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BRPI0913846A2 - Composições e método para produção de isopreno livre de hidrocarbonetos c5 sob condições de separação e/ou faixas seguras de operação - Google Patents

Composições e método para produção de isopreno livre de hidrocarbonetos c5 sob condições de separação e/ou faixas seguras de operação Download PDF

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BRPI0913846A2
BRPI0913846A2 BRPI0913846-3A BRPI0913846A BRPI0913846A2 BR PI0913846 A2 BRPI0913846 A2 BR PI0913846A2 BR PI0913846 A BRPI0913846 A BR PI0913846A BR PI0913846 A2 BRPI0913846 A2 BR PI0913846A2
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BR
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isoprene
approximately
time
cells
explosion
Prior art date
Application number
BRPI0913846-3A
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Inventor
Marguerite A. Cervin
Anthony Rudolf Calabria
Gopal K. Chotani
Joseph C. McAuliffe
Michael Charles Miller
Timothy Alan Sabo
Erin Lynne Webster
Karl J. Sanford
Richard La Duca
Gregory M. Whited
Original Assignee
Danisco Us Inc.
The Goodyear Tyre & Rubber Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Us Inc., The Goodyear Tyre & Rubber Company filed Critical Danisco Us Inc.
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Abstract

cultura de células capazes de produzir isopreno, composições, métodos de produção de isopreno, e sistema. a presente invenção refere-se a métodos para produção de isopreno a partir de células cultivadas em que as células estão na fase estacionária. a invenção também refere-se a composições que incluem estas células cultivadas e/ou quantidade aumentada de isopreno. a invenção também fornece sistemas que incluem uma concentração não inflamável de isopreno na fase gasosa. adicionalmente, a invenção fornece composições de isopreno, tais como composições com quantidade aumentada de isopreno ou pureza aumentada.

Description

r 1/230 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CULTURA : DE CÉLULAS CAPAZES DE PRODUZIR ISOPRENO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ISOPRENO, E SISTEMA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade sobre o Pedido Provisório de Patente U.S. 61/134.094, depositado em 2 de julho de 2008, Pedido Provisório de Patente U.S. 61/133.947, depositado em 2 de julho de 2008 e o Pedido Provisório de Patente U.S. 61/134.011, depositado em 2 de julho de 2008, os conteúdos de cada um são por meio deste incor- —porados por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Isopreno (2-metil-1,3-butadieno) é o material inicial crítico de uma variedade de polímeros sintéticos, mais notavelmente borrachas sintéti- cas. Isopreno é naturalmente produzido por uma variedade de espécies mi- crobianas, vegetais e animais. Em particular, duas vias foram identificadas para biossíntese de isopreno: a via de mevalonato (MVA) e a via de não me- valonato (DXP) figura 19. Entretanto, o rendimento de isopreno a partir de organismos naturais é comercialmente pouco atraente. Aproximadamente
800.000 toneladas por ano de cis-poli-isopreno são produzidas a partir da polimerização de isopreno; a maioria deste poli-isopreno é usado na indús- tria de pneus e borracha. Isopreno é também copolimerizado para uso como um elastômero sintético em outros produtos, tais como calçados, produtos mecânicos, produtos médicos, mercadorias esportivas e látex. Atualmente, a indústria de pneus e borracha é baseada no uso de borracha natural e sintética. Borracha natural é obtida da seiva leitosa de seringueiras ou plantas encontradas nas florestas tropicais da África. Borra- cha sintética é baseada principalmente em polímeros de butadieno. Para estes polímeros, o butadieno é obtido como um coproduto a partir da produ- ção de propileno e etileno. Embora isopreno possa ser obtido do fracionamento de petróleo, a purificação deste material é cara e demorada. Craqueamento de petróleo
. , 2/230 da corrente C5 de hidrocarbonetos produz somente aproximadamente 15% de isopreno. Dessa forma, métodos mais econômicos para produção de iso- ' preno são necessários. Em particular, métodos que produzam isopreno em : taxas, títulos e pureza que sejam suficientes para satisfazer as demandas de um processo comercial robusto são desejáveis. Também são desejados sis- temas para produzir isopreno a partir de materiais iniciais econômicos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um aspecto, a invenção caracteriza células em cultura que ã produzem isopreno. Em algumas modalidades, a invenção fornece células : 10 em cultura que produzem mais do que aproximadamente 400 nmols de iso- . preno/grama de células por peso úmido de células/hora (nmol/gwcn/h) de isopreno. Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico hete- rólogo que (i) codifica um polipeptídeo isopreno sintase e (ii) é operacional- í mente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cul- tivadas em meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal como, mas Ú não limitada a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipí- dio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbo- no renovável, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína microbiana ou vege- talou peptídeo), extrato de levedura, componente de um extrato de levedu- ra, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada. Em algumas modalidades, a invenção fornece células em cultura que convertem mais que aproximadamente 0,002% do carbono no meio de cultura celular em isopreno. Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo isopreno sintase e (ii) é operacionalmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal como, mas não limitada a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxia- cetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína ou peptídeo microbiano ou vegetal), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos preceden- " tes.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada. | 5 Em algumas modalidades, a invenção fornece células em cultura que compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipepti- deo isopreno sintase.
Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo isopreno sintase e (ii) é operacionalmente ligado a um promotor.
Em algumas modalidades, as célu- . 10 las são cultivadas em meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal - como, mas não limitada a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiace- [ tona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, í fonte de carbono renovável, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína ou peptídeo microbiano ou vegetal), extrato de levedura, componente de um i extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos preceden- tes.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Em um aspecto, a invenção caracteriza métodos de produção de isopreno, tal como métodos de uso de quaisquer das células descritas neste pedido para produzir isopreno.
Em algumas modalidades, o método envolve células cultivadas sob condições suficientes para produzir mais que aproxi- madamente 400 nmol/gwem/h de isopreno.
Em algumas modalidades, o mé- todo também inclui recuperação do isopreno produzido pelas células.
Em algumas modalidades, o método inclui purificação do isopreno produzido pelas células.
Em algumas modalidades, o método inclui polimerização de isopreno.
Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico hete- rólogo que (i) codifica um polipeptídeo isopreno sintase e (ii) é operacional- mente ligado a um promotor.
Em algumas modalidades, as células são culti- vadasem meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal como, mas não limitada a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipí-
dio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbo- no renovável, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína ou peptídeo microbi- ano ou vegetal), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes.
Em algumas mo- — dalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzida (tal como a quanti- dade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo por hora por ODgoo) durante a fase estacionária são maiores ou ' aproximadamente 2 ou mais vezes a quantidade de isopreno produzida du- : 10 rante a fase de crescimento de mesma duração.
Em algumas modalidades, " a fase gasosa compreende mais ou aproximadamente 9,5% de oxigênio (vo- lume), e a concentração de isopreno na fase gasosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o limite de inflamabilidade superi- MR or.
Em modalidades particulares, (i) a concentração de isopreno na fase ga- sosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o É limite de inflamabilidade superior, e (ii) as células produzem mais do que aproximadamente 400 nmol/gwcm/h de isopreno.
Em algumas modalidades, o método inclui cultura de células sob condições suficientes para converter mais que aproximadamente 0,002% do carbono (mol/mol) no meio de cultura celular em isopreno.
Em algumas mo- dalidades, o método também inclui a recuperação do isopreno produzido pelas células.
Em algumas modalidades, o método inclui purificação do iso- preno produzido pelas células.
Em algumas modalidades, o método inclui polimerização de isopreno.
Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo isopreno sintase e (ii) é operacionalmente ligado a um promotor.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tal como, mas não limitada a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di- hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, áci- do graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, tri- glicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídeo (por exemplo, uma pro- teína ou peptídeo microbiano ou vegetal), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condi- ' ções de glicose limitada. : Em algumas modalidades, o isopreno somente é produzido na fase estacionária.
Em algumas modalidades, o isopreno é produzido tanto na fase de crescimento como na fase estacionária.
Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzida (tal como a quantidade total de isopreno produzida ou a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo por hora por ODçoo) durante a fase estacionária são maiores ou aproximadamente 2, 3,4,5,10,20,30,40,50 ou mais vezes a quantidade de isopreno produzida durante a fase de crescimento de mesma duração.
Em um aspecto, a invenção caracteriza composições e sistemas que compreendem isopreno.
Em algumas modalidades, a composição com- õ preende mais ou aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 2— 15 100,200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg de isopreno.
Em | algumas modalidades, a composição compreende mais ou aproximadamen- te 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) da fração orgânica volátil da composição sendo isopreno.
Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso em comparação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição compreende menos ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de iso- preno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans- piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis- pent-3-eno-1-ino) por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbo- netos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição tem me- nos ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de 1,3-ciclopentadieno, cis- 1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil -
1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino por peso comparado ao peso ' total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em modalidades parti- ' culares, a composição tem mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno etemmais ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem menos ou aproxi- madamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno. Em modalidades particu- lares, a composição também tem mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno.
í Em algumas modalidades, a composição tem um ou mais com- postos selecionados a partir do grupo consistindo de etanol, acetona, prenil álcoois C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a composição tem mais ou aproximadamente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 ug/L de etanol, acetona, prenil álcool C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-01l ou 3-metil-2- buten-1-ol), ou quaisquer dois ou mais dos precedentes. Em modalidades particulares, a composição tem mais do que aproximadamente 2 mg de iso- preno e tem um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consis- tindo de etanol, acetona, prenil álcoois C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
Em algumas modalidades, a composição inclui isopreno e um ou mais compostos secundários selecionados a partir do grupo consistindo de 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpira- Zina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diace- tila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1- butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-but-1-enila, acetato de 3-metil-2-but-1-
enila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (2)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno e 2,3- ciclo-heptenolpiridina. Em várias modalidades, a quantidade de um destes Ô componentes secundários em relação à quantidade de isopreno em unida- , des de porcentagem por peso (isto é, peso do componente dividido pelo pe- so de isopreno vezes 100) é maior ou aproximadamente 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110% (p/p).
Em algumas modalidades, a composição compreende (i) uma fase gasosa que compreende isopreno e (ii) células em cultura que produ- zem mais do que aproximadamente 400 nmol/gwcn/h de isopreno. Em algu- mas modalidades, a composição compreende um sistema fechado, e a fase gasosa compreende mais ou aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L de isopreno quando normalizada a 1 mL de 1 ODgoo cultiva- da por 1 hora. Em algumas modalidades, a composição compreende um sistema aberto, e a fase gasosa compreende mais ou aproximadamente 5, — 15 10,20,30,40, 50,60, 70,80, 90, 100 ug/L de isopreno quando difundido em uma taxa de 1 vwvm. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa compreende mais ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso comparado ao peso total de to- dos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil. Em algumas modali- dades,a fração orgânica volátil da fase gasosa compreende menos ou apro- ximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno (tal 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pen- tino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-pipe- rileno, pent4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino ou cis-pent-3-eno-1-ino) por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa tem menos ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de 1,3-ciclo- pentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino ou cis-pent-3-eno-1-ino por peso com-
parado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil.
Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gasosa tem mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno e tem mais ou aproximadamente | 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase ga- sosa tem menos ou aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na fração orgânica volátil da fase gasosa que iniba a polimerização de isopreno. Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gasosa também tem mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase ga- " sosa tem um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo — 15 de etanol, acetona, prenil álcoois C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa tem mais ou aproximadamente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 ou 120 ug/L de etanol, acetona, prenil álcool C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-01l ou 3-metil-2-buten-1-01), ou quaisquer dois ou maisdos precedentes. Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gasosa tem mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno e tem um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de etanol, acetona, prenil álcoois C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase ga- sosa inclui isopreno e um ou mais compostos secundários selecionados a partir do grupo consistindo de 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5- trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, ace- tato de metila, 1-propanol, diacetila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-0l, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-but-1-enila, acetato de 3-metil-2-but-1-enila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (2)-3,7-dimetil-1,3,6- octatrieno e 2,3-ciclo-heptenolpiridina. Em várias modalidades, a quantidade ' de um destes componentes secundários em relação à quantidade de isopre- no em unidades de porcentagem por peso (isto é, peso do componente divi- dido pelo peso de isopreno vezes 100) é maior ou aproximadamente 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110% (p/p) na fração orgânica volátil da fase gasosa. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições da invenção, pelo menos uma porção do isopreno está em uma fase gasosa. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do isopreno está em uma fase líquida (tal como um condensado). Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do isopreno está em uma fase sólida. Em algumas mo- dalidades, pelo menos uma porção do isopreno é adsorvida em um suporte É sólido, tal como um suporte que inclui sílica e/ou carbono ativado. Em algu- — 15 mas modalidades, a composição inclui etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre aproximadamente 75 e aproximadamente 90% por peso de etanol, tal como entre aproximadamente 75 e aproximadamente 80%, aproximadamente 80 e aproximadamente 85%, ou aproximadamente 85 e aproximadamente 90% por peso de etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre aproximadamente 4 e aproximadamente 15% por peso de isopreno, tal como entre aproximadamente 4 e aproximadamente 8%, aproximadamente 8 e aproximadamente 12%, ou aproximadamente 12 e aproximadamente 15% por peso de isopreno. Em algumas modalidades, a invenção também caracteriza sis- temas que incluem qualquer uma das células e/ou composições descritas neste pedido. Em algumas modalidades, o sistema inclui um reator em que a câmara compreende células em cultura que produzem mais do que aproxi- madamente 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000,
2.500, 3.000, 4.000, 5.000 ou mais nmol/gwen/h de isopreno. Em algumas modalidades, o sistema não é um sistema fechado. Em algumas modalida- des, pelo menos uma porção do isopreno é removida do sistema. Em algu- mas modalidades, o sistema inclui uma fase gasosa compreendendo isopre-
no. Em várias modalidades, a fase gasosa compreende qualquer uma das composições descritas neste pedido. ' Em um aspecto, a invenção fornece um pneu compreendendo : poli-isopreno. Em algumas modalidades, o poli-isopreno é produzido por (i) polimerização de isopreno em qualquer uma das composições descritas nes- te pedido ou (ii) polimerização de isopreno recuperado de qualquer uma das composições descritas neste pedido. Em algumas modalidades, o poli- isopreno compreende cis-1,4-poli-isopreno. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições, sistemas e métodos da invenção, uma concentração não inflamável de iso- preno na fase gasosa é produzida. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende menos de aproximadamente 9,5% de oxigênio (volume). Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende mais ou aproximadamen- ” te 9,5% de oxigênio (volume), e a concentração de isopreno na fase gasosa 215 é menor que o limite de inflamabilidade inferior ou maior que o limite de in- flamabilidade superior. Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa além de isopreno compreende entre aproximadamente 0% e aproximada- mente 100% de oxigênio (volume), tal como entre aproximadamente 10% e aproximadamente 100% de oxigênio (volume). Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa além de isopreno compreende entre aproximadamen- te 0% e aproximadamente 99% de nitrogênio (volume). Em algumas modali- dades, a porção da fase gasosa além de isopreno compreende entre apro- ximadamente 1% e aproximadamente 50% de CO, (volume). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, as células em cultura produzem isopreno em mais ou aproximada- mente 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000,
2.500, 3.000, 4.000, 5.000 ou mais nmol/gwcm/h de isopreno. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células da cultu- ra convertem mais ou aproximadamente 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12,0,14,0,16,0,2,0,3,0,4,0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6%, ou mais do carbono no meio de cultura celular em isopreno. Em algumas moda- lidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células em cultura produzem isopreno em mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, ' 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, ou mais ng de isopre- : no/grama de células por peso úmido das células/h (ng/gwem/h). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células em cultu- ra produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno em mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000,
10.000, 50.000, 100.000 ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcakdo, EM que o volume do caldo inclui o volume das células e o meio celular). Outras taxas exemplares de produção de isopreno e as quantidades totais da pro- dução de isopreno são reveladas neste pedido. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- 2 venção, as células compreendem ainda um ácido nucleico heterólogo que 2 15 codifica um polipeptídeo IDI. Em algumas modalidades de qualquer um dos Í aspectos da invenção, as células compreendem ainda um inserto de uma cópia de um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo IDI. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células compreendem ainda um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipep- tideo DXS. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, as células compreendem ainda um inserto de uma cópia de um áci- do nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo DXS. Em algumas mo- dalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células compreen- dem ainda um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo IDI e um polipeptíideo DXS. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspec- tos da invenção, um ácido nucleico codifica o polipeptídeo isopreno sintase, polipeptídeo IDI e polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, um vetor codifica o polipeptídeo isopreno sin- tase, polipeptídeo IDI e polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades, o vetor — compreende um marcador seletivo, tal como um ácido nucleico de resistên- cia a antibiótico.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in-
venção, o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga é operacionalmente ligado a um promotor T7, tal como um promotor T7 contido em um plasmí- 7 deo de cópia média ou alta. Em algumas modalidades de qualquer um dos : aspectos da invenção, o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga é o- peracionalmente ligado a um promotor Trc, tal como um promotor Tre conti- do em um plasmídeo de cópia média ou alta. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga é operacionalmente ligado a um promotor Lac, tal como um pro- motor Lac contido em um plasmídeo de cópia baixa. Em algumas modalida- desde qualquer um dos aspectos da invenção, o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga é operacionalmente ligado a um promotor endógeno, tal como um promotor endógeno de serina protease alcalina. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga integra-se em um -” cromossomo das células sem um marcador seletivo.
Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via i de MVA, IDI, DXP ou isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA, DI, DXP ou isopreno sintase podem ser colocados sob o controle de uma fase estacionária de fator sigma, tal como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA, IDI, DXP ou isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor induzível na fase estacionária, tal como um promotor induzível por um regulador de resposta ativo na fase es- tacionária.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, pelo menos uma porção das células mantém o ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga por pelo menos ou aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65 ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura contínua sem diluição). Em algumas modalidades de qualquer umdos aspectos da invenção, o ácido nucleico compreendendo o ácido nu- cleico de isopreno sintase, IDI ou DXS também compreende um marcador seletivo, tal como um ácido nucleico de resistência a antibiótico.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, as células compreendem ainda um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo da via de MVA (tal como um polipeptídeo da via de MVA de Saccharomyces cerevisia ou Enterococcus faecalis). Em algumas — modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células compre- endem ainda um inserto de uma cópia de um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo da via de MVA (tal como um polipeptídeo da via de MVA de Saccharomyces cerevisia ou Enterococcus faecalis). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células compre- endem um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS e MVA.
Em algu- mas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células compreendem um ácido nucleico de isopreno sintase, um ácido nucleico de DXS, um ácido nucleico de ID, e um ácido nucleico da via de MVA (além do ácido nucleico de IDI). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, o polipeptídeo isopreno sintase é um polipeptídeo natural de uma planta, tal como Pueraria (por exemplo, Pueraria montana ou Pueraria lobata). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in- venção, as células são células bacterianas, tais como células bacterianas gram-positivas (por exemplo, células de Bacillus, tais como células de Bacil- lus subtilis ou células de Streptomyces, tais como células de Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor ou Streptomyces griseus). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células são célu- las bacterianas gram-negativas (por exemplo, células de Escherichia, tais comocélulas de Escherichia coli ou células de Pantoea, tais como células de Pantoea citrea). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, as células são células fúngicas, tais como células fúngicas fila- mentosas (por exemplo, células de Trichoderma, tais como células deTri- choderma reesei ou células de Aspergillus, tais como Aspergillus oryzae e Aspergillus niger) ou células de levedura (por exemplo, células de Yarrowia, tais como células de Yarrowia lipolytica). | Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da in-
venção, a fonte de carbono de polipeptídeo microbiano inclui um ou mais polipeptídeos de levedura ou bactérias. Em algumas modalidades de qual- quer um dos aspectos da invenção, a fonte de carbono de polipeptídeo ve- getal inclui um ou mais polipeptídeos de soja, milho, canola, jatrofa, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, semente de algodão, palmiste, azeitona, cártamo, sésamo ou linhaça.
Em um aspecto, a invenção caracteriza um produto produzido por qualquer uma das composições ou métodos da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é a sequência nucleotídica de um gene de isopreno sintase de kudzu códon-otimizado para expressão em E. coli (SEQ ID NO:1). O códon de partida atg está em itálico, o códon de parada está em negrito e o sítio Pstl adicionado está sublinhado.
& A figura 2 é um mapa de pTrcKudzu.
A figura 3 é a sequência nucleotídica de pTrecKudzu (SEQ iD NO:2). RBS está sublinhado, o códon de partida de isopreno sintase de kud- zu está em letras capitalizadas em negrito e o códon de parada está em le- tras negritadas, capitalizadas, em itálico. O esqueleto do vetor é pTrcHis2B.
A figura 4 é um mapa de pETNHisKudzu.
A figura 5 é a sequência nucleotídica de pETNHisKudzu (SEQ ID NO:5).
A figura 6 é um mapa de pCL-lac-Kudzu.
A figura 7 é a sequência nucleotídica de pCL-lac-Kudzu (SEQ ID NO:7).
A figura 8A é um gráfico mostrando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli sem vetor.
A figura 8B é um gráfico mostrando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli com pCL-lac-Kudzu A figura 8C é um gráfico mostrando a produção de isopreno em células BL21defF.colicom pTrecKudzu.
A figura 8D é um gráfico mostrando a produção de isopreno em células BL21 de E. coli com pETN-HisKudzu.
A figura 9A é um gráfico mostrando OD ao longo do tempo de fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermentação em batelada ' alimentadade de 14 litros. : A figura 9B é um gráfico mostrando a produção de isopreno ao longodo tempo de fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermen- tação em batelada alimentada de 14 litros.
A figura 10A é um gráfico mostrando a produção de isopreno em Panteoa citrea.
Células controle sem isopreno sintase de kudzu recombinan- te.
Os losangos cinzas representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam ODgoo.
A figura 10B é um gráfico mostrando a produção de isopreno em Panteoa citrea expressando pCL-lac Kudzu.
Os losangos cinzas represen- tam a síntese de isopreno, os quadrados pretos representam ODgoo. ” A figura 10C é um gráfico mostrando a produção de isopreno em 2— 15 Panteoa citrea expressando pTrcKudzu.
Os losangos cinzas representam a | síntese de isopreno, quadrados pretos representam ODçoo.
A figura 11 é um gráfico mostrando a produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase recombinante.
BG3594comK é uma cepa de B. subtilis sem plasmídeo (produção de isopreno nativa). CF443-BG3594comK é uma cepa de B. subtilis com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante). IS no eixo y indica o isopreno.
A figura 12 é a sequência nucleotídica de pBS Kudzu %2 (SEQ ID NO:57). A figura 13 é a sequência nucleotídica da isopreno sintase de kudzu códon-otimizada para expressão em Yarrowia (SEQ ID NO:8). A figura 14 é um mapa de pTrex3g compreendendo um gene de isopreno sintase de kudzu códon-otimizado para expressão em Yarrowia.
A figura 15 é a sequência nucleotídica do vetor pSPZ1 (MAP29Spb) (SEQ ID NO:11). A figura 16 é a sequência nucleotídica do gene de isopreno de kudzu sintético (Pueraria montana) códon-otimizado para expressão em Yar- rowia (SEQ ID NO:12).
A figura 17 é a sequência nucleotídica do gene de isopreno sin- tase de álamo híbrido sintético (Populus alba x Populus tremula) (SEQ ID NO:13). O códon de partida ATG está em negrito e o códon de parada está sublinhado. A figura 18A mostra um esquema delineando a construção de vetores pYLA 1, pYL1 e pYL2. A figura 18B mostra um esquema delineando a construção do vetor pYLA (POP1). A figura 18C mostra um esquema delineando a construção do vetor pYLA (KZ1) A figura 18D mostra um esquema delineando a construção do vetor pYL| (KZ1) A figura 18E mostra um esquema delineando a construção do í vetor pYL! (MAP29) A figura 18F mostra um esquema delineando a construção do vetor pYLA (MAP29) A figura 19 mostra as vias metabólicas de MVA e DXP para iso- preno (baseadas em F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). A seguinte descrição inclui nomes alternativos de cada polipeptídeo nasviase uma referência que revela um ensaio para medida da atividade do polipeptídeo indicado (cada uma destas referências é por meio deste incor- porada por referência em sua totalidade, particularmente com relação a en- saios para atividade de polipeptídeo para polipeptídeos nas vias de MVA e DXP). Via de Mevalonato:AACT; Acetil-CoA acetiltransferase, MvaE, EC
2.3.1.9. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; Hidroximetilglu- taril-CoA sintase, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductase, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; mevalonato quinase, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensaio: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomeva- lonato quinase, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensaio: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato decarboxilase, MVD1, EC 4.1.1.33. Ensaio: Bio- chemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; Isopentenil-difosfato delta-isomerase,
IDII, EC 5.3.3.2. Ensaio: J.
Biol.
Chem. 264:19169-19175, 1989. Via de DXP: DXS; 1-Desoxilulose-5-fosfato sintase, dxs, EC 2.2.1.7. Ensaio: PNAS, ' 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desóxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase, dxr, EC 2.2.1.7. Ensaio: Eur.
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Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4- Difosfocitidi-2C-metil-D-eritritol sintase, ISpD, EC 2.7.7.60. Ensaio: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4- Difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase, Is- pE, EC 2.7.1.148. Ensaio: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-Metil-D- eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase, IspF, EC 4.6.1.12. Ensaio: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sin- tase,ispG, EC 1.17.4.3. Ensaio: J.
Org.
Chem., 70:9168 - 9174, 2005; HDR; 1-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato reductase, IspH, EC 1.17.1.2. En- saio: JACS, 126:12847-12855, 2004. A figura 20 mostra gráficos que representam os resultados da - análise de GC-MS para produção de isopreno por cepas de Y. lipolytica re- — 15 combinantes sem (esquerdo) ou com (direito) um gene de isopreno sintase de kudzu.
As flechas indicam o tempo de eluição do padrão de isopreno au- têntico.
A figura 21 é um mapa de pTrcKudzu yIDI DXS Can.
A figura 22 é a sequência nucleotídica de pTrcKudzu yIDI DXS Can(SEQIDNO:20). A figura 23A é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzukan.
O tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODsoo e o eixo mostrando a produção de isopreno a produtividade total de isopreno (ug/Lde espaço de cabeça ou produtividade específica (ug/L de espaço de cabeça/OD). Os losangos representam ODsçoo, Círculos representam produti- vidade de isopreno total (ug/L) e Os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD). A figura 23B é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu yIDI can.
O tempo 0 é o tempo da in- dução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODsoo E O eixo mostrando a produção de isopreno produtividade total de iso-
preno (ug/L de espaço de cabeça ou produtividade específica (ug/L de es- paço de cabeça/OD). Os losangos representam ODgoo, Círculos representam produtividade de isopreno total (ug/L) e Os quadrados representam produti- ' vidade específica de isopreno (pyg/L/OD).
A figura 23C é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu DXS can. O tempo 0 é o tempo da in- dução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODeoo e o eixo mostrando a produção de isopreno produtividade total de iso- preno (ug/L de espaço de cabeça ou produtividade específica (ug/L de es- paço de cabeça/OD). Os losangos representam ODgoo, Círculos representam produtividade de isopreno total (ug/L) e Os quadrados representam produti- vidade específica de isopreno (vg/L/OD).
A figura 23D é um gráfico mostrando a produção de isopreno a ” partir de glicose em BL21/pTrcKudzu yIDI DXS can. O tempo 0 é o tempo da — 15 indução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODepoo e o eixo y2 é produtividade total de isopreno (ug/L de espaço de ca- beça ou produtividade específica (ug/L de espaço de cabeça/OD). Os losan- gos representam ODsoo, círculos representam produtividade de isopreno total (vg/L) e Os quadrados representam produtividade específica de isopreno (ug/l/OD).
A figura 23E é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu. O tempo 0 é o tempo da indução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODsoo € O eixo y2 é produtividade total de isopreno (pug/L de espaço de cabeça ou pro- dutividade específica (ug/L de espaço de cabeça/OD). Os losangos repre- sentam ODeçoo, círculos representam produtividade de isopreno total (ug/L) e Os quadrados representam produtividade específica de isopreno (ug/L/OD).
A figura 23F é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu yIDI. O tempo 0 é o tempo da in- dução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODeoo e o eixo y2 é produtividade total de isopreno (ug/L de espaço de ca- beça ou produtividade específica (ug/L de espaço de cabeça/OD). Os losan-
gos representam ODgçoo, círculos representam produtividade de isopreno total (ug/L) e Os quadrados representam produtividade específica de isopreno ' (vg/L/OD). . A figura 23G é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partirde glicose em BL21/pCL PtrecKudzu DXS. O tempo 0 é o tempo da in- dução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é ODgoo E O eixo y2 é produtividade total de isopreno (nug/L de espaço de cabe- ça ou produtividade específica (pvg/L de espaço de cabeça/OD). Os losangos representam ODçgoo, círculos representam produtividade de isopreno total (ugl)e 0Os quadrados representam produtividade específica de isopreno (v9/L/OD).
A figura 23H é um gráfico mostrando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTreKudzulDIDXSKkan. A flecha indica o tempo da - indução com IPTG (400 umol). O eixo x é tempo após indução; o eixo y é — 15 ODeowneo %eixoy2 é produtividade total de isopreno (ug/L de espaço de ca- i beça ou produtividade específica (ug/L de espaço de cabeça/OD). Os losan- gos pretos representam ODsoo, os triângulos pretos representam a produtivi- dade de isopreno (ug/L) e quadrados brancos representam a produtividade específica de isopreno (ug/L/OD). A figura 24 é um mapa de pTrcKKDylkIS can.
A figura 25 é uma sequência nucleotídica de pTreKKDylIkIS can (SEQ ID NO:33).
A figura 26 é um mapa de pCL PtrcUpperPathway.
As figuras 27A-27D são uma sequência nucleotídica de pCL Ptr- —cUpperPathway (SEQ ID NO:46).
A figura 28 mostra um mapa do cassete contendo a via de MVA inferior e a levedura idi para integração no cromossomo de B. subtilis no lo- cus de nprE. nprE a montante/a jusante indica 1 kb de cada sequência do locus de nprE para integração. Promotor aprE (promotor de serina protease —alcalina)indica o promotor (sítio de partida de transcrição-35,-10, +1, RBS) do gene aprE. MVK1 indica o gene de mevalonato quinase de levedura. RBS-PMK indica o gene de fosfomevalonato quinase de levedura com um
Bacillus RBS a montante do sítio de partida.
RBS-MPD indica o gene de di- fosfomevalonato decarboxilase de levedura com um RBS de Bacillus a mon- " tante do sítio de partida.
RBS-IDI indica o gene de levedura idi com um Ba- : cillus RBS a montante do sítio de partida.
Terminador indica a serina protea- sealcalinaterminadora de transcrição de B. amyliquefaciens.
SpecR indica o marcador de resistência à espectinomicina. "Repetição denprE a montante para amp." indica uma repetição direta da região a montante usada para amplificação.
A figura 29 é uma sequência nucleotídica do cassete contendo a viade MVA inferior e idi de levedura para a integração no cromossomo de B. subtilis no locus de nprE (SEQ ID NO:47). A figura 30 é um mapa de p9796-álamo.
A figura 31 é uma sequência nucleotídica de p9796-álamo (SEQ ” ID NO:48). A figura 32 é um mapa de pTrcPoplar.
A figura 33 é uma sequência nucleotídica de pTrcPoplar (SEQ ID NO:49). A figura 34 é um mapa de pTrcKudzu yID! Can.
A figura 35 é uma sequência nucleotídica de pTrcKudzu yIDI Can(SEQIDNO:50). A figura 36 é um mapa de pTrcKudzuDXS Can.
A figura 37 é uma sequência nucleotídica de pTreKudzuDXS Can (SEQ ID NO:51). A figura 38 é um mapa de pCL PtrcKudzu.
A figura 39 é uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu (SEQ ID NO:52). A figura 40 é um mapa de pCL PtrcKudzu A3. A figura 41 é uma sequência nucleotídica de pCL PtrecKudzu A3 (SEQ ID NO:53). A figura 42 é um mapa de pCL PtrcKudzu yIDI.
A figura 43 é uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu yIDI| (SEQ ID NO:54).
A figura 44 é um mapa de pCL PtrcKudzu DXS.
A figura 45 é uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu 7 DXS (SEQ ID NO:55).
A figura 46 mostra gráficos que representam a produção de iso- prenoa partir de matérias-primas de biomassa. O painel A mostra a produção de isopreno a partir de palha de milho, o painel B mostra a produção de isopre- no a partir de bagaço, o painel C mostra a produção de isopreno a partir de polpa de madeira mole, o painel D mostra a produção de isopreno a partir de glicose e o painel E mostra a produção de isopreno a partir de células sem ma- téria-prima adicional. Os quadrados cinzas representam medidas de ODçoo das culturas em tempos pós-inoculação indicados e os triângulos pretos repre- sentam a produção de isopreno em tempos pós-inoculação indicados.
A figura 47A mostra um gráfico representando a produção de i- ” sopreno por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (can) em uma cultura sem glicose adicionada. Os quadrados representam ODgoo, e os triângulos repre- ' sentam isopreno produzido (pg/ml).
A figura 47B mostra um gráfico representando a produção de i- sopreno a partir de açúcar invertido de matéria-prima de glicose 1% por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (can). Os quadrados representam ODçoo, eostriângulos representam isopreno produzido (pg/ml).
A figura 47C mostra um gráfico representando a produção de i- sopreno a partir de açúcar invertido de matéria-prima de glicose 1% por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (can). Os quadrados representam ODgpoo, e os triângulos representam isopreno produzido (pug/ml).
A figura 47C mostra um gráfico representando a produção de i- sopreno a partir da matéria-prima palha de milho AFEX 1% por BL21 (ADE3) pTrceKudzu yIDI DXS (can). Os quadrados representam ODgsgoo, e os triângu- los representam isopreno produzido (pg/ml).
A figura 48 mostra gráficos demonstrando o efeito do extrato de levedura na produção de isopreno. Os painel A mostra o curso de tempo de densidade ótica dentro de fermentadores alimentados com a variação das quantidades do extrato de levedura. O painel B mostra o curso de tempo de título de isopreno dentro de fermentadores alimentados com variação das quantidades do extrato de levedura.
O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
O painel C mostra o ] efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli cultivada emculturaem batelada alimentada.
A figura 49 mostra gráficos demonstrando a produção de isopre- no a partir de um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu + yIDI + DXS.
O painel A mostra o curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 500L alimentado com extrato de le- vedurae glicose.
O painel B mostra o curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 500L alimentado com extrato de levedura e glicose.
O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
O painel C mostra o curso de tempo de isopreno total produzi- - do do biorreator de 500L alimentado com extrato de levedura e glicose.
A figura 50 é um mapa de pJMupperpathway2. A figura 51 é a sequência nucleotídica de pJMupperpathway2 (SEQ ID NO:56). A figura 52 é um mapa de pBS Kudzu f2. A figura 53A é um gráfico mostrando crescimento durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante na fermentação em batelada alimentada de 14 litros.
Os lo- sangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinzas representam Bacillus com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante). A figura 53B é um gráfico mostrando a produção de isopreno du- rante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante em fermentação em batelada alimentada de 14 litros.
Os losangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinzas representam Bacíllus com pBSKudzu (produção de isopreno recom- binante). A figura 54 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 55 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como a quanti- dade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 56 é um curso de tempo de isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 57 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicerol.
A figura 58 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicerol. O título é definido como a quanti- dade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 59 é um curso de tempo de isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicerol.
“ As figuras 60A a 60C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de ácido mevalônico, e produtividade específica dentro do biorrea- tor de 150 L alimentado com glicose.
As figuras 61A a 61C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de ácido mevalônico, e produtividade específica dentro do biorrea- tor de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 62A a 62C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de ácido mevalônico, e produtividade específica dentro do biorrea- tor de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 63A a 63C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15L alimentado com glicose.
As figuras 64A a 64C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 65A a 65C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, títulodeisopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 66A a 66C são os cursos de tempo de densidade óti-
ca, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 67A a 67C são os cursos de tempo de densidade óti- ca, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 68 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série A como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico. Por exemplo, a primeira entrada na le- genda da figura (isopreno em ar a 40ºC) corresponde à curva mais alta no gráfico.
A figura 69 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série B como uma função de concentração de com- - bustível para vários níveis de oxigênio com água 4%. A legenda da figura listaascurvasna ordem em que aparecem no gráfico.
À A figura 70 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série C como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio com CO, 5%. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
A figura 71 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série D como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio com COz2 10%. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
A figura 72 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série E como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio com CO, 15%. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
A figura 73 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série F como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio com CO, 20%. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
A figura 74 é um gráfico das temperaturas adiabáticas de chama calculadas a partir da Série G como uma função de concentração de com- bustível para vários níveis de oxigênio com CO, 30%. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico. ' A figura 75A é uma tabela da conversão dos resultados do Modelo —CAFT de porcentagem por peso a porcentagem por volume para série A.
A figura 75B é um gráfico dos resultados de inflamabilidade do modelo CAFT da Série A na Figura 68 traçado como porcentagem por volume.
A figura 76A é uma tabela da conversão dos resultados do Modelo CAFT de porcentagem por peso a porcentagem por volume para série B.
A figura 76B é um gráfico dos resultados de inflamabilidade do modelo CAFT da Série B na Figura 69 traçado como porcentagem por volume.
A figura 77 é uma figura do vaso de teste de inflamabilidade.
A figura 78A é um gráfico da Curva de inflamabilidade para a Sé- “ rie Teste 1: Vapor 0%, O kPa e 40ºC.
A figura 78B é uma tabela resumindo os pontos de dados de ex- plosão e sem explosão da Série Teste 1. A figura 78C é um gráfico da curva de inflamabilidade da Série Teste 1 em comparação ao Modelo CAFT.
A figura 79A é um gráfico da curva de inflamabilidade da Série Teste2:Vapor4%,O0kPae40C.
A figura 79B é uma tabela resumindo os pontos de dados de ex- plosão e sem explosão da Série Teste 2. A figura 79€C é um gráfico da curva de inflamabilidade da Série Teste 2 em comparação ao Modelo CAFT.
As figuras 80A e 80B são uma tabela das condições experimen- tais detalhadas e resultados da Série Teste 1. A figura 81 é uma tabela das condições experimentais detalha- das e resultados da Série Teste 2. A figura 82 é um gráfico da temperatura adiabática de chama calculada traçada como uma função da concentração de combustível para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 3 atmosferas de pressão.
A figura 83 é um gráfico da temperatura adiabática de chama calculada traçada como uma função da concentração de combustível para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 1 atmosfera de pressão. : A figura 84 é um gráfico do envelope de inflamabilidade constru- ; ido usando dados da Figura 82 e após metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos de dados experimentais (círculos) são de testes descritos neste pedido que foram conduzidos em sistema de pressão inicial de 1 atmosfera.
A figura 85 é um gráfico do envelope de inflamabilidade constru- ído usando dados da Figura 83 e após metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos de dados experimentais (círculos) são de testes descritos neste pedido que foram conduzidos em sistema de pressão inicial de 1 atmosfera.
A figura 86A é um cromatograma GC/MS de efluente gasoso da fermentação.
A figura 86B é uma expansão da Fig. 86A para mostrar voláteis 2 menores presentes no efluente gasoso da fermentação. A figura 87A é um cromatograma GC/MS de voláteis-traço pre- É sentes no efluente gasoso seguido por criocaptura a -78ºC.
A figura 87B é um cromatograma GC/MS de voláteis-traço pre- sentes no efluente gasoso seguido por criocaptura a -196ºC.
A figura 87C é uma expansão da Fig. 87B.
A figura 87D é uma expansão da Fig. 87C.
As figuras 88A e 88B são cromatograma GC/MS comparando hidrocarbonetos C5 de isopreno derivado de petróleo (Fig. 88A) e isopreno biologicamente produzido (Fig. 88B). O padrão contém três impurezas de hidrocarboneto C5 eluindo em torno do pico principal de isopreno (Fig. 88A).
Ao contrário, o isopreno biologicamente produzido contém quantidades de etanol e acetona (tempo de corrida de 3,41 minutos) (Fig. 88A).
A figura 89 é um gráfico da análise do efluente gasoso de fermen- tação de uma cepa de E. coli BL21 (DE3) pTrclS expressando uma isopreno sintase de kudzu e alimentada com glicose com extrato de levedura 3 g/L.
A figura 90 mostra as estruturas de várias impurezas que são estruturalmente similares ao isopreno e também podem atuar como venenos de catálise de polimerização.
A figura 91 é um mapa de pTrcHis2AUpperPathway (também chamado de pTrcUpperMVA).
As figuras 92A a 92C são a sequência nucleotídica de pTrcHis . 2AUpperPathway (também chamado de pTrcUpperMVA) (SEQ ID NO:86). A figura 93 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 94 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como a quanti- dade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 95 é um curso de tempo de isopreno total produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 96 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
- A figura 97 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido. O título é definido como À a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 98 é um curso de tempo de isopreno total produzido do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
A figura 99 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 100 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como a quanti- dade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 101 é um curso de tempo de atividade específica de i- —soprenodo biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 102 é um mapa de pCLPtrcUpperPathwayHGS2.
As figuras 103A a 103C são a sequência nucleotídica de pCLP- treUpperPathwayHGS2 (SEQ ID NO:87).
A figura 104 é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 105 é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como a quanti-
dade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 106 é um curso de tempo de isopreno total produzido a : partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A figura 107 é um mapa do plasmídeo MCM330. As Figuras 108A a 108C são a sequência nucleotídica do plas- mídeo MCM330 (SEQ ID NO:90).
A figura 109 é um mapa de pET24D-Kudzu.
As figuras 110A e 110B são a sequência nucleotídica de pET24 D-Kudzu (SEQ ID NO:101).
A figura 111A é um curso de tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 111B é um curso de tempo de título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como a - quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação. A figura 111C é um curso de tempo da produtividade específica de isopreno no biorreator de 15 L alimentado com glicose.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Em um aspecto, a invenção caracteriza composições e métodos para a produção de isopreno em quantidades e/ou pureza aumentadas. Co- mo usado neste pedido, o termo "isopreno" ou "2-metil-1,3-butadieno" (CASH 78-79-5) refere-se ao produto de hidrocarboneto C5 volátil direto e final a partir da eliminação de pirofosfato de 3,3-dimetilalil pirofosfato (DMAPP), e não envolve a ligação ou polimerização de uma ou mais moléculas de iso- pentenil difosfato (IPP) a uma ou mais moléculas de DMAPP.
A vasta maioria do isopreno é derivada de fontes petroquímicas como uma fração de hidrocarboneto C5 impura que requer purificação ex- tensiva antes que o material seja adequado para polimerização. Várias impu- rezas são particularmente problemáticas dado sua similaridade estrutural com isopreno e o fato que podem atuar como venenos de catálise de polime- rização. Tais compostos incluem 1,3-ciclopentadieno, cis- e trans-1,3-penta- dieno, 1-pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino e cis-pent-3-eno-1-ino (Fig. 90). Em algumas modalidades, a composição de isopreno da invenção é substanci- almente livre de qualquer contaminação de hidrocarbonetos C5 não satura- dos. Como descrito posteriormente no Exemplo 10, nenhuma quantidade detectável de hidrocarbonetos C5 não saturados além de isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pen- tino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-pi- perileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino) foi encontrada em composições de isopreno produzidas usando os métodos descritos neste pedido. Algumas composições de isopreno produzidas usan- doos métodos descritos neste pedido contêm etanol, acetona e prenil álco- ois C5 como determinado pela análise GC/MS. Todos estes componentes são muito mais prontamente removidos da corrente de isopreno do que as frações de hidrocarboneto C5 isomérico que estão presentes em composi- - ções de isopreno derivadas de fontes petroquímicas. Consequentemente, em algumas modalidades, as composições de isopreno da invenção requerem tra- tamento mínimo a fim de terem grau de polimerização.
Em um aspecto, composições e métodos da invenção aumen- tam a taxa de produção de isopreno e aumentam a quantidade total de iso- preno que é produzida. Por exemplo, sistemas de cultura de células que ge- ram4,8x10º nmol/gwen/h de isopreno foram produzidos (Tabela 1). A efici- ência destes sistemas é demonstrada pela conversão de aproximadamente 2,2% do carbono que as células consomem a partir de um meio de cultura celular em isopreno. Como mostrado nos Exemplos e na Tabela 2, aproxi- madamente 3 g de isopreno por litro de caldo foram gerados. Se desejado, quantidades ainda maiores de isopreno podem ser obtidas usando outras condições, tais como aquelas descritas neste pedido. Em algumas modali- dades, uma fonte de carbono renovável é usada para a produção de isopre- no. Em algumas modalidades, a produção de isopreno é separada do cres- cimento das células. Em algumas modalidades, as concentrações de isopre- noe qualquer oxidante estão dentro das faixas não inflamáveis para reduzir ou eliminar o risco que chama possa ocorrer durante produção ou recupera- ção de isopreno. As composições e métodos da presente invenção são de-
sejáveis porque permitem alto rendimento de isopreno por célula, alto rendi- mento de carbono, alta pureza de isopreno, alta produtividade, baixo uso de energia, baixo custo de produção e investimento e reações colaterais míni- . mas. Este processo biossintético eficiente, em larga escala, para produção de isopreno fornece uma fonte de isopreno para borracha baseada em iso- preno sintético e fornece uma alternativa desejável, de baixo custo, à utiliza- ção de borracha natural.
Como discutido posteriormente abaixo, a quantidade de isopreno produzida por células pode ser muito aumentada pela introdução de um áci- do nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo isopreno sintase (por exemplo, um polipeptídeo isopreno sintase vegetal) nas células. Os polipep- tídeos isopreno sintase convertem dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Como mostrado nos Exemplos, um polipeptídeo isopreno sintase de Puera- É ria Montana (kudzu) heterólogo foi expresso em uma variedade de células : 15 hospedeiras, tais como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia lipolytica e Trichoderma reesei. Todas estas células produziram mais isopreno do que as células correspondentes sem o polipeptídeo iso- preno sintase heterólogo. Como ilustrado nas Tabelas 1 e 2, grandes quanti- dades de isopreno são produzidas usando os métodos descritos neste pedi- do. Por exemplo, células de B. subtilis com um ácido nucléico de isopreno sintase heteróloga produziram aproximadamente 10 vezes mais isopreno em fermentador de 14 litros do que o controle correspondente de células de B. subtilis sem o ácido nucleico heterólogo (Tabela 2). A produção de 300 mg de isopreno por litro de caldo (mg/L, em que o volume do caldo inclui tanto o volume do meio celular como o volume das células) por E. coli e 30 mg/L por B. subtilis em fermentadores indica que quantidades significantes de isopre- no podem ser geradas (Tabela 2). Se desejado, o isopreno pode ser produ- zido em uma escala maior ou outras condições descritas neste pedido po- dem ser usadas para aumentar adicionalmente a quantidade de isopreno. Os vetores listados nas Tabelas 1 e 2 e as condições experimentais são descritos em detalhes adicionais abaixo e na seção de Exemplos. Tabela 1: Rendimentos exemplares de isopreno a partir de um frasco de agitação usando as culturas celulares e métodos da invenção.
O ensaio para medida da produção de isopreno é descrito no Exemplo |, parte Il.
Para este ensaio, uma amostra foi removida em um ou mais pontos de . tempo do frasco de agitação e cultivada por 30 minutos.
A quantidade de isopreno produzida nesta amostra então foi medida.
A concentração de es- paço de cabeça e a taxa específica da produção de isopreno são listadas na Tabela 1 e descritas posteriomente neste pedido. epa Produção de Isopreno em um frasco Ide Espaço de cabeça* oncentração — deiTaxa Específica espaço de cabeça Iug/Leaiao/h/OD IM9/Lgas (nmol/gwcm/h) E. coli BL21/ pTrcKudzu IS 53,2 (781,2) - IE. coli BL21/ poCL DXS yidi Kudzu IS 7,61 289,1 (4,25 x 10º) . coli BL21/MCM127 com IS de kudzu e 23,0 874,1 ia MVA completa (12,8 x 10º) . coli BL21/ pET N-HisKudzu IS 1,49 56,6 (831,1) Pantoea citrea /pTrcKudzu IS 25,1 (368,6) IE. coli w Poplar IS 5,6 Miller (2001)] (82,2) [Bacillis licheniformis Fall US 5849970 4,2 (61,4) Yarrowia lipolytica com isopreno sintase del —0,05 uo/L -2 Ikudzu (-30) Trichoderma reesei com isopreno sintase —-0,05 po/L -2 de kudzu (-30) . coli BL21/ pTrcKKD,IKS com IS de kud- 3,2x10? Eu e via MVA inferior (4,8 x 10º) *Normalizada para 1 mL de 1 ODgoo, cultivada por 1 hora em um frasco de espaço de cabeça selado com um líquido na razão de volume de espaço de cabeça de 1:19. Tabela 2: Rendimentos exemplares de isopreno em um fermen-
tador usando as culturas celulares e métodos da invenção.
O ensaio para medida da produção de isopreno é descrito no Exemplo |, parte Il.
Para este ensaio, uma amostra do efluente gasoso do fermentador foi tomada e anali- sada para a quantidade de isopreno.
A concentração de espaço de cabeça de pico (queé a concentração de espaço de cabeça mais alta durante a fermentação), o título (que é o cumulativo, quantidade total de isopreno pro- duzido por litro de caldo), e a chegada ao ponto máximo da taxa específica da produção de isopreno (que é a taxa específica mais alta durante a fer- mentação) são listados na Tabela 2 e descritos posteriormente neste pedido. feeãa 55) >b59;)8 Produção de Isopreno em Fermentadores Concentração de Título Taxa Específica Pico de Espaço de| (mgl/Lcao) de Pico Cabeça** (ug/Loss) HOI/Leao/W/OD (nmol/g,.cn/h) - . coli BL21 /pTrcKudzu com 52 41,2 37 (543,3) Kudzu IS E. coli FM5/pTreKudzu IS 21,4 (308,1) E. coli BL21/ cepa tripla (DXS, 285 300 240 (3,52 x 10º) idi, IS) E. coli FM5/ cepa tripla (DXS, 50,8 29 180,8 (2,65 x 10º) idi, 1S) . COolilMCM127 com Kudzu IS) 3815 3044 992,5 (1,46 x 10º) e via de MVA completa . coli BL21/pCLPtrc UpperPa- 2418 1248 (1,83 x 10º) hway gi1.2 via inferior integra da pTrcKudzu . coli BL21/pCLPtrc UpperPa- 3500 3300 1088 (1,60 x 10º) hwayHGS2 -pTrecKKDyikIS Bacillus subtilis selvagem 0,8 (11,7) Bacillus pBS Kudzu IS -30 5(73,4) (mais 100 h) Bacillus Marburg 6051 [Wagne; 2,04 0,61 24,5 (359,8) and Fall (1999) Bacillus Marburg 6051 Fall US) o,7 0,15 6,8 (100) 5849970 ** Normalizada para uma taxa de fluxo de efluente gasoso de 1 vvm (1 vo- lume de gás efluente por 1 Leao por minuto).
Adicionalmente, a produção de isopreno por células que contêm um ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga pode ser aumentada pelo aumento da quantidade de um polipeptídeo 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (DXS) e/ou um polipeptídeo isopentenil difosfato isomerase (IDI) ex- presso pelas células. Por exemplo, um ácido nucleico de DXS e/ou um ácido nucleico de IDI podem ser introduzidos nas células. O ácido nucleico de DXS pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno. Similarmente, o ácido nucleico de IDI pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno. Em algumas modalidades, a quantidade de DXS e/ou polipeptídeo IDI é au- mentada pela substituição de promotores DXS e/ou IDI endógenos ou regi- ões regulatórias por outros promotores e/ou regiões regulatórias que resul- tam em maior transcrição de ácidos nucleicos DXS e/ou IDI. Em algumas q modalidades, as células contêm tanto o ácido nucleico heterólogo que codifi- caum polipeptídeo isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucleico de iso- i preno sintase vegetal) como uma cópia duplicada de um ácido nucleico en- dógeno que codifica um polipeptídeo isopreno sintase. Os polipeptídeos DXS e IDI codificados são parte da via de DXP da biossíntese de isopreno figura 19). Os polipeptídeos DXS convertem piru- vatoe D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato. Não pre- tendendo estar ligado a nenhuma teoria particular, acredita-se que aumentar a quantidade do polipeptídeo DXS aumenta o fluxo de carbono pela via de DXP, levando a maior produção de isopreno. Os polipeptídeos ID! catalisam a interconversão de isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP). Não pretendendo estar ligado a nenhuma teoria particular, acredi- ta-se que aumentar a quantidade do polipeptídeo IDI nas células aumenta a quantidade (e taxa de conversão) de IPP que é convertido em DMAPP, que por sua vez é convertido em isopreno.
Por exemplo, a fermentação de células de E. coli com uma iso- prenosintase de kudzu, ácidos nucleicos de IDI de S. cerevisia, e de DXS de E. coli foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50 a 300 ug/L ao longo de um período de tempo de 15 horas (Exemplo 7,
parte VII).
Em algumas modalidades, a presença da isopreno sintase en- dógena extra ou heteróloga, de IDI e ácidos nucleicos DXS faz com que as J células cresçam mais reprodutivelmente ou permaneçam viáveis por mais tempo em comparação à célula correspondente com somente um ou dois destes ácidos nucleicos endógenos extras ou heterólogos. Por exemplo, cé- lulas contendo ácidos nucleicos de isopreno sintase heteróloga, IDI e DXS tornaram-se melhores do que células somente com ácidos nucleicos de iso- preno sintase heteróloga e DXS ou somente com um ácido nucleico de iso- preno sintase heteróloga. Além disso, ácidos nucleicos de isopreno sintase heteróloga, IDI e DXS foram com sucesso operacionalmente ligados a um promotor forte em um plasmídeo de alta cópia que foi mantido por células de E. coli, sugerindo que grandes quantidades destes polipeptídeos possam ser Y expressas nas células sem causar uma quantidade excessiva de toxicidade àscélulas. Não pretendendo estar ligado a uma teoria particular, acredita-se i que a presença de isopreno sintase endógena extra ou heteróloga e ácidos nucleicos de IDI possa reduzir a quantidade de um ou mais intermediários potencialmente tóxicos que se acumulariam de outra maneira se somente um ácido nucleico de DXS endógeno extra ou heterólogo estivesse presente nascélulas.
Em algumas modalidades, a produção de isopreno por células que contêm um ácido nucleico de isopreno sintase heteróloga é aumentada pelo aumento da quantidade de um polipeptídeo MVA expresso pelas célu- las figura 19). Polipeptídeos vias de MVA exemplares incluem qualquer um dos seguintes polipeptídeos: polipeptídeos acetil-CoA acetiltransferase (AA- CoA tiolase), polipeptídeos 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídeos 3-hidróxi-3-metilglutari-CoA reductase (HMG-CoA reductase), polipeptídeos mevalonato quinase (MVK), polipeptídeos fosfo- mevalonato quinase (PMK), polipeptídeos difosfomevalonato decarboxilase —(MVD), polipeptídeos IDI, e polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos fusão) tendo uma atividade de dois ou mais polipeptídeos da via de MVA. Por e- xemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA podem ser introduzidos nas células.
Em algumas modalidades, as células contêm a via de MVA su- perior, que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e , HMG-C0oA reductase.
Em algumas modalidades, as células contêm a via de . MVA inferior, que inclui ácidos nucleicos MVK, PMK, MVD e IDI.
Em algu- mas modalidades, as células contêm a via de MVA completa, que inclui áci- dos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA reductase, MVK, PMK, MVD e IDI.
Os ácidos nucleicos da via de MVA podem ser áci- dos nucleicos heterólogos ou cópias duplicadas de ácidos nucleicos endó- genos.
Em algumas modalidades, a quantidade de um ou mais polipeptídeos daviadeMVA é aumentada pela substituição dos ácidos nucleicos de pro- motores endógenos ou regiões regulatórias da via de MVA por outros pro- motores e/ou regiões regulatórias que resultam na maior transcrição de áci- dos nucleicos da via de MVA.
Em algumas modalidades, as células contêm tanto um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucleico de isopreno sintase vegetal) quanto i uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno que codifica um poli-
peptídeo isopreno sintase.
Por exemplo, as células de E. coli contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo isopreno sintase de kudzu e ácidos nucleicos que codificam polipeptideos MVK, PMK, MVD e IDI de Saccharomyces cere- visia geraram isopreno em uma taxa de 6,67 x 10º mol/Lcao/ODgoo/h (ver Exemplo 8). Adicionalmente, uma fermentação de 14 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos AA-CoA tiolase, HMG- CoA sintase e HMG-CoA reductase de Enterococcus faecalis produziu 22 gramas de ácido mevalônico (um intermediário da via de MVA). Um frasco de agitação destas células produziu 2 a 4 gramas de ácido mevalônico por litro.
Estes resultados indicam que os ácidos nucleicos de vias de MVA hete- rólogas são ativos em E. coli.
Células de E. coli que contêm ácidos nucleicos tanto da via de MVA superior como da via de MVA inferior bem como uma isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 127) produziram significativamente mais isopreno (874 ug/L) comparadas a células de E. coli com ácidos nuclei- cos somente para a via de MVA inferior e a isopreno sintase de kudzu (cepa
MCM 131) (ver Tabela 3 e Exemplo 8, parte VIII).
Em algumas modalidades, pelo menos uma porção das células - mantém ácido nucleico da via de isopreno sintase heteróloga, DXS, IDI e/ou MVA por pelo menos aproximadamente 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300 ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura con- tínua sem diluição). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da invenção, o ácido nucleico compreendendo a cópia heteróloga ou dupli- cada de um ácido nucleico da via de isopreno sintase endógena, DXS, IDI e/ou MVA também compreende um marcador seletivo, tal como ácido nucle- ico de resistência a antibiótico canamicina, ampicilina, carbenicilina, genta- miíicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina ou cloranfenicol.
Como indicado no Exemplo 7, parte VI, a quantidade de isopre- no produzida pode ser ainda aumentada pela adição de extrato de levedura 2 ao meio de cultura celular. Neste exemplo, a quantidade de isopreno produ- i 15 zida foi linearmente proporcional à quantidade do extrato de levedura em i meio celular nas concentrações testadas figura 48C). Adicionalmente, apro- ximadamente 0,11 gramas de isopreno por litro de caldo foi produzido de um meio celular com extrato de levedura e glicose (Exemplo 7, parte VIII). Am- bos experimentos usaram células de E. coli com ácidos nucleicos de isopre- no sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli para produzir iso- preno. O aumento da quantidade do extrato de levedura na presença de gli- cose resultou em mais isopreno sendo produzido do que o aumento da quantidade de glicose na presença do extrato de levedura. Além disso, au- mentar a quantidade do extrato de levedura permitiu às células produzir um altonívelde isopreno por um tempo mais longo e melhorou a saúde das cé- lulas.
A produção de isopreno também foi demonstrada usando três ti- pos de biomassa hidrolisada (bagaço, palha de milho e polpa de madeira mole) como a fonte de carbono figuras 46A a C). Células de E. coli com áci- dos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli produziram isopreno tanto a partir destas fontes de carbono de biomassa hidrolisadas como de quantidade equivalente de glicose (por exemplo, glico-
se 1%, p/v). Se desejado, qualquer outra fonte de carbono de biomassa po- de ser usada nas composições e métodos da invenção. Fontes de carbono ' de biomassa são desejáveis porque são mais baratas do que muitos meios : celulares convencionais, por meio disso viabilizando a produção econômica deisopreno.
Adicionalmente, foi mostrado que açúcar invertido como função de uma fonte de carbono para a geração de isopreno figuras 47C e 96 a 98). Por exemplo, 2,4 g/L de isopreno foram produzidos a partir de células expressando polipeptídeos da via de MVA e uma isopreno sintase de kudzu (Exemplo38, parte XV). Glicerol também foi usado como uma fonte de carbo- no para à geração de 2,2 mg/L de isopreno a partir de células que expres- sam uma isopreno sintase de kudzu (Exemplo 8, parte XIV). Expressão de um ácido nucleico de DXS, um ácido nucleico de IDI e/ou um ou mais ácidos 7 nucleicos da via de MVA (tais como ácidos nucleicos que codificam a via de MVA completa) além de um ácido nucleico de isopreno sintase pode aumen- | tar a produção de isopreno a partir do glicerol. Em algumas modalidades, um óleo está incluído no meio celular. Por exemplo, células de B. subtilis contendo um ácido nucleico de isopreno sintase de kudzu produziram isopreno quando cultivadas em um meio celular contendo um óleo e uma fonte de glicose (Exemplo 4, parte Ill). Em algumas modalidades, mais de um óleo (tal como 2, 3, 4, 5 ou mais óleos) está incluí do no meio celular. Não pretendendo estar ligado a nenhuma teoria particu- lar, acredita-se que (i) o óleo pode aumentar a quantidade de carbono que está disponível para conversão em isopreno nas células, (ii) o óleo pode aumentar a quantidade de acetil-CoA nas células, por meio disso aumentan- do o fluxo de carbono pela via de MVA, e/ou (ii) o óleo pode fornecer nutrien- tes extras às células, que é desejável uma vez que muito carbono nas célu- las é convertido em isopreno em vez de outros produtos. Em algumas moda- lidades, células que são cultivadas em um meio celular contendo óleo natu- ralimente usam a via de MVA para produzir isopreno ou são geneticamente modificadas para conter ácidos nucleicos da via de MVA inteira. Em algumas modalidades, o óleo é parcialmente ou completamente hidrolisado antes de ser adicionado ao meio de cultura celular para facilitar o uso do óleo pelas células hospedeiras.
Uma das principais barreiras à produção comercial de pequenas moléculas, tais como isopreno em células (por exemplo, bactérias) é o desa- coplamento da produção da molécula do crescimento das células.
Em algu- mas modalidades para produção comercialmente viável de isopreno, uma quantidade significante do carbono da matéria-prima é convertida em iso- preno, em vez de no crescimento e manutenção das células ("eficiência de carbono"). Em várias modalidades, as células convertem mais ou aproxima- damente 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% do carbono no meio de cultura celular em isopreno.
Em modalidades particulares, uma porção significante do carbono da matéria- p prima que é convertida em produtos a jusante é convertida em isopreno.
Como descrito posteriormente no Exemplo 11, células de E. coli expressan- Ô do ácidos nucleicos da via de MVA e de isopreno sintase de kudzu exibiram o desacoplamento intermediário da produção de isopreno ou ácido mevalô- nico do crescimento, resultando em alta eficiência de carbono.
Em particular, ácido mevalônico foi formado a partir de células expressando a via de MVA superior de Enterococcus faecalis.
Isopreno foi formado a partirde células que expressam a via de MVA superior de Enterococcus faecalis, a via de MVA inferior de Saccharomyces cerevisiae, e a isopreno sintase de Pueraria montana (Kudzu). Este desacoplamento de isopreno ou produção de ácido mevalônico do crescimento foi demonstrado em quatro cepas diferentes de E coli BL21(LDE3), BL21 (LDE3) Tuner, FM5 e MG1655. As duas primei- ras cepas de E. coli são cepas B, e as últimas duas são cepas K12. Desaco- plamento da produção do crescimento também foi demonstrada em uma variante MG1655 com genes ack e pta deletados.
Esta variante também demonstrou menor produção de acetato. — Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos Exemplares Vários ácidos nucleicos e polipeptídeos da via de isopreno sinta- se, DXS, IDI e/ou MVA podem ser usados nas composições e métodos da invenção.
Como usado neste pedido, "polipeptídeos" incluem polipeptí- deos, proteínas, peptídeos, fragmentos de polipeptídeos e polipeptídeos fu- são. Em algumas modalidades, o polipeptídeo fusão inclui parte ou todo um primeiro polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo da via de isopreno sin- tase, DXS, IDI ou MVA ou fragmento cataliticamente ativo do mesmo) e po- de incluir opcionalmente parte ou todo um segundo polipeptídeo (por exem- plo, um peptídeo que facilita a purificação ou detecção do polipeptídeo fu- são, tal como uma marcação His). Em algumas modalidades, o polipeptídeo fusãotem uma atividade de dois ou mais polipeptídeos da via de MVA (tais como polipeptídeos AA-CoA tiolase e HMG-CoA reductase). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo natural (tal como o polipeptí- deo codificado por um ácido nucleico mvaE de Enterococcus faecalis) que Pp tem uma atividade de dois ou mais polipeptídeos da via de MVA. Em várias modalidades, um polipeptídeo tem pelo menos ou a- í proximadamente 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 ou mais amino- ácidos. Em algumas modalidades, o fragmento de polipeptídeo contém pelo menos ou aproximadamente 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou mais aminoá- cidos contíguos de um polipeptídeo completo e tem pelo menos ou aproxi- madamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de uma atividade de um polipeptídeo completo correspondente. Em modalidades particulares, o polipeptídeo inclui um segmento ou sequência de aminoácido completa de qualquer polipeptídeo da via de isopreno sinta- se, DXS, IDI ou MVA natural. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem uma ou maismutações em comparação à sequência de um polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza).
Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo iso- lado. Como usado neste pedido, um "polipeptídeo isolado" não é parte de uma biblioteca de polipeptídeos, tal como uma biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais polipeptídeos diferentes e é separado de pelo menos um compo- nente com o qual ocorre na natureza. Um polipeptídeo isolado pode ser obti-
do, por exemplo, pela expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica o polipeptídeo. x Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo he- terólogo.
Por "polipeptídeo heterólogo" entende-se um polipeptídeo cuja se- quênciade aminoácido não é idêntica àquela de outro polipeptídeo natural- mente expresso na mesma célula hospedeira.
Em particular, um polipepti- deo heterólogo não é idêntico a um ácido nucleico selvagem que é encon- trado na mesma célula hospedeira na natureza.
Como usado neste pedido, um "ácido nucleico" refere-se a dois ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos em forma de fita úni- ca ou dupla.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante.
Por "ácido nucleico recombinante" entende-se um ácido nu- cCleico de interesse que é livre de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes) que, no genoma que ocorre na natureza do organismo do qual o áci- do nucleico de interesse é derivado, flanqueia o ácido nucleico de interesse. | O termo, por isso, inclui, por exemplo, DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma, ou em DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma mo- lécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico, ou um fragmento de cCDNA produzido por PCR ou digestão por endonuclea- se de restrição) independente de outras sequências.
Em várias modalidades, um ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante.
Em algumas modali- dades, um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é operacionalmente ligado a outro ácido nucleico que codifica todo ou uma porção de outro polipeptídeo tal que o ácido nucleico recombinante codifique um polipeptídeo fusão que inclui um polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA e todo ou parte de outro polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo que facilite a purificação ou detecção do polipeptídeo fusão, tal co- mo uma marcação His). Em algumas modalidades, parte ou todo um ácido —nucleico recombinante é quimicamente sintetizado.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico heterólogo.
Por "ácido nucleico heterólogo" entende-se um ácido nucleico cuja sequência de ácido nucleico não é idêntica àquela de outro ácido nucle- ico naturalmente encontrado na mesma célula hospedeira.
Em modalidades particulares, o ácido nucleico inclui um seg- : mento ou sequência de ácido nucleico completa de qualquer ácido nucleico daviadeisopreno sintase, DXS, IDI ou MVA natural. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico inclui pelo menos ou aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA natural. Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações em com- —paração à sequência de um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza). Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações (por e- xemplo, uma mutação silenciosa) que aumentam a transcrição ou tradução c do ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma variante degenerada de qualquer ácido ' nucleico que codifica uma polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, iDI ou MVA.
"Degeneração de códon" refere-se à divergência no código ge- nético que permite a variação da sequência nucleotídica sem afetar a se- quência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. O versado está consciente do "viés do códon" exibido por uma célula hospedeira específica no uso de códons nucleotídicos para especificar um dado aminoácido. Por isso, ao sintetizar um ácido nucleico para expressão melhorada em uma cé- lula hospedeira, é desejável em algumas modalidades desenhar o ácido nu- cleicotalque sua frequência de uso de códon aproxime-se da frequência de uso de códon preferencial da célula hospedeira.
Os números de acesso de polipeptídeos e ácidos nucleicos e- xemplares da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA são listados no Apêndice 1 (os números de acesso do Apêndice 1 e suas sequências cor- respondentes são neste pedido incorporadas por referência em suas totali- dades, particularmente em relação a sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de polipeptídeos e ácidos nucleicos da via de isopreno sintase,
DXS, IDI e/ou MVA). O banco de dados Kegg também contém as sequên- cias de aminoácido e ácidos nucleicos de numerosos polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA (ver, por exemplo, a rede de alcance mundial em "genome.jp/kegg/pathway/map/ map00100.html" e as sequências neste, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação às sequências de aminoácido e ácidos nucleicos de polipeptídeos e ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA). Em algumas mo- dalidades, um ou mais dos polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA têm uma sequência idêntica a uma se- quência publicamente disponível em 12 de dezembro de 2007, tal como qualquer uma das sequências que correspondem a qualquer um dos núme- ros de acesso no Apêndice 1 ou qualquer uma das sequências presentes no 7 banco de dados Kegg. Polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares adicio- naisda via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA são ainda descritos a- ' baixo.
Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos Exemplares de Isopreno Sintase Como observado acima, polipeptídeos isopreno sintase conver- tem dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Polipeptídeos isopreno sinta- se exemplares incluem polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos, peptí- deos e polipeptídeos fusões que têm pelo menos uma atividade de um poli- peptídeo isopreno sintase. Métodos padrão podem ser usados para determi- nar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo isopreno sintase pela medida da capacidade do polipeptídeo converter DMAPP em isopreno in vitro, em um extrato celular, ou in vivo. Em um ensaio exemplar, extratos celulares são preparados pela cultura de uma cepa (por exemplo, cepa de E. colilpTrecKudzu descrita neste pedido) no método de frasco de agitação co- mo descrito no Exemplo 1. Após a indução ser completa, aproximadamente 10 mL de células são precipitados por centrifugação a 7000 x g por 10 minu- toseressuspensos em 5 ml de PEB sem glicerol. As células são lisadas u- sando um French Pressure cell usando procedimentos padrão. Alternativa- mente, as células são tratadas com lisozima (solução de lisozima Ready-
Lyse; EpiCentre) após um congelamento/descongelamento a -80C.
Atividade de polipeptídeo isopreno sintase no extrato celular po- de ser medida, por exemplo, como descrito em Silver et al!., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 e referências neste, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação a ensaios para atividade de polipeptídeo isopreno sintase. DMAPP (Sigma) é evaporado à secura sob uma corrente de nitrogênio e reidratado a uma concentração de 100 mM em tampão fosfato de potássio 100 mM pH 8,2 e armazenado a -20ºC. Para realizar o ensaio, uma solução de 5 ul. de MgClz 1M, DMAPP 1 mM (250 pg/ml), 65 ul de Tampão de Extrato Vegetal (PEB) (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, MgCl 20 MM, glicerol 5% e DTT 2 mM) é adicionada a 25 ul do extrato celular em um frasco de Espaço de cabeça de 20 ml com uma tampa rosqueável metálica e separação de silicone revestida uy com teflon (Agilent Technologies) e cultivada a 37ºC por 15 minutos com agitação. A reação é extinta pela adição de 200 ul de EDTA 250 mM e quantificada por GC/MS como descrito no Exemplo 1, parte |l.
Ácidos nucleicos exemplares de isopreno sintase incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo, fragmento de um polipeptídeo, peptídeo, ou polipeptídeo fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídeo isopreno sintase. Polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares de isopreno sintase incluem polipeptídeos ocorrência natural e ácidos nucle- icos de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido bem como polipeptídeos e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo isopreno sintase ou á- cido nucleico é da família Fabaceae, tal como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou ácido nucleico de isopreno sintase é um polipeptídeo ou ácido nucleico de ocorrência natural de Pueraria mon- tana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, álamo (tal como Populus alba x tremula CAC35696) Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001) aspen (tal como Populus tremuloides) Silver et al., JBC 270 (22): 13010-1316, 1995), ou Carvalho inglês (Quercus robur)
(Zimmer et al., WO 98/02550), que são cada um por meio deste incorpora- dos por referência em suas totalidades, particularmente em relação a ácidos nucleicos de isopreno sintase e a expressão de polipeptídeos isopreno sin- tase. Isopreno sintases adequadas incluem, mas não são limitadas àquelas identificadas por Números de Acesso Genbank. AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, e AY182241, que são cada uma por meio deste in- corporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação a ácidos nucleicos e polipeptídeos sequências de isopreno sintase. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo ou ácido nucleico de isopreno sintase não éum polipeptídeo ou ácido nucleico de ocorrência natural de Quercus robur (isto é, o polipeptídeo ou ácido nucleico de isopreno sintase é um polipeptií- deo isopreno sintase ou ácido nucleico além de um polipeptídeo ou ácido nucleico de ocorrência natural de Quercus robur). Em algumas modalidades, 7 o ácido nucleico ou polipeptídeo isopreno sintase não é um polipeptídeo ou ácido nucleico de ocorrência natural do álamo (tal como Populus alba x tre- ' mula CAC35696).
Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos de DXS Exemplares Como observado acima, polipeptídeos 1-desóxi-D-xilulose-5-fos- fato sintase (DXS) convertem piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-de- sóxi-D-xilulose-5-fosfato. Polipeptíideos DXS exemplares incluem polipepti- deos, fragmentos de polipeptídeos, peptídeos, e polipeptídeos fusões que têm pelo menos uma atividade de um polipeptíideo DXS. Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usados para determi- nar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo DXS pela medida da capacidade do polipeptídeo converter piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato in vitro, em um extrato celular, ou in vivo. Áci- dos nucleicos de DXS exemplares incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo, fragmento de um polipeptídeo, peptídeo, ou polipeptídeo fusão que tem pelo menos uma atividade de um polipeptídeo DXS. Polipep- tídeose ácidos nucleicos de DXS exemplares incluem polipeptídeos e áci- dos nucleicos de ocorrência natural de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido bem como polipeptídeos e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido.
Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos de IDI Exemplares Polipeptídeos isopentenil difosfato isomerase (isopentenil-difos- fato delta-isomerase ou IDI) catalisam a interconversão de isopentenil difos- fato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP) (por exemplo, convertendo IPP em DMAPP e/ou convertendo DMAPP em IPP). Polipeptídeos IDI exemplares incluem polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos, peptídeos, e polipeptí- deos fusões que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídeo IDI.
Mé- todos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo IDI pela medida da capacidade do polipeptídeo interconverter IPP e DMAPP in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
Ácidos nucleicos exemplares de IDI inclu- em ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo, fragmento de um poli- Ss peptídeo, peptídeo, ou polipeptídeo fusão que tem pelo menos uma ativida- dede um polipeptídeo IDI.
Polipeptídeos e ácidos nucleicos de IDI exempla- res incluem polipeptídeos ocorrência natural e ácidos nucleicos de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido bem como polipeptídeos e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido.
Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos Exemplares da Via de MVA Polipeptídeos exemplares da via de MVA incluem polipeptídeos acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídeos 3-hidróxi-3- metilglutari-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídeos 3-hidróxi-3- metilglutaril-CoA reductase (HMG-CoA reductase), polipeptídeos mevalonato quinase(MVK), polipeptídeos fosfomevalonato quinase (PMK), polipeptídeos difosfomevalonato descarboxilase (MVD), polipeptídeos IDI, e polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos fusão) tendo uma atividade de dois ou mais po- lipeptídeos da via de MVA.
Em particular, os polipeptídeos da via de MVA incluem polipeptídeos, fragmentos de polipeptídeos, peptídeos, e polipeptí- deos fusões que têm pelo menos uma atividade de um polipeptídeo da via de MVA.
Ácidos nucleicos exemplares da via de MVA incluem ácidos nuclei- cos que codificam um polipeptídeo, o fragmento de um polipeptídeo, peptí-
deo, ou polipeptídeo fusão que tem pelo menos uma atividade de um poli- peptídeo da via de MVA. Polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares da via de MVA incluem polipeptídeos e ácidos nucleicos de ocorrência natural de qualquer um dos organismos fonte descritos neste pedido bem como poli- peptídeos e ácidos nucleicos mutantes derivados de qualquer um dos orga- nismos fonte descritos neste pedido.
Em particular, polipeptídeos acetil-CoA acetiltransferase (AA- CoA tiolase ou AACT) convertem duas moléculas de acetil-CoA em acetoa- cetil-CoA. Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) po- dem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de poli- peptídeo AA-CoA tiolase pela medida da capacidade do polipeptídeo conver- ter duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
7 Polipeptídeos 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase ou HMGS) convertem acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril- CoA. Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo HMG-C0A sintase pela medida da capacidade do polipeptídeo ao converter acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA in vitro, em um extrato celu- lar,ouinvivo.
Polipeptídeos 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA reductase (HMG-CoA ou HMGR reductase) convertem 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalona- to. Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo —HMG-CoA reductase pela medida da capacidade do polipeptídeo converter 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalonato in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
Polipeptídeos mevalonato quinase (MVK) fosforilam mevalonato para formar mevalonato-5-fosfato. Métodos padrão (tais como aqueles des- critos neste pedido) podem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo MVK pela medida da capacidade do polipepti- deo converter mevalonato em mevalonato-5-fosfato in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
Polipeptídeos fosfomevalonato quinase (PMK) fosforilam meva- lonato-5-fosfato para formar mevalonato-S5-difosfato. Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usados para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptídeo PMK pela medida da capaci- dade do polipeptídeo converter mevalonato-5-fosfato em mevalonato-5- difosfato in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
Polipeptídeos difosfomevalonato decarboxilase (MVD ou DPMDC) convertem mevalonato-S5-difosfato em polipeptídeos isopentenil difosfato (IPP).
Métodos padrão (tais como aqueles descritos neste pedido) podem ser usa- dos para determinar se um polipeptídeo tem atividade de polipeptideo MVD pela medida da capacidade do polipeptídeo converter mevalonato-5-difosfato em IPP in vitro, em um extrato celular, ou in vivo.
” Polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares de IDI são descri- tos acima.
' Métodos Exemplares para Isolamento de Ácidos Nucleicos Ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA podem ser isolados usando métodos padrão. Os métodos de obtenção de ácidos nucleicos desejados de um organismo fonte de interesse (tais como um genoma bacteriano) sejam comuns e bem conhecidos na técnica da bio- logia molecular (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas nele, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação ao isolamento de ácidos nucleicos de interesse). Por exemplo, se a sequência do ácido nucleico é conhecida (tais como qualquer um dos ácidos nucleicos conhecidos descritos neste pedido), bibliotecas genômicas adequadas podem ser criadas por digestão de endonuclease de restrição e podem ser rastreadas com sondas comple- mentares à sequência de ácido nucleico desejada. Uma vez que a sequên- cia é isolada, DNA pode ser amplificado usando os métodos de amplificação direcionados de iniciador padrão, tais como reação de polimerase em cadeia (PCR) (Patente U.S. No. 4.683.202, que é incorporada por referência em sua totalidade, particularmente em relação a métodos de PCR) para obter quan-
tidades de DNA adequado para transformação usando vetores apropriados. Alternativamente, ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA (tais como quaisquer ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA com uma sequência de ácido nucleico conheci- da)podem ser quimicamente sintetizados usando métodos padrão.
Polipeptídeos e ácidos nucleicos adicionais da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA que podem ser adequados para uso nas composi- ções e métodos descritos neste pedido podem ser identificados usando mé- todos padrão. Por exemplo, bibliotecas de cosmídeo de DNA cromossômico de organismos conhecidas por produzir isopreno, naturalmente, podem ser construídas em organismos, tais como E. coli, e então rastreadas para pro- dução de isopreno. Em particular, as bibliotecas de cosmídeo podem ser criadas onde os grandes segmentos de DNA genômico (35 a 45 kb) são em- & pacotados em vetores e usados para transformar hospedeiros apropriados. Vetores cosmidiais são os únicos que são capazes de acomodar grandes quantidades de DNA. Geralmente, vetores cosmidiais têm pelo menos uma cópia da sequência de DNA de cos que é necessária para o empacotamento e circularização subsequente de DNA heterólogo. Além da sequência de cos, estes vetores também contêm uma origem de replicação, tal como Co- IEle marcadores de resistência a fármaco, tais como um ácido nucleico re- sistente à ampicilina ou neomicina. Métodos de uso de vetores cosmidiais para a transformação de hospedeiros bacterianos adequados são bem des- critos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"º Ed,, Cold Spring Harbor, 1989, que é por meio deste incorporado por referência em suatotalidade, particularmente em relação a métodos de transformação. Tipicamente para clonar cosmídeos, DNA heterólogo é isolado usando as endonucleases de restrição apropriadas e ligadas adjacentes à região de cos do vetor cosmidial usando as ligases apropriadas. Vetores cosmidiais contendo DNA heterólogo linearizado então são reagidos com veículo de empacotamento de DNA, tal como bacteriófago. Durante o pro- cesso de embalagem, os sítios de cos são clivados e DNA heterólogo é em- pacotado na porção dianteira da partícula viral bacteriana. Estas partículas então são usadas para transfectar células hospedeiras adequadas, tais co- mo E. coli. Uma vez injetado na célula, DNA heterólogo circulariza sob a in- fluência das extremidades adesivas de cos. Desta maneira, grandes seg- mentos de DNA heterólogo podem ser introduzidos e expressos em células hospedeiras.
Métodos adicionais para obtenção de ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA incluem o rastreamento de uma biblio- teca metagenômica por ensaio (tal como o ensaio de espaço de cabeça descrito neste pedido) ou por PCR usando iniciadores dirigidos contra a co- dificação de nucleotídeos para um comprimento de aminoácidos conserva- dos (por exemplo, pelo menos 3 aminoácidos conservados). Aminoácidos conservados podem ser identificados pelo alinhamento das sequências de aminoácido conhecidas de polipeptídeos da via de isopreno sintase, DXS, % IDI e/ou MVA. Aminoácidos conservados de polipeptídeos isopreno sintase : 15 podem ser identificados com base em sequências alinhadas de polipepti- deos isopreno sintase conhecidos. Um organismo encontrado para produzir isopreno naturalmente pode ser submetido a métodos de purificação protei- ca padrão (que são bem conhecidos na técnica) e o polipeptídeo purificado resultante pode ser sequenciado usando métodos padrão. Outros métodos são encontrados na literatura (ver, por exemplo, Julsing et al., Applied. Mi- crobiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol. 73 (19):6277-83, 2007, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com respeito à identificação de ácidos nucleicos envolvidos na síntese de isopreno).
Adicionalmente, programas de alinhamento de sequência padrão e/ou predição de estrutura podem ser usados para identificar polipeptídeos e ácidos nucleicos adicionais da via de DXS, IDI ou MVA com base na simila- ridade de sua estrutura secundária polipeptídica primária e/ou predita com aquela de polipeptídeos e ácidos nucleicos conhecidos da via de DXS, IDI ouMVA. Bancos de dados padrão, tais como o banco de dados swissprot- trembl (rede de alcance mundial em "expasy.org", Swiss Institute of Bioin- formatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4,
Suíça) também podem ser usados para identificar polipeptídeos e ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA.
A estrutura secundá- ria e/ou terciária de um polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA pode ser predita usando as configurações pré-ajustadas de programas de predição de estrutura padrão, tais como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA). Alternativamente, a estrutura secundária e/ou terciária real de um polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA pode ser determinada usando métodos padrão.
Ácidos nucleicos adicionais da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA também podem ser identificados por hibridização com sondas geradas a partir de ácidos nucleicos conhecidos da via de isopreno sintase, DXS, IDI, ou MVA.
Promotores e Vetores Exemplares Qualquer ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou Rr MVA descrito neste pedido pode estar incluído em um ou mais vetores.
Con- sequentemente, a invenção também caracteriza vetores com mais ácidos | nucleicos que codificam quaisquer polipeptídeos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA que são descritos neste pedido.
Como usado neste pedi- do, um "vetor" significa um construto que é capaz de entrega, e desejavel- mente expressando um ou mais ácidos nucleicos de interesse em uma célu- la hospedeira.
Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a, plas- mídeos, vetores virais, DNA ou vetores de expressão de RNA, cosmídeos e vetores de fago.
Em algumas modalidades, o vetor contém um ácido nuclei- co sob controle de uma sequência controle de expressão.
Como usado neste pedido, uma "sequência controle de expres- são" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico de interesse.
Uma sequência controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível, ou um potencializador.
Um "promotor induzível" é promotor que é ativo sob re- gulação ambiental ou do desenvolvimento.
A sequência controle de expres- sãoé operacionalmente ligada ao segmento ácido nucleico a ser transcrito.
Em algumas modalidades, o vetor contém um marcador seletivo.
O termo "marcador seletivo" refere-se a um ácido nucleico capaz de expres-
são em uma célula hospedeira que facilita a seleção daquelas células hos- pedeiras contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, ácidos nuclei- cos de resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, ampicilina, carbe- nicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina ou clo- ranfenicol) e/ou ácidos nucleicos que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional na célula hospedeira. Marcadores seleti- vos nutricionais exemplares incluem aqueles marcadores conhecidos na técnica como amdS, argB e pyr4. Marcadores úteis em sistemas de vetor para transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (ver, por e- xemplo, Finkelstein, Chapter 6 em Biotechnology of Filamentous Fungi, Fin- kelstein et al., Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; e Kinghorn et al. Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie í Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres, 1992, que são ca- daum por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, par- ticularmente em relação a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, o marcador seletivo é o ácido nucleico de amdS, que codifica a enzima ace- tamidase, permitindo que células transformadas cresçam em acetamida co- mo uma fonte de nitrogênio. O uso de um ácido nucleico de amdS de A. ni- dulanscomo um marcador seletivo é descrito em Kelley et al, EMBO J. 4:475 - 479, 1985 e Penttila et al, Gene 61:155-164, 1987 (que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particular- mente em relação a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA integra-se em um cromossomo das células sem um marcador seletivo.
Vetores adequados são aqueles que são compatíveis com a cé- lula hospedeira empregada. Vetores adequados podem ser derivados, por exemplo, de uma bactéria, um vírus (tal como bacteriófago T7 ou um fago derivado de M-13), um cosmídeo, uma levedura ou uma planta. Protocolos para obtenção e uso de tais vetores são conhecidos por aqueles na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2" ed., Cold Spring Harbor, 1989, que é por meio deste incorporado por re-
ferência em sua totalidade, particularmente em relação ao uso de vetores).
Promotores são bem conhecidos na técnica. Qualquer promotor que funcione na célula hospedeira pode ser usado para expressão de um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, ID! ou MVA na célula hos- pedeira. Regiões controle ou promotoras de iniciação, que são úteis para dirigir a expressão de ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA em várias células hospedeiras são numerosas e familiares para os versados na técnica (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências nele citadas, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação a vetores para expressão de ácidos nucleicos de interesse). Virtualmente, qualquer promotor capaz de direcionar estes ácidos nucleicos é adequado para a presente invenção in- cluindo, mas não limitado a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, - PHOS, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO e TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Píchia); e lac, trp, APx, ' APr, T7, tac, e trc (útil para expressão em E. col).
Em algumas modalidades, um promotor de glicose isomerase é usado (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº 7.132.527 e referências citadas nesta, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação a promotores e sistemas plas- midiais para expressar polipeptídeos de interesse). Mutantes de promotor de glicose isomerase relatados podem ser usados para variar o nível da ex- pressão do polipeptídeo codificado por um ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor de glicose isomerase (Patente U.S. Nº 7.132.527). Em várias modalidades, o promotor de glicose isomerase é contido em um plasmídeo de baixa, média ou alta cópia (Patente U.S. Nº 7.132.527).
Em várias modalidades, um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA é contido em um plasmídeo de baixa cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em aproximadamente 1 a aproxima- damente 4 cópias por célula), plasmídeo de média cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em aproximadamente 10 a aproximadamente 15 cópias por célula), ou plasmídeo de alta cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em aproximadamente 50 ou mais cópias por célula). Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é operacionalmente ligado a um pro- motor T7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endó- geno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA operacionalmente ligado a um promotor T7 está contido em um plasmídeo de média ou alta cópia.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA está operacionalmente ligado a um promotor Trc.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico hete- —rólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA ope- racionalmente ligado a um promotor Trc está contido em um plasmídeo de média ou alta cópia.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA está opera- í cionalmente ligado a um promotor Lac.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI i ou MVA operacionalmente ligado a um promotor Lac está contido em um plasmídeo de baixa cópia.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico hete- rólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA está operacionalmente ligado a um promotor endógeno, tal como um promotor endógeno de Escherichia, Panteoa, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces ou Tri- choderma, ou um promotor endógeno da via de serina protease alcalina, isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA.
Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico heterólogo ou endógeno extra da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA operacionalmente ligado a um promotor endógeno está contido em um plasmídeo de alta cópia.
Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo de replicação que não se integra em um cromossomo nas células.
Em algu- mas modalidades, parte ou todo o vetor integra-se em um cromossomo nas células.
Em algumas modalidades, o vetor é qualquer vetor que quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica é integrado ao genoma de célula hospedeira e é replicado.
Referência é feita a Fungal Genetics Stock Center of Strains (FGSC, rede de alcance mundial em "fgsc.net" e referên-
- 2 54/230 cias citadas neste, que são cada uma por meio deste incorporados por refe- rência em suas totalidades, particularmente em relação a vetores) para uma lista de vetores. Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integra- ção adequados são fornecidos em Sambrook et a/.,, Molecular Cloning: À Laboratory Manual, 2" ed., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section
7.7.18); van den Hondel em Bennett and Lasure (Eds). More Gene Manipula- tions in Fungi, Academic Press, pp. 396-428, 1991; e Patente U.S. No.
5.874.276, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em relação a vetores. Vetores particular mente úteis incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 e pENTR/D. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA está operacionalmente ligado a um promotor ade- x quado que mostra atividade transcricional em uma célula hospedeira fúngi- ca.O promotor pode ser derivado de um ou mais ácidos nucleicos que codi- i ficam um polipeptídeo que é endógeno ou heterólogo à célula hospedeira. Em algumas modalidades, o promotor é útil em um hospedeiro Trichoderma. Exemplos não limitantes adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, e- gl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1 e amy. Em algumas modalidades, o promo- toré aquele que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades quando 7. reesei é o hospedeiro, o promotor é nativo de T. re- esei. Em algumas modalidades, o promotor é cbh1 de T. reesei, que é um promotor induzível e foi depositado no GenBank sob No. de Acesso D86235, que é incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em rela- çãoa promotores. Em algumas modalidades, o promotor é aquele que é he- terólogo à célula hospedeira fúngica. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores dos genes de glicoamilase de A. awamori e de A. niger (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al, EMBO J. 3:1581-1585, 1984, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em relação a promotores); alfa amilases de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, xln1 de T. reesei e celobiohidrolase 1 de T. reesei (EP 137280, que é incorporada por referência em sua totalidade, particularmente em relação a promotores).
Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de terminação. Regiões controle de terminação também po- dem ser derivadas de vários genes nativos à célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência de terminação e a sequência promotora são deri- vadas da mesma fonte. Em outra modalidade, a sequência de terminação é endógena à célula hospedeira. Uma sequência terminadora particularmente é adequada é cbh1 derivada de uma cepa de Trichoderma (tal como T. ree- ; sei). Outros terminadores fúngicos úteis incluem o terminador de um ácido | 10 —nucleico de glicoamilase de A. niger ou A. awamori (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; que são h cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em relação a terminadores fúngicos). Opcionalmente, um - sítio de terminação pode estar incluído. Para expressão eficaz dos polipeptí- deos, o DNA que codifica o polipeptídeo é operacionalmente ligado por có- dons de iniciação a regiões controle de expressão selecionadas tal que a expressão resulte na formação do RNA mensageiro apropriado.
Em algumas modalidades, o promotor, região de codificação e terminador, todos originam-se do ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS,IDIouMVA a ser expresso. Em algumas modalidades, a região de co- dificação de um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é inserida em um vetor de expressão de uso geral tal que esteja sob controle transcricional de sequências promotoras de construto de expressão e termi- nadoras. Em algumas modalidades, os genes ou parte deles são inseridos a jusantedo promotor cbh1 forte.
Um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA pode ser incorporado em um vetor, tal como um vetor de expressão, usando técnicas padrão (Sambrook et a/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação ao rastreamento de sequên- cias de DNA apropriadas e a construção de vetores). Métodos usados para ligar o construto de DNA compreendendo um ácido nucleico de interesse (tal s "* 56/230 como um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA), um promotor, e outras sequências terminadoras e para inseri-los em um vetor adequado são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, enzimas de restri- ção podem ser usadas para clivar o ácido nucleico e o vetor da via de iso- preno sintase, DXS, ID! ou MVA. Então, as extremidades compatíveis de ácido nucleico clivado da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA e o vetor clivado podem ser ligadas. A ligação é geralmente realizada pela ligação em ' sítios de restrição adequados. Se tais sítios não existirem, os ligantes oligo- - nucleotídicos sintéticos são usados conforme a prática convencional (ver, p 10 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"º ed., Cold S- pring Harbor, 1989, e Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fun- gi, Academic Press, San Diego, pp. 70-76, 1991, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em - relação a ligantes oligonucleotídicos). Adicionalmente, vetores podem ser construídos usando técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, i Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
Em algumas modalidades, pode ser desejável superexpressar ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI, ou MVA em níveis muito mais altos do que atualmente encontrados em células de ocorrência natural. Este resultado pode ser realizado pela clonagem seletiva dos ácidos nucleicos que codificam aqueles polipeptídeos em plasmídeos multicópia ou colocando aqueles ácidos nucleicos sob um promotor induzível ou constituti- vo forte. Métodos para super-expressar polipeptídeos desejados são comuns e bem conhecidos na técnica da biologia molecular e exemplos podem ser encontrados em Sambrook et a/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2" ed., Cold Spring Harbor, 1989, que é por meio deste incorporado por re- ferência em sua totalidade, particularmente em relação a técnicas de clona- gem.
Os recursos seguintes incluem descrições de metodologia geral — adicional útil conforme a invenção: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 e Ausubel et a/., Eds. Current Protocols in Mole- cular Biology, 1994, que são cada um por meio deste incorporados por refe-
. à 57/230 rência em suas totalidades, particularmente com respeito à biologia molecu- lar e técnicas de clonagem.
Organismos Fonte Exemplares Ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA (e seus polipeptídeos codificados) podem ser obtidos de qualquer organismo que naturalmente contenha ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA.
Como observado acima, o isopreno é formado natural- ' mente por uma variedade de organismos, tais como bactérias, levedura, . plantas e animais.
Organismos contêm a via de MVA, via de DXP, ou ambas " 10 asviasde MVA e DXP para produzir o isopreno figura 19). Dessa forma, ácidos nucleicos de DXS podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer or- É ganismo que contenha a via de DXP ou contenha ambas as vias de MVA e DXP.
Ácidos nucleicos de IDI e isopreno sintase podem ser obtidos, por e- 7 xemplo, de qualquer organismo que contenha a via de MVA, via de DXP, ou ambas as vias de MVA e DXP.
Ácidos nucleicos da via de MVA podem ser ' obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contenha a via de MVA ou contém ambas as vias de MVA e DXP.
Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é idêntica à sequência de um ácido —nucleico que é produzido por alguns dos seguintes organismos na natureza.
Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido da polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é idêntica à sequência de um poli- peptídeo que é produzida por qualquer um dos seguintes organismos na na- tureza.
Em algumas modalidades, ácido nucleico ou polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA é um ácido nucleico ou polipeptídeo mu- tante derivado de alguns dos organismos descritos neste pedido.
Como usa- do neste pedido, "derivado de" refere-se à fonte do ácido nucleico ou poli- peptídeo no qual uma ou mais mutações são introduzidas.
Por exemplo, um polipeptídeo que é "derivado de um polipeptídeo vegetal" refere-se ao poli- peptídeo interesse que resulta da introdução de uma ou mais mutações na sequência de um polipeptídeo vegetal selvagem (isto é, uma sequência que ocorre na natureza).
í ' 58/230
Em algumas modalidades, o organismo fonte é um fungo, exem- plos do qual são espécies de Aspergillus, tal como A. oryzae e A. niger, es- pécies de Saccharomyces, tal como S. cerevisiae, espécies de Schizosac- charomyces, tal como S. pombe, e espécies de Trichoderma, tal como T. reesei Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma célula fúngica filamentosa.
O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas fila- mentosas da subdivisão Eumycotina (ver, Alexopoulos, C.
J. (1962), Intro- í ductory Micology, Wiley, New York). Estes fungos são caracterizados por um - micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose e ' 10 outros polissacarídeos complexos.
Os fungos filamentosos são morfologica- mente, fisiologicamente e geneticamente distintos de leveduras.
O cresci- i mento vegetativo por fungos filamentosos é através do alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é aeróbico obrigatório.
A célula parental fúngica 7 filamentosa pode ser uma célula de uma espécie de, mas não limitada a, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei, o morfo assexuado de Hy- ' pocrea jecorina, anteriormente classificado como T. longibrachiatum, Tricho- derma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl.
Microbiol.
Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765 e ATCC No. 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. lanu- ginose ou H. grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gli- ocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A. sojae, A. japonicus, A. nidulans ou A. awamori) (Ward et al., Appl.
Microbiol.
Biotech- nol. 39: 7380743, 1993 e Goedegebuur et a/., Genet 41: 89-98, 2002), Fusa- rium sp., (por exemplo, F. roseum, F. graminum, F. cerealis, F. oxysporuim oufF.venenatum), Neurospora sp., (por exemplo, N. crassa), Hypocrea Sp., Mucor sp., (por exemplo, M. miehei), Rhizopus sp. e Emerícella sp. (ver tam- bém, Innis et al., Sci. 228: 21-26, 1985). O termo "Trichoderma" ou "Tricho- derma sp." ou "Trichoderma spp." refere-se a qualquer gênero fúngico ante-
riormente ou atualmente classificado como Trichoderma.
Em algumas modalidades, o fungo é A. nidulans, A. avamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. víride, F. oxysporum ou F. solani.
Cepas de Aspergillus são reveladas em Ward et al., Appl.
Mi-
7 . 59/230 crobiol. Biotechnol. 39:738-/43, 1993 e Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, os quais são cada um por meio deste incorporados por refe- rência em suas totalidades, particularmente em relação a fungos. Em moda- lidades particulares, o fungo é uma cepa de Trichoderma, tal como uma ce- padelT. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não limitan- tes incluem ATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767 e NRRL 15709, que são cada um por meio ' deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em - relação a cepas de T. reesei. Em algumas modalidades, a cepa hospedeira p 10 é um derivado de RL-P37. RL-P37 é revelado em Sheir-Neiss et a/., Appl. ' Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984, que é por meio deste incorporado S por referência em sua totalidade, particularmente em relação a cepas de T.
reesei. 7 Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma levedura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. ou Candida ' Sp.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria, tal como cepas de Bacillus, tais como B. lichenformis ou B. subtilis, cepas de Pantoea, tais como P. citrea, cepas de Pseudomonas, tais como P. alcalige- nes, cepas de Streptomyces, tais como S. lividans ou S. rubiginosus, ou ce- pas de Escherichia, tais como E. coli.
Como usado neste pedido, "gênero Bacillus" inclui todas as es- pécies dentro do gênero "Bacillus," como conhecidas por aqueles versados na técnica incluindo, mas não limitadas a B. subtilis, B. licheniformis, B. len- tus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lau- tus e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua sofren- do reorganização taxonômica. Dessa forma, entende-se que o gênero inclui espécies que foram reclassificadas incluindo, mas não limitadas a tais orga- nismos como B. stearothermophilus, que é denominado agora "Geobacillus stearothermophilus." A produção de endosporos resistentes na presença de oxigênio é considerada a característica de definição do gênero Bacillus, em-
É a Y r 60/230 bora esta característica também se aplique ao recentemente denominado Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermo- bacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria gram-positiva. Exemplos não limitantes incluem cepas de Streptomyces (por exemplo, S. lividans, S. coelicolor ou S. griseus) e Bacillus. Em algumas mo- dalidades, o organismo fonte é uma bactéria gram-negativa, tal como E. coli ou Pseudomonas sp.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma planta, tal como uma planta da família Fabaceae, tal como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o organismo fonte é kudzu, álamo (tal como Populus alba x tremula CAC35696), aspen (tal como Populus tremuloides) ou Quer- c cus robur.
Em algumas modalidades, os organismos fonte são algas, tais como algas verdes, algas vermelhas, glaucófitos, cloraracniófitos, euglení- deos, cromista ou dinoflagelados.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma cianobacté- ria, tal como cianobactéria classificada em qualquer um dos seguintes gru- poscom base na morfologia: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales ou Stigonematales.
Células hospedeiras Exemplares Uma variedade de células hospedeiras pode ser usada para ex- pressar polipeptídeos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA e pro- duzirisopreno nos métodos da invenção reivindicada. Células hospedeiras exemplares incluem células de qualquer um dos organismos listados na se- ção anterior sob o título "Organismos Fonte Exemplares." A célula hospedei- ra pode ser uma célula que naturalmente produz isopreno ou uma célula que não produz isopreno naturalmente. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira naturalmente produz isopreno usando a via de DXP, e um ácido nu- cleico de isopreno sintase, DXS e/ou IDI é adicionado para aumentar a pro- dução de isopreno usando esta via. Em algumas modalidades, a célula hos-
pedeira naturalmente produz o isopreno usando a via de MVA, e uma iso- preno sintase e/ou um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA são adicio- nados para aumentar a produção de isopreno usando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira naturalmente produz o isopreno usando a viaDXPeumou mais ácidos nucleicos da via de MVA são adicionados para produzir isopreno usando parte ou toda a via de MVA bem como a via DXP. Em algumas modalidades, a célula hospedeira naturalmente produz o iso- preno usando tanto o DXP como vias MVA e um ou mais ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA são adicionados para aumentar aprodução de isopreno por uma ou ambas as vias.
Métodos de Transformação Exemplares Ácidos nucleicos da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA ou vetores que os contêm podem ser inseridos em uma célula hospedeira 7 (por exemplo, uma célula vegetal, uma célula fúngica, uma célula de levedu- raou uma célula bacteriana descrita neste pedido) usando técnicas padrão : para expressão de polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA codificado. A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas, tais como transforma- ção, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por e- xemplo, lipofecção mediada ou transfecção mediada por DEAE-dextrina ou transfecção usando um vírus de fago recombinante), incubação com DNA por fosfato de cálcio precipitado, bombardeio de alta velocidade com micro- projéteis recobertos com DNA e fusão de protoplasto. Técnicas de transfor- mação gerais são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Current Proto- colsin Molecular Biology (F. M. Ausubel ef a/. (eds) Chapter 9, 1987; Sam- brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2" ed. Cold Spring Harbor, 1989; e Campbell et a/., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particu- larmente em relação a métodos de transformação). A expressão do polipep- tídeo heterólogo em Trichoderma é descrita na Patente U.S. No. 6.022.725; Patente U.S. Nº 6.268.328; Patente U.S. Nº 7.262.041; WO 2005/001036; Harkki et al.; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio.
Techno! 7:596-603, 1989; EP 244.234; EP 215.594; e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," em Industrial Molecular Micol- ogy, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc, NY pp. 129-148, 1992, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalida- des, particularmente em relação a transformação e métodos de expressão). Referência também é feita a Cao et al., (Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023; e Yelton et al., Proceedings Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalida- des, particularmente em relação a métodos de transformação) para trans- formação de cepas de Aspergillus. Os ácidos nucleicos introduzidos podem estar integrados em DNA cromossômico ou mantidos como sequências de replicação extracromossômica.
: Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para se- lecionar transformantes. Em um exemplo não limitante, transformantes está- Ú veis incluindo um marcador amdS são distinguidos de transformantes instá- veis por sua taxa de crescimento mais rápida e a formação de colônias circu- lares com um traçado liso, em vez de irregular em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos um teste da estabili- dade adicional é conduzido pela cultura dos transformantes em um meio só- lido não seletivo (por exemplo, um meio sem acetamida), coleta dos esporos deste meio de cultura, e determinação da porcentagem destes esporos que posteriormente germinam e crescem em meios seletivos contendo acetami- da.
Em algumas modalidades, células fúngicas são transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto e transformação dos protoplastos seguidos pela regeneração da parede celular de uma maneira conhecida. Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma Sp. para transformação envolve a preparação de protoplastos de micélio fúngico (ver, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que é incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a métodos de transformação). Em algumas modalidades, o micélio é obtido de esporos vegetativos germinados. O micélio é tratado com uma enzima que digere a parede celular resultando em protoplastos. Os protoplastos então são prote- gidos pela presença de um estabilizador osmótico no meio de suspensão. Estes estabilizadores incluem sorbitol, manitol, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e similares. Normalmente a concentração destes estabilizado- res varia entre 0,8 M e 1,2 M. É desejável usar uma solução de aproxima- damente 1,2 M de sorbitol no meio de suspensão. Absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. de- pende da concentração de íon cálcio. Geralmente, entre aproximadamente CaCl)10mM e CaCl; 50 mM é usado em uma solução de absorção. Além do íon cálcio na solução de absorção, outros compostos geralmente incluí- dos são um sistema de tamponamento, tal como tampão TE (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM) ou MOPS 10 mM, tampão pH 6,0 (ácido morfolinopropa- 1 nossuifônico) e polietilenoglicol (PEG). Não pretendendo estar ligado a ne-
15. nhuma teoria particular, acredita-se que o polietilenoglicol atue fundindo as : membranas celulares, dessa forma permitindo os conteúdos do meio serem entregues no citoplasma da cepa de Trichoderma sp. e DNA plasmidial a ser transferido para o núcleo. Esta fusão frequentemente deixa múltiplas cópias de DNA plasmidial integradas no cromossomo hospedeiro.
Normalmente, uma suspensão contendo protoplastos ou células de Trichoderma sp. que foram submetidos a um tratamento de permeabili- dade em uma densidade de 10º a 10'/mL (tal como 2 x 10º/mL) é usada na transformação. Um volume de 100 uL destes protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo, sorbitol 1,2 M e CaCl; 50 mM) é mis- turado com DNA desejado. Geralmente, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplasto. Em algumas modalidades, aproximadamente 0,25 volume são adicionados à suspensão de protoplasto. Aditivos, tais como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de po- tássioe similares também podem ser adicionados à solução de absorção e auxiliar na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas (ver, por exemplo, Patentes U.S.s Nº
6.022.725 e 6.268.328, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação a métodos de transformação).
Geralmente, a mistura então é cultivada a aproximadamente 0ºC porum período entre 10 e 30 minutos. PEG adicional então é adicionado à mistura para aumentar adicionalmente a absorção da sequência de ácido nucleico desejada. PEG 4000 25% é geralmente adicionado em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transformação; entretanto, volumes maiores e menores podem ser adequados. PEG 4000 25% é desejavelmen- te aproximadamente 10 vezes o volume da mistura de transformação. Após PEG ser adicionado, a mistura de transformação então é cultivada à tempe- ratura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e CaCb. A suspensão de protoplasto então é ainda adicionada a alíquotas & fundidas de um meio de crescimento. Quando o meio de crescimento inclui uma seleção de crescimento (por exemplo, acetamida ou um antibiótico), ela permite somente o crescimento de transformantes.
A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, como descrito em Sam- brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a métodos de transformação. Meios de Cultura Celular Exemplares A invenção também inclui uma célula ou uma população de célu- las em cultura que produz isopreno. Por "células em cultura" entendem-se duas ou mais células em uma solução (por exemplo, um meio celular) que permite às células sofrer uma ou mais divisões celulares. "Células em cultu- ra" não incluem células vegetais que são parte de uma planta multicelular viva, contendo células que se diferenciaram em tecidos vegetais. Em várias modalidades, a cultura celular inclui pelo menos ou aproximadamente 10, 20,50,100,200, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais células.
Qualquer fonte de carbono pode ser usada para cultivar as célu- las hospedeiras. O termo "fonte de carbono" refere-se a um ou mais com-
postos contendo carbono capazes de serem metabolizados por uma célula ou organismo hospedeiro. Por exemplo, o meio celular usado para cultivar as células hospedeiras pode incluir qualquer fonte de carbono adequada para manter a viabilidade ou crescimento das células hospedeiras.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um carboidrato (tal como monossacarídeo, dissacarídeo, oligossacarídeo ou polissacari- deos), açúcar invertido (por exemplo, xarope de sacarose enzimaticamente tratado), glicerol, glicerina (por exemplo, um subproduto de glicerina de um biodiesel ou processo de produção de sabão), di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo (por exemplo, uma planta ou óleo vegetal, tal como óleo de milho, palma ou soja), gordura animal, óleo animal, ácido graxo (por exem- plo, um ácido graxo saturado, ácido graxo não saturado ou ácido graxo poli- insaturado), lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, 7 triglicerídeo, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína ou peptídeo microbia- no ou vegetal), fonte de carbono renovável (por exemplo, uma fonte de car- bono de biomassa, tal como uma fonte de carbono de biomassa hidrolisada), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, polímero, ácido, álcoois, aldeído, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas moda- lidades,afonte de carbono é um produto de fotossíntese, incluindo, mas não limitada a, glicose.
Monossacarídeos exemplares incluem glicose e frutose; oligos- sacarídeos exemplares incluem lactose e sacarose, e polissacarídeos e- xemplares incluem amido e celulose. Carboidratos exemplares incluem açú- cares C6 (por exemplo, frutose, manose, galactose ou glicose) e açúcares C5 (por exemplo, xilose ou arabinose). Em algumas modalidades, o meio celular inclui um carboidrato bem como uma fonte de carbono além de um carboidrato (por exemplo, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável ou um componente de um extrato de levedura). Em algumas mo- dalidades, o meio celular inclui um carboidrato bem como um polipeptídeo
(por exemplo, uma proteína ou peptídeo microbiano ou vegetal). Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo microbiano é um polipeptídeo de levedura ou bactérias. Em algumas modalidades, o polipeptídeo vegetal é um polipep- tídeo de soja, milho, canola, jatrofa, palma, amendoim, girassol, coco, mos- tarda, colza, semente de algodão, palmiste, azeitona, cártamo, sésamo ou linhaça.
Em algumas modalidades, a concentração de carboidrato é pelo menos ou aproximadamente 5 gramas por litro de caldo (g/L, em que o vo- lume do caldo inclui tanto o volume do meio celular como o volume das célu- las), tal como pelo menos ou aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 g/L ou mais. Em algumas modalidades, a con- centração de carboidrato está entre aproximadamente 50 e aproximadamen- te 400 g/L, tal como entre aproximadamente 100 e aproximadamente 360 E g/L, entre aproximadamente 120 e aproximadamente 360 g/L, ou entre apro- ximadamente 200 e aproximadamente 300 g/L. Em algumas modalidades, á esta concentração de carboidrato inclui a quantidade total de carboidrato que é adicionado antes e/ou durante a cultura das células hospedeiras.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condi- ções de glicose limitada. Por "condições de glicose limitada" entende-se que a quantidade de glicose que é adicionada é menor ou aproximadamente 105% (tal como aproximadamente 100%) da quantidade de glicose que é consumida pelas células. Em modalidades particulares, a quantidade de gli- cose que é adicionada ao meio de cultura é aproximadamente a mesma que a quantidade de glicose que é consumida pelas células durante um período detempo específico. Em algumas modalidades, a taxa de crescimento celu- lar é controlada pela limitação da quantidade de glicose adicionada tal que as células cresçam na taxa que possa ser suportada pela quantidade de gli- cose no meio celular. Em algumas modalidades, a glicose não se acumula durante o tempo em que as células são cultivadas. Em várias modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada por aproxima- damente 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou 70 ou mais horas. Em várias modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada por ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 100% ou mais do período de tempo total que as células são culti- vadas. Não pretendendo estar ligado a nenhuma teoria particular, acredita- se que condições de glicose limitada possam permitir regulação mais favo- ráveldas células.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença de um excesso de glicose. Em modalidades particulares, a quantidade de glicose que é adicionada é maior do que aproximadamente 105% (tal como aproximadamente ou mais que 110, 120, 150, 175, 200, 250, 300, 400 ou 500%) ou mais da quantidade de glicose que é consumida pelas células du- rante um período de tempo específico. Em algumas modalidades, glicose acumula-se durante o tempo em que as células são cultivadas.
Lipídios exemplares são quaisquer substâncias contendo um ou : mais ácidos graxos que sejam ácidos graxos C4 e acima sendo saturados, não saturados ou ramificados.
í Óleos exemplares são lipídios que são líquidos à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o lipídio contém um ou mais ácidos graxos C4 ou acima (por exemplo, contém um ou mais ácidos graxos satu- rados, não saturados, ou ramificados com quatro ou mais carbonos). Em algumas modalidades, o óleo é obtido de soja, milho, canola, jatrofa, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, semente de algodão, palmiste, azeitona, cártamo, sésamo, linhaça, células microbianas oleaginosas, pau de sebo ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes.
Ácidos graxos exemplares incluem compostos de fórmula RCO- OH, onde"R"é um hidrocarboneto. Ácidos graxos não saturados exempla- res incluem compostos onde "R" inclui pelo menos uma ligação dupla carbo- no-carbono. Ácidos graxos não saturados exemplares incluem, mas não são limitados a, ácido oleico, ácido vacênico, ácido linoleico, ácido palmitelaídico e ácido araquidônico. Ácidos graxos poli-insaturados exemplares incluem compostos onde "R" inclui uma pluralidade de ligações duplas carbono- carbono. Ácidos graxos saturados exemplares incluem compostos onde "R" é um grupo alifático saturado. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui um ou mais ácidos graxos C12-C>7, tais como um ácido graxo saturado Ci12, um ácido graxo saturado Ci4, um ácido graxo saturado Cie, um ácido graxo saturado C18, um ácido graxo saturado C2x9 ou um ácido graxo satura- do C22. Em uma modalidade exemplar, o ácido graxo é ácido palmítico. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um sal de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo não saturado), um derivado de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo não saturado), ou um sal de um derivado de ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo não saturado). Sais adequados incluem, mas não são limitados a, sais de lítio, sais de potássio, sais de sódio e simi- lares. Di- e trigliceróis são ésteres de ácido graxo de glicerol.
Em algumas modalidades, a concentração de lipídio, óleo, gor- dura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo ou triglicerídeo é pelo menos ou aproximadamente 1 grama por litro de caldo (g/L, em que o volume do 1 caldo inclui tanto o volume do meio celular como o volume das células), tal como pelomenos ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, ' 150, 200, 300, 400 g/L ou mais. Em algumas modalidades, a concentração de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou trigli- cerídeo está entre aproximadamente 10 e aproximadamente 400 g/L, tal co- mo entre aproximadamente 25 e aproximadamente 300 g/L, entre aproxima- damente 60 e aproximadamente 180 g/L, ou entre aproximadamente 75 e aproximadamente 150 g/L. Em algumas modalidades, a concentração inclui a quantidade total de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, di- glicerídeo ou triglicerídeo que é adicionado antes e/ou durante a cultura das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui tanto (i) um lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo quanto (ii) um carboidrato, tal como glicose. Em algumas modalidades, a proporção de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglice- rídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo por carboidrato é aproximadamente 1:1 em uma base de carbono (isto é, um carbono em lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo ou triglicerídeo por carbono de carboidra- to). Em modalidades particulares, a quantidade de lipídio, óleo, gordura, áci- do graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo está entre aproxima-
damente 60 e 180 g/L, e a quantidade do carboidrato está entre aproxima- Ú damente 120 e 360 g/L.
Fontes de carbono de polipeptídeo microbianos exemplares in- a cluem um ou mais polipeptídeos de levedura ou bactérias. Fontes de carbo- —node polipeptídeo vegetal exemplares incluem um ou mais polipeptídeos de soja, milho, canola, jatrofa, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, col- za, semente de algodão, palmiste, azeitona, cártamo, sésamo ou linhaça. Fontes de carbono renováveis exemplares incluem permeado de soro de queijo, água de maceração de milho, melaço de beterraba, malte de cevadae componentes de qualquer um dos precedentes. Fontes de carbono renováveis exemplares também incluem glicose, hexose, pentose e xilose presentes em biomassa, tal como milho, switchgrass, cana-de-açúcar, resi- duos celulares de processos de fermentação e subproduto proteico da moa- 7 gem de soja, milho ou trigo. Em algumas modalidades, a fonte de carbono de biomassa é um material lignocelulósico, hemicelulósico ou celulósico tal ' como, mas não é limitado a, uma gramínea, trigo, palha de trigo, bagaço, bagaço de cana de açúcar, polpa de madeira mole, milho, espiga ou casca de milho, semente de milho, fibra de sementes de milho, palha de milho, Sswitchgrass, produto de casca de arroz, ou um subproduto da moagem úmi- da ou seca de grãos (por exemplo, milho, sorgo, centeio, triticato, cevada, trigo e/ou grãos de destilaria). Materiais celulósicos exemplares incluem re- síduos de madeira, papel e polpa, ervas e polpa de fruta. Em algumas moda- lidades, a fonte de carbono inclui qualquer parte vegetal, tal como troncos, grãos, raízes ou tubérculos. Em algumas modalidades, toda ou parte de al- guma das seguintes plantas é usada como uma fonte de carbono: milho, trigo, centeio, sorgo, triticate, arroz, painço, cevada, mandioca, legumes, tais como feijões e ervilhas, batatas, batatas-doce, bananas, cana-de-açúcar e/ou tapioca. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um hidrolisado de biomassa, tal como um hidrolisado de biomassa que inclui tanto xilose comoglicose ou que inclui tanto sacarose como glicose.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tal co- mo biomassa) é pré-tratada antes que seja adicionada ao meio de cultura celular.
Em algumas modalidades, o pré-tratamento inclui pré-tratamento : enzimático, pré-tratamento químico ou uma combinação tanto do pré- tratamento enzimático como químico (ver, por exemplo, Farzaneh et al., Bio- ' resource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; Patente U.S.
Nº 6.176.176; Patente U.S.
Nº 6.106.888; que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação ao pré- tratamento de fontes de carbono renováveis). Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável é parcialmente ou completamente hidrolisada antes que seja adicionada ao meio de cultura celular.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tal co- mo palha de milho) sofre pré-tratamento de expansão de fibra com amônia (AFEX) antes que seja adicionada ao meio de cultura celular (ver, por exem- plo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005). Du- :- rante o pré-tratamento de AFEX, uma fonte de carbono renovável é tratada com amônia anidra líquida em temperaturas moderadas (tais como aproxi- É madamente 60 a aproximadamente 100ºC) e alta pressão (tais como apro- ximadamente 1723,69 kPa a aproximadamente 2068,43 kPa) por aproxima- damente 5 minutos.
Então, a pressão é rapidamente liberada.
Neste proces- so, os efeitos químicos e físicos combinados de solubilização de lignina, hi- drólisede hemicelulose, descristalização de celulose e área superficial au- mentada permitem conversão enzimática próxima à completa de celulose e hemicelulose a açúcares fermentáveis.
O pré-tratamento de AFEX tem a vantagem que quase toda da amônia pode ser recuperada e reutilizada, en- quanto o resto serve como fonte de nitrogênio para micróbios em processos a jusante.
Além disso, uma corrente de lavagem não é necessária para o pré-tratamento de AFEX.
Dessa forma, a recuperação de matéria seca após tratamento de AFEX é essencialmente 100%. AFEX é basicamente um pro- cesso seco-seco.
A fonte de carbono renovável tratada é estável por perío- dos longos e pode ser alimentada em cargas sólidas muito altas em hidrólise enzimática ou processos de fermentação.
Celulose e hemicelulose são bem conservadas no processo de AFEX, com pouca ou nenhuma degradação.
Não há nenhuma necessidade da neutralização antes da hidrólise enzimáti-
ca de uma fonte de carbono renovável que sofreu pré-tratamento de AFEX. À Hidrólise enzimática de fontes de carbono tratadas com AFEX produz cor- rentes de açúcar limpas para uso em fermentação subsequente. ' Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (porexemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a pelo menos ou aproximadamente glicose 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50% (p/v). A quantidade equivalente de glicose pode ser determinada usan- do métodos de HPLC padrão com glicose como uma referência para medir a quantidade de glicose gerada a partir da fonte de carbono. Em algumas mo- dalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente entre aproximadamente glicose 0,1 e a- proximadamente 20%, tal como entre aproximadamente glicose 0,1 e apro- ximadamente 10%, entre aproximadamente glicose 0,5 e aproximadamente : 10%, entre aproximadamente glicose 1 e aproximadamente 10%, entre a- proximadamente glicose 1 e aproximadamente 5%, ou entre aproximada- mente glicose 1 e aproximadamente 2%.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui extrato de levedura ou um ou mais componentes do extrato de levedura. Em algumas modalidades, a concentração do extrato de levedura é pelo menos 1 grama doextratode levedura por litro de caldo (g/L, em que o volume do caldo in- clui tanto o volume do meio celular como o volume das células), pelo menos ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300 g/L ou mais. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura está entre aproximadamente 1 e aproximadamente 300 g/L, tal como entre aproximadamente 1 e aproximadamente 200 g/L, entre aproximadamente 5 e aproximadamente 200 g/L, entre aproximadamente 5 e aproximadamente 100 g/L, ou entre aproximadamente 5 e aproximadamente 60 g/L. Em algu- mas modalidades, a concentração inclui a quantidade total de extrato de le- vedura que é adicionado antes e/ou durante a cultura das células hospedei- ras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui tanto extrato de le- vedura (ou um ou mais componentes do mesmo) como outra fonte de car- bono, tais como glicose. Em algumas modalidades, a proporção do extrato de levedura para outra fonte de carbono é aproximadamente 1:5, aproxima- B damente 1:10 ou aproximadamente 1:20 (p/p). Adicionalmente a fonte de carbono também pode ser substratos ] de um carbono, tais como dióxido de carbono ou metanol. A produção de glicerola partir de fontes de carbono único (por exemplo, metanol, formalde- ido ou formato) foi relatada em leveduras metilotróficas (Yamada et al., A- gric. Biol. Chem., 53 (2) 541-543, 1989, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a fontes de carbono) e em bactérias (Hunter et. al., Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, queé por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particu- larmente em relação a fontes de carbono). Estes organismos podem assimi- lar compostos de carbono único, que variam no estado de oxidação de me- tano a formato, e produzir glicerol. A via de assimilação de carbono pode ser 7 através de monofosfato ribulose, através de serina ou através de xilulose- monofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer- ' Verlag: New York, 1986, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a fontes de carbono). A via de monofosfato ribulose envolve a condensação de formato com ribulose-5- fosfato para formar um açúcar de seis carbonos que se transforma em fruto- see consequentemente o produto de três carbonos gliceraldeído-3-fosfato. Do mesmo modo, a via de serina assimila o composto de um carbono na via glicolítica através de metilenotetra-hidrofolato. Além de um e dois substratos de carbono, também é conhecido que organismos metilotróficos utilizam diversos outros compostos contendo carbono, tais como metilamina, glucosamina e uma variedade de aminoáci- dos para atividade metabólica. Por exemplo, leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono da metilamina para formar trehalose ou glicerol (Bellion et al., Microb. Growth CI Compad,, [Int. Symp.], 7"? ed., 415-
32. Editors: Murrell ef a/., Publisher: Intercept, Andover, Reuno Unido, 1993, queé por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particu- larmente em relação a fontes de carbono). Similarmente várias espécies de Candida metabolizam alanina ou ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol.
153 (5), 485-9, 1990, que é por meio deste incorporado por referência em ' sua totalidade, particularmente em relação a fontes de carbono). Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio : padrão contendo sais fisiológicos e nutrientes (ver, por exemplo, Pourquie, J. etal,Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al, Academic Press, pp. 71-86, 1988 e llmen et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, que são cada um por meio deste incorporados por refe- rência em suas totalidades, particularmente em relação a meios celulares). Meios de crescimento exemplares são meios comuns comercialmente pre- parados, tais como caldo Luria Bertani (LB), caldo Dextrose Sabouraud (SD), ou caldo de meio de Levedura (YM). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio apropriado para cresci- mento de células hospedeiras particulares é conhecido por um versado na e técnica da ciência de fermentação ou microbiologia.
Além de uma fonte de carbono apropriada, o meio celular dese- í javelmente contém minerais, sais, cofatores, tampões e outros componen- tes adequados conhecidos pelos versados na técnica adequados para o crescimento das culturas ou para o aumento da produção de isopreno (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas nestes e WO 96/35796 e referências citadas neste, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente em relação a meios celu- lares e condições de cultura celular). Em algumas modalidades, onde um ácido nucleico da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA está sob con- trole de um promotor induzível, agente de indução (por exemplo, um açúcar, sal metálico ou antimicrobiano), é desejavelmente adicionado ao meio em uma concentração eficaz para induzir a expressão de um polipeptídeo da via de isopreno sintase, DXS, IDI e/ou MVA. Em algumas modalidades, o meio celular tem um antibiótico (tal como canamicina) que corresponde ao ácido nucleico de resistência a antibiótico (tal como um ácido nucleico de resistên- ciaàcanamicina)em um vetor que tem um ou mais ácidos nucleicos da via de DXS, IDI ou MVA.
Condições de Cultura Celular Exemplares Materiais e métodos adequados para a manutenção e cresci- mento de culturas bacterianas são bem conhecidos na técnica. Técnicas exemplares podem ser encontradas no Manual of Methods for General Bac- teriology Gerhardt et a/., eds), American Society of Microbiology, Washing- ton, DC (1994) ou Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbi- ology Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalida- des, particularmente em relação a técnicas de cultura celular. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitem a expressão de um ou mais polipeptídeos da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA codificados por um ácido nucleico inserido nas células hospedeiras.
Condições de cultura celular padrão podem ser usadas para cul- tura de células (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas neste, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente em relação à cultura celular e condições de fermentação). Células são cultivadas e mantidas a uma temperatura, mistura de gás e pH apropriados (tal como em aproximadamente 20 a aproximada- mente 37ºC, em aproximadamente 6% a aproximadamente 84% de CO; e em um pH entre aproximadamente 5 e aproximadamente 9). Em algumas modalidades, as células são cultivadas a 35ºC em um meio celular apropria- do. Em algumas modalidades, por exemplo, as culturas são cultivadas a a- proximadamente 28ºC em meio apropriado em culturas de agitação ou fer- —mentadores até que a quantidade desejada de produção de isopreno seja alcançada. Em algumas modalidades, as faixas de pH da fermentação estão entre aproximadamente pH 5,0 e aproximadamente pH 9,0 (tal como apro- ximadamente pH 6,0 a aproximadamente pH 8,0 ou aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0). Reações podem ser realizadas sob condições aeró- bicas, anóxicas ou anaeróbicas com base nas exigências das células hos- pedeiras. Condições de cultura exemplares de um dado fungo filamentoso são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou da fonte dos fungos, tais como American Type Culture Collection e Fungal Genetics Stock Center.
Em várias modalidades, as células são cultivadas usando qual- quer modo conhecido para fermentação, tal como processos em batelada, em batelada alimentada ou contínuos. Em algumas modalidades, um méto- do de fermentação em batelada é usado. Fermentação em batelada clássica é um sistema fechado onde a composição dos meios é estabelecida no iní- cio da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fer- mentação. Dessa forma, no início da fermentação o meio celular é inoculado comas células hospedeiras desejadas e permite-se que a fermentação ocor- ra sem que se adicione nada ao sistema. Tipicamente, entretanto, a fermen- tação "em batelada" é em batelada com relação à adição da fonte de carbo- no e muitas vezes são feitas tentativas nos fatores de controle, tais como concentração de oxigênio e pH. Em sistemas em batelada, o metabólito e composições de biomassa do sistema modificam-se constantemente até o tempo de fermentação ser parado. Dentro de culturas em batelada, células aumentam através de uma fase lag estática a uma fase log de alto cresci- mento e finalmente a uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Em algumas modalidades, as células na fase log são responsáveis pela maior parte da produção de isopreno. Em algumas moda- lidades, as células na fase estacionária produzem o isopreno.
Em algumas modalidades, uma variação no sistema em batela- da padrão é usada, tal como o sistema em Batelada Alimentada. Os proces- sos de fermentação em batelada alimentada compreendem um sistema em —batelada típico à exceção de que a fonte de carbono é adicionada em incre- mentos à medida que a fermentação progride. Sistemas em batelada alimen- tada são úteis quando a repressão de catabólito tem tendência de inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter limitadas quantidades de fonte de carbono no meio celular. Fermentações em batelada alimentada — podem ser realizadas com fonte de carbono (por exemplo, glicose) em uma quantidade limitada ou em excesso. A medida da concentração de fonte de carbono real em sistemas em batelada alimentada é difícil e por isso é esti-
mada com base nas modificações de fatores mensuráveis, tais como PH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases residuais, tais como CO;. Fermentações em batelada e em batelada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica e exemplos podem ser encontrados em Brock, Biote- —chnology A Textbook of Industrial Microbiology Second Edition (1989) Si- nauer Associates, Inc., que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação à cultura celular e condições de fermentação.
Em algumas modalidades, métodos de fermentação contínuos são usados. Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante onde as células estão principalmente em crescimento de fase log.
Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetem crescimento celular ou produção de isopreno. Por exemplo, um método mantém um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou nível de nitrogênio em uma taxa fixa e permite todos outros parâmetros serem moderados. Em outros sistemas, diversos fatores que afetam crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular (por exemplo, a concentração medida pela turbidez média) é mantida constante. Dessa forma, a perda celular devido a meios que são retirados é equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fer- —mentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento de processos de fermentação contínuos bem como técnicas para maximização da taxa da formação de produto são bem conhecidos na técnica de microbio- logia industrial e uma variedade de métodos são detalhados por Brock, Bio- technology: A Textbook of Industrial Microbiology Second Edition (1989) Si- —nauer Associates, Inc., que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a condições de cultura celular e fermentação.
Em algumas modalidades, as células são imobilizadas em um substrato como catalisadores celulares completos e submetidas a condições de fermentação para produção de isopreno.
Em algumas modalidades, as garrafas da cultura líquida são co- —locadas em agitadores a fim de introduzir oxigênio ao líquido e manter a uni- formidade da cultura. Em algumas modalidades, uma incubadora é usada para controlar a temperatura, umidade, velocidade de agitação e/ou outras condições nas quais uma cultura é cultivada. As incubadoras mais simples são caixas isoladas com um aquecedor ajustável, tipicamente aproximando- sede-65ºC. Incubadoras mais elaboradas também podem incluir a capaci- dade de diminuir a temperatura (através de refrigeração), ou a capacidade de controlar umidade ou níveis de CO. A maioria das incubadoras inclui um cronômetro; algumas também podem ser programadas para variar através de diferentes temperaturas, níveis de umidade, etc. As incubadoras podem variar do tamanho de tampo de mesa a unidades do tamanho de pequenas salas.
Se desejado, uma porção ou todo o meio celular pode ser modi- ficado para reabastecer novamente de nutrientes e/ou evitar o acúmulo de subprodutos metabólicos potencialmente perigosos e células mortas. No ca- so de culturas em suspensão, as células podem ser separadas dos meios por centrifugação ou filtração da cultura em suspensão e então ressuspen- são das células em meios frescos. No caso de culturas aderentes, os meios podem ser removidos diretamente por aspiração e substituídos. Em algumas modalidades, o meio celular permite pelo menos uma porção das células —dividirse por pelo menos ou aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65 ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura con- tínua sem diluição).
Em algumas modalidades, um promotor constitutivo ou leaky (tal como um promotor Trc) é usado e um composto (tal como IPTG) não é adi- —cionado para induzir a expressão de ácido(s) nucleico(s) da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou MVA operacionalmente ligado ao promotor. Em algu- mas modalidades, um composto (tal como IPTG) é adicionado para induzir a expressão de ácido(s) nucleico(s) da via de isopreno sintase, DXS, IDI ou : MVA operacionalmente ligado ao promotor.
Métodos Exemplares para Desacoplamento da Produção de Isopreno do - Crescimento Celular Desejavelmente, carbono da matéria-prima é convertido em iso- preno em vez de crescimento e manutenção das células. Em algumas moda- lidades, as células são cultivadas a uma ODgçoo baixa ou média, então a pro- dução de isopreno é iniciada ou aumentada. Esta estratégia permite a uma grande porção de carbono ser convertida em isopreno.
Em algumas modalidades, as células alcançam uma densidade ótica tal que não mais se dividam ou se dividam extremamente lentamente, mas continuem produzindo isopreno por várias horas (tal como aproxima- damente 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais horas). Por exemplo, as Figs.
* 60A a 67C ilustram que as células podem continuar produzindo uma quanti- dade substancial de ácido mevalônico ou isopreno após as células alcança- f rem uma densidade ótica tal que não mais se dividam ou se dividam extre- mamente lentamente. Em alguns casos, a densidade ótica em reduções de 550 nm ao longo do tempo (tal como uma redução na densidade ótica após as células não estarem mais em uma fase de crescimento exponencial devi- doãlisecelular, cessação de crescimento, falta de nutrientes ou outros fato- res que conduzem à falta de crescimento celular), e as células continuam produzindo uma quantidade substancial de ácido mevalônico ou isopreno. Em algumas modalidades, a densidade ótica em aumentos de 550 nm de células por menos ou aproximadamente 50% (tal como por menos ou apro- ximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) ao longo de certo período de tempo (tal como mais ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 ho- ras), e as células produzem isopreno em mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000; 1.250;
1.500; 1.750; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000;
40.000; 50.000; 100.000; 200.000; 300.000; 400.000; 500.000; 600.000;
700.000; 800.000; 900.000; 1.000.000 ou mais de nmols de isopreno/grama de células por peso úmido das células/hora (nmol/gwcn/h) durante este tem-
po período. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre : aproximadamente 2 e aproximadamente 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 e aproximadamente 100 nmol/gwcn/h, aproximadamente - 100 a aproximadamente 500 nmol/gwem/h, aproximadamente 150 a aproxi- madamente 500 nmols/gwcm/h, aproximadamente 500 a aproximadamente
1.000 nmol/gwen/h, aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 nmol/ gGwom/h, ou aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 nmol/gwem/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproxima- damente 20 a aproximadamente 5.000 nmol/gwcm/h, aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 nmol/gwcn/h, aproximadamente 200 a aproximada- mente 2.000 nmol/gwen/h, aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 nmol/gwem/h, aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nmol/gwcm/h ou aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 nmol/gwem/h. 7 Em algumas modalidades, a densidade ótica em 550 nm das cé- lulas aumenta por menos ou aproximadamente 50% (tal como por menos ou ' aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) ao longo de certo período de tempo (tal como mais ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno em mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300,400,500,600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500,
3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000 ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Leaido, EM que o volume do caldo inclui o volume das células e o meio celular) durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproximadamente 2 e aproximadamente
5.000 mg9/Leako, tal como entre aproximadamente 2 e aproximadamente 100 mglLeao, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/Leato, aproxima- damente 500 a aproximadamente 1.000 mg/Lcako, aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg/Lcako, OU aproximadamente 2.000 a aproxima- damente 5.000 mg/Lcago. Em algumas modalidades, a quantidade de isopre- no está entre aproximadamente 20 a aproximadamente 5.000 mga/Lceaido, a- proximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg/Lcatão, aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg/Lcato, aproximadamente 200 a aproxima-
damente 1.000 mg/Lcatko, aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 i m9/Leatdo, OU aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 mg/Leawdo-
Em algumas modalidades, a densidade ótica em 550 nm das cé- - lulas aumenta por menos ou aproximadamente 50% (tal como por menos ou aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) ao longo de certo período de tempo (tal como mais ou aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células convertem mais ou aproximadamente 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% do car- —bonono meio de cultura celular em isopreno durante este período de tempo.
Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono no isopreno está entre, tais como aproximadamente 0,002 a aproximadamente 4,0%, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 3,0%, aproximadamente 0,002 7 a aproximadamente 2,0%, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 1,6%, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,005%, aproximada- ' mente 0,005 a aproximadamente 0,01%, aproximadamente 0,01 a aproxi- madamente 0,05%, aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15%, 0,15 a aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,0%, ou aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,6%. Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono no isopreno está entre aproximadamente 0,002 e aproximadamente 0,4%, 0,002 a aproximadamente 0,16%, 0,04 a aproximadamente 0,16%, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,23%, ou aproximadamente
0,05 a aproximadamente 0,3%. Em algumas modalidades, o isopreno somente é produzido na fase estacionária.
Em algumas modalidades, o isopreno é produzido tanto na fase de crescimento como na fase estacionária.
Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzida (tal como a quantidade total de isopreno produzida ou a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo por hora por ODsoo) durante a fase estacionária é maior do que ou aproximadamente
2,3,4,5, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes a quantidade de isopreno produ- : zida durante a fase de crescimento de mesma duração. Em várias modali- dades, mais ou aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, : 99% ou mais da quantidade total de isopreno que é produzida (tal como a produção de isopreno durante uma fermentação por certo período de tempo, tal como 20 horas) é produzida enquanto as células estão na fase estacioná- ria. Em várias modalidades, mais ou aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% ou mais da quantidade total de isopreno que é pro- duzida (tais como a produção de isopreno durante uma fermentação de certo período de tempo, tal como 20 horas) é produzida enquanto as células se dividem lentamente ou de modo nenhum tal que a densidade ótica em 550 nm das células aumente por menos ou aproximadamente 50% (tal como por menos ou aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%). Em algumas modali- z dades, isopreno somente é produzido na fase de crescimento. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via k de MVA, IDI, DXP ou isopreno sintase são colocados sob controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA, IDI, DXP ou isopreno sintase podem ser colocados sob controle de um fator sig- ma de fase estacionária, tal como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via de MVA, IDI, DXP ou isopreno sintase são co- locados sob controle de um promotor induzível na fase estacionária, tal co- mo um promotor induzível por um regulador de resposta ativo na fase esta- cionária.
Produção de isopreno dentro das Faixas Operacionais Seguras A produção de isopreno dentro de níveis operacionais seguros de acordo com suas características de inflamabilidade simplifica o desenho e a construção de instalações comerciais, melhora vastamente a capacidade de operar seguramente e limita o potencial para ocorrência de incêndios. Em particular, as faixas ótimas para a produção de isopreno estão dentro da zo- na segura, isto é, a faixa não inflamável de concentrações de isopreno. Em tal aspecto, a invenção caracteriza um método para a produção de isopreno
| 82/230 i dentro da faixa não inflamável de concentrações de isopreno (fora do enve- y lope de inflamabilidade de isopreno). Dessa forma, modelagem computacional e teste experimental fo- ram usados para determinar os limites de inflamabilidade de isopreno (tal comoisopreno na presença de Ox, Na, CO, ou qualquer combinação de dois ou mais dos gases precedentes) a fim de assegurar a segurança do proces- so.
O envelope de inflamabilidade é caracterizado pelo limite de inflamabili- dade inferior (LFL), limite de inflamabilidade superior (UFL), concentração de oxigênio limitante (LOC), e temperatura limitante.
Para um sistema ser infla- ; 10 mável, uma quantidade mínima de combustível (tal como isopreno) deve estar na presença de uma quantidade mínima de oxidante, tipicamente oxi- gênio.
LFL é a quantidade mínima de isopreno que deve estar presente para ; sustentar a queima, enquanto UFL é a quantidade máxima de isopreno que i E pode estar presente.
Acima deste limite, a mistura é rica em combustível e a | 15 fração de oxigênio é muito baixa para obtenção de uma mistura inflamável. ! LOC indica a fração mínima de oxigênio que também deve estar presente para haver uma mistura inflamável.
A temperatura limitante é baseada no | ponto de centelha de isopreno e é a temperatura mais baixa na qual a com- ; bustão de isopreno pode propagar-se.
Estes limites são específicos para a | 20 concentração de isopreno, tipo e concentração do oxidante, inertes presen- tes no sistema, temperatura e pressão do sistema.
As composições que es- j tão incluídas nos limites do envelope de inflamabilidade propagam a com- | bustão e requerem precauções de segurança adicionais tanto no desenho | como na operação do equipamento de processo. | 25 As seguintes condições foram testadas usando simulação com- | putacional e análise matemática e teste experimental.
Se desejado, outras | condições (tais como outra temperatura, pressão e composições de gás permanente) podem ser testadas usando os métodos descritos neste pedido i para determinar as concentrações de LFL, UFL e LOC. | 30 Simulação computacional e análise matemática : Suíte de Teste 1: isopreno: 0% por peso - 14% por peso
O»: 6% por peso - 21% por peso N>: 79% por peso - 94% por peso Suíte de Teste 2: isopreno: 0% por peso - 14% por peso O»>: 6% por peso - 21% por peso N>: 79% por peso - 94% por peso Saturado com HO Suíte de Teste 3: isopreno: 0% por peso - 14% por peso O»>: 6% por peso - 21% por peso N>: 79% por peso - 94% por peso CO»: 5% por peso - 30% por peso 2) Teste experimental para determinação final de limites de inflamabilidade Suíte de Teste 1: isopreno: 0% por peso - 14% por peso O»: 6% por peso - 21% por peso N>: 79% por peso - 94% por peso Suíte de Teste 2: isopreno: 0% por peso - 14% por peso O»>: 6% por peso - 21% por peso N>: 79% por peso - 94% por peso Saturado com HO O programa de simulação foi usado para fornecer uma estimati- va das características de inflamabilidade do sistema para várias condições deteste diferentes. CO» não mostrou efeito significante nos limites de infla- mabilidade do sistema. As Suítes de teste 1 e 2 foram confirmadas por teste experimental. Os resultados de modelagem estavam alinhados com os resul- tados de teste experimentais. Somente leves variações foram encontradas com a adição de água.
LOC foi determinada ser 9,5% por volume de uma mistura de i- sopreno, O>, No e CO» a 40ºC e 1 atmosfera. A adição de CO, até 30% não afetou significativamente as características de inflamabilidade de uma mistu-
ra de isopreno, O? e N7. Somente leves variações nas características de in- flamabilidade foram mostradas entre um sistema isopreno saturado seco e água, O, e N>. A temperatura restritiva é aproximadamente -54ºC. As tempe- - raturas abaixo de aproximadamente -54ºC são demasiado baixas para pro- pagara combustão de isopreno.
Em algumas modalidades, LFL de isopreno varia de aproxima- damente 1,5% por volume a aproximadamente 2,0% por volume, e UFL de faixas de isopreno de aproximadamente 2,0% por volume a aproximadamen- te 12,0% por volume, dependendo da quantidade de oxigênio no sistema.
Em algumas modalidades, LOC é aproximadamente 9,5% por volume de oxigênio. Em algumas modalidades, LFL de isopreno está entre aproxima- damente 1,5% por volume a aproximadamente 2,0% por volume, UFL de isopreno está entre aproximadamente 2,0% por volume a aproximadamente z 12,0% por volume, e LOC é aproximadamente 9,5% por volume de oxigênio quando a temperatura está entre aproximadamente 25 e aproximadamente ' 55ºC (tal como aproximadamente 40ºC) e a pressão está entre aproximada- mente 1 atmosfera e 3 atmosferas.
Em algumas modalidades, isopreno é produzido na presença de menos de aproximadamente 9,5% por volume de oxigênio (isto é, abaixo da LOC necessária para haver uma mistura inflamável de isopreno). Em algu- mas modalidades nas quais o isopreno é produzido na presença de mais ou aproximadamente 9,5% por volume de oxigênio, a concentração de isopreno é abaixo de LFL (tal como abaixo de aproximadamente 1,5% por volume). Por exemplo, a quantidade de isopreno pode ser mantida abaixo do LFL pela —diluiçãoda composição de isopreno com um gás inerte (por exemplo, adicio- nando continuamente ou periodicamente um gás inerte, tal como nitrogênio para manter a composição de isopreno abaixo do LFL). Em algumas modali- dades nas quais isopreno é produzido na presença de mais ou aproximada- mente 9,5% por volume de oxigênio, a concentração de isopreno está acima do UFL (tal como acima de aproximadamente 12% por volume). Por exem- plo, a quantidade de isopreno pode ser mantida acima do UFL usando um sistema (tal como qualquer um dos sistemas de cultura celular descritos nes-
te pedido) que produz isopreno em uma concentração acima do UFL. Se desejado, um nível relativamente baixo de oxigênio pode ser usado para que i UFL seja também relativamente baixo. Neste caso, uma concentração de - isopreno mais baixa é necessária para permanecer acima do UFL.
Em algumas modalidades nas quais isopreno é produzido na presença de mais ou aproximadamente 9,5% por volume de oxigênio, a con- centração de isopreno está dentro do envelope de inflamabilidade (tal como entre LFL e UFL). Em algumas modalidades quando a concentração de iso- preno pode estar incluída no envelope de inflamabilidade, uma ou mais eta- passão realizadas para reduzir a probabilidade de um incêndio ou explosão. Por exemplo, uma ou mais fontes de ignição (tais como qualquer material que possa gerar uma faísca) podem ser evitadas. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas são realizadas para reduzir o período de tempo que a . concentração de isopreno permanece dentro do envelope de inflamabilidade. Em algumas modalidades, um sensor é usado para detectar quando a con- í centração de isopreno está próxima ou dentro do envelope de inflamabilida- de. Se desejado, a concentração de isopreno pode ser medida em um ou mais pontos de tempo durante a cultura celular, e as condições de cultura celular e/ou a quantidade de gás inerte podem ser ajustadas usando méto- dos padrão se a concentração de isopreno estiver próxima ou dentro do en- velope de inflamabilidade. Em modalidades particulares, as condições de cultura celular (tais como condições de fermentação) são ajustadas para re- duzir a concentração de isopreno abaixo do LFL ou aumentar a concentra- ção de isopreno acima do UFL. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é mantida abaixo do LFL diluindo a composição de isopreno com um gás inerte (tal como adicionando continuamente ou periodicamente um gás inerte para manter a composição de isopreno abaixo do LFL).
Em algumas modalidades, a quantidade de voláteis inflamáveis além de isopreno (tais como um ou mais açúcares) é pelo menos aproxima- damente2,5,10,50,75, ou 100 vezes menor do que a quantidade de iso- preno produzida. Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa além de gás isopreno compreende entre aproximadamente 0% e aproximadamen-
te 100% de oxigênio (volume), tal como entre aproximadamente 0% e apro- ; ximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, apro- ximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a apro- - ximadamente 40%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, apro- ximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a apro- ximadamente 70%, aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, apro- ximadamente 90% a aproximadamente 90% ou aproximadamente 90% a aproximadamente 100% de oxigênio (volume). Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa além de gás isopreno compreende entre aproxima- damente 0% e aproximadamente 99% de nitrogênio (volume), tal como entre aproximadamente 0% e aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, aproximadamente 40% a : aproximadamente 50%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70%, aproximadamente 70% a 7 aproximadamente 80%, aproximadamente 90% a aproximadamente 90%, ou aproximadamente 90% a aproximadamente 99% de nitrogênio (volume).
Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa além de gás isopreno compreende entre aproximadamente 1% e aproximadamente 50% (volume) CO,, tal como entre aproximadamente 1% e aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, ou aproximadamente 40% a aproximadamente 50% (volume) de CO,. Em algumas modalidades, uma composição de isopreno tam- bém contém etanol. Por exemplo, etanol pode ser usado para destilação ex- trativa de isopreno, resultando em composições (tais como correntes de pro- duto intermediário) que incluem tanto etanol como isopreno. Desejavelmen- te, a quantidade de etanol está fora do envelope de inflamabilidade do eta- nol. A LOC de etanol é aproximadamente 8,7% por volume, e LFL do etanol é aproximadamente 3,3% por volume em condições padrão, tais como apro- ximadamente 1 atmosfera e aproximadamente 15,56ºC (NFPA 69 Standarts on Explosion Prevention Systems, 2008 edition, que é por meio deste incor-
porado por referência em sua totalidade, particularmente em relação a valo- res de LOC, LFL e UFL). Em algumas modalidades, as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na presença de menos do que a - LOC necessária para haver uma mistura inflamável de etanol (tal como me- nos de aproximadamente 8,7% por volume). Em algumas modalidades nas quais as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na pre- sença de mais ou aproximadamente a LOC necessária para haver uma mis- tura inflamável de etanol, a concentração de etanol está abaixo do LFL (tal como menos de aproximadamente 3,3% por volume).
Em várias modalidades, a quantidade do oxidante (tal como oxi- gênio) está abaixo da LOC de qualquer combustível no sistema (tal como isopreno ou etanol). Em várias modalidades, a quantidade do oxidante (tal como oxigênio) é menos de aproximadamente 60, 40, 30, 20, 10 ou 5% da 7 LOC de isopreno ou etanol. Em várias modalidades, a quantidade do oxidan- te (tal como oxigênio) é menos do que a LOC de isopreno ou etanol por pelo h menos 2, 4, 5 ou mais pontos de porcentagem absoluta (% por volume). Em modalidades particulares, a quantidade de oxigênio é pelo menos 2 pontos de porcentagem absoluta (% por vol) menor que a LOC de isopreno ou eta- nol (tal como uma concentração de oxigênio de menos de 7,5% por volume quando a LOC de isopreno é 9,5% por volume). Em várias modalidades, a quantidade do combustível (tal como isopreno ou etanol) é menos ou apro- ximadamente 25, 20, 15, 10, ou 5% do LFL daquele combustível.
Produção Exemplar de Isopreno Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitem a produção de isopreno pelas células. Por "produtividade absoluta de pico" entende-se a quantidade absoluta má- xima de isopreno no efluente gasoso durante a cultura de células por um período de tempo particular (por exemplo, cultura de células durante uma fermentação direcionada particular). Por "ponto de tempo de produtividade absoluta de pico" entende-se o ponto de tempo durante uma fermentação dirigida quando a quantidade absoluta de isopreno no efluente gasoso está em um máximo durante a cultura de células por um período de tempo parti-
cular (por exemplo, cultura de células durante uma fermentação direcionada particular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de produtividade absoluta de pico. Em algumas modalida- - des, a produtividade absoluta de pico das células é aproximadamente algu- madas quantidades de isopreno reveladas neste pedido.
Por "produtividade específica de pico" entende-se a quantidade máxima de isopreno produzida por célula durante a cultura de células de um período de tempo particular (por exemplo, cultura de células durante uma fermentação direcionada particular). Por "ponto de tempo de produtividade específica de pico" entende-se o ponto de tempo durante cultura de células de um período de tempo particular (por exemplo, cultura de células durante uma fermentação direcionada particular) quando a quantidade de isopreno produzida por célula está em um máximo. A produtividade específica é de- z terminada pela divisão da produtividade total pela quantidade de células, como determinado pela densidade ótica em 600nm (OD600). Em algumas ' modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de pro- dutividade específica de pico. Em algumas modalidades, a produtividade específica de pico das células é aproximadamente alguma das quantidades de isopreno por célula revelada neste pedido.
Por "produtividade total cumulativa" entende-se a quantidade cumulativa total de isopreno produzido durante a cultura de células de um período de tempo particular (por exemplo, cultura de células durante uma fermentação direcionada particular). Em algumas modalidades, a quantidade cumulativa total de isopreno é medida. Em algumas modalidades, a produti- vidade total cumulativa das células é aproximadamente alguma das quanti- dades de isopreno reveladas neste pedido.
Por "resposta de detector relativa" refere-se à proporção entre a resposta de detector (tal como a área GC/MS) para um composto (tal como isopreno) à resposta de detector (tal como a área GC/MS) de um ou mais compostos (tal como todos os hidrocarbonetos C5). A resposta de detector pode ser medida como descrita neste pedido, tais como a análise GC/MS realizada com um sistema Agilent 6890 GC/MS ajustado com uma coluna
Agilent HP-SMS GC/MS (30 m x 250 um; espessura de filme de 0,25 um). Se desejado, a resposta de detector relativa pode ser convertida em uma porcentagem por peso usando os fatores de resposta para cada um dos - compostos. Este fator de resposta é uma medida de quanto sinal é gerado parauma dada quantidade de um composto particular (isto é, quão sensível o detector é a um composto particular). Este fator de resposta pode ser usa- do como um fator de correção para converter a resposta de detector relativa a uma porcentagem de peso quando o detector tem sensibilidades diferentes aos compostos que são comparados. Alternativamente, a porcentagem por peso pode ser aproximada pela suposiçao que os fatores de resposta sejam os mesmos dos compostos que são comparados. Dessa forma, a porcenta- gem por peso pode ser assumida ser aproximadamente a mesma como a resposta de detector relativa. - Em algumas modalidades, as células em cultura produzem iso- prenoem mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 7 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500,
3.000, 4.000, 5.000 ou mais nmols de isopreno/grama de células do peso úmido das células/hora (nmol/gwam/h). Em algumas modalidades, a quanti- dade de isopreno está entre aproximadamente 2 e aproximadamente 5.000 nmol/gwm/h, tal como entre aproximadamente 2 e aproximadamente 100 nmol/gwen/h, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmol/gwem/h, aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmol/gwem/h, aproximada- mente 500 a aproximadamente 1.000 nmol/gwen/h, aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 nmol/gwcm/h, ou aproximadamente 2.000 a apro- ximadamente 5.000 nmol/gw.m/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproximadamente 20 e aproximadamente 5.000 nmol/gwen/h, aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 nmol/gwecn/h, aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 nmol/gwcm/h, aproximada- mente 200 a aproximadamente 1.000 nmol/gwen/h, aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nmol/gwcm/h, ou aproximadamente 400 a aproxima- damente 1.000 nmol/gwcnm/h.
A quantidade de isopreno em unidades de nmol/gwen/h pode ser medida como revelado na Patente U.S. Nº 5.849.970, que é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade, particularmente em relação à i medida da produção de isopreno. Por exemplo, dois mL de espaço de cabe- - ça (por exemplo, espaço de cabeça de uma cultura, tal como 2 mL da cultura cultivada em frascos selados a 32ºC com agitação a 200 rpm por aproxima- damente 3 horas) são analisados para isopreno usando um sistema de cro- matografia gasosa padrão, tal como um sistema operado isotermicamente (85ºC) com uma coluna n-octano/porasil C (Alltech Associates, Inc, Deerfi- eld, Ill.) e acoplado a um detector de gás de redução de óxido mercúrico RGD?2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (ver, por exemplo, Greenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol. 97:1588- 1591, 1991, que são cada um por meio deste incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com respeito à medida da produção de e isopreno). As unidades de área de cromatografia gasosa são convertidas em nmol de isopreno através de uma curva de calibração de concentração de F isopreno padrão. Em algumas modalidades, o valor para os gramas de célu- las do peso úmido das células é calculado pela obtenção do valor de Agoo de uma amostra da cultura celular, e então converter o valor de Açoo para gra- mas de células com base em uma curva de calibração de pesos úmidos de culturas celulares com um valor de Asoo conhecido. Em algumas modalida- des, os gramas das células são estimados pela suposição que um litro de caldo (incluindo meio celular e células) com um valor de Agoo de 1 tenha um peso úmido de célula de 1 grama. O valor também é dividido pelo número de horas que a cultura tem sido incubada, tais como três horas. Em algumas modalidades, as células em cultura produzem iso- preno em mais ou aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500,
3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000 ou mais ng de isopreno/grama de célu- las de peso úmido das células/hora (n9/gwcn/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproximadamente 2 e aproximadamente
5.000 ng/gwen/h, tal como entre aproximadamente 2 e aproximadamente 100 ng/gwen/h, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/gwcm/h, apro-
ximadamente 500 a aproximadamente 1.000 ng/gwem/h, aproximadamente
1.000 a aproximadamente 2.000 ng/dwcn/h, ou aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade - de isopreno está entre aproximadamente 20 e aproximadamente 5.000 ng/gwen/h, aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 ng/gwen/h, apro- ximadamente 200 a aproximadamente 2.000 ng/gwcm/h, aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 n9g/gwem/h, aproximadamente 300 a aproxi- madamente 1.000 n9/dwen/h, ou aproximadamente 400 a aproximadamente
1.000 ng/gwem/h. A quantidade de isopreno em ng/gwem/h pode ser calculada multiplicando o valor da produção de isopreno em unidades de nmol/gwcm/h discutidas acima por 68,1 (como descrito na Equação 5 abaixo). Em algumas modalidades, as células em cultura produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno em mais ou aproximadamen- : te 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, ' 50.000, 100.000 ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaigo, EM que O volume do caldo inclui o volume das células e o meio celular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproximadamente 2 e a- proximadamente 5.000 mg/Leatko, tal como entre aproximadamente 2 e apro- ximadamente 100 mg/Lecakão, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg9/Leado, aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 mg/Lcatdo, apro- ximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg/Lcakdo, OU aproximadamen- te 2.000 a aproximadamente 5.000 mg/Lcago: Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre aproximadamente 20 e aproximadamente
5.000 mg/Lcao, aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg/Lceatdo, aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg/Lceawdo, aproximadamen- te 200 a aproximadamente 1.000 mg/Lcako, aproximadamente 300 a aproxi- madamente 1.000 mg/Lcatdo, OU aproximadamente 400 a aproximadamente
1.000 mg/Leao- A produtividade específica de isopreno em mg de isopreno/L a partir do espaço de cabeça de frasco de agitação ou culturas similares pode ser medida tomando uma amostra de 1 ml da cultura celular em um valor de
ODeoo de aproximadamente 1,0, colocando-a em um frasco de 20 mL, incu- bando por 30 minutos, e então medindo a quantidade de isopreno no espaço i de cabeça (como descrito, por exemplo, no Exemplo |, parte 11). Se o valor - de ODçeoo não for 1,0, então a medida pode ser normalizada a um valor de —ODçoode 1,0 pela divisão pelo valor de ODçoo. O valor em mg de isopreno/L de espaço de cabeça pode ser convertido em mg/Lcao/N/ODgeoo do caldo de cultura pela multiplicação por um fator de 38. O valor em unidades de m9I/Lcaigo/N/ODgoo pode ser multiplicado pelo número de horas e o valor de ODs0o para obter o título cumulativo em unidades de mg de isopreno/L de caldo.
A taxa de produção de isopreno instantânea em mg/Leao/h em um fermentador pode ser medida tomando uma amostra do efluente gasoso do fermentador, analisando-a para a quantidade de isopreno (em unidades, 7 tais como mg de isopreno por Laás) como descrito, por exemplo, no Exemplo |, parte ll e multiplicando este valor pela taxa na qual efluente gasoso é pas- 7 sado através de cada litro do caldo (por exemplo, em 1 vum (volume de ar/volume de caldo/minuto) isto é 60 Lyas por hora). Dessa forma, um nível de efluente gasoso de 1 mg/Lgas corresponde a uma taxa de produção ins- tantânea de 60 mg/Leawko/h no fluxo de ar de 1 vvm. Se desejado, o valor em unidades de mg/Leaao/h pode ser dividido pelo valor de ODgoo para obter a taxa específica em unidades de mg/Lcago/N/OD. O valor médio de mg isopre- no/Lgas pode ser convertido na produtividade de produto total (gramas de isopreno por litro de caldo de fermentação, mg/Leao) pela multiplicação des- ta concentração de isopreno de efluente gasoso média pela quantidade total de efluente gasoso difundido por litro de caldo de fermentação durante a fermentação. Dessa forma, uma concentração de isopreno de efluente gaso- so média de 0,5 mg/Lecao/h por mais de 10 horas em 1 vvm corresponde a uma concentração de produto total de 300 mg isopreno/Lcao- Em algumas modalidades, as células da cultura convertem mais ou aproximadamente 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% do carbono no meio de cultura celular em iso-
preno. Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono no isopreno está entre, tais como aproximadamente 0,002 e aproximadamente 4,0%, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 3,0%, aproximadamente - 0,002 a aproximadamente 2,0%, aproximadamente 0,002 a aproximadamen- te1,6%, aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,005%, aproximada- mente 0,005 a aproximadamente 0,01%, aproximadamente 0,01 a aproxi- madamente 0,05%, aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15%, 0,15 a aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,0%, ou aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,6%. Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono no isopreno está entre aproximadamente 0,002 e aproximadamente 0.4%, 0,002 a aproximadamente 0,16%, 0,04 a - aproximadamente 0,16%, aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,3%, ou aproximadamen- í te 0,05 a aproximadamente 0,3%.
A conversão percentual de carbono no isopreno (também "ren- dimento de carbono de% referido como") pode ser medida dividindo o car- bono de mols no isopreno produzido pelo carbono de mols na fonte de car- —bono (talcomo os mois de carbono em batched e glicose alimentada e extra- to de levedura). Este número é multiplicado em 100% para dar um valor de porcentagem (como indicado na Equação 1).
Equação 1 % de Rendimento de Carbono = (mols de carbono em isopreno produzido) /(mols de carbono em fonte de carbono) * 100 Para este cálculo, extrato de levedura pode ser assumido conter 50% p/p de carbono. Como um exemplo, para os 500 litros descritos no E- xemplo 7, parte VIII, a conversão percentual de carbono em isopreno pode ser calculada como mostrado na Equação 2.
Equação2 % Rendimento de Carbono = (39,1 g de isopreno * 1/68,1moi/g * 5 C/mol) / [[181221 g de glicose * 1/180 mol/g * 6 C/mol) + (17780 g de ex-
trato de levedura * 0,5 * 1/12 mol/g)] * 100 = 0,042% Para as duas fermentações de 500 litros descritas neste pedido (Exemplo 7, partes VII e VII!), a conversão percentual de carbono em iso- e preno esteve entre 0,04 e 0,06%. Um rendimento de carbono de 0,11 a 0,16% foi alcançado usando sistemas de 14 litros como descrito neste pedi- do.
Exemplo 11, parte V descreve a conversão de 1,53% de carbono a iso- preno usando os métodos descritos neste pedido.
Um versado na técnica pode converter prontamente as taxas da produção de isopreno ou quantidade de isopreno produzida em qualquer outra unidade.
Equações exemplares são listadas abaixo para interconverter entre unidades.
Unidades de Taxa de produção de Isopreno (total e específica) Equação 3 : 1 g isopreno/Leao/h = 14,7 mmol isopreno/Leawo/h (taxa volumé- tricatotal) : Equação 4 1 nmol isopreno/gwcn/h = 1 nmol isopreno/Leago/N/ODgoo (Esta conversão assume que um litro do caldo com um valor de ODgoo de 1 tenha um peso úmido de célula de 1 grama.) EquaçãoS5 1 nmol isopreno/gwcn/h = 68,1 ng isopreno/gwem/h (dado o peso molecular de isopreno) Equação 6 1 nmol isopreno/Lgas O2/h = 90 nmol isopreno/Leago/h (em uma taxadefluxode O, de 90 L/h por L de caldo de cultura) Equação 7 1 ug isopreno/Lh.ss isopreno em efluente gasoso = 60 ug isopre- no/Leago/h em uma taxa de fluxo de 60 Los por Lcaido (1 vum) Unidades de Título (total e específico) Equação8 1 nmol isopreno/mg proteína celular = 150 nmol isopreno/Lcatão! ODsgoo (Esta conversão assume que um litro do caldo com um valor de ODgoo de 1 tenha uma proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (produti- vidade específica) i Equação 9 - 1 g isopreno/Leako = 14,7 mmol isopreno/Leatão (título total) Se desejado, a Equação 10 pode ser usada para converter al- guma das unidades que incluem o peso úmido das células nas unidades cor- respondentes que incluem o peso seco das células.
Equação 10 Peso seco de células = (peso úmido de células)/3,3 Se desejado, a Equação 11 pode ser usada para converter entre unidades de ppm e ug/L. Em particular, "ppm" significa partes por milhão definido em termos de ug/g (p/p) ou ul/L (volívol). A conversão de ug/L a ppm (por exemplo, ug de analito por g de gás) pode ser realizada pela de- k terminação da massa por L de efluente gasoso (isto é, a densidade do gás). Por exemplo, um litro de ar nas STP tem uma densidade de aproximada- h mente 1,2 g/L. Dessa forma, uma concentração de 1 ppm (ug/g) é igual a 0,83 ug/L nas STP (equação 11). A conversão de ppm (ug/g) a ug/L é uma função tanto de pressão, temperatura, como de composição total do efluente gasoso. Equação11 1 ppm (ug/g) é igual a 0,83 ug/L em temperatura e pressão pa- drões (STP; 101,3 kPa (1 bar) e 273,15K). A conversão de ug/L a ppmv (por exemplo, uL de analito por L de gás) pode ser realizada usando a Lei Universal dos Gases (equação 12). Por exemplo, uma concentração de efluente gasoso de 1000 ug/Loas Corres- ponde a 14,7 umol/Lyas. A constante universal dos gases é 0,082057 L.atm K mor, então usando a equação 12, o volume ocupado por 14,7 umol de HG nas STP é igual a 0,329 mL. Por isso, a concentração de 1000 ug/L de HG é igual a 329 ppmv ou 0,0329% (v/v) nas STP. Equação12 PV = nRT, onde "P" é pressão, "V" é volume, o "n" é mois de gás, "R" é a Constante universal dos gases, e "T" é temperatura em Kelvin.
A quantidade de impureza em composições de isopreno é tipi- camente medida neste pedido em uma base de peso por volume (p/v) em À unidades, tais como ug/L. Se desejado, as medidas em unidades de ug/L - podem ser convertidas em unidades de mg/m? usando a equação 13. —Equação13 1ug/L=1mgm? Em algumas modalidades englobadas pela invenção, uma célula que compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo isopreno sintase produz uma quantidade de isopreno que é pelo menos ou aproximadamente 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes ou mais a quantidade de iso- preno produzida a partir de uma célula correspondente cultivada essencial- mente sob as mesmas condições sem o ácido nucleico heterólogo que codi- z fica o polipeptídeo isopreno sintase. Em algumas modalidades englobadas pela invenção, uma célula 7 compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo isopreno sintase e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo da via de DXS, IDI e/ou MVA produz uma quantidade de isopreno que é pelo menos ou aproximadamente 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes ou mais a quantidade de isopreno produzida a partir de uma célula corres- pondente cultivada essencialmente sob as mesmas condições sem os áci- dos nucleicos heterólogos.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compre- ende mais ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma res- posta de detector relativa de mais ou aproximadamente 99,90, 99,91, 99,92, 99,93, 99,94, 99,95, 99,96, 99,97, 99,98, 99,99, ou 100% para isopreno comparada à resposta de detector de todos os hidrocarbonetos C5 na com- posição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre aproximadamente 99,90 a aproximadamente 99,92, aproximadamente
99,92 a aproximadamente 99,94, aproximadamente 99,94 a aproximada- mente 99,96, aproximadamente 99,96 a aproximadamente 99,98, aproxima- damente 99,98 a 100% de isopreno por peso comparado ao peso total de - todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compre- ende menos ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3- pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1- butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1- ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino) por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composi- ção tem uma resposta de detector relativa de menos ou aproximadamente - 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, — 0,00005, ou 0,00001% do hidrocarboneto C5 além de isopreno comparada à r resposta de detector de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta de detector relativa de menos ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% para 1,3- ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2- pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis- piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino comparada à resposta de detector de todos os hidrocarbonetos C5 na com- posição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,04%, aproximadamente 0,04 a aproximadamente 0,06%, aproximadamente 0,06 a 0,08%, aproxima- damente 0,08 a 0,10%, ou aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,12% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno (tal 1,3-ciclopentadieno, cis- 1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2- —metil-I-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno- 1-ino, trans-pent-3-eno-1-ina, ou cis-pent-3-eno-1-ina) por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compre- : ende menos ou aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno - para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de iso- preno Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre aproximadamente 0,005 a aproximadamente 50, tais como aproxima- damente 0,01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0,01 a aproxima- damente 5, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5, ou aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ug/L : de um hidrocarboneto além de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3- pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1- buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cís-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino). Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre aproximadamente 0,005 a a- proximadamente 50, tais como aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5, ou a- proximadamente 0,01 a aproximadamente 0,005 ug/L de um hidrocarboneto além de isopreno.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05,0,01 ou 0,005 ug/L de um ácido graxo ou proteína (tal como um ácido graxo ou proteína que está associada naturalmente com borracha natural). Em algumas modalidades, a composição de isopreno compre- ende menos ou aproximadamente 10, 5, 1, 0,8, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ppm de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrila ou 1,3-ciclopentadieno.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou aproximadamente 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 ppm de enxofre ou ale- nos.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende me-
nos ou aproximadamente 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ou 0,005 : ppm de todos os acetilenos (tal como pentino-1, butino-2, 2MB1-3ino, e 1- pentino-4ino). Em algumas modalidades, a composição de isopreno com- . preende menos do que ou 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10,5, 1,0,5,0,1,0,05,0,01 ou 0,005 ppm de dímeros de isopreno, tais como regu- ladores para dímeros de isopreno cíclicos (por exemplo, compostos C10 cí- Clicos derivados da dimerização de duas unidades de isopreno). Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui eta- nol, acetona, um prenil álcool C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-01 ou 3-metil-2- buten-1-ol), ou quaisquer dois ou mais dos precedentes. Em modalidades particulares, a composição de isopreno compreende mais ou aproximada- mente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 ug/L de etanol, acetona, um prenil álcool C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol íá ou 3-metil-2-buten-1-01), ou quaisquer dois ou mais dos precedentes. Em . 15 algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre aproxi- madamente 0,005 a aproximadamente 120, tais como aproximadamente 0,01 a aproximadamente 80, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 60, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20, apro- ximadamente 0,01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0,1 a aproxi- madamente 80, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60, aproximada- mente 0,1 a aproximadamente 40, aproximadamente 5 a aproximadamente 80, aproximadamente 5 a aproximadamente 60, ou aproximadamente 5 a aproximadamente 40 ug/L de etanol, acetona, um prenil álcool C5, ou quais- —querdoisou mais dos precedentes.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais dos seguintes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4, 5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1- butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2- butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-but-
1-enila, acetato de 3-metil-2-but-1-enila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)- 3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3-ciclo-heptenolpiridina, ou um polímero de isopreno linear (tal como um dímero de isopreno linear ou um trímero de iso- f preno linear derivado da polimerização de múltiplas unidades de isopreno). Em várias modalidades, a quantidade de um destes componentes relativa à quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (isto é, peso do componente dividido pelo peso de isopreno vezes 100) é maior do que ou aproximadamente 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110% (p/p). Em algumas modalidades, a resposta de detector relativa do segundo composto comparada à resposta de detector do isopre- no é maior do que ou aproximadamente 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110%. Em várias modalidades, a quan- tidade de um destes componentes em relação à quantidade de isopreno em f unidades de porcentagem por peso (isto é, peso do componente dividido 2 15 pelopeso de isopreno vezes 100) está entre aproximadamente 0,01 e apro- ximadamente 105% (p/p), tal como aproximadamente 0,01 a aproximada- mente 90, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 80, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0,02 a aproximadamente 50, aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50, apro- ximadamente 0,1 a aproximadamente 50, ou 0,1 a aproximadamente 20% (p/p).
Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais do seguinte: um álcool, um aldeído, ou uma cetona (tal como algum dos álcoois, aldeídos ou cetonas descritos neste pedido). Em algumas mo- dalidades, a composição de isopreno inclui (i) um álcool e um aldeído, (ii) um álcool e uma cetona, (iii) um aldeído e uma cetona, ou (iv) um álcool, um aldeído e uma cetona. Em algumas modalidades, a composição de isopreno contém um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1- butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1- butanol ou indol. Em algumas modalidades, a composição de isopreno con-
tém 1 ppm ou mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, eta- nol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2- butanona, 2-metil-1-butanol ou indol. Em algumas modalidades, a concen- tração de mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol/ 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2- butanona, 2-metil-1-butanol ou indol, estão entre aproximadamente 1 a a- proximadamente 10.000 ppm em uma composição de isopreno (tal como efluente gasoso antes que seja purificado). Em algumas modalidades, a composição de isopreno (tal como efluente gasoso após sofrer uma ou mais etapas de purificação) inclui um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeí- do, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol ou indol, em uma concentração entre aproxi- madamente 1 e aproximadamente 100 ppm, tais como aproximadamente 1 a Á aproximadamente 10 ppm, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 i 15 ppm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 ppm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 ppm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 ppm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 ppm, aproximadamen- te 60 a aproximadamente 70 ppm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 ppm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 ppm, ou aproximada- mente 90 a aproximadamente 100 ppm. Compostos orgânicos voláteis de culturas celulares (tal como compostos orgânicos voláteis no espaço de ca- beça de culturas celulares) podem ser analisados usando métodos padrão, tais como aqueles descritos neste pedido ou outros métodos padrão, tais como espectrometria de massa da reação de transferência de próton (ver, por exemplo, Bunge et al. Applied and Environmental Microbiology, 74(7): 2179-2186, 2008 que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particular com respeito à análise de compostos orgânicos volá- teis).
Em algumas modalidades, a composição compreende mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno, tal como mais ou aproximadamen- te 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, : 90, 100 g de isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição está entre aproximadamente 2 e aproximadamente 5.000 : mg, tal como entre aproximadamente 2 e aproximadamente 100 mg, aproxi- — madamente 100 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 500 a apro- ximadamente 1.000 mg, aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg, ou aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição está entre aproxima- damente 20 a aproximadamente 5.000 mg, aproximadamente 100 a aproxi- madamente 5.000 mg, aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg, aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 mg, aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 mg, ou aproximadamente 400 a aproximadamen- te 1.000 mg. Em algumas modalidades, mais ou aproximadamente 20, 25, í 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 95% por peso da fração orgânica volátil da — 15 composição sendo isopreno.
Em algumas modalidades, a composição inclui etanol. Em algu- mas modalidades, a composição inclui entre aproximadamente 75 e aproxi- madamente 90% por peso de etanol, tal como entre aproximadamente 75 e aproximadamente 80%, aproximadamente 80 a aproximadamente 85%, ou aproximadamente 85 a aproximadamente 90% por peso de etanol. Em al- gumas modalidades nas quais a composição inclui etanol, a composição também inclui entre aproximadamente 4 e aproximadamente 15% por peso de isopreno, tal como entre aproximadamente 4 e aproximadamente 8%, aproximadamente 8 a aproximadamente 12%, ou aproximadamente 12 a aproximadamente 15% por peso de isopreno.
Em algumas modalidades englobadas pela invenção, uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo da via de isopreno sintase, polipeptídeo DXS, polipeptídeo IDI e/ou polipeptídeo MVA produz uma quantidade de um composto isoprenoide (tal como um composto com 10 ou mais átomos de carbono que é formado da reação de uma ou mais moléculas de IPP com uma ou mais moléculas de DMAPP) que é mais ou aproximadamente 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 ve-
zes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes ou : mais a quantidade do composto isoprenoide produzido de uma célula cor- respondente cultivada essencialmente sob as mesmas condições sem um É ou mais ácidos nucleicos heterólogos. Em algumas modalidades englobadas pelainvenção, uma célula compreendendo um ou mais ácidos nucleicos he- terólogos que codificam um polipeptídeo isopreno sintase, polipeptídeo da via de DXS, polipeptídeo IDI, e/ou polipeptídeo MVA produz uma quantidade de um prenil álcool C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-01 ou 3-metil-2-buten-1-ol) que é mais ou aproximadamente 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes ou mais a quantidade do prenil álcool C5 produzida a partir de uma célula correspon- dente cultivada essencialmente sob as mesmas condições sem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos.
i Métodos de Purificação de Isopreno Exemplares Em algumas modalidades, um dos métodos descritos neste pe- dido inclui ainda recuperação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzi- do usando as composições e métodos da invenção pode ser recuperado usando técnicas padrão, tal como arraste por gás, separação potencializada por membrana, fracionamento, adsorção/dessorção, pervaporação, dessor- ção térmica ou a vácuo de isopreno de uma fase sólida ou extração de iso- preno imobilizado ou absorvido em uma fase sólida com um solvente (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4.703.007 e 4.570.029, que são cada uma por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades, particular- mente em relação a métodos de purificação e recuperação de isopreno). Em modalidades particulares, destilação extrativa com um álcool (tal como eta- nol, metanol, propanol, ou uma combinação dos mesmos) é usada para re- cuperar o isopreno. Em algumas modalidades, a recuperação de isopreno envolve o isolamento de isopreno em uma forma líquida (tal como uma solu- ção pura de isopreno ou uma solução de isopreno em um solvente). Arraste por gás envolve a remoção do vapor de isopreno da corrente de efluente gasoso da fermentação de uma maneira contínua. Tal remoção pode ser alcançada de vários modos diferentes incluindo, mas não limitados a, adsor-
ção a uma fase sólida, partição em uma fase líquida ou condensação direta B (tal como condensação devido à exposição a uma serpentina de condensa- ção ou a um aumento na pressão). Em algumas modalidades, enriquecimen- ' to de membrana de uma corrente de vapor de isopreno diluída acima do ponto de orvalho do vapor resultando na condensação de isopreno líquido. Em algumas modalidades, o isopreno é comprimido e condensado.
A recuperação de isopreno pode envolver uma etapa ou múlti- plas etapas. Em algumas modalidades, a remoção do vapor de isopreno a partir do efluente gasoso da fermentação e a conversão de isopreno a uma fase líquida são realizadas simultaneamente. Por exemplo, isopreno pode ser diretamente condensado da corrente efluente gasoso para formar um líquido. Em algumas modalidades, a remoção do vapor de isopreno a partir do efluente gasoso da fermentação e a conversão de isopreno a uma fase , líquida são realizadas sequencialmente. Por exemplo, isopreno pode ser — 15 adsorvidoa uma fase sólida e então extraído da fase sólida com um solven- te.
Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos neste pedido inclui ainda a purificação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido usando as composições e métodos da invenção pode ser purifica- do usando técnicas padrão. Purificação refere-se a um processo pelo qual isopreno é separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é ob- tido como um líquido substancialmente puro. Exemplos de métodos de puri- ficação incluem destilação (i) de uma solução em um extractante líquido e (ii) cromatografia. Como usado neste pedido, "isopreno purificado" significa iso- preno que foi separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é pelo menos aproximadamente 20%, por peso, livre de outros componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em várias modalidades, o isopreno é pelo menos ou aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou 99%, por peso, puro. Pureza pode ser anali- sada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, análise por HPLC ou análise por GC-MS. : Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da fase ga- Sosa que permanece após uma ou mais etapas de recuperação da remoção ' de isopreno é reciclada pela introdução da fase gasosa em um sistema de culturacelular (tal como um fermentador) para a produção de isopreno.
Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos neste pedido inclui ainda polimerização de isopreno. Por exemplo, métodos padrão podem ser usados para polimerizar isopreno purificado para formar cis-poli-isopreno ou outros produtos de corrente a jusante usando métodos padrão. Consequentemente, a invenção também caracteriza um pneu com- preendendo poli-isopreno, tal como cis-1,4-poli-isopreno e/ou trans-1,4-poli- isopreno produzido a partir de qualquer uma das composições de isopreno reveladas neste pedido.
' EXEMPLOS : 15 Os exemplos, que são destinados a ser puramente exemplares da invenção e por isso não devem ser considerados limitando a invenção de qualquer modo, também descrevem e detalham aspectos e modalidades da invenção discutida acima. A menos que indicado de outra maneira, a tempe- ratura está em graus Centígrados e a pressão é ou está próxima da atmosfé- rica. Exemplos precedentes e descrição detalhada são oferecidos por meio de ilustração e não para o fim de limitação. Todas as publicações, pedidos de patentes e patentes citados neste relatório descritivo são neste pedido incorporados por referência como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Em particular, todas as publicações citadas neste pedido são expressamente incorporadas neste pedido por referência para fins de descrição e revelação de composições e metodologias que po- deriam ser usadas em relação à invenção. Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo parafinsde clareza de entendimento, será prontamente evidente para aque- les técnicos no assunto à luz dos ensinos desta invenção que certas modifi- cações e alterações podem ser feitas neste sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações adicionadas. . Exemplo 1: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu recombinante ' 1. Construção de vetores para expressão da isopreno sintase de kudzu em E. col A sequência proteica do gene de isopreno sintase (IspS) de kud- zu (Pueraria montana) foi obtida de GenBank (AAQ84170). Um gene de iso- preno sintase de kudzu, otimizado para uso de códon de E. co/i, foi adquirido de DNA2.0 (SEQ ID NO:1). O gene de isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão por endonuclease de restrição com Bs- PLU11IV/PsA, purificado em gel, e ligado em pTrcHis2B (Invitrogen) que havia sido digerido com Ncol/Pstl.
O construto foi desenhado tal que o códon de parada no gene da isopreno sintase estava 5' ao sítio Pstl.
Como resultado, ' quando o construto foi expresso, a marcação His não é ligada à proteína de 2 15 isopreno sintase.
O plasmídeo resultante, pTrcKudzu, foi verificado por se- quenciamento figuras 2 e 3). O gene de isopreno sintase também foi clonado em pET16b (Novagen). Neste caso, o gene de isopreno sintase foi inserido em pET16b tal que a proteína isopreno sintase recombinante contivesse o N-terminal da “marcação His.
O gene de isopreno sintase foi amplificado de pTrcKudzu por PCR usando o conjunto de iniciadores pET-His-Kudzu-2F: 5- CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID NO:3) e PET-His-Kudzu-R: 5- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:4). Estes iniciadores adicionaram um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio BamH1 na extremidade 3' do gene respectivamente.
O plasmídeo pTreKud- Zu, descrito acima, foi usado como DNA molde, Herculase polimerase (Stra- tagene) foi usada de acordo com orientações do fabricante, e os iniciadores foram adicionados em uma concentração de 10 pMols.
PCR foi realizada em um volume totalde 25 yuL.O produto de PCR foi digerido com Ndel/BamH1 e clonado em pET16b digerido com as mesmas enzimas.
A mistura de ligação foi transformada em E. coli Top10O (Invitrogen) e o clone correto selecionado por sequenciamento. O plasmídeo resultante, no qual o gene de isopreno : sintase de kudzu foi expresso a partir do promotor T7, foi designado pET- NHisKudzu figuras 4 e 5). ' O gene de isopreno sintase de kudzu também foi clonado no plasmídeo de baixa cópia pCL1920. Iniciadores foram usados para amplificar o gene de isopreno sintase de kudzu de pTrcKudzu descrito acima. O iniciador de sentido direto adicionou um sítio Hindlll e um RBS consenso de E. coli à extre- midade 5'. O sítio de clonagem Pstl já estava presente em pTreKudzu so- mente 3' do códon de parada assim o iniciador de sentido reverso foi construído tal que o produto de PCR final inclui o sítio Psfl. As sequências dos iniciadores foram: Hindlll-rbs-Kudzu F: 5-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGA GGAATAAACC (SEQ ID NO:6) e BamH1-Kudzu R: 8-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG : (SEQ ID NO:4). O produto de PCR foi amplificado usando Herculase polime- — 15 rase com iniciadores em uma concentração de 10 pmol e com 1 ng de DNA molde (pTrcKudzu). O protocolo de amplificação incluiu 30 ciclos (de 95ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto, 72ºC por 2 minutos). O produto foi digerido com Hindlll e Pstl e ligado em pCL 1920 que também havia sido digerido com Hindlll e Pstl. A mistura de ligação foi transformada em E. coli Top10. Vários transformantes foram verificados por sequenciamento. O plasmídeo resultante foi designado pCL-lac-Kudzu figuras 6 e 7).
11. Determinação de produção de isopreno Para culturas de frasco de agitação, um ml de uma cultura foi transferido de frascos de agitação para frascos de espaço de cabeça CTC de20ml(frasco Agilent cat 5188 2753; tampa cattt 5188 2759). A tampa foi rosqueada justamente e os frascos incubados em temperatura equivalente com agitação a 250 rpm. Após 30 minutos os frascos foram removidos da incubadora e analisados como descrito abaixo (ver a Tabela 1 para alguns valores experimentais deste ensaio). Nos casos onde a produção de isopreno em fermentadores foi determinada, as amostras foram tomadas do efluente gasoso do fermenta- dor e analisadas diretamente como descrito abaixo (ver Tabela 2 de alguns valores experimentais deste ensaio). : A análise foi realizada usando um sistema Agilent 6890 GC/MS com interface com um autoanalisador CTC Analytics (Suíça) com auto- í operador de CombiPAL que funciona no modo de espaço de cabeça.
Uma coluna Agilent HP-SMS GC/MS (30 m x 0,25 mm; espessura de filme 0,25 pm) foi usada para separação de analitos.
O amostrador foi configurado para injetar 500 ul de gás de espaço de cabeça.
O método GC/MS utilizou hélio como o gás carreador em um fluxo de 1 ml/min.
O orifício de injeção foi man- tido a 250ºC com uma razão de divisão de 50:1. A temperatura de forno foi mantidaem 37ºC pelos 2 minutos de duração da análise.
O detector seletivo de massa Agilent 5793N foi dirigido em modo de monitoramento de íon único (SIM) em m/z 67. O detector foi desligado de 1,4 a 1,7 minuto para permitir a eluição de gases permanentes.
Sob estas condições, foi observado que iso- í preno (2-metil-1,3-butadieno) eluiu em 1,78 minuto.
Uma tabela de calibra- — 15 çãofoiusada para quantificar a quantidade absoluta de isopreno e foi encon- trada ser linear de 1 ug/L a 2000 ug/L.
O limite da detecção foi estimado ser de 50 a 100 ng/L usando este método.
Ill.
Produção de isopreno em frascos de agitação contendo células de E. coli expressando isopreno sintase recombinante Os vetores descritos acima foram introduzidos na cepa de E. coli BL21 (Novagen) para produzir cepas BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu e BL21/pETHisKudzu.
As cepas foram propagadas para isolamento em LA (ágar Luria) + carbenicilina (50 po/ml) e incubadas por uma noite a 37ºC.
Colônias únicas foram inoculadas em frascos de agitação de 250 ml com compartimentos contendo 20 ml de caldo Luria Bertani (LB) e carbenicilina (100 pg/ml). Culturas foram cultivadas por uma noite a 20ºC com agitação a 200 rpm.
As ODgçoo das culturas noturnas foram medidas e as culturas foram diluídas em um frasco de agitação de 250 ml com compartimentos contendo ml de MagicMedia (Invitrogen) + carbenicilina (100 pg/ml) a uma ODgo,o de 30 > 005.A cultura foi incubada a 30ºC com agitação a 200 rpm.
Quando a ODeoo de — 0,5 a 0,8, IPTG 400 uM foi adicionado e as células foram incuba- das por 6 horas adicionais a 30ºC com agitação a 200 rpm.
Em 0,2,4 e 6 horas após indução com IPTG, alíquotas de 1 ml! das culturas foram coleta- : das, a ODgoo foi determinada e a quantidade de isopreno produzida foi medi- da como descrito acima. Os resultados são mostrados na figura 8. ' IV. Produção de isopreno a partir de BL21/ptrecKudzu em fermentação de 14 litros Produção em larga escala de isopreno de E. coli contendo o ge- ne de isopreno sintase de kudzu recombinante foi determinada a partir de uma cultura em batelada alimentada. A fórmula para os meios de fermenta- ção (TM2) por litro de meio de fermentação foi como se segue: KHPO, 13,6 dg KH2PO,13,69g, MASO4 * 7H70 2 g, monohidrato ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônio 0,3 g, (NHa)2SO, 3,2 g, extrato de levedura 5 g, Solução de Metal Traço Modificada 1000X 1 ml. Todos dos componentes foram adi- cionados em conjunto e dissolvidos em diH7O. O pH foi ajustado a 6,8 com ' hidróxido de potássio (KOH) e q.s. para volume. O produto final foi esterili- — 15 zado pro filtração com filtro de 0,22 yu (somente, não autoclavar). A fórmula para Solução de Metal Traço Modificada 1000X foi como se segue: Ácidos Cítricos * HO 40 g, MNSO, * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO, * 7H2O 1 g, CoCla * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuSO, * 5H2O0 100 mg, H;BO;3 100 mg, Na- MoO, * 2H7O0 100 mg. Cada componente foi dissolvido um após outro em ditH7O, pH a3,0com HCI/NaOH, então q.s. para volume e esterilizado pro filtração com um filtro de 0,22 up.
Este experimento foi realizado em biorreator de 14 L para moni- torar a formação de isopreno a partir da glicose em fermentação desejada, pH 6,7 e temperatura 34ºC. Um inóculo de cepa de E. coli BL21/ptreKudzu tomado de um frasco congelado foi preparado em meio de glicose do extrato de soytone-levedura. Após o inóculo ter a ODs5o = 0,6, dois frascos de 600 ml foram centrifugados e os conteúdos ressuspensos em 70 ml de sobrena- dante para transferir o precipitado celular (70 ml! de material OD 3,1) ao bior- reator. Em vários tempos após inoculação, as amostras foram removidas e a — quantidade de isopreno produzida foi determinada como descrito acima. Re- sultados são mostrados na Figura 9.
Exemplo 2: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase V de álamo recombinante A sequência proteica da isopreno sintase de álamo (Populus al- f ba x Populus tremula) (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) foi obtidado GenBank (CAC35696). Um gene, códon otimizado para E. coli, foi adquirido de DNA2.0 (p9796-álamo, figuras 30 e 31). O gene de isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão de endonuclease de restrição com Bspl.U111/Pstl, purificado em gel e ligado em pTrcHis2B que havia sido digerido com Ncol/Pstl. O construto é clonado tal que o códon de parada na inserção esteja antes do sítio Pstl, que resulta em um constru- to no qual a marcação His não é ligada à proteína de isopreno sintase. O plasmídeo resultante pTrcPoplar figuras 32 e 33), foi verificado por sequen- ciamento. Ê Exemplo 3: Produção de isopreno em Panteoa citrea expressando isopreno — 15 sintasedekudzu recombinante Os plasmídeos pTrcKudzu e pCL-lac Kudzu descritos no Exem- plo 1 foram eletroporados em P. citrea (Patente U.S. No. 7.241.587). Trans- formantes foram selecionados em LA contendo carbenicilina (200 pg/ml) ou espectinomicina (50 ug/ml) respectivamente. A produção de isopreno a partir defrascos de agitação e determinação da quantidade de isopreno produzida foi realizada como descrito no Exemplo 1 para cepas de E. coli que expres- sam isopreno sintase de kudzu recombinante. Resultados são mostrados na Figura 10. Exemplo 4: Produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
1. Construção de um plasmídeo para replicação em B. subtilis expressando isopreno sintase de kudzu O gene de isopreno sintase de kudzu foi expresso na cepa de Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK (BG3594comK) usando um plasmídeo de replicação (pBS19 com um cassete de resistência a cloranfenicol) sob controle do promotor aprE. O gene de isopreno sintase, o promotor aprE e o terminador de transcrição foram amplificados separadamente e fusionados usando PCR. O construto então foi clonado em pBS19 e transformado em B.
. subtilis.
a) Amplificação do promotor aprE f O promotor aprE foi amplificado de DNA cromossômico de Bacil- lussubtilis usando os seguintes iniciadores: CF 797 (+) Partida aprE promotor Mfel 5-GACATCAATTGCTCCATITTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:58) CF 07-43 (-)promotor de fusão de aprE a ispS de Kudzu 5-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTITA (SEQ ID NO:59) b) Amplificação do gene de isopreno sintase O gene de isopreno sintase de kKkudzu foi amplificado do plasmí- deo pTrcKudzu (SEQ ID NO:2). O gene havia sido códon otimizado para E.
' coli e sintetizado por DNA 2.0. Os seguintes iniciadores foram usados: 2 1sS CF 07-42 (+) promotor aprE fusionado ao gene de isopreno sin- tase de kudzu (códon de partida GTG) 8"-TASAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:60) CF 07-45 (-) Fusão da extremidade 3' do gene de isopreno sin- tasedekudzu ao terminador 5-CCAAGGCCGGTTTTITTITTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:61) c) Amplificação do terminador de transcrição O terminador da serina protease alcalina de Bacillus amyliquefa- ciens foi amplificado de um plasmídeo anteriormente sequenciado p- JHPms382 usando os seguintes iniciadores: CF 07-44 (+) Fusão da extremidade 3' de isopreno sintase de kudzu ao terminador 5-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAMACCGGCCTTGG (SEQ ID NO:62) — CF 0746() Extremidade do terminador de B. amyliquefaciens (BamHl)
5-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63) : O fragmento kudzu foi fusionado ao fragmento terminador usan- do PCR com os seguintes iniciadores: , CF 07-42 (+) Fusão do promotor aprE ao gene de isopreno sin- tasede kudzu (códon de partida GTG) 5-TAMAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:61) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaciens (BamHl) &8- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63) O fragmento kudzu-terminador foi fusionado ao fragmento pro- motor usando PCR com os seguintes iniciadores: CF 797 (+) Partida aprE promotor Mfel ' 8'- GACATCAATTGCTCCATTITTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:64) CF 07-46 (-) Extremidade do terminador de B. amyliquefaciens (BamHl) 58'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63) O fragmento de PCR de fusão foi purificado usando um conjunto Qiagen e digerido com as enzimas de restrição Mfel e BamHl.
Este fragmen- tode DNA digerido foi purificado em gel usando um conjunto Qiagen e ligado a um vetor conhecido como pBS19, que havia sido digerido com EcoRI e BamHlI e purificado em gel.
A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli Top 10 e colônias foram selecionadas em placas de carbeniciliha LA+50. Um totalde seis colônias foi escolhido e cultivado por uma noite em carbenicilina LB+50 e então os plasmídeos foram isolados usando um conjunto Qiagen.
Os plasmídeos foram digeridos com EcoRI e BamHI para verificar inserções e três dos plasmídeos corretos foram entregues para sequenciamento com os seguintes iniciadores: CF 149 (+) EcoRI partida de promotor aprE 8-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:65) CF 847 (+) Sequência em pXX 049 (extremidade do promotor aprE) ; 5-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO:66) CF 07-45 (-) Fusão à extremidade 3' de isopreno sintase de kud- í zu ao terminador &8-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:61) CF 07-48 (+) Iniciador do sequenciamento para isopreno sintase de kudzu 8'- CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO:67) CF 07-49 (+) Sequenciamento na isopreno sintase de kudzu 8"- GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO:68) O plasmídeo designado pBS Kudzu *2 figuras 52 e 12) estava correto por sequenciamento e foi transformado em BG 3594 comK, uma ce- Í pa hospedeira de Bacillus subtilis.
A seleção foi feita em placas LA + 5 clo- 2 15 ranfenicol.
Um transformante foi escolhido e batido em colônias únicas em LA + 5 cloranfenicol, então cultivado em LB+5 cloranfenicol até que alcan- çasse uma ODgço, de 1,5. Foi armazenado congelado em um frasco a -80ºC na presença de glicerol.
A cepa resultante foi designada CF 443. Il.
Produção de isopreno em frascos de agitação contendo célu- lasdeB. subtilis expressando isopreno sintase recombinante Culturas de uma noite foram inoculadas com uma colônia única de CF 443 de um LA + Cloranfenicol (Cm, 25 pg/ml). Culturas foram cultiva- das em LB + Cm a 37ºC com agitação a 200 rpm.
Estas culturas de uma noite (1 ml) foram usadas para inocular frascos de agitação com comparti- —mentosde 250 ml contendo 25 ml de Meios Grants || e cloranfenicol em uma concentração final de 25 ug/ml.
A fórmula de Meios Grants |l era 10 g de soytone, 3 ml de K2HPO, 1M, 75 g de glicose, 3,6 g de ureia, 100 ml de MOPS 10X, q.s. para 1 L com HzO, pH 7,2; a fórmula de MOPS 10X era 83,72 g de MOPS, 7,17 g de tricina, 12 g de KOH precipitado, 10 ml de solu- çãodeK SO,0,276M, 10 ml de solução de MgCl2 0,528M, 29,22 g de NaCl, 100 ml de micronutrientes 100X, q.s. para 1 L com HO; e fórmula de micro- nutrientes 100X era 1,47 g de CaCl*2H2,0, 0,4 g de FeSO,*7H20, 0,1 g de
MnSO,4"H20, 0,1 g de ZnSO,"H2O, 0,05 g de CuCls*2H,O, 0,1 g de Co- : CI2*68H2O, 0,1 g de Na2MoO,4*2H20O, q.s. para 1 L com HzO. Frascos de agi- tação foram incubados a 37ºC e as amostras foram tomadas em 18, 24 e 44 ' horas. Em 18 horas, os espaços de cabeça de CF443 e a cepa controle fo- ram escolhidos. Isto representou 18 horas de acúmulo de isopreno. A quan- tidade de isopreno foi determinada por cromatografia gasosa como descrito no Exemplo 1. A produção de isopreno foi aumentada significativamente pela expressão de isopreno sintase recombinante figura 11).
III. Produção de isopreno por CF443 em fermentação de 14 L Produção em larga escala de isopreno de B. subtilis contendo o gene de isopreno sintase de kudzu recombinante em um plasmídeo de repli- cação foi determinada a partir de uma cultura em batelada alimentada. Cepa de Bacillus CF 443, expressando um gene de isopreno sintase de kudzu, ou : cepa controle a qual não expressa um gene de isopreno sintase de kudzu foi . 15 cultivada por fermentação em batelada alimentada convencional em um meio nutriente contendo farelo de soja (Cargill), fosfato de sódio e potássio, sulfato de magnésio e uma solução de ácido cítrico, cloreto férrico e cloreto de manganês. Antes da fermentação os meios são macerados por 90 minu- tos usando uma mistura de enzimas incluindo celulases, hemicelulases e pectinases (ver, WOS95/04134). As fermentações em batelada de 14 L são alimentadas com glicose 60% p/p (dextrose Cargill DE99, ADM Versadex greens ou açúcar invertido Danisco) e óleo 99% p/p (óleo de soja Western Family, onde 99% p/p é a concentração de óleo antes de ser adicionado ao meio de cultura celular). Alimentação foi iniciada quando glicose na batelada era não detectável. A taxa de alimentação foi reduzida várias horas e foi a- justada para adicionar óleo em uma base de carbono igual. O pH foi contro- lado em 6,8 a 7,4 usando hidróxido de amônio 28% p/v. Em caso da espu- ma, agente anti-espumante foi adicionado aos meios. A temperatura de fer- mentação foi controlada a 37ºC e a cultura de fermentação foi agitada a 750 rpm. Vários outros parâmetros, tais como pH, DO%, corrente de ar e pres- são, foram monitorados ao longo do processo inteiro. DO% é mantida acima de 20. Amostras foram tomadas ao longo do curso de tempo de 36 horas e analisadas quanto ao crescimento celular (ODs5509) e produção de isopreno. ' Resultados destes experimentos são apresentados nas figuras 53A e 53B.
IV.
Integração de isopreno sintase de Kudzu (ispS) em B. subtilis. ' O gene de isopreno sintase de kudzu foi clonado em um plasmí- deo de integração (pJH101-cmpR) sob controle do promotor aprE.
Sob as condições testadas, nenhum isopreno foi detectado.
Exemplo 5: Produção de isopreno em Trichoderma |. Construção de vetores de expressão da isopreno sintase de kudzu em Trichoderma reesei O gene de IS de kudzu códon-otimizado de Yarrowia lipolytica foi sintetizado por DNA 2.0 (SEQ ID NO:8) figura 13). Este plasmídeo serviu como molde para a seguinte reação de amplificação por PCR: 1 uL de plas- mídeo molde (20 ng/ul)) 1 ul de Iniciador EL-945 (10 uM) 5- ' GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG É (SEQ |D — 15 NOS9, 1 ul de Iniciador EL-965 (10 uM) 5- : CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO:10), 1 ul de dNTP (10 mM), 5 uL de Tampão PfuUltra 1! Fusion HS DNA Polimerase 10x, 1 ul de PfuUltra Il Fusion HS DNA Polimerase, 40 ul. de água em um volu- me de reação total de 50 ul.
O iniciador de sentido direto continha 4 nucleo- tídeos adicionais na extremidade 5' que não correspondiam ao gene de iso- preno sintase de kudzu códon-otimizado de Y. lipolytica, mas foi necessário para clonagem no vetor pENTR/D-TOPO.
O iniciador de sentido reverso continha 21 nucleotídeos adicionais na extremidade 5' que não correspondi- am ao gene de isopreno sintase de kKudzu códon-otimizado de Y. lipolytica, mas foram inseridos para clonagem em outros esqueletos de vetor.
Usando o Termociclador MJ Research PTC-200, a reação de PCR foi realizada como se segue: 95ºC por 2 minutos (primeiro ciclo somente), 95ºC por 30 segun- dos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 30 segundos (repetição para 27 ci- clos), 72ºC por 1 minuto após o último ciclo.
O produto de PCR foi analisado emum E-gel 1,2% para confirmar a amplificação bem-sucedida do gene de isopreno sintase de kudzu códon-otimizado de Y. lipolytica.
O produto de PCR então foi clonado usando o Conjunto de Clo-
nagem TOPO pENTR/D-TOPO após protocolo do fabricante: 1 ul de reação ' de PCR, 1 ul de solução de Sal, 1 ul. de vetor TOPO pENTR/D-TOPO e 3 HL de água em um volume de reação total de 6 ul. A reação foi incubada à ' temperatura ambiente por 5 minutos. Um microlitro da reação TOPO foi transformado em células TOP10 de E. coli quimicamente competentes. Os transformantes foram selecionados em placas de LA + canamíicina 50 pg/ml. Várias colônias foram escolhidas e cada uma foi inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB + canamícina 50 pg/ml e as culturas cultivadas por uma noi- te a 37ºC com agitação a 200 rpm. Os plasmídeos foram isolados dos tubos de cultura de uma noite usando Conjunto QIAprep Spin Miniprep, após pro- tocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificação se a sequência de DNA era correta. Um plasmídeo pENTR/D-TOPO único, codificando um gene de ] isopreno sintase de kudzu códon-otimizado de Y. lipolytica, foi usado para É 15 Gateway Cloning em um vetor pTrex3g feito sob encomenda. Construção de pTrex3g é descrita em WO 2005/001036 A2. A reação foi realizada após protocolo do fabricante para o Conjunto Gateway LR Clonase |l Enzyme Mix (Invitrogen): 1 ul. de vetor doador pENTR/D-TOPO do gene de isopreno sin- tase de kudzu códon-otimizado de Y. lipolytica, 1 ul. de vetor de destino p- Trex3g,6 yL de tampão TE, pH 8,0 em um volume de reação total de 8 ul. A reação foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora e então 1 ul de solução de proteinase K foi adicionado e a incubação continuada a 37ºC por 10 minutos. Então 1 ul. da reação foi transformado em células TOP10 de E. coli quimicamente competentes. Os transformantes foram selecionados em —placasdeLA + carbenicilina 50 pg/ml. Várias colônias foram escolhidas e cada uma foi inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB + carbenicilina 50 uLg/ml e as culturas foram cultivadas por uma noite a 37ºC com agitação a 200 rpm. Os plasmídeos foram isolados dos tubos de cultura noturna usando Conjunto QlAprep Spin Miniprep (Qiagen, Inc), após protocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificar que a sequência de DNA era correta.
A transformação por biolística de plasmídeo pTrex3g de isopre-
no sintase de kudzu códon-otimizado de Y. lipolytica figura 14) em uma de- Ú leção quádrupla da cepa de Trichoderma reesei foi realizada usando o Bio- listic PDS-1000/HE Particle Delivery System (ver WO 2005/001036 A2). Iso- ' lamento de transformantes estáveis e avaliação por frasco de agitação foi realizado usando protocolo listado no Exemplo 11 da publicação patente WO 2005/001036 A2.
11. Produção de isopreno em cepas recombinantes de T. reesei Um mil de culturas de 15 e 36 horas de transformantes de iso- preno sintase descritos acima foram transferidos para frascos de espaço de cabeça. Os frascos foram selados e incubados por 5 horas a 30ºC. Gás de espaço de cabeça foi medido e isopreno foi identificado pelo método descrito no Exemplo 1. Dois dos transformantes mostraram traços de isopreno. À quantidade de isopreno pode ser aumentada por uma incubação de 14 ho- fá ras. Duas amostras positivas mostraram isopreno em níveis de aproxima- i 15 damente 0,5 ug/L para 14 horas de incubação. O controle não transformado : não mostrou nível detectável de isopreno. Este experimento mostra que T. reesei é capaz de produção de isopreno do precursor endógeno quando for- necido uma isopreno sintase exógena. Exemplo 6: Produção de isopreno em Yarrowia |. Construção de vetores para expressão de isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica. O ponto de partida para a construção de vetores para a expres- são do gene de isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica foi o vetor PSPZ1 (MAP29Spb). A sequência completa deste vetor (SEQ ID No:11) é mostrada na figura 15. Os seguintes fragmentos foram amplificados por PCR usando DNA cromossômico de uma cepa de Y. lipolytica GICC 120285 como molde: uma forma sem promotor do gene URA3, um fragmento gênico de RNA ri- bossomal 188, um terminador de transcrição do gene XPR2 de Y. lipolytica e dois fragmentos de DNA contendo os promotores de genes XPR2 e ICL1. Os seguintes iniciadores PCR foram usados: ICL1 3
&8-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ : ID NO:69) ICLI5 á 8"- GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO:70) XPR3 858'- CCOTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO:71) XPR5 8- GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO:72) XPRT3 5-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO:73) XPRT5 58"- GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO:74) Y18S3 ' 8"- GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCOTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO:75) 5 Y18S 5 ' 5'- GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO:76)
YURAS 8'- GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO:77) YURA 50 5&-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO:78) YURA 51 8"- GCEGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO:79) Para a amplificação por PCR, a PfuUltrall polimerase (Stratage- ne), tampão fornecido pelo fornecedor e dNTP's, iniciadores 2,5 UM e DNA de molde indicado foram usados de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação foi feita usando o seguinte ciclo: 95ºC por 1 min; 34x (95ºC por 30 segundos; 55ºC por 30 segundos; 72ºC por 3 min) e 10 min a 72ºC seguido por uma incubação a 4ºC. Moléculas de DNA sintético que codificam o gene de isopreno sintasede kudzu, códon-otimizado para expressão em Yarrowia, foram obti- das de DNA 2.0 figura 16; SEQ ID NO:12). Detalhes completos do esquema de construção dos plasmídeos pYLA (KZ1) e pYLI (KZ1) carregando o gene de isopreno sintase de kudzu sintético sob controle de promotores XPR2 e ' ICL1 respectivamente são apresentados na figura 18. Plasmídeos de contro- le nos quais um gene de fator auxiliar (MAP29) é inserido no lugar de um ã gene de isopreno sintase também foram construídos nas figuras 18E e 18F). Um procedimento de clonagem similar pode ser usado para ex- pressar um gene de isopreno sintase de álamo (Populus alba x Populus tre- mula). A sequência do isopreno de álamo é descrita em Miller B. et a/. (2001) Planta 213, 483-487 e mostrada na figura 17 (SEQ ID NO:13). Um esquema de construção para a geração dos plasmídeos pYLA (POP1) e pYL!I (POP1) carregando gene de isopreno sintase de álamo sintético sob controle de promotores XPR2 e ICL1 respectivamente é apresentado na Figura 18A e B. 1l. Produção de isopreno por cepas recombinantes de Y. lipolyti- ca.
á Os vetores pYLA (KZ1), pYL! (KZ1), pYLA (MAP29) e pyYLI (MAP29) foram digeridos com Sacll e usados para transformar a cepa de Y. - lipolytica CLIB 122 por um procedimento de acetato de lítio /polietilenoglico! padrão para fototrofia por uridina. Resumidamente, as células de levedura cultivadas em YEPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%, glicose 2%) por uma noite, foram coletadas por centrifugação (4000 rpm, 10 min), lavadas uma vez com água estéril e suspensas em acetato de lítio 0,1 M, pH 6,0. Alíquotas de duzentos ul. da suspensão celular foram misturadas com solu- ção de DNA plasmidial linearizada (10 a 20 ug), incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e misturadas com 1 ml de PEG 4000 50% no mesmo tampão. As suspensões foram ainda incubadas por 1 hora à temperatura ambiente seguida por um choque de calor por 2 minutos a 42ºC. Células então foram plaqueadas em placas SC his leu (base de nitrogênio de levedu- ra 0,67%, glicose 2%, 100 mg/L de cada de leucina e histidina). Transfor- mantes apareceram após 3 a 4 dias de incubação a 30ºC. Três isolados a partir da transformação de pYLA (KZ1), três iso- lados a partir da transformação de pYLI (KZ1), dois isolados a partir da transformação de pYLA (MAP29) e dois isolados a partir da transformação pYL! (MAP29) foram cultivados por 24 horas em meio YEP7 (extrato de le-
vedura 1%, peptona 2%, pH 7,0) a 30ºC com agitação.
Células de 10 ml de . cultura foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em 3 ml de YEP7 fresco e colocadas em frascos de tampa rosqueável de 15 ml.
Os frascos ' foram incubados por uma noite à temperatura ambiente com agitação suave (60rpm). O conteúdo de isopreno no espaço de cabeça destes frascos foi analisado por cromatografia gasosa usando detector massa-espectrométrico como descrito no Exemplo 1. Todos os transformantes obtidos com pYLA (KZ1) e pYL! (KZ1) produziram quantidades prontamente detectáveis de iso- preno (0,5 ug/L a 1 ug/L, figura 20). Nenhum isopreno foi detectado no es- —paçode cabeça das cepas controle carregando gene de fitase em vez de um gene de isopreno sintase.
Exemplo 7: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de Kkudzu e idi, ou dxs, ou idi e dxs ' |. Construção de vetores que codificam isopreno sintase de kud- : 15 zueidi, ou dxs, ou idi e dxs para a produção de isopreno em E. coli ' i.
Construção de pTrecKudzuKan O gene bla de pTrcKudzu (descrito no Exemplo 1) foi substituído pelo gene que confere resistência à canamicina.
Para remover o gene bla, pTrceKudzu foi digerido com BspHI, tratado com Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP), neutralizado por calor a 65ºC, então preenchido de fragmento Klenow e dNTPs.
O grande fragmento de 5 kbp foi purificado de um gel de agarose e ligado ao gene kan' que havia sido amplificado por PCR de pCR-Blunt-1l- TOPO usando iniciadores MCM22 5-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCA GCTG (SEQ ID NO:14) e MCM23 5-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTC AAGAAGGC (SEQ ID NO:15), digerido com Hindlll e Pvul, e preenchido.
Um transformante carregando um plasmídeo conferindo resistência à canamicina (pTreKudzuKan) foi selecionado em LA contendo canamiíicina 50 pa/ml. ii) Construção de pTrcKudzu yIDI Kan pTrcKudzuKan foi digerido com Pstl, tratado com SAP, neutrali- —zado por calor e purificado em gel.
Foi ligado a um produto de PCR que co- difica idi de S. cerevisiae com um RBS sintético.
Os iniciadores para POR foram Nsil-YIDI 1 F -CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAA AAAA-
ATGAC (SEQ ID NO:16) e Pstl-YIDI 1 R 5-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTT ' ATAGC (SEQ ID NO:17); e o molde foi DNA genômico de S. cerevisiae. O produto de PCR foi digerido com Nsil e Psfl e purificado em gel antes da li- ' gação. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 quimica- mente competentes e selecionada em LA contendo canamicina 50 pg/ml. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resul- tante foi chamado pTreKudzu-yIDI (can) (figuras 34 e 35). iii) Construção de pTrecKudzu DXS Kan O plasmídeo pTrcKudzuKan foi digerido com Pstl, tratado com SAP, neutralizado por calor e purificado em gel. Foi ligado a um produto de PCR que codifica dxs de E. coli com um RBS sintético. Os iniciadores para PCR foram MCM13 5-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAA AAAA- CATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO:18) e MCM14 5- ] CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19); e o molde : 15 foi DNA genômico de E. coli. O produto de PCR foi digerido com Nsil e Pstl e : purificado em gel antes da ligação. A reação de transformação resultante foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA com canamicina 50 upg/ml. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi chamado pTrcKudzu-DXS (can) (figuras 36 e 37). iv) Construção de pTrcKudzu-yIDI-dxs (can) pTrcKudzu-yIDI (can) foi digerido com Pstfl, tratado com SAP, neutralizado por calor e purificado em gel. Foi ligado a um produto de PCR que codifica dxs de E. coli com um RBS sintético (iniciadores MCM13 5'-
GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGC CAAATACCCG (SEQ ID NO:18) e MCM14 5-CATGCTGCAGTTAT GC- CAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19); células TOP10 de molde) que ha- via sido digerido com Nsil e Pstl e purificado em gel. O plasmídeo final foi chamado pTrceKudzu-yIDI-dxs (can) figuras 21 e 22). v) Construção de pCL PtrcKudzu Um fragmento de DNA contendo o promotor, gene estrutural e terminador do Exemplo 1 acima foi digerido de pTrcKudzu usando Sspl e purificado em gel. Foi ligado a pCL1920 que havia sido digerido com Pvull,
tratado com SAP e neutralizado por calor. A mistura de ligação resultante foi E transformada em células TOP10 e selecionada em LA contendo espectino- micina 50 pg/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e dois foram ' selecionados. pCL PtrcKudzu e pCL PtrcKudzu (A3) têm o inserto em orien- tações opostas (figuras 38 a 41).
vi) Construção de pCL PtrcKudzu yIDI O Nsil-Pstl digerido, purificado em gel, amplicon de PCR de IDI (ii) acima foi ligado em pCL PtrcKudzu que havia sido digerido com Pstl, tra- tado com SAP e neutralizado por calor. A mistura de ligação foi transformada em células TOP1O e selecionada em LA contendo espectinomicina 50 pg/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado pCL PtrcKudzu ylIDI (figuras 42 e 43).
vii) Construção de pCL PtreKudzu DXS O Nsil-Pstl digerido, purificado em gel, amplicon de PCR de DXS É 15 de (iii) acima foi ligado em pCL PtrcKudzu (A3) que havia sido digerido com e Pstl, tratado com SAP e neutralizado por calor. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA contendo espectino- micina 50 ug/ml. Vários clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado pCL PtrcKudzu DXS(figuras 44 e 45).
Il. Medida de isopreno em espaço de cabeça de culturas expres- sando isopreno sintase de kudzu, idi, e/ou dxs em números de cópia diferen- tes.
Culturas de E. coli BL21 (ADE3) anteriormente transformadas com plasmídeos pTrcKudzu(can) (A), pTrcKudzu-yIDI can (B), pTrecKudzu- DXScan(C), pTrecKudzu-yIDI-DXS can (D) foram cultivadas em LB canami- cina 50 ug/mL. Culturas de pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL Ptrc- Kudzu-yIDI (F) e pCL PtrcKudzu-DXS (G) foram cultivadas em LB especti- nomicina 50 ug/mL. Culturas foram induzidas com IPTG 400 UM no tempo O (ODgoo aproximadamente 0,5) e amostras tomadas para a medida de espaço de cabeça de isopreno (ver Exemplo 1). Os resultados são mostrados nas Figuras 23A a 23G.
O plasmídeo pTreKudzu-yIDI-dxs (can) foi introduzido em BL21 de cepa de E. coli por transformação. A cepa resultante BL21/pTrc Kudzu IDI ' DXS foi cultivada por uma noite em LB contendo canamicina (50 pg/ml) a 20ºC e usada para inocular frascos de agitação de TM3 (13,6 g de K2PO;, ' 13,6 g de KH.PO,, 2,0 g de MgASOs*7H2O), 2.0 g de monohidrato de ácido cítrico, 0,3g de citrato férrico de amônio, 3,2 g de (NH4)2SO;, 0,2 g de extra- to de levedura, 1,0 ml de Solução de Metal Traço Modificada 1000x, ajusta- da a pH 6,8 e q.s. para H20, e filtro esterilizado) contendo glicose 1%. Os frascos foram incubados a 30ºC até que uma ODsoo de 0,8 fosse alcançada, e então induzidos com IPTG 400 UM. Amostras foram tomadas em vários tempos após indução e a quantidade de isopreno no espaço dianteiro foi medida como descrito no Exemplo 1. Resultados são mostrados na figura 23a.
Ill. Produção de isopreno a partir de biomassa em E. co- : lilpTreKudzu yIDI DXS : 15 A cepa BL21 pTrceKudzulDIDXS foi testada para a capacidade ' de gerar isopreno a partir de três tipos de biomassa; bagaço, palha de milho e polpa de madeira mole com glicose como um controle. Hidrolisados da biomassa foram preparados por hidrólise enzimática (Brown, L and Torget, R., 1996, NREL standart assay method LAP-O009 "Enzymatic Saccharification ofLignocellulosic Biomass") e usados em uma diluição com base em equiva- lentes de glicose. Neste exemplo, equivalentes de glicose foram iguais à gli- cose 1%. Uma colônia única de uma placa de células BL21 recentemente transformadas (DE3) pTrceKudzu yIDI DXS (can) foi usada para inocular 5 ml de LB mais canamicina (50 pg/ml). A cultura foi incubada por uma noite a 25ºC com agitação. No dia seguinte a cultura noturna foi diluída a uma ODçsoo de 0,05 em 25 ml de TM3 + YE 0,2% + matéria-prima 1%. A matéria-prima foi palha de milho, bagaço ou polpa de madeira mole. Glicose foi usada co- mo um controle positivo e nenhuma glicose foi usada como um controle ne- gativo. Culturas foram incubadas a 30ºC com agitação a 180 rpm. A cultura foimonitorada para ODgoo e quando alcançou uma ODgço, de —O,8, as cultu- ras foram analisadas em 1 e 3 horas para produção de isopreno como des- crito no Exemplo 1. Culturas não são induzidas. Todas as culturas contendo matéria-prima adicionada produzem isopreno equivalente àquelas da glicose . de controle positivo.
Experimentos foram feitos em duplicata e são mostra- dos na figura 46. ' IV.
Produção de isopreno a partir de açúcar invertido em E. co- lipTreKudzulDIDXS Uma colônia única de uma placa de células BL21 recentemente transformadas (ADE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (can) foi usada para inocular 5 mL de LB + canamicina (50 pg/ml). A cultura foi incubada por uma noite a 25ºC com agitação.
No dia seguinte a cultura noturna foi diluída a uma ODçoo de005em2?25mldeTM3 +YE 0,2% + matéria-prima 1%. Matéria-prima foi glicose, glicose invertida ou palha de milho.
A matéria-prima de açúcar inver- tido (Açúcar invertido de Danisco) foi preparada pelo tratamento enzimático de xarope de sacarose.
A palha de milho AFEX foi preparada como descrita i abaixo (Parte V). As células foram cultivadas a 30ºC e a primeira amostra foi ' 15 medida quando as culturas alcançaram uma ODçoo de -0,8 a 1,0 (hora O). As ' culturas foram analisadas para o crescimento como medido por ODsoo e para produção de isopreno como no Exemplo 1 em 0, 1 e 3 horas.
Resultados são mostrados na figura 47. V.
Preparação do hidrolisado a partir de palha de milho pré- tratada AFEX Palha de milho pré-tratada AFEX foi obtida do Michigan Biotech- nology Institute.
As condições de pré-tratamento foram 60% de umidade, carga de amônia 1:1, e 90ºC por 30 minutos, então ar seco.
O conteúdo de umidade na palha de milho pré-tratada AFEX era 21,27%. Os conteúdos de glicanae xilana na palha de milho pré-tratada AFEX foram 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente.
O processo de sacarificação foi como se se- gue; 20 g de palha de milho pré-tratada AFEX foram adicionados em um frasco de 500 ml com 5 ml de tampão citrato de sódio 1 M pH 4,8, 2,25 ml de Accellerase 1000, 0,1 ml! de Grindamyl H121 (produto de xilanase de Danis- codo Aspergillus niger da indústria panificadora), e 72,65 ml de água DI.
O frasco foi posto em um agitador orbital e incubado a 50ºC por 96 horas.
Uma amostra foi tomada do agitador e analisada usando HPLC.
O hidrolisado continha 38,5 g/I de glicose, 21,8 g/l de xilose, e 10,3 g/l de oligômeros de ! glicose e/ou xilose.
VI.
O efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em Ô E. coli cultivada em cultura de batelada alimentada Fermentação foi realizada em escala de 14 L como anteriormen- te descrito com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu yIDI DXS descrito acima.
O extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Ca- nadá) foi alimentado em uma taxa exponencial.
A quantidade total do extrato de levedura entregue ao fermentador foi variada entre 70 a 830 g durante as 40 horas de fermentação.
Densidade ótica do caldo de fermentação foi me- dida em um comprimento de onda de 550 nm.
A densidade ótica final dentro dos fermentadores foi proporcional à quantidade do extrato de levedura adi- cionado (figura 48A). O nível de isopreno no efluente gasoso do fermentador f foi determinado como anteriormente descrito.
O título de isopreno aumentou i 15 ao longo do curso da fermentação (figura 48B). A quantidade de isopreno : produzida foi linearmente proporcional à quantidade do extrato de levedura alimentada (figura 48C). VII.
Produção de isopreno em 500 L de fermentação de pTrc- Kudzu DXS ylIDI Uma fermentação de 500 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisiae e DXS de E. coli (E. coli BL21 (ADE3) pTrc Kudzu dxs yidi) foi usada para produzir isopreno.
Os níveis de isopreno variaram de 50 a 300 ug/L ao longo de um período de tempo de 15 horas.
Com base nas concentrações de isopreno médias, o fluxo médio através do dispositivo e a extensão do avanço de isopreno, a quantidade de isopreno coletada foi calculada sendo aproximadamente 17 g.
VIII.
Produção de isopreno em fermentação de 500 L de E. coli cultivada em cultura em batelada alimentada Fórmula do Meio (por litro de meio de fermentação): K2HPO, 7,5 g, MASO, * 7H2O 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônio 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, 1 ml de Solução de Metal Traço Modificada 1000X.
Todos os componentes foram adiciona-
dos em conjunto e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi autoclavada. O pH ' foi ajustado a 7,0 com gás amônia (NH;3) e q.s. para volume. Glicose 10 9, tiamina * HCI 0,1 g e antibiótico foi adicionada após ajuste de pH e esterili- ' zação. Solução de Metal Traço Modificada 1000X: Ácidos Ciítricos * HyO 40 g, MnSO, * H2O 30 g, NaCl 10 g, Fe- SO4”* 7H20 1 g, CoCkl * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuSO,* 5H2O0 100 mg, H3BO;3 100 mg, NaMoO, * 2H,O0 100 mg. Cada componente é dissolvido um após outro em DI HO, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. para volume e filtroesterilizado com filtro de 0,22 mícron.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 500 L com célu- las de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu yIDI DXS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno de glicose e extrato de : levedura na fermentação desejada pH 7,0 e temperatura 30ºC. Um inóculo : 15 dacepade£.colitomada de um frasco congelado foi preparado em meio de ' glicose do extrato de soytone-levedura. Após o inóculo crescer a OD 0,15, medido em 550 nm, 20 ml foi usado para inocular um biorreator contendo 2,5 L de meio de glicose do extrato de soytone-levedura. O biorreator de 2,5 L foi cultivado a 30ºC a OD 1,0 e 2,0 L foram transferidos para o biorreator de 500L.
Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) e glicose foi alimentado em taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura disponibilizada ao biorreator durante as 50 horas de fermentação foi 181,2 quilogramas e 17,6 quilogramas, respectivamente. À densidade ótica dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrada na Figu- ra 49A. O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi determinado como anteriormente descrito. O título de isopreno aumentou ao longo do Curso da fermentação figura 49B). A quantidade total de isopreno produzida durante as 50 horas de fermentação foi 55,1 g e o curso de tempo da produ- çãoé mostrado na figura 49C.
Exemplo 8: Produção de isopreno em E. coli expressando genes da via de isopreno sintase de kudzu e ácido mevalônico recombinante
1. Clonagem da via de MVA inferior : A estratégia para clonagem da via mevalônica inferior foi como se segue. Quatro genes da via de biossíntese de ácido mevalônico; genes ' de mevalonato quinase (MVK), fosfomevalonato quinase (PMK), difosfome- — valonatodecarboxilase (MVD) e isopentenil difosfato isomerase foram ampli- ficados por PCR de DNA cromossômico de S. cerevisiae e clonados indivi- dualmente no plasmídeo pCR Bluntll TOPO (Invitrogen). Em alguns casos, o gene idi foi amplificado de DNA cromossômico de E. coli. Os iniciadores fo- ram desenhados tal que um RBS consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID NO:80) ou AAGGAGG (SEQ ID NO:81)) fosse inserido na extremidade 5', 8 pb a montante do códon de partida e um sítio Pstl foi adicionado na extremi- dade 3'. Os genes então foram clonados um por um no vetor pTrcHis2B até que a via completa fosse montada. ' DNA cromossômico de S. cerevisiae S288C foi obtido de ATCC : 15 (ATCC 204508D). O gene MVK foi amplificado do cromossomo de S. cerevi- - siae usando iniciadores MVKF (5-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCG TTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO:21) e MVK-Pst1-R (5-ATGGCTGCAGG CCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO: 22) usando PfuTurbo de acordo com as instruções do fabricante. O produto dePCR de tamanho correto (1370 pb) foi identificado por eletroforese atra- vés de um E-gel 1,2% (Invitrogen) e clonado em pZeroBLUNT TOPO. O plasmídeo resultante foi designado pMVK1. O plasmídeo pMVK1 foi digerido com endonucleases de restrição Sacl e Taq1 e o fragmento foi purificado em gel e ligado em pTrcHis2B digerido com Sacl e BsíBI. O plasmídeo resultan- tefoidenominado pTrcMVK1.
O segundo gene na via de biossíntese de ácido mevalônico, PMK, foi amplificado por PCR usando iniciadores: Pstl-PMK1 R (5-GAA TTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO:23) e BsiHKA I-PMK1 F (5-CG ACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO:24). À reação por PCR foi realizada usando Pfu Turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as instruções de fabricante. O produto de tamanho correto (1387 pb) foi digerido com Pstl e BsiHKI e ligado em pTrcMVK1 digerido com Pstl.
O plasmídeo resultante foi denominado pTrcKK.
O MVD e os genes idi foram : clonados da mesma maneira.
PCR foi realizado usando os pares de iniciador Pstl-MVD 1 R (5-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO:25) e Nsil-MVD 1 F (S-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID NO:26) para amplificar o gene MVD e Pstl-YIDI 1 R (S-CCTTCTGCAGGA CGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO:27) e Nsil-YIDI 1 F (5-CATCAATGCA TCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID NO:28) para amplificar o gene yIDI.
Em alguns casos, o gene de IPP isomerase, idi de E. coli foi usado.
Para amplificar idi de DNA cromossômico de E. coli, o seguinte con- junto de iniciador foi usado: Pstl-CIDI 1 R (S-GTGTGATGGATATCTG CA- GAATTCG, SEQ ID NO:29) e Nsil-CIDI 1 F (S-CATCAATGCATCGCCCTTA GGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID NO:30). DNA de molde foi DNA cromos- sômico isolado por métodos padrão de FM5 de E. coli (WO 96/35796 e WO i 2004/033646, que são cada um por meio deste incorporados por referência i 15 em suas totalidades, particularmente em relação ao isolamento de ácidos - nucleicos). Os plasmídeos finais foram denominados pKKDly para o constru- to que codifica o gene idi de levedura ou pKKDIc para o construto que codifi- ca o gene jidi de E. coli.
Os plasmídeos foram transformados em cepas de E. coli BL21 para análise subsequente.
Em alguns casos, a isopreno sintase de
—Kkudzufoiclonada em plasmídeo pKKDIy produzindo pKKDIyIS.
A via de MVA inferior também foi clonada em pTrc contendo um marcador de resistência ao antibiótico canamicina.
O plasmídeo pTrcKKDIy foi digerido com endonucleases de restrição Apal e Pstl, fragmento de 5930 pb foi separado em agarose E-gel 1,2% e purificado usando o conjunto Qia- genGelPurification de acordo com as instruções do fabricante.
O plasmídeo pTrceKudzuKan, descrito no Exemplo 7, foi digerido com endonucleases de restrição Apal e Pstl, e fragmento de 3338 pb contendo o vetor foi purificado em um E-gel 1,2% usando o conjunto Qiagen Gel Purification.
O fragmento de vetor de 3338 pb e o fragmento da via de MVA inferior de 5930 pb foram ligados usando o conjunto Roche Quick Ligation.
A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 de E. coli e tranformantes foram cultivados a 37ºC por uma noite com seleção em LA contendo canamicina (50 pg/ml).
Os transformantes foram verificados por digestão de enzima de restrição e cada um foi congelado como um estoque. O plasmídeo foi designado pTrc- KanKKDIy. Il. Clonagem de um gene de isopreno sintase de kudzu em p- TrcKanKKDIy O gene de isopreno sintase de kudzu foi amplificado por PCR de pTrcKudzu, descrito no Exemplo 1, usando iniciadores MCM50 5-GATCATG
CATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTT ACT (SEQ ID NO:31) e MCM53 5-CGGTCGACGGATCCCOTGC AGTTAGA- CATACATCAGCTG (SEQ ID NO:32). O fragmento de PCR resultante foi clonado em pCR2.1 e transformado em E. coli TOP10. Este fragmento con- tém a sequência de codificação para isopreno sintase de kKudzu e uma regi- ão a montante contendo um RBS de E. coli. Transformantes foram incuba- : dos por uma noite a 37ºC com seleção em LA contendo carbenicílina (50 : 15 upoml). A inserção correta do fragmento foi verificada pelo sequenciamento e - esta cepa foi designada MCM93. O plasmídeo da cepa MCMS93 foi digerido com endonucleases de restrição Nsil e Pstl para liberar um inserto de 1724 pb contendo o RBS e isopreno sintase de kudzu. O fragmento de 1724 pb foi separado em E-gel de agarose 1,2% e purificado usando o conjunto de Qiagen Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKanKKDly foi digerido com a endonuclease de restrição Pstl, tratado com SAP por 30 mi- nutos a 37ºC e purificado usando o conjunto de limpeza Qiagen PCR. O plasmídeo e a isopreno sintase de kudzu que codifica fragmento de DNA foram ligados usando o conjunto de Roche Quick Ligation. A mistura de liga- ção foi transformada em células TOP10 de E. coli e transformantes foram cultivados por uma noite a 37ºC com seleção em LA contendo Canamíicina em 50 ug/ml. O transformante correto foi verificado por digestão de restrição e o plasmídeo foi designado pTrcKKDylkISKan figuras 24 e 25). Este plas- —mídeofoitransformado em células BL21 (ADE3) (Invitrogen). Ill. Produção de isopreno a partir de mevalonato em E. coli ex- pressando a via de mevalonato inferior recombinante e isopreno sintase de
Kkudzu.
H A cepa BL21/pTrcKKDylkISKan foi cultivada em meio MOPS (Neidhardt et al/., (1974) J.
Bacteriology 119:736-747) ajustado a pH 7,1 e - suplementado com glicose 0,5% e ácido mevalônico 0,5%. Uma cultura con- troletambém foi configurada usando condições idênticas, mas sem a adição de ácido mevalônico 0,5%. A cultura foi iniciada de uma cultura de semente noturna com inóculo 1% e induzida com IPTG 500 uM quando a cultura tinha alcançado uma ODgço, de 0,3 a 0,5. As culturas foram cultivadas a 30ºC com agitação a 250 rpm.
A produção de isopreno foi analisada 3 horas após in- dução usando o ensaio de espaço de cabeça descrito no Exemplo 1. A pro- dução máxima de isopreno foi 6,67 x 10º mol/Lcado/ODçoo/h onde Leaido É O volume de caldo e inclui tanto o volume do meio celular como o volume das células.
A cultura controle não suplementada com ácido mevalônico não é produziu isopreno mensurável.
IV.
Clonagem da via de MVA superior A via biossintética de mevalonato superior, compreendendo dois genes que codificam três atividades enzimáticas, foi clonada de Enterococ- cus faecalis.
O gene mvaE codifica uma proteína com as atividades enzimá- ticas tanto de acetil-CoA acetiltransferase como de 3-hidróxi-3-metilglutaril- —CoA(HMG-CoA) reductase, a primeira e a terceira proteína na via, e o gene mvas codifica a segunda enzima na via, HMG-CoA sintase.
O gene mva£ foi amplificado de DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um sítio de ligação a ribossomo de E. coli e um espaçador na frente usando os seguintes iniciadores: CF 07-60 (+)lIníciodemvaEc/RBS + códon de partida ATG Sacl 5-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:34) CF 07-62 (-) Fusão de mvaE a mvaS com RBS no meio 8"-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTITTITACCTCCTTTATTGTITTTCTTAAATC —(SEQIDNO:35) O gene mvas foi amplificado de DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um RBS e espaçador de E. coli na frente usando os seguintes iniciadores: : CF 07-61 (+) Fusão de mvaE a mvaS com RBS no meio 5-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA ' (SEQ ID NO:36) CF 07-102 (-) Extremidade do gene mvaS Ball 5' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:37) Os fragmentos de PCR foram fusionados em conjunto com PCR usando os seguintes iniciadores: CF 07-60 (+) Partida de mvaE c/ RBS + códon de partida ATG Sacl 5-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:34) CF 07-102 (-) Extremidade do gene mvaS Ball : S-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:37) : 15 O fragmento de PCR de fusão foi purificado usando um conjunto ] Qiagen e digerido com as enzimas de restrição Sacl e Bglll. Este fragmento de DNA digerido foi purificado em gel usando um conjunto Qiagen e ligado no vetor comercialmente disponível pTrcHis2A, que havia sido digerido com Sacl e Bglll e purificado em gel.
A mistura de ligação foi transformada em células Top 10 de E. coli e as colônias foram selecionadas em placas com LA+ carbenicilina 50 ug/ml. Um total de seis colônias foi escolhido e cultivado por uma noite em LB + carbenicilina 50 ug/ml e plasmídeos foram isolados usando um conjun- to Qiagen. Os plasmídeos foram digeridos com Sacl e Bglll para verificar por insertos e um plasmídeo correto foi sequenciado com os seguintes iniciado- res: CF 07-58 (+) Início do gene mvaE 8' -—- ATGAMAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:38) CF 07-59 (-) Extremidade do gene mvaE &8 -ATGTTATTIGTTITTCTTAMATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:39) CF 07-82 (+) Início do gene mvaS 85' —- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:40)
CF 07-83 (-) Extremidade do gene mvaS : 5' = TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:41) CF 07-86 (+) Sequência em mvaE ' 8' — GAMATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:42) CF 07-87 (+) Sequência em mvaE 8' = TIGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:43)
CF 07-88 (+) Sequência em mvaE 5' — GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO:44)
CF 07-89 (+)Sequência em mvaS
8 —-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45)
O plasmídeo chamado pTrcHis2AUpperPathwayttf1 foi correto por sequenciamento e foi transformado na cepa BL21 de E. coli comercial- mente disponível.
A seleção foi feita em LA + carbenicilina 50 ug/ml.
Dois
, transformantes foram escolhidos e cultivados em LB + carbenicilina 50 ug/ml : 15 até que alcançassem uma ODçoo de 1,5. Ambas as cepas foram congeladas ' em um frasco a -80ºC na presença de glicerol.
As cepas foram designadas CF 449 para pTrcHis2AUpperPathwayft1 em BL21, isolado %1 e CF 450 para pTrcHis2AUpperPathwayft1 em BL21, isolado f2. Foi encontrado que ambos os clones se comportavam identicamente quando analisados.
V.
Clonagem da Via de MVA Superior em pCL 1920
O plasmídeo pTrcHis2AUpperPathway foi digerido com a endo- nuclease de restrição Sspl para liberar um fragmento contendo pTrce-mvaE- mvaS-(marcação His)-terminador.
Neste fragmento, a marcação His não foi traduzida.
Este fragmento de 4,5 kbp terminado cego foi purificado de um E-
gel1,2% usando o conjunto Qiagen Gel Purification.
Um fragmento de 4,2 kbp desfosforilado terminado cego de pCL 1920 foi preparado pela digestão do vetor com a endonuclease de restrição Pvull, tratamento com SAP e puri- ficação em gel de um E-gel 1,2% usando o conjunto Qiagen Gel Purification.
Os dois fragmentos foram ligados usando o Roche Quick Ligation Kit e trans-
formados em células TOP10 quimicamente competentes.
Transformantes foram selecionados em LA contendo espectinomicina (50 pg/ml). Uma colô- nia correta foi identificada pelo rastreamento para a presença do inserto por
PCR.
O plasmídeo foi designado pCL PtrcUpperPathway figuras 26 e 27A a : 27D). VI.
Cepas expressando as Vias de Ácido Mevalônico Superior e ' Inferior combinadas Para obter uma cepa com uma via de ácido mevalônico comple- ta mais isopreno sintase de kudzu, os plasmídeos pTrcKKDylkISkan e p- CLpTreUpperPathway foram ambos transformados em células competentes BL21 (ADE3) (Invitrogen) e os transformantes foram selecionados em LA contendo Canamicina (50 ug/ml) e Espectinomicina (50 ug/ml). Os transfor- mantes foram verificados pelo plasmídeo prep para assegurar que ambos os plasmídeos foram conservados no hospedeiro.
A cepa foi designada MCM127. VII.
Produção de ácido mevalônico de glicose em E. colil puUp- perpathway ' 15 As colônias únicas de BL21/pTreHis2A-mvaE/mvaS ou FM5/p - pTreHis2A-mvaE/mvaS são inoculadas em LB + carbenicilina (100 pg/ml) e são cultivadas por uma noite a 37ºC com agitação a 200 rpm.
Estas culturas foram diluídas em 50 ml de meio em frascos de 250 ml com compartimentos a uma ODçoo de 0,1. O meio foi TM3 + glicose 1 ou 2% + carbenicilina (100 ug/ml) ou TM3 + glicose 1% + óleo de soja hidrolisado + carbenicilina (100 ug/ml) ou TM3 + biomassa (bagaço preparado, palha de milho ou switch- grass). As culturas foram cultivadas a 30ºC com agitação a 200 rpm por a- proximadamente 2 a 3 horas até que uma ODsçoo de 0,4 fosse alcançada.
Neste ponto a expressão do construto mvaE mvas foi induzida pela adição delPTG (400 uM). As culturas foram incubadas por 20 ou 40 horas adicio- nais com amostras tomadas em intervalos de 2 horas a 6 horas pós-indução e então em 24, 36 e 48 horas como necessário.
A amostragem foi feita pela remoção de 1 ml da cultura, medida da ODsoo, precipitação das células em uma microcentrífuga, remoção do sobrenadante e análise dele para ácido mevalônico.
Uma fermentação de 14 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos que codificam AA-CoA tiolase de Enterococcus faecalis, HMG-CoA sintase, e polipeptideos HMG-CoA reductase produziu 22 gramas de ácido , mevalônico com meio TM3 e glicose 2% como meio celular. Um frasco de agitação destas células produziu 2 a 4 gramas de ácido mevalônico por litro à. com meio LB e glicose 1% como meio de cultura celular. A produção de ácido —mevalônico nestas cepas indicou que a via de MVA foi funcional em E. coli. VIII. Produção de isopreno a partir de E. coli BL21 contendo a via de MVA superior e inferior mais isopreno sintase de kudzu. As seguintes cepas foram criadas pela transformação em várias combinações de plasmídeos contendo a via de MVA superior e inferior e o gene de isopreno sintase de kudzu como descrito acima e os plasmídeos contendo os genes idi, dxs, e dxr e de isopreno sintase descritos no Exemplo
7. As células hospedeiras usadas foram BL21(ADE3) quimicamente compe- tentes e as transformações foram feitas por métodos padrão. Transforman- ' tes foram selecionados em ágar L contendo canamicina (50 pg/ml) ou ca- Ê 15 namicina mais espectinomicina (ambas em uma concentração de 50 ug/ml). e As placas foram cultivadas a 37ºC. As cepas resultantes foram designadas como se segue: Cultivadas em Canamíicina mais Espectinomicina (50 ug/ml cada um) MCM127 - pCL MVA Superior + pTrcKKDylkIS (can) em BL21 (ADE3) MCM131 - pCL1920 + pTreKKDyIkIS (can) em BL21(ADE3) MCM125 - pCL MVA Superior + pTrcHis2B (can) em BL21 (ADE3) Cultivadas em Canamicina (50 pg/ml) MCMG64 - pTrcKudzu yIDI DXS (can) em BL21(ADE3) MCMS5O0 - pTrcKudzu (can) em BL21(ADE3) MCM123 - pTrcKudzu yID! DXS DXR (can) em BL21(ADE3) As cepas acima foram riscadas de estoques de congeladores para LA + antibiótico apropriado e cultivadas por uma noite a 37ºC. Uma co- lônia única de cada placa foi usada para inocular frascos de agitação (25 ml! de LB + o antibiótico apropriado). Os frascos foram incubados a 22ºC por uma noite com agitação a 200 rom. Na manhã seguinte, os frascos foram transferidos para um incubador a 37ºC e cultivados por 4,5 horas adicionais : com agitação a 200 rpm.
Os 25 ml de culturas foram centrifugados para pre- cipitar as células e as células foram ressuspensas em 5 ml de LB + o antibió- 7 tico apropriado.
As culturas então foram diluídas em 25 ml de LB + glicose 1%+o antibiótico apropriado a uma ODgoo de 0,1. Dois frascos de cada ce- pa foram configurados, um configurado para indução com IPTG (800 uM) o segundo configurado não foi induzido.
As culturas foram incubadas a 37ºC com agitação a 250 rpm.
Um conjunto das culturas foi induzido após 1,50 horas (imediatamente após amostragem do ponto de tempo 1). Em cada ponto de tempo de amostragem, a ODgoo foi medida e a quantidade de iso- preno determinada como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresen- tados na Tabela 3. A quantidade de isopreno produzida é apresentada como a quantidade na produção de pico da cepa particular.
Tabela 3. Produção de isopreno em cepas de E. coli : Memtas fio ND: não detectado Traço: pico presente, mas não integrável.
IX.
Análise de ácido mevalônico Mevalonolactona (1,0 g, 7,7 mmols) (CASA 503-48-0) foi forneci- da de Sigma-Aldrich (WI, EUA) como um xarope que foi dissolvido na água (7,7mL)efoitratado com hidróxido de potássio (7,7 mmolis) a fim de gerar o sal de potássio de ácido mevalônico.
A conversão ao ácido mevalônico foi confirmada pela análise por 1H RMN.
Amostras da análise por HPLC foram preparadas pela centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos para remover células, seguidas pela adição de uma alíquota de 300 ul. do sobrenadante a 900 ul de HO.
Ácido perclórico (36 ul. de uma solução 70%) então foi adi- cionado em seguida por mistura e resfriamento em gelo por 5 minutos.
As amostras então foram centrifugadas novamente (14.000 rpm por 5 min) eo E sobrenadante transferido para HPLC.
Os padrões de ácido mevalônico (20, 10, 5, 1 e 0,5 g/L) foram preparados da mesma maneira.
A análise de ácido mevalônico (volume de injeção de 20 ul) foi realizada por HPLC usando uma coluna BioRad Aminex 87-H+ (300 mm por 7,0 mm) eluída com ácido sulfúrico 5 mM em 0,6 mL/min com detecção do índice refrativo (RI). Sob estas condições, o ácido mevalônico eluiu como a forma lactona em 18,5 minutos.
X.
Produção de isopreno a partir de E. coli BL21 contendo a via deMVA superior mais isopreno sintase de kudzu Uma fermentação em escala de 15 L de E. coli expressando po- lipeptídeos da via de ácido mevalônico e isopreno sintase de KkKudzu foi usada para produzir isopreno a partir de células em cultura de batelada alimentada.
Este experimento demonstra que cultura de células sob condições restritivas EP 15 deglicose resultou na produção de 2,2 g/L de isopreno. : Fórmula do Meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 gd, MASO, * 7H7O 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônio 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, e 1mlde solução de metal traço modificada 1000X.
Todos os componentes foram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH7O.
Esta solução foi au- toclavada.
O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. pa- ra volume.
Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após ajuste de pH e esterilização.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: ácidos cítricos * HO 40 g, MNSO, * H2O 30 g, NaCl 10 g, FESO,4 * 7H20 1 g, CoCl * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O0 1 g, CuSO, * 5SH20 100 mg, H;BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H7O0 100 mg.
Cada componente foi dissolvido um após outro em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. pa- ra volume, e filtro esterilizado com um filtro de 0,22 mícrons.
A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com célu-
las BL21 (DE3) de E. coli contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperPathway figura 26) e pTrcKKDylkIS.
Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose em pH de fermentação desejado - 7,0 e temperatura 30ºC.
Um inóculo da cepa de E. coli tomado de um frasco congelado foiriscado em uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incubado a 37ºC.
Uma colônia única foi inoculada em meio soytone-extrato de levedura-glicose.
Após o inóculo crescer a OD 1,0 quando medida em 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu- las alcançassem a fase estacionária.
Após este tempo, a alimentação de glicose foi reduzida para satisfazer exigências metabólicas.
A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 54 horas de fermentação foi 3,7 kg.
A indução foi alcançada pela adição de isopropil-beta-D-1- á tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG foi trazida a 25 uM é 15 quando a densidade ótica em 550 nm (ODss5o) alcançou um valor de 10. A concentração IPTG foi aumentada a 50 uM quando ODs5o alcançou 190. À concentração de IPTG foi aumentada a 100 uM em 38 horas de fermenta- ção.
O perfil de ODs5o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na Fig. 54. O nível de isopreno no gás do biorreator foi determinado como des- crito neste pedido.
O título de isopreno aumentou ao longo do curso da fer- mentação a um valor final de 2,2 g/L (Fig. 55). A quantidade total de isopre- no produzido durante as 54 horas de fermentação foi 15,9 g, e o curso de tempo da produção é mostrado na Fig. 56. Xl.
Fermentação de isopreno de E. coli expressando genes da viade ácido mevalônico e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15L Uma fermentação em escala 15 L de E. coli expressando poli- peptídeos da via de ácido mevalônico e isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir o isopreno a partir de células em cultura de batelada alimenta- da Esteexperimento demonstra que cultivo de células sob condições restri- tivas de glicose resultou na produção de 3.0 g/L de isopreno.
Fórmula do Meio (por litro de meio de fermentação):
. - 138/230 O meio foi gerado usando os seguintes componentes por meio , de fermentação de litro: KHPO, 7,5 g, MgSO, * 7H2O0 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 9, citrato férrico de amônio 0,3 g, extrato de levedura 0,59, e v 1 ml de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH,7O. Esta solução foi au- toclavada. O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. pa- ” ra volume. Glicose 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, e antibióticos foram adicionados PR após ajuste de pH e esterilização. - Solução de Metal Traço Modificada 1000X: R 10 Uma solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usan- do os componentes a seguir: ácidos cítricos * HO 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCl 10 g, FeSO, * 7H20 1 g, CoClz * 68H20 1 g, ZnSO * 7H270 1 g, CuSO, * 5H20 100 mg, H3BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H20 100 mg. Cada componente : foi dissolvido um após o outro em diH7O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então ' 15 q. para volume, e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 mícron. Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTre KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de iso- preno a partir de glicose de fermentação desejada pH 7,0 e temperatura 30ºC. Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco congelado foi riscado em uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incubado a 37ºC. Uma colônia única foi inoculada em meio triptona-extrato de levedu- ra. Após o inóculo crescer a OD 1,0, medido a 550 nm, 500 mL foram usa- dos para inocular um biorreator de 5 L.
Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu- las alcançassem a fase estacionária. Após este tempo, a alimentação de glicose foi reduzida para satisfazer as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 59 horas de fermentação foi 2,2 kg. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de IPTG foitrazida a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (ODs5o) alcan- çou um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando í ODs50 alcançou 190. O perfil de ODs59 dentro do biorreator ao longo do tem-
Soo 139/230 po é mostrado na figura 93. O nível de isopreno no efluente gasoso do bior- . reator foi determinado como descrito aqui.
A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 3,0 g/L figura 94). À r quantidade total de isopreno produzida durante as 59 horas de fermentação foi22,8g,eocurso de tempo de produção é mostrado na figura 95. O ren- dimento molar do carbono utilizado que foi para a produção de isopreno du- 1 rante a fermentação foi 2,2%. O rendimento percentual em peso de isopreno F a partir de glicose foi 1,0%. , XIl.
Fermentação de isopreno de genes expressando E. coli a : 10 partir da via de ácido mevalônico e desenvolvida em cultura em batelada alimentada em escala de 15 L Uma fermentação em escala de 15 L de E. coli expressando po- lipeptídeos da via de ácido mevalônico, isopreno sintase de Pueraria lobata, ' e isopreno sintase de kudzu foram usados para produzir isopreno a partir de ' 15 células em cultura em batelada alimentada.
Este experimento demonstra ' que células em desenvolvimento sob condições limitantes de glicose resul- tou na produção de 3,3 g/L de isopreno. i) Construção de pCLPtrcUpperPathwayHGS2 O gene que codifica isopreno sintase a partir de Pueraria lobata foi amplificado por PCR usando iniciadores Nsil-RBS-HGS F (CTTGATG- CATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, SEQ ID NO:88) e pTrcR (CCAGG- CAAATTCTGTTTITTATCAG, SEQ ID NO:89), e pTreKKDylkIS como um mol- de.
O produto de PCR assim obtido foi digerido por restrição com Nsil e Pstl e purificado em gel.
O plasmídeo pCL PtrcUpperPathway foi digerido por restrição com Pstl e desfosforilado usando fosfatase alcalina rAPid (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.
Estes fragmentos resultantes de DNA foram ligados em conjunto e a reação de ligação foi transformada em células de E. coli Top10 quimica- mente competentes (Invitrogen), plaqueadas em ágar L contendo especti- —nomicina (50 ug/mL) e incubadas por uma noite a 37ºC.
DNA plasmidial foi preparado a partir de 6 clones usando o conjunto Qiaquick Spin Mini-prep.
O DNA plasmidial foi digerido com enzimas de restrição EcoRV e Mlul para
AN 140/230 identificar um clone no qual o inserto tinha a orientação correta (isto é, o ge- ne orientado do mesmo modo que o promotor pTrc). O plasmídeo correto resultante foi designado pCLPtrcUpperPa- thwayHGS2. O plasmídeo resultante foi testado usando o teste de espaço de cabeça descrito aqui e observado produzir isopreno em E. coli Top10, assim validando a funcionalidade do gene.
O plasmídeo foi transformado em í BL21(LDE3) contendo pTreKKDylkIS para produzir a cepa BL21/pCLP tr- ' cUpperPathwayHGS2-pTreKKDylkIS.
A cepa resultante tem uma cópia extra . de isopreno sintase comparada às cepas BL21/pCL PtrcUpperMVA e pTrc R 10 KKDyIkIS (Exemplo 8, parte XI). A cepa resultante também tem expressão e atividade aumentada de HMGS comparada às cepas BL21/pCL PtrcUp- perMVA e pTrc KKDyIkIS usadas no Exemplo 8, parte XI. ii) Fermentação de isopreno de E. coli expressando pCLPtrcUp- ' perPathwayHGS2-pTrcKKDylIkIS e cultivadas em cultura em batelada ali- : 15 mentadaem escalade 15L ] Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 g, MgSO,. * 7H,O 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, extrato de levedura 0,59, e solução de metal traço modificada 1000X 1 mL.
Todos os componentes fo- ram adicionados em conjunto e dissolvidos em ditH2O.
Esta solução foi auto- clavada.
O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para volume.
Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste de pH.
Solução de metal traço modificada 1000X: Uma solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usan- do os componentes a seguir: ácidos cítricos * H7yO 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCl! 10 g, FeSO, * 7H2O0 1 g, CoCl * 68H20 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO, * 5H2O0 100 mg, H;BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H,0 100 mg.
Cada componente é dissolvido um após o outro em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. para volume e esterilizada em filtro com filtro de 0,22 mícrons.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células é Em 141/230 de E. coli BL21 (DE3) contendo os plasmídeos pCLPtrcUpperPathwayHGS2 e pTrc KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose de fermentação desejada pH 7,0 e temperatu- ra 30ºC. Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco congela- dofoiplaqueadoem uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e in- cubado a 37ºC. Uma colônia única foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura. Após o inóculo crescer a OD 1,0 medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5L.
ó Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu- las alcançassem a fase estacionária. Após este tempo a alimentação de gli- : cose foi reduzida para satisfazer as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 58 horas de fermentação foi 2,1 kg. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de ] IPTG foi trazida a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (ODs5o) alcan- ' 15 çouum valor de 89. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando - ODs50 alcançou 170. O perfil de ODs5o dentro do biorreator ao longo do tem- po é mostrado na figura 104. O nível de isopreno no efluente gasoso do bior- reator foi determinado como descrito aqui. A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 3,3 g/L figura 105). À quantidade total de isopreno produzida durante as 58 horas de fermentação foi 24,5 g e o curso de tempo de produção é mostrado na figura 106. O ren- dimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno du- rante a fermentação foi 2,5%. O rendimento percentual em peso de isopreno a partir de glicose foi 1,2%. Análise mostrou que a atividade da isopreno sin- tasefoi aumentada em aproximadamente 3 a 4 vezes àquela comparada a BL21 que expressa os plasmídeos CL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS (da- dos não mostrados). XIII. Integração cromossômica da via de Mevalonato inferior em E. coli.
Um operon sintético contendo mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e IPP isomerase foi integrado no cromossomo de E. coli. Se desejado, a expressão pode ser
' - 142/230 alterada ao integrar diferentes promotores 5' do operon.
A Tabela 9 relaciona os iniciadores usados para este experimento.
Tabela 9. Iniciadores
MCM78 attTn7 de sentido reverso | gcatgctegageggecgeTTTTAATCAAA-
a montante do construto | CATCCTGCCAACTC (SEQ ID NO:91) de integração
MCM79 attTn7 de sentido reverso | gategaagggegateg TGTCA-
a jusante do construto de | CAGTCTGGCGAAACCOG (SEQ ID integração NO:92)
p MCM88 attTn7 de sentido direto a | ctgaattctagcaga- p montante do construto de | tato TGTTTTTCCACTCTTCGTTCACT integração TT (SEQ ID NO:93) ' MCM89 attTn7 de sentido direto a | tetagagggcccAA-
jusante do construto de | GAMAAATGCCCCGCTTACG (SEQ ID integração NO:94)
MCM104 | promotor GI1.2— MVK Gatcgeggecgegcecctigacgatgeca-
' catcctgagcaaataattcaaccac-
Ú taattatgageggataacacaaggaggaaa-
' cagctatgatcattacegttettaactto (SEQ ID NO:95)
MCM105 | terminador aspA- yIDI Gatcgggccccaagaaaaaago- cacgtcatctgacgtgccttttitattitata- gacgcagttattatagcattcta (SEQ ID NO:96)
MCM120 | Sentido direto de attTn7: | aaagtagccgaagatgacggtttateacata-
atttn7 — homologia, GB | gagttagcaggatatttaattaaaagcAAT- homologia de marcação TAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID NO:97) MCM127 | Complemento de sentido | AGAGTGTTCACCAAAAATAA- reverso de 1,2 GI: GB | TAARCCTTTCCCGGTGCAgaagttaa- . homologia de marcação | gaacggtaatgaca- (extra longo), promotor, | tagctatttcctecttgtattatccgeteacaat- RBS, ATG tagtggttaaattatitactcag- gatgtagcategteaaggge TANTACGACT- CACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO:98) i) Construção do vetor alvo O sítio attTn7 foi selecionado para integração.
Regiões de homo- logia a montante (attTn7 up) (iniciadores MCM78 e MCM79) e a jusante (attTn7 down) (iniciadores MCM88 e MCMB89) foram amplificados por PCR a partir de células MG1655. Uma reação de 50 ul com 1 ul de iniciadores 10 uM, 3 ul de ddH2O, 45 uL de Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fide- lity, e uma colônia raspada de MG1655 foi desnaturada por 2:00 a 94ºC, ci- clada 25 vezes (2:00 a 94ºC, 0:30 a 50ºC, e 1:00 a 68ºC), estendida por 7:00 a 72ºC, e resfriada a 4ºC.
O DNA resultante foi clonado em pCR2.1 (Invitro- gen)de acordo com as instruções do fabricante, resultando em plasmídeos MCM278 (attTn7 up) e MCM252 (attTn7 down). O fragmento digerido de 832bp Apal-Pvul e purificado em gel a partir de MCM252 foi clonado em A- - pal-Pvul digerido e purificado em gel plasmídeo pR6K, criando o plasmídeo : MCM?276. O fragmento de 825bp Pstl-Notl digerido e purificado em gel a par- É 10 tir de MCM278 foi clonado em Pstl-Notl digerido e purificado em gel Ú MCM?276, criando o plasmídeo MCM281. ii) Clonagem de via inferior e promotor Genes MVK-PMK-MVD-IDI foram amplificados de pTrecKKDyIkIS i com iniciadores MCM104 e MCM105 usando Roche Expand Long PCR Sys- ' 15 tem de acordo com as instruções do fabricante.
O resultante produto foi di- ' gerido com Notl e Apal e clonado em MCM281 que foi digerido com Notl e Apal e purificado em gel.
Iniciadores MCM120 e MCM127 foram usados pa- ra amplificar cassete de CMR a partir do DNA molde GeneBridges FRT-gb2- Cm-FRT usando Stratagene Pfu Ultra Il.
Um programa de PCR de desnatu- ração a 95ºC por 4:00, 5 ciclos de 95ºC por 0:20, 55ºC por 0:20, 72ºC por 2:00, 25 ciclos de 95ºC por 0:20, 58ºC por 0:20, 72ºC por 2:00, 72ºC por 10:00, e então resfriamento a 4ºC foi usado com quatro reações de PCR de 50uL contendo 1uL -10 ng/ul de modelo, 1uL de cada iniciador, 1,25 ul de dNTPs 10 mM, 5 ul de tampão 10x, 1 ul de enzima, e 39,75 ul. de ddH20O.
Asreações foram agrupadas, purificadas em uma coluna de limpeza de PCR Qiagen, e usadas para eletroporar células Pir1 lavadas com água contendo plasmídeo MCMZ296. A eletroporação foi realizada em cubetas de 2 mm a 2,5V e 200 ohms.
As reações de eletroporação foram recuperadas em LB por 3 h a 30ºC.
Transformante MCM330 foi selecionado em LA com CMP5, Kan50 figuras 107e108Aa108C). iii) Integração em cromossomo de E. coli DNA em Miniprep (conjunto Qiaquick Spin) a partir de MCM330 foi digerido com SnaBl e usado para eletroporar BL21(DE3) (Novagen) ou MG1655 contendo plasmídeo pRedET Carb GeneBridges. Células foram desenvolvidas a 30ºC a -OD1 então induzidas com L-arabinose 0,4% a 37ºC por 1,5 horas. Essas células resultantes foram lavadas três vezes a 4ºC com ddH2O antes da eletroporação com 2 ul. de DNA. Integrantes fo- ram selecionados em ágar L contendo cloranfenicol (5 ug/mL) e subsequen- temente confirmado por não se desenvolver em ágar L + Canamiíicina (50 ug/mL). MCM331 integrante de BL21 e MCM333 integrante de MG1655 fo- ram congelados.
iv) Construção de pET24D-Kudzu codificando isopreno sintase de kudzu O gene de isopreno sintase de kudzu foi subclonado no vetor pET24d (Novagen) a partir do vetor pCR2,1 (Invitrogen). Em particular, o gene de isopreno sintase de kudzu foi amplificado a partir do DNA molde ' 15 pTrcKudzu usando iniciadores MCM50 5-GATCATGCAT TCGCCCTTAG : GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TCAATTTACT (SEQ ID NO:99) e MCM53 5-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC AT- CAGCTG (SEQ ID NO:100). As reações de PCR foram realizadas usando Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e o produto de PCR resultante foi clonado em vetor de clonagem pCR2,1-TOPO TA (Invitrogen), e transformado em células quimicamente competentes E. coli Top10 (Invitrogen). Transforman- ' tes foram plaqueados em ágar L contendo carbenicilina (50 ug/mL) e incu- bados por uma noite a 37ºC. Cinco mL de caldo de cultura Luria contendo carbenicilina 50 ug/mL foram inoculados com transformantes simples e culti- —vados por uma noite a 37ºC. Cinco colônias foram rastreadas para o inserto correto por sequenciamento de DNA plasmiíidial isolado a partir de 1 mL de cultura líquida (Caldo Luria) e purificado usando o conjunto QlAprep Spin Mini-prep (Qiagen). O plasmídeo resultante, designado MCM93, contém a sequência de codificação de isopreno sintase de kudzu em uma estrutura de pCR21. A sequência de codificação de Kudzu foi removida por digestão de endonuclease de restrição com Pcil e BamH1 (Roche) e purificado em gel usando o conjunto QIAquick Gel Extraction (Qiagen). O DNA do vetor PET24d foi digerido com Ncol e BamHI (Roche), tratado com fosfatase alca- lina de camarão (Roche), e purificado usando o conjunto QIAprep Spin Mini- prep (Qiagen). O fragmento de isopreno sintase de kudzu foi ligado ao —Ncol/BamH1 digeriu pET24d usando o conjunto Rapid DNA Ligation (Roche) em uma proporção de 5:1 de fragmento para vetor em um volume total de 20 uL.
Uma porção da mistura de ligação (5 uL) foi transformada em células E. coli Top 10 quimicamente competentes e plaqueadas em ágar L contendo canamicina (50 pug/mL). O transformante correto foi confirmado por sequen- ciamento e transformado em células BL21(ADE3)pLysS quimicamente com- petentes (Novagen). Uma colônia única foi selecionada após desenvolvimen- to por uma noite a 37ºC em ágar L contendo canamicina (50 pg/ml). Um mapa do plasmídeo resultante designado como pET24D-Kudzu é mostrado ' na Figura 109. A sequência de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:101) é mostrada — 15 nas Figuras 110A e 110B.
Atividade de isopreno sintase foi confirmada u- ' sando um teste de espaço de cabeça. v) Produção de cepas Cepas MCM331 e MCM333 foram cotransformadas com plasmí- deos pCLPtrcUpperPathway e ou pTrcKudzu ou pETKudzu, resultando nas cepas mostradas na Tabela 10. Tabela 10. Produção de Cepas Inferior MVA Superior isopreno sintase | de cepa Pathwa Pathwa Pathwa vi) Fermentação de Isopreno a partir de genes expressando E. coli da via de ácido mevalônico e cultivada em cultura em batelada alimenta- da em escala de 15 L.
Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 g, MgSO, * 7H7O0 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, extrato de levedura 0,59,e solução de metal traço modificada 1000X 1 mL. Todos os componentes fo- ram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH7O. Esta solução foi auto- clavada. O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para volume. Glicose 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste de pH.
Solução de metal traço modificada 1000X: A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os componentes a seguir: ácidos cítricos * H7O 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCl 10 g, FESO, * 7H20 1 g, CoCl2 * 68H20 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO, * 5H20 : 100 mg, H3BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H20 100 mg. Cada componente é dis- -— 15 solvidoum após o outro em ditHlyO, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. para volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 mícrons.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via de MVA inferior gi1,2 integrada descrita acima e os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTreKudzu. Este experimento foirealizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose da fermentação desejada pH 7,0 e temperatura 30ºC. Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco congelado foi plaqueado em uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incubado a 37ºC. Uma colônia única foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura. Após o inóculo crescer à OD1,0,medidaa 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de5L.
Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu- las alcançassem a fase estacionária. Após este tempo, a alimentação de glicose foi reduzida para satisfazer as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 57 horas de fermentação foi 3,9 kg. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de IPTG foi trazida a 100 uM quando a taxa de evolução de dióxido de carbono alcançou 100 mmol/L/h.
O perfil de OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 111A.
O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi determinado como descrito aqui.
A titulação de isopreno au- mentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 1,6 g/L figura 111B).A produtividade específica de isopreno ao longo do curso da fermen- tação é mostrada na figura 111C e alcançou o pico a 1,2 mg/OD/h.
A quanti- dade total de isopreno produzida durante as 57 horas de fermentação foi 16,2 g.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 0,9%. O rendimento percentual em peso deisopreno a partir de glicose foi 0,4%. XIV. — Produção de isopreno a partir de E. coli BL21 contendo a isopreno sintase de kudzu usando glicerol! como uma fonte de carbono A fermentação em escala de 15 L de E. coli expressando isopre- : no sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno a partir de células ali- -— 15 mentadas com glicerol em cultura em batelada alimentada.
Este experimento : demonstra que células em desenvolvimento na presença de glicerol (sem glicose) resultou na produção de 2,2 mg/L de isopreno.
Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 g, MgSO,a * 7H2O0 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, e solução de metal traço modificada 1000X 1 mL.
Todos os componentes foram adicionados em con- junto e dissolvidos em diH2O.
Esta solução foi autoclavada.
O pH foi ajusta- do a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para volume.
Glicerol 5,1 g, tiamina* HCl 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste de pH.
Solução de metal traço modificada 1000X: O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: ácidos cítricos * HyO 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCI 109g,FeSO,*7H2O 1g, CoClz * 8BHZO 1 g, ZnSO * 7H70 1 g, CuSO, * 5SHO 100 mg, H;BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H2O0 100 mg.
Cada componente foi dissolvido um após o outro em diH7O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s.
para volume e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 mícrons.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo pTrcKudzu. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicerol em pH7,0de fermentação desejada e temperatura 35ºC. Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco congelado foi plaqueado em uma pla- ca de ágar de caldo LA (com antibióticos) e incubado a 37ºC. Uma colônia única foi inoculada em um meio de soytone-extrato de levedura-glicose e cultivada a 35ºC. Após o inóculo crescer a OD 1,0, medida a 550 nm, 600 mL foram usados para inocular um biorreator de 7,5 L.
Glicerol foi alimentado em uma taxa exponencial até que as cé- lulas alcançaram uma densidade ótica a 550 nm (ODs59) de 153. A quantida- de total de glicerol entregue ao biorreator durante as 36 horas de fermenta- á ção foi 1,7 kg. Além da glicose no inóculo, nenhuma glicose foi adicionada — 15 aobiorreator. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de À IPTG foi trazida a 20 uM quando a ODs5o alcançou um valor de 50. O perfil de ODss5o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 57. O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi determinado como descrito aqui. A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fer- mentação a um valor final de 2,2 mg/L figura 58). A quantidade total de iso- preno produzida durante as 54 horas de fermentação foi 20,9 mg, e o curso de tempo de produção é mostrado na figura 59.
XV. Fermentação de isopreno a partir de genes expressando E. coli da via de ácido mevalônico e cultivada em cultura em batelada ali- —mentada em escala de 15 L usando açúcar invertido como uma fonte de carbono Uma fermentação em escala de 15 L de E. coli expressando po- lipeptídeos da via de ácido mevalônico e isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno a partir de células alimentadas de açúcar invertido em cultura em batelada alimentada. Este experimento demonstra que células em desenvolvimento na presença de açúcar invertido resultou na produção de 2,4 g/L de isopreno.
Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: K2HPO, 7,5 g, MgSO,. * 7H7O0 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, e — solução de metal traço modificada 1000X 1 mL. Todos os componentes fo- ram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH7O. Esta solução foi auto- clavada. O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para volume. Açúcar invertido 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adi- cionados após esterilização e ajuste de pH.
Solução de metal traço modificada 1000X: A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os componentes a seguir: ácidos cítricos * H2O 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCl 10 g, FeSO,4 * 7H20 1 g, CoCl7; * 68H20 1 g, ZnSO * 7H2O0 1 g, CuSO, * 5H20 É 100 mg, H3BO3 100 mg, e NaMoO, * 2H,0 100 mg. Cada componente é dis- -— 15 solvido um após o outro em diHzO, pH a 3,0 com HCINaOH, então q.s. para volume e esterilizada em filtro com filtro de 0,22 mícrons.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTre KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de iso- preno a partir de açúcar invertido da fermentação desejada pH 7,0 e tempe- ratura 30ºC. Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco con- gelado foi plaqueado em uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incubado a 37ºC. Uma colônia única foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura. Após o inóculo crescer a OD 1,0, medido a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5L.
Açúcar invertido foi alimentado em uma taxa exponencial até que as células alcançaram a fase estacionária. Após este tempo a alimenta- ção de açúcar invertido foi reduzida para satisfazer as demandas metabóli- cas. A quantidade total de açúcar invertido enviada ao biorreator durante as 44 horas de fermentação foi 2,4 kg. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de IPTG foi trazida a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (ODss5o) alcançou um valor de 9. A concentração de IPTG foi ele-
vada a 50 uM quando ODs5,5 alcançou 200. O perfil de ODs55 dentro do bior- reator ao longo do tempo é mostrado na figura 96. O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi determinado como descrito aqui. A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 2,49g/Lfigura97). A quantidade total de isopreno produzida durante as 44 horas de fermentação foi 18,4 g e o curso de tempo de produção é mostrado na figura 98. O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produ- ção de isopreno durante a fermentação foi 1,7%. O rendimento percentual em peso de isopreno a partir de glicose foi 0,8%. Exemplo9. Construção da via de MVA superior e inferior para integração em Bacillus subtilis
1.Construção da via de MVA superior em Bacillus subtilis A via superior de Enterococcus faecalis é integrada em B. subti- : lis sob controle do promotor aprE. A via superior consiste de dois genes; Ú 15 mva£E, que codifica para AACT e HMGR, e mvasS, que codifica para HMGS. ' Os dois genes são fundidos juntos com um códon de terminação entre os mesmos, um sítio RBS na frente de mvasS, e estão sob o controle do promo- tor aprE. Um terminador é situado após o gene mvaE. O marcador de resis- tência a cloranfenicol é clonado após o gene mvaE e o construto é integrado aolocus aprE por duplo cruzamento usando regiões flanqueadoras de ho- mologia.
Quatro fragmentos de DNA são amplificados por PCR de modo que os mesmos contêm projeções que permitirão aos mesmos serem fundi- dos juntos por uma reação de PCR. Amplificações de PCR são realizadas usando Herculase polimerase de acordo com as instruções do fabricante.
1. PaprE CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82) CF 07-94 (-) Fusão PaprE a mvaE &- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO:83) Molde: DNA cromossômico de Bacillus subtilis
2. mvaE CF 07-93 (+) Fusão mvaE ao promotor aprE (códon de partida GTG) 8- — TTAMAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84) CF 07-62 (-) Fusão mvaE ao mvaS com RBS no meio 8-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTITTACCTCCTITTATTGTTTTCTTAAATO (SEQ ID NO:35) Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis (de ATCC)
3. mvaS CF 07-61 (+) Fusão mvaE ao mvaS com RBS no meio 8-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:36) : CF 07-124 (-) Fusão da extremidade de mvasS ao terminador - 15 &S-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT ' (SEQ ID NO:85) Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis
4. B. Extremidade de serina protease alcalina de amyliquefaci- ens CF 07-123 (+) Fusiona a extremidade de mvaS ao terminador 5- ACCGTTCGTTCTTATOEGAAACTAAAAAMAMACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO:86) CF 07-46 (-) Extremidade de B. amyliquefaciens terminador Ba- mHI &5-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63) Molde: DNA cromossômico de Bacillus amyliquefaciens Reações de fusão por PCR
5. Fusão de mvaE ao mvaS CF 07-93 (+) Fusão de mvaE ao promotor aprE (códon de parti- daGTG) 8"- TTAMAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84)
CF 07-124 (-) Fusiona a extremidade de mvasS ao terminador 58-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTITTAGTTTOGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85) Molde: 2 e 3 a partir de cima
6. Fusão mvaE-mvasS ao promotor aprE CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pst| 58'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82) CF 07-124 (-) Fusão a extremidade de mvasS ao terminador 5- — CGGGGCCAAGGCCGGTTTTITTITAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQIDNO:85) Molde t1 e HH a partir de acima
7. Fusão PaprE-mvaE-mvasS ao terminador , CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl À 8'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82) 215 CF 07-46 (-) Extremidade de B. amyliquefaciens terminador Ba- o mHI 8"- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63) Molde: tt e 6 O produto é digerido com endonucleases de restrição Ps- 20 t/BamHl e ligado a pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for ge- netic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615 — 624. Em A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacte- ria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington,D.C.) que é digerido com Psti/BamHlI. A ligação é 25 transformada em células de E.coli TOP 10 quimicamente competentes e os transformantes são selecionados em LA contendo carbenicilina (50 ug/mL). O plasmídeo correto é identificado por sequenciamento e é designado pJ- MUpperPathway?2 figuras 50 e 51). DNA plasmidial purificado é transformado em aprEnprE Pxyl-comK de Bacillus subtilis e transformantes são seleciona- 30 dosemágarL contendo cloranfenicol (5 ug/mL). Uma colônia correta é sele- cionada e é plaqueada em sequência em ágar L contendo cloranfenicol 10, e 25 ug/mL para amplificar o número de cópias do cassete contendo a via superior.
A cepa resultante é testada para a produção de ácido mevalôni- co pelo cultivo em LB contendo glicose 1% e 1%. Culturas são analisadas por GC para a produção de ácido mevalônico.
A cepa resultante é usada subsequentemente como um hospe- deiro para a integração da via de ácido mevalônico inferior.
Os iniciadores a seguir são usados para sequenciar os diversos construtos acima.
Iniciadores de Sequenciamento: CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl 5- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82) CF 07-58 (+) Início do gene mvaE 8'- ATGAMAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:38) ni CF 07-59 (-) Extremidade do gene mvaE -— 15 8-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:39) CF 07-82 (+) Início do gene mvaS 8"- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:40) CF 07-83 (-) Extremidade do gene mvaS 5'- TTIAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:41) CF 07-86 (+) Sequência em mvaE 5'- GAMATAGCCCCATTAGAAGTATOC (SEQ ID NO:42) CF 07-87 (+) Sequência em mvaE 8"- TIGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:43) CF 07-88 (+) Sequência em mvaE 5-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO:44) CF 07-89 (+) Sequência mvaS 858'- GAMACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45) Transformantes são selecionados em LA contendo cloranfenicol a uma concentração de 5 ug/mL. Uma colônia é confirmada para ter a inte- gração correta por sequenciamento e é plaqueada em LA contendo concen- trações crescentes de cloranfenicol por diversos dias, em um nível final de 25 pg/mL. Isto resulta na amplificação do cassete contendo os genes de in-
teresse. A cepa resultante é designada CF 455: pJMUpperPathwaytt1 X Ba- cillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (amplificada para se desenvolver em LA contendo cloranfenicol 25 ug/mL). Il. Construção da via de MVA inferior em Bacillus subtilis A via inferior de MVA, consistindo dos genes mvk1, pmk, mpd e idi são combinados em um cassete consistindo de regiões flanqueadoras de DNA a partir da região nprE do cromossomo de B. subtilis (sítio de integra- ção), o promotor aprE, e o marcador de resistência à espectinomicina (ver Figuras 28 e 29). Este cassete é sintetizado por DNA 2.0 e é integrado no cromossomo de B. subtilis contendo a via de MVA superior integrado ao lo- cus aprE. Um gene de isopreno sintase de kudzu é expresso a partir do plasmídeo replicante descrito no Exemplo 4 e é transformado na cepa tanto com ambas as vias superior e inferior integradas. Ú Exemplo 10: Composições exemplares de isopreno e métodos de produção dasmesmas
1.Análise composicional de efluente gasoso da fermentação con- tendo isopreno Uma fermentação em escala de 14 L foi realizada com uma cpa recombinante de E. coli BL21 (DE3) contendo dois plasmídeos (pCL upper- Mev; pTrecKKDylkIS codificando a via de mevalonato completa para a bios- síntese de precursor de isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase a partir de levedura, e uma isopreno sintase a partir de Kudzu. Efluente gaso- so da fermentação do tanque de 14 L foi coletado em frascos de espaço de cabeça de 20 mL em torno do tempo de pico da produtividade de isopreno (27,9 horastempo de fermentação decorrido, "EFT") e analisado por GC/MS de espaço de cabeça para componentes voláteis. Análise de espaço de cabeça foi realizada com um sistema Agi- lent 6890 GC/MS equipado com uma coluna Agilent HP-SMS GC/MS (30 m x 250 pm; 0,25 um de espessura de filme). Um autoinjetor combiPAL foi usado para amostragem de alíquotas de 500 uL a partir de frascos de espaço de cabeça de 20 mL. O método GC/MS utilizou hélio como o gás veículo a um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção foi mantida a 250ºC com um coeficien-
te de fracionamento de 50:1. A temperatura do forno foi mantida a 37ºC por um período inicial de 2 minutos, seguido de um aumento para 237ºC a um coeficiente de 25º C/min por um tempo total do método de 10 minutos. O de- tector seletivo de massa Agilent 5793N esquadrinhou a partir de m/2z 29 a m/z300.0O limite de detecção do sistema resultante é de aproximadamente 0,1 ug/Lass OU aproximadamente 0,1 ppm. Se desejado, equipamento mais sensível com um limite de detecção mais baixo pode ser usado. O efluente gasoso consistiu de 99,925 % (v/v) de gases perma- nentes (N7,, CO, e O>), aproximadamente 0,075% de isopreno (2-metil-1,3- butadieno) (-750 ppmv, 2100 ug/L) e quantidades menores (< 50 ppmv) de etanol, acetona e dois prenil álcoois C5. A quantidade de vapor de água não foi determinada, mas foi estimada ser igual a o equilíbrio da pressão de va- por a 0ºC. A composição da fração orgânica volátil foi determinada por inte- ' gração da área sob os picos no cromatograma GC/MS figuras 86A e 86B) e — 15 érelacionadana Tabela6. Curvas de calibração para os padrões de etanol e acetona permitiram a conversão da área GC para a concentração de fase gasosa em unidades de ug/L usando métodos padrão. Tabela 6. Composição de componentes orgânicos voláteis em efluente gasoso da fermentação. O efluente gasoso foi analisado no ponto de tempo de 27,9 horas da fermentação usando uma cepa de E. coli BL21 (DE3) expressando uma via de mevalonato heteróloga, uma isoprenil piro- fosfato isomerase a partir de levedura, e uma isopreno sintase a partir de Kudzu. [Jean "lise [230005 joe [eme | eno
1. Medida dos compostos orgânicos traço voláteis (VOCs) —coproduzidos com isopreno durante fermentação de uma cepa recombinante de E. coli Uma fermentação em escala de 14 L foi realizada com uma cepa recombinante de E. coli BL21 (DE3) contendo dois plasmídeos (pCL upper- Mev; pTrcKKDylkIS) codificando a via de mevalonato completa para biossín- tesede precursor de isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase a par- tir de levedura, e uma isopreno sintase a partir de Kudzu.
Efluente gasoso da fermentação foi passado através frascos de espaço de cabeça resfriados a fim de concentrar e identificar componentes orgânicos traço voláteis. O efluente gasoso a partir da fermentação resultan- te foi amostrado a um coeficiente de 1 Limin por 10 minutos através de um frasco de espaço de cabeça de 20 mL acondicionado com lã de quartzo (29) e resfriado a -78ºC com gelo seco. O frasco foi retampado com uma tampa de frasco nova e analisado por GC/MS de espaço de cabeça para VOCs captura- á dos usando as condições descritas no Exemplo 10, parte |. As razões dos com- — 15 postos observadas nas figuras 87A a 87D são uma combinação do nível geral no ' efluente gasoso de fermentação, a pressão de vapor relativa a -78ºC, e a respos- ta do detector do espectrômetro de massa. Por exemplo, o baixo nível de iso- preno com relação aos voláteis oxigenados (por exemplo, acetona e etanol) é uma função da elevada volatilidade do material resultante de modo que o “mesmo não se acumula no frasco de espaço de cabeça a -78ºC.
A presença de muitos desses compostos é única para composi- ções de isopreno derivadas de fontes biológicas. Os resultados são ilustra- dos nas figuras 87A a 87D e resumidos nas Tabelas 7A e 7B.
Tabela 7A: Traços de voláteis presentes no efluente gasoso produzido por E. coli BL21(DE3)(pCL upperMev; pTreKKDylkIS) seguido por crio-captura a -78ºC. [emo [nes [10509620 [12708 || 10530 |
RT (min) | Área GC' | Áreas? 2-metil-3-buten-2-ol 2,316 902735 1,087 [amentonana — | 27 | 165162 [0100 | 165 : | | Enem [om [om [oe] 10 [230conpencipmana | soe | 1missar | 1540 | mas | ? Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto relacionado. ? Área % é a área de pico expressa como a % em relação à á- rea de pico total de todos os compostos. ? Razão % é a área de pico expressa como a % em relação à área de pico de 2-metil-1,3-butadieno.
Tabela 7B.
Voláteis traço presentes em efluente gasoso produzido por E. coli
BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrecKKDylkIS) seguido por crio-captura a -196ºC. [aceto demente — — fr852 Jazz —fooss fooe — | [abwenoma — — |a216 [25964 [oc foos — | — [smerzaenoa — azst [116sst [ooto foca — | [apentanona — —|soss Íes520 — [oo foor — | [ametribuanod — — faser 572596 fooss fom — [ameta-butentor — 4048 [302558 —J[ooso jooe — | enila enila sanar o Jets [eomer fosse Joc | octatrieno santo o Jets Jese Jams Jo 1 Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto relacionado. 2? Área % é a área de pico expressa como a % em relação à á-
rea de pico total de todos os compostos.
? Razão % é a área de pico expressa como a % em relação à área de pico de 2-metil-1,3-butadieno.
u. Ausência de isômeros de hidrocarboneto C5 em isopre- —noderivado de fermentação.
Criocaptura de isopreno presente no efluente gasoso da fermen- tação foi realizada usando em um frasco de espaço de cabeça de 2 mL res- friado em nitrogênio líquido. O efluente gasoso (1 L/min) foi primeiro passado através de um frasco de 20 mL contendo grânulos de hidróxido de sódio a fim de minimizar o acúmulo de gelo e CO, sólido no frasco de 2 mL (-196ºC). Aproximadamente 10L de efluente gasoso foram passados através do fras- co, após o qual foi permitido aquecer-se a -78ºC com ventilação, seguido de revedação com uma tampa de frasco nova e a análise por GC/MS.
Análise de espaço de cabeça GC/MS foi realizada com um sis- tema Agilent 6890 GC/MS usando uma seringa de 100 ul hermética a gás em modo de espaço de cabeça. Uma coluna Zebron ZB-624 GC/MS (30 m x 250 um; 1,40 um de espessura de filme) foi usada para a separação dos analitos. O autoinjetor GC foi equipado com uma seringa hermética a gás de 100 uL, e a altura da agulha foi ajustada para permitir a injeção de uma a- mostrade 50 ul de espaço de cabeça a partir de um frasco GC de 2 mL. O método GC/MS utilizou hélio como o gás veículo em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção foi mantida a 200ºC com um coeficiente de fracionamento de 20:1. A temperatura do forno foi mantida a 37ºC pelos 5 minutos de dura- ção da análise. O detector seletivo de massa Agilent 5793N foi executado emum modo de monitoramento de íon simples em m/z 55, 66, 67 e 70. Sob estas condições, isopreno foi observado eluir em 2,966 minutos figura 88B). Um padrão de isopreno derivado de petróleo (Sigma-Aldrich) foi também analisado usando o esse método e foi observado conter isômeros de hidro- carboneto C5 adicionais, que eluíram imediatamente antes ou após do pico principale foram quantificados com base na área GC corrigida figura 88A).
Tabela 8A: Análise GC/MS de isopreno derivado de petróleo Hidrocarbonetos C5 |1sopreno — UU | 2966 [10210 [onee% >| Tabela 8B: Análise GC/MS de isopreno derivado de fermentação (% total de hidrocarbonetos C5) carbonetos C5 Em um experimento separado, uma mistura padrão de hidrocar- —bonetos C5 foi analisada para determinar se a resposta do detector foi a . mesma para cada um dos compostos.
Os compostos foram 2-metil-1- buteno, 2-metil-1,3-butadieno, (E)-2-penteno, (Z)-2-penteno e (E) 1,3- pentadieno.
Neste caso, a análise foi realizada em uma coluna Agilent DB- Petro (100 m x 0,25 mm, 0,50 um de espessura de filme) mantida a 50ºC por minutos.
O método GC/MS utilizou hélio como o gás veículo a um fluxo de 1 mL/min.
A porta de injeção foi mantida a 200ºC com um coeficiente de fracionamento de 50:1. O detector seletivo de massa Agilent 5793N foi exe- cutado em modo de leitura total a partir de m/z 19 a m/z 250. Sob estas con- dições, uma concentração de 100 ug/L de cada padrão produziu a mesma 15 resposta do detector dentro do erro experimental.
W.
Composições compreendendo isopreno adsorvido em uma fase sólida.
Isopreno biologicamente produzido foi adsorvido em carbono ati- vo resultando em uma fase sólida contendo 50 a 99,9% de carbono, 0,1% a 50% de isopreno, 0,01% a 5% de água, e quantidades menores (< 0,1%) de outros componentes orgânicos voláteis.
Efluente gasoso da fermentação foi passado através de uma serpentina de condensação de cobre mantida a 0ºC, seguido de um filtro dessecante de sílica granulada de modo a remover vapor d'água.
O efluente gasoso desumidificado foi então passado através filtros contendo carbono (Koby Jr, Koby Filters, MA) ao ponto no qual a ruptura do isopreno foi detec- tada na saída do filtto por GC/MS.
A quantidade de isopreno adsorvido no cartucho pode ser determinada indiretamente ao se calcular a concentração no efluente gasoso, o coeficiente de fluxo total e o percentual de ruptura so- bre o período de coleta.
Alternativamente o isopreno adsorvido pode ser re- cuperado a partir dos filtros por meio de dessorção térmica, a vácuo, ou me- diado por solvente.
V.
Coleta e análise de isopreno condensado.
Efluente gasoso da fermentação é desumidificado, e o CO, re- movido por filtragem através um adsorvente adequado (por exemplo, ascari- te). A corrente de efluente gasoso resultante é então passada através de um .- 15 condensador resfriado em nitrogênio líquido de modo a condensar os VOCs : na corrente.
O frasco de coleta contém t-butil catecol para inibir o condensa- do de isopreno resultante.
O condensado é analisado por GC/MS e RMN de modo a determinar a pureza usando métodos padrão, tais como aqueles descritos aqui.
VI.
Produção de prenil álcoois por fermentação Análise de efluente gasoso a partir de uma cepa de E. coli BL21 (DE3) expressando isopreno sintase de kudzu revelou a presença tanto de isopreno como 3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol). Os níveis dos dois compos- tos em um efluente gasoso da fermentação em relação à fermentação são mostrados na figura 89 como determinado por GC/MS de espaço de cabeça.
Níveis de isoprenol (3-metil-3-buten-1-0l, 3-MBA) alcançados foram de apro- ximadamente 10 ug/Lefuente gasoso Neste experimento.
Experimentos adicionais produziram níveis de aproximadamente 20 ug/L enuente gasoso EM UM efluente gasoso da fermentação.
Exemplo11: O desacoplamento do cultivo e produção de isopreno em E. coli expressando genes da via de ácido mevalônico e fermentada em uma cultu- .ra em batelada alimentada
Exemplo 11 ilustra o desacoplamento do cultivo celular a partir de ácido mevalônico e produção de isopreno. |.Condições de Fermentação Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 g, MgSO,. * 7H,O0 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, extrato de levedura 0,59, e solução de metal traço modificada 1000X 1 mL.
Todos os componentes fo- ram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH2O.
Esta solução foi auto- clavada.
O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para volume.
Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste de pH.
Solução de metal traço modificada 1000X: . Uma solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usan- .- 15 doos componentes a seguir: ácidos cítricos * HO 40 g, MNSO, * HO 30 g, : NaCl 10 g, FeSO, * 7H20 19g, CoCI2 * 6H,O 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuSO, * 5H20 100 mg, H3BO;3 100 mg, e NaMoO, * 2H7O0 100 mg.
Cada componen- te foi dissolvido um após o outro em diH7O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. para volume, e esterilizado em filtro com um filtro de 0,22 mícrons.
A fermentação foi realizada com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcHis2AUpperPathway (também denominado pTrcUpperMVA, Figuras 91 e 92A a 92C) (carbenicilina 50 pg/mL) ou o plasmídeo pCL Ptr- CUpperMVA (também denominado pCL PtrcUpperPathway figura 26)) (es- pectinomicina 50 pg/ml). Para os experimentos nos quais o isopreno foi produzido, as células de E. coli também continham o plasmídeo pTrc KKDyl- kIS (canamíicina 50 ug/mL). Esses experimentos foram realizados para moni- torar formação de ácido mevalônico ou isopreno a partir de glicose da fer- mentação desejada pH 7,0 e temperatura 30ºC.
Um inóculo de uma cepa de E. coli obtida a partir de um frasco congelado foi plaqueado em uma placa de ágar de caldoLA (com antibióticos) e incubado a 37ºC.
Uma colônia úni- ca foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura.
Após o inóculo crescer i a densidade ótica 1,0 quando medido a 550 nm, o mesmo foi usado para inocular o biorreator.
Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu- las alcançassem a fase estacionária. Após este tempo a alimentação de gli- cose foi reduzida para satisfazer as demandas metabólicas. A indução foi — alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de ácido mevalônico no caldo de fermentação foi determinada ao se aplicar amostras tratadas com ácido perclórico (Sigma-Aldrich *% 244252) (0,3 M incubado a 4ºC por 5 minutos) a uma coluna de HPLC de ácidos orgânicos (BioRad f 125-0140). A concen- tração foi determinada ao comparar o tamanho do pico do caldo de ácido mevalônico à curva de calibração gerada a partir de mevalonolacetona (Sigma-Aldrich %£ M4667) tratada com ácido perclórico para formar D,L- mevalonato. O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi deter- minado como descrito aqui. A titulação de isopreno é definida como a quan- tidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
1. Produção de ácido mevalônico a partir de células de E. ' coli BL21 (DE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA a uma escala de 150L Células BL21 (DE3) que foram desenvolvidas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 45 mL de meio triptona-extrato de levedura e incubada a 30l com agitação a 170 rpm por 5 horas. Esta solução foi transferida a um biorreator de 5 L de meio triptona-extrato de levedura, e as células foram cultivadas a 30ºC e 27,5 rpm até que a cultura alcançou uma ODs595 de 1,0. Os 5 L do inóculo foram semeados em um biorreator de 150 L contendo 45 kg de meio. A concentração de IPTG foi trazida a 1,1 mM quando a ODssºo alcançou um valor de 10. O perfil de ODs555 dentro do biorreator ao longo do tempo é mos- trado na figura 60A. A titulação do ácido mevalônico aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 61,3 g/L figura 60B). O perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura 60C e a comparação coma | Figura 60A ilustra o desacoplamento da cultura e a produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico pro- duzido durante as 52,5 horas de fermentação foi 4,0 kg a partir de 14,1 kg de glicose utilizada.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de ácido mevalônico durante a fermentação foi 34,2%. ur.
Produção de ácido mevalônico a partir de células de E. coli BL21 (DE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de1i5L Células BL21 (DE3) que foram desenvolvidas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivada a 30ºC a 160 rpm para ODs5o9 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio.
A concentração de IPTG foi trazida a 1,0 mM quando a ODs5o alcançou um valor de 10. O perfil de OD55o dentro do bior- reator ao longo do tempo é mostrado na figura 61A.
A titulação do ácido me- valônico aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de : 53,9 g/L figura 61B). Um perfil de produtividade específica através da fer- — 15 mentaçãoé mostrado na figura 61C e a comparação com a figura 61A ilustra o desacoplamento da cultura e produção de ácido mevalônico.
A quantidade total de ácido mevalônico produzido durante as 46,6 horas de fermentação foi 491 g a partir de 2,1 kg de glicose utilizada.
O rendimento molar de car- bono utilizado que foi para a produção de ácido mevalônico durante a fer- mentação foi28,8%. W.
Produção de ácido mevalônico a partir de células de E. coli FM5 expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de 15 L Células FM5 que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 500 mL demeiotriptona-extrato de levedura e desenvolvida a 30ºC a 160 rpm para ODs50o 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio.
A concentração de IPTG foi trazida a 1,0 mM quando a ODsso alcançou um valor de 30. O perfil de ODs5o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 62A.
A titulação do ácido mevalônico aumentou aolongo do curso da fermentação a um valor final de 23,7 g/L figura 62B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura 62C e a comparação com a figura 62A ilustra o desacoplamento da cultura e a produção de ácido mevalônico.
A quantidade total de ácido meva- lônico produzido durante as 51,2 horas de fermentação foi 140 g a partir de 1,1 kg de glicose utilizada.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de ácido mevalônico durante a fermentação foi 15,2%. Vv.
Produção de isopreno a partir de células de E. coli BL21 (DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS em uma escala de 15 L Células BL21 (DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUp- perMVA e pTrc KKDyIkIS que foram desenvolvidas em uma placa como ex- plicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivada a 30ºC a 160 rpm para ODs5o 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L conten- do 4,5 kg de meio.
A concentração de IPTG foi trazida a 25 uM quando a . ODs50o alcançou um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando ODss5º5 alcançou 190. A concentração de IPTG foi elevada a 100 uM em 38 horas de fermentação.
O perfil de OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 63A.
A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 2,2 g/L de caldo figura 63B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mos- trado na Figura 63C e a comparação com a figura 63A ilustra o desacopla- mento da cultura e produção de isopreno.
A quantidade total de isopreno produzida durante as 54,4 horas de fermentação foi 15,9 g a partir de 2,3 kg de glicose utilizada.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 1,53%. Vl.
Produção de isopreno a partir de células tuner de E. coli BL21 (DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyI- kIS em uma escala de 15 L Células tuner BL21 (DE3) expressando os plasmídeos pCL Ptr- CUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram desenvolvidas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco con- tendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivado a 30ºC a 160 rpm para ODs5o 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio.
A concentração de IPTG foi trazida a 26 uM quan- do a ODs55 alcançou um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando ODs5o alcançou 175. O perfil de ODs5o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 64A.
A titulação de isopreno aumen- tou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 1,3 g/L de caido figura 64B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura 64C e a comparação com a figura 64A ilustra o desaco- plamento da cultura e produção de isopreno.
A quantidade total de isopreno produzida durante as 48,6 horas de fermentação foi 9,9 g a partir de 1,6 kg de glicose utilizada.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 1,34%. VI.
Produção de isopreno a partir de células de E. coli MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS ' em uma escala de 15L Células MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperM- hi VA e pTrc KKDyIkIS que foram desenvolvidas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivada a 30ºC a 160 rpm para ODs50 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kgde meio A concentração de IPTG foi trazida a 24 uM quando a ODs5so alcançou um valor de 45. O perfil de ODs5so dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 65A.
A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 393 mg/L de caldo figura 65B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura65C ea comparação com a Figura 65A ilustra o desacoplamento da cultura e produção de isopreno.
A quantidade total de isopreno produzida durante as 67,4 horas de fermentação foi 2,2 g a partir de 520 g de glicose utilizada.
O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 0,92%. VIll. — Produção de isopreno a partir de células de E. coli MG1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkKIS em uma escala de 15L
Células MG1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL Ptr- CUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram desenvolvidas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco con- tendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivada a 30ºC a 160 rpm para ODs5so 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi trazida a 30 uM quan- do a ODsso alcançou um valor de 10. O perfil de OD55o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 66A. A titulação de isopreno aumen- tou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 368 mg/L de caldo figura66B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura 66C e a comparação com a figura 66A ilustra o desaco- plamento da cultura e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzida durante as 56,7 horas de fermentação foi 1,8 g a partir de 531 g de glicose utilizada. O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 0,73%.
IX. Produção de isopreno a partir de células de E. coli FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS em uma escala de 15 L Células FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram desenvolvidas em uma placa como explicado aci- ma no Exemplo 11, a parte | foi inoculada em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e desenvolvida a 30ºC a 160 rpm para ODss5o 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi trazida a 27 uM quando à ODs5o alcançou um valor de 15. O perfil de ODs5o dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 67A. A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 235 mg/L de caldo figura 67B). Um perfil de produtividade específica através da fermentação é mostrado na figura 67C e a comparação com a figura 67A ilustra o desacoplamento da culturae produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzida durante as 52,3 horas de fermentação foi 1,4 g a partir de 948 g de glicose utilizada. O rendimento molar de carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 0,32%. Exemplo 12: Produção de isopreno durante a fase de crescimento exponen- cial de genes expressando E. coli a partir da via de ácido mevalônico e fer- mentados em uma cultura em batelada alimentada Exemplo 12 ilustra a produção de isopreno durante a fase de desenvolvimento exponencial de células.
Fórmula de meio (por litro de meio de fermentação): O meio foi gerado usando os componentes a seguir por litro de meio de fermentação: KHPO, 7,5 g, MgSO, * 7H7O 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato férrico de amônia 0,3 g, extrato de levedura 0,5 g, e solução de metal traço modificada 1000X 1 mL.
Todos os componentes fo- ram adicionados em conjunto e dissolvidos em diH,7O.
Esta solução foi auto- clavada.
O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. para - volume.
Glicose 10 g, tiamina * HCI 0,1 g, e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste de pH. ' Solução de metal traço modificada 1000X: A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os componentes a seguir: ácidos cítricos * HSO 40 g, MNSO, * HO 30 g, NaCl 10 g, FESO, * 7H20 1 g, CoCI2 * 6H7O 1 g, ZnSO * 7H270 1 g, CuSO, * 5H7O0 100 mg, H;BO3 100 mg, e NaMoO, * 2H,70 100 mg.
Cada componen- te é dissolvido um após o outro em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.S. para volume e esterilizada em filtro com filtro de 0,22 mícrons.
Fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli ATCC11303 contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS.
Este experimento foi realizado para monitorar a formação de iso- preno a partir de glicose em pH 7,0 de fermentação desejada e temperatura 30ºC.
Um inóculo de cepa de E. coli obtido a partir de um frasco congelado foi plaqueado em uma placa de ágar de caldo LB (com antibióticos) e incu- bado a 37ºC.
Uma colônia única foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura.
Após o inóculo crescer a OD 1,0, medido a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
Glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até que as célu-
las alcançassem a fase estacionária. Após este tempo a alimentação de gli- cose foi reduzida para satisfazer as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 50 horas de fermentação foi 2,0 kg. A indução foi alcançada ao adicionar IPTG. A concentração de IPTGfoitrazida a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (ODs59) alcan- çou um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando ODss5o alcançou 190. O perfil de OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 99. O nível de isopreno no efluente gasoso do biorreator foi determinado como descrito aqui. A titulação de isopreno au- —mentou ao longo do curso da fermentação a um valor final de 1,4 g/L figura 100). A quantidade total de isopreno produzida durante as 50 horas de fer- mentação foi 10,0 g. O perfil da produtividade específica do isopreno com o tempo dentro do biorreator é mostrado na figura 101. O rendimento molar de Ú carbono utilizado que contribuiu para a produção do isopreno durante a fer- mentação foi 1,1%. O rendimento percentual em peso de isopreno a partir de glicose foi 0,5%. Exemplo 13: Modelagem por inflamabilidade e teste de isopreno
1.Sumário de modelagem por inflamabilidade e teste de isopreno Modelagem por inflamabilidade e experimentos foram realizados para várias misturas de hidrocarboneto/oxigênio/nitrogênio/água/dióxido de carbono. A modelagem resultante e teste experimental tiveram como objeti- vo a definição das curvas de inflamabilidade do isopreno e oxigê- nio/nitrogênio sob concentrações específicas de vapor e de monóxido de carbono em pressão e temperatura fixas. Uma matriz das condições do mo- deloé mostrada na Tabela 4, e a matriz dos experimentos realizados é mos- trada na Tabela 5.
. ' 170/230 o os o Ss 83 o — S SS 3 o 7 o o oo o 3 SS. 2 o o o o o 7 7 o > >|) >| > >| >) >) SS | 8) SS) Ss] ge É 2 SS Ss Ss Ss 8 = o ff == TFT) TT 8 GG > > > >>> > & Ss 2) go O BE | & Ss 5X | O O > |> o vs o Ss o — vs O 3 o To o oo o = SS 2 o o So o o o o so >| >|) >| >| >| > > E 8) 8) ce) SS & SÉ 2 Ss Ss Ss ss ss E o asi $ o > > >>> > > S 5 8/8 cc o O = O) O o o s Q2A'T0)|'= Oo o 8 83 SS o x 8 5 2 o & 9 E 38 S e e o Ss ol vo o o D s o Tr Tia oO 2 Es S : ã ê ] 8 oO EF o o Ez o > 6 8º o o O e o E eg S S/S? q a &/g 3 | 85 s|E =|/|£ESº Tv oo vo| “X OI cs = s/ o L 8lo 2/28 SS Lilo Bio 2lo Ss = o o > o) e o CR: 8 5 Ss = E 8 E 2 o O =|-|— Bion 2 a É SS na NS; = s o) E = ) õ NO E o | o E) FE =| alo 83 8 E Eis ol O O O) o = 3 SD E/S T 2ihoe a) Ee ss) > E/S E O 2 E > o n/ o " [o « Po | so | << O uioO os E | e) Ss . FILE =
Il. Descrição do modelo de temperatura de chama adiabática calculada (CAFT) Temperaturas adiabáticas de chama calculadas (CAFT) junto com um temperatura de chama limite selecionada para propagação de com- bustão foram usadas para determinar a curva de inflamabilidade para iso- preno. O programa de computador usado no presente estudo para calcular as temperaturas de chama é o programa NASA Glenn Research Center CEA (Chemical Equilibrium with Applications).
Há cinco etapas envolvidas na determinação da curva de infla- mabilidade usando um modelo de temperatura de chama adiabática para um mecanismo de combustão homogênea (onde não só o combustível, mas também o oxidante estão no estado gasoso): seleção dos reagentes deseja- dos, seleção da condição de teste, seleção da temperatura limite de chama, modificação dos reagentes, e construção da curva de inflamabilidade a partir — 15 doscálculos.
' Nesta primeira etapa, a seleção dos reagentes desejados, uma decisão deve ser tomada quanto à espécie de reagente que estará presente no sistema e as quantidades de cada. Em muitos casos os programas de computador usados para os cálculos apresentam uma lista de espécies de reagente e produto. Se quaisquer dos dados para as espécies a serem estu- dadas não são encontrados no programa, os mesmos podem ser obtidos a partir de outras fontes tais como as tabelas de JANAF ou a partir da internet. Neste modelo atual de dados, água, nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbo- no estavam presentes na base de dados do programa. A base de dados do programa não tinha isopreno como espécie; portanto as propriedades ter- modinâmicas foram incorporadas manualmente.
A próxima etapa é determinar as condições de pressão e tempe- ratura iniciais nas quais o processo de combustão está ocorrendo. Neste modelo a pressão era 1 atmosfera (absoluta) e a temperatura era 40ºC, o ponto de ebulição de isopreno.
Temperatura limite de chama para combustão pode ser selecio- nada com base em princípios teóricos ou determinada experimentalmente.
Cada método apresenta suas próprias limitações.
Com base em estudos anteriores, a temperatura limite de chama de hidrocarbonetos se encontra em uma faixa de 1000 K a 1500 K.
Para es- te modelo, o valor de 1500 K foi selecionado.
Esta é a temperatura na qual a reação de monóxido de carbono em dióxido de carbono (uma reação alta- mente exotérmica e constitui uma significante proporção de energia de cha- ma) se torna autossustentável.
Uma vez que a temperatura limite de chama foi determinada, os cálculos do modelo são realizados em uma determinada mistura de reagente (concentrações das espécies) e a temperatura adiabática de chama é de- terminada.
A propagação de chama é considerada ter ocorrido apenas se a temperatura for maior do que temperatura limite de chama.
A composição de mistura de reagente é então modificada para criar conjuntos de dados para Í misturas de propagação e não propagação.
Este tipo de modelo mostra uma boa concordância com os limi- ' tes de inflamabilidade determinados experimentalmente.
As regiões fora da curva derivada são não inflamáveis e regiões dentro da mesma são inflamá- veis.
O formato da curva forma um nariz.
O nariz da curva está relacionado à concentração de oxigênio limitante (LOC) para combustíveis gasosos.
III.
Resultados a partir do modelo de temperatura de chama adi- abática calculada (CAFT) Traçados nas figuras 68 a 74 estão os resultados do modelo CAFT para a série Série A a G, respectivamente.
As figuras traçam a tempe- ratura de chama adiabática calculada (usando o programa NASA CEA) co- mo uma função da concentração de combustível (em peso) para diversas proporções de oxigênio/nitrogênio (em peso). As partes da curva que estão acima de 1500 K, a temperatura de chama limite selecionada, contêm níveis de combustível suficiente para a propagação de chama.
Os resultados po- dem ser difíceis de interpretar na forma apresentada nas figuras 68 a 74. Adicionalmente, a forma atual não é condutora em comparação com os da- dos experimentais que são em geral apresentados em termos de volume por cento.
Usando a série A como um exemplo, os dados na figura 68 po- dem ser traçados na forma de uma curva de inflamabilidade tradicional.
U- sando a figura 68 e lendo através da linha de temperatura de 1500 K na or- denada, pode-se determinar a concentração de combustível para este limite detemperatura de chama ao reduzir a tangente para a abscissa para cada curva (proporção de oxigênio para nitrogênio) que a intersecciona.
Esses valores podem então ser tabulados como porcentagem em peso de combus- tível para uma porcentagem em peso determinada do oxidante figura 75A). Então conhecendo a composição do combustível (100 % em peso de iso- preno)ea composição do oxidante (relativa ao teor de água, oxigênio e ni- trogênio) quantidades molares podem ser estabelecidas.
A partir das quantidades molares resultantes, as concentrações do volume percentual podem ser calculadas.
As concentrações em termos . de volume percentual podem então ser traçadas para gerar a curva de infla- — 15 mabíilidade figura 75B). A área circunscrita pela curva é a faixa explosiva e a : área excluída é a faixa não explosiva.
A porção de nariz da curva é a con- centração de oxigênio limitante.
As figuras 76A e 76B contêm as concentra- ções de volume calculado para a curva de inflamabilidade para a série B ge- rada a partir dos dados apresentados na figura 69. Uma abordagem similar pode ser usada nos dados apresentados nas figuras 70 a 74. IV.
Equipamento experimental de teste de inflamabilidade e pro- cedimento Teste de inflamabilidade foi conduzido em um frasco de 4 litros de alta pressão.
O vaso tinha formato cilíndrico com um diâmetro interno de 15,24 cm e uma altura interna de 21,91 cm.
A temperatura do vaso (e os gases no interior) foi mantida usando aquecedores externos que foram con- trolados por um controlador PID.
Para evitar perdas de calor, lã cerâmica e isolamento refletivo foram enrolados em torno do vaso de pressão.
Termopa- res do tipo K foram usados para medir a temperatura do espaço de gás as- sim como a temperatura do vaso em si.
A figura 77 ilustra o frasco de teste.
Antes de o teste ser rodado, o vaso foi evacuado e purgado com nitrogênio para garantir que quaisquer gases dos testes anteriores fossem removidos. Vácuo foi então proporcionado no vaso. A pressão após isto ter sido feito foi tipicamente em torno de 6 kPa (a). Em virtude da purga de ni- trogênio, o gás responsável por esta pressão inicial foi assumido ser nitrogê- nio. Usando pressões parciais, água, isopreno, nitrogênio, e oxigênio foram então adicionados nas quantidades apropriadas para alcançar as condições teste em questão. Um ventilador de mistura magneticamente acionado den- tro do vaso garantiu a mistura do conteúdo gasoso. Os gases foram permiti- dos misturar por cerca de 2 minutos com o ventilador sendo desligado apro- ximadamente 1 minuto antes da ignição.
O ignitor foi compreendido de uma bobina de ni-cromo de 1,5 ohm e uma fonte de voltagem AC em um circuito temporizador. Usando um osciloscópio, foi determinado que 34,4 VAC foram enviados ao ignitor por 3,2 segundos. Uma corrente máxima de 3,8 Amp ocorreu aproximadamente . a meio caminho no ciclo de ignição. Assim, a potência máxima foi 131 Wea .- 15 energia total proporcionada em um período de ciclo de ignição foi aproxima- damente 210 J. Dados de deflagração foram adquiridos usando um transdutor de pressão de relutância variável Validino DP215 conectado ao sistema de a- quisição de dados. Uma mistura de gás foi considerada ser deflagrada se o aumento de pressão for maior ou igual a 5%. V. Resultados do teste de inflamabilidade A primeira série experimental (Série 1) foi corrida a 40ºC e 0 kPa sem vapor. Correr os testes em concentrações variáveis de isopreno e oxi- gênio produziu a curva de inflamabilidade mostrada na figura 78A. Os pontos dedados mostrados nesta curva são apenas aqueles que margeiam a curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados obtidos para esta série é mostrada nas figuras 80A e 80B.
A figura 78B resume os pontos de dados de potencial de explo- são mostrados na figura 78A. A figura 78C é a comparação dos dados expe- rimentais com a curva de inflamabilidade prevista pelo modelo CAFT. O mo- delo harmoniza-se muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem ser em virtude da natureza não adiabática da câmara de teste e das
. ' 175/230 limitações do modelo. O modelo está orientado para um horizonte de tempo infinito para a reação de oxidação e não permite qualquer limitação cinética de reação.
Adicionalmente, o modelo é limitado pelo número de espécies químicas em equilíbrio que estão em sua base de dados e assim pode não adequadamente prever as espécies pirolíticas. Também, a curva de inflama- bilidade desenvolvidas pelo modelo usa um valor para a temperatura limite de chama (1500K). Temperatura limite de chama pode ser uma gama de valores a partir de 1.000K a 1.500K dependendo das espécies de reação química. A natureza complexa das espécies químicas pirolíticas formadas em concentrações de combustível acima do nível estequiométrico de com- bustível/oxidante é uma razão pela qual o modelo pode não prever com pre- cisão os limites inflamáveis superiores para o sistema resultante. A segunda série experimental (Série 2) foi corrida a 40ºC e O .- 15 kPacom uma concentração de vapor fixa de 4%. Testes de corrida em con- : centrações variadas de isopreno e oxigênio produziu a curva de inflamabili- dade mostrada na figura 79A. Os pontos de dados mostrados nesta curva são somente aqueles que limitam à curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados tomados para esta série é mostrada na figura 81. Devido à similaridade entre os dados da série 1 somente os pontos-chave do limite inflamável inferior, concentração limitante de oxigênio, e limites inflamáveis superiores foram testados. A adição do vapor 4% à mistura de teste não modificou significativamente os limites-chave do envelope de inflamabilida- de. Deve ser observado que concentrações mais altas do vapor/água e ou outroinertes podem influenciar no envelope de inflamabilidade.
A figura 79B resume os pontos de dados de explosibilidade mos- trados na figura 79A. A figura 79C é uma comparação dos dados experimen- tais com o envelope de inflamabilidade predito do modelo CAFT. O modelo harmoniza-se muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem —serdevido aos mesmos fatores descritos na série 1 V. Cálculo de Limites de Inflamabilidade de Isopreno em Ar em 3 Atmosferas de Pressão
Os métodos descritos no Exemplo 13, partes | a IV também fo- ram usados para calcular os limites de inflamabilidade de isopreno em uma pressão de sistema absoluta de 3 atmosferas e 40ºC.
Estes resultados fo- ram comparados àqueles do Exemplo 13, partes | a IV em uma pressão de sistema absoluta de 1 atmosfera e 40ºC.
Esta pressão mais alta foi testada porque o envelope de inflamabilidade se expande ou se torna maior quando a pressão inicial do sistema é aumentada.
O limite de inflamabilidade superi- or é o mais afetado, seguido pela composição de oxigênio restritiva.
O limite de inflamabilidade mais baixo é o menos afetado (ver, por exemplo, "Bulletin 627- Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors" escri- tos por Michael G.
Zabetakis e publicado pelo antigo US Bureau of Mines (1965), que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade, particular com respeito ao cálculo de limites de inflamabilidade). À Na figura 82, a temperatura de chama adiabática calculada é traçada como uma função de concentração de isopreno (combustível), ex- - pressa em porcentagem de peso do combustível/nitrogênio/oxigênio total, onde a pressão de sistema foi inicialmente 3 atmosferas.
As temperaturas de chama calculadas são muito similares àquelas determinadas inicialmente no sistema de 1 atmosfera (figura 83). Como resultado, quando os envelopes de inflamabilidade são gerados usando os dados de inflamabilidade adiabá- ticos calculados, as curvas são muito similares (ver figuras 84 e 85). Por is- so, baseado nestes cálculos teóricos, um aumento de pressão de sistema de 1 atmosfera a 3 atmosferas não resulta em um aumento/alargamento signifi- cante do envelope de inflamabilidade.
Se desejado, estes resultados modelo — podem ser validados usando teste experimental (tal como o teste experimen- tal descrito neste pedido a uma pressão de 1 atmosfera). VII.
Resumo de estudos de inflamabilidade Um modelo de temperatura adiabático calculado foi desenvolvi do para o envelope de inflamabilidade do sistema de isopre- —no/oxigênio/nitrogênio/água/dióxido de carbono a 40ºC e O kPa.
O modelo CAFT que foi desenvolvido harmonizou-se bem aos dados experimentais gerados pelos testes conduzidos neste trabalho.
Os resultados a partir de experimentos da Série 1 e 2 validaram os resultados a partir de modelos de Série AeB.
A menos que definido de outra maneira, os significados de todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido são os comumente en- tendidos por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Single- ton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) fornece a um versado um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção. Deve ser entendido que esta invenção não é limitada a metodologia, protocolos, e re- agentes particulares descritos, como estes podem variar. Um versado na técnica também apreciará que qualquer método e materiais similares ou e- quivalentes aos descritos neste pedido também podem ser usados para pra- : ticar ou testar a invenção.
Os títulos fornecidos neste pedido não são limitações dos vários - aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo como um todo.
Para uso neste pedido, a menos que claramente indicado de ou- tra maneira, o uso dos termos "a", "o", "um", "uma" e similares refere-se a umourmais.
A referência a "aproximadamente" um valor ou parâmetro neste pedido inclui (e descreve) as modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro por si. Por exemplo, a descrição referindo-se a "aproximadamente X" inclui descrição de "X". Faixas numéricas são inclusivas dos números de- finindoafaixa.
Entende-se que os aspectos e as modalidades da invenção des- crita neste pedido incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente" de aspectos e modalidades.
Apêndice 1 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de 1-desóxi-D-xilulose-5- fosfato sintase ATH: AT3G21500(DXPS1) ATAG15560(CLA1) ATSG11380(DXPS3)
. 1 178/230 OSA: 4338768 4340090 4342614 CME: CMF089C PFA: MAL13P1.186 TAN: TA20470 TPV:TPO1 0516 ECO: b0420(dxs) ECJ: JWO0410(dxs) ECE: Z0523(dxs) ECS: ECS0474 ECC: co531(dxs) ECI: UTI89 CO443(dxs) ECP: ECP 0479 ECV: APECO1 1590(dxs) : ECW: EcE24377A 0451(dxs) — 15 ECX EcHS A0491 STY: STY0461(dxs) STT: t2441(dxs) SPT: SPA2301(dxs) SEC: SCO463(dxs) STM: STMO422(dxs) YPE: YPO3177(dxs) YPK: y1008(dxs) YPM: YP 0754(dxs) YPA: YPA 2671 YPN:YPN 0911 YPP: YPDSF 2812 YPS: YPTBO939(dxs) YPI: YpsI/P31758 3112(dxs) SFL: SFO0357(dxs) SFX:S0365(dxs) SFV: SFV. 0385(dxs) SSN: SSON 0397(dxs)
. H 179/230 SBO: SBO 0314(dxs) SDY: SDY 0310(dxs) ECA: ECA1131(dxs) PLU: plu3887(dxs)
BUC:BU464(dxs) BAS: BUsg448(dxs) WBR: WGLp144(dxs) SGL: SG0656 KPN: KPN 00372(dxs)
BFL:Bfl238(dxs) BPN: BPEN 244(dxs) HIN: HI 439(dxs) HIT: NTHITI691(dxs) HIP: CGSHIEE 04795
-— 15 HIQ: CGSHIGG 01080
HDU: HDO0441(dxs) HSO: HS 0905(dxs) PMU: PMO0532(dxs) MSU: MS1059(dxs)
APL:APL 0207(dxs) XFA: XF2249 XFT: PD1293(dxs) XCC: XCC2434(dxs) XCB: XC 1678
XCV:XCV2764(dxs) XAC: XAC2565(dxs) X0O: XOO02017(dxs) XOM: XOO 1900(XOO01900) VCH: VCO889
WVVU:WV1 0315 VVY: VVO868 VPA: VPO686
. f 180/230 VFI: VFO711 PPR: PBPRAO805 PAE: PA4044(dxs) PAU: PA14 11550(dxs) PAP:PSPA7 1057(dxs) PPU: PP 0527(dxs) PST: PSPTO 0698(dxs) PSB: Psyr 0604 PSP: PSPPH 0599(dxs) PFL:PFL 5510(dxs) PFO: Pfl 5007 PEN: PSEENO6O00(dxs) PMY: Pmen 3844 Á PAR: Psyc 0221(dxs) -— 15 PCR Pcryo 0245 ACI: ACIAD3247(dxs) SON: SO 1525(dxs) SDN: Sden 2571 SFR: Sfri 2790 SAZ: Sama 2436 SBL: Sbal 1357 SLO: Shew 2771 SHE: Shewmr4 2731 SHM: Shewmr7 2804 SHN:Shewana3 2901 SHW: Sputw3181 2831 ILO: 112138(dxs) CPS: CPS 1088(dxs) PHA: PSHAa2366(dxs) PAT:Patl 1319 SDE: Sde 3381 PIN: Ping 2240 v , 181/230 MAOQ: Maqu 2438 MCA: MCAO817(dxs) FTU: FTT1018c(dxs) FTF: FTF1018c(dxs) FTW:FTW 0925(dxs) FTL: FTL 1072 FTH: FTH 1047(dxs) FTA: FTA 1131(dxs) FTN: FTN 0896(dxs) NOC:Noc 1743 AEH: Mlg 1381 HCH: HCH 05866(dxs) CSA: Csal 0099 " ABO: ABO 2166(dxs) -— 15 AHA:AHA 3321(dxs) ' BCI: BCI 0275(dxs) RMA: Rmag 0386 VOK: COSY 0360(dxs) NME: NMB1867 —NMA: NMAO589(dxs) NMC: NMCO0352(dxs) NGO: NGO0036 CVI: CV 2692(dxs) RSO: RSc2221(dxs) —REU:Reut A0882 REH: H16 A2732(dxs) RME: Rmet 2615 BMA: BMAAO330(dxs) BMV: BMASAVP1 1512(dxs) BML:BMA10299 1706(dxs) BMN: BMA10247 A0364(dxs) BXE: Bxe B2827
. 1 182/230 BUR: Bcep18194 B2211 BCN: Bcen 4486 BCH: Bcen2424 3879 BAM: Bamb 3250 BPS:BPSS1762(dxs) BPM: BURPS1710b AO842(dxs) BPL: BURPS1106A A2392(dxs) BPD: BURPS668 A2534(dxs) BTE: BTH 110614(dxs) BPE:BP2798(dxs) BPA: BPP2464(dxs) BBR: BB1912(dxs) RFR: Rfer 2875 : POL: Bpro 1747 -— 15 PNA:Pnap 1501 . ' AJS: Ajs 1038 MPT: Mpe A2631 HAR: HEARO0279(dxs) MMS: mma 0331 NEU:NE1161(dxs) NET: Neut 1501 NMU: Nmul A0236 EBA: ebA4439(dxs) AZO: azo1198(dxs) DAR: Daro 3061 TBD: Tbd 0879 MFA: Mfla 2133 HPY: HP0354(dxs) HPJ: jnap0328(dxs) HPA:HPAG1 0349 HHE: HHO608(dxs) HAC: Hac 0968(dxs)
. ' 183/230 WSU: WS1996 TDN: Tmden 0475 CJE: Cjo321(dxs) CJR: CJE0366(dxs) CJJ:CJJ81176 0343(dxs)
CJU: C8J 0298(dxs) CJD: JJD26997 1642(dxs) CFF: CFF8240 0264(dxs) CCV: CCV52592 1671(dxs) CCV52592 1722
CHA: CHAB381 1297(dxs) CCO: CCC13826 1594(dxs) ABU: Abu 2139(dxs) NIS: NIS 0391(dxs) SUN: SUN 2055(dxs)
-— 15 GSU: GSUO68S6(dxs-1) GSU1I764(dxs-2) ã GME: Gmet 1934 Gmet 2822
PCA: Pcar 1667 PPD: Ppro 1191 Ppro 2403 DVU: DVU1350(dxs)
DVL: Dvul 1718 DDE: Dde 2200 LIP: LIO408(dsx) DPS: DP2700 ADE: Adeh 1097
MXA: MXAN 4643(dxs) SAT: SYN 02456 SFU: Sfum 1418 PUB: SAR11 0611(dxs) MLO: mIr7474
MES:Meso 0735 SME: SMc00972(dxs) ATU: Atu0745(dxs)
- LS 184/230 ATC: AGR C 1351 RET: RHE CHO0913(dxs) RLE: RLO973(dxs) BME: BMEI1498 BMF:BAB1 0462(dxs)
BMS: BRO436(dxs) BMB: BruAb1 0458(dxs) BOV: BOV 0443(dxs) BJA: bll2651(dxs)
BRA: BRADO?2161(dxs) BBT: BBta 2479(dxs) RPA: RPAO952(dxs) RPB: RPB 4460
: RPC: RPC 1149 .- 15 RPD:RPD 4305
RPE: RPE 1067 NWI: Nwi 0633 NHA: Nham 0778 BHE: BHO04350(dxs)
—BQU:BQ03540(dxs) BBK: BARBAKC583 0400(dxs) CCR: CC 2068 SIL: SPO0247(dxs) SIT: TM1I040 2920
RSP:RSP 0254(dxsA) RSP 1134(dxs) JAN: Jann 0088 Jann 0170 RDE: RD1 0101(dxs) RD1 0548(dxs) MMR: Mmar10 0849 HNE: HNE. 1838(dxs)
ZMO:ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs) NAR: Saro 0161 SAL: Sala 2354
. 185/230 ELI: ELI 12520 — GOX: GOX0252 - GBE: GPCGDNIH1 0221 GPCGDNIH1 2404 í RRU: Rru AOOS54 Rru A2619 MAG: amb2904 MGM: Mmc1 1048 SUS: Acid 1783 BSU: BG11715(dxs) BHA: BH2779 BAN: BA4400(dxs) BAR: GBAA4400(dxs) BAA: BA 4853 BAT: BAS4081 . BCE: BC4176(dxs) -— 15 BCA:BCE 4249(dxs) : BCZ: BCZK3930(dxs) BTK: BT9727 3919(dxs) BTL: BALH 3785(dxs) BLI: BLO1523(dxs) BLD:BLi02598(dxs) BCL: ABC2462(dxs) BAY: RBAM 022600 BPU: BPUM 2159 GKA: GK2392 GTN:GTNG 2322 LMO: Imo1365(tktB) LMF: LMOf2365 1382(dxs) LIN: lin1402(tktB) LWE: we 1380(tktB) LLA:LI08911(dxsA)L123365(dxsB) LLC: LACR 1572 LACR 1843 LLM: lIMg 0749(dxsB)
. « 186/230 SAK: SAK 0263 - LPL: lp 2610(dxs) LJO: LJO406 í LAC: LBAO356 LSL:LSL 0209(dxs) LGA: LGAS 0350 STH: STH1842 CAC: CAC2077 CA PO0106(dxs) CPE: CPE1819 CPF:CPF 2073(dxs) CPR: CPR 1787(dxs) CTC: CTCO1575 CNO: NTO1CX 1983 : CTH: Cthe 0828 — 15 CDF:CD1207(dxs) CBO: CBO1881(dxs) CBA: CLB 1818(dxs) CBH: CLC 1825(dxs) CBF: CLI 1945(dxs) CKL:CKL 1231(dxs) CHY: CHY 1985(dxs) DSY: DSY2348 DRM: Dred 1078 PTH: PTH 1196(dxs) SWO: Swol 0582 CSC: Csac 1853 TTE: TTE1298(dxs) MTA: Moth 1511 MPE: MYPE730 —“MGA:MGA 1268(dxs) MTU: Rv2682c(dxs1) Rv3379c(dxs2) MTC: MT2756(dxs)
: CC 187/230 MBO: Mb2701c(dxs1) Mb3413c(dxs2) ' MLE: ML1038(dxs) MPA: MAP2803c(dxs) i MAV: MAV 3577(dxs) MSM: MSMEG 2776(dxs) MMC: Mmcs 2208 CGL: NCgl1827(cgl1902) CGB: cg2083(dxs) CEF: CE1796 CDI: DIP1397(dxs) CJK: jk1078(dxs) NFA: nfa37410(dxs) RHA: RHA1 ro06843 ] SCO: SCO6013(SC1C3.01) SCO6768(SC6AS.17) — 15 SMA: SAV1I646(dxs1) SAV2244(dxs2) í TWH: TWT484 TWS: TW280(Dxs) LXX: Lxx10450(dxs) CMI: CMM 1660(dxsA) AAU:AAur 1790(dxs) PAC: PPA1062 TFU: Tfu 1917 FRA: Francci3 1326 FAL: FRAAL2088(dxs) ACE: Acel 1393 SEN: SACE 1815(dxs) SACE 4351 BLO: BL1132(dxs) BAD: BAD 0513(dxs) FNU: FN1208 FN1464 RBA:RB2143(dxs) CTR: CT331(dxs) CTA: CTA 0359(dxs)
. < 188/230 CMU: TCO0608 - CPN: CPn1060(tktB 2) CPA: CP0790 K CPJ: CPj1060(tktB 2) CPT:CpB1102 CCA: CCAPO3S04(dxs) CAB: CAB301(dxs) CFE: CFO699(dxs) PCU: pco0619(dxs) TPA:TPO824 TDE: TDE1910(dxs) LIL: LA3S285(dxs) LIC: LIC10863(dxs) : LBJ: LBJ 0917(dxs) -— 15 LBL:LBL 0932(dxs) SYN: sIN1945(dxs) SYW: SYNW1292(Dxs) SYC: syc1087 c(dxs) SYF: Synpcc7942 0430 SYD:Syncc9605 1430 SYE: Syncc9902 1069 SYG: sync 1410(dxs) SYR: SynRCC307 1390(dxs) SYX: SynWH7803 1223(dxs) CYA:CYA 1701(dxs) CYB: CYB 1983(dxs) TEL: til0623 GVI: gll0194 ANA: alro0599 —AVA: Ava 4532 PMA: Pro0928(dxs) PMM: PMMO0907(Dxs)
. Li 189/230 PMT: PMTO685(dxs) f PMN: PMN2A 0300 PMI: PMT9312 0893 i PMB: AS601 09541(dxs) PMC:P9515 09901(dxs) PMF: P9303 15371(dxs) PMG: P9301 09521(dxs) PMH: P9215 09851 PMJ: P9211 08521 PME: NATL1 09721(dxs) TER: Tery 3042 BTH: BT 1403 BT 4099 BFR: BFO873 BF4306 : BFS: BFO0796(dxs) BF4114 -— 15 PGlI PG2217(dxs) : CHU: CHU 3643(dxs) GFO: GFO 3470(dxs) FPS: FP0279(dxs) CTE: CT0337(dxs) CPH:Cpha266 0671 PVI: Cvib 0498 PLT: Plut 0450 DET: DETO0745(dxs) DEH: cbdb A720(dxs) DRA: DR 1475 DGE: Dgeo 0994 TTH: TTC1I614 TTJ: TTHAOOO6 AAE: aq 881 —TMA:TM1770 PMO: Pmob 1001 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de acetil-CoA-acetiltransferase
HSA: 38(ACAT1) 39(ACAT2) Fr PTR: 451528(ACAT1) MCC: 707653(ACAT1) 708750(ACAT2) i MMU: 110446(Acat1) 110460(Acat2) —RNO:25014(Acat1) CFA: 484063(ACAT2) 489421(ACAT1) GGA: 418968(ACAT1) 421587 (RCJMBO4 34i5) XLA: 379569(MGC69098) 414622(MGC81403) 414639(MGC81256) 444457 (MGC83664) XTR: 394562(acat2) DRE: 30643(acat2) SPU: 759502(LOC759502) DME: Dmel CG10932 Dmel CG9149 Í CEL: TO2G5.4 TO2G5.7 T02G5.8(kat-1) - 15 ATH:AT5G48230(ACAT2/EMB1276) ' OSA: 4326136 4346520 CME: CMAD42C CME0O87C SCE: YPLO28W(ERG10) AGO: AGOS ADR165C PIC:PICST 31707(ERG10) CAL: CaO19.1591(erg10) CGR: CAGLOL12364g SPO: SPBC215.09c MGR: MGG 01755 MGG 13499 —ANI:AN1I409.2 AFM: AFUA 6G14200 AFUA 8G04000 AOR: AO090103000012 AO090103000406 CNE: CNCO05280 UMA: UMO3571.1 DDI:DDB 0231621 PFA: PF14 0484 TET: TTHERM 00091590 TTIHERM 00277470 TTHERM 00926980
TCR: 511003.60 - ECO: b2224(atoB) ECJ: JW2218(atoB) JW5453(ygeF) i ECE: Z4164(ygeF) ECS:ECs3701 ECC: c2767(atoB) c3441(ygeF) ECI: UTI89 C2506(atoB) UTI89 C3247(ygeF) ECP: ECP 2268 ECP 2857 ECV: APECO1 3662(ygeF) APECO1 4335(atoB) APECO1 43352(atoB) ECX:EcHS A2365 STY: STY3164(ygeF) STT: t2929(ygeF) SPT: SPA2886(ygeF) É SEC: SC2958(ygeF) .- 15 STM: STM3019(ygeF) f SFL: SF2854(ygeF) SFX: S3052(ygeF) SFV: SFV. 2922(ygeF) SSN: SSON 2283(atoB) SSON 3004(ygeF) SBO:SBO 2736(ygeF) ECA: ECA1282(atoB) ENT: Ent638 3299 SPE: Spro 0592 HIT: NTHIO932(atoB) XCC:XCC1297(atoB) XCB: XC 2943 XCV: XCV1401(thlA) XAC: XAC1348(atoB) X0OO: XOO1881(atoB) XOM:XOO 1778(XKO0O01778) VCH: VCAO690 VCO: VCO395 0630
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LIC: LIC10396(phbA) - LBJ: LBJ 2862(paaJ-4) LBL: LBL. 0209(paaJ-4) ' SYN: sIr1993(phaA) SRU:SRU 1211(atoB) SRU 1547 CHU: CHU 1910(atoB) GFO: GFO 1507(atoB) FJO: Fjoh 4612 FPS: FPO0770 FP1586 FP1725 RRS: RoseRS 3911 RoseRS 4348 RCA: Rcas 0702 Rcas 3206 HAU: Haur 0522 DRA: DR 1072 DR 1428 DR 1960 DR 2480 DR AO0O053 : DGE: Dgeo 0755 Dgeo 1305 Dgeo 1441 Dgeo 1883 TTH: TTCO0191 TTCO330 E TTJ: TTHAO5SS59 TME: Tmel 1134 FNO: Fnod 0314 PMO: Pmob 0515 HMA:rminACO896(acaB3) rmAC2815(aca2) rimAC3497(ygeF) rmnBO240(aca1) rinBO242(acaB2) rrnBO309(acaB1) TAC: Ta0582 TVO: TVNO649 PTO: PTO1505 APE:APE 2108 SSO: SSO02377(acaB+4) STO: ST0514 SAI: Saci 0963 Saci 1361(acaB1) MSE: Msed 0656 PAI: PAE1I220 PIS: Pis! 0029 Pisl 1301 PCL: Pcal 0781
PAS: Pars 0309 Pars 1071 - CMA: Cmaq 1941 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de HMG-CoA sintase : HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2) PTR:457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1) MCC: 702553(HMGCS1) 71354 1(HMGCS2) MMU: 15360(Hmgcs2) 2087 15(Hmgcs1) RNO: 24450(Hmgcs2) 29637 (Hmgcs1) CFA: 479344(HMGCS1) 607923(HMGCS2) BTA:407767(HMGCS1) SSC: 397673(CH242-38B5.1) GGA: 39637 9(HMGCS1) XLA: 380091(hmgcs1) 447204(MGC80816) ! DRE: 394060(hmgcs1) SPU: 578259(LOC578259) à! DME: Dmel CG4311(Hmgs) CEL: F25B4.6 ATH: ATA4G11820(BAP1) OSA: 4331418 4347614 CME: CMM189C SCE: YML126C(ERG13) AGO: AGOS ADL356C PIC: PICST 83020 CAL: CaO19 7312(CaO19.7312) CGR:CAGLOHO4081g SPO: SPACA4F8.14c(hces) MGR: MGG 01026 ANI: AN4923.2 AFM: AFUA 3G10660 AFUA 8G07210 —AOR:AO090003000611 AO090010000487 CNE: CNCO5080 CNG02670 UMA: UMO5362.1
ECU: ECU10 0510 . DDI: DDBDRAFT 0217522 DDB 0219924(hgsA) TET: TTHERM 00691190 Í TBR: Tb927.8.6110 YPE:YPO1457 YPK: y2712(pksG) YPM: YP 1349(pksG) YPA: YPA 0750 YPN: YPN 2521 YPP: YPDSF 1517 YPS: YPTB1475 CBD: COXBU7E912 1931 TOX: Ter 1719 : DNO: DNO 0799 BMA: BMAA1I212 : BPS: BPSS1002 BPM: BURPS1710b A2613 BPL: BURPS1106A A1384 BPD: BURPS668 A1470 BTE:BTH 111670 MXA: MXAN 3948(tac) MXAN 4267(mvaS) BSU: BG10926(pksG) OIH: OB2248 SAU: SA2334(mvasS) SAV: SAV2546(mvaS) SAM: MW2467(mvaS) SAR: SAR2626(mvaS) SAS: SAS2432 SAC: SACOL2561 SAB: SAB2420(mvaS) SAA: SAUSA300 2484 SAO: SAOUHSC 02860
SAJ: SaurJH9 2569 - SAH: SaurJH1 2622 SEP: SE2110 : SER: SERP2122 —SHA: SHO508(mvaS) SSP: SSP0324 LMO: Imo1415 LMF: LMOf2365 1434(mvasS) LIN: lin1454 LWE: we1l432(mvaS) LLA: L13187(hmcM) LLC: LACR 1666 LLM: llmg 0929(hmcM) SPY: SPy 0881(mvaS.2) SPZ:M5005 Spy 0687(mvaS.1) : SPM: spyM18 0942(mvaS2) SPG: SpyM3 0600(mvaS.2) SPS: SPs1253 SPH: MGAS10270 Spy0745(mvaS1) SPI: MGAS10750 Spy0779(mvaS1) SPJ: MGAS2096 Spy0759(mvaS1) SPK: MGAS9429 Spy0743(mvaS1) SPF: SpyM51121(mvaS) SPA: M6 Spy0704 SPB:M28 Spy0667(mvasS.1) SPN: SP 1727 SPR: spr157 1(mvaS) SPD: SPD 1537(mvaS) SAG: SAG1316 —SAN:gbs1386 SAK: SAK 1347 SMU: SMU.943c
STC: str0577(mvaS) - STL: stu0577(mvaS) STE: STER 0621 i SSA: SSA 0338(mvaS) SSU:SSUO5 1641 SSV: SSU98 1652 SGO: SGO 0244 LPL: Ip 2067(mvaS) LJO: LJ1607 LAC:LBAO628(hmcS) LSA: LSA1484(mvasS) LSL: LSL. 0526 LDB: Ldb0881(mvaS) : LBU: LBUL 0806 LBR:LVIS 1363 - LCA: LSEI 1785 LGA: LGAS 1372 LRE: Lreu 0676 PPE: PEPE 0868 EFA:EF1363 OOE: OEOE 0968 LME: LEUM 1184 NFA: nfa22120 SEN: SACE 4570(pksG) —BBU:BBO683 BGA: BG0706 BAF: BAPKO 0727 FJO: Fjoh 0678 HAL: VNG1615G(mvaB) —HMA:rrmnAC1740(mvaS) HWA: HQO2868A(mvaB) NPH: NP2608A(mvaB 1) NP4836A(mvaB 2)
. , 207/230 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de hidroximetilglutaril-CoA re- - ductase HSA: 3156(HMGCR) : PTR: 471516(HMGCR) —MCC:705479(HMGCR) MMU: 15357 (Hmgcr) RNO: 25675(Hmgrcr) CFA: 479182(HMGCR) BTA: 407159(HMGCR) GGA:395145(RCJMBO4 14m24) SPU: 373355(LOC373355) DME: Dmel CG10367(Hmgcr) CEL: FO8F8.2 OSA: 4347443 SCE: YLR450W(HMG2) YMLO75C(HMG1) : AGO: AGOS AER152W CGR: CAGLOL11506g SPO: SPCC162.09c(hmg1) ANI: ANS817.2 AFM:AFUA 1G11230 AFUA 2G03700 AOR: AO090103000311 AO090120000217 CNE: CNF04830 UMA: UMO3014.1 ECU: ECU10 1720 DDI:DDB 0191125(hmgA) DDB 0215357(hmgB) TBR: Tb927.6.4540 TCR: 506831.40 509167.20 LMA: LmjF30.3190 VCH: VCAO723 WVCO:VCO0395 0662 WVVU: VW2 0117 VVY: VVAO625
VPA: VPAO0968 - VFI: VFAO841 PAT: Patl 0427 ] CBU: CBU 0030 CBU 0610 CBD: COXBU7E912 0151 COXBU7E912 0622(hmgA)
TCOX: Ter 1717 DNO: DNO 0797 CVI: CV 1806 SUS: Acid 5728 Acid 6132
SAU: SA2333(mvah) SAV: SAV2545(mvaA) SAM: MW2466(mvaA) SAB: SAB2419c(mvaA)
: SEP: SE2109 LWE: Wwe0819(mvaA) - LLA: L10433(mvaA)
LLC: LACR 1664 LLM: IImg 0931(mvaA) SPY: SPy 0880(mvaS.1)
SPM:spyM18 0941(mvaS1) SPG: SpyM3 0599(mvaS.1) SPS: SPs1254 SPH: MGAS10270 Spy0744 SPI: MGAS10750 Spy0778
SPJ: MGAS2096 Spy0758 SPK: MGAS9429 Spy0742 SPA: M6 Spy0703 SPN: SP 1726 SAG: SAG1317
—SAN:gbs1387 STC: str0576(mvaA) STL: stu0576(mvaA)
STE: STER 0620 - SSA: SSA 0337(mvaA) LPL: lp 0447 (mvaA) Í LJO: LJ1608 LSL:LSL 0224 LBR: LVIS 0450 LGA: LGAS 1373 EFA: EF1364 NFA: nfa22110 —BGA: BG0708(mvaA) SRU: SRU 2422 FPS: FP2341 MMP: MMPOO087(hmgA) ' MMOQ: MmarC5 1589 MAC: MA3S073(hmgA) MBA: Mbar A1972 MMA: MM 0335 MBU: Mbur 1098 MHU: Mhun 3004 MEM: Memar 2365 MBN: Mboo 0137 MTH: MTH562 MST: Msp 0584(hmgA) MSI: Msm 0227 MKA: MKO0355(HMG1) AFU: AF1736(mvaA) HAL: VNG1875G(mvaA) HMA: rrnAC3412(mvaA) HWA: HQ3215A(hmgR) —NPH: NPOSSSA(mvaA 2) NP2422A(mvaà 1) TAC: Ta0406m TVO: TVN1168
. , 210/230 PTO: PTO1143 - PAB: PAB2106(mvaA) PFU: PF1848 TKO: TK0914 —RClI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA) APE: APE 1869 IHO: Igni 0476 HBU: Hbut 1531 SSO: SSO0531 STO: ST1352 SAI: Saci 1359 PAI: PAE2182 PIS: Pisl 0814 . PCL: Pcal 1085 PAS:Pars 0796 : Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de mevalonato quinase HSA: 4598(MVK) MCC: 707645(MVK) MMU: 17855(Mvk) RNO:81727(Mvk) . CFA: 486309(MVK) BTA: 505792(MVK) GGA: 768555(MVK) DRE: 49247 7(z9gc:103473) SPU: 585785(LOC585785) DME: Dmel CG33671 OSA: 4348331 SCE: YMR208W(ERG12) AGO: AGOS AER335W PIC:PICST 40742(ERG12) CGR: CAGLOFO3861g SPO: SPAC13G6.11c
MGR: MGG 06946 - ANI: AN3869.2 AFM: AFUA 4G07780 AOR: AO090023000793 CNE: CNK01740 ECU: ECUO9 1780 DDI: DDBDRAFT 0168621 TET: TTHERM 00637680 TBR: Tb927.4.4070 TCR:436521.9509237.10 LMA: LmjF31.0560 CBU: CBU 0608 CBU 0609 CBD: COXBU7ES912 0620(mvk) : LPN: lIpg2039 LPF: Ipl2017 ' LPP: Ipp2022 BBA: Bd1027(ImbP) Bd1630(mvk) MXA: MXAN 5019(mvk) OIH: OB0225 —SAU: SAO547(mvaK1) SAV: SAVO5S9O(mvaK1) SAM: MWO545(mvaK1) SAR: SARO596(mvaK1) SAS: SASO0549 SAC: SACOLO636(mvk) SAB: SABO540(mvaK1) SAA: SAUSA3Z00 0572(mvk) SAO: SAOUHSC 00577 SEP: SE0361 SER: SERPO238(mvk) SHA: SH2402(mvaK1) SSP: SSP2122
LMO: Imo0010 - LMF: LMOf2365 0011 LIN: lin0010 Ô LWE: lve0011(mvk) LLA:L7866(yeaG) LLC: LACR 0454 LLM: llmg 0425(mvk) SPY: SPy 0876(mvaK1) SPZ: M5005 Spy O682(mvaK1) SPM:spyM18 0937(mvaK1) SPG: SpyM3 0595(mvaK1) SPS: SPs1258 SPH: MGAS10270 Spy0740(mvaK1) : SP!: MGAS10750 Spy0774(mvaK1) SPJ: MGAS2096 Spy0753(mvaK1) - SPK: MGAS9429 Spy0737(mvaK1) SPF: SpyM51126(mvaK1) SPA: M6. Spy0699 SPB: M28 Spy0662(mvaK1) SPN:SP 0381 SPR: spr0338(mvk) SPD: SPD 0346(mvk) SAG: SAG1326 SAN: gbs1396 —SAK: SAK 1357(mvk) SMU: SMU.181 STC: stro559(mvaK1) STL: stu0559(mvaK1) STE: STER 0598 —SSA:SSA 0333(mvaK1) SSU: SSUOS5 0289 SSV: SSU98 0285
. , 213/230 SGO: SGO 0239(mvk) - LPL: Ip 1735(mvaKi) LJO: LJ1205 : LAC: LBA1167(mvaK) LSA: LSAO908(mvaK1) LSL: LSL O685(eRG) LDB: Ldbo999(mvk) LBU: LBUL. 0906 LBR: LVIS 0858 LCA:LSEI 1491 LGA: LGAS 1033 LRE: Lreu 0915 PPE: PEPE 0927 EFA: EFO904(mvk) OOE:OEOE 1100 5 LME: LEUM 1385 NFA: nfa22070 BGA: BG0711 BAF: BAPKO 0732 FPS:FPO0313 MMP: MMP1335 MAE: Maeo 0775 MAC: MAO6O2(mvk) MBA: Mbar A1421 MMA: MM 1762 MBU: Mbur 2395 MHU: Mhun 2890 MEM: Memar 1812 MBN: Mboo 2213 MST:Msp 0858(mvk) MSI: Msm 1439 MKA: MKO0993(ERG12)
« r 214/230 HAL: VNG1145G(mvk) . HMA: rrnACO0077 (mvk) HWA: HQ2925A(mvk) Ú NPH: NP2850A(mvk) PTO:PTO1352 PHO: PH1625 PAB: PABO372(mvk) PFU: PF1637 (mvk) TKO: TK1474 RCl: LRC399(mvk) APE: APE 2439 HBU: Hbut 0877 SSO: SSO0383 : STO: ST2185 SAI: Saci 2365(mvk) : MSE: Msed 1602 PAI: PAE3 108 PIS: Pis! 0467 PCL: Pcal 1835 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de fosfomevalonato quinase HSA: 10654(PMVK) PTR: 457350(PMVK) MCC: 717014(PMVK) MMU: 68603(Pmvk) CFA:612251(PMVK) BTA: 513533(PMVK) DME: Dmel CG10268 ATH: AT1IG31910 OSA: 4332275 SCE: YMR220W(ERG8) AGO: AGOS AER354W PIC: PICST 52257(ERG8)
" r 215/230 CGR: CAGLOFO3993g - SPO: SPAC343.01c MGR: MGG 05812 i ANI: AN2311.2 AFM:AFUA 5G10680 AOR: AO090010000471 CNE: CNMO00100 UMA: UMO0760.1 ; DDI: DDBDRAFT 0184512 TBR:TbO9.160.3690 ' TCR: 507913.20 508277.140 1 LMA: LmjF15.1460 MXA: MXAN 5017 OIH: OB0227 SAU: SAO549(mvaK2) - SAV: SAVO592(mvakK2) SAM: MWO547 (mvaK2) SAR: SARO598(mvakK2) SAS: SASO0551 SAC: SACOLO638 SAB: SABO542(mvakK2) SAA: SAUSA300 0574 SAO: SAOUHSC 00579 SAJ: SaurJH9 0615 SEP: SE0363 SER: SERP0240 SHA: SH2400(mvaK2) SSP: SSP2120 LMO: Imooo12 —LMF:LMOf2365 0013 LIN: linoo12 LWE: we0013
“ r 216/230 LLA: L10014(yebA) - LLC: LACR 0456 LLM: lImg. 0427 Ê SPY: SPy. 0878(mvaK2) SPZ:M5005 Spy 0684(mvaK2) SPM: spyM18 0939 SPG: SpyM3 0597(mvaK2) SPS: SPs1256 : SPH: MGAS10270 Spy0742(mvaK2) SPI MGAS10750 Spy0776(mvaK2) h SPJ: MGAS2096 Spy0755(mvaK2) SPK: MGAS9429 Spy0739(mvaK2) SPF: SpyM51124(mvaK2) : SPA: M6 Spy0701 SPB:M28 Spy0664(mvaK2) - SPN: SP 0383 SPR: spro340(mvaK2) SPD: SPD 0348(mvaK2) SAG: SAG1324 SAN:gbs1394 SAK: SAK 1355 SMU: SMU.938 STC: stro561(mvaK2) STL: stu0561(mvaK2) STE: STER 0600 SSA: SSA 0335(mvaK2) SSU: SSUO5 0291 SSV: SSU98 0287 SGO: SGO 0241 LPL:Ip 1733(mvaK2) LJO: LJ1207 LAC: LBA1169
N v 217/230 LSA: LSAO9O6(mvakK2) . LSL: LSL 0683 LDB: Ldb0997(mvaK) i LBU: LBUL, 0904 LBR:LVIS 0860 LCA: LSEI 1092 LGA: LGAS 1035 LRE: Lreu 0913 A PPE: PEPE 0925 EFA:EFO902 f NFA: nfa22090 S BGA: BG0710 BAF: BAPKO 0731 < NPH: NP2852A “15 SSO:SSO02988 i STO: ST0978 SAI: Saci 1244 Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de difosfomevalonato descar- boxilase HSA:4597(MVD) PTR: 468069(MVD) MCC: 696865(MVD) MMU: 192156(Mvd) RNO: 81726(Mvd) CFA:489663(MVD) GGA: 425359(MVD) DME: Dmel CG8239 SCE: YNRO43W(MVD1) AGO: AGOS AGL232C PIC:PICST 90752 CGR: CAGLOCO3630g SPO: SPAC24C9.03
4d 1. 218/230 MGR: MGG 09750 . ANI: AN4414.2 AFM: AFUA 4G07130 i AOR: AO090023000862 CNE: CNLO04950 UMA: UMO5179.1 DDI: DDBDRAFT 0218058 TET: TTHERM 00849200 . TBR: Tb10.05.0010 Tb10.61.2745 TCR:507993.330 511281.40 À LMA: LmjF18.0020 CBU: CBU 0607(mvaD) CBD: COXBU7ES912 0619(mvaD) - LPN: Ipg2040 LPF: lpl2018 : LPP: Ipp2023 TCX: Ter 1734 DNO: DNO. 0504(mvaD) BBA: Bd1629 MXA:MXAN 5018(mvaD) OIH: OB0226 SAU: SAO548(mvaD) SAV: SAVO591(mvaD) SAM: MWOS546(mvaD) SAR: SARO597(mvaD) SAS: SASO0550 SAC: SACOLO637(mvaD) SAB: SABO541(mvaD) SAA: SAUSA300 0573(mvaD) SAO: SAOUHSC 00578 SAJ: SaurJH9 0614 SAH: SaurJHi 0629
É * 219/230 SEP: SE0362 - SER: SERP0239(mvaD) SHA: SH2401(mvaD) Ú SSP: SSP2121 LMO:Imo0011 LMF: LMOf2365 0012(mvaD) LIN: lino011 LWE: lwe0012(mvaD) - LLA: L9089(yeaH) LLC:LACR 0455 ' LLM: limg. 0426(mvaD) SPY: SPy 0877(mvaD) SPZ: M5005 Spy O683(mvaD) = SPM: spyM18 0938(mvd) SPG: SpyM3 O0596(mvaD) SPS: SPs1257 SPH: MGAS10270 Spy0741(mvaD) SPI: MGAS10750 Spy0775(mvaD) SPJ: MGAS2096 Spy0754(mvaD) SPK: MGAS9429 Spy0738(mvaD) SPF: SpyM51125(mvaD) SPA: M6 Spy0700 SPB: M28 Spy0663(mvaD) SPN: SP 0382 —SPR:spro339(mvd1) SPD: SPD 0347(mvaD) SAG: SAG1325(mvaD) SAN: gbs1395 SAK: SAK 1356(mvaD) —SMU: SMU.937 STC: stro560(mvaD) STL: stu0560(mvaD)
e DD 220/230 STE: STER 0599 : SSA: SSA 0334(mvaD) SSU: SSUO5 0290 ] SSV: SSU98 0286 SGO:SGO 0240(mvaD) LPL: lp 1734(mvaD) LJO: LJ1206 LAC: LBA1168(mvaD) : LSA: LSAO907(mvaD) LSL:LSL 0684 i LDB: Ldbo998(mvaD) ] LBU: LBUL, 0905 LBR: LVIS 0859 - LCA: LSEI 1492 LGA:LGAS 1034 7 LRE: Lreu 0914 PPE: PEPE 0926 EFA: EFO9SO03(mvaD) LME: LEUM 1386 —NFA:nfa22080 BBU: BBO686 BGA: BG0709 BAF: BAPKO 0730 GFO: GFO 3632 FPS: FPO310(mvaD) HAU: Haur 1612 HAL: VNGO593G(dmd) HMA: rrinAC1489(dmd) HWA: HQ 1525A(mvaD) —NPH: NP1580A(mvaD) PTO: PTO0478 PTO1356 SSO: SSO02989 e » 221/230 STO: STO0977 - SAI: Saci 1245(mvd) MSE: Msed 1576 Ú Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de isopentenil-difosfato Delta- isomerase (IDI) HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2) PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1) MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730) MMU: 319554(Idi1) RNO: 89784(Idi1l) GGA: 420459(IDI1) XLA: 49467 1(LOC494671) XTR: 496783(idi2) ” SPU: 586184(LOC586184) CEL: K06H7.9(idi-1) : ATH: AT3G02780(IPP2) OSA: 4338791 4343523 CME: CMBO062C SCE: YPL117C(IDI1) AGO: AGOS ADL268C PIC: PICST 68990(IDI1) CGR: CAGLOJO06952g SPO: SPBC106.15(idi1) ANI: ANO579.2 AFM:AFUA 6G11160 AOR: AO090023000500 CNE: CNA02550 UMA: UMO04838.1 ECU: ECUO2 0230 DDI:DDB 0191342(ipi) TET: TTHERM 00237280 TTHERM 00438860 TBR: Tb09.211.0700
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= AFW: Anae109 4082 MXA: MXAN 5021(fni) RPR: RP452
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LJO: LJ1208 - LAC: LBA1171 LSA: LSAO905(idi) Ú LSL: LSL 0682 LDB: Ldbo996(fni) LBU: LBUL 0903 LBR: LVIS 0861 LCA: LSEI 1493 LGA: LGAS 1036 LRE:Lreu 0912 EFA: EFO0901 OOE: OEOE 1103 STH: STH1674 - CBE: Cbei 3081 DRM: Dred 0474 | SWO: Swol 1341 MTA: Moth 1328 MTU: Rv1745c(idi) MTC: MT1787(idi) MBO:Mb1774c(idi) MBB: BCG 1784c(idi) MPA: MAP3079c MAV: MAV. 3894(fni) MSM: MSMEG 1057(fni) MSMEG 2337 (fni) MUL:MUL 0380(idi2) MVA: Mvan 1582 Mvan 2176 MGI: Mfly 1842 Mflv 4187 MMC: Mmes 1954 MKM: Mkms 2000 MJL:Mjls 1934 CGL: NCgl2223(cgl2305) CGB: cg2531(idi)
CEF: CE2207 . CDI: DIP1730(idi) NFA: nfa19790 nfa22100 ' RHA: RHA1 ro00239 SCO: SCO6750(SC5F2A.33c) SMA: SAV1663(idi) LXX: Dox23810(idi) CMI: CMM 2889(idiA) AAU: AAur 0321(idi) PAC: PPA2115 FRA: Francci3 4188 FRE: Franean1 5570 FAL: FRAAL6504(idi) ” KRA: Krad 3991 SEN: SACE 2627(idiB 2) SACE 5210(idi) í STP: Strop 4438 SAQ: Sare 4564 Sare 4928 RXY: Rxyl 0400 BBU: BBO684 BGA:BG0707 SYN: sI 1556 SYC: syc2161 c SYF: Synpcc7942 1933 CYA: CYA 2395(fni) CYB:CYB 2691(fni) TEL: til1403 ANA: all4591 AVA: Ava 2461 Ava BO346 TER: Tery 1589 SRU: SRU 1900(idi) CHU: CHU 0674(idi) GFO: GFO 2363(idi)
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— Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de isopreno sintase Nos. de Acesso Genbank AY341431
AY316691 - AVY279379 AJ457070 Ú AVY182241

Claims (2)

  1. » 1165
    REIVINDICAÇÕES e 1. Cultura de células capazes de produzir isopreno, caracteriza- da pelo fato de que as células estão na fase estacionária e em que a produ- ção de isopreno é maior que ou aproximadamente 2 vezes maior que a — quantidade de isopreno produzida durante a fase de crescimento no mesmo tempo período de tempo.
    2. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o isopreno é produzido na fase gasosa e (a) em que a fase gasosa compreende mais que ou aproxima- damente 9,5% de oxigênio (volume), e a concentração de isopreno na fase gasosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o limite de inflamabilidade superior ou (b) a concentração de isopreno na fase gasosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o limite de inflama- bilidade superior, e as células produzem mais do que aproximadamente 400 nmol/gwcm/h de isopreno.
    3. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que produzem mais que aproximadamente 400 nmol/gwan/h de isopreno, em que as células são cultivadas sob condições que separam a produção de isopreno do crescimento celular.
    4. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que tem uma produtividade volumétrica média de isopreno maior do que aproximadamente 0,1 mg/Lcao/h, em que as células são culti- vadas sob condições que separam a produção de isopreno do crescimento celular.
    5. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que convertem mais do que aproximadamente 0,002 molar por cento de carbono que as células consumem em um meio de cultura celu- lar em isopreno, em que as células são cultivadas sob condições que sepa- rama produção de isopreno do crescimento celular.
    6. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que as células são cultivadas sob condições de glicose
    » 2/5 limitada.
    7 7. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a quantidade de isopreno produzida durante a fase estacionária é maior que ou aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, oumaisvezes a quantidade de isopreno produzida durante a fase de cres- cimento no mesmo período de tempo.
    8. Cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo isopreno sintase.
    9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, e compreendendo mais do que ou aproximadamente 99,94% por peso de isopreno em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição, ou (b) mais do que ou aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg de iso- preno produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, ou (c) mais do que ou aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) a partir da fração orgânica volátil das cé- lulascomo definida na reivindicação 1, ou (d) mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, e compreendendo menos do que ou aproximadamente 0,5 ug/L por composto para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno.
    10. Composição de acordo com a reivindicação 9(d), caracteri- zada pelo fato de que a composição que inibe a polimerização de isopreno compreende menos do que ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de um ou mais hidrocarbonetos C5 selecionados a partir do grupo consistindo em: 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2- pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis- piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino e cis-pent-3-eno-1-ino
    " 3/5 por peso comparado ao peso total de todos os hidrocarbonetos CS na com- ' posição, ou em que a composição que inibe a polimerização de isopreno tem menos do que ou aproximadamente 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005,0,001,0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001% de 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2- metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno- 1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino por peso em compara- ção ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
    11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, e tendo mais do que ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98 ou 100% de isopreno por peso em compa- ração ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição, em que, opcionalmente, o isopreno é recuperado de uma porção de efluente gasoso.
    12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende mais do que aproximadamente 2 mg de isopreno produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, e compreendendo um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo em etanol, acetona, prenil álcoois C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono, ou compreendendo mais do que aproximadamente 2 mg de isopre- no produzidos pelas células como definida na reivindicação 1, e compreen- dendo um ou mais dos segundos compostos selecionados a partir do grupo consistindo de 2-heptanona, 6-metil-S-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3, 5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1- propanol, diacetila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil- 1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3- metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, ace- tato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-but-1-enila, acetato de 3-metil-2- but-1-enila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (2)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno e 2,3-ciclo-heptenolpiridina; em que a quantidade do segundo composto em
    . 4/5 relação à quantidade do isopreno é maior do que ou aproximadamente de : 0,01% (p/p).
    13. Composição compreendendo (i) uma fase gasosa compree- endendo isopreno e (ii) células em cultura como definida em qualquer uma dasreivindicações1a8.
    14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- da pelo fato de que a composição compreende um sistema fechado, e a fase gasosa compreende mais do que ou aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ug/L de isopreno quando normalizada para 1 mL de uma ODsoo 1 cultivada por 1 hora.
    15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- da pelo fato de que a composição compreende um sistema aberto, e a fase gasosa compreende mais do que ou aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ug/L de isopreno quando difundida em uma taxa de 1wm.
    16. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- da pelo fato de que a composição compreende uma fração orgânica volátil da fase gasosa compreendendo mais do que ou aproximadamente 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno por peso em comparação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil.
    17. Método de produção de isopreno, o método caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultura de células como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, sob condições de cultura adequadas para a produção de isopreno; em que a quantidade de isopreno produzida durante a fase esta- cionária é maior do que ou aproximadamente 2 vezes maior que a quantida- de de isopreno produzida durante a fase de crescimento no mesmo período de tempo, e (b) produção de isopreno, em que, opcionalmente, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada, ou em que, opcionalmente, o isopreno é recuperado de uma porção de efluente gasoso da cultura celu- lar.
    . 55
    18. Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende uma ' concentração não inflamável de isopreno em fase gasosa em que (a) a fase gasosa compreende menos do que aproximadamente 9,5% de oxigênio (volume) ou (b) a fase gasosa compreende mais do que ou aproximadamen- te 9,5% de oxigênio (volume), e a concentração de isopreno na fase gasosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o limite de inflamabilidade superior.
    19. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe- lofatode que a porção da fase gasosa além de isopreno compreende entre aproximadamente 10% a aproximadamente 100% de oxi- gênio (volume), ou entre aproximadamente 0% a aproximadamente 99% de nitro- gênio (volume), entre aproximadamente 1% a aproximadamente 50% de CO, (volume).
    20. Método de produção de isopreno, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultura de células sob condições de cultura adequadas para a produção de isopreno, em que a fase gasosa compreende mais do que ou aproximadamente 9,5% de oxigênio (volume), e (b) produção de isopreno, em que a concentração de isopreno na fase gasosa é menor do que o limite de inflamabilidade inferior ou maior do que o limite de inflamabilidade superior, e em que as células produzem —maisdo que aproximadamente 400 nmol/gwcn/h de isopreno.
    21. Método de produção de isopreno, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultura de células sob condições de cultura adequadas para a produção de isopreno, em que a fase gasosa compreende menos do que ouaproximadamente 9,5% de oxigênio (volume), e (b) produção de isopreno, em que as células produzem mais do que aproximadamente 400 nmol/gwcn/h de isopreno.
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    - Fig 4 E T7 terminator Bam HI (320) ba o Peti (330) Parí66ss) —ao A KudzulS ot pETNHisKudzu Po . e, FA Node 1(2025) A histao Á Tv Eua
    TINT2 Fig 5A o 1 ttcetoatgtttgacagettatcategataagetttaatgeggtagtttatcacagttaaattgo taacgcagtcaggcacegtgtatgaaatetaacaatgcgeteategteatecteggeacegtea ccectaggatgctgtaggcataggcttaggttatgcoggtactgcegagectettacgggatatoecg gatatagttcctectttcagcaaaaaaceccetoraagaccegtttagaggececaaggggttato ctagttattgctcageggtageageagecaacteagettectttegagetttattagcagecga atccectgcagttagacatacatcagectggttaategggaaagggteaatoageagecagtttgat geggttttcagtegegtagtetaggegacecagaccategecatactagtaggtgcagtgggaa acacgtgccatgttaactgegatttecatgaacgetttaggcageagggtggagtegetaacge gttcacgattcatctttttccatteggegtegateagtttacgcagttettegegggectatte ctegetagtaccategttttegtgcatgtagctaatgatagaattggtagtctegoecacgtteo agctecegecegeagaggtggecagategttacacaggeggaagataacgcagetagaacgcaccoca gaccatggaagteggtcagggaacgcagegegtggteggagatatettectactactageatac ggaaaagtaagacggegecagcagegetacaceggaggaggaaacgetggegttttoecaggtac ttggagaaagccgggataattttgttgttagaccatttegectettgcagaaaggetttacaca gttcacgccagettttegteagataggacaggttgttatgaccetttcetetttcagaatagaata ggacgtgtcgttaacggtgttgtacagtgccaggaaacacagtttcatatagtceggcagggtg ttaatagcgttaacgtcecagegetetacageateggtgaacagttgcagttegtecagagtge ” cataaacgtcatacacgtcatcgatgatcegtcaccagaccaaacattttagtaacagetttgeg acattcaccaaactgcgggtctagegecatacecagtgcecagaaataaacttecatcaggegg tegegtacaaaatecagtttgctagecaggeccateteggtecaccagegggacagatettgca > getetttetggrgcagggtetgataccatgttaaaatecagettegecagetecageageagetg gtgatacggttettteggttegtatttatecaggaaccaacgtgectecagacggtgcagacge tggtgatatggcagttecagggegtageteacttagttetacaacoettagtattaatgccttett tcaggttgttettcaggtaggtgatggaaaaggtacgegectectecageaggtteteacecte gaaacccaggtaagacgcttcatacaggetcageaggecttggacgtceacetttcagttoaceg ctgaaaccaccttctttatccttgaaacgetcaaaaacatcetgagaaacctegaaacegtaget gacgcagcagacggaaagacagageggttgegtgcaggteagatttgttotttttattttoegto cagcagtacgatgttttccagggetttaatgatgtetttttcaaatttgtaggtcagacecagg cgetgcacategtegateagetecageagggacageggetaggtgtctacacggttgateatgo agegaacttettectecagtttagtogetttetectecagettttoecactttcaggtegttete cagggattgcaggaattcgaaattccacaggtttggetgatagtttgoggaacgacgagaatta tgcteggtaatetagagtaaattgagaagaggtegcacacatatgacgaccttegatatggecege tgctgtgatgatgatgatgatgatgatgatgatggeccatggtatatctecttettaaagttaa acaaaattatttctagaggggaattgttatcegeteacaattecectatagtgagtegtattaa tttcgegggategagatetegatcetetacgecggacgeategtggecggeateaceggegeca caggtgeggttgactggegectatategeegacatcracegatggggaagategggetegecactt cgggetceatgagegettgttteggegtaggtatggtageaggececgtagecggagggactgtta ggegecatetecttgcatgcaccattecttgeggeggeggtgceteaacagecteaacetactac tgggctgettectaatgcaggagtegcataagggagagegtegagateceggacaccoategaat ggcgcaaaacetttegeggtatggcatgatagegeceggaagagagtcaattcagggtagtgaa tgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgcegatatetettateagacegttteo cgcgtggtgaaccaggecagecacgtttetgegaaaacgegggaaaaagtggaageggegatag cggagctgaattacattcccaacegegtggeacaacaactggegggeaaacagtegttgetgat tagegttgccacetecagtetggecoetgcacgegecgtegeaaattategeggegattaaatet
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    Fig 7B cgttaaggtttcatttagegectcaaatagatcetgttcaggaaceggateaaagagttecteo gcegetggacetaccaaggeaacgetatagttoetettacttttatcagcaagatagecagatcaa tgtegategtggetggetogaagatacetgcaagaatgtcattgegetgecattetecaaatto cagttcgegettagetggataacgccacggaatgatgtegtegtgcacaacaatogtgacttet acagcgeggagaatctegetetetecaggggaagecgaagtttecaaaaggtegttgateaaag ctegcegegttgttteateaagecttacggtcacegtaaccageaaateaatatcactgtatgg cttcaggeegecatcecactgcggagecgtacaaatgtacggecageaacgteggttegagatgg egetegatgacgecaactacetotgatagttgagtegatactteggegateacegettecetea tgatgtttaactttgttttagggegactagccetagctgegtaacategttgetactecataacat caaacatecgacccacggegtaacgegettgetgettagatgecegaggeatagactgtaceeca aaaaaacagtcataacaagccatgaaaacegecactgegeegttaccacegetgegtteggtea aggttctggaccagttgegtgagegeatacgetacttgcattacagcettacgaaccgaacagge 1 ttatgtccactgggttegtgcctteateegtttocacggtatacgteaceeggcaacettggge agcagcgaagtegaggcatttetgtoctagetagegaacgagegeaaggttteggtetecacge atcgtcaggcattggeggocttgotgattettetacggeaaggtactatgcacggatetgeceta gettcaggagatcggaagaccteggecategeggegettgceggtagtgctgaccceggatgaa Fl gtggttegcatecteggttttctagaaggegageategtttgttegecoagettetgtatggaa egggcatgeggatcagtgagggtttgcaactgegagtcaaggatetggatttegatcacggeac gatcatcgtgegggagggeaagggetecaaggategggecttgatgttaccogagagettagea ccecagectgegegageaggggaattaatteccacgagttttgctacoogcaaacaggctattet ggtgttgctagtttgttatcagaategcagateeggetteageeggtttgceggetgaaagege tatttcttccagaattgccatgattttttecocacgggaggegtcactagetecegtattgteg gcagcetttgattegataageageategectgtttcaggetatetatgtatgactgttgagetat aacaagttgtctcaggtgttcaatttcatagttotagttgotttattttactagtttcacetatt ctattaggtgttacatgctgttcatetgttacattgtegatetgttcatagtgaacagetttga atgcaccaaaaactcgtaaaagetetgatgtatetatettttttacaccattttcatctatgca tatggacagttttccctttgatatgtaacggtgaacagttgttcotacttttgtttattagtett gatgcttcactgatagatacaagagccataagaacctcagatcetteegtatttagecagtatg ttctetagtgtggttegttgtttttgogtgagcecatgagaacgaaccattgagatcatacttac tttgcatgtcactcaaaaattttgcotcaaaactoggtgagctgaatttttacagttaaageate gtgtagtgtttttcttagtcegttatataggtaggaatctgatgataatggttgattgagtatttta tcaccattcatttttatetagttattoteaagtteggattacgagatecatttgtetatetagtt caacttggaaaatcaacgtatcagtegggeggectegettateaaccaccaattteatattagot gtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaacccattggttaageottttaaactcatag ' tagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggctaatctctatatttgcottat gagttttcttttgtgttagttcttttaa taaccactcataaatcctcatagagtatttottttc aaaagacttaaca tgttccagattatattttatgaatttttttaactggaaaagataaggcaat atctettcactaaaaactaattctaatttttegoettgagaacttagoatagtttgtecactaga aaatctcaaagectttaaccaaaggattcectgatttoecacagttetegteateagetetetagt tgctttagctaatacaccataageattttocctactgatgttcateatetgagegtattagtta taagtgaacgatacegtcegttetttocttgtagggttttcaategtagagttgagtagtgcca cacagcataaaattagcttggtttcatgctocgttaagtcatagegactaategetagtteatt tgctttgaaaacaactaattcagacatacatctcaattggtctaggtgattttaatcactatac caattgagatgggctagtcaatgataattactagtcettttectttgagttgtaggtatctagta
    Fig 7C Aattctgctagacctttagctagaaaacttgtaaattctgctagaccctetgtaaattecegetag acctttgtgtgttttttttgtttatattcaagtggttataatttatagaataaagaaagaataa aaaaagataaaaagaatagatcccageccctgtgtataactcactactttagtcagtteegeagt attacaaaaggatgtegeaaacgetgtttgctectetacaaaacagacettaaaaccctaaagg cttaagtagcaccctegeaagetegggeaaategetgaatattecttttatetecgaccateag gcacctgagtegetgtetttttogtgacattcagttegetgegeteacggetetageagtgaat gggggtaaatggcactacaggegecttttatggattcatgcaaggaaactacccataatacaag aaaagecegteacgggetteteagggegttttatggeggagtetactatgtagtgctatetgact ttttgctgttcagcagttectgecetetgattttcecagtetgaceactteggattatecegtga caggtcattcagactggctaatgcacccagtaaggcageggtatceateaacaggetta
    (SEQ ID NO:7)
    Fig 8A hospedeiro de E. coli 25 20
    A E P 15 2 ? A nn 3 ' e 10 . H : ã 5 É 5º 2 PA o E o i o 4 8 - tempo (h) f —e ls ---—-OD600
    Fig 8B E coli pCL-lac-Kudzu 20 je 2o / 15 2 Fr. " 3 : 2 E Sº Bd $ i 2 1 o o o 4 8 i tempo (h) r - —e- ls -- O0D600 .
    Fig 8 | E. coli prro-Kudzu
    2. 20 ; | ss | | 10 eo o - & 5 | E ; | o E o : ! tempo (h) + —e- ls o OD600
    Fig &8D ' E coli pET N-His Kudzu 20 2 2] 7º tio 2 15 " 8 :
    2. Gs 10 Ss 2 10 / 8 os A 6 o o o 4 8 - tempo (h)
    Fig 9 É '
    A 280 : 240 200 o 160 O 120 80 40 o o 10 20 30 f 40 tempo (h) B. 3 45 8 40 8 35 = 30 E 25 8 20 += e mia ongs oo rs eme: é BB LL DIDO ÁOILLIDOO 8 10 AO A es e 2 o À : E o 10 20 30 40 tempo (h) Í :
    Fig 10A Pantoea 20 " 20 15 3 15 s 10 8 2 10 o : ê 3 5 5 À o o o 4 8 tempo (h) : —e |s « —s— OD600
    Fig 10B . Pantoea pCL-lac-Kudzu 25 20
    = 15 315 W 8 ê 10 8 ss é . o aid sito o 4 8 tempo (h) ' * |s —m—0D600
    Fig 10C Pantoea pTrc-Kudzu 20 E: 1 : 2 8 = ns FR e 8 . 3. Fr 5 h o EX o o 4 8 a tempo (h) J —— —s- OD600 .
    Fig n"
    14 TE E ECN IATE RIAT : e Mo
    | EAST A EEECAEES TS ETIAA LISA ANS E 9 DO TEA ca ass aaa NA ENA E Ca RANÇA Ea] sp ETaE ? 4 [ERAS ETR Ato [ES :
    BG3594comK CF43 cepa de Bacillus
    Fig 12A "o : gaattgctecattttettetgctateaaaataacagactegtgattttccaaacgagetttcaa aaaagectetgceccttgcaaateggatgectatetataaaattccegatattggttaaacage ggcgcaatggeggecacatetgatgatetttgcttagegaatattoatettatttoettcctecot Ctcaataattttttcattcetatcecettttotataaagtttatttttcagaatacttttatcatc atgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagecacacgcaggteatttga acgaattttttegacaggaatttgcegggactcaggageatttaacctaaaaaageatgacatt tcagcataatgaacatttactcatgtctattttegttettttctgtatgaaaatagttattteg agtctctacggaaatagegagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaato ggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtct actctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgtgtacgacctettetcoaatttacteaga ttaccgagcataattccegtegtteegeaaactatcagecaaacetgtggaatttogaattect gcaatccctggagaacgacctgaaagtggaaaagetggaggagaaagegaccaaactagaggaa | gaagttegetgcatgateaacegtgtagacacecagecgetgtecetgetggagetgategacg atgtgcagegectaggtetgaccetacaaatttgaaaaagacatcattaaagccetagaaaacat cgtactgctggacgaaaacaaaaagaacaaatctgacctgcacgcaacegetetgtetttecat ctgctgegtcageacagtttegaggttteteaggatgtttttgagegtttcaaggataaagaag - gtggtttcageggtgaactgaaaggtgacgtccaaggcctgctgagectatatgaagegtetta cetgggtttegagggtgagaacetgctagaggaggegegtacettttecatcacecacetgaag aacaacctgaaagaaggcattaataccaaggttgcagaacaagtgagecacgecetggaactgo e catatcaccagegtctgcacegtetggaggeacgttggttectagataaatacgaaccgaaaga accegecateaccagetgetgetagagetagegaagetagattttaacatggtacagaccctgcac cagaaagagctgcaagatctgtceegetagtagacegagatgggectggetagcaaactagatt ttgtacgegacegectgatggaagtttatttetaggcactgggtatagegecagaccegeagtt tggtgaatgtegcaaagetgttactaaaatgtttggtetagtaacgatcategatgacgtatat gacgtttatggcactctggacgaactgcaactgttcacegatgctgtagagegetgggacgtta acgctattaacaccetgceggactatatgaaactgtgtttcctggcactatacaacacegttaa cgacacgtcctattctattctgaaagagaaaggtcataacaacetgtectatetgacgaaaage tggegtgaactatgcaaagectttcetgcaagaggegaaataggtecaacaacaaaattatccega ctttetecaagtacetggaaaacgecagegtttectecteeggtgtagegetgctggegecgte ttacttttcegtatgccagcagcaggaagacatetecgaceacgegetgegttecetgacegac ttccatggtetagtgegttetagetgegttatetteogectgtgcaacgatetagecaceteto cggcggagetagaacgtggegagactaccaattetatcattagetacatgcacgaaaacgatogg taccagegaggaacaggecegegaagaactgcgtaaactgatcegacgcegaatggaaaaagatgo aatcgtgaacgcgttagegactccaccetgctgcctaaagegttcatggaaategcagttaaca tggcacgtgtttoccactgcacetaccagtatggegataggtetgggtegeccoagactacgegac tgaaaaccgcatcaaactgctgctgattgacectttecegattaaccagetgatgtatgtctaa aaaaaaccggecttggeceogoogattttttattatttttettectecogoatgtteaatecget ccataatcgacggatageteccotetgaaaattttaacgagaaacggegaggttgaceceggeteag tecegtaacggecaagtectgaaacgtetcaategeegetteceggtttecggtcageteaata cegtaacggteggeggegttttectgatacegagagacggcattegtaateggatectetagag tegacctgcaggcatgcaagetttgectegegegttteggtaatgacggtgaaaacetetgaca catgcagctcecggagacagtcacagettgtetataageggatgcegggagcagacaagecegt cagggcgegtcagegggtattggegggtategaggegeagecatgaccecagteacgtagegata
    Fig 12B gcggagtgtatactggettaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatato cggtgtgáaatacegcacagatgegtaaggagaaaatacegcatceaggegetetteegettect Ccgeteactgactegetgegeteggtegtteggetrtgeggegageggtatcagetcacteaaagge ggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggecag caaaaggccaggaacegtaaaaaggecgegttgctggegtttttecataggeteegecececta acgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggegaaacecgacaggactataaagata ccaggegtttececeetggaagetecetegtgegetetectgttecegacectacegettacegga tacctgtcegectttetecettegaggaagegtagegettteteaatgeteacgetataggtate teagtteggtgtaggtegttegetecaagetgggetgtatgcacgaacececegtteagecega cegetgegecttatecggtaactategtettgagtccaaceeggtaagacacgacttategeca ctggcagcagccactggtaacaggattagcagagegaggtatataggoggtgctacagagttect tgaagtggtggcctaactacggetacactagaaggacagtatttggtatctgegetetgetgaa geccagttacctteggaaaaagagttggtagetettgatccggcaaacaaaceacegetggtage ggtggtttttttgttigcaagcagcagattacgegcagaaaaaaaggatctcaagaagatectt tgatcttttetacggagtetgacgeteagtggaacgaaaactcacgttaagggattttagtcat gagattatcaaaaaggatcgaagtcggttcagaaaaagaaggatatggatctggagoetgtaata taaaaaccttcttcaactaacggggcagattagtgacattagaaaaccgactgtaaaaagtaca - gteggeattatcteatattataaaagecagtcattaggectatcetgacaattcctgaatagagt tcataaacaatcctgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatagcggtaa atatattgaattacctttattaatgaattttcctgctgtaataatagggtagaaggtáattacta - ttattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccatggaataatagaaagagaaaaag cattttcaggtataggtgttttgggaaacaatttaaaagaaccattatatttctotacatcaga aaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaataccagagaatagtt ttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctetaacttatcccaataacetaacteteegt cgctattgtaaccagttctaaaagetgtatttgagtttatcacccettatcactaagaaaataaa tgcagggtaaaatttatatecttettgttttatgtttoggtataaaacactaatatcaatttoct gtggttatactaaaagtegtttgttagttcaaataatgattaaatatoetottttetettocaat tgtctaaatcaattttattaaagttcatttgatatgcctectaaatttttatctaaagtgaatt taggaggettacttgtetagctttettcattagaatcaatecttttttaaagtcaatattactot aacataaatatatattttaaaaatatcecactttatccaattttegtttgttgaactaatoggt getttagttgaagaataaagaccacattaaaaaatogtaggtettttatatttttttaaaggattt gagcegtacgegaaaaatecttttetttotttcttatoettgataataagggtaactattgcoggt tgtccattcatggetgaactetgcttectetgttgacatgacacacatcatctceaatateegaa tagggcccatcagtcetgacgaccaagagagecataaacaccaatagecttaacatcoatececat atttatccaatattcgttccttaatttcatgaacaatetteattetttottetetagteattat tattggtccattcactattcteattecettttcagataattttagatttgcttttotaaataag aatatttggagagcacegttettatteagetattaataactegtettectaageatecttoaat cecttttaataacaattatagcatctaatcttcaacaaactggccegtttgttgaactactettt aataaaataatttttcegtteccaattccacattgcaataatagaaaatccatettceategget ttttegteateatetgtatgaatcaaategecttettetatgteateaaggtttaattttttat gtatttcttttaacaaaccaccataggagattaaccttttacggtataaaccttcctecaaato agacaaacgtttcaaattcttttcttcatcateggteataaaateegtatectttacaggatat tttgcagtttegtcaattgcegattgtatatceegatttatatttattttteggtegaatceattt gaacttttacatttggatcatagtctaatttcattgectttttocaaaattgaatocattgttt
    Fig 120 ttgattcacgtagttttctgttattcetaaaataagttogttecacacataccattacatgcato tgctgattataagaattatctttattatttattgtcacatcegttgcacgcataaaaccaacaa gatttrttattaatttttttatattgcatcatteggegaaatecttgagecatatcetgateaaact cttatttaattcttegoecaterataaacatttttaactgttaatgtgagaaacaaccaacgaact gttggettttgatttaataacttcagcaacaacettttgtgactgaatgccatatttcattgete tcetecagttgcacattggacaaagectagatttgcaaaaccacactegataccactttettte gecetgtttcacgattttatttatactoetaatatttcagcacaatettttactotttcagecttt ttaaattcaagaatatgcagaagttcaaagtaatcaacattagegattttcttttoetotocatg gtetcacttttecactttttgtottgtecactaaaacecttgatttttcatetgaataaatgct actattaggacacataatattaaaagaaacccecatctatttagttatttaotttagtcacttat aactttaacagatggggtttttctgtgcaaccaattttaagggttttcaatactttaaaacaca tacataccaacacttcaacgcacctttcagcaactaaaataaaaatgacgttatttctatatat atcaagataagaaagaacaagttcaaaaccatcaaaaaaagacaccttttcaggtagcttttttt attttataaactcattcectgatotegacttegttetttttttaceteteggttatgagttagt tcaaattegttetttttaggttetaaategtgtttttottgagaattgtagctattttatocttta ccttgtctacaaacccettaaaaacgtttttaaaggettttaageegtetgtacgttecttaag
    - (SEQ ID NO:57)
    Fig 13
    ATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTACTCAGATTACCGAGCATAATTCTCGACGATCTGCTAACT
    ACCAGCCGAACCTTTGGAACTTTGAGTTTCTCCAGTCTCTCGAAAATGACCTGAAGGTGGAAAA
    GCTCGAGGAGAAGGCGACCAAACTCGAGGAGGAGGTGCGATGTATGATCAACAGAGTTGACACC
    CAACCCCTGTCTTTGCTGGAGCTGATCGACGATGTGCAGCGGTTGGGTTTGACTTATAAATTCG
    AGAAGGACATTATCAAGGCACTGGAGAACATTGTGCTCCTCGACGAGAACAAGAAGAACAAGTC
    TGATCTTCACGCTACCGCTCTCTCTTTCCGACTTCTTCGACAACACGGCTTCGAGGTGTCGCAG
    GACGTCTTCGAGAGATTTAAGGACAAGGAGGGAGGATTTAGCGGCGAGCTGAAGGGAGACGTTC
    AGGGTCTTCTCTCCTTGTACGAGGCGTCCTACCTGGGATTCGAGGGAGAGAACCTCCTGGAGEA
    AGCTCGTACATTTTCCATCACTCACCTTAAGAATAACCTTAAGGAGGGAATTAACACCAAGGTG
    GCCGAGCAGGTTTCTCACGCCCTGGAGCTCCCCTACCACCAACGGCTCCATAGACTGGAGGCTC
    GTTGGTTCCTGGACAMATATGAGCCAAAGGAGCCTCATCATCAGTTGCTGTTGGAGTTGGCCAA
    GCTGGACTTCAATATGGTTCAGACGCTGCACCAAAAGGAGTTGCAGGACCTGTCTCGATGGTEG
    ACCGAGATGGGATTGGCCTCGAAGCTGGATTTTGTCCGTGACCGACTTATGGAGGTCTATTTTT GGGCCCTTGGAATGGCGCCTGACCCCCAGTTCGGAGAGTGCCGGAAGGCGGTGACGAAGATGTT '
    CGESTCTTGTGACTATCATCGACGACGTCTACGATGTCTACGGCACACTCGACGAGTTGCAGCTG
    TTCACTGACGCCGTCGAGCGATGGGATGTGAACGCCATTAATACTCTCCCTGACTATATGAAGC
    TGTGCTTCCTGGCTCTGTACAACACTGTCAACGATACCTCGTACTCTATCCTCAAGGAGAAGGG " ACACAACAATCTCTCCTACTTGACCAAATCCTGGCGAGAACTGTGCAAGGCTTTTCTGCAGGAG
    GCTAAATGGTCCAARTAACAAGATCATTCCTGCTTTTTCTAAMATACCTGGAAAATGCCTCGGTGT
    CGAGCTCTGGCETCGCCCTTCTGECCCCOTTCCTACTTCTCCGTCTGCCAGCAGCAGGAGGATAT
    Í TTCCGATCATGCTCTTAGATCGCTGACCGATTTTCACGGCCTCGTGCGATCTTCCTGCGTGATT
    TTTCGGTTGTGTAATGACCTTGCGACCTCTGCTGCTGAGCTGGAACGAGGCGAGACTACAAATT
    CCATTATTTCTTACATGCACGAAAACGATGGAACATCTGAAGAACAGGCTAGAGAGGAACTGCG
    AAAGTTGATCGACGCCGAGTGGAAGAAGATGAACAGAGAGCGGGTGTCCGACTCTACCCTGCTT
    CCCAAGGCCTTCATGGAGATCGCCGTGAACATGGCTCGAGTTTCCCATTGTACTTACCAGTACG
    GTGACGGCCTGEGTCGTCCGGACTACGCTACAGAGAACCGAATCAAGCTGCTGCTCATCGACCC
    CTTCCCTATCAACCAATTGATGTACGTGTAA (SEQ ID NO:8)
    Fig 14 o f N Promoter 2 A ; É Kudzu 1S pTrex3g À : 109546 bo É Y É Kudzo 18 gen: amdS marker O terminator
    Fig 15A : 21 TCGACCGGTG AGAAGAACAG CATCGGGACA AGGGAAGGAA GAACAAAGAC AAAGAAAACA 61 AMAGAAAGCA ATTGAARACA ARACAAAACA ATTTTICATTC CTTCTCTTAT CATTCCTTTT 121 CTTTTCTTTT CTCTCATTCA ACGCACTCCA TCGTATCCGT ATTCCTCTTA TTTTTTCTCT 181 TTCTCTATAT CCATTTCTTT CTCTCTAGGT GTGTCCTCTC TCTCTCTTCA ATTTCTCTAC 243 TCCGCATTCC AACGCATCCT TCCCCCAACC TCCCATTTCC TCCTTACGGC CCGATAGCGA 301 TCGTCTTTCC CTCGCTATCA CTCGCTACCG GCCCCTCCTC TGCACCGTAA CCTCCTACGT 361 ATTTACCATA TCATAAAGTT TTTTCCGACG CTTATCGCTG ACCCCCTGTC GCCCTCCTAT 421 TGGCTTCCGG ATTATCTTCT TGTCCATAAG GTGATCCATG CTTCCTGAAG ATTCCCGAARA 481 TGTGTCCACT TTGGCGGGGA ATCATTCCAT CCACTTCTTT CTCTCTCGCT TTCCTCATTC 541 GGCGCTCCCC TTCCGCGTCT CATTGGTCTT CCGCTCCGTT TTTGCTTTGC CGATGTTACT 601 TGGGGAGAGG TGCGATAATC CTTTCGCAAMA AACTCGGTTT GACGCCTCCC ATGGTATAAA 661 TAGTGGGTGG TGGACAGGTG CCTTCGCTTT TCTTTAAGCA AGAGAATCCC ATTGTCTTGA 721 CTATCACGAA TTCACATACA TTATGAAGAT CACCGCTGTC ATTGCCCTTT TATTCTCACT 781 TGCTGCTGCC TCACCTATTC CAGTTGCCGA TCCTGGTGTG GTTTCAGTTA GCAAGTCATA 841 TGCTGATTTC CTTCGTGTTT ACCAAAGTTG GAACACTTTT GCTAATCCTG ATAGACCCAA 901 CCTTAAGAAG AGAAMATGATA CACCTGCAAG TGGATATCAA GTTGAMAAAG TCGTAATTTT 961 GTCACGTCAC GGTGTTAGGG CCCCTACARA AATGACTCAA ACCATGCGTG ATGTCACTCC 1021 TAATACATGG CCAGAATGGC CCGTTAAATT AGGATATATT ACACCAAGAG GTGAACACTT-: ' 12081 GATATCACTT ATGGGCGGTT TTTACCGTCA AMMATTCCAG CAACAAGGAA TCCTTTCTCA 1141 GGGCTCCTGT CCTACTCCTA ACTCCATATA TGTCTGGGCT GACGTCGATC AGCGTACTTT 1201 AAAAACTGGT GAAGCATTCC TTGCTGGTTT GGCACCACAA TGTGGCTTGA CAATTCATCA 1261 CCAACAAAAT CTTGAGAMAG CTGATCCTCT TTTTCATCCC GTTAAAGCTG GAACCTGCTC 1321 TATGGATAMA ACTCAAGTTC AACAAGCTGT TGAGAAGGAG GCACAAACTC CTATAGATAA -- 1381 TTTGAATCAA CATTACATCC CCTTTTTAGC TTTAATGAAT ACAACATTAA ATTTTAGTAC 1441 TTCTGCCTGG TGCCAAAAAC ACTCTGCTGA TAAATCCTGT GACCTAGGTT TATCCATGCC 1501 TTCTAAATTG TCCATAAAAG ATAATGGTAA CAAGGTCGCA TTGGATGGAG CTATTGGTCT 1561 ATCCTCTACT TTGGCCGAGA TTTTTCTTCT TGAATATGCT CAAGGCATGC CTCAAGCTGC - 1621 TTGGGGTAAC ATCCACTCAG AGCAAGAGTG GGCTTCCTTG CTAAAGTTGC ATAATGTTCA 1691 ATTCGATTTG ATGGCCCGAA CACCTTATAT TGCTCGACAT AACGGTACTC CTTTATTGCA 1741 AGCTATATCA AATGCCCTTA ATCCCAACGC CACTGAATCA AAACTTCCAG ATATTTCACC 1801 TGATAACARA ATATTGTTCA TTGCAGGTCA TGACACAAMAT ATTGCTAATA TAGCCGGCAT 1861 GTTAAATATG CGTTGGACAT TACCAGGTCA ACCAGATAAT ACTCCTCCAG GTGGTGCCCT 1921 AGTATTTGAA CGTCTTGCTG ATAAAAGTGG AAAACAATAT GTTTCTGTAT CTATGGTTTA 1981 TCAAACACTA GAACAACTTC GATCACAGAC TCCCCTTTCT CTARATCAGC CTGCCGGATC 2041 TGTTCAACTT ARAATTCCAG GTTGCAATGA TCARACAGCC GAGGGTTACT GTCCTCTTTC 2101 CACTTTTACA AGAGTTGTTT CCCAATCTGT TGAACCTGGA TGCCAACTTC AATAATGAGG 2161 ATCCAAGTAA GGGAATGAGA ATGTGATCCA CTTTTAATTC CTAATGAATA CATGCCTATA 2221 GTTCTTTTCT TTTGTTCTTT ATGTCGTTTT TCGATGGTAC GGCCGTTGTC AATCTCAGTT 2281 TGTGTGCTTG GTTGCAGCTT GGTTTCAAAT CTGTTCATCT CATGAATCTT TTACCATTTC 2341 ACCACACGTT TATACCATTC TCTCATAGAA TCTTCATCAA ACCATCTCGG GGTTAGAGTG 2401 GAAAGAAAGT CTTGTTCTTT TATTTCCTTT TTTCCATCTT CAMGGCTTTT CTTTTCTTCC 2461 TCCTCCTCGT TCATCTTGAG GTTTGACGTG TCTGTTTAGA ATTTTGAGCT GTTGCAGCAT 2521 CTTATTTTTT GTTTTGCGAA AACGAAGCGC TTTACTCTCT TCATCAGTTG GACGATTGTA 2581 CCTTTGAAAA CCAACTACTT TTGCATGTTT TGTATAGAAMA TCAATGATAT TAGAATCCCA 2641 TCCTTTAATT TCTTTCAAAG TAGTTGAGCT ATAGTTAAGT GTAAGGGCCC TACTGCGAAA 27021 GCATTTGCCA AGGATGTTTT CATTAATCAA GAACGAAAGT TAGGGGATCG AAGACGATCA 2761 GATACCGTCG TAGTCTTAAC CATAMACTAT GCCGACTAGG GATCGGGCAA TGTTTCATTT 282] ATCGACTTGC TCGGCACCTT ACGAGAAATC AAAGTCTTTG GGTTCCGGGG GGAGTATEGT 2881 CGCAAGGCTG AAACTTAAAG GAATTGACGG AAGGGCACCA CAATGGAGTG GAGCCTGCGG 2941 CTTAATTTGA CTCAACACGG GGAAACTCAC CAGGTCCAGA CATAGTAAGG ATTGACAGAT 3001 TGAGAGCTCT TTCTTGATTC TATGGGTGGT GGTGCATGGC CEGTTCTTAGT TGGTGGAGTG 3061 ATTTGTCTGC TTAATTGCGA TAACGAACGA GACCTTAACC TGCTAAATAG CTGGATCAGC 3121 CATTTTGGCT GATCATTAGC TTCTTAGAGG GACTATTGGC ATAARAGCCAA TGGAAGTTTG 3181 AGGCAATAAC AGGTCTGTGA TGCCCTTAGA TGTTCTGGGC CGCACGCGCG CTACACTGAC 3241 GGAGCCAACG AGTTGAARAA AATCTTTTGA TTTTTTATCC TTGGCCGGAA GGTCTGGGTA 3301 ATCTTGTTAA ACTCCGTCGT GCTGGGGATA GAGCATTGCA ATTATTGCGG CCGCTCCTCA 3361 ATTCGATGTT GCAGATTTTA CAAGTTTTTA AMATGTATTT CATTATTACT TTTTATATGC 3421 CTAATAAAAA AGCCATAGTT TAATCTATAG ATAACTTTTT TTCCAGTGCA CTAACGGACG
    Fig 15B 3481 TTACATTCCC ATACAAAACT GCGTAGTTAA AGCTAAGGAA AAGTTAATAT CATGTTAATT 3541 AMATACGCTA TTTACAATAA GACATTGAAC TCATTTATAT CGTTGAATAT GAATAACCAA 3601 TTTCAGCGAA TTTTTAACAA ACATCGTTCA CCTCGTTTAA GGATATCTTG TGTATGGGGT 3661 GTTGACTTGC TTTATCGAAT AATTACCGTA CCTGTAATTG GCTTGCTGGA TATAGCGGTA 3721 GTCTAATATC TAGCAMAAAT CTTTTGGGTG AAAAGGCTTG CAATTTCACG ACACCGAACT 3781 ATTTGTCATT TTTTAATAAG GAAGTTTTCC ATAMATTCCT GTAATTCTCG GTTGATCTAA 3841 TTGAAAAGAG TAGTTTTGCA TCACGATGAG GAGGGCTTTT GTAGAAAGAA ATACGAACGA 3901 AACGAAMATC AGCGTTGCCA TCGCTTTGGA CAMAGCTCCC TTACCTGAAG AGTCGAATTT 3961 TATTGATGAA CTTATAACTT CCAAGCATGC AAACCAAAAG GGAGAACAAG TAATCCAAGT 4021 AGACACGGGA ATTGGATTCT TGGATCACAT GTATCATGCA CTGGCTAAMAC ATGCAGGCTG 4081 GAGCTTACGA CTTTACTCAA GAGGTGATTT AATCATCGAT GATCATCACA CTGCAGAAGÇA 4141 TACTGCTATT GCACTTGGTA TTGCATTCAA GCAGGCTATG GGTAACTTTG CCGGCGTTAA 4201 AAGATTTGGA CATGCTTATT GTCCACTTGA CGAAGCTCTT TCTAGAAGCG TAGTTGACTT 4261 GTCGGGACGG CCCTATGCTG TTATCGATTT GGGATTAAMAG CGTGAMAAGG TTGGGGAATT 4321 GTCCTGTGAA ATGATCCCTC ACTTACTATA TTCCTTTTCG GTAGCAGCTG GAATTACTIT e" 4381 GCATGTTACC TGCTTATATG GTAGTAATGA CCATCATCGT GCTGAAAGCG CTTTTAAATC 4441 TCTGGCTGTT GCCATGCGCG CGGCTACTAG TCTTACTGGA AGTTCTGAAG TCCCAAGCAC 4501 GAAGGGAGTG TTGTAARAGAT GAATTGGATT ATGTCAGGAA AAGAACGACA ATTTTGCATC 4561 CARATTGTCT AAMATTTTAGA GTTGCTTGAA AACAATAGAA CCTTACTTGC TTTATAATTA É 4621 CGTTAATTAG AAGCGTTATC TCGTGAAGGA ATATAGTACG TAGCCGTATA AATTGAATTG 4681 AATGTTCAGC TTATAGAATA GAGACACTTT GCTGTTCAAT GCGTCGTCAC TTACCATACT 4741 CACTTTATTA TACGACTTTA AGTATAAACT CCGCGGTTAT GGTAMAATTA ATGATGCACA 4801 AACGTCCGAT TCCATATGGG TACACTACAA TTAAMATACTT TTAAGCTGAT CCCCCACACA 4861 CCATAGCTTC AAAATGTTTC TACTCCTTTT TTACTCTTCC AGATTTTCTC GGACTCCGCG mM 4921 CATCGCCGTA CCACTTCAMA ACACCCAAGC ACAGCATACT AMATTTTCCC TCTTTCTTCC 4981 TCTAGGGTGT CGTTAATTAC CCGTACTAMA GGTTTGGAAA AGAAMAMAAGA GACCGCCTCG 5041 TTTCTITTTC TTCGTCGAAA AAGGCAATAA AAATTTTTAT CACGTTTCTT TTTCTTGAAA R S101 TTTTTTTTTT TAGTTITTIT CTCTTICAGT GACCTCCATT GATATTTAAG TTAATAAACG á 5161 GTCTTCAATT TCTCAAGTTT CAGTTTCATT TTTCTTGTTC TATTACAACT TTTTTTACTIT 5221 CTTGTTCATT AGAAAGAAAG CATAGCAATC TAATCTAAGG GCGGTGTTGA CAATTAATCA 5281 TCGGCATAGT ATATCGGCAT AGTATAATAC GACAAGGTGA GGAACTAMAC CATGGCCAAG S341 TTGACCAGTG CCGTTCCGGT GCTCACCGCG CGCGACGTCG CCGGAGCGGT CGAGTTCTGG 5401 ACCGACCGGC TCGGGTTCTC CCGGGACTTC GTGGAGGACG ACTTCGCCGG TGTGGTCCEG S461 GACGACGTGA CCCTGTTCAT CAGCGCGGTC CAGGACCAGG TGGTGCCGGA CAACACCCTG 5521 GCCTGGETGT GEGTGCGCGG CCTGGACGAG CTGTACGCCG AGTGGTCGGA GGTCGTEGTCC 5581 ACGAACTTCC GGGACGCCTC CGGECCGGCC ATGACCGAGA TCGGCGAGCA GCCETGEGEG 5641 CGGGAGTTCG CCCTGCGCGA CCCGECCEGC AACTGCGTGC ACTTCGTGGC CGAGGAGCAG 5701 GACTGACACG TCCGACGGCG GCCCACGGGT CCCAGGCCTC GGAGATCCGT CCCCCTTTTC 5761 CTTTGTCGAT ATCATGTAAT TAGTTATGTC ACGCTTACAT TCACGCCCTC CCCCCACATC 5821 CGCTCTAACC GAMAAGGAAG GAGTTAGACA ACCTGAAGTC TAGGTCCCTA TTTATTTTTT 5881 TATAGTTATG TTAGTATTAA GAACGTTATT TATATTTCAA ATTTTTCTTT TTTTTCTGTA 5941 CAGACGCGAG CTTCCCAGTA AATGTGCCAT CTCGTAGGCA GAAAACGGTT CCCCCGTAGG 6001 GTCTCTCTCT TGGCCTCCTT TCTAGGTCGG GCTGATTGCT CTTGAAGCTC TCTAGGGGGG 6061 CTCACACCAT AGGCAGATAA CGTTCCCCAC CGGCTCGCCT CGTAAGCGCA CAAGGACTGC 6121 TCCCAMAGAT CCTAGGCGGG ATTTTGCCGA TTTCGGCCTA AAGGAACCGG AACACGTAGA 6181 AAGCCAGTCC GCAGAAMACGG TGCTGACCCC GGATGAATGT CAGCTACTGG GCTATCTGGA 6241 CABGGGAAAA CGCAAGCGCA AAGAGAAMAGC AGGTAGCTTG CAGTGGGCTT ACATGGCGAT 6301 AGCTAGACTG GGCGGTTTTA TGGACAGCAA GCGAACCGGA ATTGCCAGCT GGGGCGCCCT 6361 CTGGTAAGGT TGGGAAGCCC TGCAAAGTAA ACTGGATGGC TTTCTTGCCG CCAAGGATCT 6421 GATGGCGCAG GGGATCAAGA TCTGATCAAG AGACAGGATG AGGATCGTTT CGCATGATTG 6481 AACAAGATGG ATTGCACGCA GGTTCTCCGG CCGCTTGEGT GGAGAGGCTA TTCGGCTATG 6541 ACTGGGCACA ACAGACAATC GGCTGCTCTG ATGCCGCCGT GTTCCGGCTG TCAGCGCAGE 6601 GGCGCCCGGT TCTTTTTGTC AAGACCGACC TGTCCGGTGC CCTGAATGAA CTGCAGGACG 6661 AGGCAGCGCG GCTATCGTGG CTGGCCACGA CGGGCETTCC TTGCGCAGCT GTGCTCGACG 6721 TTGTCACTGA AGCGGGAAGG GACTGGCTGC TATTGGGCGA AGTGCCGGGG CAGGATCTCC 6781 TGTCATCTCG CCTTGCTCCT GCCGAGAMAG TATCCATCAT GGCTGATGCA ATGCGGCGGC 6841 TGCATACGCT TGATCCGGCT ACCTGCCCAT TCGACCACCA AGCGAMACAT CGCATCGAGC 6901 GAGCACGTAC TCGGATGGAA GCCGGTCTTG TCGATCAGGA TGATCTGGAC GAAGAGCATC 6961 AGGGGCTCGC GCCAGCCGAA CTGTTCGCCA GGCTCAAGGC GCGCATGCCC GACGGCGAGG
    Fig 15C 7021 ATCTCGTCGT GATCCATGGC GATGCCTGCT TGCCGAATAT CATGGTGGAA AATGGCCGCT 7081 TTTCTGGATT CAACGACTGT GGCCGGCTGG GTGTGGCGGA CCGCTATCAG GACATAGCGT 7141 TGGATACCCG TGATATTGCT GAAGAGCTTG GCGGCGAATG GGCTGACCGC TTCCTCGTGC 7201 TTTACGGTAT CGCCGCTCCC GATTCGCAGC GCATCGCCTT CTATCGCCTT CTTGACGAGT 7261 TCTTCTGAAT TGAAAAMAGGT ACCAAGTTTA CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT 7321 TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT 7381 CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC 7441 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAMACAARAARA AACCACCGCT 7501 ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT CTTTTTCCGA AGGTAACTGG 7561 CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAMBATACTGT CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA 7621 CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC 7681 TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA 7741 TAAGGCGÇAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC 7801 GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA GARAGCGCCA CGCTTCCCGA 7861 AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG 7921 GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG 7981 ACTTGAGCGT CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG 8041 CARCGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA TGTTCTTTCC 8101 TGCGTTATCC CCTÊATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC TTTGAGTGAG CTGATACCGC 8161 TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA G . (SEQID NO:11)
    Fig 16
    1 GAATTCAAAA CAAAATGTGT GCAACCTCCT CCCAGTTTAC TCAGATTACC GAGCATAATT 61 CTCGACGATC TGCTAACTAC CAGCCGAACC TTTGGAACTT TGAGTTTCTC CAGTCTCTCG 121 AAAATGACCT GAAGGTGGAA AAGCTCGAGG AGAAGGCGAC CAAACTCGAG GAGGAGGTGC 181 GATGTATGAT CAACAGAGTT GACACCCAAC CCCTGTCTTT GCTGGAGCTG ATCGACGATG 241 TGCAGCGGTT GGGTTTGACT TATAAATTCG AGAAGGACAT TATCAAGGCA CTGGAGAACA 301 TTGTGCTCCT CGACGAGAAC AAGAAGAACA AGTCTGATCT TCACGCTACC GCTCTCTCTT 361 TCCGACTTCT TCGACAACAC GGCTTCGAGG TGTCGCAGGA CGTCTTCGAG AGATTTAAGG 421 ACAAGGAGGG AGGATTTAGC GGCGAGCTGA AGGGAGACGT TCAGGGTCTT CTCTCCTTGT 481 ACGAGGCGTC CTACCTGGGA TTCGAGGGAG AGAACCTCCT GGAGGAAGCT CGTACATTIT 541 CCATCACTCA CCTTAAGAAT AACCTTAAGG AGGGAATTAA CACCAAGGTG GCCGAGCAGG 6021 TTTCTCACGC CCTGGAGCTC CCCTACCACC AACGGCTCCA TAGACTGGAG GCTCGTTGGT 661 TCCTGGACAA ATATGAGCCA AAGGAGCCTC ATCATCAGTT GCTGTTGGAG TTGGCCAAGC 721 TGGACTTCAA TATGGTTCAG ACGCTGCACC AAAAGGAGTT GCAGGACCTG TCTCGATGGT 781 GGACCGAGAT GGGATTGGCC TCGAAGCTGG ATTTTGTCCG TGACCGACTT ATGGAGGTCT 841 ATTTTTGGGC CCTTGGAATG GCGCCTGACC CCCAGTTCGG AGAGTGCCGG AAGGCEGTEA 901 CGAAGATGTT CGGTCTTGTG ACTATCATCG ACGACGTCTA CGATGTCTAC GGCACACTCG 961 ACGAGTTGCA GCTGTTCACT GACGCCGTCG AGCGATGGGA TGTGAACGCC ATTAATACTC 1021 TCCCTGACTA TATGAAGCTG TGCTTCCTGG CTCTGTACAA CACTGTCAAC GATACCTCGT 1081 ACTCTATCCT CAAGGAGAAG GGACACAACÇA ATCTCTCCTA CTTGACCAAA TCCTGGCGAG 12141 HACTGTGCAA GGCTTTTCTG CAGGAGGCTA AATGGTCCAA TAACAAGATC ATTCCTGCTT 1201 TTTCTAAATA CCTGGAAAAT GCCTCGGTGT CGAGCTCTGG CGTCGCCCTT CTGGCCCCTT 1261 CCTACTTCTC CGTCTGCCAG CAGCAGGAGG ATATTTCCGA TCATGCTCTT AGATCGCTGA 1321 CCGATTTTCA CGGCCTCGTG CGATCTTCCT GCGTGATTTT TCGGTTGTGT AATGACCTTG - 1381 CGACCTCTGC TGCTGAGCTG GAACGAGGCG AGACTACAAA TTCCATTATT TCTTACATGC 1441 ACGAMAACGA TGGAACATCT GAAGAACAGG CTAGAGAGGA ACTGCGAAAG TTGATCGACG 1501 CCGAGTGGAA GAAGATGAAC AGAGAGCGGG TGTCCGACTC TACCCTGCTT CCCAAGGCCT 1561 TCATGGAGAT CGCCGTGAAC ATGGCTCGAG TTTCCCATTG TACTTACCAG TACGGTGACG ç 1621 GCCTGEGTCG TCCGGACTAC GCTACAGAGA ACCGAATCAA GCTGCTGCTC ATCGACCCCT
    1681 TCCCTATCAA CCAATTGATG TACGTGTAAT AGTCTAGAGG ATCC
    (SEQTID NO:12)
    Fig 17 1 GAATTCAACA AAAATGTGCT CTGTTTCCAC TGAGAACGTG TCCTTTACTG AGACTGAGAC 61 TGAAGCACGT AGAAGCGCCA ACTACGAACC CAACTCCTGG GATTATGACT TTCTGCTGTC 121 TTCTGACACC GACGAGTCGA TCGAGGTTTA TAAGGATAAG GCCAAGAAAC TTGAGGCCGA 181 GGTCAGACGA GAGATTAACA ACGAGAAGGC CGAGTTCCTG ACCCTTCTTG AGCTGATCGA 241 CAACGTTCAA CGACTTGGTC TTGGTTACCG TTTCGAATCC GATATCCGAC GTGCATTGGA 301 TCGATTTGTC TCGTCCGGAG GTTTCGATGG TGTGACTAAG ACGTCGCTGC ACGCCACAGC 361 TCTTTCCTTC AGACTGTTGC GGCAGCATGG ATTTGAGGTT TCCCAGGAAG CCTTITTCTGG 421 TTTCAAGGAT CAGAACGGAA ACTTTTIGGA GAATCTCAAG GAGGACACCA AGGCCATCCT 481 GTCGTTGTAT GAGGCCTCGT TCCTGGCTCT TGAGGGCGAG AATATTCTGG ATGAGGCTCGE 541 GGTTTTCGCT ATTTCGCACC TGAAGGAGTT GTCGGAGGAA AAGATCGGAA AGGAMACTGGC 601 CGAGCAGGTC AACCATGCAC TTGAACTTCC CCTGCATCGA CGTACCCAGC GACTGGAGGC 661 CGTGTGGAGC ATCGAGGCGT ACAGAAAMAA GGAGGATGCT AATCAGGTTC TGCTCGAACT 721 CGCTATCCTC GACTATAACA TGATTCAGAG CGTGTACCAG CGTGACTTGC GAGAGACAAG 781 CCGGTGGTGG CGACGGGTGG GACTGGCCAC GAAGCTCCAC TTTGCTAAAG ATCGATTGAT 841 TGAGTCGTTC TACTGGGCAG TGGGTGTGGC CTTTGAGCCT CAGTACTCCG ACTGCCGAAA 901 CTCCGTTGCA AAGATGTTTT CTTTTGTCAC TATCATCGAC GACATCTACG ATGTTTACGG 961 CACTCTCGAT GAACTCGAAC TCTTCACGGA CGCTGTCGAG CGATGGGATG TGAATGCCAT 1021 TAATGATCTG CCAGATTATA TGAAGTTGTG TTTCTTGGCG CTCTACAACA CAATTAATGA 1081 AATTGCCTAC GACAACCTCA AGGACAAGGG AGAGAACATT CTGCCCTACC TTACTAMAGC ' 1141 CTGGGCCGAC CTGTGTAACG CCTTTTTGCA GGAAGCCAAG TGGCTCTATA ACAMATCTAC 1201 TCCTACATTT GATGACTACT TCGGCAACGC TTGGAAGTCT TCCAGCGGCC CTCTCCAGTT 1261 GATCTTCGCT TACTTTGCAG TGGTCCAGAA CATCAAGAAA GAGGAGATTG AGAACCTCCA 1321 GAAGTATCAC GACATCATCT CCCGACCTTC GCACATCTTT CGACTGTGCA ATGACCTTGC ! 1381 CTCCGCATCC GCTGAGATTG CCCGAGGAGA AACAGCCAAT TCTGTGTCGT GTTACATGCG ' 1441 TACAMAGGGC ATCTCCGAGG AGCTGGCTAC CGAGTCTGTG ATGAACCTGA TCGATGAAAC 1501 CTGTAAGANG ATGAACAAAG AGAAACTGGG CGGTTCTCTG TTCGCCAAMAC CATTTGTTGA 1561 AACCGCGATC AATCTGGCTC GTCAGTCTCA TTGTACTTAC CATAACGGTG ACGCGCACAC r 1621 TTCGCCGGAC GAATTGACCC GTAAGCGTGT GCTTTCGGTG ATTACCGAGC CGATCCTGCC 1681 GTTCGAAAGA TAATAGGATC C (SEQTID NO:13)
    Fig 18A
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    . Fig 22B - gagtcaattcagggtagtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtegcagagtatgceggtr gtectettatcagacegtttecegegtagtgaacraggecagecacgtttctgogaaaacgeggg aaaaagtggaageggegatggeggagetgaattacatteccaacegegtggeacaacaactgge gggcaaacagtegttagctgattggegttgccacetecagtetggecetgcacgegecegtegeaa attgtcgeggegattaaatetegegecgateaactaggtgccagegtggtgagtategatggtag aacgaageggegtegaagectgtaaageggeggtgcacaatettetegegeaacgegteagtgg gectgatcattaactatcegetggatgaccaggatgecattactgtagaagetgcctgcactaat gttceggegttatttettgatgtetetgaceagacacecateaacagtattattttetoccata aagacggtacgegactgggegtgagagcatctggtegeattaggteaccagcaaategegetgtt agecgggeecattaagttetgteteggegegtetgegtetggetaggetggeataaatateteact cgcaatcaaattcagcegatageggaacgggaaggegactagagtgecatgtecggttttcaac aaaccatgcaaatgctgaatgagggcategtteccactagegatgetagttgccaacgatcagat ggegetgggegeaatgoegegecattacegagtecgggetgegegtrtagtgeggatatetegata gtgggatacgacgataccgaagacagetcatgttatatecegeegteaaceaceateaaacaga attttcgcctgctgagggcaaaccagegtggacegettgctgcaacteteteagggecaggeggt gaagggcaatcagetgttgecegteteactagtgaaaagaaaaaccaccctagegecraataca caaacegectetececgegegttagecgatteattaatgcagetggcacgacaggtttecegac 2 tggaaagcgggcagtgagegcaacgeaattaatgtgagttagegegaattgatetagtttogaca gecttatcategactgcacggtgcaccaatgcttcetagegteaggeagecateggaagetatagt atggctgtgcaggtegtaaatcactgcataattegtgtegeteaaggegeactecegttetaga z taatgttttttgegeogacatcrataacggttcetggcaaatattctgaaatgagctgttgacaat taatcatceggetegtataatgtgatggaattatgageggataacaatttcacacaggaaacage gccegetgagaaaaagegaageggeactgctetttaacaatttatcagacaatetgtgtaggcac tecgaceggaattatogattaactttattattaazaaattaaagaggtatatattaatgtatcgat taaataaggaggaataaaccatgtgtgcgacctcttceteaatttactceagattaccgageataa ttccogtegttecegeaaactatcagecaaacetgtggaatttegaattcoctgoaatecetagag aacgacctgaaagtggaaaagcetggaggagaaagegaccaaactaggaggaagaagttegetgea tgatcaaccegtgtagacaccceagecgetgtecetactagagetgategacgatatacagegect gggtctgacctacaaatttgaaaaagacatcattaaagccctggaaaacatcocgtactgctggac gaaaacaaaaagaacaaatctgacctgcacgcaacegetetgtetttecegtetactgegteage acggtttcegaggtttceteaggatgtttttgagegtttcaaggataaagaaggtagtttcagegg tgaactgaaaggtgacgtccaaggectgctgagectgtatgaagegtettaccetgggtttogag ggtgagaacctgctggaggaggegegtaccettttecateacecacetgaagaacaacetgaaag aaggcattaataccaaggttgcagaacaagtgagecacgecetggaactgccatateaceageg tetgcacegtetggaggcacgttagttcctggataaatacgaaccgaaagaacegcateaceag ctgctgctgagagetggegaagetagattttaacatggtacagacccetgcaccagaaagagetgo aagatctgtccegetagtggacegagatgggectggetagcaaactaggattttgtacgegaceg cectgatggaagtttatttctgggcactgggtatggegecagaceegcagtttagtgaatgatege aaagctgttactaaaatgtttggtcetggtgacgateategatgacgtgtatgacgtttatagca ctctggacgaactgcaactgttcacegatgetgtagagegetgggacgttaacgctattaacac cectgceggactatatgaaactgtgtttcctageactagtacaacacegttaacgacacgtectat tctattctgaaagagaaaggtcoataacaaccetgtecetatetgacgaaaagetggegtgaactat gcaaagecctttcetgcaagaggegaaatggtcecaacaacaaaattateceggctttetecaagta cetggaaaacgecagegtttectecteeggtatagegetgetagegecegtettacttttocgta
    - Fig 220 tgccagcageaggaagacatctcegaceacgegetgegttecetgacegacttecatagtetag tgegttetagetgegttatetteegectgtgcaacgatcetagecacctetgeggeggagetgga acgtggcgagactaccaattctatcattagetacatgcacgaaaacgatagtaccagegaggaa caggccegegaagaactacgtaaactgatcegacgcegaatagaaaaagatgaategtgaacacg ttagegactecacectgctgcctaaagegtteatggaaategeagttaacataggeacatattto ccactgcacctaccagtatggegatagtetgaggtogeccagactacgegactgaaaacegeate aaactgctgetgattgaccoetttccegattaacceagetgatatatgtetaactgcategecett aggaggtaaaaaaaaatgactgcegacaacaatagtatgececatagtgcagtatetagttacy ccaaattagtgcaaaaccaaacacctgaagacattttggaagagtttcctgaaattattccatt acaacaaagacctaataccegatctagtgagacgteaaatgacgaaageggagaaacatatttt tcetaggtcatgatgaggagcaaattaagttaatgaatgaaaattgtattgttttggattgaggacg ataatgctattggtgccagtaccaagaaagtttgtcatttaatagaaaatattgaaaagggttt actacategtgcatteteegtetttattttcaatgaacaaggtgaattacttttacaacaaaga 7 gccactgaaaaaataactttecetgatetttggactaacacatgctgeteteatecactatgta ttgatgacgaattaggtttgaagggtaagctagacgataagattaagggegetattactagcgge ggtgagaaaactagatcatgaattaggtattccagaagatgaaactaagacaaggggtaagttt cactttttaaacagaatccattacatggcaccaagcaatgaaccatggggtgaacatgaaattg .- attacatcctattttataagatcaacgctaaagaaaacttgactgtcaacccaaacgtcaatga agttagagacttcaaatgggtttcaccaaatgatttgaaaactatgtttgctgacccaagttac aagtttacgccttagtttaagattatttgoegagaattacttattcaactggtgggagcaattag 7? atgacctttctgaagtggaaaatgacaggcaaattcatagaatgctataacaacgegtectaca ttegecettaggaggtaaaaaaacatgagttttgatattgccaaataccegacectggeactag tegactecacecaggagttacgactgttgocgaaagagagtttacegaaactetgegacgaact gegeegetatttactegacagegtgagecgttecagegggeacttegectecaggetgggcaca gtegaactgacegtggegetgcactatgtctacaacaccecegtttgaccaattgatttagaato tggggcatcaggcttatcegcataaaattttgaceggacgcegegacaaaateggcaceateeg tcagaaaggeggtetgcaceegttecegtagegeggegaaagegaatatgacgtattaagegte gggcattcatcaacctecateagtgecggaattggtattgeggttgctgcogaaaaagaaggca aaaategcegeacegtetgtgteattagegatggegegattacegcaggcataggegtttgaage gatgaatcacgegggegatatcoegtectgatatgctggtgattctcaacgacaatgaaatateg atttcegaaaatgteggegegeteaacaaceatetggeacagetgetttoeoggtaagetttact cttcactgcgegaaggegggaaaaaagttttetetagegtgeoagecaattaaagagetgctcaa acgcaccgaagaacatattaaaggcatagtagtgcctggcacattatttgaagagetgggottt aactacatcggcceggtagacagteacgatgtgctagggettatcaccacgetaaagaacatge gegacctgaaaggecegcagttectgcatatcatgaccaaaaaaggtegtagttatgaacegge agaaaaagacccgatcactttccacgeegtgcctaaatttgatecetoecagegattatttaceg aaaagtageggeggtttgcoegagetattcaaaaatetttggogactagttgtgcegaaacggecag cgaaagacaacaagctgatggegattacteeggegatgegtgaaggttecggeatggtegagtt ttcacgtaaattcccggategetacttegacgtageaattgcogageaacacgeggtgacettt getgegggtetagegattgagtgggtacaaacccattgtegegatttactecactttectagcaao gegectatgatcaggtgctgcatgacgtggegattcaaaagetteeggtectattegecatega cegegegggeattgattagtgctagacagteaaacccatceagggtgcttttgatetetettacetoa ecgctgcataceggaaatggtcattatgacccegagegatgaaaacgaatgtegecagatgetet ataccggctatcactataacgatggecegtcageggtgegetaceegegtggeaacgeggtogg
    " Fig 22D cgtggaactgacgcegetagaaaaactaccaattggcaaaggcattgtgaagegtegtagegag aaactggcgatccttaactttggtacgctgatgccagaagegacgaaagtegecgaategetga . acgccacgetggtegatatgegttttatgaaacegcettgatgaagegttaattetggaaatage cgeccagecatgaagegetagteacegtagaagaaaacgecattatgggeggegeaggeagegge gtgaacgaagtgctgatggcecategtaaaccagtaccegtgetgaacattdggcetgceggact tetttattcogcaaggaactcaggaagaaatgegegecgaacteggectegatgeegetagtat ggaagccaaaatcaaggectagetggcataactagca (SEQ ID NO:20)
    : Fig 23A pTreKudzu kan
    5.00 25 si || Ao g
    4.00 e isopreno de headspace específico (uglfL*OD)) 23?
    FB
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    2.00 15 Ê 8 ss 8 28 o vs É EE E a o fº 33 "EEE ão
    A
    0.00 o = o 1 2 3 4 . 5 6 horas após a indução
    . .“. 47/172 : Fig 23B PpTreKudzu y1D) kan
    5.00 25 Ú || —e— OD6oo asas 400 Er isopreno de hesdspace específico (uglil*OD)) 20 5 || —e-isopreno de headspace total, (ugn ao 1" 200 12 8 FE ê LR é : :
    É
    2.00 > osê . 23 sz
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    | Fig 23C PTreKudzu DXS kan .
    6.00 o e OD800 oa ATA EnsasaNaNE
    5.00 | B-isopreno de headspace total (ug/L) = - ê
    FB ” aê
    HD sã = sm & 8 zº 103 S 200 E Es e ea drês z | nb ás
    0.00 aaa o = o 1 2 3 4 5 6 ' horas após a indução V
    : Fig 23D PTreKudzu yIDI DXS kan so 25
    4.00 R -B3-isopreno de headspace específico (vg/(L*OD)) E sê ; 3 —O- isopreno de headspace total (ug/ ). AN er | ô : :
    LA o AN são [X ? o 7 o 1 2 3 4 5 6 horas após a indução
    - Fig 23E pCt PtreKudzu
    5.00 25 || —e—OD600 aNsAas 400 Er isopreno de headspace especifico(ug/(L*OD)) 25 8 ! | 300 sê 3 8 32 â Es > 8 ' 200 E ser o u 100 | e - st : - 0.00 ? o 2 o 1 2 3 4 5 6 horas após a indução
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    FER iê
    1.00 Pr E y i : 100 Po o OO et] o 7 o 1 2 3 4 5 6 horas após a indução
    . .. 52/172 : Fig 23G POL PtreKudzu DXS 500 25 260 FL rassaremaa ima EAV n. É | 78 isopreno de headspace total (gl) Ea ã ê o Ud ê Í 8 7 â E o 8 200 e 3º .
    É Hs 3 E sê j TF 8 & o 00 - o 7 o 1 2 3 4 5 6 horas após a indução
    - Fig 23H RISOS ASIA Covo AaAEO o, o sô SI dE LEO co sTÊ eo ao E o] So FDS CAÇA * 52 LECCE ENO ENO e x E e A AA o CRB E Ea é O ESSAS TAB mo cs EA AN E ARARAS NO a. CARECA co] 8 8. DZ SA A ],8
    LÉTOOO LINE LEE RE RR BESSA RITO NANA 8 ” o Dio EE CRS, Lan acid, o 1.20 2.20 3.20 4.20 6.00 Tempo (após a indução) .
    n 4 54/172 : Fig 2 no peRSZ2 crign Í » Mot . Kerr ' Kanproma PiKat Tmtemiretor PTIOGDKS ken MWwoat lartasisoprene syrthase o
    ” É 55/172 : Fig 25A !
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    , 56/172 - Fig 25B tatacagaactegatcatgcaaattctagatttatggatggactatctaaactagategettac acgagactcatgacgattacagcgatcagatatttgagtctcettgagaggaatgactatacecto tcaaaagtatcctgaaatcacagaagttagagatgcagttgccacaattagacgttectttaga aaaataactaaagaatctggtgcegatategaacctecegtacaaactagettattggatgatt - gecagaccttaaaaggagttettacttgcttaatacetggtgctggtagttatgacgecattgo agtgattactaagcaagatgttgatcttagggotoaaacegetaatgacaaaagattttctaag gttcaatggctagatgtaactcaggetgactggggtattaggaaagaaaaagatccggaaactt 1 atcttgataaataacttaaggtagctgcatgcagaattegecettaaggaggaaaaaaaaatga r cegtttacacagceatecgttacegeaceegtraacategeaacecttaagtattgggggaaaag ggacacgaagttgaatctgcccaceaattegtecatatcagtgactttategcaagatgacete agaacgttgacctctgeggectactgcacctgagtttgaacgegacactttagtagttaaatggag F aaccacacagcatcgacaatgaaagaactcaaaattgtctgoegegacetacgccaattaagaaa ggaaatggaatcgaaggacgcctceattgeecacattateteaatggaaactecacattgtetee gaaaataactttcctacagcagctggtttagettecteegetgetaggetttgetgcattagtet ctgcaattgctaagttataccaattaccacagtcaacttcagaaatatctagaatagcaagaaa ggggtetagttcagettatagategttgtttggeggatacatggectgggaaatgggaaaaget gaagatggtcatgattccatggcagtacaaategcagacagetetgactggoctcagatgaaag ne cttgtgtccetagttgtcagegatattaaaaaggatgtgagttcecactcagggtatgcaattgac cgtggcaacctcegaactatttaaagaaagaattgaacatgtcgtaccaaagagatttgaagte atgcgtaaagecattgttgaaaaagatttegecacetttgcaaaggaaacaatgatggattecca - « actetttccatgccacatgtttagactetttecotocaatattetacatgaatgacacttccaa gegtatcatcagttggtgecacaccattaatcagttttacogagaaacaategttacatacacg tttgatgcaggtccaaatgctgtgttgtactacttagctgaaaatgagtoegaaactotttgcat ttatctataaattgtttggotetgttoctggatgggacaagaaatttactactgagcagettga ggctttcaaccatcaatttgaatcatctaactttactgcacgtgaattggatcttgagttgcaa aaggatgttgccagagtgattttaactcaagtcggttcaggcccacaagaaacaaacgaatoett tgattgacgcaaagactggtctaccaaaggaataagatcaattegetgeategecettaggagg taaaaaaaaatgactgcegacaacaatagtatgcccocatggtgcagtatctagttacgccaaat tagtgcaaaaccaaacacctgaagacattttggaagagtttcetgaaattattccattacaaca aagacctaataccegatctagtgagacgtcaaatgacgaaageggagaaacatgtttttetagt catgatgaggagcaaattaagttaatgaatgaaaattgtattgttttagattgaggacgataato ctattggtgceggtaccaagaaagtttgtcatttaatggaaaatattgaaaagggtttactaca tegtgcattcteegtetttattttcaatgaacaaggtgaattacttttacaacaaagagecact gaaaaaataactttccctgatcetttagactaacacatgctgctetoeatecactatgtattgato acgaattaggtttgaagggtaagetágacgataagattaagggegctattactgeggceggtgag aaaactagatcatgaattaggtattccagaagatgaaactaagacaaggggtaagtttcacttt ttaaacagaatccattacatggcaccaagcaatgaaccataggggtgaacatgaaattgattaca tectattttataagatcaacgctaaagaaaacttgactgtcaacccaaacgtcaatgaagttag agacttcaaatgggtttcaccaaatgatttgaaaactatgtttgctgacccaagttacaagttt acgcettaggtttaagattatttgcgagaattacttattcaactggtaggagcaattagatgace tttctgaagtggaaaatgacaggcaaattcatagaatgctataacaacgegtectgcattegec cttaggaggtaaaaaaacatotgtgcgacctettctoaatttacteagattacegageataatt ccegtegttecgcaaactatcagecaaacetgtagaatttegaattcctgcaatocetagagaa ecgacctgaaagtggaaaagctggaggagaaagegaccaaactaggaggaagaagttegetgacato
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    : Fig 270 caaagetegecgegttatttcateaagecttacggteacegtaaccageaaatceaatatcactog tgtggetteaggecgecatecactagceggagecgtacaaatgtacggecageaacgateggttega gatggegetegatgacgoecaactaccetctgatagttgagtegatactteggegateacegetto ccteatgatgtttaactttattttagggegactgecctactgegtaacategttactgetecat aacatcaaacatcgacccacggegtaacgegettgetgcttagatgaccegaggcatagactgta CCcccaaaaaaacagtcataacaagccatgaaaacegecactgegecgttaceacegetgegtte ggtcaaggttctggaccagttgegtgagegeatacgetacttgcattacagettacgaacegaa caggcttatgtecactgggttegtgectteatecegtttecacgagtgtgegteacecggeaacet tgggcagcagegaagtegaggeatttetgtoectagetggegaacgagegeaaggtttegateto cacgcategtcaggcattggeggecttgotgattettotacggcaaggtgetgtgcacggateto ccctggettcaggagateggaagaceteggecgtegeggegettgeeggtggtgctgacecegg atgaagtggttegeatecteggttttetagaaggegageategtttgttogeceagettetata . tggaacgggcatgcggatcagtgagggtttgcaactgcgggtoaaggatctagatttegateac ggcacgatcatcgtgegggagggcaagggêtccaaggategagecttgatgttaccegagaget tggcacccagectgegegageaggagaattaatteccacggattttactaceegeaaacagaot gttctaggtgttactagtttgttatcagaatcgcagatecggetteagecggtttgcoggctgaa agegetatttettecagaattgccatgattttttececacgggaggegteactggetecegtgt - tgteggeagetttgattegataageageategectatttcaggetatetatgtgtgactgttga gctgtaacaagttatcetceaggtatteaatttcatagttetagttactttgttttactagtttcac ctgttetattaggtgttacatgctattcatcetattacattgtegatetgtteatggtgaacage s tttgaatgcaccaaaaactcgtaaaagetetgatgtatetatcttttttacacegttttoatet gtgcatatggacagttttccetttgatatgtaacggtgaacagttgttctactrttatttatta gtcttgatgcttcactgatagatacaagagccataagaacctcagatecttecgtatttageca gtatgttctetagtgtggttegttgtttttgogtgagecatgagaacgaaccattgagatcata cttactttgcatgtcactcaaaaattttgcctoaaaactagtgagetgaatttttgcagttaaa gcategtgtagtgtttttettagtcegttatataggtaggaatctgatgataatggttgttagta ttttgtcaccattcatttttatctagttgttcotoaagtteggattacgagatcecatttatetato tagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcegggeggectegettateaaceaceaattteata ttgctataagtgtttaaatetttacttattggtttcaaaacccattaggttaagecttttaaact catggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggctaatctetatatttago cttgtgagttttcttttatgttagttcettttaataaccactcataaatcctcatagagtattto ttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaatttttttaactggaaaagataag gcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttegettgagaacttaggcatagtttgtecca ctggaaaatctcaaagcectttaaccaaaggattectgatttecacagttetegteateagetet ctggttgctttagctaatacaccataagcattttecetactgatgttcatcatetgagegtatt ggttataagtgaacgatacegteegttetttocttgatagggtttteaategtagggttgagtag tgccacacagcataaaattagettagtttcatactecgttaagteatagegactaategetagt tcecatttgctttgaaaacaactaattcagacatacatctcaattggtcetaggtgattttaatcac tataccaattgagatgggctagtcaatgataattactagtccettttoctttgagttoataggtat ctgtaaattctgctagacctttgctggaaaacttgtaaattctgctagacecctetgtaaattec gctagaccetttgtgtgttttttttatttatattcaagtggttataatttatagaataaagaaag aataaaaaaagataaaaagaatagatcccagcecetgtgtataacteactactttagteagtteco gcagtattacaaaaggatgtcegcaaacgetgtttgctectetacaaaacagaccettaaaaceect aaaggcttaagtagcaccetegeaagetegggeaaategetgaatattecttttatetecegace
    . Fig 27D Atcaggcacctgagtegetgtetttttegrtgacattcagttegetgegeteaceggetetggcag tgaatgggggtaaatggcactacaggegecttttatggattcatacaaggaaactacccataat acaagaaaagecegteacgggetteteagggegttttatagegagtetgctatatagtagctate tgactttttgotattcagcagttectgcccetetgattttecagtetgacoactteggattateco cgtgacaggtcattcagactggctaatgcacccagtaaggeageggtatcatcaacaggetta (SEQ ID NO:46)
    : Fig 28
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    Fig 290 sos tgtaacctttgctttcaaatgagtagaaataatgcacatccatgtttgtategtgcaaataaag tgtttcatcegtaggaaaaaatgactttagtatctgtteegetttttetgatgaaatgtgctec ccgacaaaattgaatgaatcatggacatttgctaggctttgatacagegaaageagecegttecta tgttatatateggatttaacagcaggacaaaaaacaccatgacagecategtceacecacttatt cacacgcacataaacctttcctgacttttggaacagatgatagctcatcaaaaatecegecatt gccaaataaategtatataggcattactgcaccataatcettttgagatttgattgggatatggeg caagcagcaagacaagcagtceegataatcagegtataaaataagectagtaagatcettatecgt tetecaatacagettgaaaaacactacattcaacgcaatgggaagagtgatgatgaaaaacaga aacacgaatgcaatceggetecateceateegggtattecttecaatacgaaaagaaactaaaaa tcatttgtacgateggcaaactgacaacagcaaggtegaacgtataaaacttaccettteeges atgatcacgeggcatcagcatatagtgaaaagcegtcagcagcacatatcegtataacaaaaaa E tgcagcageggeageagttetttteegtectetettaagtaagegetagtgaagtttgttgatt gcacctggtgaataagttcaacagacactêcegecageageacaatecgcaatataacaceege caagaacattgtgcgctgceggtttattttagggatgatgcaccaaaagatataagecegecaga acaacaattgaccattgaatcagcagggtgctttgtetgcttaatataaaataacgttcgaaat gcaatacataatgactgaataactccaacacgaacaacaactcecattttcettctgctatcaaaa - taacagactegtgattttccaaacgagetttcoaaaaaagectetgecocttgcaaateggatgo ctgtctataaaattccegatattggttaaacageggegeaatageggcegeatetgatatettt gcttggegaatgtteatettatttettectecoteteaataattttttcattetatecetttto ? tgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatcc attgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttegacaggaatttgceggga ctcaggagcatttaacctaaaaaageatgacatttcagcataatgaacatttactcatotctat tttogttcttttetatatgaaaatagttatttegagtctetacggaaatagegagagatgatat acctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattac aataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaa agagtgtcattacegttettaacttetgcacegggaaaggttattatttttggtgaacacteto ctgtgtacaacaagcctgcegtegetactagtgtatetgegttgagaacetacetagctaataag cgagtcatctgcaccagatactattgaattggacttcceggacattagetttaatcataagtog tccatcaatgatttcaatgccatcaccgaggatcaagtaaactcccaaaaattggccaaggete aacaagccacegatggcettatetcaggaactegttagtettttagatoecgttgttagctoaact atcegaatecttecactacecatgcagegttttgtttectatatatatttotttgcotatacece catgccaagaatattaagttttctttaaagtetactttacccateggtgetaggttaggcteaa gegectetatttetatatcactggecttagetatggectacttagaggggattaataggatctaa tgacttggaaaagctgtcagaaaacgataagcatatagtgaatcaataggcettcataggtgaa aagtgtattcacggtaccccttcaggaatagataacgetgtggecacttatggtaatgcectge tatttgaaaaagactcacataatggaacaataaacacaaacaattttaagttcttagatgattt ccecagecattecaatgatectaacctatactagaattccaaggtctacaaaagatettgttgot cgegttegtgtgttagtracegagaaatttectgaagttatgaagecaattctagatagccatag gtgaatgtgccctacaaggettagagatcatgactaagttaagtaaatgtaaaggcaccgatga cgaggctgtagaaactaataatgaactgtatgaacaactattggaattgataagaataaatcat « —ggactgcttgtcteaateggtgttteteatectagattagaacttattaaaaatctgagegato atttgagaattggctecacaaaacttaceggtactggtggcggeggttgetoctttgactttatr acgaagagacattactcaagagcaaattgacagcttcaaaaagaaattgcaagatgattttagt
    : Fig .29B : tacgagacatttgaaacagacttgggtgggactggetgctgtttattaagcegcaaaaaatttga ataaagatcttaaaatcaaatccctagtattccaattatttgaaaataaaactaccacaaagea acaaattgacgatctattattgccaggaaacacgaatttaccatggacttcataaaaggagagg gtgtcagagttgagagcettcagtgceccagggaaagegttactagetggtagatatttagttt tagatacaaaatatgaagcatttgtagtcggattateggcaagaatgcatgctatagcccateo ttacggttcattgcaagggtetgataagtttgaagtgcatatgaaaagtaaacaatttaaagat ggggagtggctgtaccatataagtectaaaagtggetteattectatttogataggeggateta agaaccctttcattgaaaaagttategetaacgtatttagctactttaaacctaacatggacga ctactgcaatagaaacttgttegttattgatattttetetgatgatgcctaccattcteaggag gatagcgttaccegaacatcogtggcaacagaagattgagttttcattegcacagaattgaagaag ttcccaaaacagggetgggetecteggcaggtttagteacagttttaactacagetttagecto ' cttttttgtateggacetggaaaataatgtagacaaatatagagaagttattcataatttagca caagttgctcattgtcaageteagggtaaaattggaagegggtttgatgtageggacgageageat * atggatctatcagatatagaagattcccacecgeattaatetetaatttgccagatattggaag tgctacttacggcagtaaactggcgcatttggttgatgaagaagactggaatattacgattaaa agtaaccatttaccttecgggattaactttatggatgggegatattaagaatggttcagaaacag taaaactggtccagaaggtaaaaaattggtatgattegcatatgcecagaaagettgaaaatata - tacagaactegatcatgcaaattctagatttatggatagactatctaaactagategettacac gagactcatgacgattacagegatcagatatttgagtctettgagaggaatgactataccetate BR aaaagtatcctgaaatcacagaagttagagatgcagttgccacaattagacgttcctttagaaa 7 aataactaaagaatctggtgcegatategaacetecegtacaaactagettattagatgattgo cagaccttaaaaggagttcttacttgcttaatacctaggtgctggtggttatgacgcecattgcag tgattactaagcaagatgttgatcttagggetcaaacegetaatgacaaaagattttctaaggt tcaatggctggatgtaactcaggetgactagagtgttaggaaagaaaaagatceggaaacttat cttgataaataaaaggagagggtgaccegtttacacagceatcegttacegeaceegteaacateg caaccecttaagtat tgggggaaaagggacacgaagttgaatctgceccaccaattegtecatate agtgactttatcgcaagatgacctcagaacgttgacctetgeggetactgcacctgagtttgaa cgegacactttgtggttaaatggagaaccacacagcatcgacaatgaaagaactcaaaattaoto tgegegaccetacgccaattaagaaaggaaatggaategaaggacgcectceattgcecacattateo tcaatggaaactccacattgtctccogaaaataactttectacageagetagtttagettectee getgetggetttgctgcattggtoetetgcaattgctaagttataccaattaccacagtcaactt cagaaatatctagaatagcaagaaaggggtctggttcagettatagategttatttageggata cgtggcctgggaaatgggaaaagetgaagatggtcatgattcecatageagtacaaategeagac agctctgactggectcagatgaaagettgtgtectagttgtcagegatattaaaaaggatgtga gttccactcagggtatgcaattgacegtggcaacetoegaactatttaaagaaagaattgaaca tgtcgtaccaaagagatttgaagtcatgcgtaaagecattgttgaaaaagatttegeceacettt gcaaaggaaacaatgatggattccaactetttecatgccacatatttaggactetttecetecaa tattctacatgaatgacacttccaagegtatcatcagttggtgecacaccattaatcagtttta cggagaaacaatcgttgcatacacgtttgatgcaggtccaaatagctgtgttgtactacttagoct gaaaatgagtcgaaactctttgcatttatcetataaattgtttggotetattoctagataggaca agaaatttactactgagcagcttgaggetttcaaccatcaatttgaatcatctaactttactgc acgtgaattggatcttgagttgcaaaaggatattgccagagtgattttaactcaagteggttea ggcccacaagaaacaaacgaatetttgattgacgcaaagactggtctaccaaaggaataaaago agagggtgactgcegacaacaatagtatgccccatggtgcagtatetagttacgccaaattagt
    . Fig 29 gcaaaaccaaacacctgaagacattttggaagagtttcctgaaattattccattacaacaaaga cectaataccegatcetagtgagacgtcaaatgacgaaageggagaaacatgtttttctggtcatg atgaggagcaaattaagttaatgaatgaaaattgtattgttttagattgggacgataatgctat tggtgcceggtaccaagaaagtttotcatttaatggaaaatattgaaaagggtttactacatoegt gcattetocgtetttatttteaatgaacaaggtgaattacttttacaacaaagagccactgaaa aaataactttccctgatcetttagactaacacatgctagcteteatecactatgtattgatgacga attaggtttgaagggtaagctagacgataagattaagggegetattactgoggeggtgagaaaa ctagatcatgaattaggtattccagaagatgaaactaagacaaggggtaagtttcactttttaa acagaatccattacatggcaccaagcaatgaaccatggggtgaacatgaaattgattacatooct attttataagatcaacgctaaagaaaacttgactatcaacccaaacgtcaatgaagttagagac ttcaaatgggtttcaccaaatgatttgaaaactatgtttgctgacccaagttacaagtttacge cttggtttaagattatttgogagaattacttattcaactggtgggagcaattagatgacctttc tgaagtggaaaatgacaggcaaattcatagaatgctataaaaaaaaccggecttggececageog gttttttatratttttettcetocgcatgtteaatecgetecataategacggatggetecete . tgaaaattttaacgagaaacggcegggttgacceggctcagtecegtaacggecaagtectgaaa ecgtcteaategecegetteceggtttceggtcageteaatgcegtaacggtegaceggegttttoeo tgataccgggagacggcattegtaatttgaatacatacgaacaaattaataaagtgaaaaaaat x acttceggaaacatttaaaaaataaccttattggtacttacatgtttggatcaggagttgagagt ggactaaaaccaaatagtgatcttgactttttagtcgtegtatetgaaccattgacagatcaaa gtaaagaaatacttatacaaaaaattagacctatttcaaaaaaaataggagataaaagcaactt
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    : Fig 31B ggcacgtcagagccactgcaccetaccacaatggtgacgcacatactagceceggatgaactgact cgtaaacgtgtactatctattateacegaacegattetgcegttegaacgttaactgcagegte aatcgaaagggegacacaaaatttattctaaatgcataataaatactgataacatcttatagtt tgtattatattttgtattatcgttgacatgtataattttgatatcaaaaactgattttoccttt attattttcgagatttattttcttaattctetttaacaaactagaaatattgtatatacaaaaa atcataaataatagatgaatagtttaattataggtgttcatcaategaaaaageaacgtatcett atttaaagtgcgttgcttttttctoatttataaggttaaataattetoatatatcaageaaagt gacaggcgcccettaaatattetgacaaatgctetttecetaaactecococataaaaaaacecg cegaagegggtttttacgttatttogcagattaacgattactegttateagaacegeceagggag ccegagettaagactggoecgtegttttacaacacagaaagagtttgtagaaacgcaaaaaggeo atcegtcaggggecttetgcttagtttgatgcctageagttecetactetegecttecegettee tegeteactgactegetgegeteggtegtteggetgeggegageggtateageteacteaaago cggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggeca “gcaaaaggccaggaacegtaaaaaggcegegttgetagegtttttecataggetecgeceaect gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggegaaaceegacaggactataaagat accaggegtttececetagaagetecetegtgegetetectgtteegacectagcegettacega - atacctgtecegectttetecettegggaagegtggegettteteatagetceacgetgtaggtat ctcagtteggtgtaggtegttegetecaagetgggetgtgtgcacgaacececegttcageceg acegetgegecttateegataactategtettgagtecaacceggtaagacacgacttategec " actggcagcagccactggtaacaggattagcagagegaggtatgtaggeggtgctacagagtte ttgaagtggtgggctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatetgegetetgetga agecagttacctteggaaaaagagttggtagectettgateceggeaaacaaaceacegetggtag cggtggtttttttatttgcaagcagcagattacgegcagaaaaaaaggatetcaagaagatect ttgatcttttctacgggatctgacgetcagtggaacgacgegegegtaacteacgttaagggat tttggtcatgagettgegoegtecegtraagtoagegtaatgctetgottt (SEQ ID NO:48)
    : Fig 32 Poptar IS PTrcPoplar . 6o6stp '
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    ó Fig 34 pEFOZ2 Fo rar en pronotes, "pre regos Tm terdnaior A pTrdday Vic kn
    A un” Jota! iscprene syntiase '
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    - Fig '37A ttgtctgeteceggeateegettacagacaagetgtgacegtetecegggagetacatgatgateag aggttttcaccgtcatcacegaaacgegegaggeageagateaattegegegegaaggegaage ggcatgcatttacgttgacaccategaatagtgcaaaacetttegeggtatageatgatagege ceggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtegcagagt atgceggtgtctettatcagacegtttocegegtggtgaaccaggecagecacgtttetgogaa aacgcgggaaaaagtggaageggegatggeggagetgaattacatteccaacegegtgageacaa caactggcgggcaaacagtegttgctgattgagegttgccacetecagtetagecetgeaegege cgtegeaaattgtegeggegattaaatetegegeegateaactaggtgccagegtagtagtate gatggtagaacgaageggegtegaagectgtaaageggeggtgcacaatettetegegeaacege gtcagtgggctgatcattaactatcegetggatgaccaggatgccattgctatagaagetagcect gcactaatgttceggegttatttcttgatgatetetgaccagacacecatcaacagtattatttt ctcecatgaagacggtacgegactaggegtggageatetggtegeattgggteracoageaaate gegetattagegggeccattaagttetgteteggegegtetgegtetagetagetageataaat atctcactegcaatcaaattcagcegatageggaacgggaaggegactggagtgecatgtecgg ttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcategtteceactgegatgetagttgccaac x gatcagatggegetaggegeaatgegegecattacegagteegggetgegegttagtgeggata fá teteggtagtgggatacgacgataccegaagacageteatgttatatccegeegtoaacoacoat * —caaacaggattttegectgetggggeaaaceagegtggacegettgctacaactcetetcagage E caggcggtgaagggcaatcagetattgccegteteactagtgaaaagaaaaaccaceetggege ] ccaatacgcaaacegecteteceegegegttagecegatteattaatgcagetaggecacgacaggt ttccegactggaaagegggeagtgagegeaacgcaattaatgtgagttagegegaattgatoeto gtttgacagcettatcatcegactgcacggtgcaccaatgcttetagegtcaggcagecateggaa gectgtggtatggctatgcaggtogtaaatcactgcataattegtgtegeteaaggegeactece gttctggataatgttttttgegecgacateataacaggttetageaaatattetagaaatgageto ttgacaattaatcatceggctegtataatgtgtagaattgtgageggataacaatttcacacag gaaacagcegcegetgagaaaaagegaageggeactgctctttaacaatttatcoagacaatetot gtgggcactegaceggaattategattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaat gtatcgattaaataaggaggaataaaccatgtgtgegacetetteteaatttacteagattace gagcataattccegtegttecgeaaactatcagecaaacetgtagaatttegaattectgcaat cecctggagaacgacctgaaagtggaaaagctggaggagaaagegaccaaactaggaggaagaagt tegetgcatgatcaacegtgtagacaccecagecgetgtecetactagagetgategacgatata cagegectgggtcetgacctacaaatttgaaaaagacatcattaaagecctggaaaacategtac tgctggacgaaaacaaaaagaacaaatctgacctgcacgeaacegetetgtettteegtetaget gegtcageacggtttegaggttteteaggatgtttttgagogtttcaaggataaagaaggtggt ttcagcggtgaactgaaaggtgacgtccaaggectgctgagectgtatgaagegtettacetogg gtttegagggtgagaacetgctagaggaggegegtacettttecatcacccacctgaagaacaa cectgaaagaaggcattaataccaaggttgcagaacaagtgagecacgecetggaactgccatat caccagegtetgcacegtetggaggeacgttggttectagataaatacgaaccegaaagaacege atcaccagetgctgctggagetggegaagetagattttaacatggtacagaccctgcaceagaa agagctgcaagatetgtecegetagtggacegagatgggectaggetagcaaactagattttata egegacegectgatggaagtttatttctaggcactaggtatggegecagaceegcagtttagto aatgtegcaaagetgttactaaaatgtttggtctagtgacgatcategatgacgtatatgacgt ttatggcactctggacgaactgcaactgttcacegatgetatagagegetaggacattaacget
    - Fig 37B attaacacccetgceggactatatgaaactgtgtttoectageactatacaacacegttaacgaca ecgtcectattetattcetgaaagagaaaggtcataacaacetagtoectatetgacgaaaagetageg tgaactgtgcaaagcctttctgcaagaggegaaatagtocaacaacaaaattateceggettto tccaagtacctaggaaaacgecagegtttectecteceggtatagegetgetggegecatettact tttcegtatgccageageaggaagacatetecgaceacgegetgegttecetgacegactteca tggtetggtgcegttetagetgegttatotteogectgtgcaacgatetggecacetetageggeg gagctggaacgtggegagactaccaattctatcattagetacatgcacgaaaacgatggtacca gcgaggaacaggccegegaagaactacgataaactgategacgeegaatagaaaaagatgaateg tgaacgegttagegactecacectgetacetaaagegtteatggaaategeagttaacataggea cgtgtttcccactgcacetaccagtatggegatagtetgaggtegeccagactacgegactgaaa accegcatcaaactgetgetgattgaccetttocogattaaccagetgatgtatgtetaactgca ttegcecettaggaggtaaaaaaacatgagttttgatattgccaaataccegacecetageactag y tegactecacccaggagttacgactgttgcegaaagagagtttacegaaactetgegacgaact gegeegetatttactegacagegtgagecgttecagegggeacttegectecegggetgaggcacg gtegaactgacegtggegetgcactatgtetacaacacecegtttgaccaattgatttaggato tggggcatcaggettateegoataaaattttgaceggacgecegegacaaaateggcaccatecg : tcagaaaggeggtetgcaceegttecegtggegeggegaaagegaatatgacgtattaagegte gggcattcatcaacctccatceagtgeccggaattggtattgeggattgctgacegaaaaagaaggcoca aaaategeegeacegtetgtatcoattagegatggegegattacegeaggeatagegtttgaage N gatgaatcacgcgggegatatcegtecetgatatgctggtgattceteaacgacaatgaaatgteg atttccgaaaatgtecggegegetraacaaccatetaggeacagetgetttecegataagetttact cttcactgcgegaaggeggagaaaaaagttttoetetagegtgcegecaattaaagagetgceteaa acgcacegaagaacatattaaaggcatggtagtgcctageacgttatttgaagagetgggottt aactacatcggcceggtagacggteacgatgtgctagagettatcaccacgetaaagaacatge gegacctgaaaggecegeagttoctgcatatcatgaccaaaaaaggtcgtagttatgaacegge agaaaaagaccegatcactttecacgcegtgectaaatttgatecctecagegagattatttgceg aaaagtagceggcggtttgacegagetattcaaaaatetttaggoegactggttgatgcgaaacggcag cgaaagacaacaagetgatggegattacteceggegatgegtgaaggttecggcatagtegagtt ttcacgtaaattcccggategetacttegacgtagecaattgcogagecaacacgeggtgacettt “getgegggtetggegattggtgggatacaaacecattgtegegatttactecactttectacaao gegectatgatcaggtgctgcatgacgtggegattcaaaagettecgatectattegecatega cegegegggeattgttagtgctgacggtcaaacecatceagggtgcttttgatetetettaceta cgctgcataceggaaatggtcattatgaccccegagegatgaaaacgaatgtegecagatgetet ataccggctatcactataacgatggecegtcageggtgegetaceegegtgageaacgegagtegg cgtaggaactgacgcegetggaaaaactaccaattggcaaaggcattgtgaagegtegtagegag aaactggegatecttaactttggtacgctgatgccagaageggegaaagtegecgaategetga acgccacgetagtegatatgegttttgtgaaacegottgatgaagegttaattetagaaatgge cgccagecatgaagegetggteacoegtagaagaaaacgccattatgggeggegeaggeagegge gtgaacgaagtgctgatggcccategtaaaccagtaceegtgetgaacattaggectgeeggact tcetttattcogcaaggaactcaggaagaaatgegegeegaacteggectegatgeegetagtat ggaagccaaaatcaaggcctggetggeataactgcagetagtaccatatgggaattcgaagett tctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagegecgtegaccateatcatcateat cattgagtttaaacggtctecagettggetgttttggoeggatgagagaagattttcagcctagat acagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctaggeggcagtagegeg
    : Fig 37C gtggtcccacetgaccecatgcegaactcragaagtgaaacgeegtagegecgatggtagtgtag ggtctccccatgegagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggetcagtegaaag actgagggcetttegttttatetattatttategatgaacgetetectgagtaggacaaatecges gggageggatttgaacgttgcgaagcaacggeceggagggtggegggcaggacgecegecataa actgccaggcatcaaattaageagaaggecatectgacggatagectttttacgtttcetacaaa ctetttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatcegoettaaceggaattgccagetg gggegecetetgagtaaggttaggaagecetgcaaagtaaactggatggetttetegeegecaag gatctgatggegeaggaggatcaagetcetgatcaagagacaggatgaggategtttegeatgatt gaacaagatggattgcacgcaggttctceeggeegettaggatagagaggetatteggetatgact gggcacaacagacaateggctgctetgatgcegecgtgttecggetgtragegeaggggegece ggttctttttgtcaagacegacctgtceggtgecoctgaatgaactgcaagacgaggcagegegg ctatcgtggetggecacgacgggegttecttgegeagetgtgctegacgttgtcactgaagega gaagggactaggetgctattgggegaagtgceggggcaggatetectgteateteacettacteo . tgcegagaaagtatccatcatggetgatgcaatgeggeggetgcatacgettgatecgagetace tgccecattegaccaccaagegaaacategeategagegageacgtacteggatggaagecgagteo ttgtcgatcaggatgatctggacgaagageatcaggggetegegecagecgaactgttegecag : getcaaggegageatgcceegacggegaggatetegtegtgacecataggegatgeetgcttgcog aatatcatggtggaaaatggcegettttetagattceategactatagecggetaggtatagegg acegetateaggacatagegttggetaceegtgatattgctgaagagettageggegaatagge - .tgacegettectegtgetttacggtategeegetecegattegecagegeategecttetatege ' cttcttgacgagttettetgacgeatgaccaaaatcccttaacgtgagttttegttecactgag cgtcagacccegtagaaaagatcaaaggatcttettgagatectttttttoetacgegtaateto ctgcttgcaaacaaaaaaaccacegetaccageggtagtttgtttaceggatraagagetaceca actctttttcegaaggtaactggettcagcagagegeagatacceaaatactagtcecttetagtot agcegtagttaggecaccacttcaagaactetgtageacegectacatacetegetetgetaat cetgttaccagtggetgctgccagtggegataagtegtgtettacegggttagactcaagacga tagttaccggataaggegeageggtegggetgaacggggggttegtgcacacageccagettag agcgaacgacctacacegaactgagatacctacagegtgagetatgagaaagegecacgetteeo cgaagggagaaaggeggacaggtatecggtaageggcagggteggaacaggagagegeacgaga gagcttcecagggggaaacgectaggtatctttatagtcectgtegggtttegecacetetgactta agecgtegatttttgtgatgctegtcagggaggeggagectatggaaaaacgccagecaacgegge ctttttacggttectagecttttgctagecttttacteacatattotttoctacgttateceet gattctgtggataaccgtattacegectttgagtgagetgatacegetegeegecagecgaacga cecgagegcagegagtcagtgagegaggaageggaagagegectgatgeggtattttetecttac gcatctgtgeggtatttcacacegeatatggtgcacteteagtacaatetgetetgatgeogea tagttaagccagtatacacteegetategetacgtgactaggtcatggetgoegeceagacaceo gecaacaccegetgacgegecetgacggge (SEQ ID NO:51)
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    - Fig 39A : 5º ctggegtaatagegaagaggecegeacegatogecettecoaacagttgegeagectgaatgage gaatggegectgatgeggtattttoetecttacgeatetatgcggtatttcacacegeatatagt gcactcetcagtacaatctgctetagatacegeatagttaagecagecocogacacoogeocaacace cgctgacgagettagtaaagecetegetagattttaatgoeggatgttgegattacttogocaao tattgcgataacaagaaaaagecagectttcoatgatatatetecceaatttatatagggettatt atgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacctgatagtttagctgtgageaattatgtgo ttagtgcatctaacgcttgagttaagcegegecgegaageggegteggettgaacgaattgtta gacattatttgcegactaccttggtgatetegecttteacgtagtggacaaattettocaacta atctgegegegaggecaagegatettettottgtecaagataagectatetagetteaagtato acgggctgatactgggceggcaggegetecattgcecagteggcagegacatectteggegega ttttgccggttactgegetgtaccaaatgegggacaacgtaagcactacatttegetoategeo agcccagtegggeggegagttecatagegttaaggttteatttagegectraaatagatceetot . tcaggaaccggatcaaagagttcctecgecgetgagacetaccaaggcaacactatattetetta cttttgtcagcaagatagccagatcaatgtegategtggetaggetegaagatacetgcaagaat gtcattgcegetgecattetecaaattgcagttegoegettagetaggataacgecacagaatgata , tegtegtgcacaacaataggtgacttetacagegeggagaatetegetetetecaggggaagecg aagtttccaaaaggtegttgatcaaagetegecgegttgtttcateaagecttacagteacegt aaccagcaaatcaatatcactgtgtaggetteaggecgecatecactgeggagecegtacaaatot Hi acggccagcaacgteggttegagatggegetegatgacgecaactaccetetgatagttgagteg atacttcggegatcacegetteceteatgatgtttaactttgttttagggegactagccctgcta cgtaacatcgttgetgctecataacatcaaacategacecacggegtaacgegettgetgctta gatgccegaggcatagactgtaccocaaaaaaacagtcataacaagecatgaaaacegecactg cgcegttaccacegetgcgttegateaagattetggaccagttgcgtgagegecatacactactt gcattacagcttacgaacegaacaggettatgtecactagggttegtgacetteateegtttecas ggtgtgegteaceeggeaacettgggcageagegaagtegaggeatttetgtectagetggega acgagcgcaaggttteggatetecacgeategtoaggeattggeggecttgctattcttetacag caaggtgctgtgcacggatetgecetaggetteaggagateggaagaceteggecgtegeggege ttgceggtagtgctgaccceggatgaagtagttoegcatectegatttt ctggaaggegageato gtttgttegeccagettoetatatggaacggagecatgeggateagtgagggtttgcaactgegggt caaggatctggatttegatcacggeacgatcategtgegggagggcaagggetecaaggategg gcettgatgttaccegagagettggcacecagectgegegageaggggaattaattceccacaga ttttgctgecegeaaacgggetattetagtgttgctagtttgttatceagaategeagatecegge ttcagceggtttgcoggctgaaagegetatttettccagaattgcecatgattttttececacag gaggegtcactggetccegtgttgteggcagetttgattegataageageategectatttoag gctgtetatatatgactattgagetataacaagttgteteaggatattcaatttcatgttetagt tgotttgttttactggtttceacotgattetattaggtgttacatgetgttcatetattacattot cgatctgttcatggtgaacagetttgaatgcaccaaaaactegtaaaagetetgatgtatetat cttttttacaccgttttcatctgtgcatatggacagttttccotttgatatgtaacggtgaaca gttgttctacttttatttgttagtcttgatgcttcactgatagatacaagagccataagaacct cagatccttceegtatttagoecagtatgttetetagtgtagttegttgatttttacatagagcecata agaacgaaccattgagatcatacttactttgcatgtcactcaaaaattttgoctraaaactagt gagctgaatttttgcagttaaagcategtgtagtgtttttottagtecgttatataggataggaa tectgatgtaatggttattagtattttgtcaccatteatttttatcetggttgtteteaagttogg
    : Fig 39B ttacgagatccatttgtctatctagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtegggeggecteg cttatcaaccaccaatttcatattgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaace cattggttaagccettttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcat caaggctaatctetatatttgcettatagagttttoettttgtattagttcettttaataaccacte ataaatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaat ttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttegorto agaacttggcatagtttgtccactggaaaatctcaaagectttaaccaaaggattectgattto cacagttetegteateagetetetggttactttagoetaatacaccataagcattttoccetacto atgttcatcatctgagegtattggttataagtgaacgatacegtecegttetttecttatagggt tttcaatcgtggggttgagtagtgecacacagcataaaattagettagtttceatagctecgttaa gtcatagcgactaategetagtteatttgctttgaaaacaactaattcagacatacatctcaat tggtctaggatgattttaatcactataccaattgagatgggctagtcaatgataattactagteo ttttcctttgagttataggatatcetgtaaattctgcetagacetttgctagaaaacttgtaaatte tgêtagaccctctgtaaattcegetagacetttgtatgattttttttatttatattcaagtagtt ataatttatagaataaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcccagecetagtgtata actcactactttagtcagttcegcagtattacaaaaggatgtoegcoaaacgetgtttgctecteot z acaaaacagaccttaaaaccctaaaggcttaagtagcaceetegeaagetegggeaaategeta aatattcettttgteteegaceateaggeacetgagtegetgtetttttegtgacatteagtte gctgcegetoacggetetaggcagtgaatagggggtaaatggcactacaggegecttttatagatte E atgcaaggaaactacccataatacaagaaaagecegteacgggettetcagggegttttatage í - gagtcetgetatgtagtactatctgactttttactattcagcagttcctgecetetaattttcca gtctgaccactteggattatecegtgacaggteattcagactggetaatgcacccagtaaggea geggtatcatcaacaggettacceogtettactgtoegggaattegegttagecgattcoattaata cagattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcoeggetegtataatgtgtggaattgtagago ggataacaatttcacacaggaaacagegcegetgagaaaaagegaageggeactactetttaac aatttatcagacaatctgtatagacactegaceggaattategattaactttattattaaaaat taaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatgtgtgêógacetctte tcaatttactcagattaccgagcataattecegtegtteogeaaactatcagecaaacetatag aatttegaattcctgcaatecetaggagaacgacetgaaagtggaaaagetggaggagaaagega ccaaactggaggaagaagttcgctgcatgatcaacegtgtagacacccagecgetgtecetact ggagctgategacgatgtgcagegectaggtetgaccetacaaatttgaaaaagacatcattaaa gceccetggaaaacategtactgctggacgaaaacaaaaagaacaaatcetgacctgcacgecaaceg ctetgtetttoecgtetactacgtoageacagtttegagatttoetoaggatgtttttgagegttt caaggataaagaaggtggtttcageggtgaactgaaaggtgacgtocaaggectactgagecto tatgaagcegtettacctgggtttogagggtgagaaccetagctggaggaggegegtacetttteca tcacccacctgaagaacaacctgaaagaaggcattaataccaaggttgcagaacaagtgageca egecetggaactgccatateaccagegtetgcacegtetggaggeacgttggttcctggataaa tacgaaccgaaagaacegcatcaccagetgetgctagagcetggegaagetggattttaacatog tacagacccetgcaccagaaagagetgcaagatctgtecegetggtagacegagatgggectagge tagcaaactggattttatacgegacegectgatagaagtttatttetagacactaggtatageg ccagaccegeagtttggtgaatgtegcaaagetgttactaaaatotttaggtcetagtgacgatea tegatgacgtgtatgacgtttatagcactetaggacgaactgcaactgttçacegatgctataga gegetaggacgttaacgetattaacaccetgceggactatatgaaactgtgtttcctaggcacto tacaacaccgttaacgacacgtcctattctattetgaaagagaaaggtcataacaacctgtcct
    : Fig 39C
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    ' (SEQ ID NO:52)
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    Fig 4A 51 cecegtettactgtegggaattegegttageogattoattaatgcagattattgaagcatttato agggttattgtctcatgageggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaaaagagtt tgtagaaacgcaaaaaggecatcegtcaggatggecttoetacttaatttgatgcctaggeagttt atggcegggegtectgecegecacectecgggecgattgcttegcaacgtteraaatecgetecegg cggatttgtectactceaggagagegtteacegacaaacaacagataaaacgaaaggeccagtet ttegactgagecoetttegttttatttgatacetageagttecetactetegeatggggagacoco acactaccatcggegectacggegtttoacttetgagttegacatggggtoaggtgggaccaceg egetactgcegecaggcaaattetgttttatcagacegettetgegttetgatttaatetatat caggctgaaaatctteteteatecgecaaaacagecaagetggagacegtttaaactcoaatgat gatgatgatgatggtegacggcgctattcagatcectettetgagatgagtttttoattctagaaa gcttegaatteccatataggtaccagetgcagttagacatacatcagcetggttaategagaaago ' gtcaatcagcagcagtttgatgeggttttcagtegegtagtctgggegacecagaceategeca tactggtaggtgcagtgggaaacacgtgccatgttaactgegatttecatgaacgetttaggca* gcagggtagagtegetaacgegtteacgattcatetttttecatteggegtegateagtttaca cagttcttegegaggectattectegetagtaccategttttegtacatatagetaatgatagaa - ttaggtagtctegecacgttecageteegecgcagaggtagecagategttgcacaggeggãaga taacgcagetagaacgcaccagaccatggaagteggtcagggaacgcagegegtggteggagat gtcttectactgctggcatacggaaaagtaagacggegecagecagegetacaceggaggaggaa acgctagegttttcecaggtacttggagaaagecgggataattttagttattagaccatttegect Ú cttgcagaaaggetttgcacagtteacgecagettttegtragataggacaggttgttatagaco tttctctttcagaatagaataggacgtgtegttaacggtattgtacagtgccaggaaacacagt ttcatatagtceggeagggtgttaatagegttaacgteceagegetetacagcateggtgaaca gttgcagttegtecagagtgecataaacgtcatacacgtcategatgategtcaccagacoaaa cattttagtaacagctttgegacattcaccaaactgegagtetggegecatacecagtgeccag aaataaacttccatcaggeggtegegtacaaaatecagtttgctagecaggeceateteggtec accagcgogacagatettgcagetetttetagtacagggtetagtaccatgttaaaatecagett cegccagetecageageagetggtgatacggttetttegattegtatttatcecaggaaccaacgt gectecagacggtgcagacgetaggtgatatggcagttecagggegtaggetoacttoattetgcaa cettggtattaatgccttetttcaggttgttettoaggtgggtgatggaaaaggtacgegecte ctccagcaggtteteacectegaaacccaggtaagacgcettcatacaggetcagcaggecttoag acgtcacctttceagtteacegetgaaaceacettetttatecttgaaacgeteaaaaacatoct gagaaacctcgaaacegtgetgacgcagcagacggaaagacagagegattagcgtagcaggtoaga tttgttetttttgttttegtecageagtacgatgttttecagggetttaatgatgtoetttttca aatttgtaggtcagacccaggegetgcacategtegatceagetecageagggacageggetggg tgtctacacggttgatcatgcagegaacttettectecagtttggtegetttotoctecagett ttcecactttcaggtegttetecagggattacaggaattcegaaattcecacaggtttggetaatag tttgcggaacgacgggaattatgocteggtaatctgagtaaattgagaagaggtegeacacatag tttattcetecttatttaategatacattaatatatacctetttaatttttaataataaagtta atcgataattceggtegagtgccocacacagattgtctgataaattagttaaagagcagtgeoeget tegettttteteageggegetgtttectgtatgaaattgttatcegeteacaattecacacatt atacgagceggatgattaattgtcaacagcetcatttcagaatetaggegtaatagegaagaggec cgcacegategecetteceaacagttgegeagectagaatggegaatagegectgatacagtatt ttetecttacgeatetgtgeggtatttcacacegecatatggtgcacteteagtacaatetgete
    * Fig 41B tgatgccegcatagttaagecagececgacaceegecaacaceegetgacgagettagtaaageo ctegetagattttaatgeggatgttgegattacttegecaactattgogataacaagaaaaage cagcetttcatgatatatcteceaatttgtatagaggettattatgcacgcttaaaaataataaa agcagacttgacctgatagtttggctgtgagcaattatgtgcttagtgcatctaacgcettgagt taagcegegecgegaageggegteggettgaacgaattgttagacattatttgcogactacett ggtgatctegecttteacgtagtggacaaattettecaactgatctgogegegaggecaagega tettettettgtecaagataagectgtetagettoaagtatgacgggetgatactgggceggea ggegetecattgcecagteggcagegacatectteggegegattttgceggttactgegetgta ccaaatgcgggacaacgtaageactacatttegeteategecageceagtegggeggegagtte catagegttaaggtttcatttagegecteaaatagatcetgttcaggaaceggatcraaagagtt ceteegecegetggacetaccaaggeaacgetatgttetettgettttgtcageaagatagecag atcaatgtegategtggetggetegaagatacetagcaagaatgtcattgegetaccatteteca aattgcagttegegettagetagataacgccacagaatgatategtegtacacaacaatagtga cttectacagegeggagaatetegetetetecaggggaagecgaagtttecaaaaggtegttgat caaagectegecegegttgtttcateaagecttacggtoacegtaaccagecaaatcaatatcacto tgtggcttcaggeegecatecactgeggagecgtacaaatgtacggecageaacgtoeggttega x gatggcgctegatgacgecaactaccetetgatagttgagtegatactteggegateacegette ceteatgatgtttaactttgttttagggegactgcectgctgegtaacategttactactecat ' aacatcaaacatcgacccacggegtaacgegettgetgettggatgceegaggeatagactgta h ccccaaaaaaaçagtcataacaagecatgaaaacegecactgegecgttaccacegetgegtto ggtcaaggttetggaccagttgegtgagegeatacgetacttgcattacagcttacgaaccegaa caggcttatgtccactagattegtgcetteatecgtttecacggtatgogteaceeggeaacet tgggcagcagegaagtegaggeatttetatectggetggegaacgagegeaaggttteggtete cacgcategtcaggeattggeggecttgetattettcetacggeaaggtgctgtgcacggateta cecetggetteaggagateggaagaceteggecgtegeggegettgceggtggtgctgacccegg atgaagtggttcegcatecteggttttetggaaggegageategtttgttegeccagettetgta tggaacgggcatgeggatcagtgagggtttgcaactgegggtcaaggatctagatttegateao ggcacgatcategtgcgggagggeaagggetocaaggategggecttgatgttaccegagaget tggcacccagectgegegageaggggaattaattcccacgggttttgctgccogcaaacgagget gttetggtgttgctagtttgttatcagaategeagateeggettoagecggtttacoegactgaa agegetatttettocagaattgocatgattttttccecacgggaggegteactggetecegtagt tgteggcagetttgattegataagcageategectgtttceaggetgtetatgtatgactattaga gectgtaacaagttgtetoaggtatteaattteatgttetagttgctttgttttactagttteac ctgttctattaggtattacatgotgttcatetgttacattgtegatctagtreatggtgaacage tttgaatgcaccaaaaactcgtaaaagetetgatgtatetatettttttacacegttttcatet gtgcatatggacagttttccctttgatatgataacggtgaacagttattctacttttatttatta * gtcttgatgcttcactgatagatacaagagccataagaacctcagatcetteegtatttageca gtatgttctetagtgtggttegttgtttttgogtgagecatgagaacgaaccattgagatcata cttactttgcatgtcactcaaaaattttgcctoaaaactggtgagetgaatttttgcagttaaa gcategtgtagtgtttttottagtcegttatgtaggtaggaatetgatgtaatggttgttggta ttttgteaccatteatttttatetggttattoeteaagtteggttacgagatecatttgtetato tagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcgggeggectegettatceaaccaceaattteata ttgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaacccattagttaagccttttaaact catggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggetaatetetatatttao
    Fig 4Cc :
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    " (SEQID NO:53) R
    Fig 42 Tm tenrinaior. ae . Radas o po PggUtn o. uai Isoprene à Synthase
    "esa pro region
    : Fig 43A
    5º ctggegtaatagegaagaggecegeacegategecetteceaacagttgegeagectgaatage gaatggcegectgatgeggtattttetecttacgeatetgtacagtattteacacegeatatggt gcactctcagtacaatctgetetgatgcegcatagttaagecageceegacacecegecaacace cgctgacgagettagtaaagecetegetagattttaatgeggatgttgogattacttegcocaac tattgcgataacaagaaaaagccagecttteatgatatateteccaatttatatagggettatt atgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacetgatagtttggctgtgageaattatgtgo ttagtgcatctaacgcttgagttaagcegegecgegaageggegteggettgaacgaattgtta gacattatttgcegactacettggtgatotoegectttoacgtagtggacaaattettcecaacto atctgegegegaggecaagegatettottettgtecaagataagectagtetagetteaagtato acgggctgatactgggecggcaggegetecattgeceagteggeagegacatectteggegega ttttgcoggttactgcogetagtaccaaatgegggacaacgtaagcactacatttegeteategeo agecccagtegggeggegagttecatagegttaaggtttcatttagegecteaaatagatectat tcaggaaccggatcaaagagttcctecegecegetggacetaccaaggeaacgactatattetettoa cttttgtcagcaagatagccagatcaatgtegategtggetggetegaagataccetgcaagaat gtcattgegoctgecattetecaaattgcagttegegettagetggataacgecacggaatgato
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    - Fig :43B ttacgagatccatttgtctatctagtteaacttggaaaatcaacgtatcagtegggeggecteg cttatcaaccaccaatttcatattgctgtaagtgtttaaatetttacttattggtttcaaaacec cattggttaagccttttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcat caaggctaatetetatatttgccttatagagttttoettttgatattagttottttaataaccacte ataaatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaat ttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttoegotta agaacttggcatagtttgtccactagaaaatctcaaagectttaaccaaaggattectgattto cacagttctegteateagetetetagttactttagetaatacaccataagcattttecetacto atgttcatcatctgagegtattaggttataagtgaacgatacegtocgttetttecttataggagt tttcaatcgtogggttgagtagtgccacacagcataaaattagettggtttcatgctecgttaa gtcatagcegactaategetagttcatttgctttagaaaacaactaattcagacatacatctcaat tggtctaggtgattttaatcactataccaattgagatgggetagtcaatgataattactagtcec ttttcctttgagttgtaggtatctgtaaattoctgctagacctttgctagaaaacttgtaaattc tgctagaccetetgtaaattcegetagacetttgtatattttttttatttatattcaagtagtt ataatttatagaataaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcccagceccetotgtata actcactactttagtcagttcegcagtattacaaaaggatgtegcaaacgetgtttgctectet - acaaaacagaccttaaaacccectaaaggecttaagtagcaccetegeaagetegggeaaategetag : aatattcecttttgteteegaceateaggeacetgagtegetatetttttegtgacatteagtte getgegeteacggetetageagtgaatgggggtaaatageactacaggegecttttatagatte - atgcaaggaaactacccataatacaagaaaagecegteacaggetteteagggegttttatage Ú gggtctgctatgtggtgctatotgactttttgetattcagcagttectacectetgattttoca gtctgaccactteggattatecegtgacaggtcattcagactagetaatgcacccagtaaggeca gcggtatcatcaacaggettaccegtettactgtoegggaattegegttagecgatterattaato cagattctgaaatgagctgttgacaattaatcatceggetegtataatgtgtagaattgtgagce ggataacaatttcacacaggaaacagcgcegetgagaaaaagegaageggeactactetttaac aatttatcagacaatctgtgtgggcactegaceggaattategattaactttattattaaaaat taaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatgtgtgoegacctetto tcaatttactcagattacegagcataattccegtegtteegecaaactatceagecaaacetagtag aatttcgaattcctgcaatccctagagaacgacctgaaagtggaaaagetggaggagaaagega ccaaactggaggaagaagttcegetgcatgatcaacegtgtagacacceagecegetgtecetact ggagctgatcegacgatgtgcagegectaggtetgacctacaaatttgaaaaagacatcattaaa gccetggaaaacategtactgctggacgaaaacaaaaagaacaaatctgacctgcacgcaaceg ctctgtcettteegtetgactagcegteageacgagtttegaggtttceteaggatatttttgagegttt caaggataaagaaggtggtttcageggtgaactgaaaggtgacgtccaaggectagctgagectg tatgaagecgtettacetagggtttegagggtgagaacetgetagaggaggegegtacetttteoca tcacccacctgaagaacaacctgaaagaaggcattaataccaaggttgcagaacaagtgageca cgcectggaactgccatatcaccagegtetgcacegtetagaggcacgttaggttectagataaa tacgaaccgaaagaaccgcatcaccagetgetgctagagetggogaagetagattttaacatag tacagaccctgcaccagaaagagetgcaagatcetgtecegetggtggacegagatgggectgage tagcaaactggattttgtacgegacegectagatagaagtttatttcetaggcactaggtatageg ccagaccegeagtttgagtgaatgtegeaaagetgttactaaaatgtttggtctagtgacgatca tegatgacgtgtatgacgtttatggcactetggacgaactgcaactgttcacegatgetataga gegetgggacgttaacgetattaacacccetgceggactatatgaaactgtgtttectageacta tacaacaccgttaacgacacgtcctattctattctgaaagagaaaggtcataacaacetogtect
    - Fig 43C atctgacgaaaagctggegtagaactagtagcaaagectttetacaagaggegaaatggtecaacaa caaaattatcceggetttetecaagtacetggaaaacgecagegtttectecteceggtatageg ctgetggegecegtettacttttecegtatgccageageaggaagacatetecgacctacgegetge gttcectgacegacttecatagtetagtagcattetagetacegttatettecgceetatacaacga tctggccacetetgeggeggagetggaacgtggegagactaccaattetatcattagetacato cacgaaaacgatggtaccagegaggaacaggecegegaagaactgegtaaactgategacgecg aatggaaaaagatgaatcgtgaacgegttagegactecacectagctacetaaagegtteataga aatcgcagttaacatggcacgtgtttcccactgeacetacceagtatggegatagtetagggtoge ccagactacgegactgaaaacegcatcaaactgetgetgattgaccctttcocogattaaccage tgatgtatgtctaactgcategecettaggaggtaaaaaaaaatgactgcegacaacaatagta tgccccatggtgcagtatctagttacgccaaattagtgcaaaaccaaacacctgaagacatttt ggaagagtttcctgaaattattccattacaacaaagacetaataccegatcetagtgagacgtca aatgacgaaagcggagaaacatgtttttctggtcatgatgaggagcaaattaagttaatgaato aaaattgtattgttttggattgggacgataatgctattggtgcoggtaccaagaaagtttgtca tttaatggaaaatattgaaaagggtttactacatcgtgcatteteegtetttattttcaatgaa caaggtgaattacttttacaacaaagagccactgaaaaaataactttcecectgatetttagacta 7 acacatgctgctctceatecactatgtattgatgacgaattaggtttgaagggtaagetagacga taagattaagggcgctattactgcggeggtgagaaaactagatcatgaattaggtattccagaa gatgaaactaagacaaggggtaagtttcactttttaaacagaatccattacatggcaccaagca - atgaaccatggggtgaacatgaaattgattacatcctattttataagatcaacgctaaagaaaa cttgactgtcaacccaaacgtcaatgaagttagagacttcaaatgggtttcaccaaatagattto aaaactatgtttgctgacccaagttacaagtttacgcettggtttaagattatttgegagaatt acttattcaactggtgggagcaattagatgacctttctgaagtggaaaatgacaggcaaattca tagaatgctataacgacgegtcetgcagetggtaccatatgggaattegaagetttotagaacg aaaactcatctcagaagaggatctgaatagegeegtegaceateateateateateattgagtt taaacggtcteccagettggetattttageggatagagagaagattttcagectgatacagattaa atcagaacgcagaagecggtetgataaaacagaatttgccetggeggeagtagegeggtggtecea cetgaccccatgcegaacteagaagtgaaacgeegtagegecegatggtagtgtggggteteces ' atgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggetcagtegaaagactoggcct ttegttttatetgttgtttateggtgaacgetetectgagtaggacaaatecgocegagagegga tttgaacgttgcegaagcaacggeceggagggtggegggeaggacgecegecataaactgecagg catcaaattaagcagaaggccatcctgacggatagectttttgogtttctacaaactettttto tttatttttctaaatacattcaaatatgtatcegeteatgagacaataaccetgataaatgectt caataat (SEQID NO:54)
    . Fig 44 í mmmiterminator no — ds POL Pirdkiidau DS Brito Tx sto g É ' ] preccegien'
    + 97/172 Fig 450 ccegtettactgtegggaattegegttagecegatteattaatgcagattattgaageatttate agggttattgtctcatgageggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaaaagagtt tgtagaaacgcaaaaaggceccateegteaggatagecttoetgettaatttgatgectageagttt atggegggegtectgecegecacecteegggecgttgcttegeaacgttcoaaatcegetecegg cggatttgtcctacteaggagagegttcacegacaaacaacagataaaacgaaaggeccagtet ttegactgagectttegttttatttgatgcectageagttecetactetegeatggggagacece acactaccatcggegetacggegttteacttetgagtteggcatagggtcaggtgggaceaceg cgetactgcegecaggeaaattetattttatcoagacegettetgegttetgatttaatetgtat caggctgaaaatctteteteatecgecaaaacagecaagetggagaccegtttaaactcaatgat gatgatgatgatggtcgacggegetatteagatectettetaagatgagtttttgttctagaaa gettegaattcccatataggtaccagetgcagttatgccagecaggecttgattttagettecat accagceggcategaggecgagtteggegegcatttettoctgagttecttgoggaataaagaag tceggeaggecaatgtteageacgaggtactagtt tacgatgggccatcagecacttegtteacge egetgecetgegeegeceataatagegttttettetacggtgaccagegetteatagetagegge catttccagaattaacgcttcatcaageggtttcacaaaacgcatategaceagegtagegtte : agegatteggegactttegeegettetageateagegtaccaaagttaaggategecagtttet á cgecacgacgettocacaatgectttgccaattggtagtttttecageggegteagttecacges gaccegegttgecacgegagtagegeacegetgacaggecategttatagtgatagceggtatag Y agcatctggegacattegtttteategeteggggteataatgaccatttecggtatgcagegea Ú ggtaagagagatcaaaagcaccetgatgggtttgacoegtcageaceaacaatgecegegeggte gatggcgaacaggaccggaagettttgaategocacgtoatgcageacetgatcrataggegegt tgcaggaaagtggagtaaatcegegacaatgggtttgtacccaccaategecagaccegeageaa aggtcacegegtgttgcteggcaattagccacgtegaagtagegatecgggaatttacgtgaaaa ctegaccatgceggaacettcoacgeategecggagtaategecateagettgttgtettteget gcegtttegcacaaccagtegecaaagatttttgaatagcteggeaaacegecgetactttteg gcaaacaacecgetggagggatcaaatttaggcacggegtggaaagtgategggtetttttetgo cggattcataaccacgacettttttagtcatgatatacaggaactgegagectttcaggtegege atgttctttagegtggtgataagececageacategtgacegtecacegggecegatgtagttaa agcccagetetteaaacaacgtgccaggeactaccatgcetttaatatgttctteggtacgttt gagcagctctttaattggoggcacgecagagaaaacttttttocogocttegegcagtgaagag taaagcttacceggaaagcagetgtgccagatggttattgagegegecegacatttteggaaateg acatttcattgtcgttgagaatcaccagcatatcaggacggatategecegegtgatteatege ttcaaacgccatgccetgeggtaategegecategecaatgacacagacggtgeggegattttto cecttetttttoggcagecaacegeaataccaatteeggcactgatagaggttgatgaatgeccega egoettaatacgteatattegetttegecgegecacgggaacgggtgcagacegectttetgacg gatggtacegattttategeggegtecagteaaaattttatacagataagectgatgccecaca teccaaatcaattggtcaaacggggtattgtagacatagtgcagegecacggteagttegaceg tgcccageceggaggegaagtgecegetggaacggetcacgctgtegagtaaatageggegeag ttcgtegcagagttteggtaaactetettteggcaacagtegtaactectaggtggagtegace agtgccagggtegggtatttggcaatateaaaactceatatttttttacctectaagggegaato cagttagacatacatcagctggttaatcgggaaagggtcaateagecageagtttgatgogattt tcagtcgegtagtetgggegaccecagaccategecatactggtaggtgcagtgggaaacacgta ccatgttaactgegatttocatgaacgetttaggcageagggtagagtegetaacgegtteacg
    Fig 45B attcatctttttccatteggegtegateagtttacgcagttettegegggcetgttectogeta gtaccategttttegtgcatgtagetaatgatagaattagtagtetegecacgttecageteceg cegeagaggtggecagategttgcacaggeggaagataacgcagetagaacgcaccagaccecato gaagteggtcagggaacgcagegegtagteggagatgtcttectgctgetageatacggaaaag taagacggegoecageagegetacaceggaggaggaaacgetagegttttecaggtacttgagaga aagcegggataattttgttattggaccatttegoctottgcagaaaggetttgcacagtteaca ccagettttegteagataggacaggttgttatgacctttctettteagaatagaataggacgto tegttaacggtattgtacagtgccaggaaacacagtttcatatagtcegacaggagtattaatag cgttaacgtcecagegetetacagcateggtgaacagttgcagttegtoecagagtgecataaao gtcatacacgtcatcgatgatcgtcaccagaccaaacattttagtaacagctttgcgacattca ccaaactgcgggtetagegecatacecagtgeccagaaataaacttccatcaggeggtegegta caaaatccagtttgctagecaggeccateteggtecaccagegagacagatettacagetettt ctggtgcaggagtetgtaccatgttaaaatccagettegecagetecageageagetggtgatgo ggttettteggttegtatttatcecaggaaccaacgtgectecagacggtgcagacgetggtgat atggcagttccagggegtggeteacttgttotgcaaccettggtattaatgcoettettteaggtt gttcttcaggtgggtgatggaaaaggtacgegectectecageaggtteteacectegaaaces y aggtaagacgcttcatacaggetcagcaggecttaggacgteacetttcagttoacegetgaaao caccttetttatocttgaaacgetcraaaaacatcctgagaaacctegaaacegtgctgacgcag cagacggaaagacagagcggttgcegtgcaggtcagatttgttoetttttgttttogtecagoagt | acgatgttttccagggetttaatgatgtetttttcaaatttgraggtcagacccaggegetgea categtegatceagetecageagggacageggetgggtatetacacggttgatcatgcagegaao . ttcttcectecagt ttggtegetttoetectecagettttecactttcaggtegttetecagggat tgcaggaattcgaaattcecacaggtttagetgatagtttgeggaacgacgggaattatgetogg taatctgagtaaattgagaagaggtcgcacacatggtttatteoctocttatttaategatacat taatatatacctctttaatttttaataataaagttaatcgataattceggtegagtgececacao agattgtctgataaattagttaaagagcagtgcegettegetttttoeteageggegetatttect gtgtgaaattgttatcegeteacaattecacacattatacgagecggatgattaattgtcaaca geteattteagaatetggegtaatagegaagaggecegeacegategecettoeceaacagttoo gcagcectgaatggegaatggegectgatgeggtattttetecttacgcatetagtacggtattto acaccgcatatggtgcactetceagtacaatetgetetgatgcegeatagttaagecagececga caccegecaacacceccegetgacgagettagtaaagecetegetagattttaatgceggatattoacg attacttegecaactattgegataacaagaaaaagecagecttteatgatatatetecoaattt gtgtagggcttattatgcacgcttaaaaataataaaagcagacttgacctgatagtttggctot : gagcaattatgtgcttagtgcatctaacgcttgagttaagecgegecgegaageggegtegget tgaacgaattgttagacattatttgcegactaccttggtgatetegectttoacgtagtagaca aattcttccaactgatctgoegegegaggecaagegatettettettgtecaagataagectgte tagcttcaagtatgacgggctgatactgggecggcaggegetecattgeocagteggeagegac atccectteggegegattttgceggttactgcgctgtaccaaatgegggacaacgtaagcactaca tttegeteategecageceagtegggeggegagttecatagegttaaggtttoatttagegect caaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagagttcotecgecegetagacctaccaaggcaao getatgttctettgettttgteageaagatagecagateaatategategtggetagetegaag atacctgcaagaatgtcattgegoetgecattetecaaattgcagttegegettagetggataac gccacggaatgatgtegtegtgcacaacaatagtgacttetacagegeggagaatetegetete tecaggggaagcegaagtttecaaaaggtegttgatceaaagetegecgegttagttteateaage
    Fig 45C cttacggtcaccegtaaccagcaaatcaatatcactgtgtagettcaggecgecatecactacgg agcegtacaaatgtacggccagceaacgteggattegagatagegetegatgacgecaactaceto tgatagttgagtcegatacttceggegateacegetteceteatgatagtrtaactttgttttagag egactgeectgetgegtaacategttgetgetecataacatoaaacategacecacggegtaao gegettgetgcttggatgccegaggcatagactgtaccecaaaaaaacagtcoataacaagecat gaaaacegccactgegecgttaccacegetgegtteggteaaggttetagaccagttgegtgag cgcatacgctacttgcattacagettacgaacegaacaggettatgtecactaggttegtacet tcatcegtttccacggtgtgegtcacceggcaacettgggcagcagegaagtegaggeatttot gtcctagetagegaacgagegeaaggttteggtetecacacategteaggeattageggectta ctgttcttcetacggeaaggtgetgtgcacggatctgcectagetteaggagateggaagacete ggcegtegeggegettaceggtagtgctgaceceggatgaagtggttegeatecteggttttet ggaaggcgagcategtttgttegeccagettetgtatggaacgggcatgeggatcagtgagagt ttgcaactgcgggtcaaggatctagatttegateacggcacgatceategtgegggagggeaagg ' gctecaaggategggcettgatgttaccegagagettggcacecagectgcgegageaggagaa ttaattcccacgggttttgctgecogeaaacgggetgttetggtgttgctagtttgttatcaga atcgcagatecggettoeagecggtttgcoggctgaaagegetatttettcocagaattgcecatga - ttttttccecacgggaggegteactaggetecogtgattagteggcagetttgattegataageage j atcgecetgttteaggetatetatgtgtgactgttgagetgtaacaagttotceteaggtatteaa tttcatgttctagttagetttgttttactagttteacetagttctattaggtgttacatgctatto atctgttacattgtegatctgttcatggtgaacagetttgaatgcaccaaaaactegtaaaage : . tetgatgtatetatertttttacacegttttcatetatgcatatagacagttttecetttgata tgtaacggtgaacagttgttctacttttgtttgttagtettgatacttcactgatagatacaag agccataagaacectcagatectteegtatttagecagtatattetetagtgtagttegttattt ttgcgtgagccatgagaacgaaccattgagatcatacttactttgcatagtcactcaaaaatttt gectcaaaactggtgagetgaatttttgcagttaaageategtgtagtgtttttettagteegt tatgtaggtaggaatctgatgtaatagttgttaggtattttgtcaccattcatttttatetagtt gttctceaagtteggttacgagatecatttgtetatetagtteaacttggaaaatcaacgtatca gtcegggeggectegettateaaccacocaatttcatattgctgtaagtgtttaaatctttactta ttggtttcaaaacccattggttaagccettttaaactcatggtagttattttcaagcattaacat gaacttaaattcatcaaggctaatctetatatttgccttgtgagttttottttatattagttot tttaataaccactcataaatcctcatagagtatttogttttcaaaagacttaacatgttccagat tatattttatgaatttttttaactggaaaagataaggcaatatctcottcactaaaaactaattc taatttttegettgagaacttggcatagtttgtecactggaaaatetcaaagectttaaccaaa ggattccetgatttecacagttetegteatceagetetetagttactttagetaatacaccataag cattttccetactgatgttcatcatetgagegtattggttataagtgaacgatacegtecgtte tttccttgtagggttttcaatcegtggggt taagtagtgccacacageataaaattagettaogtt tcatgctccegttaagtcatagegactaatogetagtteatttgctttgaaaacaactaattcag acatacatctcaattggtetaggtgattttaatcactataccaattgagatgggctagtcaatag ataattactagtcettttcetttgagttgtaggtatetgtaaattetgctagacctttgctaga aaacttgtaaattctgctagaccectetgtaaattoecgetagacetttgtatattttttttatet atattcaagtggttataatttatagaataaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcc cagccectgtgtataactceactactttagtcagttcegeagtattacaaaaggatgtegcaaacg ctatttgctectetacaaaacagaccettaaaaccctaaaggcttaagtagcaccetegeaaget cgggcaaategetgaatattcocttttgtetecgaccateaggecacetgagtegetagtoettttto
    Fig 45D Gtgacattcagttcegetgegeteacggetetageagtgaatgggggtaaatggcactacaggeg cettttatggattcatgcaaggaaactacccataatacaagaaaagecegtceacgggettetea gggcgttttatggegagtetgetatatggtgetatetgactttttgotgttcagcagttectgo cetetgattttecagtetgaccactteggattatecegtgacaggtoattcagactggetaatog cacccagtaaggcageggtateatceaacaggetta (SEQ ID NO:55)
    e 101/172 Fig 460 A. - so 5 = 2a 4 ss 2 3 es es LÊ ? ã 310 ; : . o o . o 1 2 3 4 tempo (h) Fig 46B
    B s s E . 2% z 2
    GA : s 8% ' : o o o 1 2 3 4 tempo (1)
    Fig -46C c.
    E 5 Fra sê A « e F sra ºã s2. 20 BE da a Cras ano | nl To o - o 1 o 1 2 3 4 tempo (h) Fic 46D pD. | so s sas « P Bs 4 1, 2É as ' s o o o + 2 3 4 ' tempo (h)*
    Fig 46E E, so H as '
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    ' % 1 2 3 ú À tempo (h)
    Fig 47A No glucose-1 : 5 s 4 n S5 3 so <= 3 É E A 1 . ; = : o 1 2 3 í Í tempo (h) Fig 47B ê 5 : 4 — 5 = " ô z >» ; e e A ? no 8 1 Joe o : o 1 2 y . tempo (h)
    : 105/172 " Fig 470 açúcar invertido-1 7 5 8 4 - 5 sa 4 A 3 Ss O 2 a Pa " 8 o — 2 ÃO o ' eh 1 1em ' o à» o o 1 2 3 4 tempo (h) Fig 47D palha de milho-1 AFEX i 7 5 6 4 = 5 É a * es 2 o a 2 8 2 aà o o o o 1 2 3 4 tempo (h)
    Fig 48A ' 250 - fi A
    Ê 1 8 |-x- 1349 3 |70g 810 x. á LM ' o = = o 10 20 ao 4oº tempo (h) Fio 48B 250 8 à 150 830 9 $ 538 9 Ê a 134 9 8 100 3709 dee : o A o 10 20 30 4o tempo (h)
    : . 107/172 Fig 48C
    4
    4 3 Rº=0.9985 225
    2 ir à. 2 15 1 : os . o A. . O 200 400 600 800 1000 extrato de levedura (g)
    PE » a 108/172 Fic 49A 300 F 250 à 7 2 200 É 150 8 . 100 ê É so . o — o 10 20 30 . 40 so tempo (h) í Fig 49B o «120 - 3 $ 100 8 s 8o
    É e o ê $a 8 32 z Dao o 1o 20 30 ao so tempo (h) :
    . 109/172 Fig 49C 60 50 ? 40 s : 3 P 5 . 8 20 2 -: 10 o - o 10 20 30 40º so ' ] tempo (h) '
    Fig 50 Terminator mas.
    A . “Re AmpR ' PpIMupperpathway2 | r : soxbo f CAT pCiss mvaE í 'aprE promoter
    Fig 51A 51 tegetgegeteggtegtteggetaceggegageggtateageteacteaaaggeggtaatacggt tatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggecageaaaaggocag gaaccgtaaaaaggeegegttgetagegtttttecataggeteegececectgacgageateac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggegaaaccegacaggactataaagataccaggegttte ccecectggaagetecetegtgegetetectgttecegacectgcegoettacoggatacetgtoege ctttetecettegggaagegtaggegettteteatageteacgetataggtateteagttegata taggtecgttegetecaagetgggetgtgtgcacgaacececegttceagecegacegetgegect tatcecggtaactategtcettgagtecaacceggtaagacacgacttatcgecactggcageage cactggtaacaggattagcagagegaggtatgtaggeggtgctacagagttcttgaagtagtgg cctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatetgegetetgctgaagecagttacet teggaaaaagagttggtagetettgatecggeaaacaaaccacegetagtageggatagtttttt tgtttgcaagcagcagattacgcegcagaaaaaaaggatcetcoaagaagatoctttgatettttet acggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttagtcatgagattatcaa aaaggatcttcacctagatcettttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatata tgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatceagtgaggecacetateteagegatetat - ctatttegttcatecatagttgcetgacteceegtegtatagataactacgatacgggaggget taccatctggccccagtgctgcaatgataccgegagacecacgetcoacoggctecagatttato agcaataaaccagccagecggaagggecgagegeagaagtggtectgcaactttatoeogectes . p atccagtctattaattgttgcogagaagetagagtaagtagttegecagttaatagtttgcgca É acgttgttgccattgctacaggcategtggtgtcacgetegtegtttagtataggettcattcag ctecggtteccaacgateraaggegagttacatgatececcatagttgtgcaaaaaagegattago tcetteggtectecgategrtgtceagaagtaagttggecgcagtgttatcactcatagttatag cagcactgcataattctettactateatgecatecgtaagatgettttetatgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgceggegacegagttgetettgcecggegteaata cgggataatacegegecacatageagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttettogg ggcgaaaactctcaaggatettacegetgttgagatcecagttegatgtaacecactegtgcace caactgatcttcagcatcttttactttcaccagegtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaa aatgcegcaaaaaagggaataagggegacacggaaatattgaatactcatactettecttttto aatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgageggatacatatttgaatgtattta gaaaaataaacaaataggggttcegegeacatttecocgaaaagtgccacetgacgtctaagaa accattattatcatgacattaacctataaaaataggegtatcacgaggecetttegtetegege gtttcggtgatgacggtgaaaacctetgacacatgcagetceceggagacggteacagettatet gtaagceggatgcegggageagacaagecegtcagggegegteagegggtattagegagtgtega ggctggcttaactatgeggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatagatctggageta taatataaaaaccttcttcaactaacggggcaggttagtgacattagaaaaccgactgtaaaaa gtacagtcggcattatctceatattataaaagecagtcattaggecetatetgacaattectgaat agagttcataaacaatcetgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatage ggtaaatatattgaattacctttattaatgaattttcctgctgtaataatgggtagaaggtaat tactattattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccatggaataatagaaagaga aaasagcattttcaggtataggtgttttgggaaacaattteccegaaceattatatttetetaca tcagaaaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaataccagaga atgttttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctetaacttatcccaataacetaacto tcegtegetattgtaaccagttctaaaagectgtatttgagtttatcacecttgtcactaagaaãa ataaatgcagggtaaaatttatatcoettettgtttratattto
    Fig 51B ggtataaaacactaatatcaatttctgtggttatactaaaagtegtttgttggttcaaataato attaaatatctcttttetottocaattgtetaaatceaattttattaaagttcatttgatatace tectaaatttttatctaaagtgaatttaggaggcttacttgtoetgctttoettcattagaatcaa tecttttttaaaagtcaatattactgtaacataaatatatattttaaaaatatcccactttatc caattttegtttgttgaactaatgggtgactttagttgaagaataaaagacctatgcggtatgaa ataccgcacagatgcgtaaggagaaaatacegcatcaggegecattegecattcaggetgegea actgttgggaagggegateggataegggectettegetattacgecagetggegaaagggggata tgctgcaaggegattaagttgggtaacgecagggtttteccagtcacgacgttgtaaaacgacg gecagtgccaagettgcatgcotgcactocattttettetactatoraaaataacagactegtga ttttccaaacgagctttcaaaaaagectetgeceettgcaaateggatgcctgtcetataaaatt ccegatattagttaaacageggegeaataggeggecgeatetgatagtetttgettggogaatatt catcttatttcttoctecototeaataattttttoattetatocottttctgtaaagtttattt ttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacgga agcacacgcaggêtcatttgaacgaattttttogacaggaatttgcogagacteaggageattta acctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtcotattttogttottttot gtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagegagagatgatatacctaaatagagat 7 aaaatcatctcaaaaaaatagggtctactaaaatattattccatetattacaataaattcacaga j atagtcttttaagtaagtctactetgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgaaaacagt agttattattgatgcattacgaacaccaattggaaaatataaaggcagcttaagtcaagtaagt y gccegtagacttaggaacacatgttacaacacaacttttaaaaagacattccactatttctgaag : aaattgatcaagtaatctttggaaatgttttacaagctggaaatggccaaaatcocegeacgaca aatagcaataaacagecggtttgtceteatgaaattecogeaatgacagttaatgaggtetgegga tcaggaatgaaggccegttattttggegaaacaattgattcaattaggagaageggaagttttaa ttgctggegggattgagaatatgtcccaagcacctaaattacaacottttaattacgaaacaga aagctacgatgcgcctttttctagtatgatgtatgatggattaacagatgcctttagtagtcag gcaatgggcttaactgctgaaaatgtggccgaaaagtatcatgtaactagagaagagcaagatc aattttctgtacattcacaattaaaagcagctcaagcacaagcagaagggatattegetgacga aatagcceccattagaagtatcaggaacgettgtggagaaagatgaagggattegecetaattog agegttgagaagctaggaacgcttaaaacagtttttaaagaagacggtactgtaacagcaggga atgcatcaaccattaatgatggggettotgctttgattattgcttcacaagaatatgccgaage acacggtcttecttatttagetattattegagacagtgtggaagteggtattgatecagectat atgggaatttegeegattaaagecattcaaaaactgttagegegeaateaacttactacggaag aaattgatctgtatgaaatcaacgaagcatttgcagcaacttcaategtggtccaaagagaact ggctttaccagaggaaaaggtcaacatttatggtggeggtatttcattaggtcatgogattagt geccacaggtgetegtttattaacgagtttaagttatcaattaaatcaaaaagaaaagaaatato gagtagcttetttatgtateggeggtagettaggactegetatgetactagagagaccteagea aaaaaaaaacagcegattttatcaaatgagtectgaggaacgectagettetettettaatgaa ggccagatttctgetgatacaaaaaaagaatttgaaaatacggctttatcttegcagattgcca atcatatgattgaaaatcaaatcagtgaaacagaagtgccgatgggogttagottacatttaac agtggacgaaactgattatttggtaccaatggegacagaagageceteagttattacggottta agtaatggtgcaaaaatagcacaaggatttaaaacagtgaatcaacaacgcttaatgcgtagac aaatecgttttttacgatgttgcagatecegagteattgattgataaactacaagtaagagaage ggaagtttttcaacaagcagagttaagttatccatetategttaaacggggeggeggettaaga gatttgcaatategtacttttgatgaatcatttgtatcetagtegactttttagtagatgattaaga atgcaatgggggcaaatategttaacgctatgttggaaggatgto
    Fig 51C gcecegagttgttcegtgaataggtttgeggageaaaagattttattcagtattttaagtaattato ccacggagteggttgttacgatgaaaacggetattocagttteacgtttaagtaaggggageaa tggcegggaaattgctgaaaaaattgttttagettcacgetatgctteattagatecttategg gcagtcacgcataacaaaggaatcatgaatagcattgaagetagtagttttagctacaggaaato atacacgcgctattagegettettgteatacttttacagtgaaggaaggtegetaccaagaett gactagttggacgctggatggegaacaactaattggtgaaatttcagttceegettactttagec acggttggeggtgaccacaaaagtettacctaaatctcaageagetgetgatttattagcagtga cggatgcaaaagaactaagtcgagtagtageggctgttagtttaggcacaaaatttagoagegtt acaggccttagtcetetgaaggaattoraaaaaggacacataggctetacaageacgttoetttageg atgacggtcggagetactggtaaagaagttgaggcagtegeteaacaattaaaacgtcaaaaaa cgatgaaccaagaccgagcecatggetattttaaatgatttaagaaaacaataaaaggagagggt gacaattgggattgataaaattagtttttttgtgococottattratattgatatgacggcacto gctgaagccagaaatgtagaccetggaaaatttcatattggtattgggcaagaccaaatggegg tgaacccaatcagccaagatattgtgacatttgcagccaatgcegcagaagegatettgaccaa agaagataaagaggccattgatatggtgattgtegggactgagtocagtategatgagtcaaaa + geggceegeagttgtettacategtttaatggggattcaacetttegetegetetttegaaatea - aggaagcttgttacggagcaacageaggettacagttagetaagaatcacgtagecttacateo agataaaaaagtcttggtcgtageggcagatattgcaaaatatggcttaaattctageggtgag cctacacaaggagetgggageggattgcaatattagttgctagtgaacegegeattttagetttaa - aagaggataatgtgatgctgacgcaagatatctatgacttttggegtecaacaggecaceegta tcetatggtegatggtectttgtoaaacgaaacetacatccaatcettttgcccaagtetgggat gaacataaaaaacgaacecggtcttgattttgcagattatgatgctttagegttecatattectt acacaaaaatgggcaaaaaagecttattagcaaaaatctcegacraaactgaagcagaacagga acgaattttagcccegttatgaagaaagtatogtctatagtegtegegtaggaaacttatatacg ggttcactttatctgggactcatttccocttttagaaaatgcaacgactttaaccgcaggcaato aaattggtttattcagttatggttctagtactategetgaatttttcactggtgaattagtago tggttatcaaaatcatttacaaaaagaaactcatttagcactgctggataateggacagaactt tctatcegetgaatatgaagccatgtttgcagaaactttagacacagacattgatcaaacgttag aagatgaattaaaatatagtatttctgctattaataatacegttegttcettatogaaactaaaa aaaaccggcettggececegeegattttttattatttttettoctecegeatgtteaateegetec ataatcgacggatggeteccetetgaaaattttaacgagaaacggegggttgacceggctoagte cegtaacggecaagtectgaaacgteteaategecegetteceggtttooggtceageteaataeo gtaacggteggeggegttttectgatacegggagacggeattegtaategggatececgggtac cgagetegaattegraatcatgtceatagetatttectagtatgaaattgttatccgotoacaatt Cccacacaacatacgagceggaageataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagetaac tcacattaattgegttgogeteactgocegetttecagtegagaaaccetgtegtagccagetgca ttaatgaatcggecaacgegeggggagaggeggtttgogtattgggegetettecegettectog ctcactgac (SEQ ID NO:56)
    Fig 52 , Apré promotor Net l6o7m. an . PS EcoRI (698) f CFITAS f pBS Kudzut2 Kudn fspS | ss. dat (1524) À b rotas À “NectO924) X stopcodon Se 7 “teminator j Neon Ss MÓ Ne Bambi 2519) TA A Nascem) ApolI (90d) % His) = “Apoli (2806) +
    Fig 53A - 280 F 240 DS RE tias em te tr 2003 df, - - NA er o 160 o A o tr = er oo O pag def oo ano ee enc so NÚ me ea renata ta pune altere a] amenas entatet) vma 4o : sea o o 20 40 so 80 100 120 tempo (h) : - Fig 53B g 35 $ so1d. te ca AAA 3 26d 000 / É 20 Po ndo eo msm menino $ 16 do fa ces o e cs oo É todo cem mo ce mimo e 85 é : o 2 o ã o 20 4o so so 100 120 tempo (h) == Controle! —e CF443
    Fig 54 280 72 E 200 g 160 2 120 = s 80 s 40 - ol | O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tempo (h) : Fig 55 postem mrmmmeememamn] a - 2 8 215
    E e Ss ã 8 805 2 2 . Do 7 7 O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tempo (h)
    Fig 56 18 16 ' 14 12 E 10 $ 8 à 6 8 Pa
    2. o 7 O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tempo (h) Fig 57 í 1000 s s p s i a : 2 100 8 s 8 E o
    E Ec 1 O 5 10 15 20 25 30 35 40 tempo (h)
    Fig :58 25 g gg 2 8 : 315 Bt ê ã 1 s Í 8 eos 2 o o 5 10 15 20 25 30 35 40 tempo (h) z Fig 59 25 + 20 ês | Í | 2 ão
    É o o 5 10 15 20 25 30 35 40 tempo (h)
    Fig — 60A-60C A.
    B Cc ro e eme tirada | pereira meme eee To oo ! ão ds : í às is ! Es 1 E» i NS i ê .. 1d ! e Ped TTIRERTARA CTodegridios QIIIIZIZDOO F 614-61C . A B Cc mp gap | au— 1a” £ ! o o à» j : A á Í 1 | à. ! 13 ES a D di Po Gn—— o remar E encaram remo A arareamreraretmear tempo (1) tempo (h) tempo (h) F 28 62A-62C A B c pt tt & É 1 1ão à Í Í ij ão i 3 j ão» is ! o Í is b i VE 1 Tamo a Ear UE mom mas do ma a os tempo (h) tempo (h) tempo (h) F re63A-63C A B Cc Amo comeca cama esc] go BM us teams tes secas 204 Ms om o ee cmo 4 À) ão ge j 1 do = ís 12 | : ! TETEIRIETES CSTVISIRSSSTES Ce TRTRIIS
    Fig — 64A-64C : A B Cc ED io | . ião ão ; i E [E : ã pão iz Í ão” is | de i 18 ; e i ; jÊ, VÊ Í TIRAR O CITWISIDEITe CoTRIEILTTs Fig —65A-65C A B [o Mep rea gap esa | ep is e ! 1º jo eo Í | [s FÉ | : a FA ão i ; dês sê | MTERpanEATES CTUTERISATES STR (orESRWEDESO Fig 66A-66C
    A B C jd 1 ! : | és 1d Í FF E js Í : Dão Dz | â ão : 1 Í ; jêes ão ! TRINTA CUTATIEITITORDA CV TViSTITTIDSS Fig 67A-67C A B Cc Í i. | gm : º [ds | é. ! ; .” 1 | o Em 1d | ; Êo, 1 E, | TreimignerE: CTT Eos Corvos ciníTITS s Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogêni ' 2500 Pp! ie xigêni itrogênio 2000 AR B e - E
    É ES s 1500 IIS 8 SS 2 E gatas 10 ê AE Tn Shao acaTaDE js 1000. LR A E LL As sc oo, ss TZSpeom texoaanats É TA ZE: | sopro AM MNDOTEANA —eopreroem & : ——opreroem 1250288% Nº : so0 —— eoprero em 119%02T9tNZ ——lkoprenaem 10%0290XNE . —— kopreroem GORE —oprenaem grucenenha TT Mopremem rxoomee o o 2 4 6 [ “o nr nu" Concentração de combustão fnwt.%). e Fig 68 : :
    | Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio . i i (amHOsubstavtes Ny) já NASBASRERA O o ASAS BAAÊNHA: NR ÁTE : é o AEE Em | ãs E 3 1500 AZESSS MÁ Es Li LEE = —
    E E Ê =àn——— —exionsrce nte . — REA Eo —EONTLCLRTAE
    VM EE . — eeonacenmon ——AAXHEONION CRETA — exeomcaende — mutormotnda en HCOTCIAMOS o o 2 Do. 6 8 1o e " Concentração de combustão [wL%) Fig 69 2 :
    p Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio í . (56% CO, substatutes N2) : à aus auaNNSAL o NES ANNE NaSAçSA 2000 LT s = 150 Pa ; : SS É = ET à LEIS — exame, E 1000 CRE = w — somente | Fr — AXO2/BIAN2/SACOO.
    A A — IO TaNNHANCOS —YIOREINNAAÇOR —NxOORMANDAÇCOR mm OKCUEEANESACOS. — RORTTAN/ACOR — TNOBTENNAADO cr bNDRTEIANDAADOR o 7 o . 2. 4 6 8 10 112 4 Concentração de combustãolwt.%] ' : í Fig 70 nr ue * Táopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio ' p (10% CO, substatutes N.) . Í f o AC : : :; CÁ
    S VS Sho OE 8 SS 3
    E HT ROUNNENTAÇOE ê AZ —megmaaneicos É 1900 / EE = — texoeeenmAcOs Ê a aa A — excomstdmcos | O exoonentanacoe — tetos : igxoemma e nTicos —txcommaeincoa E = rogmmaeNoAÇOS : Lmogt mentos x mogmnan TAC: - TD Monaco o . o 2 4 6 8 to 12 14 . Concentração de combustão [wt%] ' Fig A
    Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio ' ' : (15% CO, substatutês N) : A E o ema o “ 2000 - F : o Á 3 ES S 1500. ÊIOS . SS 1500 / s s CSI —imaensentço À É [<= =—= — exobenanco: | : E 1000 FERROS E ca — smormmuensico: | Fr Ee O co XONTINXAWNSAÇO? ||| imoemaneneçdo || : ——tnxoaTANenNsADOS || —ixoamaNentácos | 500 mes 10RC0TSNDNISACOR — mL OBTTANANSAOO2 - — xOUTERNANTAÇOS
    ACO TRANANSACOE o - o. 2 4 6 os 1o 12 uau Concentração de combustão fwt.%) ' Fig 72 ] .
    ne ' Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio E * 20%.CO, subsiahtés No) ”
    EA ã na ã Se AÁZESS e s g
    MAR ê E iricanraaemeos, 1 EEE Es sos o = stcnstanmico: | iStoammenencos | : Tiefaemenos | iRamentos | : o —troemmnandos | cimenaaçoo: - tr Beernaaemess PS 2 4 6 8 10 12 14 : Concentração de combustãofwt.%) . Fig 7
    ' Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio : | : - : PÁ 3 SEER = 150 AZ : DÁ SEE en | É inoeguventoe | ê ARS Et anda sm O RE ss Eos cena cc guoomvenaã | pra | : —2XO2/BN2IOR.COR —txoomANDAADO: | ES —iokDemmANAmcOs | “e—comNAAcO | romena | i —excomnNanAcO | o o 2 4 6 8 10 12 14 ' Concentração de combustão lwt.%! Fig 74 É
    TE Tao ro OT Concentrationat Defagratiot mo o CT Uni! Makevp + Oxddizer Makeup — > > MolarConcentration based on 160g ot sample | : deal gas law. . Fuel Oúddizer UC À : . 1 Cons Cone”. lscprene HO, Ox, “Neo fsopreno HO. O No, Total, lsoene “O UN HO E) o fee o pesa oo SS o 2 dmeis). (melo) tmele) +. fe 2 x pot: x o
    2.10 9690 100 - O: 12 BB - 4566 000, 3634 30454. 34544 132 1052 BIG 000 910 9690 100 o 18 8 4.56. ,0.00 - 3937 20108 245017. 132 ;1%4 6727 .o00| 310 —s60 10 “o 14 & 456 2000. 4239 29762 34457 132 1230 8837 * 000 310 9690 . 100 O, 15 865º 456 o 4542 29416 3440140 132 — dz ebás — c00]| 310 9690 10. O 16 8 456, 000 4845 29070 34971 133 1410 858 000
    3.10 9690 +. 100 0 17, 83 456 000 .5148 28724 24328 1% 1500 ess o00|. 310 969 100 0.21 79 456: 000 6359. 2/7340 - 341,55 - 1339 - 186 8005 000 350 9650 100 “O 111 889 515 000 33947 30639 34501 “149 D70 8881 o00| 440 9660 1007 O 12 8 ' 647” 000 3585 30046 34278 189 1046 8765 000 550 9450 ./100 6 “13 8 280 000 3639 20363 34010 248 1129 “ess3 —000| 660 9340. 100 - 0. 14 86 97 000 4086 28687 33744 288 1211 650. 000 76 8240 30 O S 6 1118 000 4331 28050 00499 ; 334 1256 8373 000 850 9150 100 COCO 16 60 250 000. 45757 274500 008750 1076. 1375 6249 0000 980 9040 — 100 [0 17 8 14/2 (000 4603 26797 33011: 428 1455 8118 000 ã 13.50 8650. 100 O 21 79 198 000 5677 24405 32067 619 1770 7611 = 000 - . i Fig 75A sa 7 . =. - = 2 FE Nãoexplosivo . ea . [E e. " . ! . o 2 ad a é s NESTAS A Bo o cmo amo Cs 4 so 6 Cantos cds cao E O; Concentração (vol. %) á nm
    A e : [o es sie - Motar Concentratíon based on 100g of.
    Volumetric Concerirations based : takeup | Oxidizer Makeup o.
    E : onideal gas law.
    Com — Cons |isopene [HO O; Ne lsoprene.
    HO O Ne Total |isoprena O; Nº HO) x) 2 m Ke 3): | maes ímete) gates moles nóis | qo ALA) fal.) “3252 —96748| 100 | 4 12 84 | 478 2150 3626 20024 356281| 136 1028 8227 609 2274 967 | 100 | 4 13 83 | 48) 2149 3929 28672 25233) 137 1115 8is6 600 3290 96.710 100 4 " 82 484. 2149 4231 28322 351.86 1,38 1202 8049 611 . 3268 oTI2| 100 | 4 15 81 | 464 2140 4523 27977 35143] 138 1290 7961 612 3266 —o6714| 100 | 4 16 80 |. 483 2149 4896 27633 35101) t38 1978 7872 612| 3204 o67IS| 100 | 4 17 79 | 483 :2149 5138 27288 35058| 138. 1466 7784 613 3276 o6724| 100 [4 21 75 | 482 2140 6348 25908 34087| 138 1819 7426 616 3500 — 96500] 100 4 i16 845| 515 214 3468 29122 05249] 146 984 8262. 608 4200 o5800| 100 | 4 12 8 | 618 2129 3598 28740 35079| 176 1024 8188 607 5300 st] 100 | 4 13 83 | 779 20100 2847 28072 34803] 224 1105 8066 605 e 6400 —sa60o| 100 | 4 14 82 | 941 2080 4095 27411 GN528| 273 1186.7039 602 ' 7400 —s26o| 100 | «4 15 81 | 108 2058 4341 26788 34274| 318 1266 7816 600| 8500 1500] 100 | 4 16 80 1250 2033 4575 26143 34001 368 1346 7689 596 9400 —Soscol 100 é 17 79| 1382 2013 4803 25562 337,71] 409 1425 7569 596 f 12300 — 86700] 100 4 21 75 | 1956 1927 5600 23223 22795| 596 1735 7081 567 Fig 76A 7 : 6 o. 5 . Na , t . 2 ' í 1 1 : AO ! ês : À mo ANE 3 ] losi s, : pop Roc! : Não-explosivo 1 - 1 . K U BR d : : o : 8 s o non ” "n 1" 1" w oo os , .
  2. 2 Or Concentração (vol.%) ' . V Fig 76B
    : a E PES . | | CD ] ransducor DD | (tow) Á FP Hon [ esDkomr mea | | f ge asas Ag . FS / | momento Tâniter i quão
    TES AA (SET p : Fig 77 ' | :
    | QN Ss < e
    SS o = s eg 38 >. z e: Ê á e | & Sm - S E. cc 8: | Ez = o | 8 x 8 à | e í ”” Õ | 8 1 i js As | Ss * x * Ex co SS o co o < S ó bai = (%10A) oesenusasuoo Ho í Explosivos Não-explosivos O; Concentração CsHg Concentração O, Concentração CsHs Concentração " (vol. %) (vol. %) (vol. %) (vol. %) 210 1.5 21.0 14
    13.0 15 130 14
    11.0 16. . 11o 1.5 104 18 104 17
    10.0 19 : 10.0 18
    98. 2" 97 2
    10.0 22 10.0 23 . 10.4 25 . 10.4 2.6
    11.0 29 11.0 30 '
    13.0 40 13.0 41
    17.7 8.0 17.6 8.0 210 11.8 21.0 119 Fit 78B.
    j QN Ss *< e
    SN co 2 fr 8 a & =| 8 R|Z Ss : 2 Tx o 8 SI : W Ss = 6 ss = 8 8 OD = Sã C Ol. Seg Ss 7 o qa o“ 6
    S o d 2 M o co o e co o T SS o - — (9101) oesenusouoo Ho í o Ss úK o Ss co 2 El, $ã : | e — - < & õ - 1 oO õ..
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    Í . a o - co o o o o v ne o I ? (%IOA] oesenusouoo Ho
    1: Explosivos LF ENA - — Não-explosivos O; Concentração CsHs Concentração O, Concentração CH Concentração (rol. %) * (vol %) ol H) (vol. %)
    21.0 ST MTO. 0 AL o 11 Ú 210 . 118. ' 210 .. uo z 210 11.8 ' 210 119 ' o 2 e. 45 : asso 14
    21.0 A 15 0 220 2. 2 0.14 - 10.2 ' 20 210 ' 14 101 Íí RO 98 - o 20
    10.0 . 20 os so. 20 9 20 98 20 a . - Fig 79B e.
    Ú o o x o o 2
    E FR FT o — o ss == > : ' e | o o 'S, 8 | z E|é
    FE ox cu 1 = Ss, | iz o ! Sa | z | E qe z ] T à o 4 Z x o = co os o co o x o o - = (%104) oBÍSenuanuoo Enio
    TESTSERES 1 : ' Initial Partial Pressures Concentrations BR [ue] 520 Does ata at Ta, | mm || <C | bama |imbar' mbar mbar | vol% vol% vol.% bara 17 IrTtaÇOO | ao |. 1012 [72 7867 213 | 12 778 210 | NomrExplosion| 1.05 : 2 ITI1120701| 40 | 1016 | 16 787 218 | 16 775 210] Explosion | 55 3 fTH120702| 40 1.015 14. 788 213/14 776 210 | NonExplosion|<1.02 4 lTH120703| 40 | 1014 | 15 766 213] 15 775 2010 | NonExplosion | <1.02 ITN120704| 40 | 1014 1.15 766 213 | 15 775 210 Explosion | 491 6 |TINI20705| 40 | 1017 | 18 766 214 | 18 772 210 |. Explosion | 547 7 |T1H1207068] 40 | 1014 | 15. 786 213 | 15 775º 210 | Explosion | 451 8 IT1120707| 40 | 1014 | 14 78 213] 14 776 210 |NomExplosion|<1.02 9 IT1120708] 40 | 1014 | 14 787 213 | 14 776 210 |NonExplosion| 1.05 |Tt11120709] 40 | 1015 [102 700 213.100 690 210| Explosion | 145 7 17 IT1120770]| 40 | 1014 | 102 6% 213 /101 689 210| Explosbn | 139 12 |T11120711| 40 | 1014 | 106 65 213 /105 685 210) Explosion | 134 13 |T1120712| 40 | 1014 | 113 68 2138 111 679 210 | Explosion | 129 - 14 IT11120713] 40 | 1014 [122 679 218 /120 670 210 | NonExplosion| <1.02 " 15 |T1N20714| 40 | 1014 | 117 68 2138 | 115º 675 210| Explosion | 1.32 16 |TH120715| 40 | 1014 | 120 681 213 |/118 672 210 | NomExplosion| 1.08 17 |TH130700] 40 | 1014 | 120 681 2018 |/118 672º 210 | Explosion | 109 18 THI30701| 40 | 1014 | 121 680 213/1179 67t 210 | NomExplosion| 1.07 19 |TI111390702] 40 | 1015 | 121 681 213 |/119 671 210 |NomExplosion| 1.06 |T1130703] 40 | 1.015 | 124 681 213 119 671 210 |NomExpiosion| 1.07 21 |T1130704| 40 | 1035 | 30 853 132| 30 80 130 | Explosion | 161] 22 |T11130705| 40 | 1.014 | 36 846 132| 36 84 130| Explosion |. 128 23 |T111307068| 40 | 1014 | 39 843 132/38 81 190] Exposin'| 112 24 |T1190707] 40 | toiws5 | 41º 82 132 / 40 830 130 | Explosion | 1.09 |TM10708| 40 | 1014 | 42 80 132/41 828 130 |NonExplosion| 1.06 26 ITI1130709] 40 | 1015 | 42 81 132/41 69 130 | NonExplosion| 1.06 27 |rT1190710| 40. | 101 | 42º 80 132| 41 88 130 | NomExplosion| 1.05 : 28 |T1130711 | 40 | 101 | 15. 867 132 | 15 855 130 | NomExplosion| 1.03 | 29 |Ti130712| 40 | 1.014 | 16 86 132| 16 854 130 | Explosion | 481 so |TI130719| 40 | 1014 [15 667 132.) 15 865 130 | Explosion 4 31 ITi1130714| 40 | 101 | tá 868 132 | 14 856 130 |NonExplosion| 1.03 32 I|Ti1130715| 40 | 10% | 14 668 132 | 14 856 130 | NonExplosion|<1.02 33 ITH1130716] 40 | 1014 | 14. 868 132 | 14 856 130 | NomExplosion| 1.03 |” 34 | TI11130717 | 40 1.015 | 20 883 112] 20. 80 110 | Explosion 17 1 ITI130778| 40 | 1014 | 28 874 112 28 862110 | NonExploslon| 1.08 s6 ITI190719]| 40 | 1014 | 28 874 112/28 862 110 | NonExplosion| 1.08 87 |TI1130720| 40 | 1014 | 28 84 112/28 82 110] Exploson | 113 .| s6 ITI1M130721 | 40 | 1015 | 29 874 112] 298. 861 110 | NonExplosion| 1.08] 39 jTINAONT22| 40 | tom | 2 8a 112 | 29 861 110 | Explosion | 11 t Fig S80A : :
    ; Data Fãs Temp] ísa | ParialPressores | - “Concentrations Tp "o Test | Afro P' | Pressure | CH Nzo O OH NE 0] Rest ' < | tam fmbar mbar mbar | vol% vol vol% | bara 40 f[Tinmaozas | ao | 1014 | 30 872 112 | 30 860 11,0 | NorExplosion| 1.08 . 41 |Ti1130724 /.40 | 1014 | 30 872 112 | 30 860 11.0 | NonExplosion | 1.05. 42 |TIN130725| do | 1014 | 30 872 12 | 30 80 110 | NomExploston| 1.05 | * 43 |TI1H1390726| 40 | 1014 | 15 87 112| 15 875 110 | NorExploslon|<1.02| : R 44 | T11130727| 40 1014 | t5 87 112] is 85 1910 | NonExplosn|<1o2] 45 |TI11140700| do | 1014 | 16. 886 112 | 16 874 110 | NonExploskn | <1.02 46 |Ti11140701 | 40 | 1014 | 17 886 112] 17 83 110 | - Explosion | 181 47 |Ti1140702| 40 1014 16 ess 112 “se 87.4 11.0. Explosion .| 1.54 . 48 |T11140703| 4o | 014 | 15 887 112 | 15. 875. 11.0 | NonEgplosion |'<r.02 49 |TI11140704| do | 1015 | 20 8 o | 20 865 95 | NomExplosion| 1.05 so |T11140705| 40 | 1014 | 20 89 296 | 20 e&6 95 | NomExplosion| 1.05 51 |TI11M0706 | 4o'| 1014. | 23 890 101/23 86878 100 | NonExplosbn|.1.05 : 52 |TI11MO707| do | 1015 | 23 886 106 | 23 873 104 | Exposin | 119 “| 53 [TI1140708] 4o | 1014 [| 25 884 105| 25 8,2 104 | Explosion | 109 54 IT1140709| 40 | 1014 | 25 883 105 | 26 81 104 |NomExploson| 1.05 Ú 55 [TI1140710] 40 1.014 26 883 105 26 87.1 10.4 | Non-Explosion | 1.06 56 | T19140714 40 1014 26 883 105 26 87.1 10.4 | Non-Explosion | 1.07 57 | T11140712 4o 1.014 20 882 105 20 87.7 104 Explosion 121 E: 58 |TI140713 | 40 |. 1014 | 17 862 os | 17 880 104 | NomExplosion| 1.04 s9 ITI140714| 40 | 1014 | 18 899 105 | 18 879 104 | Explosion [121 6o |TI1MO715| 40 | 1014 | 417 882 105 | 17º 880 104 | NonExplosion| 1.03 : 61 |TI1140716| 40 | 1014 | 17 882 105 | 17 80 104 | NonExplosion| 1.08 62 |T11140717| 40 | 1014 | 26º 890 103/21 88 102 | Exposbn | 11 63 |T11140718| 40 | 1014 | 24 89 102/21 89 101| Explosion | 109 64 | T11140719 4o 1.014 2 soe 101 21 88.0 100 Explosion 1.09 65 [| TI1140720 | 40 1.014 2 8 101 22 879 100 Explosion 1 ) 66 iTiMMOT2t | do | 1014 |. 23 80 101/23 878 100 |NonExplosion| 1.08 67 |TI140722| 4o | 1014 | 23 690 101 | 23º 878 100 | NonExplosion| 1.08 68 |TI1140723| 40 | 1014 | 19 89 101 | 19 e&82 100| Explosion | 112 69 |TI1140724| 40 | 1014 | 18 896 101 | 18 83 100 | NonExplosion| 1.06 | 70 fTt11M0725]| 40 | 1014 | 18 66 101 | 18 83 100 |NorExplosion| 1.03 71 jTIN0726]| 40 | 1014. | 18 895 101 | 18 83 2100 |NonExplosion| 1.04 72 |TinmaoraT| ao | 1014 | 20 65 so | 20: 83 98 INonbôqpOsont 1.08 | - 73 |TINOTAS | 40 | toi | 20 86 069 | 20 883 98 | Exqpksn | 11 : | 74 ITiMMOT29 | do | 1014 | 20 so6 .98 1 20 884 97 INonExptosion| os | 75 |TINA07390| 4o | 1014 | 20 686 o | 20 6884 97 |NomExplosion| 1.08 1 76 |T1N14O731 | 40 | 1014 | 20 s6 o / 20 84 97 |NorExqiosion| 107 77 |TI1MO732 |. 40 | 1014 | 6h 761 172] 80 750 170 | NonExplosion| 1.04 78 |TI140733| 4o | so: | 84 750 183] 80 740 180| Epson |'13 79 |TI11140734| 40 | 101 | 8 754 179/80 744.177 | Explosion [124] f so |T11140785| 4o | 1014 | 6 757 176 80 747 174 | NomExplosion| 1.03 81 |TI1140736| 40 | 1014 | 8 756 178 /,80 745. 176 | NomExplosion| 1.05 ' 82 |TI140737| 40 |. 1014 | 81 756 178 | 80 745º 178 | NonExplosion| 1.03 83 |T11140738] 40 | 1064 | 81 755 178] 80 745 178 | NomExplosion| 1.03 Fig SOB :
    tnítial Partial Pressures Concentrations = elioeda at Cc bara imbar mbar mbar mbar|vol% vol% vol% vol%| —: | bara : 1 [T1I50700| 4o | 1014 | 41 119 6 213/40 117 632 210 | Explosion [133 2 (T11150701 | do 1014 40 121 640 213 ao 11.9... 631 21.0 | Nonexplosion | 1:07 3 |T11150702| 40 1.014 41. 120. 640. 213 | 40 11.8 631. 210 Explosion. 1.09 4 |TI11507039] 40 1.014 40 121 640 213| 39 11.9 631 21.0 | Norexplosion| 1.06 [TI11150704| 40 1.014 40 120 641 213| 39 118 62 20101 Explosion 1.09 6 |T1150705| do | 1014 | 40º 121 640 219 | 39 119 631 210 | Nonexplosion|1.08| T 7 fi150706] 40 1.014 4o 15 746 213/39 15 736. 210 Explosion 4.68 8 |TI1150707 | 40 1.014 a“ 15 745 2138 40 15 735 210 Explosion s27 9 | T11150708 | 40 1.014 41 14 746. 213 | 40 184 736 - 21.0 | Nonexplosion | 1.03 | T11150709 | 40 1.014 4e 14 745 213| 41 14 + 735 21,0 | Nonmexplosion | 1.03 11 | T11160700 | 40 1.014 n 14 746 213| 40 14 736 201.0 | Norexplosion| 103 12 [T11160701 | 40 1074 “u 20 850 103| 40 20 838 102 Explosion 11" Ú 13 [TI11160702| 40 1.014 4“ 20 851, 102| 40 20 83.9 101 Explosion 1 : 14 | TI11160703 | 40 1014 a“ 20 852 100 4o 20 840 100 Explosion 1.09 | T11160704 | 40. | 1.014 4a 20 853 100| 40 20 sas ao Explosion 1.09 16 | T11160705 | 40 1.014 ES) 20 854 “99 4.0 20 84.2 9.8 | Non-exploslon | 1.07 - 17 [T11160706 | 40 1014 4o 20 855 9 39 20 843 9.8: | Non-explosion | 1.06 18 | T11160707 | 40 1.014 41 20 854 99 40 20 842 9.8 | Nonexplosion | 1.08 Fi 81
    Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio . : (3am) . : = o
    S SS 150 EIS = SS - É som == Z TX Sfercen irtaaends E CC EE Es ALLE Aa e ek A a e eec—cc————— O sopreno em poxceraenda É Ee == —MotrOOM 1excOmEANa cn tnpreroen a9LcBATIDa TO soprenoen 1202/88 Na: 500 TT soprero em 1a ? — open em VURCRMTANE ——sopenoem PLOATANA —sopreno em ENCARAM . TD soreno em THQUSTENE F o AEE A Sort em Exonera O 4 2 838 4 - 5 6 7 8 9 10 it 12 13 4 : Concentração de combustão [w.%] Fig 82 :
    at Isopreno em ambientes de oxigênio / nitrogênio Ns : i (tam) mr
    E ÁÓÔII
    AS go Po ÁRRs SE | | ã : s 1500 LIS E : Ê* CSS eo dita E ê 1000 L<> o — Epa én fraeaa RAOL — sureno en 16xcenene Ss — hapreno em TWINS P — aero em WKORNANAZ — arena em PIRDSTANZ AA lero en texcena NE | : so — hapeno em VOTE : 7 — eogreno em 10%02HETAE — Seo Sm OeRIDE T lpemoen PeCRATC - = open em SXOAAO o o 2 a 8 8 10 12 u Concentração de combustão [wt.%] Fig 83
    14 posso sr imenso mesmmen a mom creo meme sismo é 36 menta rrememes mens mem o meses 3 0 men * NãoExposivos (3repeais) te Explosivos 12 | | Model Results 3aim = | - 10 : É 8 q 8 + 3 | ê 6 8 4 a 2 * 2 a
    2. A 6 Joiner te aee sta fas agarra tao denis do me ste ora ago meme do 8 10 2 14 16 18 20 22 - Oz Concentração (vol. %) . Fig 84 nu pn —— meras: dão Rerer rraen—o: e: Me NaoExplosvos 3 repeats) = Explosivos 12 | | Model Resuis 1 atm . | o Ê& 3 .
    º + : Í 6 8
    É õ | 4 + a" 2 E r PA +
    E A SA s 1o 12 “ 16 s 20 22 Oz Concentração(vol. %) Fig 85
    Abundância TIC: F13/ 27 9hr. full.Didata.ms 2200000 . 2 o5pobo Gases permanentes — (N2, O2, CO>z) 1800000 1600000 2: Metil -1,3- Butadieno 1400000 O 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 : 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 Tempo :--> Fig :86A . Abundância sa Tie F1327 9nrtulordaia me 5000) Ss | | N2, O2, CO? soc0o| Teoco! Tocoe| 65000) Isopreno snco0| = 5000] 0900 45000] ' 25000 ooo Acetona asoco| 3- MetiltButeno 11-01 So Elano! / 3- MetitButeno -1-0l - / soco] cencmanea tai nn eee mes, Tempo A PTOS 5 ass BRO ADO RD Fig 86B .
    Abundância TIC: F 13, cod tube Ordata.ms q 1265 'dÃão 1500000) 1400000) 2514 1300000 1200000) 1100000) 1000000 00000] soccoo| 1629, 7ococo| . abs + soc00o| 7 so000ol | 400000] k 7 300000) ste |
    200000. sem : | «sz e.706 f 200699) 2316 52864 galos 6.080 lzéõam | | sk) SO 7 dass 700 200 300 400 500 6,00 7,00 800 06.00 >” Tempo > Fig 87A Abundância TIC F13, 26h LaNZ Jong Oi date.ma. f am 25007
    2.45:07 30-07 220-07 21007, 2007;
    1.50:07]
    1.607 r1.7esor recon r1.50:07
    1.40:07]
    1.30:07 r.26:07] r10107 ram remo 000000] 8000000) 7000000 socnn0o| 1722 Soco0o| “4000000 2000000 2000000] d 1000000) im A Ti eta sussa BiSOTGIAAO A 765 200 300 400 500 600 700 800 Oo Tempo = Fig :87B
    Abundância TIG FI, 2Bnc LigN2 long. data ma ki 1a 170000] 225 160000) 150000 140000] 130000] 120000] 1.540 110000] 100000] 2as16 poco) se7s 80000 7ecoo| s2e1 60000 2212 60000] 4152 seno] ao | 30000 5194 5500 Nazis a eo À iara, PI Joss . Br 20% sec & 2000 a ol iam [Ls
    6.501.001.502.002.503.003.504.004,505.005.506.006.507.007.508.008.509.00. Tempo = Fig '87C Abundância TIG F13 29h LIGN2 Jona Didata.me 1000000 — pasa ERA soco 800000] 1.631 700000 "s00000) soco . : 400000, 2oc00o, 200000 2.315
    1.540 A 360000, 2212 | 158: 1,852 1/2023 21/2216 2461 740 150 1,80 1.70 1.60 1/60 200 2.10 2.20 280 240 250 Tempo = Fig 8D
    . A.
    B.
    Abundância Abundância . me emana st aa oena na as Te: ves guroane na, esco “es eso - | - ss ” “o ao ao - | - a A EE Free Ei Tm 2-methyl-1,3-butadiene standard.
    Td methyl-1,3-butadiene from recombinant E. coli > Fig 88A and 88B.
    Fermentation Off-gas Composition ( E. coli BL21 (DE3) pTreKudzu HGS w/ 3g/L yeast extract) 30 ' > —E— 3-MBA 2 ção . Ss E, de = o qu o 10 20 30 EFT (hr) Fig 89 cyclopentadiene - "isopiyne" = 3-Me-l-butyne trans-piperylene cis-piperylene 1-pentyne ! pent-4-ene-l1-ne trans-pent-3-ene-l-yne cis-peút3-ene-l-yne "
    Fig 91
    À
    RBS mvaE pTrcupperMVA 8000 bp .
    A "e
    ND : 7 mvas His Tag '
    Fig :92A E 1-
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    7 cticaatogtggtccaaagagaactggctitaccagaggaaaaggtcaacatttatggtggcggtattteattaggteatgcgatig gtgccacaggtgctegtitattaac gagtitaagitatcaattaaateaaaaagaaaagaaatatggagtggettctitatetategge Bgtggettaggactogetatgetactagagagaccteageaaaaaaaaaacagecgattttateaaatgagtcctgaggaacge sá ctggottetettottaatgaaggecagattictgetgatacaaaaaaagaatitgaaaatacggctitatettcgcagattgecaateat atgattgaaaatcaaatcagtgaaacagaagtgccgategecgtiggcettacatitaacagtggacgaaactgattatitggtacca atggcgacagaagageccteagttattgcggcttigagtaatggigcaaaaatagcacaaggattitaaaacagigaatcaacaao gcttaatgcgtggacaaategtitittacgatgttgcagatcccgagtcatigatigataaactacaagtaagagaageggaagttt tcaacaagcagagttaagttatecatetatogttaaacggegceggeggcttaagagatttgcaatategtacttttgatgaatcatttg tatctgtogacttitiagtagatgttaaggatgcaateggggcaaatategttaacgetatgttggaagetgiggcegagttgticos tgaatggittgcggagcaaaagattttaticagtatittaagtaatiatgccacggagteggttgttacgatgaaaacggctaticoas tttcacgtitaagtaaggggagcaategecgggaaatigetgaaaaaatigttitagcttcacgetatgettcattagatectiatogg gcagtcacgcataacaaaggaatcatgaategcattgaagetgtagtttitagetacaggaaatgatacacgegotgttagegette ttgtcatgcrtttgcggigaaggaaggtegetaccaaggetigactagttggacgetggatggegaacaactaatiggtgaaatite agttccgettgetttagecacggttggeggigecacaaaagicitacctaaatetcaageagetgetgatitgttageagtgacgga tgcaaaagaactaagtcgagtagtageggctgtiggtitggeacaaaatitageggegttacgggecttagtetetgaaggaatto aaaaaggacacalggctetacaageacgtictttagegatgacggteggagetactggiaaagaagtigaggcagtegeteaas aattaaaacgtcaaaaaacgatgaaccaagaccgagecatggetatittaaatgatitaagaaaacaataaaggaggtaaaaaaa catgacaattgggattgataaaattagttttitigigeccccttattatatigatatgacggcactggetgaagecagaaatgtagace ctggaaaattteatattggtatigageaagaccaaatggeggtgaacecaateagecaagatatigtgacatttgcagecaatgce gceagaagegatettgaccaaagaagataaagaggecattgatategtgattgtegggactgagtecagtategatgagteaaaa geggecgeagttgtettacategtttaatgegggattcaaccetttcgetegetotitegaaatcaaggaagetigttacggageaaca gcaggottacagttagetaagaatcacgtagecttacatecagataaaaaagtettggtegtageggcagatattgcaaaatatgg cttaaattctggcggtgagectacacaaggagcetggggcgetigcaatettagttgctagigaaccgegeatitiggetitaaaas aggataatgtgatgctgacgeaagatatctatgacttttggcgtecaacaggecacecgtatectatggtegatggtectttgicaa acgaaacctacatccaatctittigeccaagtctgggatgaacataaaaaacgaaccggtotigatttigcagattatgatgctitage gttccatattcettacacaaaaatgggcaaaaaagccttattageaaaaatetecgaccaaactgaageagaacaggaacgaattt tagcccgttatgaagaaagtatcgtctatagtegtegegtaggaaactigtatacggeticactitatetgggacteatttecettttag aaaatgcaacgactitaaccgcaggeaatcaaattggtttaticagitategtictggtgetgtcgelgaatititeaciggtgaatiag
    Fig 9B - tagctggttatcaaaatcatttacaaaaagaaacteatitagcactgctggataateggacagaactttetategetgaatatgaage catgtttgcagaaactttagacacagacatigatcaaacgttagaagatgaatiaaaatatagtatttetgctattaataataccgttcg ttcttatcgaaactaagagatctgcagetggtaccatatepgaattegaagetigggcccgaacaaaaactcateteagaagagg atctgaatagegecgtegaccateateateateatcattgagtttaaacggtetecagettggetgtittageggatgagagaagatt ttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaageggtetgataaaacagaatitgcetggeggcagtagegcggtggicaca cetgacccecatgecgaacteagaagtgaaacgccgtagegecgatggtagtgtggggtetecccatgcgagagtagggaact gecaggcatcaaataaaacgaaaggeteagtegaaagactgggecttegittatetgttgittgtcggtgaac getetectgagt aggacaaatccgccgggageggatttgaacgtigegaageaacggeceggagggtggcgggcaggacgecegecataaao tgccaggcatcaaattaagcagaaggccatectgacggatggectttttgcgtttetacaaactetttttgittattitictaaatacatt caaatatgtatccgeteatgagacaataaccotgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtaticaacatitecg tgtegecettattecettttttgcggcattttgcettectgititigeteacecagaaacgctggigaaagtaaaagatgcigaagatoa Egttgggtgcacgagtggegttacategaactegateteaacageggtaagatectigagagttiticgeccegaagaacgttitecaa tgatgagcacttttaaagttctgctatgtggegeggtattatecegtgttgacgecgggeaagageaacteggtegecgeatacae tattetcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaageatettacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgct gecataaccatgagtgataacactgcgeccaacttacticigacaacgateggaggaccgaaggagetaacegettttitgcaca acatgggggatcatgtaactegectigategitgggaaccggagetgaatgaagecataccaaacgacgagegigacaceacg : atgcctgtagcaatggcaacaacgtigegcaaactattaactggegaactacttactetageticccggcaacaatiaatagacte Batggaggcggataaagitgcaggaccacttetgegeteggeccettecggetggetggtitatigetgataaatetggagecggt Bagcgtgggtetegeggtateattgcageactegggecagatggtaagecetecegtategtagitatetacacgacggggagt E caggcaactatggatgaacgaaatagacagategetgagataggtgecteactgattaageattggtaactgtcagaccaagttt actcatatatactttagattgatttaaaacttcatttitaatitaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataateteatgaccaaaatec cttaacgtgapttttegttecactgagegteagacccegtagaaaagatcaaaggatettetigagatectetiticigegegtaatet getgettgcaaacaaaaaaaccaccgctaccageggtegtitgitigocggatcaagagetaccaactetttttccgaaggtaact Eecttcagcagagegeagataccaaatactgtoctictagtgtagecgtagttaggecaccacttcaagaactetgtageacege ctacatacctegetetgetaatectgttaccagiggotgotgecagtggegataagtegigtettacegggtiggactcaagacgat agttaccggataaggegcageggtegegctgaacggggggitegtgcacacageccagettggagegaacgacctacacog aactgagatacctacagegtgagetatgagaaagegecacgeticeegaagggagaaaggcggacagetatecggtaageg gceagggteggaacaggagagegcacgagggagettecagggggaaacgcctegtatetitatagtcetgtegggiticgecar ctetgacttgagegte gatttttgtgatgctegtcagggggecegagectatggaaaaacgecageaacgegecctttttacggtt cetggcettttgctggectttgeteacatgtictttectgogitateceetgattetgiggataacegratiacegeceigagrgaget Bataccgetegecgeagecgaac gacegagegeagegagteagtgagegaggaageggaagagegectgatgeggtatitt ctecttacgeatetgtgcggtatiteacacegeatatggtgeacteteagtacaatetgetetgatgcegcatagttaagecagtata cactecgcetategetacgtgactgggteatggetgcgeccagacacecgecaacacecgetgacgegecetgacgggetigic tgeteccggeatecgettacagacaagetgigaccegtetecgggagetgeatgtgtcagaggtiticacegicatcacegaaacg cgegaggcagcagatcaattegegegegaaggegaageggcatgcatitacgtigacaccategaatggtgeaaaacctttcg cggtatggcatgatagegeceggaagagagtcaaticagggtegtgaatetgaaaccagtaacgtitatacgatgtegcagagta tgccggtetetettateagaccgtttecegegtggigaaccaggecagecacgtitetgcgaaaacgegggaaaaagtggaago Egcgatggcggagctgaattacaticccaacegegtggeacaacaactggegggeaaacagicgttgetgattggegtigeca cetecagtetggecetgeacgegecgtcgeaaatigtegeggegattaaatetegegecgateaactgggtgccagegtagtas tgtcgatggtagaacgaageggcgtcgaagectetaaageggeggtgcacaatettctegegeaacgegtcagtgggetgate attaactatccgctggatgaccaggatgecattgetgtggaagetgectgeactaatgrtecggcgttatitettgatgtetetgace agacacccatcaacagtattatittcteccatgaagacggtacgegacteggcgtegagcatetggtegeatigggtcacragea aatcgcgetgttagegggcccattaagricigicteggegegtetgegiciggetggetggcataaatatetcactegeaatcaaat tcagccgatagcggaacgggaaggegactegagtgecatgiceggliticaacaaaccatgcaaatgctgaatgagegeatos
    Fig NC . . ttcecactgcgatgctegttgccaacgatcagatggcgctgggegeaatgegegecattacegagtecgggctgcgcetigats cggatatcteggtagtgggatacgacgataccgaagacageteatgttatatecegecgtcaaccaccateaaacaggattttog cctgetggggeaaaccagegtggaccgettgetgcaacteteteagggecaggcegigaagggeaatcagetgtigecegtet cactggtgaaaagaaaaaccaccctggegeccaatacgeaaacegectetececgegegitggecgaticatiaatecagetg geacgacaggtttecegactggaaagegggcagtgagegeaacgcaatiaatetgagttagegegaatigatetg
    (SEQ ID NO:86)
    ! Fig :93 1000
    F o 2 100 8 s 8 8 10 ê kl q O 5 1015 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tempo (h) » : Fig 315 ql ta a error neo pat " go : das 8 22 ss ã 3 1 8 8 os
    É o - O 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55 60 tempo (h)
    Fig 55 Ê 25 ques snsc arremesso meta 20 ii 8 1 810 3 2 . 5 o O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tempo (h) Fig 9% : 250 E 2 200 8 o 2 150 8 s e 3 100
    É S so o O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tempo (h) '
    Fig 97 : BE qto voo rom
    82.5 ' 8 82 : =15 ê g 3 . e 2º” . o o 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tempo (h) : Fig 98 quentes eita ntnas censor rnseememen TT" 7 18 16 . 14 a | 2 10 38 2 6 4 2 o o 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tempo (h)
    Fig 99 õ 1000 qui osso nto res rr riimemeremrettnctscstarsrararmnen—— É | à 2 100
    E ê 8 8 10
    É 8 1 O 5 101 52 O 25 30 354 04 5 50 55 tempo (h) Fig 100 í 1.6 q no ant nte em ceirmnee e rm—nr————==— g14 É S12 8 sz
    E 708 $ 8 os e 04 8 e E 0.2 o . 4 O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tempo (h) '
    Fig 101 f 2 BO qo = re rmem—————— £ ã $ so e gE 100 2 À 300 8 8 200 Ss É 100
    É O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 65 tempo (h)
    Fig 102 lac operator Ptro L—l/E RBS é FER repA Vea Rx, oo Re RÉ Wr, — mvaE & AS % 2 | pCLPtrcUpperPathwayHGS2 — o vo o . ada? SS E
    A E / m . x > > É vas “se, , (LLLUILTO RBS
    CR FA rn terminator His Tag IspS (fragment am plified from MCM Pa 1(566) :
    Fig 103A -
    . cccgtettactgtegggaattcgegttggecgatteattaatgcagattetgaaatgagetgttgacaattaateatecggctegtata atgtgtggaattgigagcggataacaatiteacacaggaaacagegecgetgagaanaagegaageggeactegctetitaacaa tttatcagacaatctgtgtgggcactegaccggaattategattaactttattattaaaaatiaaagaggtatatattaatgtatogatta aataaggaggaataaaccatggatccgagcteaggaggtaaaaaaacatgaaaacagiagitattattgatgcattacgaacace aattggaaaatataaaggcagettaagicaagtaagtigccgtagacttaggaacacatgtitacaacacaactittaaaaagacatto cactatttctgaagaaatigatcaagiaatctttggaaatgititacaagctggaaatggecaaaatecegeacgacaaatageaat aaacagcggtttgtcteatgaaattcccgcaatgacggttaatgagetetgcggatcaggaatgaaggecgitatitiggcgaaac aattgaticaattaggagaageggaagttitaatigetggegggatigagaatatgtcccaageaccetaaatiacaacettttaatta cgaaacagaaagctacgatgcgecttttictagtatgatgtatgategattaacggatgcetttagtegtcaggcaatgggcttaac tgctgaaaatgtggecgaaaagtatcatgtaactagagaagageaagatcaatiticigtacaticacaatiaaaageagetcaag cacaagcagaagggatattcgctgacgaaatagecccattagaagtateaggaacgctigiggagaaagatgaagggattcge cetaattcgagegttigagaagetaggaac; gettaanacagttittaaagaagacggtactgtaacagcagggaatgcateaacea ttaatgatggggcttetgerttgattatigoticacaagaatatgccgaageacacgetettecttatitagetattaticgagacagtgt ggaagtcggtatigatecagectatateggaatitegecgattaaagecaticaaaaactgttagegegeaateaacttactacgg aagaaattgatctgtatgaaatcaacgaagcatitgcageaacttcaategtegiccaaagagaactggotitaccagaggaaaa ggtcaacatttatggtggcggtatiteattaggtcatgegattggtgecacaggigetegtttatiaacgagtttaagttatcaatiaaa p tcaaaaagaaaagaaatatggagtggettctitatgtateggcegtegettaggactegetatgctactagagagacctcageaaa aaaanaacagccgattitateaaatgagtcetgaggaacgectggettetettettaatgaaggecagatttetgctgatacaaaaa aagaatttgaaaatacggctttatettegcagatigecaateatatgatigaaaatcaaatcagtgaaacagaagtgccgatgggo
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    Fig 103B : gaagatgaattaaaatatagtatttctgctattaataataccgttcgttottategaaactaaagatetgeatectgcattegecetiag gaggtaaaaaaacatgtgtgcgacctetteteaatitactcagattaccgageataaticcegtegttccgcaaactateagecaaa ccetgtggaatttcgaattcctgcaatecctggagaacgacctgaaagtggaaaagetegaggagaaagegaccaaactegagg aagaagttcgetgeatgateaacegtgtagacacecagecgetgtecetgetggagetgategacgatgtgcagegectgggte tgacctacaaatitgaaaaagacatcattaaagccotggaaaacategtactgctggacgaaaacaaaaagaacaaatetgacct geacgeaaccgetetgtettticegtetgetgegtcageacggtttegagetiteteaggatgtttttgagcgtttcaaggataaagaa getegrttcageggtgaactgaaagetgacgtecaaggectgetgagectgtatgaagegtettacetgggtitoegagggtgaga acctgctggaggaggegegtacetritecateaccecacetgaagaacaacctgaaagaaggcattaataccaaggtigoagaao aagtgagccacgccctggaactgccatateaccagegtetgcacegtetggagecacgrtggttectaggataaatacgaacega aagaaccgcatcaccagetgctgetggagetggegaagetggattttaacatggtacagaccetgeaccagaaagagetgcaa gatctgtccogetggiggacegagatgggectggetageaaactggattitigtacgegacegectgatggaagtttatitetegge actgggtatggegecagaccegeagtttggigaatgtegeaaagetgttactaaaatetttggtetggtgacgateategatgacg tgtatgacgtttatggcactetggacgaactgcaacteticacegatgctgtagagegctgggacgttaacgctattaacacectg ccpgactatatgaaactgtgtticctggeactgtacaacaccgitaacgacacgtectattetaticigaaagagaaaggicataac aacctgtectatetgacgaaaagetggegtgaacigtgcamagectttetgcaagaggegaaatggtccaacaacaaaattatec cggetttetecaagtacctggaaaacgecagogtttectoctecggtgtagegetgotggegecgtettactiticogtatgecage z agcaggaagacatetecgaccacgegetgegttecetgacegacttccatggietggtgegttetagetgegttatettecgectg tgcaacgatctggecacetetgcggeggagetggaacgtggegagactaccaattctateattagetacatgcacgaaaac, gat gglaccagegaggaacaggeccgegaagaactgcgtaaactgategacgecgaategaaaaagatgaategtgaacgegtta 7 gegactecacectgetgoctaaagegtteategaaategeagttaacatggeacgigittccecactgcacetaccagiategegat Bgtctgggtegeccagactacgegactgaaaaccgcateaaactgctgetgattgaccettitecegattaaccagetgatgtatgt ctaactgcagctggtaccatatgggaaticgaagettgggeccgaacaaaaacteateteagaagaggatetgaatagegecgt cgaccatcateatcatcateatigagtttaaacggictcagettggetgtittggeggatgagagaagatiticagectgatacaga ttaaatcagaacgcagaageggtetgataaaacagaatitgcctggeggeagtagegeggtggteccacetgaceceatgeog aactcagaagtgaaacgccgtagegecgatggtagtgtggggtetececatgcgagagtagggaactgccaggcateaaataa aacgaaaggctcagtegaaagactggecctitegititatetgttgitigtcggtgaacgetetectgagtaggacaaatecgecgg Bagce ggatttgaacgttgegaageaacggcccggagegtggegggcaggacgecegecataaactgccaggcateaaatta agcagaaggccatcctgacggatggcetttttgogitictacaaactetitrtgtitatititetaaatacaticaaatatgtatcegctea tgagacaataaccctgataaatecticaataatetggogtaatagegaagaggecegeacegategecettcecaacagitgcge agectgaatggcgaatggegectgatgcggtatitictecttacgcatetgtgcegtatttcacacegeatatggtgeacteteagta caatctgetotgatgecgeatagttaagecageccegacacecgecaacaccegetgacgagettagtaaagecetegetagat tttaatgcggategttgcgattacttegecaactatigegataacaagaaaaagecagectiteatgatatateteccaatitgtgtagg Bcttattatgcacgettaaaaataataaaagcagacttgacctgatagtttggctgtgagcaattatgtgettagtgcatetaacgett gagttaagccgcgccgegaageggegtoggetigaacgaattgitagacatiatitgcegactacettggtgatetegectitea gtagtggacaaattcttecaactgatetecgegegaggecaagegatettcttettgtecaagataagectgtetageticaagtat gacgggclgatactaggecggeaggogetecatigeccagteggcagegacatecttcggegegattttgceggttactgcget gtaccaaatgcgggacaacgtaagceactacatticgctcategecageccagtegggeggegagttecatagegttaaggtttea tttagegccteaaatagatectgticaggaaccggatcaaagagttectecgecgetggacetaccaagecaacgetatgttctett gettttgtcageaagatagecagatcaatgtegatcgtggetegetogaagatacctgcaagaatgteattigegetgecatteteca aattgcagttcgcgettagetggataacgecacggaatgatgtcgtegigeacaacaatggigacttetacagegeggagaatet cgetetetecaggggaagecgaagtticcaaaagetegtigateaaagetegecgegtigtttcateaagecttacggteacegta accagcaaatcaatatcactgtgtggeticaggecgecatecactgcggagecgtacaaatgtacggecageaacgteggttcg agatggcgetegatgacgecaactacctetgatagttgagtegatactteggegatcacegeticecteatgatgtttaactrigtttt agggegactgecetgetgegtaacategttgcigetecataacateaaacategacccacggcgtaacecgcttgetgctiggat
    Fig 103C gecegaggcatagactgtaccccaaaaaaacapteataacaagecatgaaaaccgocactgegecgitaceacegetgegtte ggtcaaggtictggaccagttgcgtgagegceatacgctacttgcattacagettacgaaccgaacaggcttatgtecactggette Bgtgeettcatecgtttecacggtgtgegteaceeggeaacetigggeageagegaagtegaggcatttetgtcetggetggegaa cgagegeaaggttteggtetecacgeategtcaggcattggeggecttgetgttetictacggcaaggtgetgtgcacggatets cectggettcaggagateggaagaceteggecgtegeggegetigecggtegtectgaccecggatgaagtggttcgeatect cggttttetegaaggegagcategtttgttcgeccagettetgtatggaacggecatgcepatcagtgagggttigcaacigogg Bgtcaaggatctggatttcgatcacggcacgatcatogtgcgggagggcaagggetecaaggategggectigatgttaccega gagettggcaccecagectgcgegageaggggaattaatteccacggetittgetgecegeaaacgegetgiictggigitgetag tttgttatcagaategcagatecggettcagecgegtttgceggetgaaagegctatitettccagaatigecatgatttiticcecacg gHaggcgteactggetecegtgttgteggcagettigattegataageageategectgtiteaggetgtetatgigigactgtiga getgtaacaagtigtctcaggtgticaatiteatettctagttgetttgtittactggtttcacetgttetattaggtgttacatgctettcat ctgttacattgtcgatcigttcatggtgaacagetttgaatgcaccaaaaactegtaaaagetetgatgtatetatetitittacacegtt ttcatctgtgcatatggacagttticectttgatatgtaacggigaacagttgttctactittgittgttagtetigatgetticacigatagat acaagagecataagaacceteagatecttecgtatitagecagtatgttetetagtgiggttegttetttitgcgtgagecatgagaac gaaccattgagatcatacttactttgcatgtcactcaaaaatitigecteaaaactggigagetgaattttigcagttaaageategtgt agigtttttettagtccgttatgtaggtaggaatctgatgtaatggttgitggtatitigtcaccattcatttitatetggttgitotcaagtto z gettacgagatccattigtctatctagttcaactiggaaaatcaacgtatcagtegggeggectegettateaaceaceaattteatat tgctgtaagtgtttaaatetitacitatiggtticaaaacccatiggttaagcctittaaactcategtagitatiticaagcattaacatga acttaaattcatcaaggctaatetetatatitgccttgigagttttctttigtgttagitetittaataaccactcataaatectcatagagtat 7 ttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatatittatgaatttttitaactggaaaagataaggcaatatctettcactaaaaactaat tctaatttttoegetigagaacttggeatagtttgtecaciggaaaateteaaagectitaaccaaaggattcetgatitecacagttete gtcateagetetetggtigetitagetaatacaccataageattttecctactgateticatcatetgagegtatiggitataagigaac gataccgtecgticttecrtgtagggititeaategtggggttgagtagtgccacacageataaaattagettggiticatgctecett aagtcatagegactaato; getagttcatttgetitgaaaacaactaatticagacatacateteaattggtetaggtgattttaateactat accaattgagatgggctagtcaatgataattactagtecttttecttigagttetgggtatetgtaaatictgetagacetitgciggaa aacttgtaaattetgetagaccctetgtaaaticegetagacetttgtgtgitttttttgtitataticaagiggttataatitatagaataaa gaaagaataaanaaagataaaaagaatagatcccagecctetgiataactcactactitagicagttecgcagtatiacaaaagga " tgtegeaaacgotetitgctectetacaaaacagacetiaaaacectaaaggcttaagtagcaccctegeaagetegggeaaate getgaatattccttttgtotocgaccatcaggeacetgagtegetegtetttttogtgacaticagttegetgegeteacs, ggetetggea gtgaatgggggtaaatggeactacaggcgcctitiatggattcatgcaaggaaactacccataatacaagaaaagecegicacg Egcttctcagggcgtttategegggtetgetatgtggigetatetgacttttigctgiteageagttectgccetetgatiticcagtet gaccactteggattateccgtgacaggtcaticagactggetaatgcacccagtaaggcagegetatcateaacaggctta (SEQ ID NO:87)
    Fig 104 E 1000 o 2 10 8 3 8 3 1 ê | 8 1 O 5 1015 20 25 30 35 40 45 50 55 60 tempo (h) Fig 105
    - 8: 8 225 sz 22 $15 ã 2 1 8 s 05 2 Do O 5 10 15 20 2530 35 40 4550 55 60 tempo (h)
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    ! Fig 107 aspA terminator o : wo. À e MR 7 tao NT uesteam V gens, Fm enR
    FRT MONVB30 - FRT-Om-FRE-Gil.2-KKDJYI at ateTh7
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    “ > 165/172 Fig 108A : 1 caagaaaaatgccccgettacgcagggcatecatitattacteaacogtaaccegattttgccaggttacgeggetggicaacetog gtgcctttgateagegegacatggtaagecageagetgeageggaacggtgtagaagatcggtgcaateacetettecacatgo gecatetegatgatgtgcatgttategetacttacaaaaccegoeatectgateggegaagacatacaactgacegecacgegege gaacttettcaatgttggatticagtttttecageaattegttgtteggtgcaacaacaataaccggcatateggcatcaattageges agcggacegtgtticagitegecageagegtaggettcagegigaatgiaagagatetetiteaaciteaatgcgecticoagege gatigggtacigategecacggcccaggaacagogcgtgatgtttgteagagaaatettetgecagegettcaatgcgtttgtect gagacagcatctgeteaatacggeteggeagegectgeagaccatgcacgatgteatgtiteaatggaggeatecagacettica ggcgagacagettegecaceageateaacageacagttaactgagtggtgaatectttagtegatgccacgecgatitetgtace cgogttggteattagegecagateggattegegeaccagagaagaacccggaacgttacagattgccagigaaccaaggtaac ccagcetetttegacagacgeaggecagecagggtatecgeggtttegecagactgtgacacgategeceticecaacagitgcg cagcctatacgtacggcagitiaaggtitacacctataaaagagagagecgttategtctetitgtggatgtacagagtgatattatt gacacgccggggegacggatggigatececetggecagigeacgtetgctgtcagataaagtetccogigaactttacecggte Btgcatateggggatgaaagetggegcatgatgaccacegatatggecagtgtgecggtetecgitateggggaagaagtgget gatctcagecacegegaaaatgacatcaaaaacgecattaacctgatgttotggggaatataaatgtcaggcatgagattateaaa aaggatetteacctagatectttteacgtagaaagecagtecgeagaaacggtgctgaceceggatgaateteagetactggget atctggacaagggaaaacgcaagegcraaagagaaageaggtagettgcagtgggcttacategegatagetagactgggesg F gttttalggacageaagegaaceggaatigecagetggggegecctetegtaaggtteggaagecetgeaaagtaaactggat ggetttotegecgecaaggatetgatggegeaggggateaagetetgateaagagacaggatgaggatcgttticgcatgatiga E acaagatggattgcacgcagettctecggececttggeiggagaggetatteggetatgactgggeacaacagacaateggot getetgatgecgecgtgiiceggetgtragegeaggggegceccggttettttgteaagacegacctgtecggigocetgaatga actgcaagacgaggcagegeggetategiggetggecacgacgggoegttectigegeagetgtgetegacgitgtcactgaas cgggaagegactggotgctatigggegaagteceggggcaggatetectgteateteacettgetectgcegagaaagtateca tcatggectgatgcaatgceggeggetgcatacgetigatecggetacetgeccattegaccaccaagegaaacategeategage gagcacgtacteggatggaagecggtetigtegatcaggatgatetagacgaagagcatcaggggetegegecagecgaact Bttegecaggeteaaggo gagcatgecegacggegaggatetegtegtgacecatggegatgectgctigecgaatateatggt Bgaaaatggecgettttetggattcategactgtggccggctgggtgtggeggacegetateaggacatagegttggetacecgt gatattigctgaagagettggeggegaatgggctgacegettectegtgctttacggtategecgetecegattegeagegeates cettetategecttettgacgagttettetgaatiattaacgottacaatttectgatgeggtatttictecitacgcatetgtgoggtattt cacaccgcatacaggtggcactiticggggaaatgtgcgeggaaccoctatttgtitattittctaaatacattcaaatatetatecge tcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacgtgaggagggecaccatggecaagttgaccagigecgttceggt geteacegegegegacgtegecggageggtegagttetegacegaceggctegggttctecectagiaacggecgecagtat getggaattcaggcagttcaacctegttgatagtacgtactaageteteatgtticacgtaciaageteteatgtitaacgtactaaget clcatgtttaacgaactaaacccteatggetaacgtactaageteteatggetaacgtactaageteteatgriteacgtactaagete tcatgtttgaacaataaaatiaatataaatcagcaacttaaatagcectctaaggttitaagttitataagaaaaaaaagaatatataage cttttaaagottitaaggtttaacggrigiggacaacaagecagggatgtaacgcactgagaageccttagagecteteaaageaa ttttcagtgacacaggaacacttaacggetgacagectgaatictgéagatatetgtttticcacteticgttcactitegecaggtag ciggtgaagacgaaggaagtcceggagecatctgegeggegtactacageaatgtittgtgaaggcagtiteagacceggatte agtttggcgatggetteateatecceacttettgattttgcecaggtagatgtegecgagggttttaccatecageaccagitegecasg acttcageccetggaatgttaacegecageaceacgecgecaateacggtcgggaactggaacagaccttcetgagecagtitite . gtcagacagcggegegtcagaggeaccaaaateaacggtatiagegataatetgttttacgecaceggaagaacegatacectg gtagttaactitattaccggtttotitetggtaagtgtcageccatttggcatacaccggegeagggaagettgeacetgeacetgte aggcttgettetgcaaacacagagaaageacteategataaggtegeggegacaacagttgcgacggtegtacgcataacttte ataatgtctectgggaggattrataaagcattgttigitggetacgagaageaaaataggacaaacaggtgacagttatategtaas gaatatgacagttitatgacagagagataaagtcttcagtctgatitaaataagogtigataticagtcaattacaaacattaataacg
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