de cevada e normal finalizada.

A triagem de cerveja de 200 | compreendeu as mesmas etapas de produ- ção como listadas acima no exemplo 8, com detalhes específicos aqui descritos abaixo.

Brassagem e cerveja com cevada.

No presente experimento, mosto foi preparado na presença da mistura de enzima Ondea Pro (Novozymes; Batch no.

NFNGO0005), adicio- nado à empastagem de acordo com as recomendações fornecidas pelo fabricante (isto é, 87,5 mist. de enzima g por 80 | HO). As condições de brassagem foram: empastagem a 54ºC por 30 min, 10 min de aquecimento para elevar a temperatura a 64ºC; de incubação . para 45 min 64ºC, aquecimento até 78ºC por 13 min, 10 min de pausa em 78ºC.

As etapas de fabricação de cerveja de filtração e ebulição do mosto, separação por whirpool, fermen- 1 tação, baixa fermentação e embalagem em garrafas de vidro verde estavam de acordo com as especificações para a prática de fabricação de cerveja padrão.

Mailtagem padrão, imersão, e brassagem.

Maltagem utilizou grãos de cevada de mutante A689 de LOX nula dupla, mutante D112 de LOX-1 nula, e de cv.

Power do tipo sel- vagem (todos da safra de 2009). Tempos de incubação de imersão a 16ºC foram: 8 h mo- lhado; 14 h seco; 8 h molhado; 10 h seco; 4 h molhado.

Condições de maltagem foram: 12 horas a 18ºC, 24 h a 16ºC, 24 h a 14ºC, 60 h a 12ºC.

Condições de secagem em estufa fo-

' 63 - ram: 12 horas a 60ºC, 3 h a 68ºC, 4 h a 74ºC, 3 h a 80ºC. Análises de cevada e malte da matéria-prima acima mencionada foram realizadas de acordo com métodos padrão EBC, com os resultados listados na Tabela 6. Todos os maites foram considerados adequados para fabricação de cerveja.

Condições de brassagem foram: incubação inicial a 48ºC por 20 min, um aqueci- mento de 18 min de duração até 67ºC, 30 min de incubação a 67ºC, em seguida, aqueci- mento até 72 ºC por 5 min, 15 min de incubação a 72 ºC; aquecimento até 78ºC por 6 min; - terminando com uma incubação de 5 min a 78ºC. As etapas de fabricação de cerveja de filtração e ebulição do mosto, separação por whirlpool, fermentação, baixa fermentação e . 10 embalagem em garrafas de vidro verde estavam de acordo com as especificações para a prática de fabricação de cerveja padrão.

Análise de mosto cozido - T2N livre. Níveis de TAN nos extratos foram determina- dos por cromatografia gasosa com detecção de espectrometria de massa (GC-MS) seguinte a extração em fase sólida em uma coluna C18, e derivatização de carbonilas com O- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)-hidroxilamina, essencialmente como descrito por Groenqvist et al. (1993), ver também Exemplo 5.

Em uma comparação direta com amostras de cv. Power e mutante D112 de LOX-1 nula, observou-se uma redução notável no T2N livre no mosto cozido produzido a partir de ambos os malte normal fabricado com cevada do mutante A6G89 de LOX nula dupla (FIG.

11). Quando comparado com o mosto de fervido de cevada produzido a partir de mutante D112 de LOX-1 nula, o do mutante A689 de LOX nula dupla exibiu uma redução de -45% no nível de T2N livre (para as amostras maltadas correspondentes, a redução foi de 15%).

Da mesma forma, uma redução de -72% foi notada por T2N livre em cerveja do mutante A689 de LOX nula dupla em comparação com a do cv. Power (para as amostras —maltadas correspondentes, a redução foi de -45%) Análise de mosto cozido - precursor de T2N. Precursores de T2N em amostras de mosto normais e de cevadade cv. Power, mutante D112 de LOX-1 nula, mutante A689 de LOX nula dupla foram determinados por GO-MS após a derivatização de carbonilas com O- . (2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)-hidroxilamina, essencialmente como descrito por Gronqvist et al (Supra). : Conforme ilustrado na FIG. 12, os precursores de T2N de mostos normais, e de cerveja de cevada fervidos foram significativamente mais baixos em amostras de mutante A689 de LOX nula dupla, totalizando uma redução de 70% em comparação com a da cv. Power do tipo selvagem (reduções também foram registradas em comparações com amos- trasdemutantede LOX nula D112).

Análise de cevada fabricada de cevada, apenas — T2N livre, envelhecimento força- do. Cerveja engarrafada derivada de fermentações de amostras de mosto de cerveja de

' 64 V cevada — e compreendendo níveis similares de sulfito - foram analisadas dentro de um mês para a produção de T2N ao longo do tempo. As referidas cervejas de cevada acima mencionadas tiveram envelhecimento força- do a 37 ºC para acompanhar o desenvolvimento de T2N livre, como aqui descrito acima.

Conforme ilustrado na FIG. 13A, os três tipos de cerveja de cevada foram facilmen- te distinguidos como um resultado de diferenças acentuadas nas cinéticas de desenvolvi- mento de T2N. Enquanto a cerveja de referência da cevada cv. Power foi realizada como . esperado (64 ppt de T2N após 8 semanas a 37ºC) — com níveis de T2N 10 — 20% maiores do que uma cerveja baseada em malte similar (não mostrada) — um desenvolvimento de . 10 T2N surpreendentemente baixo e inesperado foi observado nas cervejas de cevada deriva- das de mutante A689 de LOX nula dupla (16 ppt de T2N após 8 semanas a 37ºC), corres- pondendo a uma redução de 75% em T2N livre da cerveja final. Para a cerveja de fabricada de cevada de mutante D112 de LOX-1 nula, em comparação com o mesmo tipo de cerveja de grãos do tipo selvagem, houve 52% menos T2N livre ao longo de 8 semanas.

O experimento com envelhecimento forçado enfatizou as diferenças notáveis entre as cervejas analisadas. Já após 1,5 semanas, o nível T2N da cerveja de cevada de referên- cia da cv. Power ultrapassou o limite de sabor de -50 ppt, enquanto que o mutante de LOX nula dupla 689 estabilizou em —16 ppt, assim, muito melhor do que 32 ppt de T2N ppt para a cerveja de cevada de mutante D112 de LOX-1 nula.

Comparações de cerveja normal e fabricada de cevada - precursor T2N. Na FIG. 13B é fornecido um resumo de dados especificando níveis de precursor T2N na cerveja fresca de cevada e matérias-primas maltadas, ambas produzidas em um volume de 200 litros. Mais uma vez, matérias-primas LOX nula dupla foram superiores em propriedades medidas, na verdade, com potenciais mais baixos de T2N nas cervejas de cevada (1,2 ppb), queem cervejas produzidas com malte LOX-1 nula (1,5 ppb).

Comparações de cerveja normal e fabricada de cevada - desenvolvimento forçado de T2N. Também neste caso, isto é, envelhecimento forçado de cerveja a 37ºC, houve uma diferença marcante entre as cervejas feitas de matérias-primas do tipo selvagem e mutante * (FIG. 13C). Embora ambas as cerveja fabricadas de cevada e normal de grãos cv. Barke do tipo selvagem exibiram —50 ppt, após duas semanas, os valores correspondentes foram í reduzidos em -50% e -75% para matérias-primas de mutante de LOX-1 nula duplo D112 e mutante de LOX nula dupla A876, respectivamente. A mesma tendência foi observada após três semanas de envelhecimento forçado. Assim, foi comprovado que o uso na produção de cerveja de matérias-primas deficientes em enzimas LOX representa uma forma superior —parareduzir drasticamente o desenvolvimento de T2N durante o envelhecimento. E ainda a este respeito, as matérias-primas do mutante de LOX nula dupla A876 são superiores aque- las do mutante D112 de LOX-1 nula.

' 65 " Comparações de cerveja norma e fabricada de cevada — THAs. THAs específicos de cerveja derivados do ácido linoléico foram já descritos há várias décadas atrás (Drost et al., 1974). Desde então, vários relatos têm verificado que o conteúdo total de THAs em cer- veja varia de -5-12 ppm (Hamberg, 1991 e referências contidas nele). Enquanto 9,12,13- THA normalmente constitui 75-85% de THAs em cerveja, daqueles 9,10,13-THA quantifica para 15-25%; outros isômeros são encontrados em pequenas quantidades. Em cervejas de cevada fresca de um experimento de 200 | em escala com maté- - rias-primas de mutante de LOX-1 nula e duplo D112 e mutante de LOX nula A689, os níveis 9,12,13 - 9,10,13-THA derivados do percurso de LOX-1 e LOX-2 foram encontrados reduzi- - 10 dosem 60% e 80%, respectivamente, em comparação com aqueles do controle de cv. Po- wer (FIG. 14A). Um nível surpreendentemente elevado de 9,10,13-THA, o principal produto de THA a partir da ramificação LOX-2 do percurso LOX, foi medido em cerveja fabricada com cevada do mutante D112 de LOX-1 nula, isto é, +47% em comparação com o da cerve- ja de cv. Power. O resultado constrastou aquele obtido com mutante A689 de LOX nula du- pla, para o qual foi medida uma diminuição de 60%, novamente em comparação com cv. Power. Resultados de um experimento separado confirmaram a conclusão acima. A base molecular para a observação permanece indefinida, mas algum mecanismo celular pode ser especulado para ser ativado para compensar a ausência de LOX-1 em mutante D112, au- mentando a síntese de enzimas envolvidas na formação de 9,10,13-THA.

Por essa razão, cerveja fabricada com cevada produzida a partir de mutante A689 de LOX nula dupla gerou uma relação 9,12,13-THA : 9,10,13-TAH significativamente menor em comparação com cv. Power, Determinação dos níveis de 9,12,13-THA e 9,10,13-THA, combinada com a deter- minação de sua relação, representa uma ferramenta conveniente inicial para indicar se uma —cervejaé produzida usando cevada do mutante AG89 de LOX nula dupla. No entanto, uma avaliação mais firme sobre essa questão pode envolver exames complementares, conforme descrito no presente pedido.

Na cerveja produzida a partir de malte do mutante A689 de LOX nula dupla, a con- . centração de 9,12,13- e 9,10,13-THA derivada do percurso LOX foi encontrada como sendo reduzida em -75% e -40%, respectivamente, em comparação com a cerveja controle de cv. í Power maltada (FIG. 14B). Na referida cerveja, pode também ser calculado uma relação 9,12,13 THA : 9,10,13-THA muito baixa, quando comparado à cerveja de cv. Power. Em geral, mas não em todas as instâncias, os níveis de THA são ligeiramente mais baixos em cervejas a base de malte do que em cervejas a base fabricada com cevada (compare FIG. 14ÃAeB) Análise de cerveja fabricada com cevada apenas - estabilidade de sabor e aroma. Um painel! de especialistas de sabor avaliou as cervejas fabricadas com cevada em enve-

. 66 . lhecimento forçado de cv. Power, mutante D112 de LOX-1 nula, mutante A689 de LOX nula dupla. Em geral, o painel de sabor encontrou perfis de sabor satisfatórios para todos os ti- pos de cervejas com envelhecimento forçado e frescas depois de uma semana a 37ºC. No Í entanto, a pontuação de sabor "de papel" foi significativamente maior para a cerveja de refe- rência do que para aquela produzida com malte de mutante A689 de LOX nula dupla e mu- tante D112 de LOX-1 nula (FIG. 15A), isto é, a cerveja de referência foi caracterizada por . um sabor mais intenso de sabor áspero. Em geral, no painel de sabor preferido a cerveja fabricada com cevada produzida a partir de cevada LOX nula dupla de mutantes A689.

. 10 O quadro de especialistas treinados também avaliou o sabor "envelhecido" mais ge- ralmente após o armazenamento de cerveja por 1 mês e 3 meses a 30 ºC, mais uma vez demonstrando que pontuações de sabor foram significativamente maiores para as cervejas de cv. Power e LOX-1 nula do que o mutante de cevada LOX nula dupla A689 (FIG. 15B).

Em resumo, a estabilidade de sabor melhorada da cerveja fabricada com cevada e —normalde mutante de LOX nula dupla é extraordinário - simplesmente por causa dos níveis baixos de T2N seguintes a armazenamento, particularmente em altas temperaturas. Assim, as ações de LOX-1 e LOX-2 em estabelecimentos de cerveja representam fatores determi- nantes para o aparecimento de T2N, um composto de sabor áspero principal em cerveja envelhecida.

Comparações de cerveja fabricada com cevadae normal - espuma de cerveja. Cer- vejas fabricadas com cevada e de controle foram degaseificadas por 20 min em banho de ultrassom antes de 50 ml de H,O ser adicionado a 150 mil de cerveja. A mistura foi lenta- mente vertida em uma torre de espuma, consistindo em um tubo de gás com 16 cm de com- primento, 7 cm de largura (com um filtro de vidro e conector na parte inferior e superior, res- —pectivamente). Gás N,, a uma taxa de fluxo de 400 ml min”, foi borbulhado na referida mis- tura na parte inferior para gerar a espuma da cerveja. Esta foi conduzida através de um tu- bo, e coletada em um cone de sedimentação classificado posicionado em um peso.

O peso total da espuma foi registrado em intervalos de tempo de 5 min, até o de- . senvolvimento de espuma cessar, tanto no caso da cerveja fabricada com cevada (FIG, —16A),e quanto para cerveja fabricada com malte (FIG. 16B). Em ambos os casos, a cerveja ' de matérias-primas do mutante A689 de LOX nula dupla gerou a maior parte da espuma. Na verdade, o desenvolvimento da espuma foi melhor em cerveja fabricada com cevada do que na cerveja à base de malte comparáveis.

Tabela 6. Cevada, maite, mosto, e análises de cerveja.

Mutante Mutante Amostra ev. Poe — n112 AGB9

N 67 " MAmálisesde cevada | Proteína %* 1117 11.2 10.1 Amido %* 63.3 62.9 62.7 Germinação a 72 h % 98 99 99 Índice de germinação 1-10 8.4 7.8 7.8 Sensibilidade à água = % 9 17 24 Pontuação >2.5mMm —% 96.2 98.9 98.0 . TKW g 48.2 54.2 47.7 B-Amilase (cevada))* U/g 1039 979 1491 " trans-2-Nonenalt Ppb 270 190 150 Maite, mosto, e análises de cerveja Imersão e germinação h 120 120 120 Extrato %* 81.5 81.2 81.4 N solúvel %, NIT* 0.67 0.63 0.64 Modificação % 96 97 97 Homogeneidade % 88 86 81 B-Amilase** U/g 768 865 1007 a-Amilase*** U/g 175 172 200 trans-2-Nonenalt ppb 1100 470 390 Álcool % 3.94 3.87 3.80 Extrato real % Plato 3.76 3.80 3.30 Ph 4.3 4.2 4.2 Cor EBC U 71 8.2 5.2 Extrato original % Plato 11.42 11.33 10.72 Grau real de fer % 68.4 67.8 70.4 mentação Álcool % (vol.) 4 3 4 ã CO, Fl 5.6 6.1 5.9 SO, ppm 4 4 5 ' Diacetila ppm 23 21 10 MT *WMedido por espectroscopia de transmissão infravermelha padrão. ** Atividade B-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produto K- BETA). *** Atividade a-amilase foi medida utilizando um kit Megazyme (código de produto KCERA. + Medido basicamente como descrito por Groenqvist et al. (1993).

- 68 F Exemplo 10 O gene para LOX-2 em mutante de cevada A689 é mutado A sequência genômica de nucleotídeos que codifica LOX-2 de cv. Barke (SEQ ID NO:1), e aquela do mutante A689 de LOX nula dupla (SEQ ID NO:2), foi obtida como des- crito adiante. As sequências obtidas foram posteriormente comparadas para determinar a base molecular para o genótipo de LOX-2 nula do mutante A689, o fenótipo de que se ca- racteriza pela ausência de atividade de LOX-2 no grão de cevada germinado. - Para fins comparativos, DNAs genômicos de cevada a partir de mutantes A689 e cv. Barke do tipo selvagem foram isolados foíolos de mudas utilizando o Kit de isolamento . 10 de DNA de Planta (Roche). As duas sequências de 3331 pb cobrindo as regiões de codifica- ção de proteína para LOX-2 nos DNAs genômicos de mutante A689 e cv. Barke foram am- plificadas por PCR usando os iniciadores 5-CGCAGCGAGCTAACTTAGAAGCGTGCCACA- 3' (SEQ ID NO:3) e 5º" CCOTCATGCCTTTGTGCTATCCTTGCTTGCT-3' (SEQ ID NO:4); base para as sequências de iniciador compreendidas pela sequência genômica do gene para LOX-2(istoé, SEQIDNO:1).

As reações de PCR consistiam em 100 ng de DNA genômico ressuspenso em 20 ul de tampão de reação contendo 5 pmol de cada iniciador e 3,0 U de polimerase FailSafe (Epicentre). As amplificações por PCR foram realizadas em um ciclador MJ, utilizando os seguintes parâmetros: 30 segundos a 98ºC por 1 ciclo; 15 s a 98ºC, 30 s a 65ºC e 60 s a 72ºC por 30 ciclos; 10 min a 72ºC por 1 ciclo. Os produtos resultantes da PCR foram sepa- rados em ge! de agarose a 1%, e fragmentos de DNA correspondentes ao comprimento da amplicons foram purificados usando o kit de extração de gel Qiaex Il (Qiagen), e inseridos no vetor de plasmídeo pCR Blunt Il TOPO Blunt (Invitrogen). As regiões de codificação fo- ram aplicadas a reações de terminação em cadeia dideoxinucleotídeo com iniciadores espe- —cíficos, seguida pela determinação de sequência em um sequenciador de DNA MegaBACE 1000 (GE Biosystems). Na FIG. 17 é mostrada uma ilustração esquemática da sequência genômica abrangendo os códons de iniciação e parada da região de codificação de LOX-2.

Comparações de sequência foram realizadas utilizando o pacote de software de análise de . sequência de gene a Laser ver.5.2 (DNASTAR), revelando um ponto de mutação na forma deuma substituição G— A na posição 2689 da SEQ ID NO:2 no éxon 6 (FIG. 17).

' A sequência do tipo selvagem para LOX-2 codifica uma proteína de 864 resíduos de comprimento (SEQ ID: 5), com uma massa prevista de 96,7 kDa. Enquanto a mutação na posição 684 na sequência de codificação do mutante D112 causou a introdução de um có- don de parada maduro, aquele do gene que codifica LOX-2 do mutante A689 resultou em umtruncamento C-terminal de 180 aminoácidos, assim codificando uma proteína 76,8 kDa (SEQ ID NO:6). Tabela 7 provê um resumo sobre as diferenças moleculares relacionadas ao gene

" de LOX-2 da cevada do tipo selvagem, mutante de cevada LOX-1 nula D112 (descrito em WO 2005/087934), e mutante de cevada A689 (LOX nula dupla). Tabela 7. Dados moleculares na cevada do tipo selvagem e mutante. Cevada do tipo Mutante D112* Mutante A689 Propriedade selvagem “GenótipodeLOX . LOXTempeso, LOXInua — LOXInula LOX-2 em peso LOX-2 em peso LOX-2 nula À Mutação base** LOX-1LOX-2 - G3474-5A G3474->A 1 - - G2689->A Dados de proteína LOX-1 862 aa (96.4kDa) G665aa(742kDa) 665aa(74.2kDa) LOX-2 864 aa (96.7 kDa) 864aa(96.7kDa) 684aa(76.8kDa) TT Tinhagem materna do mutante A689, Ca211901, exibe propriedades idênticas.

** Numeração de sequência de acordo com SEQ ID NO:1 de WO 2005/087934 pa- ra o gene LOX-1, e para o gene LOX-2, de acordo com SEQ ID NO:1 da presente publica- ção.

*** Comprimentos de proteínas previstos em aminoácidos (aa), com as correspon- dentes massas previstas entre parênteses. Exemplo 11 Detecção genética de mutante de cevada LOX nula dupla A689 O ensaio de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) representa uma forma con- veniente para identificar mutantes da planta. Por SNP aqui significa um ponto de mutação com pelo menos dois nucleotídeos diferentes em um lócus. O ensaio é baseado na utiliza- ção combinada de dois conjuntos de reações de PCR utilizando DNA genômico como mode- lo. Ambas as reações contêm um iniciador de lócus específico, e um dos dois iniciadores SNP (um para cada alelo da sequência). Dois conjuntos de reações de PCR são realizados por linhagem de plantas, com o resultado de uma reação de PCR sendo que o iniciador SNP ' se liga a sequências do mutante ou ao alelo do tipo selvagem (FIG. 18A). Em um dos vários métodos, análise de SNP pode ser baseada na identificação de linhagens mutantes através º da avaliação do padrão de bandas após eletroforese em gel de produtos de PCR. DNA genômico de cevada a partir de uma linhagem de cevada e do cv Quench do tipo selvagem foi isolado de tecido foliar de mudas, utilizando o Kit isolamento de DNA de Planta (Roche) de acordo com as recomendações do fabricante. Os iniciadores de oligonu- —cleotídeos utilizados para amplificar o SNP do gene LOX-2 do tipo selvagem foram 5'- ACCTCAAGGACGCGGCGTGG-3' (SEQ ID NO:7) e 5-GAGCGAGGAGTACGCGGAG 3'- (SEQ ID NO:8), enquanto aqueles para o gene mutante correspondente foram 5"-

- 70 . ACCTCAAGGACGCGGCGTGA-3' (SEQ ID NO:9) e 5-GAGCGAGGAGTACGCGGAG-3' (SEQ ID NO:8). Estas combinações de iniciadores foram usadas em reações de PCR para amplificar fragmentos de DNA de 200 pb compreendendo partes das regiões de codificação para LOX-2 do mutante A689 de LOX nula dupla e cv. Quench, respectivamente (FIG. 18A). Asreações de PCR consistiram em 100 ng de DNA genômico em 20 ul de tampão de rea- ção contendo 25 pmo! de iniciador e 7 ul de mist. REDTaq (Sigma), utilizada de acordo com as instruções do fabricante. As amplificações de PCR de 29 ciclos foram realizadas em um + ciclador MJ: 2 min a 96ºC por 1 ciclo, 1 min a 95ºC, 1 min a 68ºC, 1 min a 72ºC, terminando com um 10 min de extensão a 72ºC.

. 10 Polinização cruzada entre uma planta de cevada homozigótica portando a mutação de LOX-1 e uma planta homozigótica portando a mutação de LOX-2 pode resultar em quatro eventos diferentes. Usando dois conjuntos de iniciadores, um conjunto de iniciador SNP - FL820 (SEQ ID NO:10 e FL823 (SEQ 1D NO:11) — para identificação da mutação de LOX-1 (mutação G>A na posição 3474 do gene LOX-1), e um conjunto de iniciador SNP - FL1034 (SEQIDNO:9) e FL1039 (SEQ ID NO:8) - para a identificação de uma mutação no gene LOX-2 [substituição G>A na posição 2689 do gene LOX-2 (SEQ ID NO:1)], deve ser possí- vel identificar um dos quatro eventos de cruzamento acima mencionados (descrito na FIG 18B) Em outras palavras, uma única reação de PCR combinada pode ser usada para gerar produtos de PCR específicos para ambas as mutações LOX-1 e LOX-2 acima mencionadas.

Osiniciadores de oligonucleotídeo utilizados para amplificar o produto de PCR SNP para a mutação GA na posição 3474 no gene LOX-1 foram 5-CAAGGTGCGGTTGCTGGTGETC- 3' (SEQ ID NO:10) e 5-CTCGCGCGTCTCCTTCCAT-3' (SEQ ID NO:11), gerando um frag- mento de DNA de 166-bp compreendendo uma parte da região de codificação para LOX-1. Os iniciadores de oligonucleotídeos utilizados para amplificar o produto de PCR SNP para detecção da mutação GA na posição 2689 no gene para LOX-2 foram 5- ACCTCAAGGACGCGGCGTGA-3' (SEQ ID NO:9) e 5-GAGCGAGGAGTACGCGGAG-3' (SEQ ID: 8), gerando um fragmento de DNA de 200 pb que abrange parte da região de codi- ficação de LOX-2. FIG.18C, faixa 2, detalha o mutante A689 de LOX nula dupla realizou em ' ambas as mutações acima referidas, enquanto o controle do tipo selvagem não realizou ne- — nhuma(FIG.18C,faixa3).

S Em outro experimento, utilizando o Kit PCR de Planta REDExtract-N-Amp (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante, o DNA de cevada genômico foi isolado de teci- dos de folhas de 23 mudas de linhagem de cultura e, posteriormente, utilizado em reações de PCR que consistiam em 100 ng de DNA genômico em 20 ul de tampão de reação con- tendo 25 pmol de iniciador. Amplificações foram realizadas em um ciclador de engenharia de DNA (MJ Research), de acordo com as instruções do fabricante: 2 min a 96ºC por 1 ciclo, 1 min a 95ºC, 1 min a 68ºC, 1 min a 72ºC por 29 ciclos e, finalmente, 10 minutos a 72ºC por

. 71 - 1 ciclo. FIG. 19 mostra o padrão de bandas após eletroforese dos produtos de PCR. Análise revelou que o procedimento é útil para a seleção da combinação desejada de mutações LOX-1 nula e LOX-2 nula. Listagem de sequência SEQ ID NO:1 A sequência de DNA genômico do tipo selvagem que codifi- ca LOX-2 a partir de cv. Barke. SEQ ID NO:2 A sequência de DNA genômico LOX-2 mutante a partir de ” mutante de cevada A689. SEQ ID NO:3 Iniciador para amplificação de região de codificação de pro- . teína para LOX-2 (também designado FL960). SEQ ID NO:4 Iniciador para amplificação de região de codificação de pro- teína de DNA genômico LOX-2 (também designado FL961). SEQ ID NO:5 A sequência de proteína LOX-2 de comprimento completo de cevada do tipo selvagem, cv. Barke. SEQ ID NO:6 A sequência de proteína LOX-2 mutante faltando atividade de LOX-2 a partir de mutante de cevada A689. SEQ ID NO:7 Iniciador para amplificação de DNA LOX-2 do tipo selvagem (também designado FL1035). SEQ ID NO:8 Iniciador para amplificação de DNA LOX-2 (também desig- nado FL1039). SEQ ID NO:9 Iniciador para amplificação de DNA LOX-2 mutante de mu- tante A689 (também designado FL1034). SEQ ID NO:10 Iniciador para amplificação de DNA LOX-1 mutante de mu- tante D112 (também designado FL820). SEQ ID NO:11 Iniciador para amplificação de LOX-1 DNA (também desig- nado FL823).

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Claims

. REIVINDICAÇÕES

1. Bebida preparada a partir de uma planta de cevada, ou uma parte da mesma, CARACTERIZADA por compreender um nível muito baixo de potencial T2N, e em que a planta de cevada, ou parte da mesma, compreende uma primeira mutação que resulta em uma perda total da enzima lipoxigenase funcional (LOX-1), e uma segunda mutação resul- tando em uma perda total da enzima LOX-2 funcional.

2. Bebida, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato da bebida an ser uma bebida de malte.

3. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, Fº 10 CARACTERIZADA por ser cerveja.

4. Bebida, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por ser cerveja de cevada.

5. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA por compreender menos de 50%, preferivelmente menos de 40%, mais —preferivemente menos de 35%, ainda mais preferivelmente menos de 30%, ainda mais pre- feriveimente menos de 25% de T2N livre comparado a uma bebida preparada da mesma maneira que cevada cv. Power, após armazenamento por 8 semanas a 37ºC.

6. Planta de cevada, ou parte da mesma, CARACTERIZADA por compreender uma primeira mutação resultando em uma perda total da enzima funcional LOX-1, e uma segun- damutação resultando em uma perda total da enzima funcional LOX-2.

7. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato do gene que codifica LOX-1 da planta compreender um códon de parada prematuro.

8. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, —“CARACTERIZADA pelo fato do gene que codifica LOX-1 da planta compreender um códon sem sentido, o códon correspondendo a base nºs. 3572-3574 da SEQ ID NO:2 do WO 2005/087934.

9. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 5e7aB, . CARACTERIZADA pelo fato do gene que codifica LOX-2 da planta compreender um códon de parada prematuro.

? 10. Bebida, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato do gene que codifica LOX-2 da planta compreender uma mutação na posição do nucleotídeo 2689 da SEQ ID NO:1, levando à formação de um códon de parada.

11. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, —CARACTERIZADA pelo fato da planta ser selecionada do grupo consistindo em plantas designadas "Barley, Hordeum vulgare L.: Linhagem A689", depositada com ATCC com o número de depósito PTA-9640, e plantas progênies da mesma.

- 2 - 12. Produto de planta CARACTERIZADO por compreender uma planta de cevada processada, ou parte da mesma, em que a planta de cevada é uma planta de cevada con- forme definida na reivindicação 6 ou uma planta de cevada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 11.

13. Produto de planta, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO por ser uma composição de malte compreendendo uma planta de cevada processada, ou parte da mesma, em que a planta de cevada é uma planta de cevada conforme definido em qual- - quer uma das reivindicações de 6 a 11.

14. Produto de planta, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO por . 10 ser uma composição de mosto preparada usando uma planta de cevada, ou parte da mes- ma, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, ou usando uma com- posição de malte preparada da planta de cevada, ou parte da mesma, ou misturas das mesmas.

15. Composição de mosto, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA —porsermosto de cevada.

16. Bebida, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA por ser preparada a partir de uma composição de malte conforme defi- nida na reivindicação 13, ou de uma composição de mosto conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15.

17. Produto de planta, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO por ser selecionado do grupo consistindo em xaropes de cevada, xaropes de malte, extratos de cevada e extratos de malte.

18. Método para produzir uma bebida com um nível muito baixo de potencial TAN CARACTERIZADO por compreender as etapas de: (i) Preparar uma composição compreendendo uma planta de cevada, ou partes da mesma, conforme definida na reivindicação 6 ou uma planta de cevada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 11; e (ii) Processar a composição de (i) em uma bebida, obtendo, desse modo, uma be- . bida com um nível muito baixo de potencial T2N.

19. Método para produzir uma composição de malte compreendendo níveis muito í baixos de T2N livre CARACTERIZADO por compreender as etapas de: (i) Prover grãos de uma planta de cevada conforme definida na reivindicação 6 ou uma planta de cevada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 11; (ii) Imergir os grãos; (iii) Germinar os grãos imersos sob condições pré-determinadas; (iv) Tratar os grãos germinados com calor, produzindo, desse modo, uma composi- ção de malte compreendendo um nível muito baixo de T2N livre.

- 3 " 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato dos níveis muito baixos de T2N livre ser no máximo 50% de T2N comparado ao T2N livre em uma composição de malte preparada da mesma maneira que a mutante de cevada D112 tendo depósito ATCC com número de acesso PTA-5487.

21. Método para preparar uma planta de cevada compreendendo uma primeira mu- tação resultando em uma perda total da enzima funcional LOX-1, e uma segunda mutação resultando em uma perda total de enzima funcional LOX-2, CARACTERIZADO por compre- a ender as etapas de: (i) Prover uma planta de cevada, ou partes da mesma, com uma perda total de en- ” 10 zimafuncional LOX-1; (ii) Mutagenizar a planta de cevada, e/ou células de cevada, e/ou tecido de cevada, e/ou grãos de cevada, e/ou embriões de cevada da planta de cevada, obtendo, desse modo, cevada de geração MO; (ili) Reproduzir as plantas de cevada mutagenizadas, grãos, e/ou embriões por pelo —menos2 gerações, obtendo, desse modo, plantas de cevada de geração Mx, em que x é um número inteiro > 2; (iv) Obter embriões das plantas de cevada Mx; (v) Germinar os embriões; (vi) Determinar as atividades de LOX-1 e LOX-2 nos embriões germinados, ou par- tesdamesma; (vii) Selecionar plantas com uma perda total de atividades de LOX-1 e LOX-2 nos embriões germinados; (viii) Determinar a presença ou ausência de uma mutação no gene que codifica LOX-1,.e no gene que codifica LOX-2; e (ix) Selecionar plantas portando uma mutação no gene que codifica LOX-1, e no gene que codifica LOX-2; obtendo, desse modo, uma planta de cevada compreendendo uma primeira muta- ção resultando em uma perda total de enzima funcional LOX-1, e uma segunda mutação « resultando em uma perda total de enzima funcional LOX-2.

É