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BRPI1011947B1 - sistema para a produção de um copolímero de isopreno - Google Patents

sistema para a produção de um copolímero de isopreno Download PDF

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BRPI1011947B1
BRPI1011947B1 BRPI1011947-7A BRPI1011947A BRPI1011947B1 BR PI1011947 B1 BRPI1011947 B1 BR PI1011947B1 BR PI1011947 A BRPI1011947 A BR PI1011947A BR PI1011947 B1 BRPI1011947 B1 BR PI1011947B1
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BR
Brazil
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isoprene
cells
methyl
polypeptide
derived
Prior art date
Application number
BRPI1011947-7A
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English (en)
Inventor
C Mcauliffe Joseph
J Sanford Karl
Paramonov Sergey
Rodewald Stephan
Original Assignee
Danisco Us Inc
Goodyear Tire & Rubber
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Us Inc, Goodyear Tire & Rubber filed Critical Danisco Us Inc
Publication of BRPI1011947A2 publication Critical patent/BRPI1011947A2/pt
Publication of BRPI1011947B1 publication Critical patent/BRPI1011947B1/pt

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Abstract

sistema para a produção de um copolímero de isopreno a presente invenção apresenta composições e métodos para produzir polímeros de isopreno derivados de recursos renováveis, como o isopreno produzido a partir de células cultivadas que usam fontes renováveis de carbono. uma composição inicial isopreno, tal como uma composição bioisopreno, distingue-se do isopreno derivado de petróleo com base no perfil de pureza (tais como níveis mais baixos de certos hidrocarbonetos c5 diferentes de isopreno, a presença de certos compostos associados com o processo biológico de produção) e o teor relativo dos isótopos de carbono. polímeros obtidos por polimerização de tal composição inicial isopreno de acordo com esta invenção, tais como um homopolímero ou um copolímero de poli-isopreno possuindo unidades de repetição que derivam de isopreno, são distinguíveis de polímeros contendo isopreno provenientes de recursos petroquímicos. a presente invenção mais especificamente revela um polímero poliisopreno, que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor d13c superior a -22 ‰. este tipo de poli-isopreno pode ser uma borracha de homopolímero cis-1,4-poli-isopreno. também, são fornecidos métodos para verificar que um homopolímero ou um copolímero de isopreno que possuam unidades de repetição que derivam de isopreno contêm isopreno que é proveniente de uma fonte renovável sustentável, não derivada de petróleo.

Description

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente
Provisória No U.S. 61/187.944, depositado em 17 de junho de 2009, cuja divulgação fica aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Antecedentes da Invenção [002] O isopreno (2-metil-buta-1,3-dieno) é um importante composto orgânico que é usado em uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, o isopreno é empregado como um intermediário ou um material inicial na síntese de inúmeros compostos químicos e polímeros. O isopreno é também um importante material biológico que é sintetizado naturalmente por muitas plantas e animais, incluindo seres humanos. O isopreno é um líquido incolor à temperatura ambiente e é altamente inflamável.
[003] O isopreno tornou-se um monômero importante para a utilização na síntese do cis-1,4-polibutadieno, quando sua polimerização estéreo-regulada se tornou comercialmente possível no início do ano de 1960. O cis-1,4-poli-isopreno produzido por tal polimerização estéreo-regulada é semelhante em estrutura e propriedades à borracha natural. Mesmo que ele não seja idêntico à borracha natural, ele pode ser usado como um substituto para a borracha natural em muitas aplicações. Por exemplo, a borracha sintética de cis-1,4-poli-isopreno é amplamente utilizada na fabricação de pneus e outros produtos de borracha. Essa demanda de borracha sintética de cis-1,4-poli-isopreno consome a maioria dos isopreno disponíveis no mercado mundial. O isopreno restante é utilizado na produção de outras borrachas sintéticas, copolímeros de bloco, e outros produtos químicos. Por exemplo, o isopreno é utilizado na produção de
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2/343 borrachas de butadieno-isopreno, borrachas de copolímero estirenoisopreno, borrachas estireno-isopreno-butadieno, copolímeros de bloco estireno-butadieno-estireno, e copolímeros de bloco estireno-isopreno. [004] Ao longo dos anos muitas rotas de síntese para a produção de isopreno têm sido investigadas. Por exemplo, a síntese do isopreno mediante reação de isobutileno com formaldeído na presença de um catalisador é descrita na Patente no U.S. 3.146.278, Patente no U.S. 3.437.711, Patente no U.S. 3.621.072, Patente no U.S. 3.662.016, Patente no U.S. 3.972.955, Patente no U.S. 4000209, Patente no U.S. 4.014.952, Patente no U.S. 4.067.923 e Patente no U.S. 4511751. A Patente no U.S. 3.574.780 revela outro processo para a fabricação de isopreno, passando uma mistura de éter metil ter-butílico e ar sobre catalisadores de óxidos mistos. O éter metil ter-butílico é então craqueado em isobutileno e metanol sobre o catalisador. O metanol produzido é oxidado em formaldeído, que então reage com o isobutileno sobre o mesmo catalisador para produzir o isopreno. A Patente no U.S. 5177290 divulga um processo para produzir dienos, incluindo isopreno, que envolve reagir uma mistura de reação de um éter de alquila terciária e uma fonte de oxigênio ao longo de dois catalisadores funcionalmente distintos sob condições de reação suficientes para produzir altos rendimentos dos dienos com mínimo de reciclo do éter.
[005] O isopreno utilizado em aplicações industriais é tipicamente produzido como um subproduto do craqueamento térmico da nafta ou petróleo ou é de outra forma extraído de fluxos petroquímicos. Este é um processo é relativamente caro no consumo de energia. Com a demanda mundial por produtos petroquímicos baseados em produtos com aumentos constantes, o custo de isopreno deverá subir para níveis muito mais elevados no longo prazo e sua disponibilidade ficar limitada em qualquer dos casos. Em outras palavras, há uma preocupação de que o abastecimento futuro de isopreno a partir de fontes de base
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3/343 petroquímicas será insuficiente para atender às necessidades projetadas e que os preços vão subir a níveis sem precedentes. Assim, há uma necessidade atual para conseguir uma fonte de isopreno oriunda de uma fonte de baixo custo, renovável, que seja ambientalmente amigável.
[006] Além disso, o isopreno produzido a partir de matérias-primas petroquímicas requer purificação extensiva antes que possa ser convertido em polímeros. Métodos de custos eficazes são desejáveis para a produção de isopreno de alta pureza a partir de recursos renováveis e para a sua conversão a produtos poli-isopreno aproveitando o elevado grau de pureza e/ou perfis únicos de impurezas das composições de bioisopreno.
[007] A invenção aqui descrita atende a essas necessidades e proporciona benefícios adicionais também.
Breve Sumário da Invenção [008] A invenção proporciona, entre outras coisas, composições e métodos para produzir polímeros de isopreno a partir de fontes renováveis.
[009] Assim, em um aspecto, a invenção fornece sistemas para a produção de um copolímero de isopreno compreendendo: (a) uma composição inicial isopreno derivadas de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial sofre polimerização de isopreno com outra molécula não-isopreno para produzir um copolímero. Em uma modalidade, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende mais que, ou cerca de 99,94% em peso de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em outra modalidade, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de
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4/343 isopreno e compreende um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em outra modalidade, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende um ou mais compostos secundários selecionados a partir do grupo que consiste em acetona, etanol, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cis- e trans-3-metil-1,3-pentadieno, um prenil C5, 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-
3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, e 2,3cicloeptenolpiridina; em que a quantidade do composto secundário relativamente à quantidade de isopreno é maior que, ou de cerca de 0,01% (p/p). Em outra modalidade, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende menos do que, ou cerca de 0,5 pg/L por composto para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno. Em outra modalidade, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 %o, ou que se encontra contido na faixa de - 30 V a -28,5 V. Em outra modalidade, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero
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5/343 adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 V, ou que se encontra contido na faixa de -32 V a -24 V. Em outra modalidade, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 V, ou que se encontra contido na faixa de -34 V a -24 V. Em outra modalidade, o polímero é um copolímero selecionado do grupo consistido de (i) copolímeros de isopreno e 1,3-butadieno, (ii) copolímeros de isopreno e estireno, (iii) copolímeros de isopreno, 1,3-butadieno, e estireno, e (iv) copolímeros de isopreno e α-metil estireno. Em outra modalidade, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor ím que é maior que 0,9. Em outra modalidade, o sistema inclui ainda um ou mais de: (i) um catalisador para polimerização de isopreno, (ii) um iniciador de polimerização, (iii) um tensoativo iônico, (iv) um solvente orgânico, e (v) um finalizador de cadeia de polimerização.
[0010] Em outro aspecto, a invenção fornece sistemas de produção de um polímero de isopreno compreendendo: (a) uma composição de isopreno derivada de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial sofre polimerização de isopreno com outras moléculas de isopreno para produzir um polímero do isopreno com um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 100.000.
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6/343 [0011] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a produção de um copolímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreendendo: (a) a cultura de células compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase em condições de cultura para a produção do isopreno; (b) produção do isopreno, e (c) polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis com outras moléculas não-isopreno para produzir um copolímero. Em uma modalidade, o método inclui ainda a recuperação do isopreno a partir da cultura de células produtoras de isopreno antes da polimerização. Em outra modalidade, o método inclui ainda a etapa (d) recuperação do polímero produzido.
[0012] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para produzir um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreendendo: (a) a cultura de células compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase em condições de cultura para a produção do isopreno; (b) produção do isopreno, e (c) polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis com outras moléculas de isopreno para produzir um polímero do isopreno com um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 100.000. [0013] Em outro aspecto, a invenção proporciona polímeros de isopreno derivados de fontes renováveis produzidas por qualquer um dos métodos descritos neste documento.
[0014] Em um aspecto, a invenção proporciona um sistema para produzir um polímero de isopreno compreendendo: (a) uma composição de isopreno derivada de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial de isopreno, em que pelo menos uma parte da composição inicial isopreno sofre polimerização. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende mais que, ou cerca de 99,94% em
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7/343 peso de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende um ou mais compostos secundários selecionados a partir do grupo que consiste em acetona, etanol, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cis- e trans-3metil-1,3-pentadieno, um prenil C5, 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-
3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, citronelol e geraniol, em que a quantidade do composto secundário relativamente à quantidade de isopreno é maior que, ou de cerca de 0,01% (p/p). Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende menos do que, ou cerca de 0,5 pg/L por composto para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno.
[0015] Em algumas modalidades, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 ou que
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8/343 está dentro da faixa de -30 V a -28,5 V. Em algumas modalidades, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 V, ou que se encontra contido na faixa de -32 V a -24 V. Em algumas modalidades, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e em que os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 V, ou que se encontra contido na faixa de -31 V a -24 V. Em algumas modalidades, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 V, ou que se encontra contido na faixa de -34 V a -24 V. Em algumas modalidades, o polímero é um copolímero selecionado do grupo consistindo em (i) copolímeros de isopreno e 1,3-butadieno, (ii) copolímeros de isopreno e estireno, (iii) copolímeros de isopreno, 1,3-butadieno, e estireno, e (iv) copolímeros de isopreno e α-metil estireno. Em algumas modalidades, o polímero produzido a partir do material inicial isopreno é um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor fM que é maior que 0,9.
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9/343 [0016] Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende um catalisador para polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende um iniciador de polimerização. Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende um tensoativo iônico. Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende um solvente orgânico adequado. Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende um finalizador de cadeia de polimerização. Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda um adicional de monômero selecionado do grupo consistindo em 1,3-butadieno e estireno. Em algumas modalidades, o sistema adicionalmente compreende monômeros adicionais, incluindo ambos os 1,3-butadieno e estireno.
[0017] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreendendo: (a) a obtenção de isopreno a partir de recursos renováveis; (b) polimerização do isopreno derivado de recursos renováveis, e (c) recuperação do polímero produzido. Em algumas modalidades, o isopreno proveniente de recursos renováveis é obtido por um método que compreende as etapas de (i) a cultura de células compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase sob condições de cultura adequadas para a produção de isopreno, (ii) produção do isopreno, e (iii) recuperação do isopreno a partir da cultura. Um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis, produzido por qualquer dos métodos descritos neste documento também é fornecido.
[0018] Em um aspecto, é provido um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor
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10/343 õ13C que está dentro da faixa de -30 a -28,5 Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. Em modalidades diversas, o poli-isopreno é livre de proteínas. Em algumas modalidades, o poli-isopreno é um homopolímero de poliisopreno.
[0019] Em um aspecto, é provido um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero poli-isopreno tem um teor de microestrutura cis-1,4 de menos de 99,9%, em que o polímero poliisopreno tem um teor de microestrutura trans-1,4 de menos de 99,9%, e no qual o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -30 a -28,5 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de 32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^.
[0020] Em um aspecto, é provido um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem um teor de microestrutura 3,4- de mais de 2%, e em que o polímero tem poliisopreno õ13C valor superior a -22 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de 30 a -28,5 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^.
[0021] Em um aspecto, é provido um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de
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11/343 isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem um teor de 1,2microestrutura de mais de 2%, e em que o polímero tem poli-isopreno õ13C valor superior a -22 Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -30 a -28,5 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^.
[0022] Em um aspecto, é provido um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 %o. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -30 %o a -28,5 %o. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. [0023] Em um aspecto, é provido um polímero de poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno líquido tem um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e em que o polímero de poli-isopreno líquido tem valor õ13C superior a -22 %o. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -30 %o a -28,5 %o. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. [0024] Em um aspecto, é fornecido um método para verificar que um homopolímero de poli-isopreno é de uma fonte renovável,
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12/343 sustentável não derivada de petróleo, que compreende: (I) determinar o valor õ13C do homopolímero de poli-isopreno; (II) se o homopolímero poli-isopreno tem um valor õ13C dentro da faixa de -34 V a -30 V ou dentro da faixa de -28,5 V a -24 V adicionalmente analisar o homopolímero de poli-isopreno para determinar (1) o seu teor de microestrutura cis-, (2) seu teor de microestrutura 3,4-, (3) seu teor de microestrutura 1,2-, (4) o seu peso molecular ponderal médio, ou (5) a presença ou ausência de residuais proteínas, sabões, lipídeos, resinas, ou açúcares indicativos de borracha natural, e (III) verificar que o homopolímero de poli-isopreno é proveniente de uma fonte sustentável, renovável, não derivada de petróleo, se tiver (i) um valor õ13C superior a -22 V, (ii) um valor õ13C que está dentro da faixa de -30 V a -28,5 V, ou (iii) o valor de um õ13C dentro da faixa de -34 V a -30 V ou dentro da faixa de -28,5 V a -24 V e se ele (a) tem um teor de microestrutura cis- de menos de 100 %, (b) teor de microestrutura 3,4-, (c) teor de microestrutura 1,2-, (d) tem um peso molecular ponderal médio de menos de 100.000, ou (e) é livre de residuais proteínas, sabões, lipídeos, resinas, ou açúcares indicativos de borracha natural. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a análise do teor de 14C do polímero e verificar que o valor fM é maior do que 0,9.
[0025] Em um aspecto, é fornecido um método para verificar que um copolímero tendo unidades de repetição que derivam de isopreno contém isopreno que é proveniente de uma fonte sustentável, renovável, não derivada de petróleo, o referido método compreendendo:
(I) determinar o valor de õ13C de pelo menos um bloco poli-isopreno no copolímero e (II) verificar que o isopreno no copolímero é proveniente de uma fonte sustentável, renovável, não derivada de petróleo, se o bloco de poli-isopreno tem (i) um valor õ13C superior a -22 V, ou (ii) um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 V a -28,5. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a análise do teor de 14C do polímero
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13/343 e verificar que o valor fM é maior do que 0,9.
[0026] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o monômero de isopreno é produzido por células em cultura. Em algumas modalidades, as células em cultura são capazes de produzir mais do que cerca de 400 nmol ou cerca de 1000 mmol de monômero de isopreno/grama de células relativamente ao peso úmido das células/hora (nmol/gwcm/hora) de monômero de isopreno. Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tais como, mas não limitado a, um hidrato de carbono, glicerina glicerol, diidroxiacetona, uma fonte de carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácidos graxos, lipídeos, fosfolipídeos, glicerolipídeos, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicérides, fonte renovável de carbono, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína microbiana ou vegetal ou peptídeo), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos elementos anteriores. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada.
[0027] Em algumas modalidades, as células em cultura são capazes de converter mais de cerca de 0,002% do carbono em um meio de cultura de células em monômero de isopreno. Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tais como, mas não limitado a, um hidrato de carbono, glicerina glicerol, diidroxiacetona, uma fonte de carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácidos graxos, lipídeos, fosfolipídeos, glicerolipídeos,
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14/343 monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicérides, fonte renovável de carbono, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína microbiana ou vegetal ou peptídeo), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos elementos anteriores. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada.
[0028] Em algumas modalidades, as células em cultura compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase. Em algumas modalidades, as células têm um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídeo de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, tais como, mas não limitado a, um hidrato de carbono, glicerina glicerol, diidroxiacetona, uma fonte de carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácidos graxos, lipídeos, fosfolipídeos, glicerolipídeos, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicérides, fonte renovável de carbono, polipeptídeo (por exemplo, uma proteína microbiana ou vegetal ou peptídeo), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos elementos anteriores. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada.
[0029] Em algumas modalidades, as células em cultura são capazes de produzir uma quantidade de monômero de isopreno (tal como a quantidade total de isopreno produzida ou a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo por hora por OD600) durante a fase estacionária é maior do que ou cerca de 2 ou mais vezes a quantidade de monômero de isopreno produzida durante a fase de crescimento para o mesmo período de tempo. Em algumas modalidades, as células em cultura são capazes de produzir monômero de isopreno apenas na fase estacionária. Em algumas modalidades, as células em cultura são
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15/343 capazes de produzir monômero de isopreno, tanto na fase de crescimento e fase estacionária. Em modalidades diversas, as células em cultura são capazes de produzir uma quantidade de monômero de isopreno durante a fase estacionária é maior do que ou cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes a quantidade de monômero isopreno produzida durante a fase de crescimento para o mesmo período de tempo.
[0030] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o isopreno do monômero de isopreno é proveniente de uma composição. Em algumas modalidades, a composição compreende mais que, ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg de monômero de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende mais que, ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de monômero isopreno (p/p) da fração orgânica volátil da composição é monômero de isopreno.
[0031] Em algumas modalidades, a composição compreende mais que, ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% em peso de monômero de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição compreende menos de, ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de outros hidrocarbonetos C5 que o monômero de isopreno (1,3 tais ciclopentadieno, cis-1,3-pendadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-
1-butino, pent-4-eno-1-ino, transpent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1ino) em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem menos de, ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% a 1,3-ciclopentadieno, cis-1, 3 pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino,
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1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, pent-4-eno -1-ino, transpent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em modalidades particulares, a composição tem mais do que cerca de 2 mg de monômero de isopreno e tem mais que, ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% em peso de monômero de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
[0032] Em algumas modalidades, a composição tem menos que ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 mg/L de um composto que inibe a polimerização de monômero isopreno para qualquer composto na composição que inibe a polimerização de monômero de isopreno. Em modalidades particulares, a composição também possui mais que cerca de 2 mg de monômero de isopreno.
[0033] Em algumas modalidades, a composição tem um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a composição tem mais que, ou cerca de 0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 mg/L de etanol, acetona, um álcool prenil C5 (tais como 3-metil-3buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou qualquer de dois ou mais dos mencionados anteriormente. Em modalidades particulares, a composição tem mais do que cerca de 2 mg de monômero de isopreno e tem um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
[0034] Em algumas modalidades, a composição inclui monômero de isopreno e um ou mais compostos secundários selecionados do grupo consistindo em 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5trimetilpiridina, 2, 3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol,
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17/343 acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-
3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, citronelol e geraniol. Em modalidades diferentes, a quantidade de um desses componentes segundo em relação à quantidade de monômero de isopreno em unidades de percentagem em peso (ou seja, o peso do componente dividido pelo peso dos tempos de isopreno 100) é maior que, ou de cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p).
[0035] Em algumas modalidades, a composição compreende (i) uma fase gasosa que compreende monômero de isopreno e (ii) células em cultura que produzem mais do que cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende um sistema fechado, e a fase gasosa compreende mais que, ou cerca de 5. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg/L de monômero de isopreno quando normalizada para 1 mL de 1 OD600 cultivada por 1 hora. Em algumas modalidades, a composição compreende um sistema aberto, e a fase gasosa compreende mais que, ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg/L de monômero de isopreno quando aspergido em uma taxa de 1 vvm. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás compreende mais que, ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% em peso de monômero de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na da fração orgânica volátil. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás compreende menos de, ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de outros hidrocarbonetos C5 que o monômero de isopreno (como 1,3ciclopentadieno, cis-1,3-pendadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4
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18/343 pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1ino) em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na da fração orgânica volátil. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás tem menos do que, ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% a 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pendadieno, trans-1,3pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1buteno, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gás tem mais do que cerca de 2 mg de monômero de isopreno e tem mais que, ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% em peso de monômero de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na da fração orgânica volátil.
[0036] Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás da composição tem menos que ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 mg/L de um composto que inibe a polimerização do isopreno para qualquer composto na fração orgânica volátil da fase gás que inibe a polimerização de monômero de isopreno. Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gás também tem mais do que cerca de 2 mg de monômero de isopreno. [0037] Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás da composição tem um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás tem mais que, ou cerca de 0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 mg/L de acetona, etanol, um álcool prenil C5 (tais como 3-metil-3
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19/343 buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou qualquer de dois ou mais dos mencionados anteriormente. Em modalidades particulares, a fração orgânica volátil da fase gás tem mais do que cerca de 2 mg de monômero de isopreno e tem um ou mais compostos selecionados do grupo consistindo em acetona, etanol, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono .
[0038] Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gás da composição compreende monômero de isopreno e um ou mais compostos secundários selecionados do grupo consistindo em 2heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil -3-buten-2-propanol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3buten-1-ila, 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-
3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, citronelol e geraniol. Em modalidades diferentes, a quantidade de um desses componentes secundários em relação à quantidade de monômero de isopreno em unidades de percentagem em peso (ou seja, o peso do componente dividido pelo peso dos tempos de isopreno 100) é maior que, ou de cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1,0,5, 1,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p) na da fração orgânica volátil da fase gás.
[0039] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições, pelo menos uma parte do monômero de isopreno está em uma fase gasosa. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte do monômero de isopreno está em uma fase líquida (como um condensado). Em algumas modalidades, pelo menos uma parte do monômero de isopreno está em uma fase sólida. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte do monômero de isopreno é
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20/343 adsorvida em um suporte sólido, como um suporte que inclui sílica e/ou carvão ativado. Em algumas modalidades, a composição inclui etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 75 a cerca de 90% em peso de etanol, tal como entre cerca de 75 a cerca de 80%, de cerca de 80 a cerca de 85%, ou cerca de 85 a cerca de 90% em peso de etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 4 a cerca de 15% em peso de monômero de isopreno, tal como entre cerca de 4 a cerca de 8%, de cerca de 8 a cerca de 12%, ou cerca de 12 a cerca de 15% em peso de monômero de isopreno.
[0040] Em algumas modalidades, as células em cultura são oriundas de um sistema que inclui uma câmara reator em que as células são capazes de produzir mais do que cerca de 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, ou mais nmol/gwcm/hora de monômero de isopreno. Em algumas modalidades, o sistema não é um sistema fechado. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte do monômero de isopreno é removida do sistema. Em algumas modalidades, o sistema inclui uma fase gasosa compreendendo monômero de isopreno. Em modalidades diversas, a fase gasosa compreende qualquer uma das composições aqui descritas.
[0041] Em um aspecto é fornecido um pneu que compreende qualquer polímero de poli-isopreno aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade é fornecido pneus compreendendo um polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 V, ou um valor õ13C que está dentro da faixa de -30 V a -28,5 V, -32 V a -24 V, ou -34 V a -24 V. Em algumas dessas incorporações, o poli-isopreno é livre de proteínas. Em algumas modalidades, o poli-isopreno é um homopolímero de poli-isopreno.
[0042] Em algumas modalidades, o polímero de poli-isopreno aqui
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21/343 descrito é produzido por (i) polimerização do monômero de isopreno em qualquer uma das composições aqui mencionadas, ou (ii) polimerização de isopreno recuperado de qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas modalidades são fornecidos métodos de produção de qualquer polímero de poli-isopreno aqui descrito por (i) polimerização do monômero de isopreno em qualquer uma das composições aqui mencionadas, ou (ii) polimerização de isopreno recuperado de qualquer uma das composições aqui descritas.
[0043] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições, sistemas e métodos descritos aqui, uma concentração não inflamável de monômero de isopreno na fase gás é produzido. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende menos de cerca de 9,5% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende mais que, ou cerca de 9,5% (volume) de oxigênio, e a concentração de monômero de isopreno na fase gasosa é menor que o limite inferior de inflamabilidade ou maior que o limite superior de inflamabilidade. Em algumas modalidades, a porção da fase gás outra que o monômero de isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 100% (volume) de oxigênio, tal como entre cerca de 10% a cerca de 100% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, a porção da fase gás outra que a de monômero de isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio. Em algumas modalidades, a porção da fase gás outra que a de monômero de isopreno compreende entre cerca de 1% a cerca de 50% (volume) de CO2.
[0044] Em algumas modalidades, as células em cultura produzem monômero de isopreno em mais que, ou cerca de 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, ou mais nrnol/gwcm/hora isopreno. Em algumas modalidades, as células em cultura convertem mais que, ou cerca de 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2,
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1,4, 1,6%, ou mais do carbono no meio de cultura de células em monômero de isopreno. Em algumas modalidades, as células em cultura produzem monômero de isopreno em mais que, ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000 ng ou mais de monômero de isopreno/grama de células relativamente ao peso úmido das células/hora (ng/gwcm/h). Em algumas modalidades, as células em cultura produzem um título cumulativo (valor total) de monômero de isopreno em mais que, ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000 mg ou mais de isopreno/L de caldo (mg/Lcaldo, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular). Outras taxas representativas da produção de monômero isopreno e quantidades totais da produção de monômero de isopreno são divulgadas aqui.
[0045] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, as células em cultura ainda compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo IDI. Em algumas modalidades, as células ainda compreendem uma inserção de uma cópia de um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo IDI. Em algumas modalidades, as células ainda compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades, as células ainda compreendem uma inserção de uma cópia de um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades, as células ainda compreendem um ou mais ácido nucleico que codificam um polipeptídeo IDI e um polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades, um ácido nucleico codifica o polipeptídeo isopreno sintase, polipeptídeo IDI, e polipeptídeo DXS. Em algumas modalidades, um vetor codifica o polipeptídeo isopreno sintase, polipeptídeo IDI, e DXS polipeptídeo. Em algumas modalidades, o vetor
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23/343 inclui um marcador seletivo, tais como um ácido nucleico de resistência aos antibióticos.
[0046] Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase é ligado de forma operacional a um promotor T7, tal como um promotor T7 contido em plasmídeo de média cópia ou alta. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase é ligado de forma operacional a um promotor Trc, tal como um promotor T rc contido em plasmídeo de média cópia ou alta. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase é ligado de forma operacional a um promotor Lac, tal como um promotor Lac contido em um plasmídeo de cópia baixa. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase é ligado de forma operacional a um promotor endógeno, tal como um promotor endógeno de serina protease alcalina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase se integra em um cromossomo das células sem um marcador seletivo.
[0047] Em algumas modalidades, um ou mais vias MVA, IDI, DXP ou ácidos nucleicos isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, uma ou mais vias MVA, IDI, DXP, ou ácidos nucleicos isopreno sintase podem ser colocados sob controle de um fator sigma de fase estacionária, tal como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais vias MVA, IDI, DXP, ou ácidos nucleicos isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor induzível em fase estacionária, tal como um promotor induzível por um regulador de resposta ativo em fase estacionária.
[0048] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte das células em cultura mantém o ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase por pelo menos, ou cerca de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (como uma cultura contínua,
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24/343 sem diluição). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreendendo a isopreno sintase, ácido nucleico IDI, ou DXS também inclui um marcador seletivo, tais como um ácido nucleico resistente aos antibióticos.
[0049] Em algumas modalidades, as células em cultura ainda compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo via MVA (como um polipeptídeo de via MVA de Saccharomyces cerevisia ou Enterococcus faecalis). Em algumas modalidades, as células ainda compreendem uma inserção de uma cópia de um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo de via MVA (como um polipeptídeo de via MVA de Saccharomyces cerevisia ou Enterococcus faecalis). Em algumas modalidades, as células compreendem um ácido nucleico de via isopreno sintase, DXS e MVA. Em algumas modalidades, as células compreendem um ácido nucleico isopreno sintase, um ácido nucleico DXS, um ácido nucleico IDI, e um ácido nucleico de via MVA (além do ácido nucleico IDI).
[0050] Em algumas modalidades, o polipeptídeo isopreno sintase é um polipeptídeo de ocorrência natural de uma planta, tais como Pueraria (por exemplo, Pueraria montana ou Pueraria lobata).
[0051] Em algumas modalidades, as células em cultura são células bacterianas, como as células bacterianas gram-positivas (por exemplo, células Bacillus, como células Bacillus subtilis ou células Streptomyces como Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, ou células de Streptomyces griseus). Em algumas modalidades, as células em cultura são células bacterianas gram-negativas (por exemplo, células de Escherichia tais como células de Escherichia coli ou células, Pantoea, tais como células Pantoea citrea). Em algumas modalidades, as células em cultura são fungos, células, como células fúngicas filamentosas (por exemplo, células de Trichoderma como as células Trichoderma reesei ou células Aspergillus, tais como Aspergillus oryzae e Aspergillus niger)
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25/343 ou células de levedura (por exemplo, células de Yarrowia como células de Yarrowia lipolytica).
[0052] Em algumas modalidades, a fonte de carbono polipeptídica microbiana inclui um ou mais polipeptídeos de leveduras ou bactérias. Em algumas modalidades, a fonte de carbono polipeptídica vegetal inclui um ou mais polipeptídeos de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, canola, algodão, dendê, oliva, girassol, gergelim ou linhaça.
[0053] Em um aspecto, a invenção apresenta um produto elaborado por qualquer uma das composições e métodos da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos [0054] A figura 1 é a sequência nucleotídica de um gene do isopreno sintase de kudzu de códon otimizado para expressão em E. coli (SEQ ID NO: 1). O códon inicial ATG está em itálico, o códon final está em negrito e o sítio PstI está sublinhado.
[0055] A figura 2 é um gráfico de pTrcKudzu.
[0056] As figuras 3A a C são a sequência nucleotídica de pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2).O RBS está sublinhado, o códon inicial do isopreno sintase de kudzu está em maiúsculas e negrito e o códon de parada está em maiúsculas, negrito. O arcabouço de vetor é de pTrcHis2B.
[0057] A figura 4 é um gráfico de pETNHisKudzu.
[0058] As figuras 5A a 5C são a sequência nucleotídica de pETNHisKudzu (SEQ ID NO: 5).
[0059] A figura 6 é um gráfico de pCL-lac-Kudzu.
[0060] As figuras 7A a 7C são a sequência nucleotídica de pCL-lacKudzu (SEQ ID NO: 7).
[0061] A figura 8A é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 sem vetor.
[0062] A figura 8B é um gráfico apresentando a produção de
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26/343 isopreno em células de E. coli BL21 com pCL-lac-Kudzu [0063] A figura 8C é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 com pTrcKudzu.
[0064] A figura 8D é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 com pETN-HisKudzu.
[0065] A figura 9A é um gráfico apresentando ao longo do tempo a
OD da fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermentação de 14 litros alimentada por bateladas.
[0066] A figura 9B é um gráfico apresentando produção de isopreno ao longo do tempo da fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermentação de 14 litros alimentada por bateladas.
[0067] A figura 10A é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Panteoa citrea. Células de controle sem isopreno sintase de kudzu recombinante. Losangos cinza representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam a OD600.
[0068] A figura 10B é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Panteoa citrea expressando pCL-lac Kudzu. Losangos cinza representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam a OD600.
[0069] A figura 10C é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Panteoa citrea expressando pTrcKudzu. Losangos cinza representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam a OD600.
[0070] A figura 11 é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase recombinante. BG3594 comK é uma cepa de B. subtilis sem plasmídeo (produção de isopreno nativa). CF443-BG3594comK é uma cepa de B. subtilis com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante). IS no eixo-y indica isopreno.
[0071] As figuras 12A a 12C são a sequência nucleotídica de pBS
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Kudzu no2 (SEQ ID NO: 57).
[0072] A figura 13 é a sequência nucleotídica do isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID NO: 8).
[0073] A figura 14 é um gráfico de pTrex3g compreendendo um gene do isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para expressão em Yarrowia.
[0074] As figuras 15A a 15C são a sequência nucleotídica do vetor pSPZ1(MAP29Spb) (SEQ ID NO 11).
[0075] A figura 16 é a sequência nucleotídica do gene de isopreno de kudzu (Pueraria montana) sintético com códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID NO: 12).
[0076] A figura 17 é a sequência nucleotídica do gene do isopreno sintase de álamo híbrido (Populus alba x Populus tremula) sintético (SEQ ID NO: 13). O códon inicial ATG está em negrito e o códon final está sublinhado.
[0077] A figura 18A (figuras 18A1 e 18A2) apresenta uma construção de esboço esquemático dos vetores pYLA 1, pYL1 e pYLA2. [0078] A figura 18B apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLA(POP1).
[0079] A figura 18C apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLA(KZ1).
[0080] A figura 18D apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pilI(KZ1).
[0081] A figura 18E apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pilI(MAP29).
[0082] A figura 18F apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLA(MAP29).
[0083] A figura 19 (figura 19A) apresenta as vias metabólicas MVA e DXP para isopreno (com base em F. Bouvier et al., Progress in Lipid
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Res. 44: 357-429, 2005). A seguinte descrição inclui nomes alternativos para cada polipeptídio nas vias e a referência que divulga um ensaio para a medição da atividade do polipeptídio indicado (cada uma dessas referências é incorporada neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a ensaios para a atividade de polipeptídios para polipeptídios nas vias MVA e DXP). Via do mevalonato: AACT; Acetil-CoA acetiltransferase, MvaE, EC 2.3.1.9. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; HidroximetilglutarilCoA sintase, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; Mevalonato quinase, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensaio: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato quinase, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensaio: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxilase, MVD1, EC 4.1.1.33. Ensaio: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI;
Isopentenil-difosfato delta-isomerase, IDI1, EC 5.3.3.2. Ensaio: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Via DXP: DXS; 1-Desóxi-xilulose-5fosfato sintase, dxs, EC 2.2.1.7. Ensaio: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desóxi-D-xilulose 5-fosfato redutoisomerase, dxr, EC 2.2.1.7. Ensaio: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-Difosfocitidil2C-metil-D-eritritol sintase, IspD, EC 2.7.7.60. Ensaio: PNAS, 97: 64516456, 2000; CMK; 4-Difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase, IspE, EC 2.7.1.148. Ensaio: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-Metil-D-eritritol
2,4-ciclodifosfato sintase, IspF, EC 4.6.1.12. Ensaio: PNAS, 96:1175811763, 1999; HDS; 1-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase, ispG, EC 1.17.4.3. Ensaio: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR; 1-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato redutase, IspH, EC 1.17.1.2. Ensaio: JACS, 126:12847-12855, 2004.
[0084] A figura 19 (figura 19B) ilustra as vias MVA clássica e modificada. 1, acetil-CoA acetiltransferase (AACT); 2, HMG-CoA sintase
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29/343 (HMGS); 3, HMG-CoA redutase (HMGR); 4, mevalonato quinase (MVK); 5, fosfomevalonato quinase (PMK); 6, difosfomevalonato descarboxilase (MVD ou DPMDC); 7, isopentenil difosfato isomerase (IDI); 8, fosfomevalonato descarboxilase (PMDC); 9, isopentenil fosfato quinase (IPK). A via MVA clássica segue da reação 1 até a reação 7 através de reações 5 e 6, enquanto uma via MVA modificada segue até as reações 8 e 9. P e PP na fórmula estrutural são fosfato e pirofosfato, respectivamente. Essa figura foi retirada de Koga e Morii, Microbiology e Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos ácidos nucleicos e polipeptídios da via MVA modificada. A via MVA modificada está presente, por exemplo, em alguns organismos de Archaea, como Methanosarcina mazei.
[0085] A figura 20 (figuras 20A e 20B) apresenta gráficos que representam os resultados da análise GC-MS de produção de isopreno por cepas de Y. lipolitica recombinante sem (esquerda) ou com (direita) um gene do isopreno sintase de kudzu. As setas indicam o tempo de eluição do padrão autêntico do isopreno.
[0086] A figura 21 é um gráfico de pTrcKudzu yIDI DXS Kan.
[0087] As figuras 22A a 22D são a sequência nucleotídica de pTrcKudzu yIDI DXS Kan (SEQ ID NO: 20).
[0088] A figura 23A é um gráfico apresentando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzukan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é a OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0089] A figura 23B é um gráfico apresentando a produção de
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30/343 isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzu yIDI kan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0090] A figura 23C é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzu DXS kan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0091] A figura 23D é um gráfico apresentando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0092] A figura 23E é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade
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31/343 específica de isopreno (pg/L/OD).
[0093] A figura 23F é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu yIDI. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 Mmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (Hg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0094] A figura 23G é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu DXS. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
[0095] A figura 23H é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan. A seta indica o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de Headspace ou produtividade específica (pg/L de Headspace /OD). Os losangos pretos representam OD600, os triângulos pretos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados brancos representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD). [0096] A figura 24 é um gráfico de pTrcKKDyIkIS kan.
[0097] As figuras 25A a 25D são a sequência nucleotídica de pTrcKKDyIkIS kan (SEQ ID NO: 33).
[0098] A figura 26 é um gráfico de pCL PtrcUpperPathway.
[0099] As figuras 27A a 27D são uma sequência nucleotídica de
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32/343 pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID NO: 46).
[00100] A figura 28 apresenta um gráfico do cassete contendo a via inferior do MVA e idi de levedura para integração no cromossomo de B. subtilis no lócus nprE. nprE a montante/a jusante indica 1 kb cada de sequência do lócus nprE para integração. O promotor aprE (promotor de serino protease alcalina) indica o promotor (-35, -10, +1 sítio de início da transcrição, RBS) do gene aprE. MVK1 indica o gene de mevalonato quinase de levedura. RBS-PMK indica o gene de fosfomevalonato quinase de levedura com um sítio de início RBS de Bacillus a montante. RBS-MPD indica o gene de levedura difosfomevalonato descarboxilase com um sítio de início RBS de Bacillus a montante. RBS-IDI indica o gene idi de levedura com um sítio de início RBS de Bacillus a montante. Terminador indica o terminador da transcrição de serino protease alcalina de B. amyliquefaciens. SpecR indica o marcador de resistência a espectomicina. nprE repetição a montante para amp. indica uma repetição direta da região a montante utilizada para amplificação.
[00101] As figuras 29A a 29D são uma sequência nucleotídica do cassete contendo a via inferior do MVA e idi de levedura para integração no cromossomo de B. subtilis no lócus nprE (SEQ ID NO: 47).
[00102] A figura 30 é um gráfico de p9796-poplar.
[00103] As figuras 31A a 31B são uma sequência nucleotídica de p9796-poplar (SEQ ID NO: 48).
[00104] A figura 32 é um gráfico de pTrcPoplar.
[00105] As figuras 33A a 33C são uma sequência nucleotídica de pTrcPoplar (SEQ ID NO: 49).
[00106] A figura 34 é um gráfico de pTrcKudzu yIDI Kan.
[00107] As figuras 35A a 35C são uma sequência nucleotídica de pTrcKudzu yIDI Kan (SEQ ID NO: 50).
[00108] A figura 36 é um gráfico de pTrcKudzuDXS Kan.
[00109] As figuras 37A a 37C são uma sequência nucleotídica de
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33/343 pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID NO: 51).
[00110] A figura 38 é um gráfico de pCL PtrcKudzu.
[00111] As figuras 39A a 39C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu (SEQ ID NO: 52).
[00112] A figura 40 é um gráfico de pCL PtrcKudzu A3.
[00113] As figuras 41A a 41C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID NO: 53).
[00114] A figura 42 é um gráfico de pCL PtrcKudzu yIDI.
[00115] As figuras 43A a 43C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu yIDI (SEQ ID NO: 54).
[00116] A figura 44 é um gráfico de pCL PtrcKudzu DXS.
[00117] As figuras 45A a 45D são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID NO: 55).
[00118] As figuras 46A a 46E apresentam gráficos que representam a produção de isopreno de matérias primas de biomassa. O painel A apresenta a produção de isopreno a partir de palhas de milho, o painel B apresenta produção de isopreno a partir de bagaços, o painel C apresenta produção de isopreno a partir de polpa de celulose de madeira macia, o painel D apresenta produção de isopreno de glicose e o painel E apresenta produção de isopreno a partir de células sem matéria prima adicional. Os quadrados cinza representam medidas de OD600 das culturas nos tempos indicados após a inoculação e os triângulos pretos representam a produção de isopreno nos tempos indicados após a inoculação.
[00119] A figura 47A apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno por BL21(ÀDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) em uma cultura sem adição de glicose. Os quadrados representam OD600 e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
[00120] A figura 47B apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de açúcar invertido de matéria
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34/343 prima de glicose por BL21(ÀDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Os quadrados representam OD600 e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
[00121] A figura 47C apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de matéria prima de açúcar invertido por BL21 (ÀDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Os quadrados representam OD600 e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
[00122] A figura 47D apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de matéria prima de palhas de milho de AFEX por BL21(ÀDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Os quadrados representam OD600 e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
[00123] As figuras 48A a 48C apresentam gráficos que demonstram o efeito do extrato de levedura de produção de isopreno. O painel A apresenta a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro de fermentadores alimentados com quantidades variadas do extrato de levedura. O painel B apresenta a evolução ao longo do tempo da concentração de isopreno dentro de fermentadores alimentados com quantidades variadas do extrato de levedura. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação. O painel C apresenta o efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli cultivada em cultura alimentada por bateladas.
[00124] As figuras 49A a 49C apresentam gráficos que demonstram a produção de isopreno a partir de um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo um plasmídeo pTrcKudzu + yIDI + DXS. O painel A apresenta a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura. O painel B apresenta a evolução ao longo do tempo da concentração de
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35/343 isopreno dentro do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. O painel C apresenta a evolução ao longo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura. [00125] A figura 50 é um gráfico de pJMupperpathway2.
[00126] As figuras 51A a 51C são a sequência nucleotídica de pJMupperpathway2 (SEQ ID NO: 56).
[00127] A figura 52 é um gráfico de pBS Kudzu no2.
[00128] A figura 53A é um gráfico apresentando o crescimento durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante em fermentação alimentada por batelada de 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinza representam CF443, cepa Bacillus BG3594comK com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
[00129] A figura 53B é um gráfico apresentando a produção de isopreno durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante em fermentação alimentada por bateladas de 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinza representam CF443, Bacillus cepa BG3594comK com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
[00130] A figura 54 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00131] A figura 55 é a evolução ao longo do tempo de concentração de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo
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36/343 de fermentação.
[00132] A figura 56 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00133] A figura 57 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicerol.
[00134] A figura 58 é a evolução ao longo do tempo de concentração de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicerol. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00135] A figura 59 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicerol.
[00136] As figuras 60A a 60C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 150 L alimentado com glicose.
[00137] As figuras 61A a 61C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00138] As figuras 62A a 62C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00139] A figura 63A a 63C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00140] As figuras 64A a 64C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00141] As figuras 65A a 65C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro
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37/343 do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00142] As figuras 66A a 66C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00143] As figuras 67A a 67C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00144] A figura 68 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série A como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico. Por exemplo, a primeira entrada na legenda da figura (isopreno em ar em 40°C) corresponde à mais alta curva no gráfico.
[00145] A figura 69 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série B como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 4% de água. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico. [00146] A figura 70 é um gráfico da temperatura adiabática de chama calculada para a Série C como uma função da concentração de combustível para vários níveis de oxigênio com 5% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
[00147] A figura 71 é um gráfico da temperatura adiabática de chama calculada para a Série D em função da concentração de combustível para vários níveis de oxigênio com 10% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
[00148] A figura 72 é um gráfico da temperatura adiabática de chama calculada para a Série E como uma função da concentração de combustível para vários níveis de oxigênio com 15% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
[00149] A figura 73 é um gráfico da temperatura adiabática de chama
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38/343 calculada para Série F como uma função da concentração de combustível para vários níveis de oxigênio com 20% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
[00150] A figura 74 é um gráfico das temperaturas calculadas chama adiabática para a Série G como uma função da concentração de combustível para vários níveis de oxigênio com 30% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem no gráfico.
[00151] A figura 75A é uma tabela da conversão do Modelo CAFT com os resultados da porcentagem do peso à porcentagem do volume para a Série A.
[00152] A figura 75B é um gráfico da inflamabilidade com os resultados a partir do Modelo CAFT para a Série A com a figura 68 plotada como porcentagem de volume.
[00153] A figura 76A é uma tabela da conversão do Modelo CAFT com os resultados da porcentagem do peso à porcentagem do volume para a Série B.
[00154] A figura 76B é um gráfico da inflamabilidade os resultados a partir do Modelo CAFT para a Série B com a figura 69 plotada como porcentagem de volume.
[00155] A figura 77 é uma figura representando o vaso de teste de inflamabilidade.
[00156] A figura 78A é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 1: 0% de Vapor, 0 psig e 40°C.
[00157] A figura 78B é uma tabela que resume os pontos de dados da explosão e da não explosão para a Série de Testes 1.
[00158] A figura 78C é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 1 comparado com o Modelo CAFT.
[00159] A figura 79A é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 2: 4% de Vapor, 0 psig e 40°C.
[00160] A figura 79B é uma tabela que resume os pontos de dados
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39/343 da explosão e da não explosão para a Série de Testes 2.
[00161] A figura 79C é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 2 comparado com o Modelo CAFT.
[00162] As figuras 80A a 80B são uma tabela das condições experimentais detalhadas e dos resultados para a Série de Testes 1.
[00163] A figura 81 é uma tabela das condições experimentais detalhadas e dos resultados para a Série de Testes 2.
[00164] A figura 82 é um gráfico da temperatura calculada das chamas adiabáticas plotado como uma função da concentração do fluido para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 3 atmosferas de pressão.
[00165] A figura 83 é um gráfico da temperatura calculada das chamas adiabáticas plotado como uma função da concentração do fluido para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 1 atmosfera de pressão.
[00166] A figura 84 é um gráfico da curva envelope da inflamabilidade construído com o uso de dados da figura 82 e seguindo a metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos de dados experimentais (os círculos) são de testes descritos neste que foram conduzidos em uma pressão de sistema de uma atmosfera inicial.
[00167] A figura 85 é um gráfico da curva envelope da inflamabilidade construído com o uso de dados da figura 83 e seguindo a metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos dos dados experimentais (os círculos) são de testes descritos neste que foram conduzidos em uma pressão de sistema de uma atmosfera inicial.
[00168] A figura 86A é um cromatograma GC/MS de gás de escape de fermentação.
[00169] A figura 86B é uma expansão da Fig. 86A para apresentar volatilidades menores presentes em gás de escape de fermentação.
[00170] A figura 87A é um cromatograma GC/MS de voláteis traços
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40/343 presentes em gás de escape seguido de retenção por criogenia em 78 C.
[00171] A figura 87B é um cromatograma GC/MS de voláteis traços presentes em gás de escape seguido de retenção por criogenia em 196DC.
[00172] A figura 87C é uma expansão da figura 87B.
[00173] A figura 87D é uma expansão da figura 87C.
[00174] As figuras 88A a 88B são cromatogramas GC/MS comparando hidrocarbonetos C5 de isopreno derivado de petróleo (figura 88A) e isopreno biologicamente produzido (figura 88B). O padrão contém três impurezas de hidrocarbonetos C5 eluindo em volta do pico principal de isopreno (figura 88A). Em contraste, o isopreno biologicamente produzido contém quantidades de etanol e acetona (tempo de execução de 3,41 minutos) (figura 88A).
[00175] A figura 89 é um gráfico da análise de gás de escape de fermentação de uma cepa de E. coli BL21(DE3) pTrcIS expressando uma isopreno sintase de kudzu e alimentadas com glicose com 3 g/L de extrato de levedura.
[00176] A figura 90 apresenta as estruturas de várias impurezas que são estruturalmente similares ao isopreno e podem também agir como venenos de catalisador de polimerização.
[00177] A figura 91 é um gráfico de pTrcHis2AUpperPathway (também chamado de pTrcUpperMVA).
[00178] As figuras 92A a 92C são a sequência nucleotídica de pTrcHis2AUpperPathway (também chamado de pTrcUpperMVA) (SEQ ID NO: 86).
[00179] A figura 93 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00180] A figura 94 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A
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41/343 concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
[00181] A figura 95 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00182] A figura 96 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
[00183] A figura 97 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
[00184] A figura 98 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
[00185] A figura 99 é a evolução ao longo do tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00186] A figura 100 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00187] A figura 101 é a evolução ao longo do tempo de atividade específica de isopreno a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00188] A figura 102 é um gráfico de pCLPtrcUpperPathwayHGS2. [00189] As figuras 103A a 103C são a sequência nucleotídica da pCLPtrcUpperPathwayHGS2 (SEQ ID NO: 87).
[00190] A figura 104 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00191] A figura 105 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A
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42/343 concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00192] A figura 106 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00193] A figura 107 é um gráfico de plasmídeo MCM330.
[00194] As figuras 108A a 108C são a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM330 (SEQ ID NO: 90).
[00195] A figura 109 é um gráfico de pET24D-Kudzu.
[00196] As figuras 110A e 110B são a sequência nucleotídica de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO: 101).
[00197] A figura 111A é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00198] A figura 111B é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
[00199] A figura 111C é a evolução ao longo do tempo da produtividade específica de isopreno na biorreator de 15 L alimentado com glicose.
[00200] A figura 112 é um gráfico de plasmídeo pET24 P.alba HGS. [00201] As figuras 113A e 113B são a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pET24 P.alba HGS (SEQ ID NO: 102).
[00202] A figura 114 é um diagrama esquemático mostrando sítios de restrição utilizados para a digestão endonuclease o construto plasmídeo EWL230 e extremidades coesas compatíveis entre sítios BspHI e NcoI.
[00203] A figura 115 é um gráfico de plasmídeo EWL230.
[00204] As figuras 116A e 116b são a seqüências de nucleotídeos de plasmídeo EWL230 (SEQ ID NO: 103).
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43/343 [00205] A figura 117 é um diagrama esquemático mostrando sítios de restrição utilizados para a digestão endonuclease de construto plasmídeo EWL244 e extremidades coesas compatíveis entre sítios NsiI e PstI.
[00206] A figura 118 é um gráfico de EWL244.
[00207] As figuras 119A e 119b são a seqüência de nucleotídeos de plasmídeo EWL244 (SEQ ID NO: 104).
[00208] A figura 120 é um gráfico de plasmídeos MCM484-487.
[00209] As figuras 121A a 121C é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo MCM484 (SEQ ID NO: 105).
[00210] As figuras122 a 122C é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo MCM485 (SEQ ID NO: 106).
[00211] As figuras123A a 123C é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo MCM486 (SEQ ID NO: 107).
[00212] As figuras124A a 124C é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo MCM487 (SEQ ID NO: 108).
[00213] As figuras125A a 125D são gráficos de produção de isopreno por cepa E. coli (EWL256) expressando genes da via MVA e cultivadas em cultura alimentada por batelada na escala de 15 L, sem alimentação de extrato de levedura. A figura 125A mostra a evolução temporal da densidade óptica no biorreator de 15L alimentado com glicose. A figura 125B mostra a evolução temporal do título de isopreno dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação. A figura 125C mostra a evolução temporal do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15-L alimentado com glicose. A figura 125D mostra a taxa total de evolução de dióxido de carbono (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose.
[00214] As figuras126A a 126E são gráficos de produção de isopreno
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44/343 por cepa E. coli (EWL256) expressando genes da via MVA e cultivadas em cultura alimentada por batelada na escala de 15 L com alimentação de extrato de levedura. A figura 126A mostra a evolução temporal da densidade óptica no biorreator de 15L alimentado com glicose. A figura 126.oB mostra a evolução temporal do título de isopreno dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação. A figura 126C mostra a evolução temporal do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15-L alimentado com glicose. A figura 126D mostra a produtividade volumétrica dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. Um valor médio de 1,1 g/L/hora foi mantida por um período de 40 horas (23 a 63 horas) com alimentação de extrato de levedura. A figura 126E mostra a taxa de evolução de dióxido de carbono (CER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose.
[00215] As figuras127A a 127D produção mostra de isopreno a partir de diferentes fontes de carbono através do MVA (via). A figura 127A mostra crescimento de E. coli EWL256, que contém tanto a via MVA e isopreno sintase, em ambos glicose, hidrolisado de biomassa, glicerol, ou acetato como única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionado foi incluído. O crescimento foi medido como a densidade óptica a 600 nm. A figura 127B mostra a produtividade específica de isopreno de E. coli EWL256 contendo tanto a via MVA e isopreno sintase, quando cultivada em ambos glicose, hidrolisado de biomassa, glicerol, acetato ou como fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionado foi incluído. As amostras foram colhidas 190 minutos, 255 minutos e 317 minutos após a inoculação e isopreno
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45/343 produzida pela bactéria foi medida utilizando GC-MS. A figura 127C mostra crescimento de E. coli em ambos EWL256 glicose ou xilose como única fonte de carbono. As diferentes fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionado foi incluído. O crescimento foi medido como a densidade óptica a 600nm. A figura 127D mostra a produtividade específica de isopreno de E. coli EWL256 quando cultivada em glicose ou xilose como fonte de carbono. As fontes de carbono foram adicionadas a uma concentração de 1% no meio. Um controle negativo sem fonte de carbono adicionado foi incluído. As amostras foram colhidas 260 minutos, 322 minutos e 383 minutos após a inoculação e isopreno produzida pela bactéria foi medida utilizando GC-MS.
[00216] As figuras128A e 128B mostrar a produção de isopreno por cepas de E. coli a partir da glicose e de ácidos graxos, respectivamente. Para a figura 128A, onze colônias a partir da transformação de WW4 com pMCM 118, o rolamento da via plasmídeo inferior ácido mevalônico, foram escolhidos para verificar a presença do menor via. Células das colônias foram cultivadas em meio contendo 0,1 TM3 extrato de levedura% e glicose a 2%. Alíquotas da cultura induzida foram analisadas para a produção de isopreno após 4 horas de indução. Todas as colônias mostraram a produção de isopreno. O indutor IPTG teve um forte efeito inibitório no crescimento, como foi evidente a partir de 3 a 4,6 vezes a densidade de células reduzido em ir 5-90 mM de concentração do indutor (dados não mostrados). O gráfico mostra que a maior indução, gera uma maior titulação específica de isopreno. Para a figura 128B, a cultura de produção foi inoculada a partir de uma cultura lavada durante a noite em diluição 1 a 10. O cultivo foi realizado por várias horas e induzido com 50 mM IPTG. A barra da esquerda mostra os resultados do ensaio de isopreno quatro horas após a indução
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46/343 seguida por um ensaio de uma hora de acumulação de isopreno. A barra do meio mostra o valor de uma hora normalizada para a mesma cultura com o mesmo período de indução, mas analisada por um ensaio de 12 horas de acumulação de isopreno. A barra da direita mostra o valor para um ensaio de uma hora de acumulação de isopreno da cultura que foi induzido por 13 horas.
[00217] A figura 129 é um gráfico do vetor de transporte E. coliStreptomyces pUWL201PW (6400 bp) utilizado para a clonagem de isopreno sintase de Kudzu. Tsr, gene de resistência Tioestreptona. Fotografia é tirada a partir Doumith et al. Mol. Gen. Genet. 264: 477 a 485, 2000.
[00218] A figura 130 mostra a formação de isopreno por cepa Streptomyces albus selvagem (peso) e cepas abrigando plasmídeo pUWL201PW (controle negativo) ou pUWL201_iso (sintase que codificam isopreno de Kudzu).
[00219] A figura 131A é um mapa do operon de Via Inferior M. mazei Archaea.
[00220] As figuras131B e 131C são a sequência nucleotídica do operon de Via Inferior M. mazei Archaea (SEQ ID NO: 127).
[00221] A figura 132A é um gráfico de MCM376-MVK de M. mazei Archaeal Lowerin pET200D.
[00222] As figuras132B e 132C são a sequência nucleotídica de MCM 376-MVK de M. mazei Archaeal Lowerin pET200D (SEQ ID NO: 128).
[00223] As figuras133A a 133D mostram o crescimento e a produtividade específica de produção de isopreno para EWL256 em comparação com RM11608-2. O crescimento (OD550) é representado pelos losangos brancos; a produtividade específica de isopreno é representada pelas barras sólidas. O eixo x é o tempo (horas) pósindução com um 200 (figuras 133A e 133b) ou 400 (figuras 133C e
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47/343
133D) IPTG mM. Eixo Y-1 é a produtividade do isopreno (mg/L/OD/h) e Y-2 representa unidades arbitrárias de densidade óptica no comprimento de onda de 550. Estes valores para o OD550 devem ser multiplicados por 6,66 para obter o OD real da cultura.
[00224] A figura 134 é um gráfico de plasmídeo pBBRCMPGI1.5 PGL.
[00225] As figuras135A e 135B são a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pBBRCMPGI1.5 PGL (SEQ ID NO: 136).
[00226] As figuras136A a 136F são gráficos de produção de isopreno por cepa E. coli expressando M. mazei mevalonato quinase, P.alba isopreno sintase, e PGL (RHM111608-2), e cultivadas em cultura alimentada por batelada em escala 15-L. A figura 136A mostra a evolução temporal da densidade óptica no biorreator de 15L alimentado com glicose. A figura 136B mostra a evolução temporal do título de isopreno dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação. Método de cálculo de isopreno: isopreno cumulativo produzido em 59 horas, g/fermentador de volume em 59 horas, L [=] g/L de caldo. A figura 136c também mostra o tempo de curso do título de isopreno dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. Método de cálculo de isopreno: dt (taxa de produção instantânea de isopreno, g/L/h) de t = 0 a 59 horas [=] caldo g/L. A figura 136D mostra a evolução temporal do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15-L alimentado com glicose. A figura 136E mostra produtividade volumétrica dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. A figura 136F mostra a evolução de dióxido de carbono taxa (CER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose.
[00227] A figura 137A é um gráfico de plasmídeo pJ201: 19.813. [00228] As figuras 137B e 137C são as seqüências de nucleotídeos
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48/343 de pJ201: 19813 (SEQ ID NO: 137).
[00229] A figura 138 mostra a evolução temporal da densidade óptica no biorreator de 15L alimentado com glicose.
[00230] A figura 139 mostra a evolução temporal do título de isopreno dentro do biorreator de 15-L alimentado com glicose. O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
[00231] A figura 140 mostra a evolução temporal do isopreno total produzido a partir do biorreator de 15-L alimentado com glicose.
[00232] A figura 141 é um gráfico que ilustra a evolução temporal da densidade óptica dentro do 500-L biorreator alimentado com glicose e extrato de levedura.
[00233] A figura 142 é um gráfico que ilustra a evolução temporal do título de isopreno dentro do 500-L biorreator alimentado com glicose e extrato de levedura. O título é definido como a quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
[00234] A figura 143 é um gráfico que ilustra a evolução temporal do isopreno total produzido a partir do biorreator de 500-L alimentado com glicose e extrato de levedura.
Descrição Detalhada da Invenção [00235] A invenção provê, entre outras coisas, composições e métodos para produzir um polímero de isopreno a partir de recursos renováveis. Em uma modalidade, são providas aqui composições e métodos para a produção de copolímeros de isopreno e outras moléculas não-isopreno. Em outra modalidade, é aqui provido um polímero do isopreno derivado de fontes renováveis de vários pesos moleculares, por exemplo, uma borracha de homopolímero de cis-1,4poli-isopreno. O polímero é produzido pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis. O isopreno sintético contendo os polímeros desta invenção oferece a vantagem de ser verificável como
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49/343 sendo derivado de fontes de base não petroquímica. Em um aspecto, o isopreno derivado de recursos renováveis compreende bioisopreno. Em outro aspecto, o isopreno derivado de fontes renováveis pode ser bioisopreno. Em outro aspecto, o isopreno derivado de fontes renováveis pode ser uma composição bioisopreno produzida pelas células de cultura expressando uma enzima heteróloga isopreno sintase. Em alguns aspectos, o isopreno derivado de fontes renováveis sofre polimerização para a produção de poli-isopreno como cis-1,4-poliisopreno. Em outros aspectos, o isopreno derivado de fontes renováveis sofre polimerização com um ou mais de monômeros para produzir outros co-polímeros compreendendo unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno.
Definições [00236] Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que comumente entendido por aqueles usualmente versados na técnica a que pertence esta invenção. Embora todos os métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos encontrem uso na prática da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são aqui descritos. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo são descritos mais detalhadamente por referência a Especificação como um todo. Todos os documentos citados são, em suas partes pertinentes, aqui incorporados por referência. Todavia, a citação de qualquer documento não deve ser interpretada como uma admissão de que ele seja anterioridade com respeito à presente invenção.
[00237] Como usado aqui, recursos renováveis refere-se a recursos que não sejam combustíveis fósseis. Geralmente, os recursos renováveis são derivados de organismos vivos ou organismos recentemente vivos que podem ser repostos à medida que são consumidos. Os recursos renováveis podem ser substituídos por ciclos
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50/343 ecológicos naturais ou práticas de boa gestão. Exemplos não limitantes incluem a biomassa (por exemplo, gramíneas, cânhamo, milho, choupo, salgueiro sorgo, cana), árvores e outras plantas. Recursos renováveis, fontes de carbono renováveis e bio-renováveis são geralmente aqui intercambiáveis.
[00238] Como usado aqui, pelo menos uma parte da composição inicial isopreno pode se referir a, pelo menos, de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%, ou 100% da composição inicial de isopreno que experimenta polimerização.
[00239] O termo isopreno ou monômero de isopreno refere-se a
2-metil-1,3-butadieno (CAS no 78-79-5), que é o produto direto e final de hidrocarboneto C5 volátil proveniente da eliminação de pirofosfato de
3,3-dimetilalil pirofosfato (DMAPP), e não envolve articulação ou polimerização de [um] molécula(s) IPP a uma molécula(s) DMAPP. O termo isopreno não é geralmente pretendido a ser limitado a seu método de produção, a menos que de outro modo aqui indicado.
[00240] Como usado aqui, isopreno biologicamente produzido ou bioisopreno é o isopreno produzidos por qualquer meio biológico, tais como produzido por culturas de células geneticamente modificadas, microbianos naturais, plantas ou animais. Uma composição bioisopreno geralmente contém menos impurezas de hidrocarbonetos que o isopreno produzido a partir de fontes petroquímicas, e muitas vezes requer um tratamento mínimo, a fim de ser de grau de polimerização. Uma composição bioisopreno também tem um perfil de impurezas diferente de uma composição de isopreno petroquimicamente produzida.
[00241] O bioisopreno derivado de carbono renovável pode ser convertido para uma variedade de polímeros por polimerização química.
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São aqui fornecidos métodos para a recuperação de isopreno a partir da fermentação e posterior conversão em polímeros compreendendo unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, recuperação e purificação de isopreno a partir de gás de escape de fermentação e a subsequente polimerização da fase gás ou fase líquida. Ambos os processos em modo contínuo ou em bateladas contemplados dentro do escopo da invenção.
[00242] Como aqui mais detalhado, as composições de bioisopreno distinguem-se de isopreno derivado de petróleo (aqui referida como petro-isopreno) composições em que as composições bioisopreno são substancialmente livres de qualquer contaminação de hidrocarbonetos C5 insaturados que estão usualmente presentes nas composições petro-isopreno, tais como, mas não limitado a, 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, cis-1,3-pendadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, e cis-pent-3-eno-1-ino. Se houver qualquer contaminação de hidrocarbonetos C5 presentes na composição do material inicial bioisopreno aqui descrito, ela será em níveis menores que aquelas nas composições de petro-isopreno. Várias dessas impurezas são particularmente problemáticas devido à sua semelhança estrutural com isopreno e o fato de que elas podem agir como venenos para o catalisador de polimerização. Como detalhado abaixo, composições de isopreno biologicamente produzidas podem ser substancialmente livres de qualquer contaminação por hidrocarbonetos C5 insaturados sem sofrer purificação extensiva.
[00243] A composição bioisopreno se distingue da composição petro-isopreno pelo fato de que a composição bioisopreno contém outros bio-derivados (compostos derivados de fontes biológicas e/ou associados a processos biológicos que são obtidos em conjunto com o
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52/343 bioisopreno) que não estão presentes ou presentes em níveis muito mais baixos nas composições petro-isopreno, tais como alcoóis, aldeídos, cetonas e similares. Os bio-subprodutos podem incluir, mas não estão limitados a, etanol, acetona, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cis- e trans-3metil-1,3-pentadieno, um álcool prenil C5 (tais como 3-metil-3-buten-1ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2, 4,5trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2propanol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-
2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3- cicloeptenolpiridina, 3-hexen-1-ol, o acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3, 7-dimetil-2,6-octadien-1-ol), citronelol (3,7-dimetil-6octen-1-ol) ou um polímero linear de isopreno (como um dímero de isopreno linear ou um trímero de isopreno linear derivado do a polimerização de unidades de isopreno múltiplas). Em alguns aspectos, um ou mais destes compostos são removidos a partir da composição bioisopreno antes da polimerização. Em outros aspectos, um ou mais destes compostos estão incluídos na reação de polimerização.
[00244] Além disso, bioisopreno se distingue do petro-isopreno por impressão digital carbono. Em um aspecto, bioisopreno tem um maior teor de carbono 14 radioativo (14C) ou maior relação de 14C/12C que petro-isopreno. O bioisopreno é produzido a partir de fontes renováveis de carbono, assim, o teor de 14C ou a razão 14C/12C em bioisopreno é a mesma que presente na atmosfera. Petro-isopreno, por outro lado, é derivado de combustíveis fósseis depositados milhares a milhões de anos atrás, portanto, o teor de 14C ou a razão 14C/12C é diminuída devido
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53/343 ao decaimento radioativo. Como discutido em maiores detalhes aqui, os produtos combustível derivado de bioisopreno tem maior teor de 14C ou razão 14C/12C de combustível derivado de produtos petro-isopreno. Em uma modalidade, um produto combustível derivado de bioisopreno aqui descrito tem um teor de 14C ou razão 14C/12C semelhante à da atmosfera. Em outro aspecto, bioisopreno pode ser analiticamente distinguido dos petro-isopreno pela relação de isótopos estáveis de carbono (13C/12C), que pode ser relatado como valores delta representado pelo símbolo õ13C. Por exemplo, para isopreno derivado de destilação extrativa de fluxos C5 de refinarias de petróleo, δ 13C é de cerca de -22 a cerca de -24 %o. Esta faixa é típica para hidrocarbonetos insaturados, leves, derivados de petróleo, e produtos derivados de isopreno de base petróleo tipicamente contêm unidades isoprênicas com o mesmo δ 13C. O bioisopreno produzido por fermentação de glicose derivada de milho (δ 13C -10,73 %o), com quantidades mínimas de outros nutrientes contendo carbono (por exemplo, extrato de levedura) produz isopreno, que pode ser polimerizado em poli-isopreno com δ 13C -14,66 %o a -14,85 %o. Produtos produzidos a partir de tal bioisopreno são esperados possuir valores δ 13C que são menos negativos que aqueles dos isopreno derivados de petróleo.
[00245] Embora o isopreno possa ser obtido por fracionamento do petróleo, a purificação desse material é cara e demorada. Craqueamento de petróleo do fluxo de hidrocarbonetos C5 produz apenas 15% de isopreno. O isopreno também é produzido naturalmente por uma variedade de microrganismos, plantas e espécies animais. Em particular, dois caminhos foram identificados para a biossíntese de isopreno: a via mevalonato (MVA) e as vias não-mevalonato (DXP). Culturas de células geneticamente modificadas em biorreatores têm produzido isopreno de forma mais eficiente, em quantidades maiores,
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54/343 em purezas mais elevadas e/ou com perfis únicos de impurezas, por exemplo, como descrito nos pedidos de patentes provisórias nos U.S. 61/013.61/013 e 386.574, depositados em 13 de dezembro de 2007, WO 2009/076676, pedidos de patentes provisórias Nos U.S. 61/134.094, 61/134.947, 61/134.011 e 61/134.103, depositados em 02 de julho de 2008, WO 2010/003007, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031079, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.186, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031062, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.189, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031077, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.200, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031068, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.204, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031076, pedido de patente provisória no U.S. 61/141.652, depositado em 30 de dezembro de 2008, PCT/US09/ 069862, Pedido de Patente No U.S. 12/335.071, depositado 15 de dezembro de 2008 (EUA 2009/0203102 A1) e dos Pedido de Patente No U.S. 12/429.143, depositados em 23 abril de 2009 (EUA 2010/0003716 A1), que estão incorporados por referência em suas totalidades.
[00246] Em um aspecto, a invenção apresenta composições e sistemas para a produção de um polímero do isopreno compreendendo: (a) uma composição de isopreno derivada de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial de isopreno, em que pelo menos uma parte da composição inicial isopreno sofre polimerização. Um material inicial de isopreno derivado de fontes renováveis é submetido a polimerização química para produzir um polímero que compreende unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno a partir de fontes renováveis. Em um aspecto, uma composição de isopreno derivada de fontes renováveis pode ser
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55/343 uma composição bioisopreno derivado de fontes renováveis de carbono.
Composições Exemplificadoras Iniciais Isopreno [00247] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis compreende mais que, ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg de isopreno. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende mais que, ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende mais que, ou cerca de 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 kg de isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição inicial é entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg, por exemplo, entre cerca de 2 a cerca de 100 mg, de cerca de 100 a cerca de 500 mg, de cerca de 500 a cerca de 1.000 mg, de cerca de 1.000 a cerca de 2.000 mg, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição inicial é entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg, de cerca de 100 a cerca de 5.000 mg, de cerca de 200 a cerca de 2.000 mg, de cerca de 200 a cerca de 1.000 mg, de cerca de 300 a cerca de 1.000 mg, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição inicial é entre cerca de 2 a cerca de 5.000 g, por exemplo, entre cerca de 2 a cerca de 100 g, de cerca de 100 a cerca de 500 g, de cerca de 500 a cerca de 1.000 g, de cerca de 1.000 a cerca de 2.000 g, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 g. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição inicial é entre cerca de 2 a cerca de 5.000 kg, de cerca de 10 a cerca de 2.000 kg, de cerca de 20 a cerca de 1.000 kg, de cerca de 20 a cerca de 500 kg, de cerca de 30 a cerca de 200 kg, ou cerca de 40 a cerca de 100 kg. Em algumas modalidades, mais que, ou cerca de 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% (p/p) da
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56/343 fração orgânica volátil da composição inicial é isopreno.
[00248] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis compreende mais que, ou cerca de 98,0,
98.5, 99,0, 99,5, ou 100% em peso de isopreno em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição de partido isopreno altamente pura compreende mais que, ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96,
99,98, ou 100% em peso de isopreno em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial tem uma resposta do detector em relação maior que, ou de cerca de 98,0, 98,5, 99,0, 99,5, ou 100% de isopreno em comparação com a resposta do detector de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial tem uma resposta do detector em relação maior que, ou de cerca de 99,90, 99,91, 99,92, 99,93, 99,94, 99,95, 99,96, 99,97,
99,98, 99,99, ou 100% de isopreno em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende entre cerca de 98,0 a cerca de 98,5, de cerca de 98,5 a 99,0 com, de cerca de 99,0 a cerca de 99,5, de cerca de 99,5 a cerca de 99,8, de cerca de 99,8-100 isopreno% em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende entre cerca de 99,90 a cerca de 99,92, de cerca de 99,92 a cerca de 99,94, de cerca de 99,94 a cerca de 99,96, de cerca de 99,96 a cerca de 99,98, de cerca de 99,98-100 isopreno% em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial.
[00249] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis constitui menos do que, ou cerca de 2,0,
1.5, 1,0, 0,5, 0,2, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001,
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0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 outros que o isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pendadieno, trans-
1.3- pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, pent -4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1ino, ou cis-pent-3- eno-1-ino) em peso em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial tem uma resposta do detector em relação inferior ou cerca de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,2, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01,0,005, 0,001,0,0005, 0,0001,0,00005, ou 0,00001% a hidrocarbonetos C5 outros que o isopreno em comparação com a resposta do detector de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição inicial tem uma resposta do detector em relação inferior ou cerca de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,2, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% a 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3pendadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 1-penteno, 2-metil- 1-buteno, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino em comparação com o detector resposta para todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial. Em algumas modalidades, a composição de partido isopreno altamente pura compreende entre cerca de 0,02 a cerca de 0,04%, de cerca de 0,04 a cerca de 0,06%, de cerca de 0,06 a 0,08%, a cerca de 0,08 para 0,10%, ou cerca de 0,10 a cerca de 0,12% de hidrocarbonetos C5 outros que o isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-
1.3- pendadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino) em peso em relação ao total peso de todos os hidrocarbonetos C5 na composição inicial.
[00250] Em algumas modalidades, a composição de isopreno
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58/343 derivada de fontes renováveis constitui menos do que, ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1,0,5, 0,1,0,05, 0,01, ou 0,005 mg/L de um composto que inibe a polimerização do isopreno para qualquer composto na composição inicial que inibe a polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, tal como cerca de 0,01 a cerca de 10, de cerca de 0,01 a cerca de 5, de cerca de 0,01 a cerca de 1, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 mg/L de um composto que inibe a polimerização do isopreno para qualquer composto na composição inicial que inibe a polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno compreende menos de, ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 mg/L de um hidrocarboneto outro que isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pendadieno, trans-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil -1-butino, pent-4-eno-1ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino). Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, tal como cerca de 0,01 a cerca de 10, de cerca de 0,01 a cerca de 5, de cerca de 0,01 a cerca de 1, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 mg/L de um hidrocarboneto outro que isopreno. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno compreende menos de, ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 mg/L de uma proteína ou de ácidos graxos (como um proteína ou ácido graxo que está naturalmente associada com borracha natural).
[00251] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis constitui menos do que, ou cerca de 10, 5, 1, 0,8, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrila, ou 1, 3-ciclopentadieno. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende menos de,
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59/343 ou cerca de 5, 1,0,5, 0,1,0,05, 0,01, ou 0.005 ppm de enxofre ou alenos. Em algumas modalidades, a composição inicial de isopreno compreende menos de cerca de 30, 20, 15, 10, 5, 1,0,5, 0,1,0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de todos os acetilenos (tais como 1-pentino, 2-pentino, 3metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, e cis-pent-3eno-1-ino). Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno compreende menos de, ou cerca de 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1,0,5, 0,1,0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de dímeros isopreno, como dímeros isopreno cíclico (por exemplo, compostos cíclicos C10 derivados da dimerização de duas unidades de isopreno).
[00252] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis inclui etanol, acetona, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cise trans-3-metil-1, 3 -pentadieno, um prenil C5 (tais como 3-metil-3buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou qualquer de dois ou mais dos mencionados anteriormente. Em modalidades particulares, a composição inicial de isopreno compreende mais que, ou cerca de 0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 mg/L de etanol, acetona, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cis- e trans-3-metil-1,3-pentadieno, um prenil C5 (tais como 3-metil-3-buten-1 -ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou qualquer de dois ou mais dos mencionados anteriormente. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 120, como cerca de 0,01 a cerca de 80, de cerca de 0,01 a cerca de 60, de cerca de 0,01 a cerca de 40, de cerca de 0,01 a cerca de 30, de cerca de 0,01 a cerca de 20, de cerca de 0,01 a cerca de 10, de cerca de 0,1 a cerca de 80, de cerca de 0,1 a cerca de 60, de cerca de 0,1 a cerca de 40, de cerca de 5 a cerca de 80, de cerca de 5 a cerca de 60, ou cerca de 5 a cerca de 40 mg/L de etanol, acetaldeído metanol, acetona, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano,
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60/343 cis- e trans-3-metil-1,3-pentadieno, um C5 prenil álcool, ou qualquer de dois ou mais dos mencionados anteriormente.
[00253] Em algumas modalidades, a composição de isopreno derivada de fontes renováveis inclui um ou mais dos seguintes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5trimetilpiridina, 2, 3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-
3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3-cicloeptenolpiridina, ou um polímero de isopreno linear (como um dímero de isopreno linear ou um trímero de isopreno linear derivada da polimerização de unidades de isopreno múltiplas). Em modalidades diferentes, a quantidade de um desses componentes em relação à quantidade de isopreno em unidades de percentagem em peso (ou seja, o peso do componente dividido pelo peso dos tempos de isopreno 100) é maior que, ou de cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p). Em algumas modalidades, a resposta do detector relativo para o segundo composto em comparação com a resposta do detector de isopreno é maior que, ou de cerca de 0,01,0,02, 0,05, 0,1,0,5, 1,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110%. Em modalidades diferentes, a quantidade de um desses componentes em relação à quantidade de isopreno em unidades de percentagem em peso (ou seja, o peso do componente dividido pelo peso dos tempos de isopreno 100) é entre cerca de 0,01 a cerca de 105% (p/p ), como cerca de 0,01 a cerca de 90, de cerca de 0,01 a cerca de 80, de cerca de 0,01 a cerca de 50, de cerca de 0,01 a cerca de 20, de cerca de 0,01 a cerca de 10, de cerca de 0,02 a cerca de 50, de cerca
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61/343 de 0,05 a cerca de 50, de cerca de 0,1 a cerca de 50, ou 0,1 a cerca de 20% (p/p).
[00254] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da composição de isopreno derivada de fontes renováveis está em uma fase gasosa. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da composição de isopreno derivada de fontes renováveis está em uma fase líquida (como um condensado). Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da composição de isopreno derivada de fontes renováveis está em uma fase sólida. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da composição de isopreno derivada de fontes renováveis é absorvida a um suporte sólido, como um suporte que inclui sílica e/ou carvão ativado. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno é misturada com um ou mais solventes. Em algumas modalidades, a composição inicial isopreno é misturada com um ou mais gases.
[00255] Técnicas para a produção de isopreno em culturas de células que produzem isopreno são descritas nos pedidos de patentes provisórias Nos U.S. 61/013.386 e 61/013.574, depositados em 13 de dezembro de 2007, WO 2009/076676, pedidos de patentes provisórias Nos U.S. 61/134094, 61/ 134.947, 61/134011 e 61/134103, depositados em 2 de julho de 2008, WO 2010/003007, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031079, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.186, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/ 031062, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.189, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031077, Pedido de patente provisória no U.S. 61/097200, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031068, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.204, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031076, pedido de patente provisória no U.S. 61/141.652, depositado em dezembro 30, 2008,
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PCT/US09/069862, Pedido de Patente no U.S. 12/335, 071, depositado 15 de dezembro de 2008 (EUA 2009/0203102 A1) e Pedido de Patente no U.S. 12/429.143, depositado 23 de abril de 2009 (EUA 2010/0003716 A1), os ensinamentos dos quais aqui se incorporam por referência com a finalidade de ensinar técnicas para a produção e recuperação de isopreno por tal processo. Em qualquer caso, pedidos de patentes provisórias Nos U.S. 61/013.386 e 61/013.574, depositados em 13 de dezembro de 2007, WO 2009/076676, pedidos de patentes provisórias Nos U.S. 61/134.094, 61/134.947, 61/134.011 e 61/134103, depositados em 02 de julho de 2008, WO 2010/003007, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031079, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.186, depositado em 15 de setembro, 2008, WO 2010/031062, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.189, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031077, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.200, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031068, pedido de patente provisória no U.S. 61/097.204, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031076, pedido de patente provisória no U.S. 61/141.652, depositado em 30 de dezembro de 2008, PCT/US09/069862, Pedido de Patente no U.S. 12/335.071, depositado 15 de dezembro de 2008 (EUA 2009/0203102 A1) e dos Pedido de Patente no U.S. 12/429.143, depositado 23 de abril de 2009 (EUA 2010/ 0003716 A1) ensinam composições e métodos para a produção de quantidades aumentadas do isopreno em culturas de células. Pedido de Patente no U.S. 12/335.071, depositado 15 de dezembro de 2008 (EUA 2009/ 0203102 A1) ainda ensina composições e métodos para a coprodução de isopreno e hidrogênio a partir de células cultivadas. Em particular, estas composições e composições métodos e métodos de aumentar a taxa de produção de isopreno e aumentar a quantidade total de isopreno, que é produzida. Por exemplo, sistemas de cultura de
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63/343 células que geram 4,8 x 104 nmol/gwcm/hora de isopreno foram produzidos (Tabela 1). A eficiência destes sistemas é demonstrada pela conversão de cerca de 2,2% do carbono que as células consomem a partir de um meio de cultura celular em isopreno. Como mostrado nos exemplos e na Tabela 2, de cerca de 3 g de isopreno por litro de caldo foi gerado. Se desejar, quantidades ainda maiores de isopreno podem ser obtidas usando outras condições, tais como os aqui descritos. Em algumas modalidades, uma fonte renovável de carbono é usada para a produção de isopreno. Em algumas modalidades, a produção de isopreno é dissociada do crescimento das células. Em algumas modalidades, as concentrações de isopreno e quaisquer oxidantes são dentro das faixas não inflamáveis para reduzir ou eliminar o risco de que um incêndio possa ocorrer durante a produção ou recuperação de isopreno. As composições e métodos são desejáveis porque permitem que o rendimento de isopreno alta por célula, o rendimento de alto carbono, a pureza de isopreno alta, alta produtividade, baixo consumo de energia, baixo custo de produção e investimento, e mínimas reações paralelas. Esta escala, eficiente grandes, o processo de biossíntese para a produção de isopreno fornece uma fonte de isopreno sintético para produtos à base de isopreno, como borracha e fornece uma desejável, alternativa de baixo custo para o uso de borracha natural.
[00256] Como discutido mais adiante, a quantidade de isopreno produzida pelas células pode ser aumentada através da introdução de um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase (por exemplo, uma planta de isopreno sintase polipeptídeo) para as células. Polipeptídeos isopreno sintase converter difosfato dimetilalil (DMAPP) em isopreno. Como mostrado nos exemplos, um polipeptídio heterólogo isopreno sintase de Pueraria Montana (kudzu) ou de Populus alba (Choupo) foi expresso em uma variedade de células do hospedeiro, tais como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia
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64/343 lipolytica, e Trichoderma reesei. Como também mostram os exemplos, uma heteróloga mevalonato quinase Methanosarcina mazei (M. mazei) (MVK) foi expressa em células hospedeiras, tais como Escherichia coli para aumentar a produção isopreno. Todas essas células produziram mais isopreno que as correspondentes células sem o polipeptídeo isopreno sintase heterólogo. Como ilustrado nas Tabelas 1 e 2, grandes quantidades de isopreno são produzidos usando os métodos descritos neste documento. Por exemplo, as células B. subtilis com um ácido nucleico heterólogo isopreno sintase produziu cerca de isopreno de 10 vezes mais em um fermentador 14 litros do que o correspondente controle de células B. subtilis sem o ácido nucleico heterólogo (Tabela 2). A produção de 60,5 g de isopreno por litro de caldo (mg/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio de célula e o volume das células) por E. coli e 30 mg/L de B. subtilis em fermentadores indica que quantidades significativas de isopreno podem ser geradas (Tabela 2). Se desejar, o isopreno pode ser produzido em escala ainda maior ou outras condições aqui descritas podem ser usadas para aumentar ainda mais a quantidade de isopreno. Os vetores que figuram nos quadros 1 e 2 e as condições experimentais são descritos em mais detalhes abaixo e na seção Exemplos.
Tabela 1: Rendimentos representativos de isopreno a partir de um frasco de agitação usando as culturas de células e os métodos da invenção.
[00257] O ensaio para a medição da produção de isopreno é descrito no Exemplo I, parte II. Para este ensaio, uma amostra foi removida em um ou mais momentos do frasco de agitação e cultivadas por 30 minutos. A quantidade de isopreno produzida nesta amostra foi então medida. A concentração no Headspace e taxa específica de produção de isopreno são listadas na Tabela 1 e mais adiante aqui descrita. (IS = isopreno)
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Cepa Produção de Isopreno em um frasco com headspace*
Concentração de heaspace g/Lgás Taxa Específica pg/L caidohr/OD (nmol/gwcm/h)
E. coli BL21/ pTrcKudzu IS 1,40 53,2 (781,2)
E. coli BL21/ Pcl DXS yidi Kudzu IS 7,61 289,1 (4,25 x 103)
E. coli BL21/MCM127 com IS e via MVA completa 23,0 874,1 (1,28 x 104)
E. coli BL21/ Pet N-HisKudzu IS 1,49 56,6 (831,1)
Pantoea citrea /pTrcKudzu IS 0,66 25,1 (368,6)
E. coli w/ Poplar IS [Miller (2001)] - 5,6 (82,2)
Bacillis licheniformis Fall US 5849970 - 4,2 (61,4)
Yarrowia lipolytica com isopreno sintase kudzu ~0,05 pg/L ~2 (~30)
Trichoderma reesei com isopreno sintase kudzu ~0,05 pg/L ~2 (~30)
E. coli BL21/ pTrcKKDyIkIS com IS kudzu e via inferior MVA 85,9 3,2 x 103 (4,8 x 104)
* Normalizado para 1 mL de 1 OD600, cultivadas por uma hora em uma ampola de selado com uma relação volumétrica de líquido para Headspace de 1:19.
Tabela 2: Rendimentos representativos de isopreno em um fermentador usando culturas de células e métodos da invenção.
[00258] O ensaio para medir a produção de isopreno é descrito no Exemplo I, parte II. Para este ensaio, uma amostra do gás de escape do fermentador foi colhida e analisada para a quantidade de isopreno. O pico de concentração no heaspace (que é a maior concentração de Headspace durante a fermentação), título (que é a quantidade, total acumulada de isopreno produzido por litro de caldo), e taxa específica de pico de produção de isopreno (que é a mais alta taxa específica durante o fermentação) estão listadas na Tabela 2 e descritas mais adiante neste documento.
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Cepa Produção de isopreno nos fermentadores
Pico de concentração o headspace** (pg/Lgas) Título (mg/Lcaido) Taxa específica de pico pg/Lcaido/h/OD (nmol/gwcm/h)
E. coli BL21 /pTrcKudzu com IS kudzu 52 41,2 37 (543,3)
E. coli FM5/pTrcKudzu IS 3 3,5 21,4 (308,1)
E. coli BL21/tripla cepa (DXS, yidi, IS) 285 300 240 (3,52 x 103)
E. coli FM5/ cepa tripla (DXS, yidi, IS) 50,8 29 180,8 (2,65 x 103)
E. coli/MCM127 com IS kudzu e via MVA completa 1094 250 875 (1,28 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc via superior gi1.2 integrada via inferior pT rcKudzu 2418 1640 1248 (1,83 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc UpperPathwayHGS2 -pTrcKKDyIkIS 3500 3300 1088 (1,60 x 104)
Bacillus subtilis tipo selvagem 1,5 2,5 0,8 (11,7)
Bacillus pBS Kudzu IS 16,6 ~30 (acima de 100 horas) 5 (73,4)
Bacillus Marburg 6051 [Wagner and Fall (1999)] 2,04 0,61 24,5 (359,8)
Bacillus Marburg 6051 Fall US 5849970 0,7 0,15 6,8 (100)
E. coli via BL21/pCLPtrcUpper e gil.2KKDyI e pTrcAlbamMVK 2,03 x 104 3,22 x 104 5,9 x 103 (8,66 x 104)
E. coli via BL21/pCLPtrcUpper e gi1.2KKDyI e pTrcAlbamMVK mais pBBRCMPGI1.5pgl 3,22 x 104 6,05 x 104 1,28 x 104 (1,88 x 105)
** Normalizado a uma taxa de fluxo do gás de escape de 1 vvm (1 volume de gás de escape por 1 Lcaido por minuto).
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67/343 [00259] Adicionalmente, a produção de isopreno por células que contêm ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase pode aumentar pelo aumento da quantidade de um polipeptídio 1-desóxi-Dxilulose-5-fosfato sintase (DXS) e/ou um polipeptídio de isopentenil difosfato isomerase (IDI) expresso pelas células. Por exemplo, um ácido nucleico DXS e/ou um ácido nucleico IDI pode podem ser induzidos em células. O ácido nucleico DXS pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno. De forma similar, o ácido nucleico IDI pode ser um ácido nucleico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno. Em algumas modalidades, a quantidade de polipeptídio DXS e/ou IDI é aumentada pela substituição dos promotores DXS e/ou IDI endógenos ou regiões reguladoras por outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em maior transcrição dos ácidos nucleicos DXS e/ou IDI. Em algumas modalidades, as células contêm tanto um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio do isopreno sintase (por exemplo, ácidos nucleicos vegetais do isopreno sintase) quanto uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídio do isopreno sintase.
[00260] Os polipeptídios codificados DXS e IDI são parte da via DXP para a biossíntese de isopreno (figura 19A). Os polipeptídios DXS convertem o piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-desóxi-Dxilulose-5-fosfato. Embora não exista a intenção de se ligar a uma teoria específica, acredita-se que o aumento da quantidade de polipeptídio DXS aumenta o fluxo de carbono através da via DXP, levando a uma maior produção de isopreno. Polipeptídios IDI catalisam a interconversão de isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP). Embora não exista a intenção de se ligar a uma teoria específica, acredita-se que o aumento da quantidade de polipeptídio IDI em células aumenta a quantidade (e a taxa de conversão) de IPP que é
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68/343 convertido em DMAPP, que, por sua vez é convertido em isopreno. [00261] Por exemplo, a fermentação de células de E. coli com uma isopreno sintase kudzu, cerevisia IDI S. e E. coli DXS ácidos nucleicos foi usado para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50300 μ g/L durante um período de 15 horas (Exemplo 7, parte VII). Como outro exemplo, a fermentação de E. coli com M. mazei mevalonato quinase (MVK), isopreno sintase P. alba, a via MVA superior, e a integrada via MVA inferior foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram 32-35,6 g/L durante um período de 67 horas (Exemplo 14, parte III).
[00262] Em outro exemplo, a fermentação de E. coli com M. mazei mevalonato quinase (MVK), P.alba isopreno sintase, PGL expressão excessiva (RHM111608-2), a via MVA superior, e a integrada via MVA inferior foram usados para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variam de 33,2 g/L a 40,0 g/L durante um período de 40 horas ou 48,6 g/L para 60,5 g/L durante um período de 59 horas (Exemplo 17, parte (ii)).
[00263] Em algumas modalidades, a presença de ácidos nucleicos do isopreno sintase, IDI e DXS heterólogos ou extra endógenos, faz células crescerem de forma mais reprodutiva ou manterem-se viáveis por mais tempo quando comparadas com a célula correspondente com apenas um ou dois de tais ácidos nucleicos heterólogos ou extra endógenos. Por exemplo, células contendo ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase IDI e DXS, cresceram melhor que as células com somente ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase e DXS ou com apenas ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase. Além disso, ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase, IDI e DXS foram ligados de forma operativa com sucesso a um promotor forte em plasmídeo de alta cópia que era mantido por células de E. coli, sugerindo que grandes quantidades de tais polipeptídios podem ser
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69/343 expressas nas células sem causar quantidade excessiva de toxicidade às células. Embora não exista a intenção de se ligar a nenhuma teoria específica, acredita-se que a presença de ácidos nucleicos IDI e isopreno sintase heteróloga ou extra endógena pode reduzir uma quantidade de um ou mais intermediários potencialmente tóxicos que iriam de outra forma acumular somente se um ácido nucleico DXS heterólogo ou extra endógeno estivesse presente nas células.
[00264] Em algumas modalidades, a produção de isopreno por células que contêm ácidos nucleicos heterólogos do isopreno sintase é aumentada pelo aumento da quantidade de polipeptídio MVA expresso pelas células (figuras 19A e 19B). Polipeptídios exemplificadores de vias do MVA incluem quaisquer dos seguintes polipeptídios: polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídios de 3-hidróxi3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídios de IDI e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) contendo uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via MVA. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via MVA podem ser introduzidos nas células. Em algumas modalidades, as células contêm a via MVA superior, que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e HMGCoA redutase. Em algumas modalidades, as células contêm a via inferior do MVA, que inclui ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD e IDI. Em algumas modalidades, as células contêm uma via MVA completa que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMGCoA redutase, MVK, PMK, MVD e IDI. Em algumas modalidades, as células contêm uma via MVA completa que inclui ácidos nucleicos de
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AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, MVK, PMDC, IPK e IDI. Os ácidos nucleicos da via MVA podem ser ácidos nucleicos heterólogos ou cópias duplicadas de ácidos nucleicos endógenos. Em algumas modalidades, a quantidade de um ou mais polipeptídios da via MVA é aumentada pela substituição do promotor endógeno ou regiões reguladoras pelos os ácidos nucleicos da via MVA com outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em maior transcrição dos ácidos nucleicos da via MVA. Em algumas modalidades, as células contêm tanto um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídio do isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucleico do isopreno sintase vegetal) e uma cópia duplicada de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídio do isopreno sintase.
[00265] Por exemplo, células de E. coli contendo um ácido nucleico codificando um polipeptídio do isopreno sintase de kudzu e ácidos nucleicos codificando polipeptídios MVK, PMK, MVD e IDI de Saccharomyces cerevisiae geraram isopreno em uma taxa de 6,67 x 104 mol/Lcaldo/OD600/h (vide Exemplo 8). Adicionalmente, uma fermentação de 14 litros de células E. coli com ácidos nucleicos codificando polipeptídios de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e HMG-CoA redutase de Enterococcus faecalis produz 22 gramas de ácido mevalônico (um intermediário da via MVA). Um recipiente agitado de tais células produz 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro. Esses resultados indicam que ácidos nucleicos heterólogos da via MVA são ativos em células de E. coli que contêm ácidos nucleicos tanto para a via MVA superior quanto para a via inferior do MVA assim como uma isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 127) produz significativamente mais isopreno (874 pg/L) quando comparado com células de E. coli com ácidos nucleicos somente para a via inferior do MVA e uma isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 131) (vide Tabela 3 e Exemplo 8, parte VIII). Células de E. coli contendo um ácido nucleico que codifica P.alba
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71/343 isopreno sintase polipeptídeo e um ácido nucleico que codifica M. mazei MVK polipeptídeos geraram 320,6 g (com uma taxa de pico específico de 9,54 x 104 nmol/Lcaldo/OD600/hora (ou seja, 9,5 x 10 -5 mol/Lcaldo/OD600/hora)) do isopreno durante 67 horas de fermentação na ausência de alimentação de extrato de levedura ou 395,5 g (com uma taxa de pico específico de 8,66 x 104 nmol/Lcaldo/OD600/hora) durante uma fermentação de 68 horas na presença de extrato de levedura de alimentação (veja o Exemplo 14).
[00266] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte das células mantém ácido nucleico heterólogo do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA por pelo menos cerca de 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (como uma cultura contínua sem diluição). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção os ácidos nucleicos que compreendem ácidos nucleicos heterólogos ou cópia duplicada de uma isopreno sintase endógena, DXS, IDI, e/ou via MVA também compreendem um marcador seletivo, como um ácido nucleico de resistência ao antibiótico canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, ou de cloranfenicol.
[00267] Como indicado no Exemplo 7, parte VI, a quantidade de isopreno produzida pode ser aumentada através da adição de extrato de levedura à célula em meio de cultura. Nesse exemplo, a quantidade de isopreno produzido foi linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura no meio celular para as concentrações testadas (figura 48C). Adicionalmente, aproximadamente 0,11 gramas de isopreno por litro de caldo foram produzidas a partir de meio celular com extrato de levedura e glicose (Exemplo 7, parte VIII). Ambos os experimentos utilizaram células de E. coli com ácidos nucleicos do isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli para a produção de isopreno. O aumento da quantidade de extrato de levedura
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72/343 na presença de glicose resultou em mais isopreno sendo produzido do que o aumento da quantidade de glicose na presença do extrato de levedura. Além disso, o aumento da quantidade de extrato de levedura permitiu que as células produzissem um alto nível de isopreno por uma maior quantidade de tempo e melhorou a saúde das células.
[00268] A produção de isopreno foi também demonstrada com o uso de três tipos de biomassa hidrolisada (bagaços, palhas de milho e polpa de madeira macia) como fonte de carbono (figuras 46A-C e 127A e 127B figuras). As células de E. coli com ácidos nucleicos do isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli produziram tanto isopreno a partir dessas fontes de carbono de biomassa hidrolisada a partir da quantidade equivalente de glicose (por exemplo, 1% glicose, p/v). Células de E. coli expressando P.alba isopreno sintase e a via MVA produziram isopreno em uma maior taxa de crescimento inicial da expansão da fibra de amônia (AFEX) pré-tratados a palha de milho do que com a quantidade equivalente de glicose. (figuras 127A e 127B). Caso desejado, qualquer outra fonte de carbono de biomassa pode ser usada nas composições e métodos da invenção. As fontes de carbono de biomassa são desejáveis por serem mais baratas que muitos meios de célula convencionais, facilitando, portanto, a produção econômica de isopreno.
[00269] Adicionalmente, o açúcar invertido apresentou funcionar como uma fonte de carbono para a geração de isopreno (figura 47D). Por exemplo, 2,4 g/L de isopreno foram produzidas a partir de células expressando vias de polipeptídio MVA e isopreno sintase de kudzu (Exemplo 8, parte XV). O glicerol foi utilizado também como uma fonte de carbono para a geração de 2,2 mg/L de isopreno a partir de células expressando isopreno sintase de kudzu (Exemplo 8, parte XIV). A expressão de um ácido nucleico DXS, um ácido nucleico IDI, e/ou um ou mais entre ácidos nucleicos de via MVA (como ácidos nucleicos
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73/343 codificando toda a via MVA) além de ácidos nucleicos do isopreno sintase pode aumentar a produção de isopreno a partir de glicerol. [00270] Além disso, xilose, acetato e glicerol também foram mostrados para funcionar como uma fonte de carbono para a geração de isopreno (figuras 127A-127D). Por exemplo, células de E. coli com P.alba isopreno sintase e a via MVA cultivadas em acetato como única fonte de carbono teve uma produtividade específica de isopreno cerca de duas vezes tão elevado como durante o crescimento em glicose (Exemplo 14, Parte IV; figuras 127A e 127B).
[00271] Em algumas modalidades, um óleo é incluído no meio celular. Por exemplo, células de B. subtilis contendo ácidos nucleicos do isopreno sintase de kudzu produzem isopreno quando cultivadas em meio celular contendo um óleo e uma fonte de glicose (Exemplo 4, parte III). Como outro exemplo, células mutantes de E. coli fadR ATOC contendo a parte superior e inferior da via MVA mais isopreno sintase kudzu produziram isopreno quando cultivadas em um meio de células que contêm óleo de palma e uma fonte de glicose (Exemplo 16, parte II). Em algumas modalidades, mais de um óleo (como 2, 3, 4, 5, ou mais óleos) são incluídos no meio celular. Embora não exista a intenção de se ligar a nenhuma teoria específica, acredita-se que (i) o óleo pode aumentar a quantidade de carbono nas células que estão disponíveis para a conversão para isopreno, (ii) o óleo pode aumentar a quantidade de acetil-CoA nas células, aumentando, portanto o fluxo de carbono através da via MVA, e/ou (ii) o óleo pode fornecer nutrientes extras para as células, o que é desejável, já que boa parte do carbono nas células é convertida para isopreno ao invés de outros produtos. Em algumas modalidades, as células que são cultivadas em meio celular contendo óleo naturalmente utilizam a via MVA para a produção de isopreno ou são geneticamente modificadas para conter ácidos nucleicos para a via MVA inteira. Em algumas modalidades, o óleo é parcialmente ou
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74/343 completamente hidrolisado antes de ser adicionado ao meio de cultura da célula para facilitar o uso do óleo pelas células hospedeiras. [00272] Uma das maiores dificuldades da produção comercial de pequenas moléculas como isopreno em células (por exemplo, bactérias) é o desacoplamento entre a produção da molécula e o crescimento das células. Em algumas modalidades para a produção comercialmente viável de isopreno, uma quantidade significativa de carbono a partir da matéria prima é convertida em isopreno, ao invés de para o crescimento e a manutenção das células (eficiência do carbono). Em várias modalidades, as células convertem mais que, ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, ou 8,0% do carbono no meio de cultura da célula em isopreno. Em modalidades específicas, uma parte significativa do carbono a partir da matéria prima que é convertida em produtos a jusante é convertida em isopreno. Como descrito em maiores detalhes no Exemplo 11, as células de E. coli expressando ácidos nucleicos da via MVA e do isopreno sintase de kudzu exibiram desacoplamento entra a produção de isopreno ou do ácido mevalônico intermediário e o crescimento, resultando na alta eficiência do carbono. Em particular, o ácido mevalônico foi formado a partir de células expressando a via MVA superior de Enterococcus faecalis. O isopreno foi formado a partir de células expressando a via MVA superior de Enterococcus faecalis, a via inferior do MVA Saccharomyces cerevisiae e uma isopreno sintase de Pueraria montana (Kudzu). Esse desacoplamento entre a produção de isopreno ou ácido mevalônico e o crescimento foi demonstrada em quatro cepas diferentes de E. coli: BL21(LDE3), BL21(LDE3) Tuner, FM5 e MG1655. As primeiras duas cepas de E. coli são cepas B e as duas últimas são cepas K12. O desacoplamento entre a produção e o crescimento foi também demonstrado em uma variante de MG1655 com
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75/343 os genes ack e pta apagados. Essa variante também demonstrou menor produção de acetato.
Polipeptídios e Ácidos nucleicos Representativos [00273] Diversos polipeptídeos isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA e ácidos nucleicos podem ser usados nas composições e métodos da invenção.
[00274] Como usado aqui, polipeptídeos inclui polipeptídeos, proteínas, peptídeos, fragmentos de polipeptídeos, polipeptídeos e de fusão, que incluem parte ou a totalidade de um primeiro polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA,) e parte ou a totalidade de um segundo polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo que facilita a purificação ou a detecção do polipeptídeo de fusão, como com ‘His-tag’). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão tem uma atividade de dois ou mais polipeptídeos de via MVA (como AA-tiolase e polipeptídeos HMG-CoA redutase). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo naturalmente ocorrente (como o polipeptídeo codificado por um ácido nucleico Enterococcus faecalis mvaE) que tem uma atividade de dois ou mais polipeptídeos de via MVA.
[00275] Em modalidades diferentes, um polipeptídeo tem pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento polipeptídeo contém, pelo menos, ou cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, ou mais aminoácidos contíguos a partir de um polipeptídeo de comprimento total e tem pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% de uma atividade de um correspondente comprimento total polipeptídeo. Em modalidades particulares, o polipeptídeo inclui um segmento ou a seqüência amino ácido inteira de qualquer polipeptídeo isopreno sintase naturalmente ocorrente, DXS, IDI, ou de via MVA. Em algumas modalidades, o
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76/343 polipeptídeo tem uma ou mais mutações em comparação com a seqüência de um polipeptídeo isopreno sintase tipo selvagem (ou seja, uma seqüência que ocorrem na natureza), DXS, IDI, ou de via MVA. [00276] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo isolado. Como usado aqui, um polipeptídeo isolado não é parte de uma biblioteca de polipeptídeos, tais como uma biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais polipeptídeos diferentes e é separado de pelo menos um componente com o qual ocorre na natureza. Um polipeptídeo isolado pode ser obtido, por exemplo, pela expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica o polipeptídeo.
[00277] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo heterólogo. Por polipeptídeo heterólogo entende-se um polipeptídeo cuja seqüência amino ácido não é idêntica àquela do outro polipeptídeo, naturalmente, expressa na célula hospedeira mesmo. Em particular, um polipeptídeo heterólogo não é idêntico a um polipeptídeo do tipo selvagem que é encontrado na mesma célula hospedeira na natureza. [00278] Como usado aqui, um ácido nucleico refere-se a dois ou mais desoxirribonucletídeos e/ou ribonucleotídeos em qualquer forma de fita única ou dupla fita. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante. Por ácido nucleico recombinante entende-se um ácido nucleico de interesse que é livre de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes) que, no genoma que ocorre na natureza do organismo do qual o ácido nucleico de interesse é derivado, flanqueiam o ácido nucleico de interesse. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus que se replica de forma autônoma, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico, ou um fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão da endonuclease de restrição) independentemente de outras
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77/343 sequências. Em modalidades diferentes, um ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou ácido nucleico de via MVA é ligado de forma operacional a um outro ácido nucleico que codifica toda ou uma parte de um outro tal polipeptídeo que o ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídeo de fusão que inclui um polipeptídeo isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou polipeptídeo de via MVA e todos ou parte de outro polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo que facilita a purificação ou a detecção do polipeptídeo de fusão, como com ‘His-tag’). Em algumas modalidades, parte ou a totalidade de um ácido nucleico recombinante é quimicamente sintetizada. É preciso entender que mutações, incluindo mutações de nucleotídeo único, podem ocorrer dentro de um ácido nucleico, tal como definido aqui.
[00279] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico heterólogo. Por ácido nucleico heterólogo entende-se um ácido nucleico cuja sequência de ácido nucleico não é idêntica a de outro ácido nucleico encontrado naturalmente na mesma célula hospedeira.
[00280] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são um ácido nucleico heterólogo. Em modalidades específicas, o ácido nucleico inclui um segmento de ou toda a sequência de ácidos nucleicos de qualquer ácido nucleico do isopreno sintase, DXS, IDI, ou de via MVA, hidrogenase, maturação de hidrogenase ou fator de transcrição que ocorra naturalmente. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos incluem pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ou mais nucleotídeos contíguos de ácidos nucleicos do isopreno sintase DXS, ácido nucleico de IDI, via MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações em comparação com a seqüência de uma isopreno sintase tipo selvagem (ou seja, uma seqüência que ocorrem na natureza), DXS, IDI, ou ácido
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78/343 nucleico de via MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma ou mais mutações (por exemplo, uma mutação silenciosa) que aumentam a transcrição ou tradução de isopreno sintase, DXS, IDI, ou ácido nucleico via MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma variante degenerada de qualquer ácido nucleico que codifica um polipeptídeo isopreno sintase, DXS, IDI, ou polipeptídeo de via MVA. [00281] Degeneração de códon se refere à divergência na variação do código genético que permite a seqüência de nucleotídeos, sem afetar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Aquele usualmente versado na técnica está bem ciente do códon-bias exibido por uma célula hospedeira específica no uso de códons de nucleotídeos para especificar um determinado aminoácido. Portanto, quando da síntese de um ácido nucleico para uma melhor expressão em uma célula hospedeira, é desejável em algumas modalidades conceber o ácido nucleico tal que sua frequência de utilização de códon se aproxime da freqüência da preferida utilização do códon da célula hospedeira.
[00282] Os números de acesso de polipeptídios e ácidos nucleicos exemplificadores do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA são listados no Apêndice 1 (os números de acesso do Apêndice 1 e suas sequências correspondentes são neste incorporados por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito ao aminoácido e a sequência de ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA de polipeptídios e ácidos nucleicos). O banco de dados Kegg também contém o aminoácido e sequência de ácidos nucleicos de vários polipeptídios e ácidos nucleicos exemplificadores do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou vias MVA de (vide, por exemplo, o site da internet genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html e as sequências destes, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito às sequências de aminoácidos e
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79/343 ácidos nucleicos de polipeptídios e ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA). Em algumas modalidades, um ou mais de polipeptídios e/ou ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA possuem uma sequência idêntica a uma sequência publicamente disponível em 12 de dezembro de 2007 ou 14 de setembro de 2008 como quaisquer das sequências que correspondem a quaisquer dos números de acesso no Apêndice 1 ou quaisquer das sequências presentes no banco de dados Kegg. Exemplos adicionais de polipeptídios e ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via MVA são descritos em maiores detalhes abaixo.
Polipeptídios e Ácidos Nucleicos de Isopreno Sintase Exemplificadores [00283] Como observado acima, polipeptídios do isopreno sintase convertem dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Exemplos de polipeptídio do isopreno sintases incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio do isopreno sintase. Métodos padrões podem ser usados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio do isopreno sintase pela medida da capacidade do polipeptídio converter DMAPP no isopreno in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Em exemplos de ensaio, extratos de célula são preparados pelo cultivo de uma cepa (por exemplo, a cepa E. coli/pTrcKudzu descrita aqui) no método de recipiente agitado como descrito no Exemplo 1. Após a indução estar completa, aproximadamente 10 mL de células são peletados por centrifugação em 7000 x g por 10 minutos e ressuspensos em 5 mL de PEB sem glicerol. As células são lisadas com o uso de uma célula de Pressão Francesa com o uso de procedimentos padrões. Como alternativa, as células são tratadas com lisozima (solução de lisozima Ready-Lyse; EpiCentre) após congelamento/degelo em -80C.
[00284] A atividade de polipeptídio do isopreno sintase no extrato da
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80/343 célula pode ser medido, por exemplo, como descrito em Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 e referências deste, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos ensaios para atividade de polipeptídio do isopreno sintase. DMAPP (Sigma) é evaporado para secar sob vapor de nitrogênio e reidratar por uma concentração de 100 mM em 100 mM de tampão de fosfato de potássio pH 8,2 e armazenado em -20 DC. Para executar o ensaio, a solução de 5 pL de 1M de MgCl2, 1 mM (250 pg/mL) de DMAPP, 65 pL de Tampão de extrato vegetal (PEB) (50 mM de TrisHCl, pH 8,0, 20 mM de MgCl2, 5% de glicerol e 2 mM de DTT) é adicionado a 25 pL de extrato de célula em um frasco Headspace de 20 mL com a tampa de metal rosqueada e septo de silicone coberto por teflon (Agilent Technologies) e cultivado em 37 C por 15 minutos com agitação. A reação é interrompida pela adição de 200 pL de 250 mM de EDTA e quantificada por GC/MS como descrito no Exemplo 1, parte II. [00285] Exemplos de ácidos nucleicos do isopreno sintase incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio do isopreno sintase. Exemplos de polipeptídio do isopreno sintases e ácidos nucleicos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer dos organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios mutantes e ácidos nucleicos derivados de quaisquer dos organismos fonte descritos neste.
[00286] Em algumas modalidades, o polipeptídio do isopreno sintase ou ácidos nucleicos são de família Fabaceae, como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o polipeptídio do isopreno sintase ou ácidos nucleicos são polipeptídios ou ácidos nucleicos de Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al., Planta Physiology 137: 700712, 2005), Pueraria lobata, álamo (como Populus alba, Populus nigra,
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Populus trichocarpa, ou Populus alba x tremula (CAC35696) Miller et al., Planta 213:483-487, 2001) aspen (como Populus tremuloides) Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), ou Carvalho Vermelho (Quercus robur) (Zimmer et al., WO 98/02550), que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a ácidos nucleicos do isopreno sintase e a expressão de polipeptídio do isopreno sintases. Isopreno sintases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas identificadas pelos Nos. de Acesso do Genbank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 e AY182241, que são incorporados neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito às sequências de ácidos nucleicos e polipeptídios do isopreno sintase. Em algumas modalidades, o polipeptídio ou ácido nucleico do isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucleico que ocorre naturalmente a partir de Quercus robur (isto é, o polipeptídio ou ácido nucleico do isopreno sintase é um polipeptídio ou ácido nucleico do isopreno sintase diferente do polipeptídio ou ácido nucleico que ocorre naturalmente a partir de Quercus robur). Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio do isopreno sintase é polipeptídio ou ácido nucleico que ocorre naturalmente a partir de álamo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio do isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucleico que ocorre naturalmente a partir de álamo.
Polipeptídios e Ácidos Nucleicos de DXS Exemplificadores [00287] Como observado acima, polipeptídios de 1-desóxi-Dxilulose-5-fosfato sintase (DXS) convertem piruvato e D-gliceraldeído-3fosfato em 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato. Exemplos de polipeptídios DXS incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio DXS. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de
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82/343 polipeptídio DXS através da medida da capacidade do polipeptídio converter piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-desóxi-D-xilulose-5fosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Exemplos de ácidos nucleicos DXS incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio DXS. Exemplos de polipeptídios DXS e ácidos nucleicos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste. Polipeptídios e Ácidos nucleicos de IDI Exemplificadores [00288] Polipeptídios de isopentenil difosfato isomerase (isopentenildifosfato delta-isomerase ou IDI) catalisam a interconversão de isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP) (por exemplo, a conversão de IPP em DMAPP e/ou a conversão de DMAPP em IPP). Exemplos de Polipeptídio de IDI incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio IDI. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio IDI através da medida da capacidade de o polipeptídio interconverter IPP e DMAPP in vitro em um extrato de célula, ou in vivo. Exemplos de Ácidos nucleicos IDI incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio IDI. Exemplos de Polipeptídio e ácidos nucleicos de IDI incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleico mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
Polipeptídios e Ácidos nucleicos da Via do MVA Exemplificadores
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83/343 [00289] Exemplos de polipeptídios da via MVA incluem polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídios de 3hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídio de IDI e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) com atividade de duas ou mais polipeptídios da via MVA de. Em particular, polipeptídios da via MVA incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via MVA. Exemplos de ácidos nucleicos da via MVA incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via MVA. Exemplos de polipeptídios e ácidos nucleicos da via MVA de incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
[00290] Em particular, polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase ou AACT) convertem duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de AA-CoA tiolase através da medida da capacidade do polipeptídio converter duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00291] Polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMGCoA sintase ou HMGS) convertem acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3
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84/343 metilglutaril-CoA. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de HMG-CoA sintase através da medida da capacidade do polipeptídio converter acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA in vitro, em extrato de célula, ou in vivo.
[00292] Polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMGCoA redutase ou HMGR) convertem 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalonato. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de HMG-CoA redutase através da medida da capacidade do polipeptídio converter 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalonato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00293] Polipeptídios de mevalonato quinase (MVK) fosforilam mevalonato para formar mevalonato-5-fosfato. Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios MVK através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato em mevalonato-5fosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00294] Polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK) fosforilam mevalonato-5-fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios de PMK através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-fosfato em mevalonato-5-difosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00295] Polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD ou DPMDC) convertem mevalonato-5-difosfato em isopentenil difosfato (IPP). Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios MVD através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-difosfato em IPP in vitro, em um extrato de célula, ou in
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85/343 vivo.
[00296] Polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC) convertem mevalonato-5-fosfato em isopentenil fosfato (IP). Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios PMDC através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-fosfato em IP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00297] Polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK) fosforilam isopentil fosfato (IP) para formar isopentenil difosfato (IPP). Métodos padrões (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios IPK através da medida da capacidade de o polipeptídio converter IP em IPP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
[00298] Exemplos de polipeptídios e ácidos nucleicos de IDI e são descritos acima.
Métodos exemplificadores para Isolar ácidos nucleicos [00299] Ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou ácidos nucleicos de via MVA podem ser isolados usando métodos padrões. Métodos para obter ácidos nucleicos desejados a partir de um organismo fonte de interesse (como um genoma bacteriano) são comuns e conhecidos na técnica de biologia molecular (vide, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas neste, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a isolação de ácidos nucleicos de interesse). Por exemplo, se a sequência dos ácidos nucleicos for conhecida (como quaisquer dos ácidos nucleicos conhecidos descritos neste), bibliotecas genômicas adequadas podem ser criadas pela digestão de endonuclease de restrição e podem ser analisadas com sondas complementadas à sequência de ácidos nucleicos desejada. Após a sequência ser isolada, o DNA pode ser amplificado com o uso de
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86/343 iniciador padrão direcionado a métodos de amplificação como a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Patente No U.S. 4.683.202, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a métodos PCR) para obter quantidades de DNA adequadas para a transformação com o uso de vetores apropriados. [00300] Em alternativa, ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, (como quaisquer ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, com uma conhecida sequência de ácidos nucleicos) podem ser sintetizados quimicamente com o uso de métodos padrões.
[00301] Polipeptídios e ácidos nucleicos adicionais do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, que podem ser adequados para o uso nas composições e métodos descritos neste podem ser identificados com o uso de métodos padrões. Por exemplo, bibliotecas de cosmídeos do DNA cromossômico de organismos conhecidos para a produção de isopreno naturalmente podem ser construídos em organismos como E. coli e então analisados para a produção de isopreno. Em particular, bibliotecas de cosmídeos podem ser criadas em locais em que grandes segmentos de DNA genômico (35-45 kb) são empacotados em vetores e usados para transformar hospedeiros adequados. Cosmídeos vetores são únicos em sua capacidade de acomodar grandes quantidades de DNA. Geralmente, vetores cosmídeos de pelo menos uma cópia de sequência de cos DNA que é necessária para empacotar subsequentemente circularizar o DNA heterólogo. Adicionalmente a sequência cos, esses vetores também contêm a origem de replicação como ColEI e marcadores de resistência a drogas como ácidos nucleicos resistentes a ampicilina ou neomicina. Métodos de uso dos vetores cosmídeos para a transformação de hospedeiros bacterianos adequados são descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989, que é
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87/343 incorporado neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a métodos de transformação.
[00302] Tipicamente para clonar cosmídeos, o DNA heterólogo é isolado com o uso de endonucleases de restrição apropriadas e ligado de forma adjacente a região cos do cosmídeo vetor com o uso de ligases apropriadas. Cosmídeos vetores contendo um DNA heterólogo linearizado são então reagidos com o veículo de empacotamento de DNA como bacteriófago. Durante o processo de empacotamento, os locais sítios cos são clivados e o DNA heterólogo é empacotado com a parte da cabeça da partícula viral bacteriana. Essas partículas são então usadas para transfectar células hospedeiras adequadas como E. coli. Após ser injetado na célula, o DNA heterólogo circulariza sob a influência das extremidades aderentes do cos. Dessa forma, grandes segmentos de DNA heterólogo podem ser introduzidos e expressos em células hospedeiras.
[00303] Métodos adicionais para obter ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, incluem a análise de uma biblioteca metagenômica por ensaio (como o ensaio headspace descrito neste) ou por PCR utilizando iniciadores direcionados contra os nucleotídeos codificando o comprimento de aminoácidos conservados (por exemplo, pelo menos 3 aminoácidos conservados). Aminoácidos conservados podem ser identificados por alinhamento de sequência de aminoácidos de polipeptídios conhecidos do isopreno sintase, DXS, IDI, via MVA. Aminoácidos conservados para polipeptídios do isopreno sintase podem ser identificados com base em sequências alinhadas de polipeptídios do isopreno sintases conhecidos. Um organismo descoberto por produzir isopreno naturalmente pode ser sujeito a métodos padrões de purificação de proteína (que são bem conhecidos na técnica) e o polipeptídio resultante purificado pode ser sequenciado com o uso de métodos padrões. Outros métodos são encontrados na
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88/343 literatura (vide, por exemplo, Julsing et al., Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377 a 84, 2007; Comers et al., Appl Environ Microbiol. 73(19):6277 a 83, 2007, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito à identificação de ácidos nucleicos envolvidos na síntese de isopreno).
[00304] Adicionalmente, o alinhamento da sequência padrão e/ou programas de previsão da estrutura podem ser utilizados para identificar polipeptídios e ácidos nucleicos de via DXS, IDI ou via MVA, com base na similaridade da sua estrutura primária e/ou secundária prevista com a de polipeptídios e ácidos nucleicos via DXS, IDI ou via MVA, conhecidos. Bancos de dados padrão como o banco de dados swissprot-trembl (com site em expasy.org, Swiss Institute de Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Genebra 4, Suíça) também pode ser utilizado para identificar polipeptídios e ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, via MVA. A estrutura secundária e/ou terciária de um polipeptídio do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ode ser previstas com o uso de configurações padrões de programas de previsão de estruturas, como PredictProtein (630 Uest, 168 Street, BB217, New York, NY 10032, EUA). Alternativamente, a estrutura secundária e/ou terciária de um polipeptídeo isopreno sintase, DXS, IDI, ou polipeptídeo de via MVA pode ser determinada usando métodos padrões. Isopreno sintase adicionais, DXS, IDI, ou ácidos nucleicos de via MVA também podem ser identificados por hibridização com sondas geradas a partir de isopreno sintase conhecido, DXS, IDI, ou ácidos nucleicos de via MVA. Promotores e Vetores Exemplificadores [00305] Quaisquer ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, descritos aqui podem ser incluídos em um ou mais vetores. Assim, a invenção também inclui vetores com mais a ácido nucleico codificando quaisquer polipeptídios do isopreno sintase, via DXS, IDI ou
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89/343 via MVA, que são descritos aqui. Como usado aqui, um vetor significa um construto que é capaz de entregar, e desejavelmente expressar, um ou mais ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão DNA ou RNA, cosmídeos, e vetores de fago. Em algumas modalidades, o vetor contém um ácido nucleico sob o controle de uma seqüência de controle de expressão.
[00306] Como usado aqui, uma seqüência de controle de expressão significa uma seqüência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico de interesse. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um promotor, como um constitutivo ou um promotor induzível, ou um intensificador. Um promotor induzível é um promotor que está ativo sob regulamentação ambiental ou de desenvolvimento. A sequência de controle da expressão é ligada de forma operacional ao segmento de ácido nucleico para ser transcrita.
[00307] Em algumas modalidades, o vetor contém um marcador seletivo. O termo marcador seletivo termo se refere a um ácido nucleico capaz de expressão em uma célula hospedeira que permite a facilidade de seleção daquelas células hospedeiras contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos resistentes aos antibióticos (por exemplo, a canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, ou cloranfenicol) e/ou ácidos nucleicos que conferem uma vantagem metabólica, tais como uma vantagem nutricional sobre a célula hospedeira. Marcadores nutricionais seletivos exemplificadores incluem aqueles marcadores conhecidos na técnica como alt, ARGB e pyr4. Marcadores úteis em sistemas de vetores para a transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Finkelstein, Capítulo 6 em Biotechnology de Filamentous Fungi, Finkelstein et al.,
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Editores Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Capítulo 6., 1992; e
Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics de Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres, 1992, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, o marcador seletivo é um ácido nucleico amdS, que codifica a enzima acetamidase, permitindo que as células transformadas cresçam em acetamida como fonte de nitrogênio. O uso de um ácido nucleico de amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito em Kelley et al., EMBO J. 4:475 a 479, 1985 e Penttila et al., Gene 61:155 a 164, 1987 (que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, se integram a um cromossomo das células sem um marcador seletivo.
[00308] Vetores adequados são aqueles que são compatíveis com a célula hospedeira utilizada. Vetores adequados podem derivar, por exemplo, de uma bactéria, um vírus (bacteriófago T7 ou um fago derivado de M-13), um cosmídeo, uma levedura, ou uma planta. Protocolos para obtenção e utilização desses vetores são conhecidos por técnicos (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989, e incorporadas aqui por referência totalidade, especificamente relacionado ao uso de vetores).
[00309] Os promotores são bem conhecidos na arte. Promotores são bem conhecidos na técnica. Qualquer promotor que funciona na célula hospedeira pode ser utilizado para expressão de um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, na célula hospedeira. Regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para dirigir a expressão de ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI
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91/343 ou via MVA, em várias células hospedeiras são inúmeras e familiares para aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, WO 2004/033646 e referências já citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente que diz respeito a vetores para a expressão de ácidos nucleicos de interesse). Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir estes ácidos nucleicos é adequado para a presente invenção, mas não limitado a, CIC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO e TPI (útilpara expressão em Saccharomyces); AOX1 (útilpara expressão em Pichia); e lac, trp, ÁPl, ÁPr, T7, tac e trc (útil para expressão em E. coli). [00310] Em algumas modalidades, um promotor de glicose isomerase é usado (ver, por exemplo, Patente No U.S. 7.132.527 e referências citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a sistemas promotores e plasmídeo para expressar polipeptídios de interesse). Mutantes de promotor de glicose isomerase relatados podem ser usados para variar o nível de expressão do polipeptídio codificado por um ácido nucleico ligado de forma operativa ao promotor de glicose isomerase (Patente no US 7.132.527). Em várias modalidades, o promotor de glicose isomerase é contido em um plasmídeo de baixa, média ou, alta cópia (Patente no US 7.132.527).
[00311] Em várias modalidades, um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, está contido em um plasmídeo de baixa cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 1 a cerca de 4 cópias por célula), plasmídeo de média cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 10 a cerca de 15 cópias por célula), ou plasmídeo de alta cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 50 ou mais cópias por célula). Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é ligado de forma operacional
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92/343 ao promotor T7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ligado de forma operativa ao promotor T7 é contido em um plasmídeo de média ou alta cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é ligado de forma operacional ao promotor Trc. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ligado de forma operativa ao promotor Trc é contido em um plasmídeo de média ou alta cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é ligado de forma operacional ao Promotor Lac. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ligado de forma operativa ao promotor Lac é contido em plasmídeo de baixa cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é ligado de forma operacional a um promotor endógeno, como um promotor endógeno de Escherichia, Panteoa, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces, ou Trichoderma ou um promotor endógeno de serino protease alcalina, isopreno sintase, DXS, IDI, via MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extra endógeno do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ligado de forma operativa ao promotor endógeno é contido em plasmídeo de alta cópia. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo replicante que não se integra em um cromossomo nas células. Em algumas modalidades, parte ou todo o vetor se integra em um cromossomo nas células.
[00312] Em algumas modalidades, o vetor é qualquer vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica é integrado no genoma da célula e é replicado. Referência é feita ao Catálogo Central de Estoque Genético Fúngico de Cepas (FGSC, endereço eletrônico
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93/343 fgsc.net e referências citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a vetores) para uma lista dos vetores. Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols em Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (editores) 1987, Suplemento 30, seção 7.7.18); van den Hondel et al. em Bennett e Lasure (Editores) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, às páginas 396 a 428, 1991; e Patente no U.S.
5.874.276, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a vetores. Vetores particularmente úteis incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 e pENTR/D.
[00313] Em algumas modalidades, um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é ligado de forma operacional ao promotor adequado que apresenta atividade transcricional em uma célula hospedeira fúngica. O promotor pode ser derivado de um ou mais ácidos nucleicos codificando um polipeptídio que é endógeno ou heterólogo para a célula hospedeira. Em algumas modalidades, o promotor é útil em um hospedeiro Trichoderma. Exemplos adequados não limitantes de promotores incluem cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1 e amy. Em algumas modalidades, o promotor é um que é nativo da célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor de T. reesei nativo. Em algumas modalidades, o promotor é cbh1 de T. reesei, que é um promotor induzível e foi depositado no GenBank sob o N° de acesso D86235, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores. Em algumas modalidades, o promotor é um heterólogo para a célula hospedeira fúngica. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores dos genes de glicoamilase (glaA) de A. awamori e A. niger (Nunberg et al.,
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Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores); alfa amilases de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, xln1 de T. reesei e a celobio-hidrolase 1 de T. reesei (EP 137280, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores).
[00314] Em algumas modalidades, a expressão vetor também inclui uma sequência de terminação. Regiões de controle de terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos da célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência de terminação e a sequência promotora são derivados uma vez que tenha mesma fonte. Em outra modalidade, a sequência de terminação é endógena à célula hospedeira. Um sequência de terminador particularmente adequada é cbh1 derivada de uma cepa de Trichoderma (como T. reesei). Outros terminadores úteis incluem fungos de terminação de um A. niger ou A. awamori glicoamilase ácidos nucleicos (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2.306 a 2.315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1.581 a 1.585, 1984; que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a terminadores fúngicos). Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser incluído. Para a expressão efetiva de polipeptídios, o DNA codificando o polipeptídio é ligado de forma operacional através de códons de iniciação às regiões de controle de expressão selecionadas, de forma que a expressão que os resulte na formação do RNA mensageiro adequado.
[00315] Em algumas modalidades, o promotor, região que codifica, e terminador são todos originários do ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, a ser expresso. Em algumas modalidades, a região que codifica do ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é inserida em um vetor de expressão de uso geral, de forma
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95/343 que ela esteja sob controle transcricional de sequências de promotor e terminador de construção de expressão. Em algumas modalidades, genes ou técnica destes são inseridos a jusante do promotor forte cbh1. [00316] Um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, pode ser incorporado em um vetor, como um vetor de expressão, utilizando técnicas padronizadas (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito um para a seleção adequada de sequências de DNA e a construção de vetores). Métodos usados para ligar a construção de DNA compreendendo um ácido nucleico de interesse (como um ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA), um promotor, um terminador e outras sequências e inseri-los em um vetor adequado são conhecidos na técnica. Por exemplo, enzimas de restrição podem ser usadas para clivar o ácido nucleico do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, e o vetor. Em seguida, as extremidades compatíveis do ácido nucleico clivado do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, e o vetor clivado podem ser ligadas. A adesão é geralmente feita por ligação em sítios restrição convenientes. Se esses sítios não existem, os ligantes oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional (ver, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989 e Bennett e Lasure, More Gene Manipulations em Fungi, Academic Press, San Diego, páginas 70 a 76, 1991, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a ligantes oligonucleotídeos). Adicionalmente, vetores podem ser construídos com técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
[00317] Em algumas modalidades, pode ser desejável superexpressar ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou
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96/343 via MVA, em níveis muito mais elevados do que o atualmente encontrado em células que ocorrem naturalmente. Este resultado pode ser realizado pela clonagem seletiva de ácidos nucleicos codificando os polipeptídios em plasmídeos multicópia ou colocando os ácidos nucleicos sob um promotor constitutivo ou induzível forte. Métodos para superexpressão de polipeptídios desejados são comuns e bem conhecidos na técnica de biologia molecular e exemplos podem ser encontrados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a técnicas de clonagem.
[00318] Os seguintes recursos incluem descrições gerais suplementares, de acordo com metodologia útil de acordo com a invenção: Kreigler, Gene Transfer e Expression; A Laboratory Manual, 1990 e Ausubel et al., Editores Current Protocols in Molecular Biology, 1994, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a biologia molecular e técnicas de clonagem.
Organismos Fonte Exemplificadores [00319] Ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, (e seus polipeptídios codificados) podem ser obtidos de qualquer organismo que naturalmente contenha ácidos nucleicos do isopreno sintase, DXS, IDI, via MVA. Como observado acima, isopreno é formado naturalmente por uma variedade de organismos, como bactérias, levedura, plantas e animais. Organismos contêm uma via MVA, via DXP, ou ambas as vias MVA e DXP para produção de isopreno (figura 19). Assim, os ácidos nucleicos DXS podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contenha a via DXP ou contenha ambas as vias MVA e DXP. IDI e ácidos nucleicos de isopreno sintase podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contenha a via MVA,
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97/343 via DXP, ou ambas as vias MVA e DXP. Ácidos nucleicos de via MVA podem ser obtidos, por exemplo, de qualquer organismo que contenha a via MVA ou contenha ambas as vias MVA e DXP.
[00320] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é idêntica à sequência de ácidos nucleicos que é produzido por quaisquer dos seguintes organismos na natureza. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é idêntica à sequência de um polipeptídio que é produzido por quaisquer das seguintes organismos na natureza. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polipeptídio do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, é um ácido nucleico ou polipeptídio mutante derivado de quaisquer dos organismos descritos aqui. Como utilizado aqui, derivado de se refere à fonte do ácido nucleico ou polipeptídio em que uma ou mais mutações são introduzida. Por exemplo, um polipeptídio que é derivado de um polipeptídio vegetal se refere ao polipeptídio de interesse que os resultados da introdução de uma ou mais mutações em uma sequência de um polipeptídio vegetal selvagem (isto é, uma sequência que ocorra na natureza).
[00321] Em algumas modalidades, o organismo fonte é um fungo, exemplos dos quais são espécies de Aspergillus como A. oryzae e A. niger, espécies de Saccharomyces como S. cerevisiae, espécies de Schizosaccharomyces como S. pombe e espécies de Trichoderma como T. reesei. Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma célula de fungos filamentosos. O termo fungo filamentoso se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (ver, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos são morfológica, fisiológica e
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98/343 geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegetativo de fungos filamentosos ocorre pelo alongamento de hifas e o catabolismo de carbono e obrigatoriamente aeróbico. A célula parental de fungo filamentoso pode ser uma célula de uma espécie de, mas não limitada a, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei, a forma assexuada de Hypocrea jecorina, previamente classificada como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46 a 53, 1984; ATCC No 56.765 e ATCC No 26.921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. lanuginose, ou H. grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, ou A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 e Goedegebuur et al., Genet 41: 89 a 98, 2002),
Fusarium sp., (por exemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim, ou F. venenatum), Neurospora sp., (por exemplo, N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (por exemplo, M. miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (ver também, Innis et al., Sci. 228: 21-26, 1985). O termo Trichoderma ou Trichoderma sp. ou Trichoderma spp. se refere a qualquer gênero de fungos previamente ou atualmente classificados como Trichoderma.
[00322] Em algumas modalidades, o fungo é A. nidulans, A. awamori,
A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, ou F. solani. Cepas de Aspergillus são divulgadas em Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993 e Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a fungos. Em modalidades específicas, o fungo é uma cepa de Trichoderma, como a cepa de T. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não limitantes incluem ATCC No 13.631, ATCC No 26.921, ATCC No 56.764,
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ATCC No 56.765, ATCC No 56.767 e NRRL 15.709, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a cepas de T. reesei. Em algumas modalidades, a cepa do hospedeiro é derivada de RL-P37. RL-P37 é divulgada em SheirNeiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46 a 53, 1984, que é incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito às cepas de T. reesei.
[00323] Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma levedura, como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., ou Candida sp.
[00324] Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria, como cepas de Bacillus como B. lichenformis ou B. subtilis, cepas de Pantoea como P. citrea, cepas de Pseudomonas como P. alcaligenes, P. putida, ou P, fluorescens, cepas de Streptomyces como S. lividans ou S. rubiginosus, cepas de Corynebacterium sp. como Corynebacterium glutamicum, cepas de Rhodopseudomonas sp. como Rhodopseudomonas palustris, ou cepas de Escherichia como E. coli. [00325] Como utilizado aqui, o gênero Bacillus inclui todas as espécies dentro do gênero Bacillus, conforme conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitado a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus e B. thuringiensis. Reconhece-se que o gênero Bacillus continua a passar por reorganização taxonômica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas, incluindo, mas não limitando a organismos, tais como B. stearothermophilus, e que agora se chama Geobacillus stearothermophilus. A produção de endósporos resistentes à presença de oxigênio é considerado a característica definidora de gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recém-nomeados
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Aliciclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.
[00326] Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria gram-positiva. Exemplos não limitantes incluem cepas de Streptomyces (por exemplo, S. lividans, S. coelicolor, ou S. griseus) e Bacillus. Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria gramnegativa, como E. coli, Pseudomonas sp.
[00327] Em algumas modalidades, o organismo fonte é a planta, como a planta a partir da família Fabaceae, como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o organismo fonte é kudzu, álamo (como Populus alba x tremula CAC35696), aspen (como Populus tremuloides), ou Quercus robur.
[00328] Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma alga, como a alga verde, alga vermelha, glaucófitas, cloraraquiniófitas, euglenídeos, cromista, ou dinoflagelados.
[00329] Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma cianobactéria, como cianobactérias classificadas em quaisquer dos seguintes grupos com base em morfologia: Chroococcales,
Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, ou Stigonematales .
[00330] Em algumas modalidades, o organismo de origem é um organismo anaeróbio. Organismos anaeróbicos podem incluir, mas não estão limitados a, anaeróbios obrigatórios, anaeróbios facultativos e anaeróbios aerotolerantes. Tais organismos pode ser qualquer um dos organismos acima referidos, bactérias, leveduras, etc. Em uma modalidade, o anaeróbios obrigatórios podem ser qualquer um ou uma combinação selecionada do grupo consistindo em Clostridium ljungdahlii, autoethanogenum Clostridium, limosum Eurobacterium, carboxydivorans Clostridium, Peptostreptococcus productus e metilotrophicum Butiribacterium. É preciso entender que qualquer
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101/343 combinação de qualquer dos organismos fonte aqui descrito pode ser usado para outras modalidades da invenção.
Células hospedeiras Exemplificadoras [00331] Uma variedade de células hospedeiras pode ser usada para expressar isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou polipeptídeos de via MVA e produzir isopreno nos métodos da invenção reivindicada. Células hospedeiras exemplificadoras incluem células de qualquer dos organismos listados na seção anterior sob o título Organismos Fonte Exemplificador. A célula hospedeira pode ser uma célula que produz naturalmente isopreno ou uma célula que não produza naturalmente isopreno. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno através da via DXP, e uma isopreno sintase, DXS, e/ou ácido nucleico IDI se adiciona para aumentar a produção de isopreno utilizando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno através da via MVA, e uma isopreno sintase e/ou um ou mais ácidos nucleicos MVA via são adicionados para aumentar a produção de isopreno utilizando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno através da via DXP e uma ou mais vias MVA ácidos nucleicos são adicionados para produzir isopreno utilizando parte ou a totalidade da via MVA, bem como a via DXP. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno utilizando tanto o DXP e vias MVA e um ou mais ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI ou de via por MVA são adicionados para aumentar a produção de isopreno por um ou ambos destas vias. É preciso entender que qualquer combinação de qualquer dos organismos hospedeiros aqui descritos se pode utilizar para outras modalidades da invenção.
Métodos Exemplificadores de Transformação [00332] Ácidos nucleicos do isopreno sintase, via DXS, IDI ou via MVA, ou vetores contendo os mesmos podem ser inseridos em uma
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102/343 célula hospedeira (por exemplo, uma célula vegetal, uma célula fúngica, uma célula de levedura, ou uma célula bacteriana descrita aqui) utilizando técnicas padrões para expressão do polipeptídio codificado do isopreno sintase, DXS, IDI, via MVA. A introdução de uma construção de DNA ou vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas de transformação como, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, lipofecção mediada ou transfecção mediada por DEAE-dextrina ou transfecção usando um vírus fago recombinante), com incubação precipitado DNA por fosfato de cálcio, bombardeio em alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA e fusão de protoplastos. Técnicas de transformação geral são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Current Protocols em Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (editores) Capítulo 9, 1987;
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989; e Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação). A expressão de polipeptídio heterólogo em Trichoderma é descrita na Patente No U.S. 6.022.725; Patente U.S. N° 6.268.328; Patente U.S. N° 7.262,041;WO 2005/001036; Harkki et al.; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP
244,234; EP 215,594; e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to Expression of Both Homologous and Heterologous Genes, em Molecular Industrial Mycology, Editores Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY páginas 129 a 148, 1992, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação e expressão). Referência é também feita a Cao et al., (Sci. 9:991 a 1.001, 2000; EP 238023; e Yelton et al., Proceedings. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 81:1470-1474, 1984 (que são incorporadas aqui por
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103/343 referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação) para transformação de cepas de Aspergillus. Os ácidos nucleicos introduzidos podem ser integrados em DNA cromossomal ou mantidos como sequências replicantes extracromossomais.
[00333] Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para selecionar transformantes. Em um exemplo não limitante, transformantes adequados incluindo um marcador amdS são usados para distinguir transformantes inadequados por sua taxa de crescimento mais rápida e formação de colônias circulares com uma superfície lisa, ao invés de contorno irregular em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos, um ensaio adicional de estabilidade é conduzido pelo crescimento de transformantes em meio sólido não seletivo (por exemplo, um meio que não tem acetamida), pela coleta de esporos deste meio de cultura e pela determinação da porcentagem de esporos que, posteriormente, germinam e crescem em meio seletivo contendo acetamida.
[00334] Em algumas modalidades, células fúngicas são transformadas por um processo de formação de protoplastos e transformação dos protoplastos seguida de regeneração da parede celular de uma maneira conhecida. Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma sp. para a transformação envolve a preparação de protoplastos a partir de micélio de fungos (ver, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação). Em algumas modalidades, os micélios são obtidos a partir de esporos vegetativos germinados. Os micélios são tratados com uma enzima que digere a parede celular, resultando em protoplastos. Os protoplastos são então protegidos pela presença de um estabilizador osmótico em meio em suspensão. Estes estabilizadores incluem o
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104/343 manitol, sorbitol, cloreto de potássio e sulfato de magnésio e semelhantes. Normalmente, a concentração destes estabilizadores varia entre 0,8 M e 1,2 M. É desejável usar uma solução de cerca de 1,2 M de sorbitol no meio em suspensão.
[00335] A captação de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. depende da concentração de íons cálcio. Geralmente, são usados entre cerca de 10 mM de CaC2 e 50 mM de CaC2 em uma solução de captação. Adicionalmente à captação de íons cálcio na solução, outros compostos geralmente incluídos são um sistema tamponante como tampão TE (10 mM de Tris, pH 7,4, 1 mM de EDTA) ou tampão MOPS 10 mM, pH 6,0 (ácido morfolinopropanossulfônico) e polietileno glicol (PEG). Embora não exista uma intenção de se ligar em nenhuma teoria específica, acredita-se que o polietileno glicol aja para fundir as membranas celulares, permitindo assim que o conteúdo do meio seja distribuído no citoplasma da cepa de Trichoderma sp. e o DNA plasmidial seja transferido para o núcleo. Esta fusão frequentemente deixa várias cópias do DNA plasmidial integradas no cromossomo hospedeiro.
[00336] Normalmente uma suspensão contendo os protoplastos ou células de Trichoderma sp. que foram submetidos a um tratamento de permeabilidade com uma densidade de 105 a 107/mL (tal como 2 x 106/mL) é utilizada na transformação. Um volume de 100//L desses protoplastos ou células em uma solução adequada (por exemplo, sorbitol 1.2 M e 50 mM de CaCb) é misturado com o DNA desejado. Em geral, uma concentração elevada de PEG se adiciona à solução de absorção. Entre 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos. Em algumas modalidades, cerca de 0,25 volumes são adicionados à suspensão de protoplastos. Aditivos, tais como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio, e outros também podem ser adicionados à solução de
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105/343 captação, e ajudam na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas (ver, por exemplo, Patentes No U.S. 6.022.725 e 6.268.328, que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito aos métodos de transformação).
[00337] Geralmente, a mistura é então cultivada em cerca de 0°C por um período de 10 a 30 minutos. PEG adicional é depois adicionado à mistura para intensificar ainda mais a absorção da sequência de ácidos nucleicos desejada. O PEG 4000 a 25% é geralmente adicionado em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transformação, no entanto, volumes maiores e menores podem ser adequados. O PEG 4000 a 25% é desejavelmente cerca de 10 vezes o volume da mistura de transformação. Depois que o PEG é adicionado, a mistura de transformação é, então, cultivada em temperatura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e CaCl2. A suspensão de protoplastos é então adicionada às alíquotas fundidas de um meio de crescimento. Quando o meio de crescimento inclui uma seleção de crescimento (por exemplo, acetamida ou um antibiótico), permite-se o crescimento de transformantes apenas.
[00338] A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com os métodos convencionais, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al., ‘'Molecular Cloning: A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor, 1982, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, em particular no que diz respeito a métodos de transformação.
Meios de Cultura de Células Exemplificadores [00339] A invenção também inclui uma célula ou uma população de células em cultura que co-produzem isopreno. Por células em cultura entende-se duas ou mais células em uma solução (por exemplo, um meio de crescimento celular) que permite que as células sofram uma ou
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106/343 mais divisões celulares. Células em cultura não incluem células vegetais que fazem parte de uma planta multicelular viva contendo células que se diferenciaram em tecidos vegetais. Em várias modalidades, a cultura de células inclui pelo menos cerca de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 5.000, 10,000 ou mais células.
[00340] Qualquer fonte de carbono pode ser usada para cultivar as células hospedeiras. O termo fonte de carbono refere-se a um ou mais compostos contendo carbono, capaz de serem metabolizados por uma célula ou organismo hospedeiro. Por exemplo, o meio de cultura utilizado para cultivar as células hospedeiras pode incluir qualquer fonte de carbono adequada para manter a viabilidade ou o crescimento das células hospedeiras.
[00341] Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um carboidrato (tal como monossacarídeo, dissacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeos), açúcar invertido (por exemplo, xarope de sacarose tratado enzimaticamente), glicerol, glicerina (por exemplo, um subproduto glicerina de um biodiesel ou processo de fabricação de sabão), diidroxiacetona, fonte de único carbono, óleo (por exemplo, um óleo vegetal ou de planta como o milho, palma ou óleo de soja), gordura animal, óleo de origem animal, ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo saturado, ácido graxo insaturado ou ácido graxo poli-insaturado), lipídeo, fosfolipídeo, glicerolipídeo, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo ou proteína microbiana ou vegetal), fonte de carbono renovável (por exemplo, uma fonte de carbono da biomassa, como uma fonte de carbono da biomassa hidrolisado), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, polímero, ácido, álcool, aldeído, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol, ou qualquer combinação de dois ou mais dos supramencionados. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um produto de fotossíntese, que inclui, mas não se limita a,
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107/343 glicose. Em algumas modalidades, o carboidrato é xilose ou glicose. [00342] Monossacarídeos exemplificadores incluem a glicose e a frutose, oligossacarídeos exemplificadores incluem lactose e sacarose, e polissacarídeos exemplificadores incluem amido e celulose. Carboidratos exemplificadores incluem os açúcares C6 (por exemplo, frutose, galactose, manose ou glicose) e açúcares C5 (por exemplo, xilose ou arabinose). Em algumas modalidades, o meio celular inclui um carboidrato, bem como uma ou mais fontes de carbono que não seja um carboidrato (por exemplo, glicerol, glicerina, diidroxiacetona, fonte de único carbono, óleo, óleo de origem animal, gordura animal, ácido graxo, lipídeo, fosfolipídeo, glicerolipídeo, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeos, fonte de carbono renovável, ou um componente de um extrato de levedura). Em algumas modalidades, o meio celular inclui um carboidrato, bem como um polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo ou proteína microbiana ou vegetal). Em algumas modalidades, o polipeptídeo microbiano é um polipeptídeo de fungos ou bactérias. Em algumas modalidades, o polipeptídeo vegetal é um polipeptídeo de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmiste, oliva, açafrão, gergelim ou semente de linhaça.
[00343] Em algumas modalidades, a concentração de carboidratos é, pelo menos, ou cerca de 5 gramas por litro de caldo (g/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células), tal como pelo menos, ou cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração de carboidratos é de cerca de 50 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 100 e cerca de 360 g/L, entre cerca de 120 e cerca de 360 g/L, ou entre cerca de 200 e cerca de 300 g/L. Em algumas modalidades, essa concentração de carboidratos inclui a quantidade total de carboidrato que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das
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108/343 células hospedeiras.
[00344] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada. Por condições de glicose limitada quer dizer que a quantidade de glicose que é adicionado é menor ou cerca de 105% (como cerca de 100%) da quantidade de glicose que é consumido pelas células. Em modalidades particulares, a quantidade de glicose que é adicionado ao meio de cultura é de aproximadamente a mesma quantidade de glicose que é consumido pelas células durante um período específico de tempo. Em algumas modalidades, a taxa de crescimento celular é controlado por limitando a quantidade de glicose adicionada de tal forma que as células crescem a uma taxa que pode ser suportado pela quantidade de glicose no meio de celular. Em algumas modalidades, a glicose não se acumula durante o tempo em que as células são cultivadas. Em modalidades diversas, as células são cultivadas em condições limitadas de glicose mais que, ou cerca de 1 hora, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou 70. Em modalidades diversas, as células são cultivadas em condições limitadas de glicose mais que, ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% do comprimento total do tempo as células são cultivadas. Embora não seja a intenção de ser obrigado por nenhuma teoria em particular, acredita-se que as condições de glicose limitada podem permitir uma regulação mais favorável das células.
[00345] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada. Por condições de glicose limitada, entende-se que a quantidade de glicose que se adiciona é menor que ou cerca de 105% (tal como cerca de 100%) da quantidade de glicose que é consumida pelas células. Em modalidades particulares, a quantidade de glicose que se adiciona ao meio de cultura é aproximadamente a mesma quantidade de glicose que é consumida pelas células durante um período específico de tempo. Em algumas
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109/343 modalidades, a taxa de crescimento celular é controlada através da limitação da quantidade de glicose adicionada, de tal forma que as células crescem a uma taxa que pode ser suportada pela quantidade de glicose no meio celular. Em algumas modalidades, a glicose não se acumula durante o tempo em que as células são cultivadas. Em várias modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada por um período maior ou cerca de 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou 70 horas. Em várias modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada, por um período maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% da duração total de tempo que as células são cultivadas. Embora não pretenda ficar vinculado a qualquer teoria em particular, acredita-se que as condições de glicose limitada podem permitir uma regulação mais favorável das células.
[00346] Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença de um excesso de glicose. Em modalidades particulares a quantidade de glicose que se adiciona é maior do que cerca de 105% (tal como cerca de ou maior que 110, 120, 150, 175, 200, 250, 300, 400, ou 500%) ou mais da quantidade de glicose que é consumida pelas células durante um período específico de tempo. Em algumas modalidades, a glicose acumula-se durante o tempo em que as células são cultivadas.
[00347] Lipídeos exemplificadores são quaisquer substâncias que contenham um ou mais ácidos graxos que são ácidos graxos C4 e superiores, que são saturados, insaturados, ou ramificados.
[00348] Óleos exemplificadores são lipídeos que estão líquidos à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, os lipídeos contêm um ou mais ácidos graxos C4 ou superiores (por exemplo, contém um ou mais ácidos graxos saturados, insaturados ou ramificados com quatro ou mais carbonos). Em algumas modalidades, o óleo é obtido a
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110/343 partir de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmiste, açafrão, oliva, gergelim, linhaça, células microbianas oleaginosas, sebo chinês, ou qualquer combinação de dois ou mais dos supramencionados [00349] Ácidos graxos exemplificadores incluem compostos de fórmula RCOOH, em que R é um hidrocarboneto. Ácidos graxos insaturados exemplificadores incluem compostos em que o R inclui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Ácidos graxos insaturados exemplificadores incluem, mas não estão limitados a, ácido oleico, ácido vaccênico, o ácido linoleico, ácido palmitoleico e araquidônico. Ácidos graxos poliinsaturados exemplificadores incluem compostos em que o R inclui uma pluralidade de ligações duplas carbono-carbono. Ácidos graxos saturados exemplificadores incluem compostos em que o R é um grupo alifático saturado. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui um ou mais ácidos graxos C12C22, tais como ácidos graxos saturados C12, um ácido graxo saturado C14, um ácido graxo saturado C16, um ácido graxo saturado C18, um ácido graxo saturado C20 ou um ácido graxo saturado C22. Em uma modalidade exemplificadora, o ácido graxo é o ácido palmítico. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um sal de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), um derivado de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), ou um sal de um derivado de ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado). Sais apropriados incluem, mas não estão limitados a sais de lítio, sais de potássio, sais de sódio, e assim por diante. Di- e triglicerídeos são ésteres de ácidos graxos de glicerol.
[00350] Em algumas modalidades, a concentração de lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeos é no mínimo, ou cerca de 1 grama por litro de caldo (g/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células),
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111/343 tal como, pelo menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 g/L ou mais. Em algumas modalidades, a concentração de lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo é de cerca de 10 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 25 e cerca de 300 g/L, entre cerca de 60 e cerca de 180 g/L, ou entre cerca de 75 e cerca de 150 g/L. Em algumas modalidades, a concentração inclui a quantidade total do lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui (i) um lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo e (ii) um carboidrato, como a glicose. Em algumas modalidades, a relação de lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo para o carboidrato é de cerca de 1:1 em uma base de carbono (ou seja, um carbono no lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, diglicerídeo, monoglicerídeo ou triglicerídeo por carbono de carboidrato). Em modalidades particulares, a quantidade de lipídeo, óleo, gordura, ácido graxo, diglicerídeo, monoglicerídeo ou triglicerídeo é entre cerca de 60 e 180 g/L, e a quantidade de carboidratos é de cerca de 120 e 360 g/L.
[00351] Fontes de carbono de polipeptídeo microbiano exemplificadoras incluem um ou mais polipeptídeos de fungos ou bactérias. Fontes de carbono de polipeptídeo de plantas exemplificadoras incluem um ou mais polipeptídeos de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmiste, açafrão, oliva, gergelim ou semente de linhaça. [00352] Fontes de carbono renováveis exemplificadoras incluem permeado de soro de queijo, água de maceração de milho, melaço de açúcar de beterraba, malte de cevada, e os componentes de qualquer dos anteriores. Fontes de carbono renováveis também incluem glicose,
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112/343 hexose, pentose e xilose, presentes na biomassa, tal como milho, gramínea switchgrass, cana-de-açúcar, resíduos celulares dos processos de fermentação, e subproduto proteico da moagem de soja, milho ou trigo. Em algumas modalidades, a fonte de carbono da biomassa é um material lignocelulósico, hemicelulósico, ou celulósico, tal como, mas não limitados a, uma grama, trigo, palha de trigo, bagaço de cana, bagaço de cana de açúcar, polpa de madeira macia, milho, sabugo ou casca de milho, grão de milho, fibra de grão de milho, palha de milho, o capim, produto de casca de arroz, ou um subproduto da moagem úmida ou seca de grãos (por exemplo, milho, sorgo, centeio, triticato, cevada, trigo e/ou bagaço de destilação). Materiais celulósicos exemplificadores incluem madeira, resíduos de polpa e papel, plantas herbáceas e polpa de fruta. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui toda ou qualquer parte da planta, como caules, grãos, raízes ou tubérculos. Em algumas modalidades, a totalidade ou parte qualquer das seguintes plantas são usadas como fonte de carbono: milho, trigo, centeio, sorgo, triticato, arroz, milhete, cevada, mandioca, leguminosas, tais como feijão e ervilha, batata, batata-doce, banana, cana de açúcar, e/ou tapioca. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um hidrolisado de biomassa, tal como um hidrolisado de biomassa que inclui tanto xilose quanto glicose, ou que inclui tanto sacarose quanto glicose.
[00353] Em algumas modalidades, as fontes de carbono renováveis (como biomassa) são pré-tratadas antes de serem adicionadas ao meio de cultura de célula. Em algumas modalidades, o pré-tratamento inclui o pré-tratamento enzimático, pré-tratamento químico, ou uma combinação dos dois pré-tratamentos, enzimático e químico (ver, por exemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2.014 a 2.018, 2005; Patente no US 6.176.176; Patente No U.S. 6.106.888, que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades,
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113/343 particularmente com respeito ao pré-tratamento de fontes de carbono renováveis). Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável é parcial ou completamente hidrolisada antes de ser adicionada ao meio de cultura de células.
[00354] Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tal como palha de milho) sofre pré-tratamento de explosão de fibras com amônia (AFEX) antes de ser adicionada ao meio de cultura de células (ver, por exemplo, Farzaneh et al. Bioresource Technology 96 (18): 2.014 a 2.018, 2005). Durante o pré-tratamento AFEX, uma fonte de carbono renovável é tratada com amônia anidra líquida em temperaturas moderadas (tal como cerca de 60 a cerca de 100°C), e alta pressão (como cerca de 1,72 x 106 a cerca de 2,07 x 106 Pa (250 a 300 psi)) durante cerca de 5 minutos. Depois, a pressão é rapidamente liberada. Neste processo, efeitos físicos e químicos combinados de solubilização de lignina, hidrólise de hemicelulose, descristalisação de celulose, e aumento da área de superfície permite a conversão enzimática quase completa de celulose e hemicelulose em açúcares fermentáveis. O pré-tratamento AFEX tem a vantagem de que quase toda a amônia pode ser recuperada e reutilizada, enquanto o restante serve como fonte de nitrogênio para microorganismos em processos a jusante. Além disso, um fluxo de lavagem não é necessário para o prétratamento AFEX. Assim, a recuperação de matéria seca após o tratamento AFEX é essencialmente de 100%. AFEX é basicamente um processo ‘’dry a dry”. A fonte de carbono renovável tratada é estável por longos períodos e pode ser alimentada com cargas de sólidos muito altas em hidrólise enzimática, ou processos de fermentação. A celulose e a hemicelulose são bem preservadas no processo AFEX, com pouca ou nenhuma degradação. Não há necessidade de neutralização antes da hidrólise enzimática de uma fonte de carbono renovável que sofreu pré-tratamento AFEX. A hidrólise enzimática das fontes de carbono
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114/343 tratadas com AFEX produz fluxo de açúcar puro para uso posterior em fermentação.
[00355] Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a, pelo menos, ou cerca de 0,1, 0,5, 1, 1,5 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50% de glicose (p/v). A quantidade equivalente de glicose pode ser determinada por métodos de HPLC padronizados com glicose, como referência para medir a quantidade de glicose gerada a partir da fonte de carbono. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a entre cerca de 0,1% e cerca de 20% de glicose, tal como entre cerca de 0,1% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 0,5% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1% e cerca de 5% de glicose, ou entre cerca de 1% e cerca de 2% de glicose.
[00356] Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui extrato de levedura ou um ou mais componentes de extrato de levedura. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura é pelo menos 1 grama de extrato de levedura por litro de caldo (g/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células), tal como, pelo menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura é entre cerca de 1 e cerca de 300 g/L, tal como entre cerca de 1 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 100 g/L, ou entre cerca de 5 e cerca de 60 g/ L. Em algumas modalidades, a concentração inclui a quantidade total de extrato de levedura que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui tanto o extrato de levedura (ou um ou mais componentes do mesmo) e outra fonte de carbono, como a glicose. Em
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115/343 algumas modalidades, a razão de extrato de levedura para a outra fonte de carvão é de cerca de 1:5, cerca de 1:10, ou cerca de 1:20 (p/p).
[00357] Além disso, a fonte de carbono também pode ser substrato de único carbono tais como o dióxido de carbono, ou o metanol. A produção de glicerol a partir de fontes de único carbono (por exemplo, metanol, formaldeído, ou formiato) tem sido relatada em leveduras metilotróficas (Yamada et al. Agric. Biol. Chem., 53 (2) 541-543, 1989, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono) e em bactérias (Hunter et al. Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono). Estes organismos podem assimilar compostos de único carbono, variando em estado de oxidação do metano para o formiato, e produzem glicerol. A via de assimilação de carbono pode ser através de ribulose monofosfato, através de serina, ou através de xilulosemomofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edição, Springer-Verlag: New York, 1986, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade, particularmente no que diz respeito às fontes de carbono). A via da ribulose monofosfato envolve a condensação de formiato com ribulose-5-fosfato para formar um açúcar de seis carbonos, que se torna frutose e, eventualmente, o produto de três carbonos, gliceraldeído-3-fosfato. Da mesma forma, a via da serina assimila o composto de único carbono na via glicolítica através do metilenotetraidrofolato.
[00358] Além de substratos de um e dois carbonos, os organismos metilotróficos também são conhecidos por utilizar um número de outros compostos contendo carbono, como a metilamina, glicosamina e uma variedade de aminoácidos para a atividade metabólica. Por exemplo, as leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono da metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al., Microb.
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Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7a ed., 415 a 32. Editores:Murrell et al., Editora: Intercept, Andover, Reino Unido, 1993, que é incorporada aqui por referência, na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono). Da mesma forma, diversas espécies de Candida metabolizam o ácido oleico ou alanina (Sulter et al. Arch. Microbiol. 153 (5), 485 a 9, 1990, que é incorporado por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono).
[00359] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio padrão contendo sais fisiológicos e nutrientes (ver, por exemplo, Pourquie, J. et al., ’Biochemistry e Genetics de Cellulose Degradation, editores Aubert et al. Academic Press, páginas. 71 a 86, 1988 e Ilmen et al. Appl. Environ. Microbiol. 63:1.298 a 1.306, 1997, sendo cada uma delas incorporados aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito aos meios celulares). Meios de cultura exemplificadores são meios comercialmente preparados comuns, como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrose (DP), ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio adequado para o crescimento das células hospedeiras particulares, são conhecidos por alguém versado na técnica da ciência da microbiologia ou da fermentação.
[00360] Em adição a uma fonte de carbono adequada, o meio celular desejavelmente contém minerais adequados, sais, co-fatores, tampões e outros componentes conhecidos por aqueles versados na técnica apropriada para o crescimento das culturas, ou o aumento da produção de isopreno (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas nele, e WO 96/35796 e referências citadas, sendo elas incorporadas aqui por referência, em suas totalidades, em especial no que diz respeito a condições de meios celulares e de cultura de células). Em algumas modalidades, em que uma isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou
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117/343 ácido nucleico da via MVA está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor (por exemplo, açúcar, sal de metal ou antimicrobiano), é desejavelmente adicionado ao meio em uma concentração eficaz para induzir a expressão de uma isopreno sintase, DXS, IDI e/ou polipeptídeo da via MVA. Em algumas modalidades, o meio celular tem um antibiótico (como a canamicina), que corresponde ao ácido nucleico resistente a antibiótico (tal como um ácido nucleico resistente à canamicina) em um vetor que tem um ou mais DXS, IDI, ou ácidos nucleicos da via MVA. Condições de Cultura de Células Exemplificadoras [00361] Os materiais e os métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos no estado da técnica. Técnicas exemplificadoras podem ser encontradas em Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., editores, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Brock em Biotechnology: A textbook de Industrial Microbiology, segunda edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, sendo cada uma delas incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito às técnicas de cultura de células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitam a expressão de um ou mais isopreno sintase, DXS, IDI, ou polipeptídeos da via MVA codificados por um ácido nucleico inserido na célula hospedeira.
[00362] As condições padrões de cultura de células podem ser usadas para cultivar as células (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas no mesmo, sendo cada uma delas incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito às condições de cultura de células e de fermentação). As células são cultivadas e mantidas a uma temperatura, mistura de gases e pH adequados (tal como em cerca de 20°C a cerca de 37°C, em cerca de 6% a cerca de 84% de CO2, e com um pH entre cerca de 5 a cerca de
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9). Em algumas modalidades, as células são crescidas a 35°C em meio celular apropriado. Em algumas modalidades, por exemplo, as culturas são cultivadas a aproximadamente 28°C em meio apropriado, em culturas ou fermentadores com agitação, até a quantidade desejada de co-produção de isopreno e hidrogênio ser alcançada. Em algumas modalidades, a faixa de pH para fermentação é entre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 9,0 (tal como cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,0, ou cerca de 6,5 a cerca de 7,0). As reações podem ser realizadas em condições aeróbias, anóxicas ou anaeróbias com base nos requisitos das células hospedeiras. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de limitação de oxigênio. Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença de oxigênio em condições em que 0,5 pmols de oxigênio são tomadas por mol de isopreno produzido. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições anaeróbicas. Condições de cultura exemplificadoras para um dado fungo filamentoso são conhecidas no estado da técnica, e podem ser encontradas na literatura científica, e/ou em fonte de fungos, tal como a American Type Culture Collection e Fungal Genetics Stock Center.
[00363] Em várias modalidades, as células são cultivadas utilizando qualquer modo conhecido de fermentação, tal como batelada, batelada alimentada ou processos contínuos. Em algumas modalidades, um método de batelada de fermentação é usado. A fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é definida no início da fermentação e não está sujeita às alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação o meio de cultura é inoculado com as células hospedeiras desejadas e a fermentação é permitida a ocorrer sem acrescentar nada ao sistema. Normalmente, no entanto, a fermentação em batelada é batelada em relação à adição da fonte de carbono e as tentativas são muitas vezes feitas em fatores de controle, tais como pH e concentração de oxigênio.
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Em sistemas de batelada, as composições de metabólitos e de biomassa do sistema mudam constantemente até que o tempo de fermentação seja interrompido. Dentro de culturas em batelada, as células moderam através de uma fase lag estática para uma fase log de alto crescimento e, finalmente, para uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é reduzida ou interrompida. Em algumas modalidades, as células em fase log são responsáveis pela maior parte da produção de isopreno. Em algumas modalidades, as células em fase estacionária produzem isopreno.
[00364] Em algumas modalidades, uma variação no sistema de batelada padrão é usada, tal como o sistema alimentado por bateladas. Processos de fermentação em batelada alimentada compreendem um sistema de batelada típico, com a ressalva de que a fonte de carbono se adiciona em incrementos, como os progressos de fermentação. Sistemas alimentados por bateladas são úteis quando a repressão catabólica é apta a inibir o metabolismo das células e em que é desejável ter quantidades limitadas de fonte de carbono no meio celular. Fermentações em batelada alimentada podem ser feitas com a fonte de carbono (por exemplo, glicose) em uma quantidade limitada ou em excesso. A medição da concentração real da fonte de carbono em sistemas alimentada por bateladas é difícil e é, portanto, estimadas com base nas alterações dos fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido, e a pressão parcial de gases residuais como o CO2. Fermentações em batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidas no estado da técnica e exemplos podem ser encontrados em Brock, Biotechnology: A textbook de Industrial Microbiology, segunda edição (1989) Sinauer Associates, Inc., que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito às condições de cultura de células e de fermentação.
[00365] Em algumas modalidades, métodos de fermentação
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120/343 contínua são usados. A fermentação contínua é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é acrescentado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removido, ao mesmo tempo, para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas com uma densidade elevada e constante, em que as células estão primariamente na fase logarítmica de crescimento.
[00366] A fermentação contínua possibilita a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a produção de isopreno. Por exemplo, um método mantém um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio, a uma taxa fixa e permite que todos os outros parâmetros moderem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, enquanto a concentração de células (por exemplo, a concentração medida pela turvação do meio) é mantida constante. Sistemas contínuos esforçam-se para manter as condições de crescimento no estado estacionário. Assim, a perda de células devido ao meio que está sendo retirado, é equilibrado com a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação do produto são bem conhecidas no estado da técnica da microbiologia industrial e uma variedade de métodos são detalhados por Brock, Biotechnology: A textbook de Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito às condições de cultura de células e de fermentação.
[00367] Em algumas modalidades, as células são imobilizadas em um substrato, como catalisadores de células inteiras, e submetidas a condições de fermentação para a produção de isopreno.
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121/343 [00368] Em algumas modalidades, garrafas de cultura líquida são colocadas em agitadores, a fim de introduzir oxigênio ao líquido e manter a uniformidade da cultura. Em algumas modalidades, uma incubadora é usada para controlar a temperatura, umidade, velocidade de agitação e/ou outras condições em que uma cultura é crescida. As incubadoras mais simples são caixas isoladas com um aquecedor regulável, geralmente vai até ~65°C. Incubadoras mais elaboradas também podem incluir a capacidade de diminuir a temperatura (através de refrigeração), ou a capacidade de controlar os níveis de umidade ou CO2. A maioria das incubadoras inclui um temporizador, alguns também podem ser programados para percorrer diferentes temperaturas, níveis de umidade, etc. Incubadoras podem variar em tamanho desde o tamanho de um tampo de mesa a unidades do tamanho de salas pequenas.
[00369] Se desejado, uma porção ou todo o meio celular pode ser alterado para repor os nutrientes e/ou evitar o acúmulo de subprodutos metabólicos potencialmente prejudiciais, e de células mortas. No caso de culturas em suspensão, as células podem ser separadas do meio por centrifugação ou filtragem da cultura em suspensão e, posterior ressuspensão das células em novo meio. No caso das culturas aderentes, o meio pode ser removido diretamente por sucção e substituído. Em algumas modalidades, o meio celular permite pelo menos uma porção das células se dividirem, pelo menos, ou cerca de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65 ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura contínua sem diluição).
[00370] Em algumas modalidades, um promotor constitutivo ou de indução (“’leaky”) (como um promotor Trc) é usado e um composto (como IPTG) não é adicionado para induzir a expressão do isopreno sintase, DXS, IDI, ou ácido (s) nucleico (s) da via MVA operativamente ligado ao promotor. Em algumas modalidades, um composto (como
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IPTG) é adicionado para induzir a expressão do isopreno sintase, DXS, IDI, ou ácido(s) nucleico(s) da via MVA operativamente ligado ao promotor.
Métodos Exemplificadores de Desacoplamento entre a Produção de Isopreno e o Crescimento Celular [00371] Desejavelmente, o carbono da matéria-prima é convertido em isopreno ao invés de usado para o crescimento e manutenção das células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma baixa para OD600 médio, então a produção de isopreno é iniciada ou aumentada. Esta estratégia permite que uma grande parte do carbono seja convertida em isopreno.
[00372] Em algumas modalidades, as células atingem uma densidade ótica de tal ordem que não se dividem mais, ou dividem-se de forma extremamente lenta, mas continuam a fazer isopreno por várias horas (tal como, cerca de 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais horas). Por exemplo, as Figs. 60A a 67C mostram que as células podem continuar a produzir uma quantidade substancial de ácido mevalônico ou isopreno após as células atingirem uma densidade ótica de tal forma que não se dividem mais ou dividem-se de forma extremamente lenta. Em alguns casos, a densidade ótica a 550 nm diminui ao longo do tempo (tal como uma diminuição na densidade ótica após as células não estarem mais em uma fase de crescimento exponencial devido à lise celular), e as células continuam a produzir uma quantidade substancial de ácido mevalônico ou isopreno. Em algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos, ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células produzem isopreno em maior ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000,
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5.000, ou mais nmols de isopreno/grama de células para o peso úmido das células/hora (nmol/gwcm/h) durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno esta entre cerca de 2 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 500 nmol/ gwcm/h, cerca de 150 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, cerca de 500 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 300 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h.
[00373] Em algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno maior ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10,000, 50,000, 100,000, ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaldo, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular) durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg/ Lcaldo, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg/Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaldo, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, cerca de 1000 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg/ Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, cerca de 200 a cerca de 2.000 mg/ Lcaldo,
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124/343 cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/Lcaido, cerca de 300 a cerca de 1.000 mg/ Lcaido, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 mg/Lcaido.
[00374] Em algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células convertem mais ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01,0,02, 0,05, 0,1,0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0 % do carbono no meio de cultura de células em isopreno durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a percentagem de conversão de carbono em isopreno é entre tais como cerca de 0,002 a cerca de 4,0%, cerca de 0,002 a cerca de 3,0%, cerca de 0,002 a cerca de 2,0%, cerca de 0,002 a cerca de 1,6%, cerca de 0,002 a cerca de 0,005%, cerca de 0,005 a cerca de 0,01%, cerca de 0,01 a cerca de 0,05%, cerca de 0,05 a cerca de 0,15%, 0,15 a cerca de 0,2%, cerca de 0,2 a cerca de 0,3%, cerca de 0,3 a cerca de 0,5%, cerca de 0,5 a cerca de 0,8%, cerca de 0,8 para cerca de 1,0%, ou cerca de 1,0 a cerca de 1,6%. Em algumas modalidades, a percentagem de conversão de carbono em isopreno é entre cerca de 0,002 a cerca de 0,4%, de 0,002 a cerca de 0,16%, 0,04 a cerca de 0,16%, cerca de 0,005 a cerca de 0,3%, cerca de 0,01 a cerca de 0,3%, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,3%.
[00375] Em algumas modalidades, o isopreno é produzido apenas na fase estacionária. Em algumas modalidades, o isopreno é produzido tanto na fase de crescimento quanto na fase estacionária. Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzido (tal como a quantidade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora, por OD600) durante a fase estacionária é maior ou cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes a quantidade de isopreno produzida durante a fase de
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125/343 crescimento para o mesmo período de tempo. Em várias modalidades, maior ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% ou mais da quantidade total de isopreno, que é produzido (tal como a produção de isopreno durante uma fermentação por um determinado período de tempo, como 20 horas) é produzido enquanto as células estão na fase estacionária. Em várias modalidades, maior ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% ou mais da quantidade total de isopreno que é produzido (tal como a produção de isopreno durante uma fermentação por um determinado período de tempo, como 20 horas) é produzido enquanto as células dividem-se de forma lenta ou não se dividem, de tal forma que a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%). Em algumas modalidades, o isopreno é produzido apenas na fase de crescimento.
[00376] Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase podem ser colocados sob controle de um fator sigma de fase estacionária, tal como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos da via MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase são colocados sob controle de um promotor induzível em fase estacionária, tal como um promotor induzível por um regulador de resposta ativa em fase estacionária.
Produção de isopreno dentro de Faixas Seguras de Operação [00377] A produção de isopreno dentro de níveis seguros de operação de acordo com suas características de inflamabilidade simplifica o projeto e construção de instalações comerciais, melhora vastamente a capacidade de operar com segurança, e limita o potencial para a ocorrência de incêndios. Em particular, os intervalos ideais para
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126/343 a produção de isopreno estão dentro da zona segura, ou seja, o intervalo não inflamável de concentrações de isopreno. Em um aspecto, a invenção expõe um método para a produção de isopreno dentro do intervalo não inflamável de concentrações de isopreno (fora do envoltório de inflamabilidade do isopreno).
[00378] Assim, testes experimentais e de modelagem computacional foram utilizados para determinar os limites de inflamabilidade do isopreno (tal como isopreno na presença de O2, CO2, N2, ou qualquer combinação de dois ou mais dos gases anteriores), a fim de garantir um processo seguro. O envoltório de inflamabilidade é caracterizado pelo limite de inflamabilidade inferior (LFL), o limite de inflamabilidade superior (UFL), a concentração de oxigênio limitante (LOC), e a temperatura limitante. Para que um sistema seja inflamável, uma quantidade mínima de combustível (tal como isopreno) deve estar na presença de uma quantidade mínima de oxidante, normalmente o oxigênio. A LFL é a quantidade mínima de isopreno que deve estar presente para sustentar a queima, enquanto o UFL é a quantidade máxima de isopreno que pode estar presente. Acima deste limite, a mistura é rica em combustível e a fração de oxigênio é muito baixa para ter uma mistura inflamável. A LOC indica a fração mínima de oxigênio que também deve estar presente para ter uma mistura inflamável. A temperatura limite é baseada no ponto de fulgor do isopreno, e é a mais baixa temperatura em que a combustão do isopreno pode se propagar. Esses limites são específicos para a concentração de isopreno, tipo e concentração de oxidantes, inertes presentes no sistema, temperatura e pressão do sistema. Composições que se enquadram dentro dos limites da curva envelope de inflamabilidade propagam combustão e requerem precauções de segurança adicionais, tanto no projeto quanto na operação dos equipamentos de processo.
[00379] As seguintes condições foram testadas através de simulação
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127/343 computacional, análise matemática e testes experimentais. Se desejado, outras condições (tais como outra temperatura, pressão e composições de gás permanentes) podem ser testados usando os métodos descritos neste documento, para determinar as concentrações de LFL, UFL e de LOC.
(1) Simulação computacional e Análise matemática
Conjunto de Teste 1:
isopreno: 0% em peso - 14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
Conjunto de Teste 2:
isopreno: 0% em peso - 14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
Saturado com H2O
Conjunto de Teste 3:
isopreno: 0% em peso - 14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
CO2: 5% em peso - 30% em peso (2) Testes experimentais para determinação final dos limites de inflamabilidade
Conjunto de Teste 1:
isopreno: 0% em peso - 14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
Conjunto de Teste 2:
isopreno: 0% em peso - 14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
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Saturado com H2O [00380] O software de simulação foi usado para dar uma estimativa das características de inflamabilidade do sistema para diversas condições de teste diferentes. O CO2 não apresentou efeito significativo sobre os limites de inflamabilidade do sistema. Os conjuntos de teste 1 e 2 foram confirmados por testes experimentais. Os resultados da modelagem estavam alinhados com os resultados do teste experimental. Apenas pequenas variações foram encontradas com a adição de água.
[00381] A LOC foi determinada a 9.5% de volume para uma mistura de isopreno, O2, N2, e CO2 a 40°C e 1 atmosfera. A adição de até 30% de CO2 não afetou significativamente as características de inflamabilidade da mistura de isopreno, O2, e N2. Apenas pequenas variações nas características de inflamabilidade foram mostradas entre um sistema de N2, O2 e isopreno saturado hidratado e seco. A temperatura limite é de cerca de -54°C. Temperaturas abaixo de cerca de -54°C são demasiado baixas para propagar a combustão do isopreno.
[00382] Em algumas modalidades, a LFL dos intervalos de isopreno de cerca de 1,5% vol. a cerca de 2,0% vol., e a UFL dos intervalos de isopreno a partir de cerca de 2,0% vol. a cerca de 12,0% vol., depende da quantidade de oxigênio no sistema. Em algumas modalidades, a LOC é cerca de 9,5% vol. de oxigênio. Em algumas modalidades, a LFL de isopreno é entre cerca de 1,5% vol. a cerca de 2,0% vol., a UFL de isopreno é entre cerca de 2,0% vol. a cerca de 12,0% vol., e a LOC é cerca de 9.5% vol. de oxigênio quando a temperatura está entre cerca de 25°C a cerca de 55°C (tal como cerca de 40°C) e a pressão está entre cerca de 1 atmosfera a 3 atmosferas.
[00383] Em algumas modalidades, o isopreno é produzido na presença de menos de cerca de 9,5% vol. de oxigênio (ou seja, abaixo
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129/343 da LOC necessária para ter uma mistura inflamável de isopreno). Em algumas modalidades nas quais é produzido o isopreno na presença de mais ou cerca de 9.5% vol. de oxigênio, a concentração de isopreno está abaixo da LFL (tal como abaixo de cerca de 1.5% vol.). Por exemplo, a quantidade de isopreno pode ser mantida abaixo da LFL, diluindo a composição do isopreno com um gás inerte (por exemplo, adicionando, periodicamente ou continuamente, um gás inerte, como nitrogênio, para manter a composição de isopreno abaixo da LFL). Em algumas modalidades nas quais o isopreno é produzido na presença de oxigênio, maior ou cerca de 9.5% vol., a concentração de isopreno está acima da UFL (tal como acima de cerca de 12% vol.). Por exemplo, a quantidade de isopreno pode ser mantida acima da UFL por meio de um sistema (tal como qualquer um dos sistemas de cultura de células descritos aqui) que produz isopreno em uma concentração acima da UFL. Se desejado, um nível relativamente baixo de oxigênio pode ser usado para que a UFL também seja relativamente baixa. Neste caso, uma menor concentração de isopreno é necessária para se manter acima da UFL.
[00384] Em algumas modalidades nas quais o isopreno é produzido na presença de mais do que cerca 9,5% em volume de oxigênio, a concentração de isopreno está dentro do envelope de inflamabilidade (tal como, entre o LFL e o UFL). Em algumas modalidades, quando a concentração de isopreno pode cair dentro do envelope de inflamabilidade, uma ou mais etapas são realizadas para reduzir a probabilidade de um incêndio ou explosão. Por exemplo, uma ou mais fontes de ignição (tais como todos os materiais que podem gerar uma faísca) podem ser evitadas. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas são realizadas para reduzir a quantidade de tempo que a concentração de isopreno permanece dentro do envelope de inflamabilidade. Em algumas modalidades, um sensor é usado para
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130/343 detectar quando a concentração de isopreno está próxima ou dentro do envelope de inflamabilidade. Se desejar, a concentração de isopreno pode ser medida em um ou mais pontos do tempo durante a cultura de células, e as condições de cultura de células e/ou a quantidade de gás inerte que pode ser ajustada usando métodos padrões, se a concentração de isopreno está próxima ou dentro do envelope de inflamabilidade. Em modalidades particulares, as condições de cultura de células (tais como condições de fermentação) são ajustadas para diminuir a concentração de isopreno abaixo da concentração do LFL ou aumentar a concentração de isopreno acima da concentração do UFL. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é mantido abaixo do LFL pela diluição da composição de isopreno com um gás inerte (tal como pela adição de forma contínua ou periódica de um gás inerte para manter a composição de isopreno abaixo do LFL).
[00385] Em algumas modalidades, a quantidade de compostos voláteis inflamáveis que não sejam de isopreno (como um ou mais açúcares) é de pelo menos cerca de 2, 5, 10, 50, 75 ou 100 vezes menos que a quantidade de isopreno produzida. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa com exceção do gás isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 100% (volume) de oxigênio, como entre cerca de 0% a cerca de 10%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 20% a cerca de 30%, de cerca de 30% a cerca de 40%, de cerca de
40% a cerca de 50%, de cerca de 50% a cerca de 60%, de cercade
60% a cerca de 70%, de cerca de 70% a cerca de 80%, de cercade
90% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% (volume)de oxigênio. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa com exceção do gás isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio, por exemplo, entre cerca de 0% a cerca de 10%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 20% a cerca de 30%, de cerca de 30% a cerca de 40%, de cerca de 40% a cerca de
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50%, de cerca de 50% a cerca de 60%, de cerca de 60% a cerca de 70%, de cerca de 70% a cerca de 80%, de cerca de 90% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio.
[00386] Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa com exceção do gás isopreno compreende entre cerca de 1% a cerca de 50% (volume) de CO2, tal como entre cerca de 1% a cerca de 10%, de cerca de 10% a cerca de 20%, de cerca de 20% a cerca de 30%, de cerca de 30% a cerca de 40%, ou cerca de 40% a cerca de 50% (volume) de CO2.
[00387] Em algumas modalidades, uma composição de isopreno também contém etanol. Por exemplo, 0 etanol pode ser usado para destilação extrativa de isopreno, resultando em composições (como correntes de produto intermédio) que incluem tanto etanol quanto 0 isopreno. Desejavelmente, a quantidade de etanol está fora da curva envelope de inflamabilidade para 0 etanol. A LOC de etanol é de cerca de 8,7% vol., e 0 LFL para 0 etanol é de cerca de 3,3% vol. em condições padrões, tal como cerca de 1 atmosfera e cerca de 60°F (15,55°C) (NFPA 69 Standard on Prevention Systems, edição 2008, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a LOC, LFL, e os valores de UFL). Em algumas modalidades, as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na presença de menos do que 0 LOC requerido para ter uma mistura inflamável de etanol (tal como menos de cerca de 8,7% vol.%). Em algumas modalidades em que as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na presença de mais do que a, ou em aproximadamente na, LOC requerida para ter uma mistura inflamável de etanol, a concentração de etanol está abaixo do LFL (tal como a menos de cerca de 3,3 vol.%).
[00388] Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como 0 oxigênio) está abaixo da LOC de qualquer combustível no sistema
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132/343 (como isopreno ou etanol). Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como o oxigênio) é menor que a cerca de 60, 40, 30, 20, 10 ou 5% da LOC de isopreno ou etanol. Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como o oxigênio) é menor que a LOC do isopreno ou etanol, pelo menos, 2, 4, 5 ou mais pontos percentuais absolutos (% vol.). Em modalidades particulares, a quantidade de oxigênio é de pelo menos 2 pontos percentuais absolutos (vol.%) menos do que a LOC do isopreno ou etanol (tal como uma concentração de oxigênio menor que 7,5% vol., quando a LOC do isopreno é de 9,5% vol.). Em várias modalidades, a quantidade de combustível (como isopreno ou etanol) é menor que, ou cerca de, 25, 20, 15, 10 ou 5% do LFL para esse combustível.
Produção exemplificadora de bioisopreno [00389] Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitem a produção de isopreno pelas células. Por produtividade absoluta máxima quer-se dizer a quantidade máxima absoluta de isopreno no gás de escape (off-gas) durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de produtividade absoluta máxima quer-se dizer o ponto de tempo durante uma execução de fermentação quando a quantidade absoluta do isopreno no gás de escape é máxima durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de produtividade absoluta máxima. Em algumas modalidades, a produtividade absoluta máxima para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
[00390] Por produtividade específica máxima quer-se dizer a quantidade máxima de isopreno produzida por células durante a cultura
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133/343 das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de produtividade específica máxima quer-se dizer o ponto de tempo durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular), quando a quantidade de isopreno produzida por célula está em um máximo. A produtividade específica máxima é determinada pela divisão da produtividade total pela quantidade de células, como determinado pela densidade ótica em 600nm (OD600). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de produtividade específica máxima. Em algumas modalidades, a produtividade específica máxima para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno por células divulgadas aqui. [00391] Por produtividade volumétrica máxima entende-se a quantidade máxima de isopreno produzido por volume de caldo (incluindo o volume das células e do meio celular) durante a cultura de células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma operação de fermentação particular). Por ponto de tempo da produtividade volumétrica máxima específica entende-se o ponto de tempo durante a cultura de células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma operação de fermentação particular) quando a quantidade de isopreno produzido por volume de caldo está no máximo. A produtividade volumétrica máxima específica é determinada dividindo-se a produtividade total pelo volume de caldo e quantidade de tempo. Em algumas modalidades a quantidade isopreno é medida no ponto de tempo da produtividade volumétrica máxima específica. Em algumas modalidades a produtividade volumétrica máxima específica para as células é de qualquer quantidade de isopreno por volume por tempo divulgado aqui.
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134/343 [00392] Por concentração máxima quer-se dizer a quantidade máxima de isopreno produzida durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de concentração máxima quer-se dizer o ponto de tempo durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular), quando a quantidade de isopreno produzida por célula está em um máximo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de concentração máxima. Em algumas modalidades, a concentração máxima para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
[00393] Por produtividade volumétrica média entende-se a quantidade média de isopreno produzido por volume de caldo (incluindo o volume das células e do meio celular) durante a cultura de células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma operação de fermentação particular). A produtividade volumétrica média é determinada pela divisão do total de produtividade pelo volume de caldo e a quantidade de tempo. Em algumas modalidades a produtividade volumétrica média específica para as células é qualquer quantidade de isopreno por volume por tempo divulgado aqui.
[00394] Por produtividade cumulativa total quer-se dizer a quantidade total, cumulativa de isopreno produzida durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade total, cumulativa de isopreno é medida. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa nas células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
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135/343 [00395] Por resposta relativa do detector quer-se dizer a razão entre a resposta do detector (como a área de GC/MS) para um composto (tal como isopreno) e a resposta do detector (tal como a área de GC/MS) de um ou mais compostos (como todos os hidrocarbonetos C5). A resposta do detector pode ser medida como descrito aqui, como pela análise de GC/MS realizada com o sistema Agilent 6890 GC/MS equipado com uma coluna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 pm; 0,25 pm de espessura de filme). Se desejado, a resposta relativa do detector pode ser convertida para uma percentagem de peso usando fatores de resposta para cada um dos compostos. Este fator de resposta é uma medida da quantidade de sinal que é gerado para um composto especial (ou seja, a sensibilidade do detector é para um composto particular). Este fator de resposta pode ser usado como um fator de correção para converter a resposta do detector para uma percentagem de peso quando o detector tem sensibilidades diferentes para os compostos que estão sendo comparados. Alternativamente, a percentagem de peso pode ser aproximada ao assumir que os fatores de resposta são os mesmos para os compostos que estão sendo comparados. Assim, a percentagem de peso pode ser considerada como sendo aproximadamente a mesma que a da resposta relativa do detector.
[00396] Em algumas modalidades, as células em cultura produzem isopreno em mais que, ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 12.500, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 188.000, ou mais nmol do isopreno/grama de células para o molhado peso das células/hora (nmol/gwcm/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 2 a cerca de 200.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, de cerca de 100 a cerca de 500
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136/343 nmol/gwcm/h, de cerca de 150 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, de cerca de 500 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 5.000 a cerca de 10.000 nmol/gwcm/hora, de cerca de 10.000 a cerca de 50.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 50.000 a cerca de 100 mil nmol/gwcm/h, de cerca de 100.000 a cerca de 150 mil nmol/gwcm/h, ou cerca de 150 mil a cerca de 200 mil nmol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 20 a cerca de 200.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 100 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 300 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 400 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 2.000 a cerca de 20.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 5.000 a cerca de 50.000 nmol/gwcm/h, de cerca de 10.000 a cerca de 100 mil nmol/gwcm/h, de cerca de 20.000 a cerca de 150 mil nmol/gwcm/h, ou cerca de 20.000 a cerca de 200.000 nmol/gwcm/hora. [00397] A quantidade de unidades de isopreno em nmol/gwcm/h pode ser medida conforme divulgado na Patente US N° 5.849,970, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, particularmente no que diz respeito à medição da produção de isopreno. Por exemplo, dois mL de headspace (por exemplo, headspace de uma cultura como a 2 mL da cultura cultivadas em frascos fechados a 32°C com agitação de 200 rpm, por aproximadamente 3 horas) são analisados para isopreno usando um sistema de cromatografia gasosa padrão, tais como um sistema operado isotermicamente (85°C) com uma coluna noctano/porasil C (Alltech Associates, Inc., Deerfield, Illinois) e acoplados a um detector de gás de redução de óxido de mercúrio RGD2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (ver, por exemplo, Greenberg et al., Atmos. Environ. 27A: 2.689 a 2.692, 1993; Silver et al., Plant Physiol 97:1.588 a 1.591 de 1991, sendo cada um deles aqui incorporado por referência
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137/343 em sua totalidade, em particular, com relação à medição da produção de isopreno). As unidades de área de cromatografia gasosa são convertidas em nmol de isopreno por meio de uma curva de calibração de concentração padrão de isopreno. Em algumas modalidades, o valor para gramas de células por peso úmido das células é calculado pela obtenção do valor de A600 para uma amostra da cultura de células e, em seguida, o valor A600 é convertido para gramas de células com base em uma curva de calibração de peso úmido para as culturas de células com um valor A600 conhecido. Em algumas modalidades, os gramas de células são estimados assumindo-se que um litro de caldo (incluindo o meio celular e células) com um valor de A600 de 1 tem um peso úmido de célula de 1 grama. O valor também é dividido pelo número de horas que a cultura foi incubada, tal como três horas.
[00398] Em algumas modalidades, as células em cultura produzem isopreno em quantidades maiores que, ou de cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, ou mais de ng de isopreno/g de células para o peso úmido das células/h (nmol/gwcm/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, cerca de 500 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 300 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h. A quantidade de isopreno em nmol/gwcm/h pode ser calculada pela multiplicação do valor pela produção de isopreno nas
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138/343 unidades de nmol/gwcm/h discutidas acima de 68,1 (como descrito na Equação 5 abaixo).
[00399] Em algumas modalidades, as células em cultura produzem uma titulação cumulativa (total) de isopreno maior que, ou cerca de, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, ou mais de MG de isopreno/L de caldo (mg/Lcaldo, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg/Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaldo, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, cerca de 1000 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, cerca de 200 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo, cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, cerca de 300 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo. [00400] A produtividade específica de isopreno em mg de isopreno/L de headspace do frasco agitado ou culturas semelhantes pode ser medida tomando uma amostra de 1 mL da cultura de células em um valor de OD600 de aproximadamente 1,0, colocando-a em um frasco de 20 mL, incubando por 30 minutos e, em seguida medindo a quantidade de isopreno no headspace (como descrito, por exemplo, no exemplo 1, parte II). Se o valor da OD600 não for 1,0, então a medida pode ser normalizada para um valor de OD600 1,0 pela divisão do valor da OD600. O valor do mg de isopreno/L de headspace pode ser convertido para mg/Lcaldo/h/OD600 de cultura de caldo pela multiplicação por um fator de 38. O valor em unidades de mg/Lcaldo/h/OD600 pode ser multiplicado pelo número de horas e o valor de OD600 para obter a titulação cumulativa
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139/343 em unidades de mg de isopreno/L de caldo.
[00401] Em algumas modalidades as células em cultura têm uma produtividade média volumétrica de isopreno maior ou de cerca de 0,1,
1,0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900,
2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900,
3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, ou mais mg de isopreno/L de caldo/hora (mg/Lcaldo/hora, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular). Em algumas modalidades a produtividade média volumétrica de isopreno está entre cerca de 0,1 a cerca de 3.500 mg/Lcaldo/hora, como entre cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/Lcaldo/hora, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.000 a cerca de 1.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.500 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 2.000 a cerca de 2.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 2.500 a cerca de 3.000 mg/Lcaldo/hora, ou cerca de 3.000 a cerca de 3.500 mg/Lcaldo/hora. Em algumas modalidades a produtividade média volumétrica de isopreno está entre cerca de 10 a cerca de 3.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 100 a cerca de 3.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 200 a cerca de 1.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.000 a cerca de 3.000 mg/Lcaldo/hora, ou cerca de 1.500 a cerca de 3.000 mg/L ca ldo/hora.
[00402] Em algumas modalidades as células em cultura têm uma produtividade volumétrica máxima de isopreno maior ou de cerca de 0,5,
1,0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,
1.000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900,
2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900,
3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.750, 4.000, 4.250, 4.500,
4.750, 5.000, 5.250, 5.500, 5.750, 6.000, 6.250, 6.500, 6.750, 7.000,
7.250, 7.500, 7.750, 8.000, 8.250, 8.500, 8.750, 9.000, 9.250, 9.500,
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140/343
9.750, 10,000, 12.500, 15.000, ou mais mg de isopreno/L de caldo/hora (mg/Lcaido/hora, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular). Em algumas modalidades a produtividade volumétrica máxima de isopreno está entre cerca de 0,5 a cerca de 15.000 mg/Lcaldo/hora, como entre cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1,0 a cerca de 100 mg/Lcaldo/hora, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.000 a cerca de 1.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.500 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 2.000 a cerca de 2.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 2.500 a cerca de 3.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 3.000 a cerca de 3.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 3.500 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 5.000 a cerca de 7.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 7.500 a cerca de 10,000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 10,000 a cerca de 12.500 mg/Lcaldo/h, ou cerca de 12.500 a cerca de 15.000 mg/Lcaldo/hora. Em algumas modalidades a produtividade volumétrica máxima de isopreno está entre cerca de 10 a cerca de 15.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 100 a cerca de 2.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 1.000 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 2.500 a cerca de 7.500 mg/Lcaldo/hora, cerca de 5.000 a cerca de 10,000 mg/Lcaldo/hora, cerca de 7.500 a cerca de 12.500 mg/Lcaldo/hora, ou cerca de 10,000 a cerca de 15.000 mg/Lcaldo/hora.
[00403] A taxa de produção de isopreno instantânea em mg/Lcaido/h em um fermentador pode ser medida tomando uma amostra do fermentador de gases de exaustão, analisando a mesma para a quantidade de isopreno (em unidades tais como mg de isopreno por Lgas), como descrito, por exemplo, no exemplo 1, parte II e multiplicando este valor pela taxa que o gás de escape é passado para cada litro de caldo (por exemplo, em 1 vvm (volume de ar/volume de caldo/minuto), isto é, de 60 Lgas por hora). Assim, um nível de gases de gás de escape de 1 mg/Lgas corresponde a uma taxa de produção instantânea de 60 mg/Lcaldo/h em fluxo de ar de 1 vvm. Se desejar, o valor das unidades
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141/343 de mg/Lcaido/h pode ser dividido pelo valor ODeoo para obter a taxa específica em unidades de mg/Lcaldo/h/OD. O valor médio de mg de isopreno/Lgás pode ser convertido para a produtividade total do produto (gramas de isopreno por litro de caldo de fermentação, mg/Lcaldo) pela multiplicação desta concentração média de isopreno do gás de escape pela quantidade total de gás de escape injetado por litro de caldo de fermentação durante a fermentação. Assim, uma concentração média de isopreno de gás de escape de 0,5 mg/Lcaldo/h durante 10 horas a 1 vvm corresponde a uma concentração total do produto de 3oo mg de isopreno Lcaldo.
[00404] Em algumas modalidades, as células em cultura converter mais que, ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1,0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0,
16.0, 17.0, 18.0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 23,2, 23,4, 23,6, 23,8, 24,0,
25,0, 30,0, 31,0, 32,0, 33,0, 35,0, 37,5, 40,0, 45,0, 47,5, 50,0, 55,0, 60,0,
65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0 ou 90,0% molar do carbono no meio de cultura de células em isopreno. Em algumas modalidades, a conversão por cento de carbono em isopreno é entre cerca de 0,002 a cerca de 90,0% molar, como cerca de 0,002 a cerca de 0,005%, de cerca de 0,005 a cerca de 0,01%, de cerca de 0,01 a cerca de 0,05%, de cerca de 0,05 a cerca de 0,15%, 0,15 a cerca de 0,2%, de cerca de 0,2 a cerca de 0,3%, de cerca de 0,3 a cerca de 0,5%, de cerca de 0,5 a cerca de 0,8%, de cerca de 0,8 a cerca de 1,0%, de cerca de 1,0 a cerca de 1,6%, de cerca de 1,6 a cerca de 3,0%, de cerca de 3,0 a cerca de 5,0%, de cerca de 5,0 a cerca de 8,0%, de cerca de 8,0 a cerca de 10,0%, de cerca de 10,0 a cerca de 15,0%, de cerca de 15,0 a cerca de 20,0%, de cerca de 20,0 a cerca de 25,0%, de cerca de 25,0% a 30,0%, de cerca de 30,0 % a 35,0%, de cerca de 35,0% a 40,0%, de cerca de 45,0% a 50,0%, de cerca de 50,0% a 55,0%, de cerca de 55,0% a 60,0%, de
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142/343 cerca de 60,0% a 65,0%, de cerca de 65,0% a 70,0%, de cerca de 75,0% a 80,0%, de cerca de 80,0% a 85,0%, ou cerca de 85,0% a 90,0%. Em algumas modalidades, a conversão por cento de carbono em isopreno é entre cerca de 0,002 a cerca de 0,4% molar, 0,002 a cerca de 0,16% molar, 0,04 a cerca de 0,16% molar, de cerca de 0,005 a cerca de 0,3% molar, de cerca de 0,01 a cerca de 0,3% molar, de cerca de 0,05 a cerca de 0,3% molar, de cerca de 0,1 a 0,3% molar, de cerca de 0,3 a cerca de 1,0% molar, de cerca de 1,0 a cerca de 5,0% molar, de cerca de 2 a cerca de 5,0% molar, de cerca de 5,0 a cerca de 10,0% molar, de cerca de 7 a cerca de 10,0% molar, de cerca de 10,0 a cerca de 20,0% molar, de cerca de 12 a cerca de 20,0% molar, de cerca de 16 a cerca de 20,0% molar, de cerca de 18 a cerca de 20,0% molar, de cerca de 18-23,2% molar, de cerca de 18-23,6 molar %, de cerca de 18 a cerca de 23,8% molar, de cerca de 18 a cerca de 24,0% molar, de cerca de 18 a cerca de 25,0% molar, de cerca de 20 a cerca de 30,0% molar, de cerca de 30 a cerca de 40,0% molar, de cerca de 30 a cerca de 50,0% molar, de cerca de 30 a cerca de 60,0% molar, de cerca de 30 a cerca de 70,0% molar, de cerca de 30 a cerca de 80,0% molar, ou cerca de 30 a cerca de 90,0% molar.
[00405] A conversão percentual de carbono em isopreno (também referida como % do rendimento do carbono”) pode ser medida pela divisão dos moles de carbono no isopreno produzidos por moles de carbono na fonte de carbono (tal como os moles de carbono no lote e glicose alimentada e extrato de levedura). Este número é multiplicado por 100% a dar um valor percentual (conforme indicado na Equação 1). Equação 1 carbono em mois no isopreno produzido
Rendimento do Carbono = -------------------------------------------(carbono em mois na fonte de carbono) x 100 [00406] Para este cálculo, pode-se assumir que o extrato de levedura contém 50% p/p de carbono. Como um exemplo, para os 500 litros
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143/343 descritos no Exemplo 7, parte VIII, a conversão percentual de carbono em isopreno pode ser calculada como mostrado na Equação 2. Equação 2 Λ/_ , 39,1gisoprenox1/68,1mol / gx5C / mol % Re n dim entoCarbono =------------------------------------------------------------------------[(181,221ggli cos ex1/180mol / gx6C / mol) + (17780gextratolevedwrax0,5x1/12mol / g)]x100 = 0,042% [00407] Para as duas fermentações de 500 litros descritas aqui (Exemplo 7, partes VII e VIII), a conversão percentual de carbono em isopreno está entre 0,04-0,06%. Um rendimento de 0,11-0,16% de carbono foi alcançado usando sistemas de 14 litros, conforme descrito neste documento. O exemplo 11, parte V descreve a conversão de 1,53% de carbono para isopreno usando os métodos descritos neste documento.
[00408] Um técnico no assunto pode facilmente converter a taxa de produção de isopreno ou a quantidade de isopreno produzido em outras unidades. As equações exemplificadoras estão listadas abaixo para a interconversão entre as unidades [00409] Unidades para a taxa de produção de isopreno (total e específica)
Equação 3 [00410] 1 g de isopreno/Lcaldo/h = 14,7 mmol isopreno/Lcaldo/h (taxa volumétrica total)
Equação 4 [00411] 1 nmol de isopreno/gwcm/hora = 1 de isopreno nmol/Lcaldo/ hora/OD600 (Esta conversão assume que um litro de caldo com um valor de 1 OD600 tem um peso célula úmida de 1 grama).
Equação 5 [00412] 1 nmol de isopreno/gwcm/h = 68,1 ng isopreno/gwcm/h (dado o peso molecular do isopreno)
Equação 6 [00413] 1 nmol de isopreno/OPL O2/hora = 90 nmol isopreno/Lcaldo/h (a
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144/343 uma taxa de fluxo de O2 de 90 L/h por L de caldo de cultura)
Equação 7 [00414] 1 isopreno mg/isopreno OPL em gás de escape isopreno = 60 mg/Lcaldo/hora a uma vazão de 60 Lgas por Lcaldo (1 vvm) Unidades para testes sorológicos (total e específica)
Equação 8 [00415] 1 nmol proteína celular de isopreno/mg = 150 nmol isopreno/Lcaldo/OD600 (Esta conversão assume que um litro de caldo com um valor de 1 OD600 tem uma proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (produtividade específica)
Equação 9 [00416] 1 g de isopreno/isopreno Lcaldo = 14,7 mmol/Lcaldo (título total) [00417] Se desejado, a Equação 10 pode ser usada para converter qualquer uma das unidades que incluem o peso úmido das células para as unidades correspondentes, que incluem o peso seco das células. Equação 10 [00418] Peso seco de células = (peso úmido de células)/3,3 [00419] Se desejado, a Equação 11 pode ser usada para conversão entre unidades de ppm e pg/L. Em particular, ppm significa partes por milhão definido em termos de pg/g (p/p). As concentrações de gases também podem ser expressas em uma base volumétrica usando ppmv (partes por milhão por volume), definida em termos de pL/L (v/v). A conversão de pg/L para ppm (por exemplo, pg de analito por g de gás) pode ser realizada pela determinação da massa por L de gás de escape (ou seja, a densidade do gás). Por exemplo, um litro de ar em condições normais de temperatura e pressão (CNTP; 101,3 kPa (1 bar) e 273.15K (0°C)) tem uma densidade de aproximadamente 1,29 g/L. Assim, uma concentração de 1 ppm (pg/g) é igual a 1,29 pg/L na CNTP (Equação 11). A conversão de ppm (pg/g) pg/L é uma função tanto da pressão, temperatura como da composição global do gás de escape.
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Equação 11 [00420] 1 ppm (pg/g) é igual a 1,29 pg/L em condições normais de temperatura e pressão (CNTP; 101,3 kPa (1 bar) e 273,15K (0°C)).
[00421] A conversão de pg/L para ppmv (por exemplo, a pL do analito por L de gás) pode ser realizada usando a Lei do Gás Universal (equação 12). Por exemplo, uma concentração de gás de escape de 1000 pg/Lgás corresponde a 14,7 pmol/Lgás. A constante universal dos gases é 0,082057 L. atm K-1mol-1, então usando a equação 12, o volume ocupado por 14,7 pmol de HG na CNTP é igual a 0,329 mL. Portanto, a concentração de 1000 pg/L de HG é igual a 329 ppmv ou 0,0329% (v/v) na CNTP.
Equação 12 [00422] PV = nRT, em que P é a pressão, V é o volume, n é moles de gás, R é a constante universal do gás, e T é a temperatura em Kelvin.
[00423] A quantidade de impurezas em composições de isopreno é normalmente medida aqui em peso por volume (p/v) com base em unidades como pg/L. Se desejado, as medidas em unidades de pg/L podem ser convertidas em unidades de mg/m3 através da equação 13. Equação 13 mg/L = 1 mg/m3 [00424] Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula que compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo do isopreno sintase produz uma quantidade de isopreno que é de pelo menos ou cerca de, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzida a partir de uma célula correspondente crescida essencialmente sob as mesmas condições, sem o ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo do isopreno sintase.
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146/343 [00425] Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula que compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo do isopreno sintase e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo de DXS, IDI, e/ou via MVA produzem uma quantidade de isopreno que é pelo menos, ou cerca de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzida a partir de uma célula cultivada correspondente sob as mesmas condições, sem os ácidos nucleicos heterólogos.
[00426] Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende mais que, ou cerca de, 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno, em peso, em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta relativa de detector maior que, ou de cerca de, 99,90, 99,91,99,92, 99,93, 99,94, 99,95, 99,96, 99,97, 99,98,
99,99, ou 100% de isopreno em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 99,90 a cerca de 99,92, cerca de 99,92 a cerca de 99,94, cerca de 99,94 a cerca de 99,96, cerca de 99,96 a cerca de 99,98, cerca de 99,98 a 100 % de isopreno em peso em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
[00427] Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, cis1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1-ino) em peso, em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na
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147/343 composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta do detector de menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta relativa do detector de menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% a 1,3ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3eno-1-ino em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,02 a 0,04%, cerca de 0,04 a cerca de 0,06%, cerca de 0,06 a 0,08%, cerca de 0,08 a 0,10%, ou cerca de 0,10 a cerca de 0,12% de hidrocarbonetos C5 diferentes de isopreno (tal como, 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3pentadieno, cis-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, cis-pent-3-eno1-ino, 3-hexen-1-ol, 3-hexen-1-ila acetato, limoneno, geraniol (trans-3,7dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol), em peso, em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
[00428] Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 pg/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que iniba a polimerização de isopreno . Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, tal como cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,01 a cerca de 5, cerca de 0,01
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148/343 a cerca de 1, cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 pg/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que iniba a polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 pg/L de um hidrocarboneto diferente de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, transpiperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, ou cis-pent-3-eno-1- ino). Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, como cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,01 a cerca de 5, cerca de 0,01 a cerca de 1, cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 pg/L de um hidrocarboneto diferente de isopreno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 pg/L de uma proteína ou ácido graxo (estando essa proteína ou ácido graxo naturalmente associado com borracha natural).
[00429] Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 10, 5, 1, 0,8, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrila, ou 1,3ciclopentadieno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de enxofre ou alenos. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de todos acetilenos (tais como 1-pentino, 2pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, e cis-pent-3-eno-1-ino). Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de dímeros
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149/343 de isopreno, tais como dímeros cíclicos do isopreno (por exemplo, compostos derivados C10 cíclicos da dimerização de duas unidades de isopreno).
[00430] Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui etanol, acetona, um álcool prenil C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3metil-2-buten-1-ol), ou por dois ou mais dos elementos anteriores. Em modalidades específicas, a composição de isopreno compreende maior que ou cerca de 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 pg/L de etanol, acetona, a C5 álcool prenil (tal como 3-metil3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou por dois ou mais dos elementos anteriores. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 120, tal como cerca de 0,01 a cerca de 80, cerca de 0,01 a cerca de 60, cerca de 0,01 a cerca de 40, cerca de 0,01 a cerca de 30, cerca de 0,01 a cerca de 20, cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,1 a cerca de 80, cerca de 0,1 a cerca de 60, cerca de 0,1 a cerca de 40, cerca de 5 a cerca de 80, cerca de 5 a cerca de 60, ou cerca de 5 a cerca de 40 pg/L de etanol, acetona, a C5 álcool prenil, ou por dois ou mais dos elementos anteriores.
[00431] Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais dos seguintes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, metil acetato, 1-propanol, diacetil, 2-butanona,
2- metil-3-buten-2-ol, etil acetato, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal,
3- metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, etil isobutirato, 3-metil-2-butenal, butil acetato, 3-metilbutil acetato, 3-metil3-buten-1-il acetato, 3-metil-2-buten-1-il acetato, (E)-3,7-dimetil-1,3,6octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3-cicloeptenolpiridina, ou um polímero isopreno linear (tal como um dímero isopreno linear ou um trímero de isopreno linear derivado da polimerização de múltiplas unidades de isopreno). Em diversas modalidades, a quantidade de um
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150/343 destes componentes relativo a quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (ou seja, peso dos componentes dividido pelo peso do isopreno multiplicado por 100) é maior do que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p). Em algumas modalidades, a resposta do detector relativo ao segundo composto em comparação com a resposta do detector de isopreno é maior do que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110%. Em diversas modalidades, a quantidade de um destes componentes relativo a quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (ou seja, peso dos componentes dividido pelo peso do isopreno multiplicado por 100) está entre cerca de 0,01 a cerca de 105 % (p/p), tal como cerca de 0,01 a cerca de 90, cerca de 0,01 a cerca de 80, cerca de 0,01 a cerca de 50, cerca de 0,01 a cerca de 20, cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,02 a cerca de 50, cerca de 0,05 a cerca de 50, cerca de 0,1 a cerca de 50, ou 0,1 a cerca de 20% (p/p).
[00432] Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais dos seguintes: um álcool, um aldeído, um éster, ou uma cetona (tais como quaisquer alcoóis, aldeídos, ésteres, ou cetonas, descritos neste documento). Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui (i) um álcool e um aldeído, (ii) um álcool e uma cetona, (iii) um aldeído e uma cetona, ou (iv) um álcool, um aldeído, e uma cetona.
[00433] Em algumas modalidades, a composição de isopreno contém um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2butanona, 2-metil-1-butanol, ou indol. Em algumas modalidades, a composição de isopreno contem 1 ppm ou mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, ou
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151/343 indol. Em algumas modalidades, a concentração de mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, ou indol, está entre cerca de 1 a cerca de 10,000 ppm em uma composição de isopreno (como gás de escape antes que este seja purificado). Em algumas modalidades, a composição de isopreno (como gás de escape após este ter sido submetido a uma ou mais etapas de purificação) inclui um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, ou indol, a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 100 ppm, tal como cerca de 1 a cerca de 10 ppm, cerca de 10 a cerca de 20 ppm, cerca de 20 a cerca de 30 ppm, cerca de 30 a cerca de 40 ppm, cerca de 40 a cerca de 50 ppm, cerca de 50 a cerca de 60 ppm, cerca de 60 a cerca de 70 ppm, cerca de 70 a cerca de 80 ppm, cerca de 80 a cerca de 90 ppm, ou cerca de 90 a cerca de 100 ppm. Compostos orgânicos voláteis de culturas de células (tais como compostos orgânicos voláteis no headspace das culturas de células) podem ser analisados usando métodos padronizados tais como estes descritos neste documento ou outros métodos padronizados, tais como espectrometria de massa de reação de transferência de prótons (ver, por exemplo, Bunge et al., Applied e Environmental Microbiology, 74(7):2.179 a 2.186, 2008 que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, relativo particularmente a análise de compostos orgânicos voláteis).
[00434] Em algumas modalidades, a composição compreende mais que cerca de 2 mg de isopreno, tal como maior que ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende maior que ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de
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152/343 isopreno na composição está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg, como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg, cerca de 100 a cerca de 500 mg, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 mg, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg, cerca de 100 a cerca de 5.000 mg, cerca de 200 a cerca de 2.000 mg, cerca de 200 a cerca de 1.000 mg, cerca de 300 a cerca de 1.000 mg, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 mg. Em algumas modalidades, maior que ou cerca de 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 95% por peso da fração orgânica volátil da composição é isopreno. [00435] Em algumas modalidades, a composição inclui etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 75 a cerca de 90% por peso de etanol, tal como entre cerca de 75 a cerca de 80%, cerca de 80 a cerca de 85%, ou cerca de 85 a cerca de 90% por peso de etanol. Em algumas modalidades nas quais a composição inclui etanol, a composição também includes entre cerca de 4 a cerca de 15% por peso de isopreno, tal como entre cerca de 4 a cerca de 8%, cerca de 8 a cerca de 12%, ou cerca de 12 a cerca de 15% por peso de isopreno.
[00436] Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo do isopreno sintase, polipeptídeo DXS, polipeptídeo IDI, e/ou polipeptídeo da via MVA produz uma quantidade de um composto isoprenoide (tal como um composto com 10 ou mais átomos de carbono que é formado a partir da reação de uma ou mais moléculas de IPP com as moléculas de um ou mais DMAPP) que é maior do que ou cerca de 2-vezes, 3-vezes, 5-vezes, 10-vezes, 25vezes, 50-vezes, 100-vezes, 150-vezes, 200-vezes, 400-vezes, ou maior que a quantidade do composto isoprenoide produzido a partir de uma célula correspondente cultivada sob as mesmas condições, sem
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153/343 um ou mais ácidos nucleicos heterólogos. Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ou mais ácidos nucleicos heterólogos codificando um polipeptídeo do isopreno sintase, polipeptídeo DXS, polipeptídeo IDI, e/ou polipeptídeo da via MVA produz uma quantidade de um álcool prenílico C5 (tal como 3metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol) que é maior do que ou cerca de 2-vezes, 3-vezes, 5-vezes, 10-vezes, 25-vezes, 50-vezes, 100vezes, 150-vezes, 200-vezes, 400-vezes, ou maior que a quantidade de álcool prenílico C5 produzido a partir da célula correspondente cultivada sob essencialmente as mesmas condições, sem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos.
Métodos Exemplificadores de Purificação de Isopreno [00437] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos aqui inclui ainda a recuperação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido usando as composições e métodos da invenção podem ser recuperado usando as técnicas padrão, tais como extração gasosa, fracionamento, adsorção/dessorção, pervaporação, dessorção térmica ou vácuo de isopreno a partir de uma fase sólida, ou extração de isopreno imobilizado ou absorvido para uma fase sólida com um solvente (ver, por exemplo, Patente no U.S. 4.703.007 e Patente No U.S. 4.570.029, que estão ambas incorporadas, por referência, em suas totalidades, particularmente no que diz respeito à recuperação de isopreno e métodos de purificação). Em algumas modalidades, a recuperação do isopreno envolve o isolamento de isopreno na forma líquida (como uma solução pura do isopreno ou uma solução de isopreno em um solvente). A remoção do gás envolve a remoção de isopreno vapor a partir da fermentação de fluxo de gás de escape de forma contínua. Tal remoção pode ser alcançado de diversas maneiras, incluindo mas não limitado a, adsorção para uma fase sólida, partição em uma fase líquida, ou condensação direta. Em algumas modalidades,
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154/343 o enriquecimento de uma membrana diluir fluxo de isopreno vapor acima do ponto de orvalho do vapor resultante da condensação de isopreno líquido.
[00438] A recuperação de isopreno pode envolver uma etapa ou várias etapas. Em algumas modalidades, a remoção de isopreno vapor a partir da fermentação do gás de escape e a conversão do isopreno para uma fase líquida são realizadas simultaneamente. Por exemplo, o isopreno pode ser diretamente condensado do fluxo de gás de escape para formar um líquido. Em algumas modalidades, a remoção de isopreno vapor a partir da fermentação do gás de escape e a conversão do isopreno para uma fase líquida se realiza seqüencialmente. Por exemplo, o isopreno pode ser adsorvido por uma fase sólida e, em seguida, extraído da fase sólida com um solvente. Em uma modalidade, o isopreno é recuperado usando absorção por arraste, conforme descrito no pedido de patente provisória No U.S. 61/288.142.
[00439] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos aqui inclui ainda a purificação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido usando as composições e métodos da invenção pode ser purificado usando técnicas padrão. Purificação se refere a um processo através do qual isopreno é separada de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é obtido como um líquido substancialmente puro. Exemplos de métodos de purificação incluem (i) destilação de uma solução em um extrator líquido e (ii) cromatografia. Como usado aqui, isopreno purificado significa isopreno que foi separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é, pelo menos, de cerca de 20%, em peso, livre de outros componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em modalidades diversas, o isopreno é, pelo menos, ou cerca de 25%, 30%, 40%, 50%,
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60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, ou 99%, em peso, puro. Pureza pode ser analisada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, análise de HPLC ou análise GC-MS.
[00440] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da fase gás remanescente após uma ou mais etapas de recuperação para a remoção de isopreno é reciclado através da introdução da fase gás em um sistema de cultura de células (como um fermentador) para a produção de isopreno.
Polimerização do isopreno [00441] As composições de bioisopreno aqui descritas podem ser submetidas a reações químicas para a sua polimerização a vários produtos, tais como copolímeros ou polímeros de peso molecular específico. Como descrito acima, copolímeros refere-se a um polímero que é feita a partir da polimerização de isopreno com outra moléculas não-isopreno, incluindo mas não limitado a, 1,3-butadieno, estireno, □metil estireno. Isopreno pode ser purificado a partir de composições bioisopreno antes de qualquer reação de polimerização. Em uma modalidade, o isopreno é utilizado um monômero de isopreno. Em outra modalidade, o isopreno é utilizado poli-isopreno em que monômeros de isopreno foram polimerizados para formar um polímero de unidades de isopreno. Em uma modalidade, o poli-isopreno não é um poli-isopreno linear (isto é, poli-isopreno não-linear). Em outra modalidade, o poliisopreno é um poli-isopreno linear.
[00442] Polímeros, ou de poli-isopreno ou copolímero, podem ser também tanto polímero solúvel ou polímero gel, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, um polímero é de pelo menos cerca de 30% de polímero solúvel em, pelo menos cerca de 40% de polímero solúvel em, pelo menos cerca de 50% de polímero solúvel em, pelo menos cerca de 60% de polímero solúvel em, pelo menos cerca de 70% de polímero solúvel, pelo menos cerca de 80% de polímero solúvel em,
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156/343 pelo menos cerca de 90% de polímero solúvel em, pelo menos cerca de 95% de polímero solúvel, ou pelo menos cerca de 100% de polímero solúvel, sendo o restante polímero gel.
[00443] Em algumas modalidades, o polímero é um polímero solúvel. O polímero solúvel pode ter um peso molecular variando de 300.000 a 800.000. O polímero solúvel pode ter um peso molecular de pelo menos cerca de 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000,
900.000, ou 1.000.000. O polímero solúvel pode ter um peso molecular de, no máximo, de cerca de 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, ou 1.000.000. O polímero solúvel pode ser bidimensional.
[00444] Em outras modalidades, o polímero é um polímero gel. Em uma modalidade, o polímero gel tem um peso molecular variando de pelo menos cerca de 1 milhão para pelo menos cerca de 50 milhões. Em algumas modalidades, o polímero gel é de pelo menos cerca de 1 milhão, pelo menos, de cerca de 2 milhões, pelo menos cerca de 3 milhões, pelo menos, de cerca de 4 milhões, pelo menos cerca de 5 milhões, pelo menos, de cerca de 6 milhões, pelo menos, de cerca de 7 milhões, pelo menos, de cerca de 8 milhões, pelo menos, de cerca de 9 milhões, pelo menos, de cerca de 10 milhões, pelo menos, de cerca de milhões, pelo menos, de cerca de 20 milhões, pelo menos, de cerca de 25 milhões, pelo menos, de cerca de 30 milhões, pelo menos, de cerca de 35 milhões, pelo menos cerca de 40 milhões, pelo menos, de cerca de 45 milhões, ou pelo menos cerca de 50 milhões. Em ainda outras modalidades, o polímero gel é, no máximo, de cerca de 1 milhão, no máximo cerca de 2 milhões, no máximo cerca de 3 milhões, no máximo, de cerca de 4 milhões, no máximo cerca de 5 milhões, no máximo, de cerca de 6 milhões, no máximo, de cerca de 7 milhões, no máximo, de cerca de 8 milhões, no máximo, de cerca de 9 milhões, no máximo, de cerca de 10 milhões, no máximo cerca de 15 milhões, no
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157/343 máximo cerca de 20 milhões, no máximo cerca de 25 milhões, no máximo, de cerca de 30 milhões, no máximo, de cerca de 35 milhões, em mais cerca de 40 milhões, no máximo cerca de 45 milhões, ou no máximo pelo menos cerca de 50 milhões. O componente de gel pode ser tridimensional.
[00445] Em alguns aspectos, polímeros de poli-isopreno e métodos de fazer polímeros de poli-isopreno são fornecidos. O poli-isopreno pode incluir uma ou mais das incorporações aqui descritas (por exemplo, um valor indicado õ13C). Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos descritos neste documento (por exemplo, métodos de fabricação e/ou purificação de isopreno) inclui ainda a polimerização do isopreno (por exemplo, qualquer isopreno descrito aqui). Por exemplo, os métodos padrões podem ser usados para polimerizar o isopreno purificado para formar cis-poli-isopreno ou outros produtos mais adiante usando métodos padrões. Assim, como descrito aqui, em um aspecto é fornecido um pneumático compreendendo poli-isopreno, como cis-1,4poli-isopreno e/ou trans-1,4-poli-isopreno produzido a partir de qualquer das composições de isopreno divulgadas neste documento e/ou que utiliza qualquer dos métodos de polimerização divulgados neste documento. Em algumas dessas incorporações, o poli-isopreno (por exemplo, qualquer polímero poli-isopreno aqui descrito) é feita a partir de qualquer isopreno ou composição de isopreno aqui descritos.
[00446] Em alguns aspectos, a invenção fornece para sistemas de produção de um polímero de isopreno compreendendo: (a) uma composição de isopreno derivada de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial sofre polimerização de isopreno com outras moléculas de isopreno para produzir um polímero do isopreno com um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 100.000. Como usado aqui, pelo menos uma parte da
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158/343 composição inicial isopreno pode se referir a, pelo menos, de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%, ou 100% da composição inicial de isopreno que experimenta polimerização.
[00447] Em outros aspectos, os polímeros e copolímeros poliisopreno e métodos de fazer estes tipos de polímeros de vários pesos moleculares são fornecidos. Em uma modalidade, os polímeros têm um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 100.000. Em outras modalidades, os polímeros a ter um peso molecular de pelo menos cerca de 6.000, 7.000; 8000; 9000; 10.000; 12.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000; 35.000, 40.000, 45.000, 50.000; 55.000; 60.000; 70.000; 80.000, 90.000 ou 100.000. Em outras modalidades, os polímeros a ter um peso molecular de, no máximo, de cerca de 6.000, 7.000; 8000; 9000; 10.000; 12.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000; 35.000, 40.000, 45.000, 50.000; 55.000; 60.000; 70.000; 80.000, 90.000 ou 100.000.
[00448] Métodos adicionais e composições são descritos no pedido de patente provisória no U.S. 61/097.186, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031062, Pedido de patente provisória no U.S. 61/097.189, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031077, Pedido de patente provisória no U.S. 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, WO 2010/031079, e o Pedido de patente provisória no de série US 12/335.071 (EUA 2009/0203102 A1) os quais aqui se incorporam por referência em suas totalidades, particularmente com respeito a composições e métodos para a produção de isopreno.
[00449] Em um aspecto, é fornecido um método para produzir um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreendendo: (a) a obtenção de isopreno a partir de recursos renováveis; (b)
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159/343 polimerização do isopreno derivado de recursos renováveis, e (c) recuperação do polímero produzido. Em algumas modalidades, a partir de recursos renováveis de isopreno é obtido por um método que compreende as etapas de (i) a cultura de células compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase sob condições de cultura adequadas para a produção de isopreno, (ii) produção do isopreno, e (iii) recuperação do isopreno a partir da cultura. Um polímero do isopreno derivados de recursos renováveis, como um homopolímero de poli-isopreno, um líquido ou um poli-isopreno polímero co-polímero de isopreno e um ou mais monômeros adicionais, produzidos por qualquer dos métodos descritos neste documento.
[00450] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um sistema para produzir um copolímero de isopreno compreendendo: (a) uma composição de isopreno derivada de recursos renováveis, e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma parte do material inicial de isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial sofre polimerização de isopreno com outra molécula não-isopreno para produzir um copolímero. Como usado aqui, pelo menos uma parte da composição inicial isopreno pode se referir a, pelo menos, de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%, ou 100% da composição inicial de isopreno que experimenta polimerização.
[00451] Em algumas modalidades, o isopreno desta invenção pode ser polimerizado em polímeros úteis, incluindo borracha sintética, utilizando as mesmas técnicas que são aplicáveis ao isopreno, que é derivada de fontes petroquímicas. A polimerização e recuperação de isopreno contendo tais polímeros são adequadamente realizadas de acordo com vários métodos adequados para processos de
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160/343 polimerização dieno monômero. Isto inclui operações em batelada, operações semicontínuas ou contínuas, em condições que excluem ar e outras impurezas atmosféricas, em especial o oxigênio e a umidade. A polimerização do monômero de isopreno também pode ser realizada em um número de diferentes sistemas de reator de polimerização, que inclui mas não se limita a, polimerização em massa, polimerização de fase vapor, polimerização em solução, polimerização em suspensão, polimerização em emulsão, e sistemas de polimerização de precipitação. Os métodos de polimerização comercialmente preferidos são tipicamente polimerização em solução e polimerização em emulsão. [00452] Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis ainda compreende um catalisador para polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, o sistema e composições ainda compreendem um iniciador de polimerização. A reação de polimerização pode também ser iniciada através de um vasto conjunto de iniciadores de polimerização diferentes ou sistemas de catalisador. O sistema iniciador ou catalisador utilizado será dependente as características desejadas dos polímeros contendo isopreno sendo sintetizada. Por exemplo, nos casos em que borracha cis-1,4-poliisopreno está sendo feito um Ziegler Natta sistema de catalisador que é composto de tetracloreto de titânio e alumínio trietila pode ser utilizado. Na síntese de outros tipos de polímeros de isopreno contendo outros tipos de sistemas iniciadores podem ser necessários. Por exemplo, os polímeros contendo isopreno podem ser produzidos usando iniciador de radical compatível, um iniciador de redox, um iniciador aniônico, ou um iniciador catiônico. Os preferidos sistemas catalíticos ou iniciadores irão também depender de se o isopreno está sendo homopolimerizado ou copolimerizado com monômeros adicionais. No caso de copolímeros o iniciador utilizado também vai depender se é desejável que o polímero
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161/343 seja feito possuindo uma distribuição randômica, não randômica, ou truncada das unidades de repetição que derivam dos monômeros particulares. Por exemplo, os iniciadores aniônicos ou iniciadores de radical livre controlado são tipicamente usados na síntese de copolímeros de bloco possuindo blocos isopreno.
[00453] É importante para o iniciador ou sistema catalítico empregado ser compatível com o tipo de sistema de polimerização utilizado. Por exemplo, em polimerizações em emulsão iniciadores radicais livres são normalmente utilizados. Em polimerizações de solução, iniciadores aniônicos, como compostos de alquil-lítio, são tipicamente utilizados para iniciar a polimerização. Uma vantagem de polimerização de radicais livres é que as reações geralmente podem ser realizadas sob condições menos rigorosas do que polimerizações iônicas. Sistemas de iniciação por radical livre também apresentam uma tolerância maior de impurezas traço.
[00454] Fórmulas de emulsões convencionais também podem ser empregadas em polimerização de isopreno, em conformidade com a presente invenção, no entanto, algumas restrições e modificações podem surgir a partir da inclusão de comonômeros adicionais, ou das restrições com respeito aos parâmetros de polimerização. Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis ainda compreende um tensoativo iônico. Tensoativos iônicos conhecidos na técnica incluem, detergentes sulfonatos e os sabões carboxilato, sulfato e fosfatos são úteis para esta invenção. O nível de tensoativo iônico é calculado com base no peso total dos componentes orgânicos e pode variar de cerca de 2 a 30 partes em peso de tensoativo iônico por 100 partes em peso de componentes orgânicos. [00455] Exemplos de iniciadores radicais livres que são úteis na prática da presente invenção são aqueles conhecidos como iniciadores
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162/343 redox, tais como combinações de quelatos de sais de ferro, sulfoxilato de formaldeído de sódio, e hidroperóxidos orgânicos. Representativos de hidroperóxidos orgânicos são hidroperóxido de cumeno, hidroperóxido paramentano, hidroperóxido de butila terciária (t-BPA) e iniciadores azo, tais como azobisisobutironitrila (AIBN), são os preferidos.
[00456] A temperatura de reação utilizada nas polimerizações radical livre é normalmente mantida na faixa de 0°C a 150°C. Temperaturas entre cerca de 20°C e 120°C são geralmente preferidas e temperaturas dentro da faixa de 60°C a 100°C são normalmente mais preferidas. A pressão de reação não é crítica. Ela é tipicamente apenas mantida alta o suficiente para manter as condições de reação da fase líquida; ela pode ser pressão autogênica, que irá variar dependendo dos componentes da mistura de reação e a temperatura, ou pode ser maior, por exemplo, até 69 bar (1000 psi).
[00457] Em algumas modalidades, o método para produzir um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreende polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis em um processo em lote. Em operações em lote, o tempo de polimerização pode ser variado conforme desejado a partir de apenas alguns minutos a até vários dias. Polimerização em processos em lotes pode ser finalizada quando o monômero não for mais absorvido, ou antes, se desejar, por exemplo, se a mistura de reação tornar-se muito viscosa. Em operações contínuas, a mistura de polimerização pode ser passada através de um reator ou uma série de reatores de qualquer projeto adequado. As reações de polimerização em tais casos são devidamente ajustadas pela variação do tempo de permanência no sistema de reator. Tempos de permanência variam de acordo com o tipo de sistema de reator e variam de 10 a 15 minutos a 24 horas ou mais. A concentração de monômero na mistura de reação pode variar para cima de 5 por cento
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163/343 em peso da mistura de reação, dependendo das condições empregadas, a faixa de 20-80 por cento em peso é a preferida.
[00458] Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno por polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis ainda compreende um solvente orgânico adequado. Em algumas modalidades, a polimerização do isopreno é realizada em um solvente orgânico, que é líquido nas condições de reação e que é relativamente inerte. O solvente pode ter o mesmo número de átomos de carbono por molécula como o reagente dieno ou pode ser em uma faixa diferente de ebulição. Solventes orgânicos preferidos são normalmente alcanos e cicloalcanos. Os solventes podem ser compostos de um ou mais compostos aromáticos, parafínicos ou cicloparafínicos. Estes solventes normalmente contêm de cerca de 4 átomos de carbono por mol a cerca de 10 átomos de carbono por molécula e será líquido sob as condições da polimerização. Alguns exemplos representativos de solventes orgânicos adequados incluem isooctano, pentano, cicloexano, metilcicloexano, isoexano, n-heptano, n-octano, n-hexano, benzeno, tolueno, xileno, etilbenzeno, dietilbenzeno, isobutilbenzeno, éter de petróleo, querosene, nafta de petróleo e assim por diante, isoladamente ou em mistura. Hidrocarbonetos aromáticos, como benzeno, tolueno, isopropilbenzeno, xileno, ou compostos halogenados aromáticos, como clorobenzeno, bromobenzeno, ou ortodiclorobenzeno, também podem ser empregados, mas não são preferidos na maioria dos casos. Outros solventes úteis incluem tetraidrofurano e dioxano.
[00459] Na polimerização em solução, haverá normalmente de 5 a 30 por cento em peso de monômeros do meio de polimerização. Tais meios de polimerização são naturalmente compostos de solvente orgânico e monômeros. Na maioria dos casos, será preferível ao meio de polimerização para conter de 10 a 25 por cento em peso de
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164/343 monômeros. É geralmente mais preferido o meio de polimerização conter de 15 a 20 por cento em peso de monômeros.
[00460] A polimerização é normalmente realizada para atingir uma conversão essencialmente completa de monômeros em polímeros. Adições incrementais de monômero, ou de um agente de transferência de cadeia, podem ser utilizadas a fim de evitar a formação de gel em excesso. Tais modificações menores estão dentro da habilidade do artesão. Após a polimerização estar concluída, o polímero é recuperado a partir de uma lama ou uma solução do polímero. A filtração simples pode ser adequada para separar o polímero do diluente. Outros meios para separar os polímeros do diluente podem ser empregados. O polímero pode ser tratado separadamente ou enquanto suspenso na mistura de reação, a fim de separar os resíduos. Esse tratamento pode ser com alcoóis como o metanol, etanol ou isopropanol, com alcoóis acidificados, ou com outros líquidos polares similares. Em muitos casos, os polímeros são obtidos em soluções de hidrocarbonetos e do polímero pode ser recuperado por coagulação com álcool acidificado, por exemplo, rapidamente agitado metanol ou isopropanol contendo 2% de ácido clorídrico. Em seguida dessa coagulação inicial, os polímeros podem ser lavados com um líquido apropriado, tal como o metanol.
[00461] Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis ainda compreende um ou mais monômeros adicionais. Como já foi observado anteriormente, o isopreno pode ser copolimerizado com um ou mais comonômeros adicionais para fazer copolímeros úteis. Alguns ajustes na receita de polimerização ou condições de reação podem ser necessários de modo a obter uma taxa satisfatória de formação de polímeros, dependendo da quantidade relativa de isopreno incluído e dos monômeros envolvidos. Exemplos de comonômeros que são úteis na prática desta invenção
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165/343 incluem monômeros de dienos, tais como 1,3-butadieno e hexadienos. Monômeros vinil aromáticos também podem ser copolimerizáveis com isopreno para fazer polímeros úteis. Tais monômeros vinil aromáticos incluem estireno, α-metilestireno, divinilbenzeno, cloreto de vinila, acetato de vinila, cloreto de vinilideno, metacrilato de metila, acrilato de etila, vinilpiridina, metacrilonitrila, ácido metacrílico, ácido itacônico e ácido acrílico. Misturas de diferentes comonômeros também podem ser empregadas em diferentes níveis.
[00462] Em algumas modalidades, o monômero de isopreno é copolimerizado com um ou mais adicionais monômeros diolefina conjugada. Aqueles contendo 4-8 átomos de carbono são geralmente preferidos para fins comerciais. Alguns exemplos representativos específicos de monômeros de diolefina conjugada, que podem ser copolimerizados com isopreno incluem 1,3-butadieno, 2,3-dimetil-1,3butadieno, piperilenos, 3-butil-1,3-octadieno, 2-fenil-1,3-butadieno, e assim por diante, isoladamente ou em mistura.
[00463] Em algumas modalidades, o monômero de isopreno é copolimerizado com um ou mais monômeros etilenicamente insaturados adicionais. Alguns exemplos representativos de monômeros etilenicamente insaturados que podem copolimerizados com isopreno incluem acrilatos de alquila, tal como acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de butila, metacrilato de metila e similares; monômeros de vinilideno com um ou mais grupos terminais CH2=CH; vinil aromáticos, tais como estireno, α-metilestireno, bromostireno, cloroestireno fluorestireno, e similares; α-olefinas tais como etileno, propileno, 1buteno e similares; haletos de vinila, como brometo de vinila, cloroeteno (cloreto de vinila), iodeto de vinila, fluoreto de vinila, 1,2 -dibromoetano, 1,1-dicloroetano (cloreto de vinilideno), 1,2-dicloroetano e similares; ésteres de vinil, tais como acetato de vinila; nitrilas α, β-olefinicamente insaturadas, tais como acrilonitrila e metacrilato, amidas α, βPetição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 170/355
166/343 olefinicamente insaturadas, tais como acrilamida, N-metacrilamida, N,Ndimetilacrilamida, metacrilamida, e semelhantes. Monômeros funcionalizados também podem, opcionalmente, serem copolimerizados com o isopreno na produção de polímeros elásticos úteis. Monômeros funcionalizados deste tipo e os métodos pelos quais eles podem ser incorporados em polímeros de borracha são descritos na Patente no U.S. 6.627.721 e Patente no U.S. 6.936.669. Os ensinamentos da Patente no U.S. 6.627.721 e Patente No U.S. 6.936.669 aqui se incorporam por referência com o objetivo de descrever tais monômeros funcionalizados e sua incorporação em polímeros contendo isopreno.
[00464] Polímeros elásticos que sejam copolímeros de um ou mais monômeros de dieno com um ou mais outros monômeros etilenicamente insaturados normalmente contêm de cerca de 50 por cento em peso a cerca de 99 por cento em peso de monômeros diolefina conjugada (incluindo isopreno) e de cerca de 1 por cento em peso a cerca de 50 por cento em peso de outros monômeros etilenicamente insaturados, além dos monômeros diolefina conjugada. Por exemplo, copolímeros elásticos de monômero de isopreno com monômeros vinilaromáticos, tais como borrachas de estireno-isopreno irão normalmente conter de 50-95 por cento em peso de isopreno e 5-50 por cento de peso de monômeros vinilaromáticos.
[00465] Monômeros vinil aromáticos são provavelmente o grupo mais importante dos monômeros etilenicamente insaturados os quais são comumente incorporados nas borrachas contendo isopreno. Tais monômeros vinil aromáticos contêm tipicamente de 8-20 átomos de carbono. Normalmente, o monômero vinil aromático conterá 8-14 átomos de carbono. O monômero aromático mais utilizado é o vinil estireno. Alguns exemplos de monômeros vinil aromáticos que podem ser utilizados incluem estireno, 1-vinilnaftaleno, 2-vinilnaftaleno, α
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167/343 metilestireno, 4 fenilstireno, 3-metilestireno e assim por diante.
[00466] Alguns exemplos representativos de polímeros contendo isopreno de borracha incluem borracha de homopolímero de cis-1,3poli-isopreno, borracha de 3,4-estireno-isopreno (SIR), borracha βmetilestireno-isopreno, estireno-isopreno-butadieno (SIBR), borracha de estireno-isopreno (SIR), borracha de isopreno-butadieno (IBR), borracha de α-metilestireno-isopreno-butadieno e borracha de αmetilestireno-estireno-isopreno-butadieno. Nos casos em que o polímero de borracha é composto por unidades de repetição que derivam de dois ou mais monômeros, as unidades de repetição que derivam de monômeros diferentes, incluindo o isopreno, será normalmente distribuída de uma forma essencialmente aleatória. As unidades de repetição que são derivadas de monômeros diferem do monômero pelo fato de que uma dupla ligação é normalmente consumida pela reação de polimerização.
[00467] Em algumas modalidades, o método para produzir um polímero de isopreno derivado de fontes renováveis compreende polimerização do isopreno derivados de recursos renováveis em um processo contínuo. O polímero de borracha pode ser produzido por polimerização em solução em um processo de lote ou em um processo contínuo que carrega continuamente o monômero de isopreno e opcionalmente monômeros adicionais em uma zona de polimerização. A zona de polimerização será tipicamente um reator de polimerização ou uma série de reatores de polimerização. A zona de polimerização irá fornecer normalmente agitação para manter os monômeros, polímeros, iniciador e modificador bem dispersos por todo o solvente orgânico da zona de polimerização. Tais polimerizações contínuas são tipicamente realizadas em um sistema de múltiplos reatores. O polímero elástico sintetizado é continuamente retirado da zona de polimerização. A conversão de monômero que se consegue na zona de polimerização
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168/343 será normalmente, pelo menos, de cerca de 85 por cento. É preferível para a conversão de monômero de seja de, pelo menos, 90 por cento. [00468] Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis ainda compreende um iniciador de polimerização e um modificador polar. A polimerização pode ser iniciada com um iniciador aniônico, como um composto de alquil-lítio. Os compostos de alquil-lítio que podem ser usados normalmente contêm de 1 a cerca de 8 átomos de carbono, tais como n-butil lítio. A quantidade do iniciador de lítio utilizado irá variar de acordo com o monômero que estiver sendo polimerizado e com o peso molecular que é desejado para o polímero que está sendo sintetizado. Todavia, como uma regra geral, 0,01-1 phm (partes por 100 partes em peso de monômero) do iniciador de lítio serão utilizados. Na maioria dos casos, 0,01-1 phm do iniciador de lítio serão utilizados com ele sendo preferível utilizar 0,025-0,07 phm do iniciador de lítio.
[00469] Tais polimerizações aniônicas são opcionalmente conduzida na presença de modificadores polares, tais como éteres alquiltetraidrofurfurila. Alguns exemplos representativos de determinados modificadores polares que podem ser usados incluem éter metiltetraidrofurfurila, éter etiltetraidrofurfurila, éter propiltetraidrofurfurila, éter butiltetraidrofurfurila, éter hexiltetraidrofurfurila, éter octiltetraidrofurfurila, éter dodeciltetraidrofurfurila, éter etílico, éter di-n-propil, éter diisopropilo, éter di-N-butil, tetraidrofurano, dioxano, éter etileno glicol dimetílico, éter etileno glicol etílico, éter dietileno glicol dimetílico, éter dietileno glicol etílico, éter dimetil trietilenoglicol, trimetilamina, trietilamina, N,N,N’,N’tetrametiletilenodiamina, N-metilmorfolina, N-etilmorfolina, ou Nfenilmorfolina.
[00470] O modificador polar será tipicamente empregado em um
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169/343 nível em que a razão molar do modificador polar relativamente ao iniciador de lítio está dentro da faixa de cerca de 0,01:1 a cerca de 5:1. A relação molar do modificador polar relativamente ao iniciador de lítio vai estar mais tipicamente dentro da faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 4:1. É geralmente preferido para a razão molar de modificador polar relativamente ao iniciador de lítio estar dentro da faixa de cerca de 0,25:1 a cerca de 3:1. É geralmente mais preferido para a razão molar de modificador polar relativamente ao iniciador de lítio estar dentro da faixa de cerca de 0,5:1 a cerca de 3:2.
[00471] A temperatura de polimerização utilizada em tais polimerizações aniônicas pode variar em uma ampla faixa de cerca de -20°C a cerca de 180°C. Na maioria dos casos, uma temperatura de polimerização dentro da faixa de cerca de 30°C a cerca de 125°C será utilizado. É tipicamente preferenciais para a temperatura de polimerização estar dentro da faixa de cerca de 45°C a cerca de 100°C. É tipicamente o mais preferido para a temperatura de polimerização estar dentro da faixa de cerca de 60°C a cerca de 90°C. A pressão utilizada será normalmente suficiente para manter uma fase líquida substancialmente nas condições da reação de polimerização.
[00472] Em algumas modalidades, o sistema e composições para a produção de um polímero de isopreno pela polimerização do isopreno derivado de fontes renováveis incluem ainda um finalizador de cadeia de polimerização, como um álcool, um agente de terminação, ou um agente de acoplamento. Tais polimerizações aniônicas de isopreno são normalmente realizadas por um período de tempo suficiente para permitir a polimerização substancialmente completa do isopreno e quaisquer monômeros adicionais que estejam presentes. Em outras palavras, a polimerização é realizada normalmente até altas conversões de pelo menos cerca de 85 por cento são atingidos. A polimerização é, então, normalmente terminada pela adição de um agente, como um
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170/343 álcool, um agente de terminação, ou um agente de acoplamento. Por exemplo, um haleto de estanho e/ou haleto de silício podem ser usados como um agente de acoplamento. A haleto de estanho e/ou o haleto de silício são continuamente adicionados nos casos em que o acoplamento assimétrico seja desejado. Esta adição contínua de um agente de acoplamento estanho e/ou do agente de acoplamento silício é normalmente feita em uma zona de reação separada da zona em que a maior parte da polimerização está ocorrendo. Os agentes de acoplamento normalmente serão adicionados em um vaso de reação em separado após o desejado grau de conversão tiver sido atingido. Os agentes de acoplamento podem ser adicionados em uma solução de hidrocarbonetos, por exemplo, em ciclohexano, à mistura de polimerização com a mistura adequada para a distribuição e reação. Em outras palavras, o acoplamento normalmente será adicionado apenas depois de um alto grau de conversão tiver sido atingido. Por exemplo, o agente de acoplamento normalmente será adicionado somente após uma conversão de monômero maior que cerca de 85 por cento tiver sido conseguida. Normalmente será preferido que a conversão de monômero alcance pelo menos cerca de 90 por cento antes do agente de acoplamento ser adicionado.
[00473] Os haletos de estanho usados como agentes de acoplamento serão normalmente tetraletos de estanho, como tetracloreto de estanho, tetrabrometo de estanho, tetrafluoreto de estanho ou tetraiodeto de estanho. No entanto, trialetos estanho também podem ser usados opcionalmente. Polímeros acoplados com trialetos de estanho podem ter um máximo de três braços. Isto naturalmente contrasta aos polímeros acoplados com os tetraletos de estanho que possuem um máximo de quatro braços. Para induzir um maior nível de ramificação, tetraletos de estanho são normalmente preferidos. Como regra geral, tetracloreto de estanho é o mais preferido.
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171/343 [00474] Os agentes de acoplamento de silício que pode ser usado normalmente será tetraletos de silício, como tetracloreto de silício, tetrabrometo silício, silício ou tetraiodeto tetrafluoreto de silício. No entanto, trialetos silício também pode ser usado opcionalmente. Polímeros de silício juntamente com trialetos ter um máximo de três braços. Isto é, claro, em contraste com polímeros juntamente com tetraletos silício, que têm um máximo de quatro braços. Para induzir um maior nível de ramificação, tetraletos silício são normalmente preferidos. Como regra geral, tetracloreto de silício é o mais preferido dos agentes de acoplamento de silício.
[00475] Uma combinação de haleto de estanho e haleto de silício pode ser opcionalmente utilizada para acoplar o polímero de borracha. Pelo uso de uma tal combinação de agentes de acoplamento estanho e silício, se pode obter aprimoradas propriedades para as borrachas de uso em pneumáticos, tais como mais baixa histerese. É particularmente desejável utilizar uma combinação de agentes de acoplamento estanho e silício em compostos de banda de rodagem para pneus que contêm ambos a sílica e o negro de fumo. Nesses casos, a razão molar do haleto de estanho relativamente ao haleto de silício empregada no acoplamento do polímero de borracha será normalmente dentro da faixa, de 20:80 às 95:5. A relação molar do haleto de estanho relativamente ao haleto de silício empregada no acoplamento do polímero de borracha estará mais tipicamente dentro da faixa de 40:60 a 90:10. A relação molar do haleto de estanho relativamente ao haleto de silício empregada no acoplamento do polímero de borracha estará preferencialmente dentro da faixa de 60:40 a 85:15. A relação molar do haleto de estanho relativamente ao haleto de silício empregada no acoplamento do polímero de borracha estará mais preferencialmente dentro da faixa de 65:35 a 80:20.
[00476] Em termos gerais e exemplificadores, uma faixa de cerca de
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0,01-4,5 miliequivalentes de agente de acoplamento de estanho (haleto de estanho e haleto de silício) é empregada por 100 gramas do polímero de borracha. É normalmente preferido utilizar cerca de 0,01 a cerca de
1,5 miliequivalentes do agente de acoplamento por 100 gramas de polímero para obter a desejada viscosidade Mooney. As quantidades maiores tendem a resultar em produção de polímeros contendo grupos terminais reativos ou acoplamento insuficiente. Um equivalente de agente de acoplamento de estanho por equivalente de lítio é considerado uma quantidade ideal para o máximo de ramificação. Por exemplo, se uma mistura de tetraleto de estanho e tetraleto de silício é usada como agente de acoplamento, um mol do agente de acoplamento seria utilizado por quatro moles de extremidades vivas de lítio. Nos casos em que uma mistura de trialeto de estanho e trialeto de silício é usada como agente de acoplamento, um mol do agente de acoplamento será otimamente ser utilizado para cada três moles de extremidades vivas de lítio. O agente de acoplamento pode ser adicionado em uma solução de hidrocarbonetos, por exemplo, em ciclohexano, à mistura de polimerização no reator com adequada mistura para a distribuição e reação.
[00477] Após o término do acoplamento, um quelante terciário alquil 1,2-etilenodiamina ou um sal metálico de um álcool cíclico podem ser opcionalmente adicionados ao cimento polimérico para estabilizar o polímero de borracha acoplado. Na maioria dos casos, de cerca de 0,01 phr (partes por peso por 100 partes em peso de borracha seca) a cerca de 2 phr do quelante alquil 1,2-etilenodiamina ou sal metálico do álcool cíclico serão acrescentados ao cimento polimérico para estabilizar o polímero de borracha. Tipicamente, a partir de cerca de 0,05 phr até cerca de 1 phr do quelante alquil 1,2-etilenodiamina ou sal metálico do álcool cíclico serão acrescentados. Mais tipicamente, de cerca de 0,1 phr de cerca de 0,6 phr de quelante alquil 1,2-etilenodiamina ou o sal
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173/343 metálico do álcool cíclico serão adicionadas ao cimento polimérico para estabilizar o polímero de borracha.
[00478] Os agentes de terminação que pode ser usado para interromper a polimerização e para finalizar o polímero de borracha biva incluem monoaletos de estanho, monoaletos de silício, N,N,N’,N’tetradialquildiamino-benzofenonas (como tetrametildiaminobenzofenona e similares), N, N-dialquilaminobenzaldeídos (como dimetilaminobenzaldeído e similares), 1,3-dialquil2-imidazolidinonas (tais como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona e similares), pirrilodinonas 1-alquil substituídas; pirrolidinonas 1-aril substituídas, dialquil-dicicloalquil-carbodiimidas contendo de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono, e dicicloalquil-carbodiimidas contendo de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono.
[00479] Após a etapa de encerramento e, opcionalmente, a etapa de estabilização, tiver sido concluída, o polímero de borracha pode ser recuperado a partir do solvente orgânico. O polímero de borracha acoplado pode ser recuperado do solvente e resíduos orgânicos, por meio de coagulação química (álcool), dessolventização térmica, ou método adequado. Por exemplo, muitas vezes é desejável precipitar o polímero de borracha do solvente orgânico por meio da adição de alcoóis inferiores contendo de cerca de 1 a cerca de 4 átomos de carbono para a solução de polímero. Adequados alcoóis inferiores para precipitação da borracha a partir do cimento polimérico incluem metanol, etanol, álcool isopropílico, álcool n-propílico, e álcool t-butílico. A utilização de alcoóis inferiores para precipitar o polímero de borracha do cimento polimérico também finaliza qualquer polímero vivo pela inativação dos grupos terminais de lítio restantes. Após o polímero de borracha acoplado ser recuperado da solução, de vapor de extração pode ser empregada para reduzir o nível de compostos orgânicos voláteis no polímero acoplado de borracha. Além disso, o solvente
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174/343 orgânico pode ser removido do polímero de borracha por secagem em tambor, secagem em extrusora, secagem a vácuo, e assim por diante. [00480] Como já foi explicado, borracha sintética de cis-1,3-poliisopreno que é semelhante o suficiente para permitir a livre substituição com a borracha natural pode ser produzida pela polimerização em solução do isopreno com um sistema de catalisador Ziegler Natta que é composto de tetracloreto de titânio (TiCl4) e um composto organoalumínio, como trietil-alumínio, Al-(CH2-CH3)3. A borracha de poliisopreno que é produzida com esse sistema catalisador Ziegler Natta tem um alto teor de microestrutura cis- de até 98 por cento que se assemelha muito proximamente com aquele da borracha natural da Hevea Brasiliensis (a árvore da borracha comum; seringueira), que tem um conteúdo de microestrutura cis- de praticamente 100 por cento. No entanto, essa pequena diferença na microestrutura resulta das propriedades físicas que são inferiores àquelas da borracha natural em certos aspectos. Por exemplo, a borracha natural normalmente exibe resistência em verde que é superior àquela da borracha sintética cis-
1,4-poli-isopreno. Por outro lado, em certos outros aspectos, a borracha sintética cis-1,4-poli-isopreno é superior à borracha natural derivada da Hevea Brasiliensis, guaiúle, e Taraxacum kok-Saghyz (dandelion russo). Por exemplo, a borracha natural contém residuais de proteínas, sabões, resinas, e açúcares, já que vêm das plantas. A presença dessas impurezas residuais pode ser extremamente prejudicial em algumas aplicações. Por exemplo, a presença de proteínas residuais em produtos de borracha pode causar graves reações alérgicas em algumas pessoas e se constitui numa grande preocupação para os fabricantes de alguns produtos contendo borracha, tais como luvas de borracha, preservativos, êmbolos de seringa, e assim por diante. Em qualquer caso, as borrachas sintéticas poli-isopreno homopolímero desta invenção que são livres de proteínas, sabões, resinas, e açúcares
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175/343 presentes na borracha natural, incluindo borracha natural da Hevea Brasiliensis.
[00481] A Patente N° U.S. 3931.136 divulga um processo para a produção de cis-1,4-poli-isopreno de alto peso molecular. O catalisador utilizado neste processo é uma mistura de três componentes de (A) um tetracloreto de titânio, (B) um composto organo-alumínio da fórmula AIR3, em que cada R representa um grupo alquila, de preferência um grupo alquila contendo 1-8 átomos de carbono, um grupo arila, de preferência um grupo fenila, ou um grupo cicloalquila, de preferência um grupo cicloexila, e (C) uma beta-dicetona da fórmula:
O O
R—c—ch2—c—r onde R’ e R podem ser iguais ou diferentes e representam um grupo alquila ou um grupo arila. R' e R de preferência representam um grupo alquila contendo 1-5 átomos de carbono ou um grupo fenila. Os ensinamentos da Patente n° U.S. 3.931.136 aqui se incorporam por referência com 0 propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usadas na síntese de cis-1,4poli-isopreno.
[00482] Uma técnica de polimerização de solução para a síntese de cis-1,4-poli-isopreno com um sistema catalisador que é composto de uma mistura de tetracloreto de titânio e um composto trialquilalumínio é divulgado pela Patente n° U.S. 4430487. Neste processo a polimerização é abreviada com 4,7-diaza-decano-1,10-diamina. Os ensinamentos da Patente n° U.S. 4.430.487 são aqui incorporados por referência com 0 propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de cis-1,4poli-isopreno.
[00483] A síntese de cis-1,4-poli-isopreno pela polimerização de
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176/343 isopreno com um sistema catalisador que é composto de um tetraleto de titânio, um composto trialquilalumínio e éter difenílico pode resultar na formação indesejada de gel. A Patente no U.S. 5919876 revela que a formação de gel pode ser reduzida através da realização de tais polimerizações na presença de uma diarilamina, tais como difenilamina para-estirenada. A Patente no U.S. 5.919.876, mais especificamente revela um processo para a síntese de cis-1,4-poli-isopreno com um baixo teor de gel que compreende a polimerização de isopreno em um solvente orgânico inerte com um sistema de catalisador pré-formado que é feito pela reação de um composto organo-alumínio com tetraleto de titânio, tais como tetracloreto de titânio, na presença de pelo menos um éter, em que a referida polimerização é conduzida a uma temperatura que está dentro da faixa de cerca de 0°C a cerca de 100°C, e em que a referida polimerização é conduzida na presença de uma diarilamina. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.919.867 são aqui incorporados por referência com o propósito de ensinar sistemas catalisadores e técnicas de polimerização de solução que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4-poli-isopreno.
[00484] Cis-1,4-poli-isopreno pode ser feito por vapor de polimerização de fase utilizando um catalisador de pré-formada que é feito pela reação de um composto organo-alumínio com tetracloreto de titânio. A Patente no U.S. 6066705 divulga um método para a fase vapor polimerização de isopreno na cis-1,4-poli-isopreno em um processo compreendendo as etapas de: (1) carregar em uma zona de reação, o referido isopreno e um sistema de catalisador pré-formada que é feito pela reação de um composto organo-alumínio com tetracloreto de titânio, de preferência na presença de pelo menos um éter; em que o isopreno é mantido na fase de vapor na referida zona de reação por uma combinação adequada de temperatura e pressão, (2) deixar o referido isopreno para polimerizar em cis-1,4-poli-isopreno a uma
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177/343 temperatura dentro da faixa de cerca de 35°C a cerca de 70°C, e (3) a retirada disse cis-1,4-poli-isopreno da referida zona de reação. Foi determinado que a formação de gel pode ser reduzida em tais polimerizações de fase vapor, realizando a polimerização do monômero de isopreno na presença de uma diarilamina, tais como difenilamina para-estirenada. Os ensinamentos da Patente no U.S. 6.066.705 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização de fase vapor que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4-poli-isopreno.
[00485] A borracha de poli-isopreno que é clara (transparente) e de alta pureza pode ser sintetizada utilizando um sistema de catalisador de neodímio. A Patente no U.S. 6.780.948 refere-se a tal processo para a síntese de borracha de poli-isopreno, que compreende polimerizar monômero de isopreno na presença de um catalisador de neodímio, em que o sistema de catalisador de neodímio é preparado por (1) reação de um carboxilato de neodímio com um composto organo-alumínio na presença de isopreno por um período de cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos para produzir alumínio de neodímio-componente catalisador, e (2) subsequentemente reação do componente catalisador de neodímio-alumínio com um cloreto de alumínio dialquil por um período de pelo menos 30 minutos para produzir o sistema de catalisador de neodímio. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.919.867 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de borracha de cis-1,4-poli-isopreno, que é de alta pureza.
[00486] A Patente no U.S. 7.091.150 e Patente no U.S. 7.199.201 divulgam o uso de um sistema de catalisador de neodímio para polimerizar monômero de isopreno em borracha sintética de poliisopreno tendo um alto teor extremamente alto de microestrutura cis- e alta regularidade estéreo. Esta borracha de poli-isopreno irá se
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178/343 cristalizar sob pressão e pode ser agravada em formulações de borracha de uma forma semelhante à borracha natural. Esta técnica, mais especificamente revela um processo para a síntese de borracha de poli-isopreno, que compreende polimerizar monômero de isopreno na presença de um catalisador de neodímio, em que o sistema de catalisador de neodímio é preparado por um processo que compreende (1) reação de um carboxilato de neodímio com um composto organoalumínio em um solvente orgânico para produzir o componente catalisador de neodímio-alumínio, e (2) em seguida reagir o componente catalisador de neodímio-alumínio com um halogênio elementar para produzir o sistema de catalisador de neodímio. Ao praticar este processo, o sistema de catalisador de neodímio é tipicamente nulo de compostos contendo níquel.
[00487] A borracha sintética de poli-isopreno feita por este processo é composta de unidades de repetição que derivam de isopreno, em que a borracha sintética de poli-isopreno tem um teor de microestrutura cisque está dentro da faixa de 98,0% a 99,5%, um teor de microestrutura
3,4- que está dentro da faixa de 0,5% a 2,0%, e um teor de microestrutura trans- que está dentro da faixa de 0,0% a 0,5%. Os ensinamentos da Patente no U.S. 7.091.150 e patentes dos Estados Unidos 7.199.201 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas catalisadores neodímio e técnicas de polimerização que podem ser usadas na síntese de borracha de cis-1,4-poli-isopreno de teor extremamente alto de microestrutura cis- e alta regularidade estérea.
[00488] Catalisadores lantanídeos de um só componente, tal como diiodetos de lantanídeos, podem ser também usados na síntese de poliisopreno possuindo teor extremamente alto de microestrutura cis-. Por exemplo, diiodeto de túlio, diiodeto de disprósio e diiodeto de neodímio podem iniciar a polimerização de isopreno na forma de borracha de alto
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179/343 teor de cis-1,4-poli-isopreno sem necessidade de nenhum componente catalisador adicional. Diiodetos de lantanídeos podem ser, por conseguinte, usados para iniciar a polimerização do monômero de isopreno na forma de alto teor de cis-1,4-isopreno sob condições de polimerização de solução.
[00489] A Patente No U.S. 4.894.425 revela um processo para a síntese de poli-isopreno que podem possuir grupos funcionais e que contém mais de 70 por cento de unidades estruturais 1,2- e 3,4-. Este processo envolve a polimerização aniônica de isopreno em um hidrocarboneto inerte solvente, na presença de um composto organolítio como catalisador e um éter como o co-catalisador, em que o cocatalisador usado é um éter dialquil etileno glicol da fórmula R1-O-CH2CH2-O-R2 em que R1 e R2 são grupos alquila com números diferentes de átomos de carbono, selecionados do grupo que consiste em metila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, iso-butila, sec-butila e ter-butila, e em que a soma dos átomos de carbono nos dois grupos alquila R1 e R2 está dentro da faixa de 5-7. Os ensinamentos da Patente no U.S. 4.894.425 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poli-isopreno possuindo um alto teor de microestrutura 1,2- e
3,4-.
[00490] O 3,4-poli-isopreno cristalizável pode ser sintetizado em solventes orgânicos para produção quantitativa depois de curtos tempos de polimerização, utilizando os sistemas de catalisadores descritos pela Patente no U.S. 5.082.906. O 3,4-poli-isopreno feito utilizando este sistema catalítico é cristalizável por cepas e pode ser empregado em bandas de rodagem que proporcionam melhor tração e maior resistência ao avanço de cortes. A Patente no U.S. 5.082.906 revela especificamente um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno, que compreende polimerizar monômero de isopreno em um solvente
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180/343 orgânico a uma temperatura que está dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C na presença de um catalisador que é composto de (a) um composto organo-ferro, (b) um composto organo-alumínio, (c) um quelante amina aromática, e (d) um composto protônico; em que a razão molar do quelante amina relativamente ao composto organo-ferro está dentro da faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 1:1, em que a razão molar do composto organo-alumínio relativamente ao composto organo-ferro está dentro da faixa de cerca de 5:1 a cerca de 200:1, e em que a razão molar do composto protônico relativamente ao composto organoalumínio está dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2:1. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.082.906 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poliisopreno com um alto teor de microestrutura 3,4- e que é cristalizável por cepas.
[00491] A Patente No U.S. 5.356.997 também se refere a um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno cristalizável por cepas. Este 3,4-poli-isopreno tem um teor de microestrutura 3,4-, que está dentro da faixa de cerca de 65% a cerca de 85%, um teor de microestrutura cis-1,4-, que está dentro da faixa de cerca de 15% a cerca de 35% e, essencialmente, sem microestrutura trans-1,4- ou microestrutura 1,2-. Ele pode ser sintetizado em solventes orgânicos para produção quantitativa depois de tempos de polimerização curtos. A Patente no U.S. 5.356.997 especificamente revela um processo para a síntese de 3,4-poli-isopreno, que compreende polimerizar monômero de isopreno em um solvente orgânico a uma temperatura que está dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C na presença de um catalisador que é composto de (a) um composto organo-ferro que é solúvel no solvente orgânico, em que o ferro no composto organo-ferro está no estado de oxidação +3, (b) um composto organo-alumínio
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181/343 parcialmente hidrolisado, que foi preparado pela adição de um composto selecionado a partir do grupo protônico que consiste em água, alcoóis e ácidos carboxílicos ao composto organo-alumínio e (c) um quelante amina aromática; em que a razão molar do quelante amina relativamente ao composto organo-ferro está dentro da faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 1:1, em que a razão molar do composto organoalumínio relativamente ao composto organo-ferro está dentro da faixa de cerca de 5:1 a cerca de 200:1, e em que a razão molar do composto protônico relativamente ao composto organo-alumínio está dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2:1. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.356.997 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de poli-isopreno com um alto teor de microestrutura 3,4- e que é cristalizável por cepas.
[00492] A Patente No U.S. 5.677.402 revela um processo para preparar borracha de 3,4-poli-isopreno que compreende polimerizar monômero de isopreno com um iniciador organolítio a uma temperatura que está dentro da faixa de cerca de 30°C a cerca de 100°C na presença de um alcóxido de sódio e um modificador polar, em que a razão molar do alcóxido de sódio relativamente ao iniciador organolítio está dentro da faixa de cerca de 0.05:1 a cerca de 3:01, e em que a razão molar do modificador polar relativamente ao iniciador organolítio está dentro da faixa de cerca de 0,25:1 a cerca de 5:1. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.677.402 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar sistemas de catalisadores e técnicas de polimerização que podem ser usados na síntese de 3,4-poli-isopreno.
[00493] A Patente no U.S. 7.351.768 divulga a síntese do poliisopreno líquido com um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 5.000 a 100.000 e preferencialmente na faixa de 20.000 a 80.000. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.677.402 aqui
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182/343 se incorporam por referência com a finalidade ilustrar a síntese de poliisopreno líquido.
[00494] A Patente no U.S. 6.576.728 divulga um processo para a copolimerização de estireno e isopreno para produzir borracha de baixo teor vinil estireno-isopreno possuindo uma distribuição randômica de unidades de repetição que são derivadas de estireno. Os sistemas iniciadores empregados nestas polimerizações são compostos de (a) um iniciador de lítio e (b) um membro selecionado do grupo consistindo em (1) um alcóxido de sódio, (2) um sal sódico de um ácido sulfônico, e (3) um sal sódico de um éter de glicol. É importante para o sistema iniciador utilizado nestas polimerizações ser livre de modificadores polares, tais como bases de Lewis. Os ensinamentos da Patente no U.S. 6.576.728 aqui se incorporam por referência com a finalidade de ilustrar a síntese da borracha estireno-isopreno.
[00495] A Patente no U.S. 6.313.216 divulga um processo para sintetizar aleatória de estireno-isopreno de borracha compreendendo: (1) carregar continuamente isopreno, estireno, um iniciador, e um solvente em uma primeira zona de polimerização, (2) deixar o isopreno e estireno copolimerizar na primeira zona de polimerização até conversão total de 60 a 95 por cento para a produção de um cimento polimérico contendo correntes de estireno-isopreno vivos, (3) carregar continuamente o cimento polimérico contendo correntes de estirenoisopreno vivos e monômero de isopreno adicionais em uma segunda zona de polimerização, em que 5 a 40 por cento do montante total do isopreno alterado é carregado na segunda zona de polimerização (4), deixar a copolimerização continuar na segunda zona de polimerização até uma conversão do monômero de isopreno de pelo menos 90 por cento em que a conversão total de estireno e isopreno na segunda zona de polimerização fica limitada a um máximo de 98 por cento, (5) retirar um cimento polimérico de borracha estireno-isopreno randômica
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183/343 possuindo extremidades vivas de cadeia provenientes da segunda zona de reação (6), matar as extremidades vivas de cadeia na borracha estireno-isopreno randômica, e (7) recuperar a borracha estirenoisopreno randômica do cimento polimérico em que as copolimerizações na primeira zona de polimerização e na segunda zona de polimerização são realizadas a uma temperatura que está dentro da faixa de 70°C a 100°C, e em que a quantidade de estireno carregada na primeira zona de polimerização é pelo menos 2 por cento a mais do que a quantidade total de estireno ligados na borracha. Os ensinamentos da Patente no U.S. 6.313.216 aqui se incorporam por referência com a finalidade ilustrar a síntese da borracha estireno-isopreno.
[00496] Copolímeros de isopreno-butadieno com alto conteúdo vinílico podem ser sintetizados em solventes orgânicos até altos rendimentos após curtos tempos de polimerização mediante utilizar o processo divulgado na Patente no U.S. 5061765. Os copolímeros de isopreno-butadieno produzidos utilizando este processo tem uma temperatura de transição vítrea que está dentro da faixa de cerca de 0°C a cerca de -60°C e podem ser empregados em bandas de rodagem que proporcionam melhor tração e maior resistência ao avanço de cortes. A Patente no U.S. 5.061.765, mais especificamente revela um processo para a síntese de copolímeros de isopreno-butadieno com um alto teor vinílico, que compreende a copolimerização de monômero de isopreno e monômero de butadieno em um solvente orgânico a uma temperatura que está dentro da faixa de cerca de -10°C a cerca de 100°C em a presença de um catalisador que é composto de (a) um composto organo-ferro, (b) um composto organo-alumínio, (c) um quelante amina aromática, e (d) um composto protônico; em que a razão molar do quelante amina relativamente ao composto organo-ferro está dentro da faixa de cerca de 0,1:1 a cerca de 1:1, em que a razão molar do composto organo-alumínio relativamente ao composto organo-ferro
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184/343 está dentro da faixa de cerca de 5:1 a cerca de 200:1, e em que a razão molar de o composto protônico relativamente ao composto organoalumínio está dentro da faixa de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,2:1. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.061.765 aqui se incorporam por referência com a finalidade ilustrar a síntese de isopreno-butadieno. [00497] Uma técnica para a síntese de terpolímeros de borracha de estireno, isopreno e butadieno é divulgada na Patente no U.S. 5.137.998. Estes terpolímeros elásticos apresentam uma excelente combinação de propriedades para utilização em compostos de uso em bandas de rodagem de pneus. Ao utilizar tais terpolímeros em bandas de rodagem, podem ser construídos pneus possuindo melhoradas resistências à derrapagem em piso molhado, sem sacrificar as características de resistência ao rolamento ou de desgaste da banda de rodagem. A Patente no U.S. 5.137.998, mais especificamente revela um processo para a preparação de um terpolímero de borracha de isopreno, estireno e butadieno possuindo múltiplas temperaturas de transição vítrea e possuindo excelente combinação de propriedades para uso na fabricação de bandas de rodagem que compreende: terpolimerização de estireno, isopreno e 1,3-butadieno em um solvente orgânico, a uma temperatura não superior a cerca de 40°C na presença de (a) pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo em óxido de tripiperidino fosfina e alcóxidos de metais alcalinos e (b) um composto organolítio. Os ensinamentos da Patente No U.S. 5.137.998 aqui se incorporam por referência com a finalidade ilustrar a síntese de borracha estireno-isopreno-butadieno.
[00498] Uma borracha de isopreno-butadieno líquida (IBR), que é particularmente valiosa para uso na fabricação de bandas de rodagem para pneus de alta performance de uso automotivo, incluindo pneus de corrida, que apresentam características superiores de tração a seco e durabilidade, pode ser feita pelo processo divulgado na Patente No U.S.
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6.562.895. Esta borracha de isopreno-butadieno é um líquido à temperatura ambiente e é composta de unidades de repetição que derivam de cerca de 5 por cento em peso a cerca de 95 por cento em peso de isopreno e de cerca de 5 por cento em peso a cerca de 95 por cento em peso de 1,3-butadieno, em que as unidades de repetição derivadas de isopreno e 1,3-butadieno estão em ordem essencialmente aleatória. Esta IBR também tem um baixo peso molecular ponderal médio o qual está dentro da faixa de cerca de 3.000 a cerca de 50.000 e tem uma temperatura de transição vítrea que está dentro da faixa de cerca de -50°C a cerca de 20°C.
[00499] Esses copolímeros de isopreno-butadieno são sintetizados utilizando um iniciador organolítio e um modificador polar. O nível de iniciador organolítio empregado será dependente do peso molecular que é desejado para o polímero líquido de isopreno-butadieno que está sendo sintetizado. Como regra geral, em todas as polimerizações aniônicas o peso molecular do polímero produzido é inversamente proporcional à quantidade de iniciador utilizada. Uma vez que o polímero líquido de isopreno-butadieno com um peso molecular relativamente baixo esteja sendo sintetizado, a quantidade de iniciador utilizada será relativamente grande. Como regra geral, de cerca de 0,1 a cerca de 2 phm (partes por cem partes de monômero em peso) do composto organolítio será empregado. Na maioria dos casos, será preferível utilizar a partir de cerca de 0,2 a cerca de 1 phm do composto organolítio com ele sendo o mais preferido utilizar a partir de cerca de 0,4 phm a 0,6 phm do composto organolítio. Em qualquer caso, uma quantidade de iniciador organolítio será selecionada para resultar na produção de polímero líquido de isopreno-butadieno tendo um peso molecular ponderal médio, que está dentro da faixa de cerca de 3.000 a cerca de 50.000.
[00500] A quantidade de iniciador organolítio será preferencialmente
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186/343 selecionada para resultar na produção de polímero líquido de isoprenobutadieno tendo um peso molecular ponderal médio, que está dentro da faixa de cerca de 5.000 a cerca de 30.000. A quantidade de iniciador organolítio vai mais preferivelmente ser selecionada para resultar na produção de polímero líquido de isopreno-butadieno tendo um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de cerca de 8.000 a cerca de 18.000. Em qualquer caso, é fundamental realizar a copolimerização do 1,3-butadieno e estireno, na presença de um modificador polar, tal como N,N,N’,N’tetrametiletilenodiamina (TMEDA), para atingir um alta temperatura de transição vítrea que está dentro da faixa de cerca de -50°C a 20° C. Os ensinamentos da Patente No U.S. 6.562.895 aqui se incorporam por referência com a finalidade ilustrar a síntese de polímeros líquidos de isopreno-butadieno.
[00501] Copolímeros de bloco contendo um bloco de poli-isopreno podem ser produzidos através do processo descrito na Patente no U.S. 5.242.984. Por exemplo, polímeros dibloco lineares de estireno e isopreno (copolímeros de bloco S-I) e polímeros tribloco lineares de estireno e isopreno (polímeros tribloco S-I-S) podem ser produzidos por este processo. Nesta técnica, os monômeros são polimerizados seqüencialmente por polimerização aniônica em um solvente orgânico inerte. Normalmente, um composto organo-metal alcalino, tal como um composto alquil-lítio, é usado para iniciar a polimerização, que pode ser conduzida sobre uma ampla faixa de temperaturas.
[00502] Métodos de controlar o peso molecular dos blocos e do polímero geral são descritos na Patente no U.S. 3.149.182 e Patente No U.S. 3.231.635 que afirmam que a quantidade de monômero pode ser mantida constante e diferentes pesos moleculares podem ser alcançados mediante alterar a quantidade de catalisador ou que a quantidade de catalisador pode ser mantida constante e diferentes pesos moleculares podem ser conseguidos através da variação da
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187/343 quantidade do monômero. Após a polimerização sequencial, o produto é finalizado, como pela adição de um agente prótico de terminação, por exemplo, água, álcool ou outros reagentes ou com hidrogênio, com a finalidade de remover o lítio radical formando o núcleo para o produto de polímero condensado. O bloco de produto polímero é então recuperado, como por coagulação, utilizando água quente ou vapor, ou ambos. Os ensinamentos da Patente no U.S. 5.242.984, Patente no U.S. 3.149.182, e Patente no U.S. 3.231.635 aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar métodos para a síntese de copolímeros de bloco e polímeros S-I tribloco S-I-S.
Caracterização do Carbono [00503] Todos os tipos de polímeros feitos com o isopreno desta invenção são verificáveis como sendo feitos com isopreno que não foi originado de uma fonte petroquímica. Além disso, os polímeros contendo isopreno desta invenção também podem ser distinguidos de polímeros contendo isopreno que vêm de fontes naturais, como a borracha natural. Assim, os polímeros contendo isopreno desta invenção são analiticamente verificáveis como provenientes de fontes de bio-renováveis, ambientalmente amigáveis, delineadas neste documento.
[00504] Polímeros derivados do bioisopreno podem ser distinguidos dos polímeros derivados de carbono de origem petroquímica com base na caracterização duplo carbono-isotópica. Além disso, a fonte biológica específica de carbono (por exemplo, glicose x glicerol) pode ser determinada por impressão digital dupla carbono-isotópica (ver, patente número U.S. 7.169.588, que encontra-se aqui incorporada por referência).
[00505] Este método útil distingue quimicamente materiais idênticos, e distribui de carbono em produtos por fonte (e possivelmente anos) de crescimento do componente (planta) da biosfera. Os isótopos, 14C e 13C,
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188/343 trazem informações complementares a este problema. A datação isotópica por radiocarbono (14C), com sua meia-vida nuclear de 5.730 anos, claramente permite o aporte entre espécimes de carbono de matérias primas fósseis (morta) e da biosfera (viva) [Currie, L. A. Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and Η. P. van Leeuwen, Editores, 1 do Vol. I em IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) (1992) 3 74]. O pressuposto básico da datação por radiocarbono é que a constância da concentração de 14C na atmosfera leva à constância de 14C nos organismos vivos. Quando se tratar de uma amostra isolada, a idade de uma amostra pode ser deduzida aproximadamente pela relação: t = (-5730/0.693)ln(A AO /), em que t = idade, 5.730 anos é a meia-vida de radiocarbono, e A e AO é a atividade específica 14C da amostra e do padrão de modem, respectivamente [Hsieh, Y., Soil Sei. Soc. Am J., 56, 460, (1992)]. No entanto, por causa de testes nucleares na atmosfera desde 1950 e da queima de combustíveis fósseis desde 1850, 14C adquiriu uma segunda característica de tempos geoquímicos. Sua concentração no CO2 atmosférico - e, portanto, na biosfera viva aproximadamente dobrou no pico dos testes nucleares, em meados dos anos 1960. Desde então, a taxa de isotopes foi aos poucos voltando ao estado de equilíbrio cosmogênico (atmosférica) basal (14C/12C) de ca. 1.2x10-12, com um valor aproximado de meia-vida de relaxamento de 7 a 10 anos. (Esta última meia-vida não deve ser tomada literalmente; preferentemente, se deve utilizar a função de entrada/decaimento nuclear atmosférico detalhado para traçar a variação do 14C na atmosfera e na biosfera desde 0 início da era nuclear). É esta última característica do tempo de biosfera 14C característica que mantém a promessa da datação anual do carbono biosférico recente. 14C pode ser medido por acelerador de espectrometria de massa (AMS), com resultados apresentados em
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189/343 unidades de fração de modem de carbono (Fm). Fm é definido pelo National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B and 4990C, conhecidos como padrões ácido oxálico HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental refere-se a 0,95 vezes a razão isotópica 14C/12C HOxI (com referência a AD 1950). Isto é aproximadamente equivalente ao decaimento corrigido da madeira antes da revolução industrial. Para a presente biosfera vivente (material vegetal), fM ~ 1.1.
[00506] A proporção de isótopos estáveis de carbono (13C/12C) fornece uma rota complementar à discriminação e à repartição de origem. A relação de isótopos carbono 13C e 12C pode ser usada para identificar ou regrar as potenciais origens para muitas amostras contendo carbono. Este método funciona bem porque: (1) ambos os isótopos são estáveis em períodos de tempo geológico, (2) a proporção de 13C relativamente a 12C podem ser medidos com grande precisão usando combinações de análise de combustão, cromatografia gasosa e espectrometria de massa de razão isotópica, (3 ) as relações 13C/12C para muitos materiais naturais ocorrem dentro de estreitas faixas característica desses materiais, e (4) relações razões para 13C/12C muitos materiais se alteram de modos previsíveis à medida que esses materiais experimentam reações químicas.
[00507] Estudos envolvendo relações 13C/12C em ou perto de níveis de abundância natural geralmente relatam dados isotópicos como valores delta, que são representados pelo símbolo de ô13C e dado em partes por mil (%) em relação a uma amostra de referência padrão. Para o carbono, a amostra de referência normalmente é Pee Dee Belemite, que tem uma abundância natural 13C de 1,112328% e é atribuído δ 13C 0,00 %. A fórmula que correlaciona a proporção 13C/12C aos valores delta é:
[00508] δ13Ο (em %o) versus padrão = [(Ramostra - Rpadrão)/Rpadrão]
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190/343 (1000), em que Ramostra é a relação 13C/12C da amostra e Rpadrão θ a relação de Pee Dee Belemite.
[00509] Embora os isótopos de carbono (ou seja, 13C e 12C) participem dos mesmos processos físicos e mesmas reações químicas, a diferença de massa leve entre 13C e 12C pode ser manifestada em diferenças muito pequenas nas taxas para muitas reações e processos. Isto leva a pequenas diferenças entre as proporções 13C/12C para amostras submetidas a reações químicas ou processos físicos. Por exemplo, os processos físicos, tais como evaporação ou difusão discriminam isótopos mais pesados e, normalmente, levam ao ligeiro enriquecimento do isótopo pesado na amostra original, como a evaporação do isótopo mais leve ou difunde de distância mais rapidamente. A relação 13C/12C, portanto, aumenta ligeiramente enquanto a evaporação ou a difusão ocorre. Para as reações químicas, incluindo reações enzimáticas, a situação é mais complexa, mas há muitas vezes é uma ligeira discriminação de um isótopo em detrimento de outro, que pode ser detectada através da medição das relações 13C/12C ou valores δ 13C. Por exemplo, o CO2 atmosférico pode ser convertido em matéria vegetal através de dois mecanismos muito diferentes para a fotossíntese: a via Calvin-Benson, que ocorre em plantas C3, e a via Hatch-Slack, que ocorre em plantas C4. Esses dois mecanismos são suficientemente diferentes para produzir uma diferença mensurável em δ 13C do mesmo CO2. Para plantas C4, δ 13C geralmente varia de -9 a -17 %o, com uma média perto de -13 %o. Para as plantas C3, δ 13C normalmente varia de -20 %o e -32 %o, com uma média perto de -27 %o. Pelo fato desses intervalos serem tão diferentes e os valores δ 13C poderem ser medidos rotineiramente dentro 0,02 %o, é relativamente fácil distinguir entre resíduos vegetais provenientes de plantas C3 versus C4. Isto tem múltiplas aplicações em arqueologia e outras áreas em que a análise de carbono contendo resíduos de
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191/343 cozimento ou restos do esqueleto podem ser usados para acompanhar a evolução, as atividades e dietas de humanos e outros animais. [00510] Mais recentemente, valores ô13C foram utilizados para detectar fraude econômica, especialmente a adulteração de alimentos por outros materiais - incluindo os potencialmente prejudiciais derivados sintéticos de petroquímicos. Por exemplo, óleo de milho (milho) é considerado um óleo vegetal Premium e há uma tentação para os produtores inescrupulosos para diluir óleo de milho com óleos mais baratos. Felizmente, óleo de milho é derivado de uma planta C4, enquanto a maioria das alternativas mais baratas são derivados de plantas ou animais C3. O ô13C para o óleo de milho autêntica é, portanto, de -13,7 V a -16,4 V em comparação a -25 V a -32 %o, para as alternativas. Qualquer diluição significativa de óleo de milho por uma alternativa mais barata pode ser detectada através da medição de δ 13C. Da mesma forma, a adição de açúcar de cana (um produto da fotossíntese C4) para sucos de frutas, vinhos, licores e mel (todos os produtos da fotossíntese C3) pode ser detectada através da medição de valores δ 13C. É possível até mesmo detectar a adulteração de sabores naturais por análogos sintéticos e do uso de suplementos ilegais hormônio sintético através dos valores δ 13C.
[00511] A presente invenção utiliza a capacidade de medir com precisão valores δ 13C, a fim de produzir polímeros isoprênicos isotopicamente únicos que possam ser facilmente diferençados dos polímeros derivados de suprimentos de base petróleo. A presente invenção também utiliza a capacidade de medir com precisão os valores δ 13C, a fim de produzir novos polímeros isoprênicos isotopicamente únicos que possam ser facilmente diferençados da borracha natural. Uma característica importante da presente invenção é que ela fornece novos polímeros com uma ampla variedade de valores δ 13C que podem ser adaptados e posteriormente verificados quanto às suas
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192/343 autenticidades. Conforme descrito anteriormente, estes novos polímeros satisfazer uma necessidade crescente dos clientes por produtos que não contenham nenhum potencial de alergênicos proteináceos nem de matérias-primas derivadas de petróleo.
[00512] Os polímeros representados pela invenção atual contêm unidades de isopreno, que são isotopicamente únicas em comparação com os de borracha natural e dos polímeros sintéticos que contenham isopreno derivado do petróleo. No caso da borracha natural derivada de Hevea brasiliensis (isto é, a árvore da borracha natural comum), os valores δ 13C normalmente variam de cerca de -27 a cerca de -28 Borracha Guaiúle, que é derivada de um arbusto do deserto, tem δ 13C de cerca de -31 %o. Ambas as borrachas exibem valores δ 13C esperados para os produtos da fotossíntese C3, e ambas as borrachas são conhecidas por conterem proteínas ligadas o polímero.
[00513] O poli-isopreno sintético natural pode ter diferentes valores δ 13C, dependendo da fonte de isopreno. Para isopreno derivado de destilação extrativa de fluxos C5 de refinarias de petróleo, δ 13C é de cerca de -22 a cerca de -24 ^. Esta faixa é típica para hidrocarbonetos insaturados leves, e polímeros contendo isopreno derivado de petróleo normalmente contêm unidades isoprênicas com o mesmo δ 13C. Para polímeros contendo isopreno derivado da reação do isobutileno com formaldeído, os valores δ 13C podem ser de cerca de -
34,4 porque o formaldeído é muitas vezes derivado de matériasprimas com valores δ 13C muito mais negativos.
[00514] A presente invenção fornece polímeros contendo isopreno com diferentes valores δ 13C. Por exemplo, fermentação de glicose derivada de milho (δ 13C -10,73 %o), com quantidades mínimas de outros nutrientes contendo carbono (por exemplo, extrato de levedura) produz isopreno, que pode ser polimerizado em poli-isopreno com δ 13C de 14,66 a -14,85 ^. O 13C δ para este polímero está claramente em
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193/343 uma nova faixa que está bem fora da faixa normal para a borracha natural e de todas as do poli-isopreno sintético anteriormente conhecidas, e está dentro dos valores normalmente associados com produtos derivados de plantas C4. O valor único de δ 13C para este polímero é uma conseqüência direta do fato de que o isopreno no polímero é derivado da glicose derivada de milho, que na verdade é um produto derivado de plantas C4.
[00515] É reconhecido por aqueles com habilidade comum na técnica que resultados semelhantes podem ser obtidos usando outros açúcares fermentáveis ou derivados de plantas C4. Por exemplo, sacarose de cana-de-açúcar (δ 13C -10,4 %o), açúcar invertido a partir do açúcar de cana (δ 13C -15,3 V), glicose de amido de milho (δ 13C -11,1 V) e glicose a partir de degradação hidrolítica ou de palha de milho (δ -
11,3 V 13C) ou de bagaço de cana (δ 13C -13,0 V) deve produzir todos os isopreno que podem ser usados para produzir polímeros de isopreno com valores δ 13C que são menos negativos do que qualquer de borracha natural ou de polímeros sintéticos contendo isopreno derivado de petróleo. Aquele usualmente versado na técnica também reconhecerá que deve ser possível produzir polímeros de isopreno e isopreno com δ 13C menos negativos do que cerca de -22 V a partir de matérias-primas biodegradáveis com δ 13C aproximadamente maiores (isto é, menos negativas) do que cerca de -18 %o, incluindo misturas de matérias-primas biodegradáveis, com uma média δ 13C de aproximadamente mais do que cerca de -18 V.
[00516] Além de produzir polímeros contendo isopreno com valores δ 13C característicos de produtos derivados de plantas C4, aquele usualmente versado na técnica irá reconhecer que exclusivamente isotopicamente rotuladas de polímeros contendo isopreno podem ser feitas a partir matérias-primas fermentáveis não-C4. Por exemplo, glicose a partir de celulose de fibra longa hidrolisada (δ 13C -23 V) deve
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194/343 produzir isopreno e poli-isopreno com δ 13C perto -27 V, que está em uma faixa única entre as faixas normais observadas para isopreno derivado de destilação extrativa de frações C5 e isopreno derivado da reação do isobutileno com formaldeído. Aquele usualmente versado na técnica irá também reconhecer que a fermentação de açúcares com outras faixas de δ 13C de aproximadamente -20 V a cerca de -28 V devem produzir polímeros de isopreno e isoprênicos com δ 13C variando de cerca de -24 V a cerca de -32 V. Estes outros açúcares podem incluir (mas não estão limitados a) glicose a partir da celulose hidrolisada (δ 13C -25 ± 2 V), açúcar invertido a partir do açúcar de beterraba (δ 13C -26 V a -27 V) e lactose (δ 13C -27 V a -28 V). Fermentação de óleos vegetais (δ 13C -26 V a -32 V), incluindo óleo de palma (δ 13C -30 V) pode fornecer acesso a polímeros de isopreno com δ 13C mais negativos do que -30 V.
[00517] Aquele usualmente versado na técnica irá reconhecer que a co-fermentação de duas ou mais matérias-primas pode ser usada para produzir isopreno e, portanto, os polímeros contendo isopreno com valores intermediários de δ 13C. Por exemplo, uma mistura 1:1 de sacarose da cana de açúcar (-10,4 δ 13C V) e sacarose do açúcar de beterraba (δ 13C -26 V a -27 V) deve produzir isopreno e, portanto, os polímeros contendo isopreno com aproximadamente o mesmo valor de δ 13C como os polímeros produzidos a partir de sacarose derivada de uma única fonte com o valor médio de δ 13C (isto é, aproximadamente -
18,5 V). O mesmo deve ser verdade para açúcares invertidos derivados de açúcar e beterraba. Em ambos os casos, deve ser óbvio que os mesmos polímeros podem ser sintetizados mês a mistura e em seguida (co)polimerizar quantidades iguais de isopreno separadamente preparado a partir de sacarose ou açúcar invertido derivado de açúcar de cana e de beterraba. Também deve ser óbvio que co-fermentação de açúcares fermentáveis com outras matérias-primas - como extrato
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195/343 de levedura e óleos vegetais - pode ser usada para produzir isopreno e, portanto, os polímeros contendo isopreno com valores δ 13C intermediários. Por exemplo, co-fermentação de glicose (δ 13C -10,73 e extrato de levedura (δ 13C -26 a -27 em uma proporção de 181,2:17,6 produz isopreno que pode ser polimerizado para poliisopreno com valores δ 13C de -18 a -20 Em contraste, a fermentação da glicose com uma quantidade mínima de extrato de levedura e a subseqüente polimerização do isopreno produz poliisopreno com valores δ 13C valores de -14 a -15 ^.
[00518] Para copolímeros de isopreno com outros monômeros, aquele usualmente versado na técnica irá reconhecer que existe uma quantidade finita de isopreno, que é incorporada na base polimérica como blocos de poli-isopreno. A tendência do isopreno para formar blocos de duas ou mais unidades isoprênicas - mesmo em copolímeros aleatórios - depende de muitos fatores, incluindo a quantidade de isopreno em relação a outros monômeros, o tipo de catalisador utilizado na polimerização, e as condições de reação específica para polimerização. A presença desses blocos ao longo da espinha dorsal do polímero geralmente pode ser detectada por espectroscopia de RMN. Usando uma combinação de degradação química (por exemplo, ozonólise) e cromatografia, é possível isolar fragmentos destes blocos para análise química, incluindo a medição de δ 13C valores para os blocos de derivados do isopreno. Isso fornece uma maneira para determinar se copolímeros de isopreno com outros monômeros contêm isopreno derivado de matérias-primas renováveis / sustentáveis, especialmente matérias-primas derivadas de plantas C4.
[00519] Os polímeros de poli-isopreno desta invenção que são feitos com monômero de isopreno das culturas de células que utilizam fontes de bio-renováveis de carbono podem ser identificados como tal em virtude do seu valor õ13C e outras características poliméricas. Por
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196/343 exemplo, os seguintes polímeros contendo isopreno são verificáveis como contendo monômero de isopreno que foi produzido utilizando o método da presente invenção:
(1) Polímero de isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C superior a -22 V. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor õ13C que é maior que 21 V, e também pode ter um valor õ13C que é maior que -20 V. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -22 V a -10 V, e em outros casos, terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -21 V a -12 V. Ainda em outros casos o polímero poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de 20 V a -14 V. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será a borracha homopolímero de poli-isopreno.
(2) Um polímero poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de 30 V a -28,5 V. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -30 V a -29 V. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -30 V a -29 V, e em outros casos, o poli-isopreno polímero terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -30 V para -29,5 V. Ainda em outros casos o polímero poli-isopreno pode ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -29,5 V a -28,5 V e ainda em outros casos o polímero poli-isopreno pode ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -29,0 V a -28,5 V. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será a borracha homopolímero de poli-isopreno.
(3) Um polímero poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o poli-isopreno é livre de proteínas, e em que o polímero de poli
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197/343 isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 V a -24 V. Em alguns casos este polímero poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -32 V a -25 V. Em alguns casos este polímero poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 V a -25 V. Em outros casos, o poli-isopreno polímero tem um valor õ13C que está dentro da faixa de -33 V a -25 V, e em outros ainda o poli-isopreno polímero tem um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 V a -25 V. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno será a borracha homopolímero de poli-isopreno.
(4) Um polímero poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem um teor de microestrutura cis-1,4- de menos de 99,9%, em que o polímero de poli-isopreno tem um teor de microestrutura trans-1,4- de menos de 99,9%, e no qual o polímero de poli-isopreno tem valor de õ13C que está dentro da faixa de -34 V a -24 V. Tal poli-isopreno pode ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 V a -25 V. Em alguns casos o polímero poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -33 V a -25 V. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 V a -25 V. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 V a -24 V. O polímero de poli-isopreno pode ter um teor de microestrutura cis-1,4- de menos de 99,8%. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura cis-1,4- de menos de 99,7%. Ainda em outros casos o polímero poli-isopreno terá um teor de microestrutura cis-1,4- de menos de 99,5% ou mesmo inferior a 99%. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura cis-1,4- de menos de 98,5% ou mesmo inferior a 98%. Este polímero poli-isopreno também pode ter uma polidispersão inferior a 2,0 ou até mesmo inferior a 1,8. Em alguns casos o polímero de poli-isopreno tem uma polidispersão inferior a 1,6
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198/343 ou até menos do que 1,5. Ainda em outros casos o polímero de poliisopreno pode ter uma polidispersão inferior a 1,4 ou até menos do que
1.2. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,1.
(5) Um polímero poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem um teor de microestrutura 3,4- de mais de 2%, e no qual o polímero de poli-isopreno tem valor de õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -25 ^. Em alguns casos o polímero poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -33 a -25 ^. Em outros casos poli-isopreno polímero terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -25 ^. Em outros casos poli-isopreno polímero terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. O polímero de poli-isopreno pode ter um teor de microestrutura 3,4- de mais de 5%. Em alguns casos o polímero poli-isopreno terá um teor de microestrutura 3,4- de mais de 10%. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura 3,4- de mais de 15%. Em outros ainda o polímero poliisopreno terá um teor de microestrutura 3,4- de mais de 20%. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um conteúdo de microestrutura
3,4- superior a 25%. Este polímero de poli-isopreno pode ter uma polidispersão inferior a 2,0. Em alguns casos o polímero poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,8. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,6. Ainda em outros casos o polímero poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,5 ou até mesmo do que 1.4. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,2 ou até menos do que 1.1.
(6) Um polímero poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que
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199/343 o polímero de poli-isopreno tem um teor de microestrutura 1,2- maior que 2%, e no qual o polímero de poli-isopreno tem valor de õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 %o. Polímeros de poli-isopreno deste tipo podem ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -25
Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -33 a -25 %o. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a 25 %o. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 %o. O polímero de poli-isopreno pode ter um teor de microestrutura 1,2- maior que 5%. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura 1,2- de mais de 10%. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura 1,2- de mais de 15%. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura 1,2- de mais de 20%. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um teor de microestrutura 1,2- superior a 25%. O polímero de poli-isopreno pode ter uma polidispersão inferior a 2,0. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,8. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,6. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,5. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá uma polidispersão inferior a 1,4 ou até menos do que 1.2. É possível que o polímero de poli-isopreno tenha uma polidispersão inferior a 1,1.
(7) Um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno têm um valor õ13C superior a -22 %o. Tais polímeros de poli-isopreno podem ter um valor õ13C que é maior que -21 %o. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor
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200/343 õ13C que é maior que -20 ^. Em outros casos, o polímero de poliisopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -22 a -10 ^. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -21 %o a -12 ^. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -20 a -14 %o.
(8) Um polímero que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno e pelo menos um monômero adicional, em que o polímero inclui blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno, e no qual os blocos de unidades de repetição que derivam de isopreno ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. Tais copolímeros podem ter um valor õ13C dentro da faixa de -34 a -25 ^. Em alguns casos, copolímero deste tipo terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -33 a -25 ^. Em outros casos, copolímeros deste tipo terão um valor õ13C dentro da faixa de -32 a -25 ^. Em outros casos, copolímeros deste tipo terão um valor õ13C dentro da faixa de -32 a -24 ^. Copolímeros deste tipo podem ser copolímeros de borracha de isopreno e 1,3-butadieno, copolímeros de borracha de isopreno e estireno, copolímeros de borracha de isopreno e α-metil estireno, e assim por diante.
(9) Um polímero poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero tem um peso poli-isopreno peso molecular ponderal médio, que está dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e no qual o polímero líquido poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 %o a -25 ^. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de 33 a -25 ^. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -25 ^. Em outros
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201/343 casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 20.000 a 80.000. Em alguns casos, o polímero de poliisopreno líquido terá um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 30.000 a 50.000. Em outros casos, o polímero de poliisopreno terá uma polidispersão inferior a 2,0 ou até mesmo inferior a 1,8. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersão inferior a 1,6 ou até menos do que 1,5. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersão inferior a 1,4 ou até menos do que 1.2. É possível que o polímero líquido poli-isopreno tenha uma polidispersão inferior a 1,1.
(10) Um polímero poli-isopreno líquido que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno líquido tem um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 5.000 a 100.000, e no qual o polímero líquido poli-isopreno tem valor õ13C que está dentro da faixa de -34 a -24 ^. Tais polímeros de poli-isopreno líquido podem ter um valor õ13C que está dentro da faixa de -34 %o a -25 ^. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de 33 a -25 ^. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -25 ^. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá um valor õ13C que está dentro da faixa de -32 a -24 ^. O poli-isopreno líquido pode ter um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 20.000 a 80.000. O poli-isopreno líquido terá normalmente um peso molecular ponderal médio que está dentro da faixa de 30.000 a 50.000. O poli-isopreno líquido pode ter uma polidispersão inferior a 2,0. Em alguns casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersão inferior a 1,8. Em outros casos, o polímero de poli-isopreno líquido tem
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202/343 uma polidispersão inferior a 1,6. Em outros casos ainda, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersão inferior a 1,5 ou até menos do que 1.4. Em muitos casos, o polímero de poli-isopreno líquido terá uma polidispersão inferior a 1,2 ou até menos do que 1.1.
[00520] O homopolímero poli-isopreno, polímero de poli-isopreno líquido ou co-polímero de poli-isopreno, ou quaisquer variações aqui descritas, produzidas por polimerização química do isopreno derivado de fontes renováveis pode ser diferenciada de produtos derivados dos recursos petroquímicos pelo seu conteúdo 14C. Em algumas modalidades, um polímero derivado de bioisopreno compreende carbono-14 radioativo. Em algumas modalidades, a relação 14C/12C é maior do que ou cerca de 1,0 x 10-12, 1,05 x 10-12, 1,1 x 10-12, 1,15 x 1012, ou 1,2 x 10-12. Em algumas modalidades, o polímero derivado do bioisopreno tem um valor fM maior que, ou de cerca de 0,9, 0,95, 1,0, 1,05 ou 1,1. Em algumas modalidades, o polímero derivado do bioisopreno tem um valor fM maior que, ou de cerca de 0,9, 0,95, 1,0, 1,05 ou 1,1 e valores δ 13C de mais (menos negativo) do que -22 %o. Em algumas modalidades, o polímero derivado do bioisopreno tem um valor fM maior que, ou de cerca de 0,9, 0,95, 1,0, 1,05 ou 1,1 e um valor δ 13C que está dentro da faixa de -22 a -10, -21 a -12, ou -20 a -14 %o. Em algumas modalidades, o polímero derivado do bioisopreno tem um valor fM maior que, ou de cerca de 0,9, 0,95, 1,0, 1,05 ou 1,1 e um valor δ 13C que está dentro da faixa de -34 a -24, -32 e -24, - 34 a -25, -33 e -25, 32 e -25, -30 a -29, -30,0 para -29,5, -29,5 a -28,5, ou -29,0 a -28,5 %o.
[00521] Esta invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos que são apenas para fins ilustrativos e não devem ser consideradas como a limitação do âmbito da invenção ou a maneira pela qual ela pode ser praticada. A menos que especificamente indicado de outra forma, as partes e porcentagens são dadas por peso.
EXEMPLOS
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203/343 [00522] Os exemplos são destinados a serem puramente exemplificadores na invenção e não devem ser considerados para restringi-la de forma alguma, também descrever e detalhar os aspectos e modalidades da invenção discutidos acima. Salvo indicação em contrário, a temperatura está em graus centígrados e pressão é ou está próxima à atmosférica. Os exemplos anteriores e descrição detalhada são oferecidos a título de ilustração e não por meio de limitação.
[00523] Todas as publicações, pedidos de patentes e patentes citados neste relatório descritivo estão aqui incorporados por referência, como se cada publicação individual, pedido ou pedidos de patente estivessem específica e individualmente indicados como incorporados por referência. Em particular, todas as publicações citadas neste documento são expressamente aqui incorporadas por referência com o objetivo de descrever e divulgar composições e metodologias que possam ser utilizadas em conexão com a invenção. Embora a invenção anterior esteja descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo, para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparentes para aqueles com habilidade comum na arte, à luz dos ensinamentos da presente invenção que determinadas alterações e modificações podem fazer-lhes, sem se afastar do espírito ou o alcance das reivindicações anexadas.
[00524] Na prática desta invenção a análise 13C pode ser feita através do carregamento amostras de 0,5-1,0 mg em copos de estanho para análise isotópica do carbono usando um analisador elementar Costech ECS4010 como uma entrada para um espectrômetro de massa de relação isotópica Delta ThermoFinnigan. As amostras são gotejadas em um reator de combustão óxido cobaltoso/cobáltico a 1020°C, com gases de combustão sendo passados em um fluxo de hélio em 85mL/min. por meio de um reator de cobre (650°C) para converter NOx para N2. CO2 e N2 são separados usando uma coluna de peneira
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204/343 molecular 3-m 5 Á. Em seguida, as relações 13C/12C são calibradas para a escala VPDB usando dois padrões de laboratório (acetanilida B, 29,52 ± 0,02 m e amido de milho A, -11,01 ± 0,02 %o), que foram cuidadosamente calibrados para a escala VPDB por combustão à parte e análise de dupla entrada usando a abordagem de padrão-2 de T. B. Coplen et al., New Guidelines for 613C Measurements, Anal. Chem., 78, 2439-2441 (2006). Os ensinamentos de Coplen aqui se incorporam por referência com o propósito de ensinar a técnica para determinar valores õ13C.
Exemplo 1: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
I. Construção de vetores para expressão de isopreno sintase de kudzu em E. coli [00525] A sequência da proteína para o gene do isopreno sintase de kudzu (Pueraria montana) (IspS) foi obtida a partir do GenBank (AAQ84170). Um gene de isopreno sintase kudzu, otimizado para uso do códon em E. coli, foi comprado de DNA2.0 (SEQ ID NO: 1). O gene do isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição BspLU11I/PstI, com purificação em gel, e ligados em pTrcHis2B (Invitrogen) que tinham sido digeridos com NcoI/PstI. A construção foi projetada de tal forma que o códon no gene do isopreno sintase 5’ para o sítio de PstI. Como resultado, quando a construção foi expressa o marcador His não está ligado à proteína de isopreno sintase. O plasmídeo resultante, pTrcKudzu, foi verificado por sequenciamento (figuras 2 e 3).
[00526] O gene do isopreno sintase também foi clonado em pET16b (Novagen). Neste caso, o gene do isopreno sintase é inserido em pET16b de tal forma que a proteína de isopreno sintase recombinante continha o marcador His N-terminal. O gene do isopreno sintase foi amplificado a partir pTrcKudzu por PCR usando o conjunto de
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205/343 iniciadores pET-His-Kudzu-2F:
5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID
NO: 3) e PET-His Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO : 4). Estes iniciadores adicionaram um sítio de Ndel na extremidade 5’ e um sítio de BamHI na extremidade 3’ do gene respectivamente. O pTrcKudzu plasmídeo, acima descrito, foi utilizado como molde DNA, a polimerase Herculase (Stratagene) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante e os iniciadores foram adicionados uma concentração de 10 pMols. A PCR foi realizada em um volume total de 25 μΙ. O produto da PCR foi digerido com NdeI/BamH1 e clonado em pET16b digerido com as mesmas enzimas. A mistura de ligação foi transformada em E. coli Top10 (lnvitrogen) e o clone correto selecionado por sequenciamento. O plasmídeo resultante, em que o genes isopreno sintase de kudzu foi expresso a partir do promotor T7, foi designado pETNHisKudzu (figuras 4 e 5).
[00527] O gene de isopreno sintase de kudzu também foi clonado no plasmídeo de baixo número de cópias pCL1920. Os iniciadores foram usados para amplificar o gene do isopreno sintase de kudzu de pTrcKudzu descrito acima. O iniciador anterior adiciona um sítio de HindIII e uma RBS consenso E. coli para uma extremidade 5'. O sítio de clonagem PstI já está presente em pTrcKudzu apenas 3' do códon de parada para que o iniciador reverso seja construído de tal forma que o produto da PCR final inclua o sítio de PstI. As sequências dos iniciadores foram: HindIII-rbs Kudzu-F: 5'-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID NO: 6) e BamH1 Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 4). O produto de PCR é amplificado com a polimerase Herculase com iniciadores a uma concentração de 10 pmol e com 1 ng de molde
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DNA (pTrcKudzu). O protocolo de amplificação inclui 30 ciclos (95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos). O produto é digerido com HindIII e PstI e ligado em pCL1920 que também foi digerido com HindIII e PstI. A mistura de ligação é transformada em E. coli Top10. Vários transformantes são verificados pelo sequenciamento. O plasmídeo resultante é designado PCL-lac-Kudzu (figuras 6 e 7).
II. Determinação de produção de isopreno [00528] Para as culturas em frasco agitado, um mL de uma cultura é transferido de frascos agitados para frascos de headspace CTC de 20 mL (frasco Agilent cat no 5188 2753; tampa cat no 5188 2759). A tampa é rosqueada firmemente, e os frascos incubados à temperatura equivalente com agitação a 250 rpm. Após 30 minutos, os frascos são retirados da incubadora e analisados conforme descrito abaixo (ver Tabela 1 para alguns valores experimentais obtidos neste ensaio).
[00529] Nos casos em que a produção de isopreno no fermentador é determinada, as amostras são tomadas a partir do gás de escape do fermentador e analisadas diretamente, como descrito abaixo (ver Tabela 2 para alguns valores experimentais obtidos neste ensaio).
[00530] A análise é realizada utilizando um sistema Agilent 6890 GC/MS em interface com um amostrador automático CTC Analytics (Suíça) CombiPAL operando no modo headspace. Uma coluna CG Agilent HP-5 MS GC/MS (30 mx 0,25 mm; 0,25 espessura de filme) é usado para a separação dos analitos. O amostrador é configurado para injetar 500 pL de gás no headspace. O método GC / MS utiliza o hélio como gás de arraste a uma vazão de 1 mL / min. A porta de injeção é realizado a 250°C, com uma razão de separação de 50:1. A temperatura do forno é mantida a 37°C para a duração de 2 minutos da análise. O detector seletivo de massas Agilent 5793N é executado no monitoramento de íons simples (modo SIM) em m/z 67. O detector é desligado 1,4-1,7 minutos para permitir a eluição de gases de efeito
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207/343 permanente. Sob estas condições, observa-se que o isopreno (2-metil1,3-butadieno) é eluído em 1,78 minutos. A tabela de calibração é utilizada para quantificar a quantidade absoluta de isopreno e é encontrado para ser linear a partir de 1 pg/L a 2000 pg/L. O limite de detecção é estimada em 50 a 100 ng/L usando este método.
III. Produção de isopreno em frascos de agitação contendo células de E. coli expressando isopreno sintase recombinante [00531] Os vetores descritos acima são introduzidas em E. coli cepa BL21 (Novagen) para produzir cepas BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lacKudzu e BL21/pETHisKudzu. As cepas são distribuídas para o isolamento em LA (ágar Luria) carbenicilina + (50 pg/mL) e incubadas durante a noite a 37°C. Colônias individuais são inoculadas em frascos aletados de 250 mL agitados contendo 20 mL de caldo Luria Bertani (LB) e carbenicilina (100 pg/mL). As culturas são cultivadas durante a noite a 20°C com agitação de 200 rpm. A OD600 das culturas durante a noite são medidas e as culturas são diluídas em frascos aletados de 250 mL agitados contendo 30 mL de MagicMedia (Invitrogen) + carbenicilina (100 pg/mL) para uma OD600 ~ 0,05. A cultura é incubada a 30°C com agitação de 200 rpm. Quando a OD600 ~ 0,5-0,8, 400 mM de IPTG são adicionados e as células são incubadas por mais 6 horas a 30°C com agitação de 200 rpm. Às 0, 2, 4 e 6 horas após a indução com IPTG, 1 mL de alíquotas das culturas é coletado, a OD600 é determinada e a quantidade de isopreno produzido é medida conforme é descrito acima. Os resultados são mostrados na figura 8.
IV. Produção de Isopreno a partir de BL21/ptrcKudzu em fermentação de 14 litros [00532] A produção em larga escala de isopreno de E. coli recombinante contendo o gene de isopreno sintase de kudzu é determinada a partir de uma cultura em batelada alimentada. A receita para os meios de fermentação (TM2) por litro de meio de fermentação
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208/343 é o seguinte: K2HPO413,6 g, KH2PO413,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato de amônia férrico 0,3 g, (NH4)2SO4 3,2 g, extrato de levedura 5 g, Solução de Metal Traço Modificada 1000X 1mL. Todos os componentes são adicionados e dissolvido em diH2O. O pH é ajustado para 6,8 com hidróxido de potássio (KOH) e q.s. para volume. O produto final é esterilizado por filtração com filtro de 0,22 μ (somente, não esterilize em autoclave). A receita para Solução de Metal Traço Modificada 1000X é como se segue: ácido cítrico * H2O a 40 g, MnSO4 * H2O a 30 g, NaCl a 10 g, FeSO4 * 7H2O a 1 g, CoCl2 * 6H2O a 1 g, ZnSO4 * 7H2O a 1 g, CuSO4 * 5H2O a 100 mg, H3BO3 a 100 mg, NaMoO4 * 2H2O a 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em diH2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, então q.s. para volume e esterilizado com filtro de 0,22 μ.
[00533] Este experimento é realizado em biorreator de 14 L para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose na fermentação desejada, pH 6,7 e temperatura de 34°C. O inóculo de E. coli cepa BL21/ptrcKudzu tirada de um frasco congelado é preparado em meio de peptona de soja-extrato de levedura-e glicose. Após o crescimento inóculo para OD550 = 0,6, dois frascos de 600 mL foram centrifugados, o conteúdo ressuspenso em 70 mL de sobrenadante para transferir o pélete celular (70 mL de material OD 3,1) para o biorreator. Por várias vezes após a inoculação, as amostras são retiradas e a quantidade de isopreno produzido é determinada como descrito acima. Os resultados são mostrados na figura 9.
Exemplo 2: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de álamo recombinante [00534] A sequência da proteína para a isopreno sintase de álamo (Populus alba x Populus tremula) (Schnitzler, JP, et al. (2005) Planta 222:777-786) é obtida a partir do GenBank (CAC35696). Um gene com códon otimizado para E. coli, é comprado de DNA2.0 (p9796-álamo,
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209/343 figuras 30 e 31; SEQ ID NO:14). O gene do isopreno sintase é removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição BspLU11I/PstI, purificados em gel e ligados em pTrcHis2B que havia sido digerido com NcoI/PstI. A construção é clonada tal que o códon de parada no inserto está antes do sítio de PstI, o que resulta em uma construção em que o marcador His não está ligado à proteína isopreno sintase. O plasmídeo resultante pTrcPoplar (figuras 32 e 33), foi verificado por sequenciamento.
Exemplo 3: Produção de isopreno em Panteoa citrea expressando isopreno sintase de kudzu recombinante [00535] Os plasmídeos pTrcKudzu e pCL-lac Kudzu descrito no Exemplo 1 foram eletroporados em P.citrea (Pat. no U.S. 7.241.587). Os transformantes foram selecionados em LA contendo carbenicilina (200 pg/mL) ou espectinomicina (50 pg/mL), respectivamente. A produção de isopreno a partir de frascos de agitador e a determinação da quantidade de isopreno produzidos foram realizadas, conforme descrito no Exemplo 1 para cepas de E. coli expressando isopreno sintase recombinante de kudzu. Os resultados são mostrados na figura 10.
Exemplo 4: Produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
I. Construção de um plasmídeo replicante de B. subtilis para a expressão de isopreno sintase de kudzu [00536] O gene do isopreno sintase de kudzu foi expresso em cepa de Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK (BG3594comK) usando um plasmídeo replicante (pBS19 com um cassete de resistência a cloranfenicol) sob controle do promotor aprE. O gene do isopreno sintase, o promoter aprE e o terminador de transcrição foram amplificados separadamente e fundidos usando PCR. A construção foi então clonada em pBS19 e transformada em B. subtilis.
a) Amplificação do promotor aprE
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210/343 [00537] O promotor aprE foi amplificado a partir do DNA cromossômico de Bacillus subtilis usando os seguintes iniciadores: CF 797 (+) Início promotor aprE MfeI 5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 58)
CF 07-43 (-) Fundir promotor aprE ao Kudzu ispS 5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO: 59)
b) Amplificação do gene do isopreno sintase [00538] O gene do isopreno sintase de kudzu foi amplificado a partir de plasmídeo pTrcKudzu (SEQ ID NO:2). O gene foi códon otimizado para E. coli e sintetizado pela DNA 2.0. Os seguintes iniciadores são usados:
CF 07-42 (+) Fundir o promotor aprE ao gene sintase de isopreno kudzu (códon de início GTG) 5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 60)
CF 07-45 (-) Fundir a extremidade 3’ do gene sintase de isopreno kudzu ao terminador 5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61)
c) Amplificação de transcrição de terminador [00539] O terminador da serino protease alcalina de Bacillus amyliquefaciens foi amplificado a partir de um plasmídeo previamente sequenciado pJHPms382 usando os seguintes iniciadores:
CF 07-44 (+) Fundir a extremidade 3’ do gene sintase de isopreno kudzu ao terminador 5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO: 62)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
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211/343 [00540] O fragmento kudzu foi fundido ao fragmento terminador usando PCR com os seguintes iniciadores:
CF 07-42 (+) Fundir promotor aprE ao gene de isopreno sintase de kudzu (códon de início GTG) 5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 61)
CF 07-46 (-) Final de B. amyliquefaciens terminador (BamHI) 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) [00541] O fragmento kudzu foi fundido ao fragmento promotor usando PCR com os seguintes iniciadores:
CF 797 (+) Início promotor aprE MfeI 5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 64) CF 07-46 (-) Final do B. amyliquefaciens terminador (BamHI) 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) [00542] O fragmento de PCR de fusão foi purificado usando um kit Qiagen e digeridos com as enzimas de restrição BamHI e MfeI. Este fragmento de DNA digerido foi purificado com gel, usando um kit Qiagen e ligado a um vetor conhecido como pBS19, que foi digerido com EcoRI e BamHI e com purificação em gel.
[00543] A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli Top 10 e colônias foram selecionadas em placas de LA+50 de carbenicilina. Um total de seis colônias foram escolhidas e cultivadas durante a noite em LB+50 de carbenicilina e, em seguida, os plasmídeos são isolados, usando um kit Qiagen. Os plasmídeos foram digeridos com EcoRI e BamHI para verificar se insere e três dos plasmídeos corretos foram enviados para sequenciamento com os seguintes iniciadores:
CF 149 (+) EcoRI início de promotor aprE 5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 65) CF 847 (+) Sequência em pXX 049 (final do promotor aprE)
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5'-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO: 66)
CF 07-45 (-) Fundir a extremidade 3’ de sintase de isopreno kudzu ao terminador 5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61)
CF 07-48 (+) Iniciador de sequenciamento para isopreno sintase de kudzu
5'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO: 67) CF 07-49 (+) Sequenciamento em isopreno sintase de kudzu 5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO: 68) [00544] O plasmídio designado PBS Kudzu no 2 (figuras 52 e 12) estava correto pelo sequenciamento e foi transformado em BG 3594 comK, uma cepa hospedeira de Bacillus subtilis. A seleção foi feita em placas de LA + 5 de cloranfenicol. Um transformante foi escolhido e estriado em colônias isoladas em LA + 5 de cloranfenicol, então cultivadas em LB + 5 de cloranfenicol até que ele atingisse uma OD600 de 1,5. Ele foi armazenado congelado em um frasco a -80°C na presença de glicerol. A cepa resultante foi designada CF 443.
II. Produção de isopreno em frascos de agitação contendo células de B. subtilis expressando isopreno sintase recombinante [00545] Culturas de um dia para o outro foram inoculadas com uma única colônia da CF 443 a partir de uma LA + cloranfenicol (Cm, 25 pg/mL). As culturas foram cultivadas em LB + Cm a 37°C com agitação de 200 rpm. Essas culturas de um dia para o outro (1 mL) foram utilizados para inocular 250 mL em frascos agitados contendo 25 mL de meio Grants II e cloranfenicol, na concentração final de 25 pg/mL. Receita para Meio Grants II é 10 g de peptona de soja, 3 mL de 1M de K2HPO4, 75 g de glicose, 3,6 g de uréia, 100 mL de MOPS 10X, q.s. para 1 L com H2O, pH 7,2; 10X MOPS receita era 83,72 g MOPS, 7,17 g de tricina, 12 g de péletes de KOH, 10 mL de solução 0.276M K2SO4
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213/343 , 10 mL de solução 0,528M MgCl2, 29,22 g de NaCI, 100 mL de micronutrientes 100X, q.s. para 1 L com H2O; e receita de 100X micronutrientes é 1,47 g de CaCl2*2H2O, 0,4 g de FeSO4*7H20, 0,1 g de MnSO4*H20, 0,1 g de ZnSO4*H2O, 0,05 g de CuCl2*2H2O, 0,1 g de CuCl2*6H2O, 0,1 g Na2MoO4*2H2O, q.s. para 1 L com H2O. Frascos de agitação foram incubados a 37°C e as amostras foram colhidas em 18, 24 e 44 horas. Às 18 horas o headspace da CF443 e da cepa controle foram amostrados. Isso representa 18 horas de acúmulo de isopreno. A quantidade de isopreno foi determinada por cromatografia gasosa, conforme descrito no Exemplo 1. A produção de isopreno foi reforçada significativamente pela expressão de isopreno sintase recombinante (figura 11).
III. Produção de isopreno por CF443 em fermentação de 14 L [00546] A produção em larga escala de isopreno de B. subtilis recombinante contendo o gene de isopreno sintase de kudzu em um plasmídeo de replicação foi determinado a partir de uma cultura em batelada alimentada. A cepa de Bacillus CF 443, expressando um gene de isopreno sintase de kudzu ou cepa controle que não expressam um gene de isopreno sintase de kudzu foram cultivadas por fermentação em batelada alimentada convencionais em um meio nutriente contendo farelo de soja (Cargill), de sódio e fosfato de potássio, sulfato de magnésio e uma solução de ácido cítrico, cloreto férrico e cloreto de manganês. Antes da fermentação, os meios são macerados por 90 minutos, utilizando uma mistura de enzimas, incluindo celulases, pectinases e hemicelulases (v., WO95/04134). Fermentações de 14-L em batelada são alimentadas com 60% peso/peso de glicose (dextrose DE99 Cargill, ADM verdes Versadex Danisco ou açúcar invertido) e 99% em peso/peso do óleo (óleo de soja Família Ocidental, em que o peso de 99% peso/peso é a concentração do óleo antes dele ter sido adicionado ao meio de cultura de células). A alimentação foi iniciada
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214/343 quando a glicose no lote não era detectável. A taxa de alimentação foi elevada durante várias horas e foi ajustada para adicionar o óleo em uma base de carbono equivalente. O pH foi controlado em 6,8-7,4 usando 28% peso/volume hidróxido de amônio. Em caso de formação de espuma, antiespumante foi adicionado aos meios. A temperatura de fermentação foi controlada a 37°C e a cultura de fermentação foi agitada a 750 rpm. Vários outros parâmetros tais como pH, OD%, o fluxo de ar e pressão foram monitorados durante todo o processo. A DO% é mantida acima de 20. As amostras foram colhidas ao longo do tempo de 36 horas e analisadas para o crescimento de células (OD550) e produção de isopreno. Os resultados desses experimentos são apresentados nas figuras 53A e 53B.
IV. Integração de isopreno sintase de kudzu (ispS) em B. subtilis. [00547] O gene de isopreno sintase de kudzu foi clonado em um plasmídeo de integração (pJH101-cmpR) sob o controle do promotor aprE. Sob as condições testadas, nenhum isopreno foi detectado. Exemplo 5: Produção de isopreno em Trichoderma
I. Construção de vetores para expressão do isopreno sintase de kudzu em Trichoderma reesei [00548] O gene IS de kudzu com códon otimizado para Yarrowia lipolytica foi sintetizado pela DNA 2.0 (SEQ ID NO:6) (figura 13). Este plasmídio serviu como molde para a seguinte reação de PCR: 1 pL de molde de plasmídeo (20 ng/uL), 1 pL de Iniciador EL-945 (10 uM) 5'-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ
ID NO: 9), 1 pL de Iniciador EL-945 (10 uM) 5-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO: 10), 1 pL de dNTP (10mM), 5 pL de tampão de PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerase 10x, 1 pL de PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerase, 40 pL de água em um volume total de reação de 50 pL. O iniciador direto continha 4 nucleotídeos adicionais na extremidade 5’ que não
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215/343 correspondem ao gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, mas foram necessários para a clonagem no vetor pENTR/D-TOPO. O iniciador reverso continha 21 nucleotídeos adicionais na extremidade 5' que não correspondem ao gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, mas foram inseridos para clonagem de outros arcabouços de vetores. Usando o MJ Research PTC-200 Termociclador, a reação de PCR foi realizada da seguinte forma: 95°C por 2 minutos (primeiro ciclo só), 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos (Repita o procedimento por 27 ciclos), 72°C por 1 minuto após o último ciclo. O produto da PCR foi analisado em um E-gel 1,2% para confirmar a amplificação bem-sucedida do gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica.
[00549] O produto de PCR foi então clonado usando o seguinte protocolo do fabricante para o kit de clonagem TOPO pENTR/D-TOPO: 1 pL de reação de PCR, 1 pL de solução salina, 1 pL de vetor TOPO pENTR/D-TOPO e 3 pL de água em uma reação com total de volume de 6pL. A reação foi incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Um microlitro de reação TOPO foi transformado em células quimicamente competentes de E. coli TOP10. Os transformantes foram selecionados em placas LA + 50 pg/mL de canamicina. Várias colônias foram escolhidas e cada uma foi inoculada em um tubo de 5 mL contendo LB + 50 pg/mL de canamicina e as culturas cultivadas durante a noite a 37°C com agitação de 200 rpm. Os plasmídeos foram isolados dos tubos de cultivo durante a noite usando QIAprep Spin Miniprep Kit, seguindo o protocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificar se a sequência de DNA estava correta.
[00550] Um único plasmídeo pENTR/D-TOPO, codificando um gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, foi usado para clonagem Gateway em um vetor pTrex3g feito sob medida.
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A construção de pTrex3g é descrita no WO 2005/001036 A2. A reação foi realizada seguindo o protocolo do fabricante para o kit LR Gateway Clonase II Enzima Mix (Invitrogen): 1 pL de vetor doador pENTR/DTOPO de gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, 1 pL do vetor de destino pTrex3g, 6 pL de tampão TE, pH 8,0 em um volume total de reação de 8 pL. A reação foi incubada em temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, 1 pL de solução de proteinase K foi adicionado e a incubação prosseguiu a 37°C por 10 minutos. Em seguida, 1 pL de reação foi transformado em células quimicamente competentes de E. coli TOP10. Os transformantes foram selecionados em placas de LA + 50 pg/mL de carbenicilina. Várias colônias foram escolhidas e cada uma foi inoculada em um tubo de 5 mL contendo LB + 50 tfg/mL de carbenicilina e as culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C com agitação de 200 rpm. Plasmídeos foram isolados dos tubos de cultura durante a noite usando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.), seguindo o protocolo do fabricante. Vários plasmídeos foram sequenciados para verificar se a sequência de DNA estava correta.
[00551] A transformação biobalística de plasmídeo pTrex3g com isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica (figura 14) em um quad exclui cepa de Trichoderma reesei foi realizada através do sistema de distribuição de partícula PDS-1000/HE da Biolistic (ver WO 2005/001036 A2). O isolamento de transformantes estáveis e avaliação de frasco de agitação foram realizados usando o protocolo enumerados no Exemplo 11 da publicação de patentes WO 2005/001036 A2.
II. Produção de isopreno em cepas recombinantes de T. reesei [00552] Um mL de culturas antigas a 15 e 36 horas dos transformantes de isopreno sintase descritos acima foi transferido para frascos headspace. Os frascos foram selados e incubados por 5 horas
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217/343 a 30°C. O gás headspace foi medido e isopreno foi identificado pelo método descrito no Exemplo 1. Dois dos transformantes mostraram traços de isopreno. A quantidade de isopreno poderia ser aumentada por uma incubação de 14 horas. As duas amostras positivas mostraram isopreno em níveis de cerca de 0,5 pg/L para a incubação de 14 horas. O controle não transformado não apresentou níveis detectáveis de isopreno. Este experimento mostra que T. reesei é capaz de produzir isopreno a partir de precursor endógeno quando fornecida com uma isopreno sintase exógena.
Exemplo 6: Produção de isopreno em Yarrowia
I. Construção de vetores para expressão de isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica.
[00553] O ponto de partida para a construção de vetores para a expressão do gene do isopreno sintase de kudzu em Yarrowia lipolytica foi o vetorpSPZ1 (MAP29Spb). A sequência completa desse vetor (SEQ ID NO:11) é mostrada na figura 15.
[00554] Os fragmentos a seguir foram amplificados por PCR usando DNA cromossômico de uma cepa de Y. lipolytica GICC 120285 como molde: uma forma sem promotor do gene URA3, um fragmento do gene do RNA ribossomal 18S, um terminador de transcrição do gene XPR2 de Y. lipolytica e dois fragmentos de DNA contendo os promotores de genes e XPR2 e ICL1. Os seguintes iniciadores de PCR foram utilizados:
ICL1 3
5'GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATCTGCAGG TGAC (SEQ ID NO: 69)
ICL1 5
5'-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO: 70)
XPR 3
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5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID
NO: 71)
XPR 5
5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO: 72) XPRT3
5'-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO: 73) XPRT 5 5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO: 74)
Y18S3 5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO: 75)
Y18S 5 5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID
NO: 76)
YURA3
5'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO:
77)
YURA 50
5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO:
78)
YURA 51
5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO: 79) [00555] Para amplificação por PCR, a polimerase PfuUltrall (Stratagene), tampão fornecido pelo fornecedor e dNTPs, 2,5 μΜ de iniciadores e o molde DNA indicado foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação foi feita através do seguinte ciclo: 95°C por 1 min.; 34 x (95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 3 min.) e 10 min. a 72°C seguidos de 4°C de incubação.
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219/343 [00556] Moléculas sintéticas de DNA codificando o gene do isopreno sintase de kudzu, com códon otimizado para a expressão em Yarrowia, foram obtidas a partir da DNA 2.0 (figura 16; SEQ ID NO: 12). Detalhe completo do esquema de construção dos plasmídeos pYLA(KZ1) e pYLI(KZ1) carregando o gene do isopreno sintase de kudzu sob o controle do promotores XPR2 e ICL1, respectivamente, é apresentado na figura 18. Plasmídeos de controle no qual um gene do fator de acoplamento (MAP29) é inserido no lugar de um gene do isopreno sintase foram igualmente construídos (figuras 18E e 18F).
[00557] Um procedimento de clonagem semelhante pode ser usada para expressar uma gene de isopreno sintase de álamo (Populus alba x Populus tremula. A sequência do isopreno de Álamo é descrito em Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487 e mostrada na figura 17 (SEQ ID NO:13). Um esquema de construção para a geração dos plasmídeos pYLA (POP1) e pYLI(POP1) contendo o gene de isopreno sintase de álamo sob o controle dos promotores, XPR2 e ICL1 respectivamente, é apresentado na figuras 18A e B.
II. Produção de isopreno por cepas recombinantes de Y. lipolytica.
[00558] Os vetores pYLA(KZ1), pYLI(KZ1), pYLA(MAP29) e pYLI(MAP29) foram digeridos com SacII e usados para transformar a cepa Y. lipolytica CLIB 122 por um procedimento de acetato de lítio/polietileno glicol padrão de uridina prototrófica. Resumidamente, as células de levedura cultivadas em YEPD (1% de extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose) durante a noite, foram coletadas por centrifugação (4000 rpm, 10 min.), lavadas uma vez com água estéril e suspensas em acetato de lítio 0,1 M, pH 6,0. Alíquotas de duzentos μΙ da suspensão de células foram misturadas com uma solução de DNA plasmidial linearizado (10-20 pg), incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e misturados com 1 mL de 50% PEG 4000 no mesmo tampão. As suspensões foram adicionalmente incubadas por 1
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220/343 hora à temperatura ambiente, seguido por um choque térmico de 2 minutos a 42°C. As células foram então semeadas em placas de SC his leu (0,67% de base nitrogenada de levedura, 2% de glicose, 100 mg/L de leucina e histidina). Transformantes apareceram após 3-4 dias de incubação a 30°C.
[00559] Três isolados a partir da transformação PYLA (KZ1), três isolados a partir da transformação (KZ1) Pyli, dois isolados do (MAP29) PYLA transformação e dois isolados do Pyli (MAP29) transformação foram cultivados por 24 horas em meio YEP7 (1% de extrato de levedura, peptona 2%, pH 7,0) a 30°C com agitação. Células de 10 mL de cultura foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em 3 mL de YEP7 fresco e colocadas em frascos de 15 mL com tampa de rosca. Os frascos foram incubados durante a noite em temperatura ambiente, com suave (60 rpm) agitação. O conteúdo de isopreno no headspace dos frascos foi analisado por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa, como descrito no Exemplo 1. Todos os transformantes obtidos com PYLA (KZ1) e Pyli (KZ1) produziram facilmente uma quantidade detectável de isopreno (0,5 pg/L para 1 pg/L, figura 20). Nenhum isopreno é detectado no headspace das amostras de controle portadores do gene da fitase, em vez de um gene de isopreno sintase.
Exemplo 7: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu e idi, ou dxs, ou idi e dxs
I. Construção de vetores codificando isopreno sintase de kudzu e idi, ou dxs, ou idi e dxs para a produção de isopreno em E. coli
i) Construção de pTrcKudzuKan [00560] O gene bla de pTrcKudzu (descrito no Exemplo 1) foi substituído com o gene que confere resistência à canamicina. Para remover o gene bla, pTrcKudzu foi digerido com BspHI, tratado com Fosfatase Alcalina de camarão (SAP), aquecido a 65°C, em seguida,
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221/343 teve as extremidades preenchidas por fragmento Klenow e dNTPs. O fragmento de 5 kpb grande foi purificado a partir de um gel de agarose e ligado ao gene kanR que tinha sido amplificado a partir de PCR-BluntII-TOPO utilizando os iniciadores MCM22 5’GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID NO:14) e MCM23 5’- GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID NO:15), digerido com HindIII e PvuI, e preenchido na extremidade. Um transformante carregando um plasmídeo que confere resistência à canamicina (pTrcKudzuKan) foi selecionado em LA contendo canamicina a 50 pg/mL.
ii) Construção de pTrcKudzu yIDI Kan [00561] O pTrcKudzuKan foi digerido com PstI, tratado com a SAP, aquecido e com purificação em gel. Ele foi ligado a um produto de PCR codificando idi de S. cerevisiae com um RBS sintético. Os iniciadores para PCR NsiI-YIDI 1 F 5’CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID NO:16) e PstI-YIDI 1 R 5’- CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO:17); e o molde é DNA genômico de S. cerevisiae. O produto da PCR foi digerido com NsiI e PstI e com purificação em gel antes da ligação. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 quimicamente competentes e selecionada em LA contendo 50 pg/mL de canamicina. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi chamado yIDI pTrcKudzu (kan) (figuras 34 e 35).
iii) Construção de pTrcKudzu DXS Kan [00562] O plasmídeo pTrcKudzuKan foi digerido com PstI, tratado com a SAP, inativado por calor e purificado em gel. Ele foi ligado a um produto da PCR que codificam E. coli dxs com uma RBS sintética. Os iniciadores para PCR MCM13 5’Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 226/355
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GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATA TT GCCAAATACCCG (SEQ ID NO:18) e MCM14 5’CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19); e o molde foi DNA genômico de E. coli. O produto da PCR foi digerido com Nsil e PstI e purificado em gel antes da ligação. A reação de transformação resultante foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA com 50 pg/mL de canamicina. Vários transformantes foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante foi chamado pTrcKudzuDXS (kan) (figuras 36 e 37).
iv) Construção de pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) [00563] O pTrcKudzu-ylDI(kan) foi digerido com Pstl, tratado com a SAP, inativado por calor e purificado em gel. Ele foi ligado a um produto PCR que codificam E. coli dxs com uma RBS sintética. (iniciadores MCM13 5-GAT
CATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTG CCAA ATACCCG (SEQ ID NO:18) e MCM14 5’CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19); molde células TOP10) que foram digeridas com NsiI e PstI e purificadas em gel. O plasmídeo final foi chamado pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) (figuras 21 e 22).
v) Construção de pCL PtrcKudzu [00564] Um fragmento de DNA contendo o promotor, o gene estrutural e de terminação de Exemplo 1 acima foi digerido a partir de pTrcKudzu usando Sspl e purificado em gel. Foi ligado ao pCL1920 que tinha sido digerido com Pvull, tratado com SAP e inativado por calor. A mistura resultante da ligação foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA, contendo 50 pg/mL de espectinomicina. Vários clones foram isolados e sequenciados e dois foram selecionados. PtrcKudzu PCL e PCL PtrcKudzu (A3) têm o inserto em orientações opostas (figuras 38-41).
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223/343 vi) Construção de pCL PtrcKudzu yIDI [00565] O amplicon de PCR de IDI digerido com NsiI-PstI, purificado em gel, de (ii) acima foi ligado no pCL PtrcKudzu que tinha sido digerido com PstI, tratado com SAP e inativado por calor. A mistura de ligadura foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA contendo 50 pg/mL de espectinomicina. Diversos clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado pCL PtrcKudzu yIDI (figuras 42 e 43).
vii) Construção de pCL PtrcKudzu DXS [00566] O amplicon de PCR de DXS digerido com NsiI-PstI, purificado em gel de (iii) acima foi ligado em pCL PtrcKudzu (A3), que tinha sido digerido com PstI, tratado com a SAP e inativado por calor. A mistura de ligação foi transformada em células TOP10 e selecionada em LA, contendo 50 pg/mL de espectinomicina . Diversos clones foram isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado PCL PtrcKudzu DXS (figuras 44 e 45).
II. Medição de isopreno em headspace de culturas expressando sintase de isopreno kudzu, idi e/ou dxs em diferentes números de cópias [00567] Culturas de E. coli BL21 (ÀDE3) previamente transformadas com plasmídeos pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-yIDI kan (B), pTrcKudzuDXS kan (C), pTrcKudzu-yIDI-dxs kan (D) foram cultivadas em LB canamicina 50 pg/mL. Culturas de pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL pTrcKudzu-yIDI (F) e pCL pTrcKudzuDXS (G) foram cultivadas em LB espectinomicina 50 pg/mL. As culturas foram induzidas com 400 μΜ de IPTG no tempo 0 (OD600 de aproximadamente 0,5) e as amostras colhidas para mensuração headspace isopreno (ver Exemplo 1). Os resultados são mostrados na figura 23A-23G.
[00568] O plasmídeo pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) foi introduzido em E. coli cepa BL21 por transformação. A cepa resultante BL21/pTrc Kudzu IDI DXS foi cultivada durante a noite em LB contendo canamicina (50
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224/343 pg/mL) a 20°C e utilizado para inocular agitar frascos de TM3 (13,6 g de K2PO4, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de MgSO4*7H2O), 2,0 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de amônia férrico, 3.2 g de (NH4)2SO4, 0,2 g de extrato de levedura, 1,0 mL de Solução para Rastrear Metal Modificada 1.000 x, ajustada ao pH 6,8 e q.s. a H20 e esterilizado por filtração) contendo glicose a 1%. Frascos foram incubados a 30°C até uma OÜ600 de 0,8 fosse atingida e então induzidos com 400 pM de IPTG. As amostras foram colhidas em vários momentos após a indução e a quantidade de isopreno no headspace foi medida conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 23H.
III. Produção de isopreno a partir de biomassa em E. coli/pTrcKudzu yIDI DXS [00569] A cepa BL21 pTrcKudzuIDIDXS foi testada para a capacidade de geração de isopreno a partir de três tipos de biomassa, o bagaço, a palha de milho e polpa de madeira macia com a glicose como controle. Hidrolisados de biomassa foram preparados por hidrólise enzimática (Brown, L e Torget, R., 1996, NREL padrão de ensaio método Lap-009 Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass) e utilizados na diluição com base em equivalentes de glicose. Neste exemplo, equivalentes de glicose foram iguais a 1% de glicose. Um única colônia de uma placa de células recém-transformadas de BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) foi usada para inocular 5 mL de LB mais canamicina (50 pg/mL). A cultura foi incubada durante a noite a 25°C com agitação. No dia seguinte, o cultivo de durante a noite foi diluída a uma OD600 de 0,05 em 25 mL de TM3 + 0,2% de YE + 1% de matéria-prima. A matéria-prima foi a palha de milho, bagaço, ou polpa de madeira macia. A glicose foi usada como um controle positivo e nenhuma glicose foi usada como controle negativo. As culturas foram incubadas a 30°C com agitação a 180 rpm. A cultura foi monitorada para OD600 e quando atingiu uma OD600 de ~ 0,8, as culturas foram
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225/343 analisadas nas horas 1 e 3 para a produção de isopreno, conforme descrito no Exemplo 1. Culturas não são induzidas. Todas as culturas com adição de matéria-prima produzem isopreno equivalente àquele do controle positivo de glicose. Os experimentos foram feitos em duplicata e são mostrados na figura 46.
IV. Produção de isopreno a partir de açúcar invertido em E. coli/ pTrcKudzuIDIDXS [00570] Uma única colônia de uma placa de células recém-transformadas de BL21(ÁDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (can) foi usada para inocular 5 mL de LB + canamicina (50 pg/mL). A cultura foi incubada durante a noite a 25°C com agitação. No dia seguinte, a cultura crescida durante a noite foi diluída a uma OD600 de 0,05 em 25 mL de TM3 + 0,2% de YE + 1% de matéria-prima. A matéria-prima foi glicose, glicose invertida ou palha de milho. A matéria-prima de açúcar invertido (Danisco Invert Sugar) foi preparada pelo tratamento enzimático de xarope de sacarose. A palha de milho AFEX foi preparada como descrito abaixo (Parte V). As células foram cultivadas a 30°C e a primeira amostra foi medida quando as culturas atingiram uma OD600 ~ 0,8-1,0 (0 hora). As culturas foram analisadas pelo crescimento como medido pela OD600 e pela produção de isopreno como no Exemplo 1 nas horas 0, 1 e 3. Os resultados são mostrados na figura 47.
V. Preparação de hidrolisado de palha de milho pré-tratada por AFEX [00571] A palha de milho pré-tratada por AFEX foi obtida no Instituto de Biotecnologia de Michigan. As condições de pré-tratamento foram de 60% de umidade, carga de amônia 1:1 e 90°C por 30 minutos, em seguida, secagem ao ar. O teor de umidade na palha de milho prétratada por AFEX foi de 21,27%. Os teores de glucana e xilana na palha de milho pré-tratada por AFEX foram de 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente. O processo de sacarificação foi o seguinte: 20 g de palha de milho pré-tratada por AFEX foram adicionados em um frasco
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226/343 de 500 mL com 5 mL de tampão citrato de sódio a 1M, pH 4,8, 2,25 mL de Accellerase 1000, 0,1 mL de Grindamyl H121 (produto de xilanase da Danisco de Aspergillus niger para a indústria de panificação) e 72,65 mL de água DI. O frasco foi colocado em um agitador orbital e incubado a 50°C por 96 horas. Uma amostra foi retirada do agitador e analisada porHPLC. O hidrolisado continha 38,5 g/L de glicose, 21,8 g/L de xilose e 10,3 g/L de oligômeros de glicose e/ou xilose.
VI. O efeito de estrato de levedura na produção de isopreno no crescimento de E. coli em cultura alimentada por bateladas [00572] A fermentação foi realizada na escala de 14L como previamente descrito para células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu yIDI DXS descrito acima. O extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) foi alimentado em taxa exponencial. A quantidade total de extrato de levedura distribuído ao fermentador variou entre 70-830 g durante a fermentação de 40 horas. A densidade ótica do caldo fermentativo foi medida em um cumprimento de onda de 550 nm. A densidade ótica final nos fermentadores era proporcional à quantidade de extrato de levedura adicionado (figura 48A). O nível de isopreno no gás de escape do fermentador foi determinado conforme descrito anteriormente. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação (figura 48B). A quantidade de isopreno produzida era linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura alimentada (figura 48C).
VII. Produção de isopreno em fermentação de 500L de pTrcKudzu DXS yIDI [00573] Uma fermentação de 500 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos de DXS de E. coli , IDI de S. cerevisiae e isopreno sintase de kudzu (E. coli BL21(ÁDE3) pTrc Kudzu dxs yidi) foi usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50 a 300 pg/L em um período de 15 horas. Com base nas concentrações médias de
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227/343 isopreno, o fluxo médio através do dispositivo e o grau de avanço de isopreno, a quantidade de isopreno coletado foi calculada em cerca de 17 g.
VIII. Produção de isopreno em fermentação de 500 L de E. coli cultivada em cultura em batelada alimentada [00574] Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
[00575] K2HPO4 7,5g, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico monohidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura, 1 mL de Solução de Metal Traço Modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é submetida à autoclave. O pH é ajustado para 7,0 com gás de amônia (NH3) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibiótico são adicionados após a esterilização e ajuste de pH. [00576] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00577] Ácidos cítricos * H2O 40g, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoC2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em H2O DI, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00578] A fermentação foi realizada em um biorreator de 500L com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu yIDI DXS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose e extrato de levedura na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirada de um frasco congelado foi preparado em meio peptona de soja-extrato de levedura-glicose. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 0,15, medida a 550 nm, 20 mL foram usados para inocular um biorreator contendo 2,5 L de meio peptona de soja-extrato de levedura-glicose. O biorreator de
2,5 L foi cultivado a 30°C até a OD de 1,0 e 2,0 L foram transferidos
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228/343 para o biorreator de 500 L.
[00579] Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) e glicose foram adicionados em taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura distribuída ao biorreator durante a fermentação de 50 horas foi de 181,2 kg e 17,6 kg, respectivamente. A densidade ótica no biorreator ao longo do tempo é apresentada na figura 49A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme descrito anteriormente. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação (figura 49B). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 50 horas foi de 55,1 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 49C.
Exemplo 8: Produção de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato recombinante e de isopreno sintase de kudzu
I. Clonagem da via inferior do MVA [00580] A estratégia para clonagem da via inferior do mevalonato foi como se segue. Quatro genes da via de biossíntese do mevalonato; genes de mevalonato quinase (MVK), fosfomevalonato quinase (PMK), difosfomevalonato descarboxilase (MVD) e isopentenil difosfato isomerase foram amplificados por PCR a partir do DNA cromossômico de S. cerevisiae e clonados individualmente no plasmídeo pCR BluntII TOPO (Invitrogen). Em alguns casos, o gene idi foi amplificado a partir do DNA cromossômico de E. coli. Os iniciadores foram desenhados tal que um RBS consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID NO:80) ou AAGGAGG (SEQ ID NO:81)) fosse inserido na extremidade 5!, 8 pb a montante do códon de início e um sítio PstI fosse adicionado na extremidade 3!. Os genes foram em seguida clonados um por um no vetorpTrcHis2B até que a via inteira fosse montada.
[00581] O DNA cromossômico deS. cerevisiae S288C foi obtido na ATCC (ATCC 204508D). O gene de MVK foi amplificado a partir do
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229/343 cromossomo de S. cerevisiae usando os iniciadores MVKF (5-AGGAGGTAAAAAAACATGTCA TTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO:21) e MVK-Pst1-R (5-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCA TGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO:22) usando PfuTurbo de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR do tamanho correto (1370 pb) foi identificado por eletroforese através de um E-gel de 1,2% (Invitrogen) e clonado em pZeroBLUNT TOPO. O plasmídeo resultante foi designado pMVK1. O plasmídeo pMVK1 foi digerido com as endonucleases de restrição SacI e Taq1 e o fragmento foi purificado do gel e ligado no pTrcHis2B digerido com SacI e BstBI. O plasmídeo resultante foi nomeado pTrcMVK1.
[00582] O segundo gene na via de biossíntese do mevalonato, PMK, foi amplificado por PCR usando os iniciadores: PstI-PMK1 R (5-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO:23) e BsiHKA IPMK1 F (5’CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO:24). A reação de PCR foi realizada usando a Pfu Turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de tamanho correto (1387 pb) foi digerido com PstI e BsiHKI e ligado no pTrcMVK1 digerido com PstI. O plasmídeo resultante foi nomeado pTrcKK. Os genes de MVD e idi foram clonados da mesma maneira. A PCR foi executada usando os pares de iniciadores PstI-MVD 1 R (5-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO:25) e NsiI-MVD 1 F (5-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID NO:26) para amplificar o gene de MVD e PstI-YID11 R (5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO:27) e NsiIYIDI 1 F (5’CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID NO: 28) para amplificar o gene de yIDI. Em alguns casos, o gene da IPP
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230/343 isomerase, idi de E. coli foi utilizado. Para amplificar idi a partir do DNA cromossômico de E. coli, o seguinte conjunto de iniciadores foi utilizado: PstI-CIDI 1 R (5-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID NO:29) eNsiI-CIDI 1 F (5’CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID NO:30). O molde DNA foi DNA cromossômico isolado por métodos padrões a partir de E. coli FM5 (WO 96/35796 e WO 2004/033646, que são aqui incorporados, cada um, como referência em suas totalidades, particularmente em relação ao isolamento de ácidos nucleicos). Os plasmídeos finais foram nomeados pKKDIy para a construção que codifica o gene idi de levedura ou pKKDIc para a construção que codifica o gene idi de E. coli. Os plasmídeos foram transformados em hospedeiros de E. coli BL21 para análise subsequente. Em alguns casos, a isopreno sintase de kudzu foi clonada em pKKDIy produzindo o plasmídeo pKKDIyIS.
[00583] A via inferior do MVA também foi clonada em pTrc contendo um marcador de resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pTrcKKDIy foi digerido com as endonucleases de restrição ApaI e PstI, o fragmento de 5930 pb foi separado em um E-gel de agarose a 1,2% e purificado usando o kit Gel Purification da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKudzuKan, descrito no Exemplo 7, foi digerido com as endonucleases de restrição ApaI e PstI e o fragmento de 3338 pb contendo o vetor foi purificado a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. O fragmento de vetor de 3338 pb e o fragmento da via inferior do MVA de 5930 pb foram ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli TOP10 e transformantes foram cultivados a 37°C durante a noite com seleção em LA contendo canamicina (50 pg/mL). Os transformantes foram verificados por digestão com enzima de restrição e um foi congelado como estoque. O
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231/343 plasmídeo foi designado pTrcKanKKDIy.
II. Clonagem de um gene de isopreno sintase de kudzu em pTrcKanKKDIy [00584] O gene de isopreno sintase de kudzu foi amplificado por PCR a partir de pTrcKudzu, descrito no Exemplo 1, usando os iniciadores MCM50 5GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACC TC TTCTCAATTTACT (SEQ ID NO:31) e MCM53 5’CGGTCGACGGATCCC TGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:32). O fragmento de PCR resultante foi clonado em pCR2.1 e transformado em E. coli TOP10. Este fragmento contém a sequência codificante do isopreno sintase de kudzu e uma região a montante contendo um RBS de E. coli. Transformantes foram incubados durante a noite a 37° C com seleção em LA contendo carbenicilina (50 pg/mL). A correta inserção do fragmento foi verificada por sequenciamento e esta cepa foi designada como MCM93.
[00585] O plasmídeo da cepa MCM93 foi digerido com as endonucleases de restrição NsiI e PstI para liberar um inserto de 1724 pb contendo o RBS e a isopreno sintase de kudzu. O fragmento de 1724 pb foi separado em um E-gel de agarose a 1,2% e purificado usando o kit Gel Purification da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKanKKDIy foi digerido com a endonuclease de restrição PstI, tratado com SAP por 30 minutos a 37° C e purificado usando o kit de purificação de produto de PCR da Qiagen. O plasmídeo e o fragmento de DNA codificando a isopreno sintase de kudzu foram ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli TOP10 e transformantes foram cultivados durante a noite a 37°C com seleção em LA contendo canamicina a 50 pg/mL. O transformante correto foi verificado por digestão de restrição e o plasmídeo foi designado pTrcKKDyIkISKan
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232/343 (figuras 24 e 25). Este plasmídeo foi transformado em células BL21(ÁDE3) (Invitrogen).
III. Produção de isopreno a partir de mevalonato em E. coli expressando a via inferior recombinante do mevalonato e isopreno sintase de kudzu. [00586] A cepa BL21/pTrcKKDyIkISKan foi cultivada em meio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736 a 747) ajustado ao pH
7,1 e suplementado com 0,5% de glicose e 0,5% de ácido mevalônico. Uma cultura controle também foi estabelecida usando condições idênticas, mas sem a adição de 0,5% de ácido mevalônico. A cultura foi iniciada a partir de uma cultura semeada durante a noite com um inoculo de 1% e induzida com 500 μΜ de IPTG quando a cultura atingisse uma OD600 de 0,3 a 0,5. As culturas foram cultivadas a 30°C com agitação a 250 rpm. A produção de isopreno foi analisada 3 horas após a indução com o ensaio head space descrito no Exemplo 1. A produção máxima de isopreno foi de 6,67 x 10-4 mol/Lcaldo/ OD600/h em que Lcaldo é o volume do caldo e inclui tanto o volume do meio celular como o volume das células. A cultura controle não suplementada com ácido mevalônico não produziu isopreno mensurável.
IV. Clonagem da via MVA superior [00587] A via biossintética superior do mevalonato, compreendendo dois genes que codificam três atividades enzimáticas, foi clonada a partir de Enterococcus faecalis. O gene mvaE codifica uma proteína com as atividades enzimáticas tanto de acetil-CoA acetiltransferase como de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) redutase, a primeira e a terceira proteínas da via e o gene mvaS codifica a segunda enzima da via, HMG-CoA sintase. O gene mvaE foi amplificado a partir do DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um sítio de ligação ribossomal de E. coli e um espaçador na frente usando os seguintes iniciadores:
CF 07-60 (+) Início de mvaE w/RBS + códon de início ATG SacI
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5'GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTAT TA TTG (SEQ ID NO: 34)
CF 07-62 (-) Fundir mvaE a mvaS com RBS em meio 5'-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTA TTGTTTTCTTA AATC (SEQ ID NO: 35) [00588] O gene mvaS foi amplificado a partir do DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um RBS e espaçador de E. coli na frente usando os seguintes iniciadores:
CF 07-61 (+) Fundir mvaE a mvaS com RBS em meio 5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACA ATTGGGATT GATAAA (SEQ ID NO: 36)
CF 07-102 (-) Final do gene mvaS BglII '-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37) [00589] Os fragmentos de PCR foram fusionados, com a PCR usando os seguintes iniciadores:
CF 07-60 (+) Início de mvaE w/ RBS + códon de início ATG SacI '-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGT
AGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34)
CF 07-102 (-) Final do gene mvaS BglII 5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37) [00590] O fragmento de fusão de PCR foi purificado usando um kit Qiagen e digerido com as enzimas de restrição SacI e BglII. Este fragmento de DNA digerido foi purificado do gel usando um kit Qiagen e ligado no vetor disponível comercialmente pTrcHis2A, que tinha sido digerido com SacI e BglII e purificado do gel.
[00591] A mistura de ligação foi transformada em células E. coli Top 10 e colônias foram selecionas em placas de LA+50 pg/mL de
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234/343 carbenicilina. Um total de seis colônias foi escolhido e cultivado durante a noite em LB+50 pg/mL de carbenicilina e plasmídeos foram isolados usando um kit Qiagen. Os plasmídeos foram digeridos com SacI e BglII para checar os insertos e um plasmídeo correto foi sequenciado com os seguintes iniciadores:
CF 07-58 (+) Início do gene mvaE
ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO: 38)
CF 07-59 (-) Final do gene mvaE '- ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO: 39) CF 07-82 (+) Início do gene mvaS '- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO: 40)
CF 07-83 (-) Final do gene mvaS '- TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 41)
CF 07-86 (+) Sequência em mvaE '- GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO: 42)
CF 07-87 (+) Sequência em mvaE '- TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43)
CF 07-88 (+) Sequência em mvaE '- GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 44)
CF 07-89 (+)Sequência mvaS '- GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 45) [00592] O plasmídeo chamado pTrcHis2AUpperPathway no1 estava correto pelo sequenciamento e foi transformado na cepa BL21 de E. coli disponível comercialmente. A seleção foi feita em LA+ 50 pg/mL de carbenicilina. Dois transformantes foram escolhidos e cultivados em LB+ 50 pg/mL de carbenicilina até que eles atingissem uma OD600 de
1,5. Ambas as cepas foram congeladas em um recipiente a -80° C na presença de glicerol. As cepas foram designadas como CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway no1 em BL21, isolado no1 e CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway no1 em BL21, isolado no2. Descobriu-se que
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235/343 ambos os clones se comportam identicamente quando analisados.
V. Clonagem da via MVA superior em pCL1920 [00593] O plasmídeo pTrcHis2AUpperPathway foi digerido com a endonuclease de restrição SspI para liberar um fragmento contendo pTrc-mvaE-mvaS-(His tag)-terminador. Neste fragmento, a etiqueta His não foi traduzida. Este fragmento de 4,5 kpb de extremidades cegas foi purificado a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. Um fragmento de 4,2 kpb defosforilado, com extremidades cegas de pCL1920 foi preparado por digestão do vetor com a endonuclease de restrição PvuII, tratamento com SAP e purificação do gel a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. Os dois fragmentos foram ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche e transformados em células quimicamente competentes TOP10. Transformantes foram selecionados em LA contendo espectinomicina (50 pg/mL). Uma colônia correta foi identificada pela triagem pela presença do inserto por PCR. O plasmídeo foi designado pCL PtrcUpperPathway (figuras 26 e 27).
VI. Cepas Expressando as Vias Superior e Inferior do Mevalonato Combinadas [00594] Para obter uma cepa com uma via do mevalonato completa mais isopreno sintase de kudzu, os plasmídeos pTrcKKDyIkISkan e pCLpTrcUpperPathway foram ambos transformados em células competentes BL21 (ÁDE3) (Invitrogen) e transformantes foram selecionados em LA contendo canamicina (50 pg/mL) e espectinomicina (50 pg/mL). Os transformantes foram checados por prep. de plasmídeo para garantir que ambos os plasmídeos estivessem retidos no hospedeiro. A cepa foi designada MCM127.
VII. Produção de ácido mevalônico a partir de glicose em E. coli/ pUpperpathway [00595] Colônias isoladas de BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS ou FM5/p
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236/343 pTrcHis2A-mvaE/mvaS são inoculadas em LB + carbenicilina (100 pg/mL) e são cultivadas durante a noite a 37o C com agitação a 200 rpm. Essas culturas foram diluídas em 50 mL de meio em frascos aletados de 250 mL para uma OD600 de 0,1. O meio era TM3 + 1 ou 2% de glicose + carbenicilina (100 pg/mL) ou TM3 + 1% de glicose + óleo de soja hidrolisado + carbenicilina (100 pg/mL) ou TM3 + biomassa (painço (switchgrass), palha de milho ou bagaço preparado). Culturas foram cultivadas a 30°C com agitação a 200 rpm por aproximadamente 2-3 horas até uma OD600 de 0,4 ser atingida. Neste momento a expressão da construção mvaE mvaS foi induzida pela adição de IPTG (400 pM). Culturas foram incubadas por 20 ou 40 horas adicionais com amostras sendo tomadas em intervalos de 2 horas a 6 horas após a indução e em seguida em 24, 36 e 48 horas conforme necessário. A amostragem foi feita pela remoção de 1 mL de cultura, medição da OD600, sedimentação das células em uma em uma Microfuge, remoção do sobrenadante e análise do mesmo para ácido mevalônico.
[00596] Uma fermentação de 14 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de HMG-CoA redutase, HMG-CoA sintase e AA-CoA tiolase de Enterococcus faecalis produziu 22 gramas de ácido mevalônico com meio TM3 e 2% e glicose como o meio celular. Um frasco em agitação dessas células produziu 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro com meio LB e 1% de glicose como o meio de cultura de células. A produção de ácido mevalônico nessas cepas indicou que a via MVA era funcional em E. coli.
VIII. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo as vias superior e inferior do MVA mais isopreno sintase de kudzu.
[00597] As seguintes cepas foram criadas por transformação em várias combinações de plasmídeos contendo o gene do isopreno sintase de kudzu e da via superior e inferior do MVA, como descrito acima e os plasmídeos contendo os genes idi, dxs, dxr e de isopreno
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237/343 sintase descritos no Exemplo 7. As células hospedeiras usadas foram BL21(ÁDE3) quimicamente competentes e as transformações foram feitas por métodos padrões. Transformantes foram selecionados em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL) ou canamicina mais espectinomicina (ambas em uma concentração de 50 pg/mL). Placas foram cultivadas a 37°C. As cepas resultantes foram designadas como se segue:
Cultivadas em canamicina mais espectinomicina (50 ug/mL cada) MCM127 - pCL Upper MVA + pTrcKKDylklS (kan) em BL21(ÀDE3) MCM131 - pCL1920 + pTrcKKDyIkIS (kan) em BL21(ÀDE3) MCM125 - pCL Upper MVA + pTrcHis2B (kan) em BL21(ÀDE3) Cultivadas em canamicina (50 pg/mL)
MCM64 - pTrcKudzu yIDI DXS (kan) em BL21(ÀDE3)
MCM50 - pTrcKudzu (kan) em BL21(ÀDE3)
MCM123 - pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan) em BL21(ÁDE3) [00598] As cepas acima foram inoculadas a partir de estoques congelados em LA + antibiótico apropriado e cultivadas durante a noite a 37°C. Uma única colônia de cada placa foi usada para inocular frascos de agitação (25 mL de LB + o antibiótico apropriado). Os frascos foram incubados a 22°C durante a noite com agitação a 200 rpm. Na manhã seguinte os frascos foram transferidos para um incubador a 37° C e cultivados por 4,5 horas adicionais com agitação a 200 rpm. As culturas de 25 mL foram centrifugadas para sedimentar as células e estas foram ressuspensas em 5 mL de LB + o antibiótico apropriado. As culturas foram em seguida diluídas em 25 mL de LB+1% de glicose + o antibiótico apropriado para uma OD600 de 0,1. Foram preparados dois frascos para cada cepa, um grupo para indução com IPTG (800 pM), o segundo grupo não foi induzido. As culturas foram incubadas a 37° C com agitação a 250 rpm. Um grupo das culturas foi induzido após 1,50 horas (imediatamente após o tempo 1 de amostragem). Em cada tempo
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238/343 de amostragem, a ODeoo foi medida e a quantidade de isopreno determinada conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 3. A quantidade de isopreno feito é apresentada como a quantidade do pico de produção para a cepa particular.
Tabela 3. Produção de isopreno em cepas de E. coli
Cepa Isopreno (pg/Lcaido/h/OD)
MCM50 23,8
MCM64 289
MCM125 ND
MCM131 Traço
MCM127 874
ND: não detectado
Traço: pico presente, mas não integrável.
IX. Análise de ácido mevalõnico [00599] A mevalonolactona (1,0 g, 7,7 mmol) (CAS n° 503-48-0) foi fornecida pela Sigma-Aldrich (Wl, Estados Unidos da América) como um xarope que é dissolvido em água (7,7 mL) e foi tratada com hidróxido de potássio (7,7 mmol) a fim de gerar o sal de potássio do ácido mevalõnico. A conversão em ácido mevalõnico foi confirmada por análise de 1H RMN. Amostras para análise de HPLC foram preparadas pela centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos para remover células, seguida pela adição de uma alíquota de 300 pL de sobrenadante a 900 pL de H2O. Em seguida, foi adicionado ácido perclórico (36 pL de uma solução a 70%) seguido pela mistura e resfriamento em gelo por 5 minutos. As amostras foram em seguida centrifugadas novamente (14.000 rpm por 5 min.) e 0 sobrenadante transferido para HPLC. Padrões de ácido mevalõnico (20, 10, 5, 1 e 0,5 g/L) foram preparados da mesma maneira. A análise de ácido mevalõnico (volume de injeção de 20 pL) foi realizada por HPLC usando uma coluna BioRad Aminex
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87-H+ (300 mm por 7,0 mm) eluída com 5 mM de ácido sulfúrico a 0,6 mL/min. com detecção do índice de refração (IR). Sob estas condições, o ácido mevalônico foi eluído na forma de lactona em 18,5 minutos.
X. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo a via MVA superior mais isopreno sintase de kudzu [00600] Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato e isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno em células em cultura alimentada por bateladas. Este experimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 2,2 g/L de isopreno.
[00601] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00602] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00603] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00604] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes foram dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00605] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15-L com
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240/343 células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperPathway (figura 26) e pTrcKKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de peptona de soja-extrato de levedura-glicose. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, quando medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00606] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 54 horas foi de 3,7 kg. A indução foi feita pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG foi levada à 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 190. A concentração de IPTG foi elevada a 100 uM em 38 horas de fermentação. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 54. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um volume final de 2,2 g/L (figura 55). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 54 horas é de 15,9 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 56.
XI. Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e cultivada em cultura alimentada por bateladas na escala de 15 L [00607] Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato e isopreno sintase de kudzu foi
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241/343 usada para produzir isopreno em células em cultura alimentada por bateladas. Este experimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 3,0 g/L de isopreno.
[00608] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00609] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00610] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00611] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes foram dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume, esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00612] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a
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OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00613] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 59 horas foi de 2,2 kg. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 190. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 93. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 3,0 g/L (figura 94). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 59 horas foi de 22,8 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 95. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 2,2%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 1,0%.
XII. Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e cultivada em cultura alimentada por bateladas na escala de 15 L [00614] Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato, isopreno sintase de Pueraria lobata e isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno em células em cultura alimentada por bateladas. Este experimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 3,3 g/L de isopreno.
i) Construção de pCLPtrcUpperPathwayHGS2
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243/343 [00615] O gene que codifica a isopreno sintase de Pueraria lobata foi amplificado por PCR usando os iniciadores Nsil-RBS-HGS F (cttgATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, SEQ ID NO:105) e pTrcR (CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG, SEQ ID NO:106), e pTrcKKDylklS como o molde. O produto de PCR assim obtido foi digerido por restrição com Nsil e Pstl e purificado em gel. O plasmídeo pCL PtrcUpperPathway foi digerido por restrição com Pstl e defosforilado usando a fosfatase alcalina rAPid (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.
[00616] Esses fragmentos de DNA foram ligados e a reação de ligação foi transformada em células quimicamente competentes de E. coli Top10 (lnvitrogen), plaqueadas em L ágar contendo espectinomicina (50 pg/ml) e incubadas durante a noite a 37o C. O DNA plasmidial foi preparado a partir de 6 clones usando o kit de minipreparação Qiaquick Spin. O DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrição EcoRV e Mlul para identificar um clone em que o inserto tivesse a orientação certa (ou seja, o gene orientado da mesma forma que o promotor pTrc).
[00617] O plasmídeo correto resultante foi designado pCLPtrcUpperPathwayHGS2. Este plasmídeo foi avaliado usando o ensaio headspace aqui descrito e descobriu-se que produz isopreno em E. coli Top10, validando assim a funcionalidade do gene. O plasmídeo foi transformado em BL21 (ÁDE3) contendo pTrcKKDylklS para produzir a cepa BL21/pCLPtrcUpper PathwayHGS2-pTrcKKDylklS. Esta cepa tem uma cópia extra do isopreno sintase comparada com a cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS (Exemplo 8, parte Xl). Esta cepa também tinha maiores expressão e atividade de HMGS comparada com a cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS usada no Exemplo 8, parte Xl.
ii) Fermentação de isopreno em E. coli expressando
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244/343 pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS e cultivada em cultura alimentada por bateladas na escala de 15 L [00618] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00619] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00620] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00621] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00622] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCLPtrcUpperPathwayHGS2 e pTrc KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
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245/343 [00623] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 58 horas foi de 2,1 kg. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 9. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 170. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 104. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 3,3 g/L (figura 105). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 58 horas é de 24,5 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 106. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação é de 2,5%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 1,2%. A análise mostrou que a atividade do isopreno sintase foi aumentada aproximadamente em 3-4 vezes comparada com BL21 expressando os plasmídeos CL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS (dados não mostrados). XIII. Integração cromossômica da via inferior do mevalonato em E. coli. [00624] Um operon sintético contendo mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e a IPP isomerase foi integrado ao cromossomo de E. coli. Se desejado, a expressão pode ser alterada pela integração de diferentes promotores 5’ do operon.
[00625] A Tabela 4 lista os iniciadores usados para este experimento.
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Tabela 4: Iniciadores
MCM78 attTn7 inversão de baixo para cima para construto de integração gcalgctcgagcggccgclITTAATCAAACATCCTGCCAA CTC (SEQ ID NO:91)
MCM79 attTn7 inversão de cima para baixo para construto de integração) gatcgaagggcgatcgTGTCACAGTCTGGCGAAACCG (SEQ ID NO:92)
MCM88 attTn7 de cima para frente para construto de integração ctgaattctgcagatatcTGTTTTTCCACTCTTCGTTCACTT T (SEQ ID NO:93)
MCM89 attTn7 de baixo para frente para construto de integração tctagagggcccAAGAAAAATGCCCCGCTTACG (SEQ ID NO:94)
MCM104 promotor G11.2 - MVK Gatcgcggccgcgcccttgacgatgccacatcctgagcaaataattcaaccac taattgtgagcggataacacaaggaggaaacagctatgtcattaccgttcttaact tc (SEQ ID NO:95)
MCM105 terminador aspA - yIDI Gatcgggccccaagaaaaaaggcacgtcatctgacgtgccttttttatttgtaga cgcgttgttatagcattcta (SEQ ID NO:96)
MCM120 a frente de attTn7: homologia com attTn7, homologia com marcador GB aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgtttgattaaa agcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID NO:97)
MCM127 Rev complemento de 1.2 GI: homologia com marcador GB (extra longo), promotor, RBS, ATG AGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTITCCCGG TGCAgaagttaagaacggtaatgacatagctgtttcctccttgtgttatccgct cacaattagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatcgtcaagggcTAAT ACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO:98)
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i) Construção de vetor alvo [00626] O sítio attTn7 foi selecionado para integração. Regiões de homologia a montante (attTn7 up) (iniciadores MCM78 e MCM79) e a jusante (attTn7 down) (iniciadores MCM88 e MCM89) foram amplificadas por PCR a partir de células MG1655. Uma reação de 50 pL com 1 pL de iniciadores a 10 pM, 3 p L de ddH2O, 45 pL de Platinum PCR Supermix High Fidelity da Invitrogen e uma colônia raspada de MG1655 foi desnaturada por 2:00 a 94oC, submetida a 25 ciclos (2:00 a 94oC, 0:30 a 50 oC e 1:00 a 68oC), adiado por 7:00 a 72oC e resfriada a 4oC. Este DNA resultante foi clonado em pCR2.1 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, resultando nos plasmídeos MCM278 (attTn7 up) e MCM252 (attTn7 down). O fragmento de 832pb digerido com ApaI-PvuI e purificado em gel a partir de MCM252 foi clonado no plasmídeo pR6K digerido com ApaI-PvuI e purificado em gel, criando o plasmídeo MCM276. O fragmento de 825pb digerido com PstI-NotI e purificado em gel a partir de MCM278 foi clonado em MCM276 digerido com PstI-NotI e purificado em gel, criando o plasmídeo MCM281.
ii) Clonagem da via inferior e promotor [00627] Os genes MVK-PMK-MVD-IDI foram amplificados a partir de pTrcKKDyIkIS com os iniciadores MCM104 e MCM105 usando o sistema de PCR Expand Long PCR da Roche de acordo com as instruções do fabricante.Este produto foi digerido com NotI e ApaI e clonado em MCM281, que tinha sido digerido com NotI e ApaI e purificado em gel. Os iniciadores MCM120 e MCM127 foram usados para amplificar o cassete CMR a partir do molde DNA FRT-gb2-Cm-FRT da GeneBridges usando Pfu pLtra II da Stratagene. Um programa de PCR com desnaturação a 95 oC por 4:00, 5 ciclos de 95 oC por 0:20, 55oC por 0:20, 72oC por 2:00, 25 ciclos de 95oC por 0:20, 58oC por 0:20, 72oC por 2:00, 72oC por 10:00, e em seguida o resfriamento a 4oC foi usado com quatro reações de PCR de 50pL contendo 1pL de molde a
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248/343 ~10ng/pL, 1pL de cada iniciador, 1,25 pL de dNTPs a 10mM, 5pL de tampão 10X, 1pL de enzima e 39,75pL de ddH20. Reações foram combinadas, purificadas em uma coluna de purificação de PCR da Qiagen e usadas na eletroporação de células Pir1 lavadas em água contendo o plasmídeo MCM296. A eletroporação foi efetuada em cuvetas de 2mM a 2,5V e 200 ohms. As reações de eletroporação foram recuperadas em LB por 3h a 30°C. O transformante MCM330 foi selecionado em LA com CMP5, Kan50 (figuras 107 e 108A-108C).
iii) Integração em cromossomo de E. coli [00628] O DNA de minipreparação (kit Qiaquick Spin) de MCM330 foi digerido com SnaBI e usado na eletroporação de BL21(DE3) (Novagen) ou MG1655 contendo o plasmídeo pRedET Carb da GeneBridges. Células são cultivadas a 300C até ~OD1, em seguida induzidas com 0,4% de L-arabinose a 37oC por 1,5 horas. Essas células foram lavadas três vezes em ddH2O a 40C antes da eletroporação com 2pL de DNA. Integrações foram selecionadas em L ágar contendo cloranfenicol (5 pg/mL) e subsequentemente foi confirmado que elas não cresciam em L ágar + canamicina (50 pg/mL). A integração de MCM331 em BL21 e a integração de MCM333 em MG1655 foram congeladas.
iv) Construção de pET24D-Kudzu que codifica a isopreno sintase de kudzu [00629] O gene do isopreno sintase de kudzu foi subclonado no vetor pET24d (Novagen) a partir do vetor pCR2.1 (Invitrogen). Em particular, o gene do isopreno sintase de kudzu foi amplificado a partir do molde DNA pTrcKudzu usando os iniciadores MCM50 5!-gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgtgtg cgacctcttc tcaatttact (SEQ ID NO:99) e MCM53 5-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID NO:100). Reações de PCR foram executadas usando Taq DNA
Polimerase (Invitrogen) e o produto de PCR resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) e transformado em
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249/343 células quimicamente competentes de E. coli Top10 (Invitrogen). Transformantes foram plaqueados em L ágar contendo carbenicilina (50 pg/mL) e incubados durante a noite a 37oC. Culturas de 5 mL de caldo Luria contendo carbenicilina a 50 pg/ml foram inoculadas com um só transformante e cultivadas durante a noite a 37oC. Cinco colônias foram triadas pelo inserto correto por sequenciamento de DNA plasmidial isolado de 1 mL de cultura líquida (Caldo Luria) e purificado usando o kit de minipreparação QIAprep Spin (Qiagen). O plasmídeo resultante, designado MCM93, contém a sequência codificante de isopreno sintase de kudzu em um arcabouço de pCR2.1.
[00630] A sequência codificante de kudzu foi removida por digestão de endonuclease de restrição com Pcil e BamHI (Roche) e purificada em gel usando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). O DNA do vetor pET24d foi digerido com Ncol e BamHI (Roche), tratado com fosfatase alcalina de camarão (Roche) e purificado usando o kit QIAprep Spin Mini-prep (Qiagen). O fragmento de isopreno sintase de kudzu foi ligado ao pET24d NcoI/BamH1 digerido usando o kit Rapid DNA Ligation (Roche) em uma proporção de 5:1 de fragmento para vetor em um volume total de 20 pL. Uma parte de uma mistura de ligação (5 pL) foi transformada em células quimicamente competentes de E. coli Top 10 e plaqueada em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). O transformante correto foi confirmado por sequenciamento e transformado em células BL21(ÁDE3)pLysS quimicamente competentes (Novagen). Uma única colônia foi selecionada após o crescimento durante a noite a 37oC em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). Um mapa do plasmídeo resultante designado como pET24D-Kudzu é mostrado na figura 109. A sequência de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:101) é mostrada nas figuras 110A e 110B. A atividade de isopreno sintase é confirmada usando um ensaio headspace.
v) Cepas de produção
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250/343 [00631] As cepas MCM331 e MCM333 foram co-transformadas com os plasmideos pCLpTrcUpperPathway e pTrcKudzu ou pETKudzu, resultando nas cepas mostradas na Tabela 5.
Tabela 5. Cepas de Produção
Origem Inferior Integrad a Plasmídeo de MVA Superior Plasmídeo de isopreno sintase Cepa de Produção
BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpper Pathway pT rcKudzu MCM343
BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpper Pathway pET24D-Kudzu MCM335
MG 1655 MCM333 pCLPtrcUpper Pathway pT rcKudzu MCM345
vi) Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonate e cultivada em cultura alimentada por bateladas na escala de 15 L.
[00632] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00633] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSÜ4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em dihhO. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00634] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00635] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSÜ4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de PeSO4 * 7H2O, 1 g de C0CI2 * 6H2O, 1 g de ZnSÜ4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até 0 volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 micron.
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251/343 [00636] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo a via inferior do MVA integrada gi1.2 descrita acima e os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrcKudzu. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00637] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 57 horas foi de 3,9 kg. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 100 uM quando a taxa de evolução de dióxido de carbono atingiu 100 mmol/L/h. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 111A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 1,6 g/L (figura 111B). A produtividade específica de isopreno ao longo da fermentação é apresentada na figura 111C e picos em 1,2 mg/OD/h. A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 57 horas foi de 16,2 g. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 0,9%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 0,4%o.
XIV. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo a isopreno sintase de kudzu usando glicerol como fonte de carbono [00638] Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando
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252/343 isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno em células alimentadas com glicerol em cultura alimentada por bateladas. Este experimento demonstra que células em cultivo na presença de glicerol (sem glicose) resultam na produção de 2,2 g/L de isopreno.
[00639] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00640] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Glicerol, 5,1 g, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00641] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00642] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes foram dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00643] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo o plasmídeo pTrcKudzu. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicerol na temperatura de 35°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LA ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de peptona de soja-extrato de levedura-glicose e cultivada a 35°C. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 600 mL foram usados para inocular um
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253/343 biorreator de 7,5 L.
[00644] O glicerol foi adicionado em taxa exponencial até que as células atinjam uma densidade ótica a 550 nm (OD550) de 153. A quantidade total de glicerol distribuído ao biorreator durante a fermentação de 36 horas foi de 1,7 kg. Fora a glicose no inoculo, nenhuma glicose foi adicionada ao biorreator. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 20 uM quando a OD550 atingiu um valor de 50. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 57. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 2,2 g/L (figura 58). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 54 horas foi de 20,9 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 59.
XV. Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e cultivada em cultura alimentada por bateladas na escala de 15 L usando açúcar invertido como fonte de carbono [00645] Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato e isopreno sintase de kudzu foi usada para produzir isopreno em células alimentadas com açúcar invertido em cultura alimentada por bateladas. Este experimento demonstra que células em cultivo na presença de açúcar invertido resultam na produção de 2,4 g/L de isopreno.
[00646] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00647] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com
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254/343 hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de açúcar invertido, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00648] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00649] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00650] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de açúcar invertido na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00651] O açúcar invertido foi adicionado em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de açúcar invertido foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de açúcar invertido distribuída ao biorreator durante a fermentação de 44 horas foi de 2,4 kg. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 9. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 200. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na
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255/343 figura 96. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 2,4 g/L (figura 97). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 44 horas foi de 18,4 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 98. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,7%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 0,8%.
Exemplo 9: Construção da via superior e inferior do MVA para integração em Bacillus subtilis
Construção da via MVA superior em Bacillus subtilis [00652] A via superior de Enterococcus faecalis é integrada em B. subtilis sob o controle do promotor aprE. A via superior consiste em dois genes; mvaE, que codifica AACTe HMGR, e mvaS, que codifica HMGS. Os dois genes são fusionados a um códon de parada no meio deles, um sítio RBS na frente de mvaS e estão sob o controle do promotor aprE. Um terminador está situado após o gene mvaE. O marcador de resistência a cloranfenicol é clonado após o gene mvaE e a construção é integrada no lócus aprE por dupla permutação usando regiões flanqueadoras homólogas.
[00653] Quatro fragmentos de DNA são amplificados por PCR tal que eles contenham protrusões que permitirão que eles sejam fusionados por uma reação de PCR. Amplificações por PCR são executadas usando Herculase polimerase de acordo com as instruções do fabricante.
PaprE
CF 07-134 (+) Início de promotor aprE PstI
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-94 (-) Fusiona PaprE a mvaE
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5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO:83)
Molde: DNA cromossômico de Bacillus subtilis mvaE
CF 07-93 (+) fusiona mvaE ao promotor aprE (códon de início GTG)
5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84)
CF 07-62 (-) Fusiona mvaE a mvaS com RBS no meio
5'TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCT
T AAATC (SEQ ID NO:35)
Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis (da ATCC) mvaS
CF 07-61 (+) Fusiona mvaE a mvaS com RBS no meio
5'GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGA
TT GATAAA (SEQ ID NO:36)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis
Terminador de serino protease alcalina de B. amyliquefaciens
CF 07-123 (+) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO:86)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens BamHI
5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
Molde: DNA cromossômico de Bacillus amyliquefaciens
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Reações de Fusão por PCR
Fusionar mvaE a mvaS
CF 07-93 (+) fusiona mvaE ao promotor aprE (códon de início GTG)
5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
Molde: no2 e 3 acima
Fusionar mvaE-mvaS ao promotor aprE
CF 07-134 (+) Início do promotor aprE PstI
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
Molde no 1 e no 4 acima
Fusiona PaprE-mvaE-mvaS ao terminador
CF 07-134 (+) Início de aprE promotor PstI
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens BamHI 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63 Molde: no 4 e no 6 [00654] O produto é digerido com endonucleases de restrição PstI/ BamHI e ligado a pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vetors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, págs. 615 a 624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, e R. Losick (editores), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, DC) que é
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258/343 digerido com PstI/BamHI. A ligação é transformada em células quimicamente competentes de E.coli TOP 10 e transformantes são selecionados em LA contendo carbenicilina (50 pg/mL). O plasmídeo correto é identificado por sequenciamento e é designado pJMUpperpathway2 (figuras 50 e 51). O DNA plasmidial purificado é transformado em Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK e transformantes são selecionados em L ágar contendo cloranfenicol (5 pg/mL). Uma colônia correta é selecionada e é plaqueada sequencialmente em L ágar contendo cloranfenicol a 10, 15 e 25 pg/mL para amplificar o número de cópias do cassete contendo a via superior.
[00655] A cepa resultante é testada pela produção de ácido mevalônico pelo crescimento em LB contendo 1% de glicose e 1%. Culturas são analisadas por GC para a produção de ácido mevalônico. [00656] Esta cepa é usada subsequentemente como um hospedeiro para a integração da via inferior do mevalonato.
[00657] Os seguintes iniciadores são usados para sequenciar as várias construções acima.
Iniciadores de sequenciamento:
CF 07-134 (+) Início de promotor aprE PstI
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-58 (+) Início de gene mvaE
5'- ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:38)
CF 07-59 (-) Final do gene mvaE
5'- ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:39) CF 07-82 (+) Início de gene mvaS
5'- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:40)
CF 07-83 (-) Final do gene mvaS
5'- TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:41)
CF 07-86 (+) Sequência em mvaE
5'- GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:42)
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CF 07-87 (+) Sequência em mvaE
5'- TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:43)
CF 07-88 (+) Sequência em mvaE
5'- GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO:44)
CF 07-89 (+) Sequência mvaS
5'- GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45) [00658] Transformantes são selecionados em LA contendo cloranfenicol em uma concentração de 5 pg/mL. Confirmou-se que uma colônia tinha a integração correta por sequenciamento e esta é plaqueada em LA contendo concentrações crescentes de cloranfenicol no decorrer de sete dias, até um nível final de 25 pg/mL. Isto resulta na amplificação do cassete contendo os genes de interesse. A cepa resultante é designada CF 455: pJMupperpathway no1 X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (amplificada para crescer em LA contendo cloranfenicol a 25 pg/mL).
[00659] Construção de uma via inferior do MVA em Bacillus subtilis [00660] A via inferior do MVA, consistindo nos genes mvkl, pmk, mpd e idi combinados em um cassete consistindo em regiões de DNA flanqueadoras da região nprE do cromossomo de B. subtilis (sítio de integração), no promotor aprE, e no marcador de resistência à espectinomicina (veja as figuras 28 e 29). Este cassete é sintetizado por DNA2.0 e é integrado ao cromossomo de B. subtilis contendo a via MVA superior integrada no lócus aprE. O gene do isopreno sintase de kudzu é expresso a partir do plasmídeo que se replica descrito no Exemplo 4 e é transformado na cepa tanto com a via superior como a inferior integradas.
Exemplo 10: Composições exemplificadoras de isopreno e métodos para fazê-las
Análise Composicional de gás de escape da fermentação contendo isopreno
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260/343 [00661] Uma fermentação na escala de 14 L foi realizada com uma cepa de E. coli BL21(DE3) recombinante contendo dois plasmídeos (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS que codifica a via completa do mevalonato para a biossíntese de precursor isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu. O gás de escape da fermentação do tanque de 14 L foi coletado em recipientes de headspace de 20 mL aproximadamente no momento do pico de produtividade de isopreno (27,9 horas transcorridas do tempo de fermentação, EFT) e analisado por headspace GC/MS pelos componentes voláteis.
[00662] A análise Headspace foi realizada com um sistema Agilent 6890 GC/MS equipado com uma coluna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 pm; 0.25 pm de espessura de filme). Um injetor automático combiPAL foi usado para amostragem de alíquotas de 500 pL a partir de recipientes headspace de 20 mL. O método de GC/MS utilizou hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção foi mantida a 250oC com uma relação de divisão de 50:1. A temperatura do forno foi mantida a 37oC para um período de 2 minutos iniciais, seguido por um aumento até 237oC em uma velocidade de 25oC/min. para um tempo de método total de 10 minutos. O detector seletivo de massas Agilent 5793N fez varreduras de m/z 29 a m/z 300. O limite de detecção deste sistema é de aproximadamente 0,1 pg/Lgas ou aproximadamente 0,1 ppm. Se desejado, pode ser utilizado equipamento mais sensível com um limite de detecção menor.
[00663] O gás de escape consistiu em 99,925 % (v/v) de gases permanentes (N2, CO2 e O2), aproximadamente 0,075% de isopreno (2metil-1,3-butadieno) (~750 ppmv, 2100 pg/L) e quantidade menores (<50 ppmv) de etanol, acetona, e dois alcoóis C5 prenílicos. A quantidade de vapor de água não foi determinada, mas é estimada como sendo igual à pressão de vapor em equilíbrio a 0oC. A composição
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261/343 da fração orgânica volátil foi determinada por integração da área sob os picos no cromatograma de GC/MS (Figs. 86A e 86B) e é listada na Tabela 6. As curvas de calibração para padrões de etanol e acetona permitiram a conversão de área GC área em concentração de fase gasosa em unidade de pg/L usando métodos padrões.
Tabela 6. Composição de componentes orgânicos voláteis no gás de escape de fermentação.
[00664] O gás de escape foi analisado no tempo de 27,9 horas de uma fermentação usando uma cepa E. coli BL21(DE3) expressando uma via do mevalonato heteróloga, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu.
Composto RT (min.) GC área Área % Conc. (pg/L)
Etanol 1,669 239005 0,84 62 +/- 6
Acetona 1,703 288352 1,02 42 +/- 4
Isopreno (2-metil-1,3-butadieno) 1,829 27764544 97,81 2000 +/- 200
3-metil-3-buten-1-ol 3,493 35060 0,12 <10
3-metil-2-buten-1-ol 4,116 58153 0,20 <10
I . Medição de traços de compostos orgânicos voláteis (VOCs) coproduzidos com isopreno durante a fermentação de uma cepa de E. coli recombinante [00665] Uma fermentação na escala de 14 L foi realizada com uma cepa de E. coli BL21(DE3) recombinante contendo dois plasmídeos (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) que codifica a via completa do mevalonato para a biossíntese de precursor isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu.
[00666] O gás de escape da fermentação foi passado por recipientes headspace resfriados a fim de concentrar e identificar traços de componentes orgânicos voláteis. O gás de escape desta fermentação foi amostrado em uma taxa de 1 L/min. por 10 minutos através de um recipiente headspace de 20 mL empacotado com lã de quartzo (2g) e
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262/343 resfriado a -78oC com gelo seco. O recipiente foi tampado novamente com uma tampa de recipiente nova e analisado por headspace GC/MS para VOCs capturados usando as condições descritas no Exemplo 10, parte I. As proporções de compostos observadas nas Figs. 87A-87D são uma combinação de nível global no gás de escape de fermentação, a pressão de vapor relativa a -78oC, e a resposta do detector do espectrômetro de massas. Por exemplo, o nível baixo de isopreno em relação aos voláteis oxigenados (p.ex., acetona e etanol) é uma função da alta volatilidade deste material tal que ele não se acumula no recipiente headspace a -78oC.
[00667] A presença de muitos desses compostos é única para composições de isopreno derivadas de fontes biológicas. Os resultados são representados nas Figs. 87A-87D e resumidos nas Tabelas 7A e 7B.
Tabela 7A: Voláteis traços presentes em gás de escape produzido por E. coli BL21(DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS) após criocaptura a 78oC..
Composto RT (min.) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
Acetaldeído 1,542 4019861 4,841 40,14
Etanol 1,634 10553620 12,708 105,39
Acetona 1,727 7236323 8,714 72,26
2-metil-1,3-butadieno 1,777 10013714 12,058 100,00
1-propanol 1,987 163574 0,197 1,63
Diacetil 2,156 221078 0,266 2,21
2-metil-3-buten-2-ol 2,316 902735 1,087 9,01
2-metil-1-propanol 2,451 446387 0,538 4,46
3-metil-1-butanal 2,7 165162 0,199 1,65
1-butanol 2,791 231738 0,279 2,31
3-metil-3-buten-1-ol 3,514 14851860 17,884 148,32
3-metil-1-butanol 3,557 8458483 10,185 84,47
3-metil-2-buten-1-ol 4,042 18201341 21,917 181,76
3-metil-2-butenal 4,153 1837273 2,212 18,35
Acetato de 3-metilbutila 5,197 196136 0,236 1,96
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Composto RT (min.) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
Acetato de 3-metil-3-buten-1-ila 5,284 652132 0,785 6,51
2-heptanona 5,348 67224 0,081 0,67
2,5-dimetilpirazina 5,591 58029 0,070 0,58
Acetato de 3-metil-2-buten-1-ila 5,676 1686507 2,031 16,84
6-metil-5-hepten-2-ona 6,307 101797 0,123 1,02
2,4,5-trimetilpiridina 6,39 68477 0,082 0,68
2,3,5-trimetilpirazina 6,485 30420 0,037 0,30
(E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno 6,766 848928 1,022 8,48
(Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno 6,864 448810 0,540 4,48
3-metil-2-but-1-enil-butirato 7,294 105356 0,127 1,05
Citronelal 7,756 208092 0,251 2,08
2,3-ciclo-heptenolpiridina 8,98 1119947 1,349 11,18
1 Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto listado.
2 % de área é a área do pico expressa como uma % relativa à área total do pico de todos os compostos.
13 Proporção em % é a área do pico expressa como uma % relativa à área do pico de 2-metil-1,3-butadieno.
Tabela 7B. Traços voláteis presentes no gás de escape produzido por E. coli BL21(DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS) após criocaptura a 196oC.
Composto RT (min.) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
Acetaldeído 1,54 1655710 0,276 0,33
Metanotiol 1,584 173620 0,029 0,03
Etanol 1,631 10259680 1,707 2,03
Acetona 1,722 73089100 12,164 14,43
2-metil-1,3-butadieno 1,771 506349429 84,269 100,00
acetato de metila 1,852 320112 0,053 0,06
1-propanol 1,983 156752 0,026 0,03
Diacetil 2,148 67635 0,011 0,01
2-butanona 2,216 254364 0,042 0,05
2-metil-3-buten-2-ol 2,312 684708 0,114 0,14
Acetato de etila 2,345 2226391 0,371 0,44
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Composto RT (min.) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
2-metil-1-propanol 2,451 187719 0,031 0,04
3-metil-1-butanal 2,696 115723 0,019 0,02
3-metil-2-butanona 2,751 116861 0,019 0,02
1-butanol 2,792 54555 0,009 0,01
2-pentanona 3,034 66520 0,011 0,01
3-metil-3-buten-1-ol 3,516 1123520 0,187 0,22
3-metil-1-butanol 3,561 572836 0,095 0,11
isobutirato de etila 3,861 142056 0,024 0,03
3-metil-2-buten-1-ol 4,048 302558 0,050 0,06
3-metil-2-butenal 4,152 585690 0,097 0,12
acetato de butila 4,502 29665 0,005 0,01
Acetato de 3-metilbutila 5,194 271797 0,045 0,05
Acetato de 3-metil-3-buten-1-ila 5,281 705366 0,117 0,14
Acetato de 3-metil-2-buten-1-ila 5,675 815186 0,136 0,16
(E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno 6,766 207061 0,034 0,04
(Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno 6,863 94294 0,016 0,02
2,3-ciclo-heptenolpiridina 8,983 135104 0,022 0,03
1 Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto listado.
2 % de área é a área do pico expressa como uma % relativa à área total do pico de todos os compostos.
3 Proporção em % é a área do pico expressa como uma % relativa à área do pico de 2-metil-1,3-butadieno.
III. Ausência de isômeros de hidrocarbonetos C5 em isopreno derivado de fermentação.
[00668] A criocaptura do isopreno presente no gás de escape da fermentação foi realizada usando um recipiente headspace de 2 mL resfriado em nitrogênio líquido. O gás de escape (1 L/min.) foi primeiramente passado por um recipiente de 20 mL contendo pelotas de hidróxido de sódio a fim de minimizar o acúmulo de CO2 sólido e em gelo no recipiente de 2 mL (-196oC). Aproximadamente 10L de gás de escape foram passados pelo recipiente, após o que foram aquecidos
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265/343 até -78oC com ventilação, seguido pelo fechamento, de novo, com uma tampa de recipiente nova e análise por GC/MS.
[00669] A análise por GC/MS headspace foi realizada com um sistema Agilent 6890 GC/MS usando uma seringa hermética a gás (gas tight) de 100 pL no modo headspace. Uma coluna Zebron ZB-624 GC/MS (30 m x 250 pm; espessura de filme de 1,40 pm) foi usada para separação de analitos. O injetor automático GC foi equipado com uma seringa gas tight de 100 pL e a altura da agulha foi ajustada para permitir a injeção de uma amostra headspace de 50 pL de um recipiente GC de 2 mL. O método GC/MS utilizou hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção foi mantida a 200oC com uma relação de divisão de 20:1. A temperatura do forno foi mantida a 37oC para os 5 minutos de duração da análise. O detector seletivo de massas Agilent 5793N foi executado no modo de monitoramento de íon único em m/z 55, 66, 67 e 70. Sob essas condições, observou-se que o isopreno foi eluído em 2,966 minutos (figura 88B). Um padrão de isopreno derivado de petróleo (Sigma-Aldrich) também foi analisado usando este método e descobriu-se que contém isômeros de hidrocarbonetos C5 adicionais, que foram eluídos pouco antes ou depois do pico principal e foram quantificados com base na área GC corrigida (figura 88A).
Tabela 8A: Análise GC/MS de isopreno derivado de petróleo
Composto RT (min.) Área GC % de área de hidrocarbonetos C5 totais
2-metil-1-buteno 2,689 18,2 x 103 0,017%
(Z)-2-penteno 2,835 10,6x 104 0,101%
Isopreno 2,966 10,4x 107 99,869%
1,3-ciclopentadieno (CPD) 3,297 12,8 x 103 0,012%
Tabela 8B: Análise GC/MS de isopreno derivado de fermentação (% de hidrocarbonetos C5 totais)
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Composto RT (min.) Área GC corrigida % de hidrocarbonetos C5 totais
Isopreno 2,966 8,1 x 107 100%
[00670] Em um experimento separado, uma mistura padrão de hidrocarbonetos C5 foi analisada para determinar se a resposta do detector era a mesma para cada um dos compostos. Os compostos são 2-metil-1-buteno, 2-metil-1,3-butadieno, (E)-2-penteno, (Z)-2-penteno e (E)-1,3-pentadieno. Neste caso, a análise foi realizada em uma coluna Agilent DB-Petro (100 m x 0,25 mm, 0,50 um espessura de filme) mantida a 50oC por 15 minutos. O método GC/MS utilizou hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção foi mantida a 200oC com uma relação de divisão de 50:1. O detector seletivo de massas Agilent 5793N foi executado no modo de varredura completa de m/z 19 a m/z 250. Sob essas condições, uma concentração de 100 pg/L de cada padrão produziu a mesma resposta de detector dentro do erro experimental.
IV. Composições compreendendo isopreno adsorvido a uma fase sólida.
[00671] O isopreno produzido biologicamente foi adsorvido ao carbono ativado resultando em uma fase sólida contendo 50 a 99,9% de carbono, 0,1% a 50% de isopreno, 0,01% a 5% de água, e quantidades menores (<0,1%) de outros componentes orgânicos voláteis.
[00672] O gás de escape de fermentação foi lançado através de uma serpentina de condensação de cobre mantida a 0oC, seguido por um filtro de dessecação de sílica granulada a fim de remover vapor dágua. O gás de escape desumidificado foi em seguida lançado através de filtros contendo carbono (Koby Jr, Koby Filters, MA) até o ponto em que o surgimento de isopreno foi detectado escape de filtro por GC/MS.
A quantidade de isopreno adsorvido ao cartucho pode ser determinada indiretamente pelo cálculo da concentração no gás de
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267/343 escape, a vazão geral e o surgimento porcentual no decorre do período de coleta. Senão, o isopreno adsorvido pode ser recuperado a partir dos filtros por dessorção térmica, a vácuo ou mediada por solvente.
V. Coleta e análise de isopreno condensado.
[00673] O gás de escape de fermentação é desumidificado e o CO2 removido por filtração através de um adsorvente adequado (por exemplo, ascarite). O fluxo de gás de escape resultante é em seguida lançado através de um condensador resfriado por nitrogênio líquido a fim de condensar os VOCs no fluxo. A vasilha de coleta contém t-butil catecol para inibir o condensado de isopreno resultante. O condensado é analisado por GC/MS e RMN a fim de determinar a pureza usando métodos padrões, tal como aqueles aqui descritos.
VI. Produção de alcoóis prenílicos por fermentação [00674] A análise de gás de escape de uma cepa de E. coli BL21(DE3) expressando uma isopreno sintase de kudzu revelou a presença tanto de isopreno como de 3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol). Os níveis dos dois compostos no gás de escape da fermentação no decorrer da fermentação são mostrados na figura 89 conforme determinado por headspace GC/MS. Os níveis de isoprenol (3-metil-3buten-1-ol, 3-MBA) alcançados foram de quase 10 pg/Lgás de escape neste experimento. Experimentos adicionais produziram níveis de aproximadamente 20 pg/Lgás de escape no gás de escape de fermentação. Exemplo 11: O desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e fermentada em uma cultura alimentada por bateladas [00675] Este Exemplo 11 ilustra o desacoplamento do crescimento celular a partir de ácido mevalônico e produção de isopreno. Condições de Fermentação [00676] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00677] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro
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268/343 de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00678] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00679] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes foram dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00680] A fermentação foi realizada com células de E. coli contendo os plasmídeos pTrcHis2AUpperPathway (também chamado pTrcUpperMVA, figuras 91 e 92A-92C) (carbenicilina a 50 pg/mL) ou o pCL PtrcUpperMVA (também chamado pCL PtrcUpperPathway (figura 26)) (espectinomicina a 50 pg/mL). Para experimentos em que isopreno foi produzido, as células de E. coli também continham o plasmídeo pTrc KKDylklS (canamicina a 50 pg/mL). Estes experimentos foram realizados para monitorar a formação de ácido mevalônico ou isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LA ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptonaextrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, quando medida a 550 nm, ele foi usado para inocular o biorreator.
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269/343 [00681] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A indução foi feita pela adição de IPTG. A concentração do ácido mevalônico no caldo de fermentação foi determinada pela aplicação de amostras tratadas com ácido perclórico (Sigma-Aldrich no 244252) (incubadas com 0,3 M a 4oC por 5 minutos) em uma coluna de HPLC de ácidos orgânicos (BioRad no 125-0140). A concentração foi determinada pela comparação do tamanho do pico do ácido mevalônico do caldo com uma curva de calibração gerada a partir de mevalonolacetona (Sigma-Aldrich no M4667) tratada com ácido perclórico para formar D,L-mevalonato. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
II. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli BL21(DE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de 150 L [00682] Células BL21(DE3) que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em um frasco contendo 45 mL de meio triptona-extrato de levedura e incubadas a 30oC com agitação a 170 rpm por 5 horas. Esta solução foi transferida para um biorreator de 5 L com meio triptona-extrato de levedura e as células foram cultivadas a 30 oC e 27,5 rpm até a cultura atingir uma OD550 de 1,0. Os 5 L de inóculo foram semeados em um biorreator de 150 L contendo 45 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 1,1 mM quando a OD550 atingiu um valor de 10. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 60A. O título de ácido mevalônico aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 61,3 g/L (figura 60B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 60C e a comparação com a
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270/343 figura 60A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 52,5 horas foi de 4,0 kg para 14,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de ácido mevalônico durante a fermentação foi de 34,2%.
III. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli BL21(DE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de15 L [00683] Células BL21(DE3) que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 1,0 mM quando a OD550 atingiu um valor de 10. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 61A. O título de ácido mevalônico aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 53,9 g/L (figura 61B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 61C e a comparação com a figura 61A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 46,6 horas foi de 491 g para 2,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de ácido mevalônico durante a fermentação foi de 28,8%.
IV. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli FM5 expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de15 L [00684] Células FM5 que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi
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271/343 levada à 1,0 mM quando a OD550 atingiu um valor de 30. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 62A. O título de ácido mevalônico aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 23,7 g/L (figura 62B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 62C e a comparação com a figura 62A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 51,2 horas foi de 140 g para 1,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de ácido mevalônico durante a fermentação foi de 15,2%.
V. Produção de isopreno em células de E. coli BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de15 L [00685] Células BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 25 μΜ quando a OD550 atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 190. A concentração de IPTG foi elevada a 100 uM em 38 horas de fermentação. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 63A. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 2,2 g/L (figura 63B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 63C e a comparação com a figura 63A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 54,4 horas foi de 15,9 g para 2,3 kg de glicose utilizada. O rendimento molar
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272/343 do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,53%.
VI. Produção de isopreno em células de sintonização (tuner) de E. coli BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS em uma escala de15 L [00686] Células de sintonização BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 26 μΜ quando a OD550 atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 175. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 64A. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 1,3 g/L (figura 64B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 64C e a comparação com a figura 64A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 48,6 horas foi de 9,9 g para 1,6 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,34%.
VII. Produção de isopreno em células de E. coli MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS em uma escala de15 L [00687] Células MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e
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273/343 cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 24 μΜ quando a OD550 atingiu um valor de 45. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 65A. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 393 mg/L (figura 65B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 65C e a comparação com a figura 65A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 67,4 horas foi de 2,2 g para 520 g de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 0,92%.
VIII. Produção de isopreno em células de E. coli MG1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de 15 L [00688] Células MG1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 30 μΜ quando a OD550 atingiu um valor de 10. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 66A. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 368 mg/L (figura 66B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 66C e a comparação com a figura 66A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 56,7 horas foi de 1,8 g para 531 g de glicose utilizada.
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O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 0,73%.
IX. Produção de isopreno em células de E. coli FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de 15 L [00689] Células FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS que foram cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I foram inoculadas em a frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30oC a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material foi semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG foi levada à 27 μΜ quando a OD550 atingiu um valor de 15. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 67A. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 235 mg/L (figura 67B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 67C e a comparação com a figura 67A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 52,3 horas foi de 1,4 g para 948 g de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação foi de 0,32%.
Exemplo 12: Produção de isopreno durante a fase de crescimento exponencial de E. coli expressando genes da via do mevalonato e fermentada em uma cultura alimentada por bateladas [00690] O Exemplo 12 ilustra a produção de isopreno durante a fase de crescimento exponencial das células.
[00691] Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
[00692] O meio foi gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de
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275/343 ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCl e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00693] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00694] A solução de metal traço modificada 1000X foi gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCl, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCl2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 mícron.
[00695] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli ATCC11303 contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDyIkIS. Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado foi estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37oC. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 5 L.
[00696] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 50 horas foi de 2,0 kg. A indução foi feita pela
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276/343 adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada à 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 uM quando a OD550 atingiu 190. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 99. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumento ao longo da fermentação até um valor final de 1,4 g/L (figura 100). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 50 horas foi de 10,0 g. O perfil de produtividade específica de isopreno ao longo do tempo no biorreator é apresentado na figura 101. O rendimento molar do carbono utilizado que contribuiu para a produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,1%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 0,5%.
Exemplo 13: Modelagem de inflamabilidade e testes de isopreno Resumo de modelagem de inflamabilidade e testes de isopreno [00697] Modelagem de inflamabilidade e experimentos foram realizados para várias misturas de hidrocarboneto/oxigênio/nitrogênio/água/dióxido de carbono. Esta modelagem e testes experimentais tiveram como objetivo definir as curvas de inflamabilidade de isopreno e oxigênio/nitrogênio sob concentrações de monóxido de carbono e vapor especificadas em uma pressão e temperatura fixas. Uma matriz das condições do modelo é apresentada na Tabela 9 e uma matriz dos experimentos realizados é apresentada na Tabela 10.
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Tabela 9. Resumo da Inflamabilidade de Isopreno do Modelo
Séries Temperatura (°C) Pressão (psig) Concentração de Vapor(peso %) Concentração de Dióxido de Carbono(peso. %) Concentração deIsopreno(vol. %) Concentração de Oxigênio(vol. %)
A 40 0 0 0 Variável Variável
B 40 0 4 0 Variável Variável
C 40 0 0 5 Variável Variável
D 40 0 0 10 Variável Variável
E 40 0 0 15 Variável Variável
F 40 0 0 20 Variável Variável
G 40 0 0 30 Variável Variável
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Tabela 10. Resumo de Teste de Inflamabilidade de Isopreno
Número de Série Temperatura (°C) Pressão (psig) Concentração de Vapor (vol. %) Concentração de Isopreno (vol. %) Concentração de Oxigênio (vol. %)
1 40 0 0 Variável Variável
2 40 0 4 Variável Variável
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II. Descrição de modelo de temperatura de chama adiabática calculada (CAFT) [00698] Temperaturas de chamas adiabáticas calculadas (CAFT) junto com uma temperatura de chama limite selecionada para a propagação da combustão foram usadas para determinar a curva envelope de inflamabilidade para o isopreno. O programa computacional usado neste estudo para calcular as temperaturas de chama é o software CEA (Chemical Equilibrium with Applications) do Centro de Pesquisa Glenn da NASA.
[00699] Existem cinco etapas envolvidas na determinação da curva envelope da inflamabilidade usando um modelo de temperatura de chama adiabática para um mecanismo de combustão homogêneo (onde tanto o combustível como o comburente estão no estado gasoso): a seleção dos reagentes desejados, seleção da condição de teste, seleção da temperatura de chama limite, modificação dos reagentes e construção de uma curva envelope de inflamabilidade para cálculos.
[00700] Nesta primeira etapa, de seleção dos reagentes desejados, deve ser tomada uma decisão quanto às espécies de reagentes que estarão presentes no sistema e às quantidades de cada uma. Em muitos casos, os programas computacionais usados para os cálculos têm uma lista de espécies de reagentes e produtos. Se quaisquer dos dados para as espécies a serem estudadas não são encontrados no programa, eles podem ser obtidos a partir de outras fontes tais como as tabelas JANAF ou a partir da internet. No modelo atual, dados para água, nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbono estavam presentes na base de dados do programa. A base de dados do programa não teve isopreno como uma espécie; portanto, a propriedades termodinâmicas são incorporadas manualmente.
[00701] A próxima etapa é para decidir as condições de temperatura e pressão iniciais em que o processo de combustão está ocorrendo.
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Neste modelo, a pressão foi de 1 atmosfera (absoluta) e a temperatura foi de 40°C, o ponto de ebulição do isopreno.
[00702] A temperatura de chama limite para combustão pode ser selecionada com base em princípios teóricos ou determinada experimentalmente. Cada método tem suas próprias limitações.
[00703] Com base em estudos anteriores, as temperaturas de chamas limites de hidrocarbonetos se encaixam no intervalo de 1000 K a 1500 K. Para este modelo, o valor de 1500 K foi selecionado. Esta é a temperatura em que a reação de monóxido de carbono a dióxido de carbono (uma reação altamente exotérmica e que constitui uma proporção significativa da energia da chama) se torna autossustentável. [00704] Uma vez que se tenha decidido sobre a temperatura de chama limite, cálculos de modelo são realizados na mistura de reagentes determinada (concentrações de espécies) e a temperatura de chama adiabática é determinada. Considera-se que a propagação da chama tenha ocorrido apenas se a temperatura for maior que a temperatura de chama limite. A composição de mistura de reagentes é em seguida modificada para criar conjuntos de dados para misturas de propagação e não propagação.
[00705] Este tipo de modelo mostra boa correlação com os limites de inflamabilidade determinados experimentalmente. Regiões fora da curva envelope derivada não são inflamáveis e regiões dentro dela são inflamáveis. O formato da curva envelope forma um nariz. O nariz da curva envelope está relacionado com a concentração limite de oxigênio (CLO) para combustíveis gasosos.
III. Resultados do modelo de temperatura de chama adiabática calculada (CAFT) [00706] Os resultados de modelo CAFT são plotados nas Figs. 68 a 74 para as Séries A a G, respectivamente. As figuras plotam a temperatura de chama adiabática calculada (usando o programa CEA
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280/343 da NASA) como uma função da concentração de combustível (em peso) para várias proporções de oxigênio/nitrogênio (em peso). As partes da curva que estão acima de 1500 K, a temperatura de chama limite selecionada, contêm níveis de combustível suficientes para a propagação da chama. Os resultados podem ser difíceis de interpretar na forma apresentada nas Figs. 68 a 74. Adicionalmente, a forma atual não conduz à comparação com dados experimentais o que é geralmente apresentado em termos de porcentual de volume.
[00707] Usando a Série A como um exemplo, os dados na figura 68 podem serplotados na forma de uma curva envelope de inflamabilidade tradicional. Usando a figura 68 e a leitura através da linha de temperatura de 1500 K na ordenada uma pessoa pode determinar a concentração de combustível para esta temperatura de chama limite pela colocação de uma tangente para a abscissa de cada curva (proporção de oxigênio para nitrogênio) com que ela possua interseção. Esses valores podem em seguida serem tabelados como porcentual de peso de combustível para um determinado porcentual de peso de oxidante (figura 75A). Em seguida, tendo conhecimento sobre a composição do combustível (100% em peso de isopreno) e a composição do oxidante (teor relativo de água, oxigênio e nitrogênio) quantidades molares podem ser estabelecidas.
[00708] A partir dessas quantidades molares concentrações de volume em porcentagem podem ser calculadas. As concentrações em termos de volume porcentual podem em seguida serem plotadas para gerar uma curva envelope de inflamabilidade (figura 75B). A área delimitada pela curva envelope é o intervalo explosível e a área excluída é o intervalo não explosível. O nariz” da curva envelope é a concentração limite de oxigênio. As Figs. 76A e 76B contêm as concentrações de volume calculadas para a curva envelope de inflamabilidade para a Série B gerada a partir dos dados apresentados
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281/343 na figura 69. Uma abordagem similar pode ser usada nos dados apresentados nas Figs. 70-74.
IV. Procedimento e equipamento experimental para testes de inflamabilidade [00709] Testes de inflamabilidade foram conduzidos em um vaso de alta pressão de 4 litros. O vaso era de formato cilíndrico com um diâmetro interno de 15 cm (6) e uma altura interna de 22 cm (8,625). A temperatura do vaso (e os gases dentro dele) foi mantida usando aquecedores externos que foram controlados por um controlador PID. Para evitar perdas de calor, lã cerâmica e isolamento refletivo embrulharam o vaso de pressão. Termopares tipo K foram usados para medir a temperatura do espaço do gás assim como a temperatura do vaso em si. A figura 77 ilustra o vaso de teste.
[00710] Antes de um teste ter sido executado, o vaso foi evacuado e limpo com nitrogênio para garantir que quaisquer gases de testes anteriores fossem removidos. Em seguida, o vaso foi submetido a vácuo. A pressão após isto ter sido feito estava tipicamente em torno de 0,06 bar(a). Devido à limpeza com nitrogênio, assumiu-se que o gás responsável por esta pressão inicial fosse o nitrogênio. Usando pressões parciais, água, isopreno, nitrogênio e oxigênio foram em seguida adicionados nas quantidades apropriadas para obter as condições de teste em questão. Uma pá de mistura acionada magneticamente dentro do vaso garantiu a mistura dos conteúdos gasosos. Os gases foram misturados por cerca de 2 minutos com a pá sendo desligada aproximadamente 1 minuto antes da ignição.
[00711] O dispositivo para iniciar a ignição foi compreendido por uma serpentina de nicromo de 1,5 ohm e uma fonte de tensão AC em um circuito de temporizador. Usando um osciloscópio, determinou-se que 34,4 VAC foram distribuídos ao dispositivo de ignição por 3,2 segundos. Uma corrente máxima de 3,8 amps ocorreu aproximadamente no meio
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282/343 da via do ciclo de ignição. Assim, a potência máxima foi de 131 W e a energia total fornecida no decorrer do ciclo de ignição foi de aproximadamente 210 J.
[00712] Os dados de deflagração foram adquiridos usando um transdutor de pressão Validyne DP215 de relutância variável conectado a um sistema de aquisição de dados. Uma mistura de gás foi considerada como deflagradora se a elevação de pressão houver sido maior que ou igual a 5%.
V. Resultados de testes de inflamabilidade [00713] A primeira série experimental (Série 1) foi executada a 40°C e 0Kpa (0 psig) sem vapor. A execução dos testes em diferentes concentrações de isopreno e oxigênio produziu a curva de inflamabilidade apresentada na figura 78A. Os pontos de dados mostrados nesta curva são apenas aqueles que delineiam a curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados tomados para esta série é mostrada nas Figs. 80A e 80B.
[00714] A figura 78B resume os pontos de dados de explosibilidade mostrados na Fig. 78A. A figura 78C é uma comparação dos dados experimentais com a curva envelope de inflamabilidade predita do modelo CAFT. O modelo coincide muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem ser devido à natureza não adiabática da câmara de teste e limitações do modelo. O modelo considera um horizonte temporal infinito para a reação de oxidação e não leva em conta qualquer limitação cinética da reação.
[00715] Adicionalmente, o modelo é limitado pelo número de espécies químicas em equilíbrio que estão em sua base de dados e assim, pode não predizer apropriadamente espécies pirolíticas. Além disso, a curva envelope de inflamabilidade desenvolvida pelo modelo usa um valor para uma temperatura de chama limite (1.500K). A temperatura de chama limite pode estar em um intervalo de valores de
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1.000K a 1.500K dependendo da espécie química reagente. A natureza complexa de espécies químicas pirolíticas formadas em concentrações de combustível acima do nível de combustível/comburente estequiométrico é uma razão pela qual o modelo pode não predizer com precisão o limite inflamável superior para este sistema.
[00716] A segunda série experimental (Série 2) foi executada a 40°C e 0 psig com uma concentração de vapor fixa de 4%. A execução dos testes em diferentes concentrações de isopreno e oxigênio produziu a curva de inflamabilidade apresentada na figura 79A. Os pontos de dados mostrados nesta curva são apenas aqueles que delineiam a curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados tomados para esta série é mostrada na figura 81. Devido à similaridade entre com os dados na Série 1, apenas os pontos essenciais de limite inflamável inferior, concentração limite de oxigênio e limites inflamáveis superiores foram testados. A adição de 4% de vapor à mistura em teste não alterou significativamente os limites essenciais da curva envelope de inflamabilidade. Deve-se notar que concentrações mais elevadas de vapor/água e ou outras substâncias inertes podem influenciar a curva envelope de inflamabilidade.
[00717] A figura 79B resume os pontos de dados de explosibilidade mostrados na figura 79A. A figura 79C é uma comparação dos dados experimentais com a curva envelope de inflamabilidade predita do modelo CAFT. O modelo coincide muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem ser devido aos mesmos fatores descritos na Série 1.
VI. Cálculo de Limites de Inflamabilidade de Isopreno no Ar sob 3 Atmosferas de Pressão [00718] Os métodos descritos no Exemplo 13, partes I a IV também foram usados para calcular os limites de inflamabilidade de isopreno em uma pressão de sistema absoluta de 3 atmosferas e 40°C. Esses
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284/343 resultados foram comparados àqueles do Exemplo 13, partes I a IV em uma pressão de sistema absoluta de 1 atmosfera e 40°C. A pressão mais elevada foi testada porque a curva envelope de inflamabilidade se expande ou torna-se maior à medida que pressão de sistema inicial é aumentada. O limite de inflamabilidade superior é o mais afetado, seguido pela composição limite de oxigênio. O limite de inflamabilidade inferior é o menos afetado (veja, por exemplo, Bulletin 627 Flammability Characteristics of Combustible Gases e Vapors escrito por Michael G. Zabetakis e publicado pelo antigo US Bureau of Mines (1965), que é por meio deste incorporada como referência em sua totalidade, em particular com relação ao cálculo de limites de inflamabilidade).
[00719] Na figura 82, a temperatura de chama adiabática calculada é plotada como uma função da concentração de isopreno (combustível), expressa em porcentagem de peso do combustível/nitrogênio/oxigênio total, em que a pressão de sistema foi inicialmente de 3 atmosferas. As temperaturas de chama calculadas são muito similares àquelas determinadas inicialmente no sistema de 1 atmosfera (figura 83). Como resultado, quando curvas envelopes de inflamabilidade são geradas usando os dados de inflamabilidade adiabática calculada, as curvas são muito similares (veja as Figs. 84 e 85). Portanto, com base nesses cálculos teóricos, um aumento de pressão de sistema de 1 atmosfera a 3 atmosferas não resulta em um aumento/expansão significativo da curva envelope de inflamabilidade. Se desejado, esses resultados de modelo podem ser validados usando testes experimentais (tal como os testes experimentais aqui descritos em uma pressão de 1 atmosfera).
VII. Resumo de estudos de inflamabilidade [00720] Um modelo de temperatura adiabática calculada foi desenvolvido para a curva envelope de inflamabilidade do sistema isopreno/oxigênio/nitrogênio/água/dióxido de carbono a 40°C e 0 psig.
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O modelo CAFT que foi desenvolvido coincide bem com os dados experimentais gerados pelos testes conduzidos neste trabalho. Os resultados experimentais das Séries 1 e 2 validaram os resultados do modelo das Séries A e B.
Exemplo 14: Produção de isopreno em E. coli expressando M. mazei mevalonato quinase e P.alba isopreno sintase
I. Construção de vetores e cepas que codificam M. mazei mevalonato quinase (MVK) e P.alba isopreno sintase (I) Construção de cepa EWL201 (BL21, Cm-GI1.2-KKDyI) [00721] E. coli BL21 (marca Novagen, EMD Biosciences, Inc.) foi uma cepa de recipiente, transduzida com MCM331 P1 lisato (lisato preparado de acordo com o método descrito em Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.). Os transdutores foram selecionados por espalhamento de células sobre L Agar e 20 ugAd de cloranfenicol. As placas foram incubadas durante a noite a 30°C. A análise de transdutores não mostrou colônias nas placas de controle (água + placa de controle de células para reversão e água e placa de controle de lisato P1 para contaminação de lisato.
[00722] Quatro transdutores foram selecionados e utilizados para inocular 5 mL de L Caldo e 20 vgAd de cloranfenicol. As culturas foram crescidas durante a noite a 30°C com agitação em 200 rpm. Para fazer preparações de DNA genômico de cada transdutor para análise de PCR, 1.5mL de cultura de célula durante a noite foram centrifugados. O pellet celular foi re-suspendido com 400 pL de solução tampão de Resuspensão (20mM Tris, 1mM EDTA, 50mM NaCl, pH 7.5) e 4 pL de RNase, DNase-livre (Roche) foram adicionados. Os tubos foram incubados a 37°C durante 30 minutos seguidos pela adição de 4d 10% SDS e 4ul de 10mg/ml de solução de estoque de proteinase K (SigmaAldrich). Os tubos foram incubados a 37°C durante 1 hora. O lisato celular foi transferido para tubos de 2 ml Phase Lock Light Gel tubes
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286/343 (Eppendorf) e 200pl de cada um dos fenóis saturados de pH7.9 (Ambion Inc.) e clorofórmio foram adicionados. Os tubos foram misturados bem e microcentrifugados durante 5 minutos. Uma segunda extração foi feita com 400 pL de clorofórmio e a camada aquosa foi transferida a um novo tubo de Eppendorf. O DNA genômico foi precipitado pela adição de 1 mL de 100% de etanol e centrifugação durante 5 minutos. O pellet de DNA genômico foi lavado com 1ml de 70% de etanol. O etanol foi removido e o pellet de DNA genômico foi permitido secar pelo ar brevemente. O pellet de DNA genômico foi re-suspendido com 200 pL TE.
[00723] Utilizando Pfu pLtra II DNA polimerase (Stratagene) e 200ng/pl de DNA genômico como amostra, 2 conjuntos diferentes de tubos de reação PCR foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante. Para o conjunto 1, iniciadores MCM130 e GB Cm-Rev (Tabela 11) foram utilizados para garantir que os transdutores foram integrados com sucesso ao lócus attTn7. Os parâmetros de PCR para o conjunto 1 foram 95°C durante 2 minutos (apenas o primeiro ciclo), 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 25 segundos (repetir as etapas 2-4 durante 28 ciclos), 72°C durante 1 minuto. Para o conjunto 2, iniciadores MVD For e MVD Rev (Tabela 11) foram utilizados para garantir que o gi1.2-KKDyI operon integrou apropriadamente. Os parâmetros de PCR para o conjunto 2 foram 95°C durante 2 minutos (apenas o primeiro ciclo), 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 10 segundos (repetir as etapas 2-4 durante 28 ciclos), 72°C durante 1 minuto. A análise de PCR amplicons sobre um 1.2% E-gel (Invitrogen Corp.) mostrou que todos os 4 clones de transdutores foram corrigidos. Um foi selecionado e designado como cepa EWL201.
(ii) Construção de Cepa EWL204 (BL21, loop out -GI1.2-KKDyI) [00724] O marcador cloranfenicol foi enlaçado da cepa EWL201
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287/343 utilizando o plasmídeo pCP20 conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000) (Datsenko et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 97:66406645, 2000). A inativação de etapa única dos genes cromossômicos na Escherichia coli K-12 utilizando produtos de PCR. (Datsenko et al., PNAS, 97: 6640-6645, 2000). As células EWL201 foram cultivadas em L Caldo para a fase de midlog e então lavadas três vezes em água esterilizada congelada. Uma alíquota de 50ul de suspensão de célula foi misturada com 1ul de pCP20 e a mistura de suspensão celular foi eletroporada em uma cuveta de 2mm (Invitrogen Corp.) em 2.5 Volts e 25uFd utilizando um Eletroporador de Pulsor de Gene (Bio-Rad Inc.). 1ml de LB foi adicionado imediatamente às células, transmitidas então a um tubo de polipropileno de 14ml (Sarstedt) com uma tampa de metal. [00725] Permitiu-se que as células se recuperassem através de cultivo durante 1 hora a 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre L Agar e 20ug/ul de cloranfenicol e 50ug/ul de carbenicilina e incubados a 30°C durante a noite. O próximo dia, um único clone foi cultivado em 10ml de L Caldo e 50^g/^l de carbenicillina a 30°C até a fase log anterior. A temperatura da cultura em cultivo foi então deslocada para 42°C durante 2 horas. Diluições em série foram feitas, as células foram então espalhadas sobre as placas de LA (sem seleção de antibiótico) e incubadas durante a noite a 30°C. O próximo dia, 20 colônias foram selecionadas e corrigidas para L Agar (sem antibióticos) e LA e 20ug/ul de placas de cloranfenicol. As placas foram então incubadas durante a noite a 30°C. As células capazes de crescer sobre placas de LA, mas não LA e 20ug/ul de placas de cloranfenicol, foram consideradas para terem o marcador cloranfenicol enlaçado (selecionado um e designado como cepa EWL204).
(iii) Construção de plasmídeo pEWL230 (pTrc P. alba) [00726] O gerador de um gene sintético codificando sintase de isopreno Populus alba (P. alba HGS) foi terceirizado para DNA2.0 Inc.
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288/343 (Menlo Park, CA) com base em seus métodos de otimização de códon para expressão de E. coli. O gene sintético foi clonado personalizado para o plasmídeo pET24a (Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.) e entregue liofilizado (figuras 112, 113A e 113B).
[00727] Uma reação de PCR foi realizada para ampliar a sintase de gene isopreno P. alba (P. alba HGS) utilizando pET24a P. alba HGS como a amostra, iniciadores MCM182 e MCM192 e polimerase de DNA de Herculase II Fusion (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de PCR foram as seguintes: 95°C durante 2 minutos (apenas o primeiro ciclo), 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto, repetir durante 25 ciclos, com adiamento final a 72°C durante 3 minutos. O produto de PCR de sintase de isopreno P. alba foi purificado utilizando O kit QIAquick PCR Purification (Qiagen Inc.).
[00728] O produto de PCR de sintase de isopreno P. alba foi então digerido em uma reação de 20ul contendo 1pl de endonuclease de BspHI (New England Biolabs) com 2pl de 10X NEB Tampão 4. A reação foi incubada durante 2 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado utilizando o Kit QIAquick PCR Purification. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 20ul contendo 1pl de endonuclease de PstI (Roche) com 2pl de 10X Tampão H. A reação foi incubada durante 2 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado utilizando Kit QIAquick PCR Purification (Invitrogen Corp.). O plasmídeo pTrcHis2B foi digerido em uma reação de 20pl contendo 1pl de endonuclease de NcoI (Roche), 1pl de endonuclease de PstI e 2pl de 10X Tampão H. A reação foi incubada durante 2 horas a 37°C. O vetorpTrcHis2B digerido foi purificado de gel utilizando um 1.2% E-gel (Invitrogen Corp.) e extraído utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). (figura 114). Utilizando as extremidades coesivas dos locais de BspHI e NcoI, uma reação de
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289/343 ligação de 20μΙ foi preparada contendo 5μΙ de inserção de sintase de isopreno de P. alba, 2μΙ de vetor pTrc, 1μΙ de T4 DNA ligase (New England Biolabs), 2μ de 10X ligase tampão, e 10μl de ddH2O. A mistura de ligação foi incubada em temperatura ambiente durante 40 minutos. A mistura de litigação foi dessalinizada pela flutuação de um filtro de membrana de nitrocelulose de 0,025μm (Millipore) em uma louça petri de ddH2O e aplicando a mistura de ligação gentilmente do topo do filtro de membrana de nitrocelulose durante 30 minutos a temperatura ambiente. As células MCM446 (ver a Seção II) foram cultivadas em LB para a fase midlog e então lavadas três vezes em água esterilizada gelada. Uma alíquota de 50μl de suspensão celular foi misturada com 5μl de mistura de ligação pTrc P.alba HGS dessalinizada. A mistura de suspensão celular foi eletroporada em uma cuveta de 2mm em 2.5 Volts e 25uFd utilizando um Eletroporador de Pulsor de Gene. 1ml de LB é imediatamente adicionado às células, transferidas então para um tubo de polipropileno de 14ml (Sarstedt) com uma tampa de metal.
[00729] As células foram deixadas recuperando-se por meio de cultivo durante 2 horas em 30°C. Os transformantes foram selecionados sobre L Agar e 50μg/μl de carbenicillina e 10mM de ácido mevalônico incubados a 30°C. O dia seguinte, 6 transformantes foram selecionados e cultivados em 5ml de L Caldo e 50μg/μL de tubos de carbenicillina durante a noite a 30°C. As preparações de Plasmídeo foram realizada nas culturas durante a noite utilizando o Kit de Miniprep de QIA quick (Qiagen). Devido à utilização de células BL21 para propagação de plasmídeos, uma modificação de lavagem de colunas de rotação/spin com solução tampão PB 5X e solução tampão PE 3X foi incorporada ao protocolo do fabricante padrão para alcançar DNA de plasmídeo de alta qualidade. Os plasmídeos foram digeridos com PstI em uma reação de 20 pL para garantir o fragmento linear dimensionado corretamente. Os 6 plasmídeos foram ao tamanho correto e transportados para Quintara
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Biosciences (Berkeley, CA) para sequenciarem com os iniciadores MCM65, MCM66, EL1000 (Tabela 18). Os resultados da sequenciação de DNA mostraram que os 6 plasmídeos estavam corretos. Um plasmídeo foi selecionado designado como plasmídeo EWL230 (figuras 57, 58A e 58B).
(iv) Construção de plasmídeo pEWL244 (pTrc P. alba-mMVK) [00730] Uma reação de PCR foi realizada para ampliar o gene Methanosarcina mazei (M. mazei) MVK utilizando MCM376 com a amostra (ver seção (v) abaixo), iniciadores MCM165 e MCM177 (ver Tabela 18), e Pfu pLtra II Fusion DNA polimerase (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de PCR foram como se segue: 95°C durante 2 minutos (apena o primeiro ciclo), 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 18 segundos, repetir durante 28 ciclos, com extensão final a 72°C durante 1 minuto. O produto de PCR de M. mazei MVK foi purificado utilizando-se o Kit QIAquick PCR Purification (Qiagen Inc.).
[00731] O produto de PCR de M. mazei MVK foi então digerido em uma reação de 40vl contendo 8ul de produto de PCR, 2d de endonuclease de PmeI (New England Biolabs), 4nl de 10X NEB Tampão 4,4 pL de 10X NEB BSA e 22nl de ddH2O. A reação foi incubada durante 3 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado utilizando o Kit QIAquick PCR Purification. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 47 pL contendo 2 pL de endonuclease de NsiI (Roche), 4.7nl de 10X Tampão H e 40 pL de fragmento de M. mazei MVK digerido de PmeI. A reação foi incubada durante 3 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado de gel utilizando um 1.2% E-gel e extraído utilizando o Kit QIA quick Gel Extraction. O plasmídeo EWL230 foi digerido em uma reação de 40;d contendo 10nl de plasmídeo, 2d de endonuclease de PmeI, 4d de 10X NEB Tampão 4, 4nl de 10X NEB BSA e 20nl de ddH2O. A reação
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291/343 foi incubada durante 3 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado utilizando um Kit de purificação de QIA quick. Uma digestão de restrição secundária foi realizada em uma reação de 47 ul contendo 2pl de endonuclease de PstI, 4.7ul de 10X Tampão H, e 40ul de fragmento linear de EWL230 digerido de PmeI. A reação foi incubada durante 3 horas a 37°C. O fragmento de PCR digerido foi então purificado de gel utilizando um 1.2% E-gel e extraído utilizando o Kit de Extração de QIA quick (figura 117). Utilizando as extremidades coesivas compatíveis de NsiI e locais de PstI, uma reação de ligação de 20ul foi preparada contendo 8ul de inserção de M. mazei MVK, 3ul de plasmídeo EWL230, 1pl de T4 DNA ligase, 2pl de 10X ligase tampão e 6pl de ddH2O. A mistura de ligação foi incubada durante a noite a 16°C. No dia seguinte, a mistura de ligação foi dessalinizada pela flutuação de filtro de membrana de nitrocelulose de 0,025pm em uma louça de petri de ddH2O e aplicar a mistura de ligação gentilmente no topo do filtro de membrana de nitrocelulose durante 30 minutos em temperatura ambiente. As células MCM446 foram cultivadas em LB para a fase de midlog e então lavadas três vezes em água esterilizada gelada. Uma alíquota de 50 pL de suspensão celular foi misturada com 5ul de mistura de ligação de pTrc P.alba-mMVK dessalinizada. A mistura de suspensão celular foi eletroporado em uma cuveta de 2mm em 2.5 Volts e 25uFd utilizando um Eletroporador de Pulsor de Gene. 1 mL de LB é imediatamente adicionado às células, então as células são transferidas a um tubo de polipropileno de 14 mL com uma tampa de metal. Permitiuse que as células se recuperassem por meio de cultivo durante 2 horas a 30°C. Transformantes foram selecionados no LA e 50 pg/pL de carbenicillina e 5 mM de placas de ácido mevalônico e incubados a 30°C. No próximo dia, 6 transformantes foram selecionados e cultivados em 5 mL de LB e tubos de carbenicillina de 50pg/pl durante a noite a 30°C. Preparações de plasmídeo foram realizadas nas culturas durante
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292/343 a noite utilizando Kit de Miniprep. rotativo de QIA quick. Devido ao uso de células BL21 para propagação de plasmídeos, uma modificação de lavagem de colunas rotativas com Tampão PB 5X e Tampão PE 3X foi incorporadas ao protocolo do fabricante padrão para alcançar DNA de plasmídeo de alta qualidade. Os plasmídeos foram digeridos com PstI em uma reação de 20 pL para garantir o fragmento linear dimensionado correto. Três dos 6 plasmídeos foram do tamanho correto e transportados para Quintara Biosciences para sequenciação com os iniciadores MCM65, MCM66, EL1000, EL1003 e EL1006 (Tabela 18). Os resultados da sequenciação de DNA mostraram todos os 3 plasmídeos estavam corretos. Um foi selecionado e designado como plasmídeo EWL244 (figuras 118 e 119A e 199B).
(v) Construção do plasmídeo MCM376 - MVK a partir de M. mazei archaeal Inferior em pET200D.
[00732] MVK ORF a partir do operon de via Inferior de M. mazei archaeal (figuras 160A-C; SEQ ID NO:46) foi ampliado de PCR utilizando iniciadores MCM161 e MCM162 (Tabela 18) utilizando a mistura de Invitrogen Platinum HiFi PCR. 45 pL de mix de PCR foi combinado com 1 pL de amostra, 1 pL de cada iniciador a 10 uM, e 2 pL de água. A reação foi ciclada como se segue: 94 DC durante 2:00 minutos; 30 ciclos de 94 DC durante 0:30 minutes, 55 DC durante 0:30 minutos e 68 DC durante 1:15 minutos; e então 72 DC durante 7:00 minutos, e 4 DC até esfriar. 3 pL dessa reação de PCR foi ligado ao plasmídeo de Invitrogen pET200D de acordo com o protocolo do fabricante. 3 pL dessa ligação foi introduzida para células de Invitrogen TOP10, e transformantes foram selecionados no LA/kan50. Um plasmídeo de um transformante foi isolado e a inserção sequenciada, resultando em MCM376 (figuras 131A-C).
(vi) Construção da cepa EWL251 (BL21(DE3), Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK)
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293/343 [00733] As células MCM331 (que contêm construção cromossômica gi1.2KKDyI codificando S. cerevisiae mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase, e IPP isomerase) foram cultivadas em LB para a fase midlog e então lavadas três vezes em água esterilizada gelada. Misturados 50pl de suspensão celular com pl de plasmídeo EWL244. A mistura de suspensão celular foi eletroporada em uma cuveta de 2 mm em 2.5 Volts e 25uFd utilizandose um Eletroporados de Pulsor de Gene. 1 mL de LB é adicionado imediatamente às células e, então, as células foram transferidas a um tubo de polipropileno de 14ml com uma tampa de metal. Permitiu-se que as células se recuperassem por meio de cultivo durante 2 horas a 30°C. Transformantes foram selecionados no LA e 50pg/pl de carbenicillina e 5mM de placas de ácido mevalônico e incubados a 37°C. Uma colônia foi selecionada e designada como cepa EWL251.
(vii) Construção da cepa EWL256 (BL21(DE3), Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK, pCL Superior MVA) [00734] As células EWL251 foram cultivada em LB para a fase midlog e então lavadas três vezes em água esterilizada gelada. Misturou-se 50pl de suspensão celular com 1pl de plasmídeo MCM82 (compreendendo via superior de pCL Ptrc (também conhecido como MVA superior de pCL), codificando E. faecalis mvaE e mvaS). O via superior de pCL Ptrc de Plasmídeo foi construído como descrito no exemplo 8 acima. A mistura de suspensão celular foi eletroporada em uma cuveta de 2mm em 2.5 Volts e 25 pFd utilizando um Eletroporador de Pulsor de Gene. 1ml de LB foi adicionado imediatamente às células. As células foram então transferidas a um tubo de polipropileno de 14ml com uma tampa de metal. Permitiu-se que as células se recuperassem por meio de cultivo durante horas a 30°C. Transformantes foram selecionados em LA e 50pg/pl de carbenicillina e 50pg/pl de placas de espectinomicina e incubados a 37°C. Uma colônia foi selecionada e designada como cepa EWL256.
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Tabela 11 Sequências de Iniciador
Nome do Iniciador Sequência de Iniciador
MCM130 ACCAATTGCACCCGGCAGA (SEQ ID NO: 109)
GB Cm Rev GCTAAAGCGCATGCTCCAGAC (SEQ ID NO:110)
MVD For GACTGGCCTCAGATGAAAGC (SEQ ID NO:111)
MVD Rev CAAACATGTGGCATGGAAAG (SEQ ID NO:112)
MCM182 GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTCTGCAGTTAGCGTTCAAACGGCAGAA (SEQ ID NO:113)
MCM192 CGCATGCATGTCATGAGATGTAGCGTGTCCACCGAAAA (SEQ ID NO:114)
MCM65 ACAATTTCACACAGGAAACAGC (SEQ ID NO:115)
MCM66 CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG (SEQ ID NO:116)
EL1000 GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC (SEQ ID NO:117)
MCM165 GCGAACGATGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGGTAAGATTTACCTG (SEQ ID NO:118)
MCM177 GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTTGC (SEQ ID NO:119)
EL1003 GATAGTAACGGCTGCGCTGCTACC (SEQ ID NO: 1130
EL1006 GACAGCTTATCATCGACTGCACG (SEQ ID NO:121)
MCM161 CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (SEQ ID NO: 122)
MCM162 TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (SEQ ID NO:123)
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295/343 (viii) Construção de MCM442-449:BL21 e BL21(DE3) com FRT-cmRFRT-gi1.x-mKKDyI.
i) Construção de Modelo para recombinação [00735] Cassetes de recombinação com base em FRT, e plasmídeos para integração mediada por Red/ET e loop out do marcador de antibiótico foram obtidos do Gene Bridges GmbH (Alemanha). Procedimentos com estes materiais foram realizadas de acordo com protocolos Bridges Gene. Iniciadores MCM193 e MCM195 foram utilizados para ampliar o cassete de resistência a partir da amostra de FRT-gb2-Cm-FRT utilizando o Kit Stratageno Herculase II Fusion de acordo com o protocolo do fabricante. A reação 50pL foi ciclado da seguinte forma: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos, 55°C, 20 segundos, 72°C, 1 minuto) x 5, (95°C, 20 segundos, 60°C, 20 segundos, 72°C, 1 minuto) x 25, 72°C, há 3 minutos; 4°C até esfriar. O amplicon foi purificado por uma coluna Qiagen PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluído em 30pL EB (Buffer de eluição). DNA foi digerido com NdeI e PciI em uma reação de 20pL com 1x Roche H buffer e BSA 0,5 pL. MCM376 plasmídeo foi digerido em uma reação de 10 pL contendo 1 pL de cada NdeI, Ncol e Roche tampão H. A reação prosseguiu durante a noite a 37°C, e em seguida cortar o DNA foi purificado em colunas Qiagen PCR e eluído em 30 pL EB. O produto da PCR foi ligado em MCM376 em uma reação contendo 1 pL do vetor, 3 pL produto da PCR, 1 pL Roche rápida Ligase Buffer de 2, 5 pL T ampão 1 e Ligase 1 pL. A reação procedeu à temperatura ambiente por três horas e depois foi transformado em 5 pL Invitrogen TOP10 células acordo com o protocolo do fabricante. Transformantes foram selecionados em ágar L (LA) e cloranfenicol (10 mg/mLO) a 37°C durante a noite.
[00736] Colônias transformantes foram plaqueadas por sobre cloranfenicol contendo LA (30 mcg/mL) e canamicina (50 mg/ml) para o
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296/343 armazenamento e enviado para Quintara (Berkeley, CA) para a seqüenciamento. Quatro clones, cada um com os quatro nucleotídeos diferentes no N na cartilha MCM195, foram descobertos terem a seqüência correta para o promotor inserido. Clones foram cultivadas em LB contendo 5mL de cloranfenicol (30 mcg/mL) e canamicina (50 mg/mL) e utilizado para a preparação de DNA plasmidial. Este plasmídeo foi retransformado em TOP10 células e cepas foram congeladas como:
Tabela 12: MCM484-487
MCM484 cmR-gi1.6-MVK(mazei) em pET (clone A1 -3, variável nt A)
MCM485 cmR-gi1.0-MVK(mazei) em pET (clone B4-6, variável nt C)
MCM486 cmR-gi1.2-MVK(mazei) em pET (clone C1-5, variável nt G)
MCM487 cmR-gi1.5-MVK(mazei) em pET (clone C3-3, variável nt T)
ii) Criação de Cepas Alvos de Recombinação MCM349 e MCM441 [00737] O marcador de resistência ao cloranfenicol (CMR) foi extraído de uma cepa MCM331 usando plasmídeo pGB706 (GeneBridges) de acordo com instruções do fabricante. Células MCM331 foram cultivadas até mid-log em LB e lavadas três vezes em água gelada estéril. Uma alíquota de 1 pL de DNA pGB706 foi adicionada a 50 pL de uma suspensão celular e essa mistura foi electroporada em uma cuveta de 2 milímetros a 2,5 volts, 25uFd imediatamente seguido por recuperação em LB 500pL de uma hora, a 30 °C. Transformantes foram selecionados em LB contendo tetraciclina (5 mg/ml) a 30°C. No dia seguinte, um clone foi cultivado a 30°C em LB contendo tetraciclina (5 mg/ml) até visivelmente turva (OD600 ~ 0,5-0,8). Esta cultura foi semeada em LB e cresceu durante a noite a 37°C. Um clone que foi incapaz de crescer em LB contendo cloranfenicol (10 mcg/mL) ou LB contendo tetraciclina (5 mg/mL) foi congelado como MCM348. O plasmídeo MCM356 (pRedET carbencillin; GeneBridges) foi eletroporado como descrito acima e transformantes foram selecionados em LB contendo carbenicilina (50 mcg/mL) a 30°C. Um clone foi cultivado em LB carbenicilina (50 mcg/mL) a 30°C e congelados como MCM349.
[00738] Cepa MCM441 foi criada por eletrotransformação do plasmídeo
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MCM356 em EWL204 como acima.
iii) A recombinação de FRT-CMR-FRT-gi1.x-mMVK em MCM349 e MCM441 [00739] Plasmídeos MCM484-487 foram usados como modelo para a amplificação com iniciadores MCM120 e MCM196 e II Herculase kit Fusion, de acordo com o protocolo do fabricante. Três reações por modelo foram realizadas, com 0, 1 ou DMSO 3pL. As reações de 50pL foram reciclados da seguinte forma: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos; 55°C 20 segundos; 72°C, 1,5 minutos) para cinco ciclos; (95°C, 20 segundos; 60°C 20 segundos; 72°C, 1,5 minutos) para 25 ciclos, 72°C durante 3 minutos e 4°C, durante a noite. As três reações de um determinado modelo foram agrupadas e purificadas em colunas Qiagen PCR e eluídas com 30 mL EB a 60°C. 5pL DNA foi digerido com 1 pL Dpnl em 1x tampão Roche A por 3 horas a 37°C. Este DNA foi, então, microdializada contra o excesso de água por 30 minutos. [00740] As cepas foram cultivadas em LB 5 mL contendo carbenicilina (50 mcg/mL) de estrias fresco em 30°C a uma OD600 de ~ 0,5. 40mm L-arabinose foi adicionado e as culturas foram incubadas a 37°C por 1,5 horas. As células foram colhidas e eletroporado com 3pL de amplicons dialisados acima, e em seguida recuperadas em 500 pL SOC a 37°C por 1,5-3 horas. Os trasformantes foram selecionados em placas LA contendo cloranfenicol (5 mg/mL) a 37°C.
[00741] Clones sensíveis a canamicina foram pesquisados por PCR quanto a inserção do amplicon. Produtos de PCR de clones positivos foram sequenciados para verificar a seqüência DNA inserida. Amplicons foram consistentes com o FRT-gi1.2-yKKDyI em attTn7 em MCM441 e 348 sendo substituídos por FRT-CMR-FRT-gi1.x-mKKDyI (As designações yK mK e referem-se ao mevalonato quinase de Saccharomyces cerevisiae e mazei Methanosarcina respectivamente).
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Tabela 13A: As cepas seguintes foram cultivadas em LB contendo cloranfenicol (5 mg/mL) e congeladas.
ID Cepa Nome Origem Modelo de recombinação de amplicon
MCM442 BL21(DE3) cmR-gi1,6mKKDyI A1, clone 37 (A) MCM349 MCM484
MCM443 BL21(DE3) cmR-gi1,0mKKDyI B4, clone 27 (C ) MCM349 MCM485
MCM444 BL21(DE3) cmR-gi1,2mKKDyI C1, clone 16 (G) MCM349 MCM486
MCM445 BL21(DE3) cmR-gi1,5mKKDyI C3, clone 7 (T) MCM349 MCM487
MCM446 BL21 cmR-gi1,6mKKDyI A1-3 (A) MCM441 MCM484
MCM447 BL21 cmR-gi1,0mKKDyI B4-6 (C ) MCM441 MCM485
MCM448 BL21 cmR-gi1,2mKKDyI C1-5 (G) MCM441 MCM486
MCM449 BL21 cmR-gi1,5mKKDyI C3-3 (T) MCM441 MCM487
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Tabela 13B: Iniciadores
MCM120 AAAGTAGCCGAAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGAT GTTTGATTAAAAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID NO:97)
MCM193 GATATACATATGAATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID NO: 124)
MCM195 GCATGCATGACATGTTTTTTTACCTCCTTTGTTATCCGCTCACAAT TAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATNGTCAAGGGCG CGGCCGCGATCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO: 125)
MCM196 AGGCTCTC AACTCTGACATG'l T TT T Tf CCTCCTTAAGGGTGCAGG CCTATCGCAAATTAGCTTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCGG (SEQ ID NO: 126)
I I. O efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli
expressando genes da via ácido mevalônico e cultivadas em cultura alimentada por batelada na escala de 15 L [00742] Receita média (por litro do meio de fermentação):
[00743] 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSCh * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em dil-hO. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até 0 volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00744] Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
[00745] 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSÜ4 * H2O, 10 g de
NaCI, 1 g de PeSO4 * 7H2O, 1 g de C0CI2 * 6H2O, 1 g de ZnSÜ4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes foram dissolvidos um por vez em dil-hO, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até 0 volume esterilizados por filtração em filtro de 0,22 micron.
[00746] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via superior do mevalonato (MVA) via (pCL PtrcUpper), a via inferior do MVA integrada (gi1,2KKDyl), e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e
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300/343 isopreno sintase de P. alba (pTrcAlba-mMVK). Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em um meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular um biorreator de 15L trazendo o volume inicial para 5L.
i) A produção de isopreno em células de E.coli (EL256) cultivadas em cultura alimentada por batelada sem extrato de levedura de alimentação [00747] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até que as células atingiram a fase estacionária. Após este horário a alimentação de glicose foi diminuída para atender as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante a fermentação de 67 horas foi de 3,9 kg. Indução foi obtida pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG foi levado a 102 mM, quando a densidade óptica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 9. A concentração de IPTG foi elevada para 192 mM quando OD550 atingiu 140. O perfil OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 125A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado utilizando um espectrômetro de massa Hiden. O título de isopreno aumentou no decorrer da fermentação para um valor final de 35,6 g/L (figura 125B). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação horas 67 foi 320,6 g e o curso do tempo de produção é mostrado na figura 125C. O perfil de atividade metabólica, medida pelo TCER, é mostrado na figura 125D. O rendimento molar de carbono utilizada que entrou em produção de isopreno durante a fermentação foi de 17,9%. O rendimento por cento em peso de isopreno a partir da glicose foi de 8,1%.
ii) A produção de isopreno em células de E.coli (EL256) cultivadas em
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301/343 cultura alimentada por batelada com alimentação por extrato de levedura [00748] A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 68 horas foi de 7,1 kg. Um total de 1,06 kg de extrato de levedura também foi alimentado durante a fermentação. Indução foi obtida pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi levada a 208 mM, quando a densidade óptica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 7. A concentração de IPTG foi elevada a 193 mM, quando chegou a OD550 180. O perfil OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrada na figura 126A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinada utilizando um espectrômetro de massa Hiden. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação de um valor máximo de 32,2 g/L (figura 126.oB). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação 68 horas foi 395,5 g e o curso do tempo de produção é mostrado na figura 126C. O tempo de produtividade volumétrica é mostrada na figura 126D e mostra que uma taxa média de 1,1 g/L/hora foi mantida entre 23 e 63 horas. O perfil de atividade metabólica, medida pela CER, é mostrado na figura 126D. O rendimento molar de carbono utilizada que entrou em produção de isopreno durante a fermentação foi de 10,3%. O rendimento por cento em peso de isopreno a partir da glicose foi de 5,2%.
IV. Produção de isopreno a partir de diferentes fontes de carbono em E. coli abrigando a via por ácido mevalônico (MVA) e isopreno sintase (EWL256) [00749] Receita de meio (por litro do meio de fermentação):
[00750] K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato de amônia férrico 0,3 g,(NH4)2SO4 3,2
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302/343 g, extrato de levedura 0,2 g, Solução de Metal Traço Modificada 1000X 1mL. Todos os componentes são adicionados e dissolvido em diH2O. O pH é ajustado para 6,8 com hidróxido de amônio (30%) e trazidos a volume. O meio foi esterilizado por filtração com filtro de 0,22 μ. A fonte de carbono foi adicionada até uma concentração final de 1%. Os antibióticos necessários foram acrescentados após a esterilização e ajuste de pH.
[00751] Solução de metal traço 1000X (por litro do meio de fermentação):
[00752] Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoC2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em diH2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, então q.s. para volume e esterilizado com filtro de 0,22 μ.
i) Preparação de hidrolisado de biomassa AFEX [00753] Palha de milho pré-tratada com AFEX foi hidrolisada para preparar hidrolisado de biomassa contendo tanto xilose, glicose e acetato.
[00754] Palha de milho pré-tratada com AFEX, recebida do Michigan Biotechnology Institute, foi usada. As condições de pré-tratamento foram, umidade 60%, 1:1 carregamento de amônia, e 90°C por 30 minutos, em seguida, seca ao ar. O teor de umidade na palha de milho pré-tratada com AFEX foi 21,27%. Conteúdo de glucano e xilana na palha de milho pré-tratada com AFEX foram de 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente. A enzima utilizada foi acelerase 1000, Grindamyl H121 (Danisco produto xilanase de Aspergillus niger para panificação industrial).
[00755] Para sacarificação, 20 g de palha de milho pré-tratada com AFEX foi adicionado em um balão de 500 ml, juntamente com 5 mL de tampão citrato de sódio 1 M pH 4,8, 2,25 ml de Accellerase 1000, 0,1
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303/343 mL de Grindamyl H121, e 72,65 ml de água DI. O frasco foi colocado em um agitador orbital, e incubado a 50°C por 96 horas.
[00756] Para a análise, uma amostra foi colhida a partir do agitador e analisada utilizando HPLC. O hidrolisado continha 37,2 g/L de glicose e 24,3 g/L de xilose, e 7,6 g/L de oligômeros de glicose e/ou xilose. Além disso, o hidrolisado também contém acetato de 1,17 g/L.
ii) Procedimento Experimental [00757] Um inóculo da cepa de E. coli contendo a via EWL256 MVA e isopreno sintase foi tirada de um frasco congelado e semeado em uma placa de ágar LB contendo caldo de espectinomicina (50 mcg/mL) e carbiniclina (50 mcg/mL) e incubadas a 30°C durante a noite. Uma única colônia foi inoculada em meios contendo glicose TM3, xilose, glicerol, acetato ou biomassa como única fonte de carbono e cresceu durante a noite a 30°C. As células crescidas em acetato atingiram uma densidade óptica significativamente menor. Células cultivadas em glicose, glicerol, hidrolisado de biomassa, ou acetato foram diluídos em 20 mL de meio TM3 contendo as fontes de carbono para chegar a respectiva densidade óptica entre 0,1 medido em 600nm. Um controle negativo que não continha qualquer fonte de carbono foi elaborado a partir da cultura de glicose durante a noite. Um experimento foi realizado em separado com a glicose e xilose, em que as culturas foram diluídas a uma densidade óptica de 0,05. Todas as condições de cultura (com exceção de acetato e glicerol) foram testadas em duplicatas e os resultados apresentados são a média entre essas culturas. A produção de isopreno foi induzida com 200 μ M IPTG desde o início do experimento. Os frascos foram incubados a 30°C em agitador orbital (200 rpm) e o crescimento foi seguido pela medição da densidade óptica. Após as culturas de glicose alimentadas atingirem a uma densidade óptica de aproximadamente 0,4, as amostras foram analisadas para a produção de isopreno de todas as fontes de carbono testadas a cada hora durante três horas.
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Amostras de 100 μ L foram transferidas em duplicata para 2 frascos de vidro mL, lacrados e incubados por 30 min. a 30°C. As bactérias foram então mortas por calor de incubação a 80°C por 8 minutos. A quantidade de isopreno produzida foi medida utilizando GC-MS e produtividade específica (μ g/L * h) foi calculada.
iii) Resultados [00758] Uma significativa produção de isopreno pode ser demonstrada durante o crescimento em todas as fontes de carbono testadas. Estas fontes de carbono são exemplos de alcoóis comuns, ácidos orgânicos, açúcares contendo 5 ou 6 unidades de carbono (C5 ou C6) e hidrolisado de biomassa.
[00759] A taxa de crescimento inicial em hidrolisado de biomassa foi comparável à taxa de crescimento em glicose (figura 127A). A produtividade específica inicial durante o crescimento em hidrolisado de biomassa foi significativamente maior que durante o crescimento em glicose. Isso demonstra que o hidrolisado de biomassa pode ser usado como uma eficiente fonte de carbono para a produção de isopreno. A produtividade específica diminuiu após 255 minutos de crescimento em hidrolisado de biomassa (figura 127B). A bactéria teve uma taxa de crescimento mais lento com a xilose como única fonte de carbono, quando comparado à glicose (figura 127C), mas uma produtividade significativa de isopreno específico foi medida (figura 127D). Isso mostra que ambos os açúcares C5 e C6 podem ser utilizados para a produção de isopreno pela via do ácido mevalonato.
[00760] Surpreendentemente, as bactérias cultivadas em acetato como única fonte de carbono teve uma produtividade específica de isopreno, aproximadamente o dobro durante o crescimento com glicose (figura 127A). As bactérias cresceram mais lentamente em acetato, quando comparado à glicose (figura 127B), mas o experimento realizado demonstra que o acetato também pode ser usado como fonte
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305/343 de carbono para a produção de isopreno. Acetato também esteve presente no hidrolisado de biomassa medido por HPLC.
[00761] As bactérias cresceram bem com glicerol como única fonte de carbono (figura 127A) e uma significativa produção de isopreno foi demonstrado (figura 127B). Isso mostra que álcool comum também podem ser usados como fontes de carbono para a produção de isopreno pela via do ácido mevalonato.
Exemplo 15: Expressão de isopreno-sintase de planta em Streptomyces sp.
[00762] O gene para isopreno sintase Kudzu foi obtido a partir do plasmídeo pJ201: 19.813. O plasmídeo PJ201: 19813 codifica isopreno sintase de Pueraia lobata (Kudzu planta) e foi códon-otimizado para Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, palustris Rhodopseudomonas e Corynebacterium (figuras 137A-137C (SEQ ID NO: 137)). A digestão do plasmídeo pJ201:19813 com as enzimas de restrição NdeI e BamHI liberaram o gene iso19813 que estava ligado no pUWL201PW de vetor do tipo ponte (shuttle vector) Streptomyces-E.coli (Doumith et al., Mol. Gen. Genet. 264: 477 a 485, 2000; figura 129) até gerar o pUWL201_iso. A clonagem bem sucedida foi verificada por análise de restrição de pUWL201_iso. Expressão da sintase iso19813 isopreno estava sob controle do promotor-erm que permite a expressão constitutiva em espécies de estreptomicetos, mas não para expressão em E. coli.
[00763] PUWL201PW (sem inserção) e pUWL201_iso foram introduzidos em Streptomyces albus J1074 (Sanchez et al. Chem. Biol. 9:519-531,2002) por transformação de protoplastos, como descrito por Hopwood et al., The John Innes foundation, Norwich, 1985.
[00764] Uma alíquota de 200 pL de suspensões de protoplastos foi transformada com 1,9 ou 2,9 mg pUWL201PW pUWL201_iso mg. Após a incubação durante a noite a 28°C sobre placas Agar R5 não seletivas,
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306/343 transformantes positivos foram selecionados por incubação adicional por 4 dias em Agar de recobrimento R3 contendo Tioestreptona (250 mg/ml). Transformantes Tioestreptona resistentes foram examinados quanto a presença dos plasmídeos-pUWL pela preparação do plasmídeo usando Plasmid Mini Kit (Qiagen). O DNA plasmidial preparado foi reintroduzido em E. coli DH5 para gerar uma quantidade suficiente de DNA plasmídeo a ser analisados por análise de restrição. Transformantes positivos foram selecionados com ampicilina contendo placas Agar- L e análise de inserção foi feita por digestão do DNA plasmidial com endonucleases NdeI e BamHI. A isopreno sintase foi identificada como um fragmento de 1,7 kb em isoclones positivos pUWL201, embora nas cepas controle (pUWL201PW) nenhum tal fragmento foi observado.
[00765] Cepas do tipo selvagem e transformantes de S. albus contendo plasmídeo controle pUWL201PW ou isopreno sintase que codifica pUWL201_ iso foram analisados para a formação de isopreno. Cepas foram cultivadas em duplicata em meio sólido (ágar de caldo tripticase de soja, TSB, 2,5 mL) na presença ou ausência de Tioestreptona (200 mg/mL) e incubados por quatro dias a 28°C em frascos com espaço do tipo ‘headspace’ selados (volume total 20 mL). 500 μΙ de amostras de ‘headspace’ (medições no ponto terminal) foram analisadas por GC-MS em modo-SIM e isopreno foi identificado de acordo com as referências de tempo de medição e de massas moleculares (67 m/z). O isopreno presente nas amostras de headspace’ foi quantificado através das curvas de calibração geradas anteriormente. Embora o S.albus tipo selvagem e cepas de controle portadoras de pUWL201PW produziram isopreno em concentrações ligeiramente maiores que as do limite de detecção, (0,04-0,07 ppm), S. albus abrigando pUWL201_iso produziu isopreno em pelo menos dez vezes mais comparado aos controles (0,75 ppm; figura 130 ). Os resultados demonstram a expressão bem
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307/343 sucedida de isopreno sintase derivada de plantas em um organismo procariótico do grupo Actinomycetes.
Exemplo 16: A produção de isopreno ou mevalonato a partir de ácidos graxos ou óleo de palma em E. coli fadR ATOC LS5218 contendo as vias superior ou presente e inferior Ácido Mevalônico mais isopreno sintase kudzu.
[00766] Escherichia coli fadR ATOC cepa LS5218 (no 6966) foi obtido a partir do Centro de stock Coli genética. FadR codifica um repressor de transcrição que regula negativamente a expressão de genes que codificam enzimas de degradação de ácidos graxos (Campbell et al., J. Bacteriol 183:.. 5982-5990, 2001). ATOC é um regulador de resposta em um sistema de dois componentes de regulamentação em que regula o metabolismo Atos acetolactato. A cepa fadR ATOC permite expressão constitutiva dos genes de degradação de ácidos graxos e incorpora ácidos graxos de cadeia longa nos poliidroxialcanoatos com extensão de cadeia longa. Quando o óleo de palma é usado como fonte de carbono para qualquer mevalonato ou produção de isopreno, o óleo de palma foi convertida em glicerol mais ácido graxo. Métodos para isso são bem conhecidos na arte, e isso pode ser feito tanto enzimaticamente por incubação com uma lipase (por exemplo pâncreas porcino lipase, lípase Candida rugosa, ou outras lipases similar) ou quimicamente por saponificação com uma base como o hidróxido de sódio.
i) a E. coli estirpe fadR ATOC expressando a rota do ácido superior Mevalônico [00767] A cepa WW4 foi criada por eletroporação de pCLpTrcUpperPathway em LS5218 usando métodos padrões (Sambrooke et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, 1989). A incorporação do plasmídeo foi demonstrada pela produção de ácido mevalônico (MVA), quando as
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308/343 células foram cultivadas em meio suplementado com TM3 ou ácido graxo C12 (FA) ou óleo de palma como fonte de carbono. Para demonstrar a produção de MVA por WW4 de ácidos graxos, as células de uma cultura durante a noite foram diluídas 1-100 em 5 mL de meio modificado TM3 (TM3 sem extrato de levedura), suplementado com 0,25% C12 FA (Sigma cat no L9755). O primeiro sinal da produção MVA (24 mg/L) foi aparente após incubação durante a noite a 30°C da cultura IPTG induzida. A produção aumentou ao longo de três dias com o nível final de 194 mg/L de MVA produzido. Para demonstrar a produção de MVA por WW4 de óleo, células de uma cultura durante a noite foram diluídas em 1-100 em meio TM3 modificado suplementado com 200 mg de óleo de palma digerido por 5 mL de meio TM3. O primeiro sinal de produção de MVA (50 mg/L) foi aparente após incubação durante a noite da cultura induzida por IPTG a 30°C. A produção aumentou durante três dias com um nível final de 500 mg/L de MVA produzido.
ii) Cepa E. coli fadR ATOC expressando a via superior e inferior de MVA mais isopreno sintase kudzu [00768] A cepa de Escherichia coli WW4 (LS5218 fadR ATOC pCLpTrcUpperPathway) foi transformada com pMCM118 [pTrcKKDyIkIS] para produzir WW10. A incorporação do plasmídeo foi comprovada por indícios de produção de isopreno, quando a cepa foi cultivada em TM3 e glicose e induzida com IPTG (100, 300, ou 900 mm). A cepa foi relativamente sensível ao IPTG e mostrou um defeito de crescimento significativo, mesmo a 100 mM IPTG. Estes resultados são mostrados na figura 128A.
[00769] Para testar a produção de isopreno a partir do ácido dodecanóico, WW10 foi cultivada durante a noite em L contendo caldo de espectinomicina (50 mcg/ml) e canamicina (50 mg/ml) em 37C com agitação a 200 rpm. As células foram lavadas com meio TM3 modificado por centrifugação e ressuspensão em seu volume de cultura original
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309/343 com este meio. As células lavadas e ressuspensas na cultura inicial foram diluídas 1 a 100 e de 1 a 10 em 5 mL de meio TM3 modificado contendo 0,125% de ácidos graxos C12 (Sigma cat no L9755).
[00770] Para demonstrar a produção de mevalonato a partir de óleo de palma, o óleo foi pré-digerido com lipase a 37°C e 250 rpm durante vários dias para liberar os ácidos graxos (evidência de hidrólise foi julgado pela espuma formada quando os tubos foram agitados).
[00771] Além disso, uma cultura foi criada diluindo as células lavadas com 1 a 10 em média TM3 modificado contido em tubos de ensaio com óleo de palma. Um tubo adicional foi instituído pela adição de C12FA 0,125% a o restante (2,5 mL) das células lavadas, sem diluição (bioconversão). Após 3,75 horas de crescimento a 30°C com agitação a 250 rpm todas as culturas foram induzidas pela adição de 50 mM IPTG. Incubação foi continuada por 4 horas depois do que 200 mL de cada uma das culturas foi ensaiada para a acumulação de isopreno, com um teor modificado de ‘headspace’ (1 acúmulo de hora a 30°C com agitação a 500 rpm). Um ensaio de isopreno adicional foi conduzido por uma incubação de 12 horas o bloco de vidro de ensaio antes da análise GCMS. De incubação das culturas foi induzida continuou durante a noite e 200 mL alíquotas foram novamente testadas para a produção de isopreno (1 hora, 30 graus, a 500 rpm em agitador da Shel-Lab) na manhã seguinte. A análise dessas culturas mostrou a produção de níveis significativos de isopreno. Os maiores níveis de isopreno foram observados na cultura que foi semeado em 10/01 diluição da cultura durante a noite inicial, após ter sido induzida e incubadas durante a noite. Este resultado sugere que essa cultura continuou a crescer e aumento da densidade celular. Estes resultados são mostrados na figura 128B. Densidade celular não pode ser medida diretamente, porque a suspensão de ácidos graxos tinha uma aparência turva. Densidade das células dessa cultura foi, portanto, determinada por plaqueamento de uma
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310/343 alíquota da cultura e mostrou 8X107 unidades formadoras de colônia. Isto corresponde aproximadamente a um OD600 de 0,1. No entanto, esta cultura desde a produção de isopreno significativas; não isopreno é observado para as cepas semelhantes, sem a via descrita no exemplo. Exemplo 17: Melhoria da produção de isopreno pela expressão constitutiva de ybhE em E. coli.
[00772] Este exemplo mostra produção de isopreno em uma cepa expressando constitutivamente ybhE (PGL) em comparação com uma cepa de controle com ybhE tipo selvagem. O ybhE gene (PGL) codifica uma 6-fosfonogluconolactonase que suprime a gluconilação póstranslacional das proteínas heterologamente expressas e produz ao mesmo tempo em que melhora a produção de biomassa e fluxo através da via pentoses fosfato (Aon et al. Applied and Environmental Microbiology, 74(4): 950-958, 2008).
[00773] A cepa BL21 de E. coli produzindo isopreno (EWL256) foi construída com expressão constitutiva do gene ybhE (codificando E. coli 6-fosfogluconolactonase) em um plasmídeo de replicação pBBR1MCS5 (Gentamicina) (obtido do Dr. K. Peterson, Louisiana State University).
[00774] Cassetes de recombinação com base em FRT, e plasmídeos para integração mediada por Red/ET e loop out do marcador de antibiótico foram obtidos do Gene Bridges GmbH (Alemanha). Os procedimentos utilizando esses materiais foram executados de acordo com os protocolos do Gene Bridges. Iniciadores Pgl-F e PglGI1.5-R foram utilizados para ampliar o cassete de resistência a partir da amostra de FRT-gb2-Cm-FRT utilizando o Kit Stratageno Herculase II Fusion de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de PCR (50 pL de volume final) conteve: 5 pL de tampão, 1 pL de DNA de amostra (FRT-gb2-Cm-F da Gene Bridges), 10 pmols de cada iniciador, e 1.5 pL de mistura de 25mM dNTP, feito para 50 pL com dH2Ü. A reação foi ciclada como se segue: 1 x 2 minutos, 95°C então 30 ciclos de (30
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311/343 segundos a 95°C; 30 segundos a 63°C; 3 minutos a 72°C).
[00775] O produto de PCR resultante foi purificado utilizando o kit de purificação de PCR de QiaQick (Qiagen) e eletroporado em células de MG1655 eletrocompetentes abrigando o plasmídeo contento recombinase de pRed-ET como se segue. As células foram preparadas pelo cultivo em 5 mLs de L caldo para e 0D600~0.6 a 30°C. As células foram induzidas para expressão de recombinase pela adição de 4% de arabinose e permitidas a cultivarem durante 30 minutos a 30°C seguidos por 30 minutos de cultivo em 37°C. Uma alíquota de 1.5 mLs das cédulas foi lavada 3-4 vezes em dH2O gelada. O pellet final de célula foi ressuspenso em 40 pL de dH2O gelada e 2-5 pL do produto de PCR foi adicionado. A eletroporação foi executada em cuvetas de espaço de 1-mm, em 1.3 kV em um Eletroporador de Pulsor de Gene (Bio-Rad Inc.). As células foram recuperadas durante 1-2 horas a 30°C e plantadas no L Agar contendo cloranfenicol (5 pg/mL). Cinco transformantes foram analisados por PCR e a sequenciação utilizando iniciadores acompanhando o local de integração (2 conjuntos de iniciador: pgl e 49 rev e 3' EcoRV-pglparada; Fundo Pgb2 e Topo GB’s CMP (946)). Um transformante correto foi selecionado e essa cepa foi designada MG1655 GI1,5-pgl::CMP.
[00776] O DNA cromossômico de MG1655 GI1.5-pgl::CMP foi utilizado como amostra para gerar um fragmento de PCR contendo a construção de FRT-CMR-FRT-GI1.5 - ybhE. Essa construção foi clonada para pBBR1M CS5(Gentamicina) como se segue. O fragmento, adiante referido como CMP -GI1.5-pgl, foi ampliado utilizando o 5’ iniciador Pglconfirm-F (SEQ ID NO: 141) e 3’ iniciador 3' EcoRVpglparada (SEQ ID NO:142). O fragmento resultante foi clonado utilizando o kit de Clonagem Invitrogen TOPO-Blunt para o vetor de plasmídeo pCR-Blunt II-TOPO como sugerido do fabricante. O fragmento NsiI abrigando o fragmento CMP-GI1.5-pgl foi clonado no
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312/343 local de Pstl do pBBR1MCS5 (Gentamicina). Uma reação de ligação de 20μΙ foi preparada contendo 5μΙ de inserção de CMP-GI1.5-pgl, 2μΙ de vetor de pBBR1MCS5 (Gentamicin), 1μΙ de T4 DNA ligase (New England Biolabs), 2μΙ de 10X ligase tampão, e 10μΙ de ddPUO. A mistura de ligação foi incubada em temperatura ambiente durante 40 minutos então 2-4 pL foram eletroporados em células Top10 eletrocompetentes (Invitrogen) utilizando os parâmetros revelados acima. Transformantes foram selecionado em L Agar contendo 10 pg/ml de cloranfenicol e 5 pg/ml de Gentamicina. A sequência do clone selecionado foi determinada utilizando-se um número de iniciadores descrito acima bem como com ο T3 em casa e iniciadores Reverse providos pela Sequetech, CA. Esse plasmídeo foi designado pBBRCMPGI1.5-pgl (figuras 135A-B e SEQ ID NO: 136).
[00777] O Plásmideo pBBRCMPGI1.5-pgl foi eletroporado em EWL256, conforme descrito aqui e transformantes foram emplacados em L Agar contendo cloranfenicol (10 pg/mL), Gentamicina (5 pg/mL), espectinomicina (50 pg/mL) e carbenicillina (50 pg/mL). Uma transformante foi selecionado e designado RM11608-2.
Iniciadores:
Pgl-F
5’ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTA AAGGGCGGCCGC-3’ (SEQ ID NO: 129)
PglGI1.5-R
5’GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAA ACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAA GGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’ (SEQ ID NO: 130)
3' EcoRV-pglstop: 5’-CTT GAT ATC ΤΤΛ GTG TGC GTT Λ AC CAC CAC (SEQ ÍD NO:I31)
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313/343 pgl +49 rev: CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (SEQ ID NO: 132)
Bottom Pgb2: GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (SEQ ID NO: 133)
Top GB’s CMP (94ft): ACTGAAACGTTTTCATCGCTC (SEQ ID NO: 134)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’ (SEQ ID NO: 135)
i) Análise em pequena escala [00778] Receita de meio (meio de fermentação por litro):
[00779] K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amônio férrico 0.3 g, (NH4)2SO4 3.2 g, extrato de fermento 1 g, 1000X Solução de metais de rastreamento 1 ml. Todos os componente foram adicionado juntos e dissolvidos em diH2O. O pH foi ajustado para 6.8 com hidróxido de amônio (30%) e trazido para o volume. O meio foi esterilizado por filtragem com um filtro micron 0.22. Glicose 5.0 g e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
[00780] Solução de metal traço 1000X (por litro do meio de fermentação):
[00781] Ácido Cítrico *H2O 40g, MnSO4 *H2O 30g, NaCl 10g, PeSO4 * 7H2O 1g, Cod2 * 6H2O 1g, ZnSO4 * 7H2O 1g, CuSO4 * 5H2O 100mg, H3BO3100mg, NaMoO4 * 2H2O 100mg. Cada componente é dissolvido um cada vez em diH2O. O pH é ajustado para 3.0 com HCI/NaOH, e então a solução é trazida para volume e esterilizado por filtragem com um filtro 0,22 micron.
a) Procedimento Experimental [00782] A produção de isopreno foi analisada pelo cultivo de cepas em um Cellerator™ da MicroReactor Technologies, Inc. O volume em funcionamento em cada um dos 24 compartimentos foi de 4,5 mL. A temperatura foi mantida a 30°C, 0 ponto de ajuste do pH foi 7,0, 0 ponto de ajuste do fluxo de oxigênio foi 20 seem e a taxa de agitação foi 800
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314/343 rpm. Uma inoculação de cepa E. coli tida a partir de um frasco congelado foi listrada em uma placa de Agar de caldo LB (com antibióticos) e incubada em 30°C. Uma única colônia foi inoculada para o meio com antibióticos e cultivo durante a noite. A bactéria foi diluída em 4,5 mL de meio com antibióticos para atingir uma densidade óptica de 0,05 medido em 550 nm.
[00783] Análise sem gás de isopreno foi realizada utilizando um ensaio de headspace de espectrômetro de massa de cromatografia a gás (GC-MS) (Agilent). A preparação de amostra foi como se segue: 100 L de caldo inteira foi colocado em um frasco de GC selado e incubado a 30°C durante um período fixo de 30 minutos. Segundo uma etapa de morte por calor, consistindo em incubação a 70°C durante 5 minutos, a amostra foi carregada no GC.
[00784] Densidade óptica (OD) em um comprimento de onda de 550 nm foi obtida utilizando um leitor de micro placa (Spectramax) durante o curso do funcionamento. A produtividade específica foi obtida pela divisão da concentração de isopreno (pg/L) bela leitura de OD e o tempo (hora).
[00785] As duas cepas EWL256 e RM11608-2 foram acessadas a 200 e 400 uM de níveis de indução de IPTG. As amostras foram analisadas para a produção de isopreno e cultivo de célula (OD550) em 1, 2.5, 4.75 e 8 horas após a indução. Amostras foram feitas em duplicata.
b) Resultados [00786] O experimento demonstrou que em 2 concentrações diferentes de IPTG a cepa expressando o ybhE (pgl) teve uma aumento dramático de 2-3 vezes na produtividade específica do isopreno comparada à cepa de controle.
ii) A fermentação de Isopreno de E. coli expressando M. mazei mevalonato quinase, sintase de isopreno de P. alba e expressão
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315/343 excessiva de pgl (RHM 111608-2) e cultivo em cultura de alimentação em lotes na escala 15-L.
Receita de meio (meio de fermentação por litro):
K2HPO4 a 7,5 g, MgSO4 * 7H2O a 2 g, mono-hidrato de ácido cítrico a 2 g, citrato de amônio férrico a 0,3 g, extrato de levedura a 0,5 g, 1 ml de solução de Metal Traço Modificada 1.000X. A totalidade dos componentes foi adicionada em conjunto e dissolvida em diH2O. Essa solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado a 7,0 com hidróxido de amônia (30%) e q.s. até o volume. 10 g de glicose, tiamina * HCl a 0,1 g e antibióticos foram adicionados após esterilização e ajuste do pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1.000X [00787] Ácidos cítricos * H2O a 40 g, MnSO4 * H2O a 30 g, NaCl a 10 g, FeSO4 * 7H2O a 1 g, CoCl2 * 6H2O a 1 g, ZnSO4* 7H2O a 1 g, CuSO4 * 5H2O a 100 mg, H3BO3 a 100 mg, NaMoO4 * 2H2O a 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume e filtragem esterilizada com um filtro de 0,22 mícron.
[00788] A fermentação foi realizada em um biorreator de 15-L com células BL21 (DE3) E. coli contendo a via de ácido mevalônico superior (MVA) (pCL Superior), a via de MVA inferior integrado (gi1.2KKDyI), alta expressão de mevalonato quinase a partir de M. mazei e sintase de isopreno a partir de P. alba (pTrcAlba-mMVK), e alta expressão se E. coli pgl (pBBR-pgl). Este experimento foi executado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose em um pH de fermentação desejado 7.0 e 34°C de temperatura. Um frasco congelado da cepa de E. coli foi descongelado e inoculado no meio de extrato de fermento de triptona. Depois a inoculação cresceu para OD 1.0, medido em 550 nm, 500 mL foi utilizado para inocular um biorreator de 15-L trazendo o volume inicial para 5-L.
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316/343 [00789] A glicose foi alimentada em uma taxa exponencial até as células atingirem uma fase estacionária. Depois desse período a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante as 40 horas (59 horas) de fermentação foi 3.1 kg (4.2 kg nas 59 horas). A indução foi alcançada pela adição de IPTG. A concentração de IPTG foi trazida para 110 uM quando a densidade óptica em 550 nm (OD550) alcançou um valor de 4. A concentração de IPTG foi elevada para 192 uM quando OD550 atingiu 150. O perfil de OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 136A. O nível de isopreno no gás liberado a partir do biorreator foi determinado utilizando um espectrômetro de massa Hiden. A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso de fermentação para um valor máximo de 33.2 g/L em 40 horas (48.6 g/L em 59 horas) (figura 136B). A titulação de isopreno aumentou ao longo do curso da fermentação a um valor máximo de 40,0 g/L em 40 horas (60.5 g/L em 59 horas) (figura 136C). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 40horas (59-horas) foi 281.3 g (451.0 g em 59 horas) e o curso de tempo da produção é mostrado na figura 136D. O curso de tempo da produtividade volumétrica é mostrado na figura 136E e mostra que uma taxa média de 1.0 g/L/hora foi mantida entre 0 e 40 horas (1.4 g/L/hora entre 19 e 59 horas). O perfil de atividade metabólica, como medido por CER, é mostrado na figura 136F. O rendimento molar do carbono utilizado que foi para a produção de isopreno durante a fermentação foi 19.6% em 40 horas (23.6% em 59 horas). O rendimento de porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi 8.9% em 40 horas (10.7% em 59 horas).
Exemplo 18. A polimerização de isopreno
Preparação de amostras para a polimerização de isopreno (a) Preparação da Solução de metal traço 1000X modificada:
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317/343 [00790] Cada um dos seguintes componentes é dissolvido um por vez em Di H2O: Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. O pH foi ajustado para 3,0 com HCl/NaOH, então qs até o volume e esterilizado por filtragem com um filtro 0,22 mícron.
(B) Preparação de meio de fermentação:
[00791] Cada litro de meio de fermentação continha 7,5 g de K2HPO4, 2 g de MgSO4 * 7H2O, 2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de amônio férrico, 0,5 g de extrato de levedura, e 1 ml de solução com traços de Metal modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em DI H2O. Esta solução foi submetida à autoclave. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e quantidade suficiente para o volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCl, e antibióticos foram adicionados após a esterilização e o ajuste de pH.
(c) Coleta de amostras isopreno par purificação e polimerização: [00792] Isopreno foi coletado por adsorção em carvão ativado, mediante passagem da exaustão de fermentação através de coletores de carvão ativado dispostos em paralelo em um coletor de exaustão.
(d) Preparação da amostra A de polimerização de isopreno a partir da glicose usando E. coli [00793] A fermentação foi realizada em pH 7,0 e 30°C em um biorreator com 15 L-BL21 (DE3) células de E. coli contendo o PtrcUpperMVA PCL e plasmídeos pTrc KKDyIkIS. Um inóculo de cepas de E. coli tomadas a partir de um frasco congelado foi semeada uma placa de Agar caldo LB (com antibióticos) e incubadas a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em meio triptona-extrato de levedura. Após o inóculo cresceu para 1,0 OD, medidos a 550 nm, 500 mL foi usada para inocular um biorreator de 5 L.
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318/343 [00794] Glicose foi alimentada a uma taxa exponencial até que as células atingiram a fase estacionária. Após este horário a alimentação de glicose foi diminuída para atender as demandas metabólicas. A quantidade total de glicose entregue ao biorreator durante a fermentação de 54 horas foi de 3,7 kg. Indução foi obtida pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG). A concentração de IPTG foi trazida a 25 μΜ, quando a densidade óptica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 10. A concentração de IPTG foi elevada a 50 μΜ, quando a OD550 chegou a 190. A concentração de IPTG foi elevada para 100 μΜ em 38 horas de fermentação. O perfil OD550 dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrado na figura 138. O título de isopreno aumentou no decorrer da fermentação para um valor final de
2,2 g/L (figura 139). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação horas 54 foi de 15,9 g e do curso do tempo de produção é mostrado na figura 140. O rendimento molar de carbono utilizada que entrou em produção de isopreno durante a fermentação foi de 1,53%. (Veja as figuras 138-140).
(e) Preparação de polimerização de isopreno Amostra B a partir de glicose e extrato de levedura utilizando E. coli [00795] A formação de isopreno a partir da glicose e extrato de levedura foi realizada em pH 7,0 e 30°C em um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu + + yIDI DXS. Um inóculo de E. coli estirpe tomadas a partir de um frasco congelado foi preparado em meio de glicose por extrato de levedura Soytone. Após o inóculo crescer para 0,15 OD, medido a 550 nm, 20 mL foi usado para inocular um biorreator 2,5L contendo meio triptona-extrato de levedura. O biorreator de 2,5 L foi cultivado a 30°C para OD 1,0 e 2,0-L foi transferido para o biorreator 500-L. Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) e glicose foram alimentados a taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura
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319/343 entregue ao biorreator durante a fermentação de 50 horas foi de 181,2 kg e 17,6 kg, respectivamente. A densidade óptica dentro do biorreator ao longo do tempo é mostrada na figura 141. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação (figura 142). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação 50 horas foi de 55,1 g e do curso do tempo de produção é mostrado na figura 143.
[00796] Dessorção de isopreno a partir do carvão ativado (Método A):
[00797] O carvão ativado (130 g), que foi exposto a um fluxo de fermentador do gás de escape, foi colocado em um frasco de 1000 mL, juntamente com uma barra de agitação. Ciclohexano (563 mL) foi adicionado ao balão e a suspensão foi agitada por 2 horas. Vácuo foi aplicado (100 mbar) através de uma trapa criogênica in-line (30 ml de capacidade, imerso em liq. Nitrogênio). Quatro frações foram coletadas e combinadas para produzir uma solução de isopreno/ciclohexano (2,1 % em peso de isopreno, volume total = 53,1 g). Esta solução foi destilada a vácuo 100 mbar e uma solução de isopreno/ciclohexano nova foi coletada (rendimento = 10.1g), que foi seca sobre peneiras moleculares 3A. GC análise desta solução indicou um teor de isopreno de 7,7%p.
[00798] Dessorção de isopreno a partir do carvão ativado (Método B):
[00799] O carvão ativado (65 g), que foi exposto a um fluxo de fermentador de gás de escape, foi colocado em um frasco de 500 mL, juntamente com uma barra de agitação. Jarytherm DBT (250 g) foi adicionado ao carvão e a suspensão foi agitada por 2 horas. Vácuo foi aplicado (5 mbar) através de uma trapa criogênica in-line (30 ml de capacidade, imerso em liq. Nitrogênio). Depois de uma hora a trapa foi aquecida à temperatura ambiente. Duas fases líquidas estavam presentes na trapa (total 1,82 g de peso). A fase orgânica foi diluída com ciclohexano (3,26 g), decantado e secado sobre peneiras moleculares 3A. GC análise desta solução indicou um teor de isopreno de 27,3 %p, ou 1,22 g).
[00800] Preparação de catalisador de neodímio:
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320/343 [00801] Versatato de neodímio (2,68 mL, 0,51 M em hexano), triisobutilalumínio (54 mL, 1,0 M em hexano), e cloreto de dietilalumínio (3,40 mL, 1,0 M em hexano) foram elaborados em seringas de plástico equipada com aço cânula. Os dois primeiros componentes foram adicionados a uma solução de 1,3-butadieno em hexano (22,4 mL, 15% em peso. 1,3-butadieno, colocado em um recipiente de vidro 100 mL com septo superior, e agitado por 0,5 h à temperatura ambiente . O último componente foi adicionado à solução após o que foi envelhecido por calor durante 0,5 h a 65°C. A solução final foi límpida e amarela. A concentração da solução à base de neodímio foi 0,0164 M.
[00802] Preparação de catalisador titânio:
[00803] Um reator de 100 mL de vidro com entrada de septo e contendo uma barra de agitação magnética foi colocado em banho de gelo a 0°C, carregado com n-hexano (5,07 mL, anidro), e com TiCl4 puro (1,5 mL, 13,7 mmol ) sob agitação vigorosa. Separadamente, uma solução foi gerada composta de éter de difenila (1,2 mL, 7,6 mmol) e triisobutilalumínio (14,6 mL, 12,6 mmol, 25 %p solução em hexano). A solução foi adicionada ao vaso de reação ao longo de 5 minutos. Um precipitado marrom formou durante a adição. A suspensão foi agitada por 10 minutos e foi, então, armazenada a -40°C para uso futuro. [00804] Polimerização:
[00805] Amostras de poli-isopreno derivados principalmente a partir da glicose foram produzidas por polimerização da amostra A de polimerização de isopreno com catalisador neodímio e nBu-Li. Amostras de poli-isopreno derivadas de co-fermentação de glicose e extrato de levedura foram produzidas por polimerização da Amostra B de polimerização isopreno com catalisador neodímio, catalisador titânio, catalisador n-BuLi, e polimerização por emulsão de radical livre. As condições representativas da polimerização são descritas adiante.
[00806] Polimerização solução de isopreno com o catalisador
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321/343 neodímio:
[00807] Um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca com uma barra revestida de teflon foi recozido em um forno por 3 horas a 150°C. O frasco foi equipado com um septo de silicone Teflon foi instalado com teflon faceando um septo de silicone e tampa com abertura superior (1,5 g, 7,7 %p em cicloexano anidro). Solução de catalisador neodímio (60 mL) foi injetada dentro do frasco com uma micro seringa. O frasco foi colocado em um agitador/chapa quente regulada a 65°C, com a barra de agitação girando a 500 rpm. Após 15 minutos a solução tornou-se visivelmente mais viscosa. Depois de um tempo de reação de 1,5 h a reação foi interrompida com uma solução de isopropanol e butil-hidroxitolueno (BHT), (30 mL, 10 % em peso de BHT). Uma amostra de 100 mg do cimento foi removida para análise GPC. O cimento polimérico remanescente foi seco sob condições ambientais. O polímero isolado pesava 110 mg, foi determinado ter um peso médio peso molecular de 935.000 (por GPC) e um teor de microestrutura cis- de mais de 90% (por 13C-RMN).
[00808] Polimerização solução de isopreno com catalisador Ti: [00809] Um frasco de vidro de 4 mL com tampa de rosca com uma barra revestida de teflon foi recozido em um forno por 3 horas a 150°C. O frasco foi equipado com um septo de silicone Teflon foi instalado com teflon faceando um septo de silicone e tampa com abertura superior (1,5 g, 7,7 %p em cicloexano anidro). Suspensão de catalisador titânio foi magneticamente agitado e uma amostra foi removida (70 pL) com uma pipeta de ponta descartável, que foi em seguida adicionado ao frasco reacional através de um septo prégraduado. O septo do frasco reacional foi substituído com uma tampa sólida, e o frasco foi colocado por sobre um agitador/chapa quente regulada a 65°C, com uma barra de agitação girando a 500 rpm. Depois de 5 minutos a solução tornou-se visivelmente mais viscose. Depois de um tempo de reação de 1,5 h a reação foi
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322/343 inativada com uma solução de isopropanol e butil-hidroxitolueno (BHT), (30 mL. 10%p BHT. Uma amostra de 100 mg do cimento foi removido para análise GPC. O cimento polimérico remanescente foi seco sob condições ambientais. O polímero isolado pesava 108 mg, teve um peso médio peso molecular de 221.000 (por GPC), e tinham um teor de microestrutura cis- de mais de 94% (por 13C-RMN). [00810] Polimerização por Emulsão de Isopreno:
[00811] Um frasco de 20 mL foi usada como um vaso de polimerização. A tampa de metal foi perfurada duas vezes com um furador e papelão linear foi substituída por uma junta de borracha e Teflon linear. O frasco foi lavado com água deionizada e seco sob nitrogênio [00812] Ao frasco foi adicionado 7,05 g de água deionizada, 1,14 g de sabão 10% (sal de potássio da mistura de ácidos graxos), 174 mg de solução de persulfato de amônio 10%, e 24 mg de n-dodecano tiol. O frasco foi purgado por 30 segundos com nitrogênio e tampado. Ao frasco com a junta de borracha/Teflon foi carregado 3 mL de bio-HG (2,033 gramas de isopreno). O frasco foi colocado em um banho padrão de polimerização em garrafa (um segundo frasco branco permite ao frasco se ajustar a um suporte de garrafas de 0,1133 kg (4 oz). A mistura foi tombada por 25,5 horas a 65°C (+/- 0,2°C).
[00813] Trabalho de acompanhamento:
[00814] O látex foi transferido para um frasco de 50 mL em forma de pêra e diluído com 10 mL de água. Os orgânicos voláteis não reagidos foram removidos por evaporação de 2 mL de água a vácuo (54 mmHg, 40-50°C). Ao látex foi adicionado uma dispersão antioxidante, 140 mg de AO fenólico 50% ativo (Bostex 24). O látex foi coagulado mediante sua adição a uma solução ácida diluída (12 mL de 18% de ácido sulfúrico em 150 mL de água RO). O polímero coagulado na forma de uma única peça de grande porte que foi pressionado e lavado com água RO. A amostra era uma massa de borracha esbranquiçada, macia. O
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323/343 rendimento foi de 1,24 gramas de grumos úmidos.
[00815] O teor final de sólidos totais (TSC = 100 * peso seco/peso úmido) foi de 18,9% em peso ou uma conversão aproximada de 84%. [00816] Polimerização do isopreno com butil-lítio:
[00817] Butil-lítio (1,6 M em hexano) foi diluído com n-hexano (anidro) em uma proporção de 1:10. A solução foi titulada contra um padrão de N-pivalolil-o-benzilanilina em THF. Uma solução de isopreno em ciclohexano (4 mL) foi secada por passagem através de uma pequena coluna contendo de sílica gel tratada termicamente.
[00818] Um frasco de vidro 4 mL (seco em estufa a 150°C) foi carregado com uma pequena barra de agitação magnética revestida de teflon e uma solução de isopreno em ciclohexano (1,35 g, 21,5% em peso). Butil-lítio (0,14 M, hexano) foi adicionado por meio de seringa e o frasco foi aquecido a 65°C num agitador/chapa quente por 3 h. A reação do polímero foi inativada com uma solução de BHT/isopropanol (10% em peso BHT em isopropanol). Todos os voláteis foram removidos sob vácuo. Este procedimento resultou 290 mg de polímero que representa um rendimento teórico de cerca de 100%. Este polímero foi determinado pela análise de GPC a ter um peso molecular ponderal médio (Mw) de 17.880 e foi determinado por RMN 13C ter um teor de microestrutura cis- de 67%, um teor de microestrutura trans- de 25%, e teor de microestrutura 3,4- de 8%.
[00819] Análise de GPC de Polímeros:
[00820] Cromatografia por exclusão dimensional (SEC) é uma técnica bem estabelecida para medir peso molecular e polidispersão de polímeros (Mw/Mn). Duas colunas de microgel da Polymer Laboratories C, em série, foram utilizadas com tetraidrofurano como solvente veículo a uma vazão de 0,7 mL/minuto e uma temperatura de coluna de 40°C. SEC foi realizada utilizando um detector de dispersão de luz Wyatt Technologies miniDawn acoplado com um detector de índice refrativo Hewlett Packard 1047A. Os padrões de poliestireno foram usados para
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324/343 calibrar o instrumento.
[00821] Análise RMN de Polímeros:
[00822] As microestruturas poliméricas foram determinados por análise 13C-RMN em um espectrofotômetro Varian Unity-Plus 400 MHz em solvente clorofórmio-d.
Tabela 14: Dados das Análises Isótopos 13C/12C
Entrada Amostra (nota: PI = poli-isopreno) ô13C
1 PI de açúcar invertido de beterraba -34,98
2 PI comercial de isobutileno -34,43
3 PI comercial de isobutileno -34,42
4 Borracha Guayule -31,10
5 Óleo de palma -30,03
6 Óleo de palma -30,00
7 Borracha natural (Neco) -28,11
8 Borracha natural (Pumpic) -27,92
9 Borracha natural (Negato) -27,86
10 Borracha natural (Nivco) -27,79
11 Borracha natural (Naplo) -27,74
12 Borracha natural (Krado 1) -27,68
13 Borracha natural (Krado 1) -27,55
14 Borracha natural (Krado 2) -27,54
15 Borracha natural (Krado 2) -27,52
16 Borracha natural (Krado 2) -27,49
17 Borracha natural (Nolo) -27,38
18 Extrato de levedura -25,70
19 Extrato de levedura -25,68
20 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 2) -23,83
21 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 2) -23,83
22 Açúcar de polpa de madeira macia (Amostra 2) -23,25
23 Açúcar de polpa de madeira macia (Amostra 1) -23,00
24 Açúcar de polpa de madeira macia (Amostra 1) -22,96
25 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,95
26 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,95
27 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,94
28 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,92
29 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,90
30 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,89
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325/343
Entrada Amostra (nota: PI = poli-isopreno) ô13C
31 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,89
32 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,89
33 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,87
34 PI comercial de destilação extrativa (Amostra 3) -22,84
35 PI comercial de destilação extrativa (Amostra1) -22,63
36 PI comercial de destilação extrativa (Amostra1) -22,62
37 PI comercial de destilação extrativa (Amostra1) -22,54
38 PI de isopreno Amostra B (polimerização por emulsão) -19,67
39 PI de isopreno Amostra B (catalisador neodímio) -19,14
40 PI de isopreno Amostra B (catalisador neodímio) -18,80
41 PI de isopreno Amostra B (catalisador neodímio) -18,37
42 PI de isopreno Amostra B (catalisador n-BuLi) -18,12
43 PI de isopreno Amostra B (catalisador n-BuLi) -18,12
44 açúcar invertido (Amostra 1) -15,37
45 açúcar invertido (Amostra 2) -15,36
46 açúcar invertido (Amostra 1) -15,34
47 açúcar invertido (Amostra 1) -15,31
48 açúcar invertido (Amostra 1) -15,25
49 PI de isopreno Amostra A (catalisador neodímio) -14,85
50 PI de isopreno Amostra A (catalisador n-BuLi) -14,69
51 PI de isopreno Amostra A (catalisador n-BuLi) -14,69
52 PI de isopreno Amostra A (catalisador n-BuLi) -14,66
53 glicose de bagaço (amostra 2) -13,19
54 glicose de bagaço (amostra 1) -13,00
55 glicose de bagaço (amostra 1) -12,93
56 glicose de palha de milho (amostra 2) -11,42
57 glicose de palha de milho (amostra 1) -11,23
58 glicose de palha de milho (amostra 1) -11,20
59 amido de milho -11,12
60 amido de milho -11,11
61 amido de milho -11,10
62 amido de milho -11,07
63 Glicose -10,73
[00823] A menos que de outro modo definido, os significados de todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento são comumente entendidos por aqueles usualmente versados na técnica a que pertence esta invenção. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology
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326/343 and Molecular Biology, 2a edição, John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornece um dos dicionários gerais de muitos dos termos usados nessa invenção. É preciso entender que essa invenção não se limita à metodologia específica, protocolos e reagentes descritos, uma vez que estes podem variar. Aquele usualmente versado na técnica também irá perceber que qualquer dos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser utilizados para a prática ou teste da presente invenção.
[00824] Os títulos contidos nesse documento não constituem limitações aos diversos aspectos ou modalidades da invenção os quais podem ter tido referência ao relatório descritivo como um todo.
[00825] Para uso aqui, a menos que expressamente definido de outro modo, os termos um, uma, o, a, e semelhantes se referem a um ou mais. Os termos singulares também incluem referência ao plural a menos que o contexto claramente indique o contrário.
[00826] Referência com respeito a um valor ou parâmetro aqui mencionado inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para aquele valor ou parâmetro individualmente. Por exemplo, a descrição referindo a cerca de X inclui a descrição de X. As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a extensão da faixa.
[00827] É entendido que os aspectos e modalidades da invenção aqui descritos incluem compreendendo, consistindo e consistindo essencialmente em aspectos e modalidades.
[00828] Requer-se que cada limitação numérica máxima dada no transcurso desse relatório descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem aqui expressamente mencionadas. Cada limitação numérica mínima dada no transcurso desse relatório descritivo irá incluir cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente aqui escritas. Cada
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327/343 faixa numérica dada no transcurso desse relatório descritivo irá incluir cada faixa numérica mais estreita que se insira em uma faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas estivessem todas aqui expressamente mencionadas.
Anexo 1
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de 1-desóxi-Dxilulose-5-fosfato sintase
ΛΤΗ: AT3G21500(DXPSI) MSU: MSIO59(dxs)
AT4G15560(CLAJ) AT5GI L38O(DXPS3) APE: API._0207(dxs)
OSA: 4338768 4340090 4342614 ΧΙ·'Λ: Χ1-2249
CMH: CMF089C XFT: PD1293(dxs)
1ΊΆ: MAL13P1.186 XCC: XCC2434tdxs)
ΤΛΝ: ΤΛ20470 XCB:XC_1678
TPV: TP01 0516 XCV: XCV2764(dxs)
ECO: b0420(dxs) XAC: XAC2565(dxs)
ECJ: JW0410(dxs) XOO: XOO2017(dxs)
ECEt Z0523(dxs) XOM: XOO_19(X)(XOOl9()0)
ECS: ECs()474 VCII: VCO889
ECC: c0531(dxs) VV(J: VV1JJ3J5
ECI: llTI89_(!0443(dxs) VVY: VV0868
ECP: ECP_Ü479 VPA: VPÜ686
ECV: APECOl_159t)(dxs) VFI: VF0711
HCW: EcH24377A_045l(dxs) I’I’R: PBPRA0805
ECX: EcHS_A0491 ΡΛΕ: PA4044(dxs)
STY: ,STY046l(dxs) PAU: PA14_1155()(dxs)
STT: i2441(dxs) ΡΛΡ: PSPA7_1057(dxs)
SFl : SPA2301(dxs) PPU: PP_0527(dxs)
SEC: SC0463(dxs) PST: PSPTOJ)698(dxs)
STM: STM0422(dxs) PSB: Psyr_0604
YPE: YPO3177(dxs) PSP: PSPPH_O599(dxs)
ΥΓΚ: ylOOS(dxs) PFL: ΡΠ._55 lO(dxs)
YPM: YP_0754(dxs) Ρ1Ό: Pfl 5007
YPA: YPA_267I PEN: PSEEN06(XXdxs)
YPN: YPN_0911 PMY: Pmen 3844
YPP: YPDSF_2812 PAR: Psyc_0221(dxs)
YPS: YPTB0939(dxs) PCR: Pcry o_0245
YPI; YpsIP31758_3112(dxs) ACL ACIAD3247(dxs)
SFL: SH)357(dxs) SON: SO_l525(dxs)
SI X: SO365(dxs) SDN: Sden 2571
SEV: SFV_0385(dxs) SER: Srri_2790
SSN: SSON_0397ídxs) SAZ: Sama_2436
SBO; SBOJB14(dxs) SBL: Sba]_l357
SDY: SDY_Ü3JO(dxs) SLO: Shew_277l
ECA: ECA1131(dxs) SHE: Sliewrur4_2731
14.1): plu3887(dxs) SUM: Shewmr7_2804
BUC: BU464(dxs) SIIN: Shewana3L290l
RAS: Bllsg448(dxs) SIIW: Sputw3181_2831
WBR: WGI.pJ44(dxs) II.0:11.2138(0x8)
SGL: SG0656 CPS: CPS_1088(dxs)
KPN: KPN_00372(dx<0 ΡΤΙΛ: PSHAa2366(dxs)
BFL; Bfl238(dxs) PAT: PalJ_l3l9
BPN: BPEN 244(dxs) SDE: Sdc_3381
HIM: III I439(dxs) PIN: Ping_2240
HIT: NTIlU691(dxs) MAQ: Maqu 2438
III]?; CGSIIiEE_O4795 MCA: MCAO817(dxs)
HIQ: CGSHÍGG_Ü1Ü8Ü 1TU: i rnOI8c(dxs)
I1DIJ; HD()441(dxs) ITR FTF10l8c(dxs)
1 ISO: 1 IS_0905(dxs) I 'l'W: l'TW_0925(dxs)
PMU; PM()532(dxs) ETL: ETL_1072
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328/343
ΕΓΗ: FTH_1047(dxs)
1-ΤΛ: 1Ί'Λ_113 Kdxs)
ΕΓΝ: FTNJ)896(dxs)
N(X’: N’oc_J743
ΛΕΗ: Ml^_1381
HCH: HCHJ)5866(dxs)
CSA; Csal_0099
ADO: ABO_2166tdxs)
AHA: AIIA_332l(dxs)
BCI: BCT_O275(dxs)
RMA: Rmag_0386
VOK: Ut)SY_O36O(dxs)
NME: NMB1867
ΝΜΛ: NMA0589(dxs)
NMC: NMC(J352(dxs)
NGO: NGOOÍB6
CVI: CV_2692(dxs)
RSO: RSc2221(dxti)
REU: Reul_A()882
REH: H 16_A2732(dxs)
RME: Rmct_26l5
BMA: BMAAO33B(dxs)
BMV: BMASAVPl_1512(dxs)
RM] : BMA10299_1706(dxs)
BMN: BMA10247_A0364(dxs)
RXE: Bxc_B2827
BUR: Bi?L'pl8194_B2211
BCN: Been 4486
BOIL· Bceu2424_3879
BAM: Bamb_3250
BPS; BPSS1762(dxs)
BPM: BURPS17IQb_A0842(dxs)
BPL: BURPS1106A A2392(dxs)
BPD: UURPS668_A2534(dxs)
BTE: ΒΊΉ 110614(dxs)
BPL: BP2798(dxs)
BPA: BPP2464(dxs)
BBR: BBI9l2(dxs)
KI R; Krer_2875
POL: Bpro_J747
ΡΝΛ: I’nap_l5()l
AJS: Ajs_l (J38
ΜΡΓ: Mpc_A2631
IIAR: TIEARO279(dxs)
MMS: mma_O331
NEU: NE1161(dxs)
NET: Ncul_J5Ol
NMU: Nmul Λ0236
EBA; cbA4439(dxs)
AZO: azo J J98(dxs)
DAR; Daro_3061
TDD: Tbd_0879
MPA: Mfla 2133 ] IPY: I IP0354(dxs)
I1PJ: jhp()328ldxs)
Ι1ΡΛ: I1PAG1_O349
HHE: HH0608(dx5)
HAU; Huc_W68(dxs)
WSU: WSJ996
TDN; Tmdeu_0475 (BE; Cj()321(dxs)
CJR: CJl O366(dxs)
CJJ:CJJ8] ]76J)343(dxS)
OJU: O8J_«298(dxs)
CJD; JJD26997_1642(dxs)
OFF: lTF8240_9264(dxs)
CC V: CCV52592_ 1671 (dxs) CCV52592_1722
CHA: C1IAB381 1297(dxs) (XO:CCC13826_1594(dxs)
ABU: Abuj2139(dxs)
NIS: NlS_0391(dxs)
SUN: SUN_2()55idxs)
GSU: GSU0686(dxs-l) GSUI764(dxs-2)
GME: CrnieL_l 934 Gmet_2822
PUA: Pcar_l667
PPI): Ρρπι_Ι 191 Ppr<>_24()3
DVU: DVU135(Xdxs)
DVL: I)vul_l718
DDE: Ddc_22(J(J
LIP; LI()4t)8(dsx)
DPS: DP2700
ADE: Adeh_1097
ΜΧΛ: MXAN_4643(dxn)
SAT: SYN_02456
SELPSfum 1418
PUB: SARll_0611(dxs)
MLO: mlr7474
MES: Mcso_0735
SME: SMc(X)972(dxs)
ATU: AmO745(dxs)
ATC: AGR_C_I351
RET: RUE CII00913(dxs)
RLE: RLO973(dxs)
BME: RM El 1498
BMF: BABJ_O462(dxs)
BMS: BR0436(dxs)
BMB: BruAblJ)458(dxs)
BÜV: ROV_0443(dxs)
Β.ΙΛ: bll265J(dxQ
BRA: BRADO2161(dxN)
BBT: BBta_2479(dxs)
RPA: RPA0952(dxs)
RPR: RPR_446()
RPC: RPC_1149
RPD: Rl’D_4305
RPE; RPEJO67
NWI: Nwi_0633
NIIA: Nhaiu_O778
ΒΠΕ: Bnt)4350(dxs)
DQU: BQO354D(dxs)
B BK: [JAR BA Kt 15 83 J)4(X)(dxs)
CCR:CC 2068
SIL: SIXX)247(dxs)
SIT: TM1041).2920
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 333/355
329/343
RSP; RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs)
JAN: Jiinn_OO88 JannJJJ 70
RDE: RD1J1J01 (dxs) RDl_0548(dxs)
VW M marl ().0849
I1NE: HNE_1838idxs) /MO: ZMO1234(dxs) ZMO 1 598(dxs)
NAR: SiiniJ)161
SAL: Sala 2354
El.I: EI,I_ 12520
GOX: GOX0252
GBE: GbGGDNlIIl_0221 GbCGDNlIl 1.2404
RRU: Rm_A0054 Rru_A26l9
MAG: amb2904
MGM; Mme 1_1048
SUS: Acid 1783
BSU; BGI I7l5(dxs)
HI [A: Bl 12779
BAN; BA4400(dxs)
BAR: GBAA4400(dxs)
BAA; ΒΛ.4853
HAT: BAS408I
BCE: BC4176G1XS)
BC’A: BCE_4249(dxs)
RCZ: BCZK3930(dxs)
BTK: BI9727_3919(dxs)
RTL; RA1.1 l_3785(dxs)
BLI; BI,OI523(dxs)
BLD: BLi02598(dxs)
BCL; ABC 2442( dxs)
BAY: RBAMJÍ22600
BPU; BPUM_2159
GKA: GK2392
GTN; ÜTNG.2322
MO: hnol3G5(lklB)
I. Ml·; EMO12365.1382(dxs)
LIN; linl402(tklB)
LWl·: Iwel JUOftklB)
Ι.Ι.Λ; L10891KdxsA)],l23365(dxsB)
LLC; LAGR_1572 I.ACR_l843
J. I.M: HmgJ)749(dxsB)
SAK: SAK_()2(;3
I.PL: lp.261(J(dxs)
I JO: 1J0406
LAC: Τ.ΒΛ0356
I.SL: I.SE_0209(dxs)
LGA: I.GAS_()350
STU: STI Γ1842
CAC; CAC2077 CA IOIOWxs)
CPE:CPE1H19
CPE: CPr_2073(dxs)
CPR: CPR_1787(dxs)
CTC CTC0J575
CNO: NT01CX 1983 (ΊΉ: Clhe_0828
CDF: CDI2O7(dxs)
CBO:CBO1881(dxs)
CBA; Cl.B_18J8(dxs)
CBH: CLC_1825(dxs)
CBF: CLI_l945(dxs)
CKL: CKL_123l(dxs)
CHY: CHY_l985(dxs)
DSY: DSY2348
DRM: Dred_1078
PTI1: PTII_T196(dxs)
SWO: Swol_0582
CS<’: Csac_1853
TTE: TTEJ298(dxs)
MTA:Morh 1511
MPE: MYPE730
MG A: MGA 1268fdxs)
MTU: Rv26S2c(dxsl) Rv3379c(dxs2)
MTC: M'l2756(dxs)
MBO; Mb2701c(dxsl) Mb3413c(dxs2)
Ml.I·.: Mi.lO38(dxs)
ΜΡΛ: MAP2803c(dxs)
MAY: MAV_3577(dxs)
MSM; MSMEG_2776(dxs)
MMC: Mmcs_2208
CGI,: NCglJ 827(cg] 1902)
CGB: cg2O83(dxs)
CEF; CÉ1796
CDl: DlP1397(dxs)
CJK: jklO78(clxs)
NFA: nru37410(dxs)
RUA: R1IA1 ro06843
SCO; S<O6013(S<'lC3.0n
SCO6768(SC6A5.17)
SMA: SAV1646(dxsl) SAV2244(dxs2)
TWH; TWT484
TWS: TW28O(Dxs)
I.XX: l.xxl()450(dxs)
CM1: CMM_1660(dxsA)
AAU; AAur_1790(dxs)
PAC: ΡΡΛ1002
TFU;Tru_1917
I RA: I'rancci3_] 32<J
PAL: P'RAAUOSSCdxs)
ACE: Acd_1393
SEN: SACEJSlbidxs) SACE_4351
Bl.O: BL1132(dxs)
BAD: BAD_0513(dxs)
ENU: I’N1208 1-191464
RRA: RB2143(dxs)
CTR: CT33J (dxs)
CTA: CTA 0359(dxs)
CMU: TCttóüS
CPN: CPiiJQ6O(tkiB_2)
CPA; CP0790
CPJ: CPjIO6CKiktB_2)
CPI’: CpB1102
CCA; CCA0()304(dxs)
CAB: GAB30lfdxs)
CEE: CIO699(dxs)
PCI J: pct)619(dxs)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 334/355
330/343
ΤΡΛ: '1’1^)824 PMF: IN3O3_15371 (dxs)
ΓΟΕ: TDEI9lüídxs) PM(J: P93OI JJ9521(dxs)
1.11/ LA3285(dxs) PMH: 1^215.09851
1.1C: 1JC10863G1XS) PMJ: l*<)211_08521
I.BJ: LBJ_O917(dxs) PME: NATL1_09721(dxs)
l .BL; ].ni,_0932(íixs> TER: l'ery_3042
SYN: sll!945(dxs) ΒΤΠ: BT_14Ü3 BT_4O99
SYW: SYNW1292(Dxs) Bl-R: BFO873 BF4306
SYC: syclO87_c(dxs) BFS: BFÜ796(dxs) BF4114
SYF: Synpcc7942_0430 PG1: PG2217(dxs)
SYD: Syncc9605_1430 C1ILJ: ClIU_3643(dxs)
SYE; Syncc99()2_1069 GFO: GI O_347()(dxs)
SYG: sync_1410( dxs) I PS: l’’l*0279(dxs)
SYR; ,SyaRCC3O7_139O(dxs) CTE: CTO337(dxs)
SYX: SynW[]78O3_1223(dxs) C'PII: Cplia266_l)671
(ΎΑ: CYA_l70l(dxs) PVI: Cvih_O498
CYB: CYU_]983(dxs) PLT: Plut_0450
TET.: (110623 DET; OETÍ)745(dxs)
(ÍV[: gll()l94 l)EH: chdh_A72()(dxs)
ANA: íüjÜ599 DRA: 1)R_1475
A VA: Ava_4532 IX1E: l)geo_0994
ΡΜΛ: ΙΥοϋ928(ΰχί) TJ’II:TJV1614
PMM: PMM(M)7(Dxs) TTJ: ΤΤΗΛ0006
PMT: PMTCWídxs) ΑΛΗ: aq_881
PMN: PMN2A_0300 ΤΜΛ: TM1770
PMI: ΡΜΊΌ312_0893 PMB: A96OI_O954l(dxs) PMC: 1*9515_Ü99Ü1 (dxs) PMO: ]»iiK)b_100l
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de acetil-CoA· acetiltransferase
ISA: 38(ΛΟΛΊΊ) 39(Λ(’ΛΤ2)
PTR: 451528(Λ(’ΛΤ1)
MCC: 7O7653(ACAT1) 70S75(1(Λ(ΆΊ'2)
MMU: 110446( Acall) 110460(Acal2)
RNO: 25014(Acall)
CFA: 484063(ACAT2) 489421 (AC ATI)
GGA:4l8968(ACATl)
421587( RCJMB04_34i5)
XLA; 37956’XMGÍ'69098) 414622(MGC81403)
414639( MGC81256)
444457(MGC83664)
XTR: 394562(acul2)
DRE; 30643(acal2)
SPU: 759502(1.00759502)
DME: DmcLCG 10932 Dmel (09149
CEL: T02G5.4 T02G5.7 T02G5.8(kat-l)
ΑΓΗ: AT5G48230(ACAT2/EMB IΞ76)
OS A; 4326136 4346520
CMH: CMA()42(’ CME087C
S('E: YPLO28W(ERG1O)
A(i(): AGOS_ADR165(’
PIC: PICST_3I7O7(ERGJO) (’AL: CaO19.l591(ergl(l)
CGR: CAGL0LI2364g
SPO: SPBC215 09c
M(iR: MGG_01755 M(Ki_13499
ΛΝΙ: ANJ4ÍW.2
AFM: AEi;A_6G 14200 Al lJA_8G04(X)0
AOR: AO09Ü103000012 ΛΟ090103000406
CNE: CNC05280
UMA: UMÜ3571.1
DDE DDB_0231621
1’1'A: 1Ί-Ί 4.0484
TET; rniERM_00091590 1TIIERM_OO277470TTHERM 00926980 TCR; 511003.60
ECO: h2224(au>B)
JW22l8(alüB) JW5453(yqd:)
IΚΈ: Z4164(yqeF)
ICS: ECs3701 ] c2767(aloB) c3441(yqeF)
1ΓΙ: UT189_C2506(atoB) 111189.03247(yqcF)
ECP; ECP_2268 ECP_2857
K( ’ V: ΛIJ h( OI -3662( yqeF)
APECO1_4335(aluB)APEC01_43352(aloB)
ECX: Eel IS-A2365
STY: STY3164(yqcF)
S Γ Ι’: t2929(yqel·)
SPT: SPA2886(yqcF)
SEC: SC2958(yqcF)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 335/355
331/343
STM; STM3019(yqeF)
SI L: SI^SSTiyqcE)
SEX; S3052(yqeF)
SEV: SEV_2922(yqcF)
SSN: SSON_2283(aloB) SSON_3004(yqeF)
SRO; SnO_273Wyqcl··)
ECA: EC'A1282(ainB)
ENT: Ent 63 8.3299
SPE; Spn>_0592
HIT: NT1110932(aloB)
XCC: XCC1297(aroB)
XCB: XC.2943
XCV: XCV140HU11A)
XAC; XAC1348(atoB)
Χ(Χλ XOOI88J(aloB)
XOM; XOOJ 7781X001778)
VCH: VCA0690
VCO; VC0395.0630
V VIJ: V V 2.0494 V V 2_0~f41
VVY: WAI043 VVA12I0
VI’A: VPA0620 VPAI 123 V PA 1204
PPR: PBPRBI112 PBPRBI 840
PAE; PA200l(att>B) ΡΛ2553 ΡΛ3454 PA35S9
PA3925
PAE: PA14_38630(iiioB)
PPI): PP_2051(atoR) PP_2215(fadAx) PP.3754
PP.4636
PPI·’: Ppur 2009 1^111.2403 Pput 3523
Ppur_4498
PST: PSPTO_0957(phbA-1)
PSPTO_3164(phbA-2)
PSB: Psyr_0824 Psyr_303l
PSPtPSPPII 0850(plibAl)
PS PPI l_2209(phbA2)
PEL; PEI. 1478(aloB-2) PEI._2321 PEL_3066
Pl'L_4330(aloB-2) PEL.5283
PRO: ΡΠ.1269 ΡΠ_1739 ΡΠ_2074 ΡΠ.2868
PEN: PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx)
PSEEN4-635(phhA)
PMY: Pmen l 138 Pmen_2036 Pmen_3597 ] ’iiien_3662 I’m en_38 20
PAR: Psyc_O252 Psyc_l 169
PCR: Pcryo.0278 Pcryt>_1236 Pcryn.l260
PRW: PsycPRwi_20l I
ACE AC1ADO694 ACIAD1612
ACIAD25 l6(aitiR)
SON: SO_!677(aloB)
SDNtSdcn 1943
SER: Sfri_l338 Sfri.2063
SA7.: Sama. 1375
SBL: Sbal.1495
SBM: Shew 185.1489
SBN: SbaJ195_1525
SI O: Shew_]667 Shew_2858
SPC: Sputcn32 1397
SSE; Ssed_1473 Ssed_3533
SPL; Spea 2783
SHE; Shewinr4_2597
SUM: Slicwnir7_2664
SHN: Shewa[ia3_2771
SHW: $putw3181.2704
IT.O: 11.0872
CPS: CPS_1605 (’l’S_262(>
ΡΪΙΛ: PSITAaWOS PSIIAal454(aioB)
I’SHAal586(atoBl
PAT: Patl_2923
SDE: Sde_3149
PIN: Ping 0659 Ping .2401
MAQ: Maqu_2l 17 Maqu_2489 Maqn_2696
Maqu .3162
CBU:CBU_O974
LPN: Lpgl825(aloBl
LP1’; lpl!7K9
I.PP: Lppl788
NOC: Noc_1891
AEII: MlgJKiSS Mlg_2706>
ΗΗΛ; Hlial_L685
IICI I: ] ICH.05299
CSA:Csal_030J Csal_3l)68
ABO: ΛΒΟ_0648(ΓίΐύΛχ)
MMW: Minwyl 1-0073 Mmwyl]_3021
Mmwy11-3053 Mmwyll_3097 Mmwyll_4182
AI I A: AHA_2143(amR)
CVI; CV_2O88(atcB) CV_2790(phaA)
RSO: RSc0276iatoB) RScl632(phbA)
RSc 163 7 (bktB) R Sc 17 61 (RSO294S)
REU: Reul_AOI38 Reui_A1348 Reul_Al353
Reut_B4561 Rcut_B4738
Rcui_B5587 Reui_C5943 ReuL_C6062
RE1I: 1116 A0170I116 AÜ867 I116_AO868
1116-Λ0872 H16-AI297
1116-Al438(pliaA) Hl6 A1445(bktB)
Ι116-Λ1528 I116_A1713 II16_A1720
1116-Λ1887 Η 16_Λ2 148 Í116_IW380
H 16_B()381 H16_B0406 Η16_B0662
1116_R()668 1116J30759 I i 16_131369
HI6-B177I
RME: Rmel_0106 Rmet_]357 Rmcl_1362
Rmci-5156
ΒΜΛ; ΒΜΛ1316 ΒΜΛ1321 (phbA) ΒΜΛ1436
BMV: BMASAVPI_A1805(bklB)
BMASAVP1_A1810(phbA)
13ML: RMAI0299_A0086(phbA) BMAJ0299_A009I
BMN; BMA10247_1076(bktB)
BMAJ0247_108l(plibA)
BXE: Bxe_A2273 Bxe_A2335 Bxe_A2342
Bxc_A4255 Bxc_B0377 Bxc_BO739
Bxc_C0332 Bxe_C0574 Bxc_C0915
BVI: Bccpl 808.0519 Bccpl8O8_1717
Beep 1808-2877 Beep 1808.3594
Beep 1808.4015 Bccpl808 5507
Beep1808-5644
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 336/355
332/343
BI.'R: Bcepl8194.Λ3629 Bcepl 8194_A5080 BccpJ8l94_A509l
Bcepl 8194_Λ6102 Beep 18194_B0263
Bcepl 8I94_R1439
Bcepl8194.C6652 Bcepl8194_C6802
Bccpl8l94_C6874
Bcepl 8194_C7118 Beep 18194_C715 J
Bccpl8194_C7332
BUN: Bccu_1553 Bcen_1599 Bccn_2158
Bcen_2563 Bcen_2998 Bcen_6289
BC1I: Bccn242+_Ü542 Dcen2424_1790
Bceti2424_2772 IJccn2424_5368
Bcen2424_6232 Bcen2424.6276
BAM; Batub_i)447 Bamb_1728 Bamb_2824
Bainb.4717 Bamb 5771 Bamb 5969
BPS; BPSL1426 BPSI,l535(plibA) BPST.1540
BPM: BURPS 171 0li_2325(bktB)
BURPS l71Üb_233OÇplibA)
BURPS 1710b_2453(atoB-2)
BPT,: BURPS1 J06A_2197(bklB)
BURRS I IO6A_22O2(phbA)
BPD: BLRPS668.2160(bklB)
BURPS668_2165(plibA)
RTE; RTII_12144 B l 1IJ2256 FUJ I]J2261
PNU: Pnuc_0927
RPE: RIO447 ΒΙΌ668 BP2059
ΒΡΛ: BPPÜ6D8 BPP1744 BPP3805 BPP4216
BPP4361
BBR; BB0614 BB3364 BB4250 BB4804
BB4947
RFR: Rfcr_0272 Rfcr_l(XX) Rfcr_1871
Rlcr_2273 Rfcr_2561 Rfcr_2594
Rfei.3839
POL; Bpro_l577 Bpro_2l4Q Bprt>_3113 Bpro.4187
ΡΝΛ; l’uap_0060 l’uap_0458 Piiap_O867
Pnap_l 159 Pnap_2l36 Pnap_2804
AAV: Aave_0031 Aavc_2478 Aave_3944
Aave_4368
AJS: Ajs_tXJ14 Ajs_OI24 Ajs_1931 Ajs_2O73 Ajs_2317 Ajs_3548
Ajs_3738 Ajs_3776
VEI: Veis_1331 Veis_3818 Veis_4193
DAU: Daci.0025 Daci_OI92 Daci_3601
Daci_5988
MP I’: Mpe _A1536 Mpe_Al776 Mpe_Al869
Mpc_A3367
HAR: HEARO577tplibA)
MMS: inma_O555
NEU: NE2262(bklB)
NET: Ncut.0610
EBA: ebA5202 p2A409(lbL)
AZO: azo0464(fadAl) azo0469(fadA2) az<>2172(thlA)
DAR: Daiü_0098 Dai'o 3022
Ι1ΡΔ; IlPA(il_0675
HAU: Hac_0958(atoB)
GME: Gmei_1719 Gruei_2t)74 Gmet_2213
GriK;t_226S Gmct_33O2
GI JR: Gui-a_3O43
BBA: Bd0404(aloB) Rd2095
IX9T.: Dole_0671 Dolc_1778 Dole_2160 l>olc_2187
ADE: Adcli_0062 Adeh_2365
AI-’W: Anael09.0064 Anae 109 1504
ΜΧΛ: ΜΧΛΝ.3791
SAT: SYN_02642
SFU: Sfum 2280 Sfum 3582
RPR: RP737
RCO: RC1134 RC1135
RPL·; RF_O163(paaJ)
RBE: RBE_0139(paaJ)
RAK; A1CJ1582O
RBO: Al l_07215
RUM; A1E_04760
PUB: SARI 1 J)428(lhLA)
MJ.O: jnlr3847
MRS: Mcsn_3374
PLA: Plav_J573 Plav_2783
SME; SMal45t) SMcO3879(plibA)
SMI): Snicd_0499 Smed_3117 Smed_5094
Smed_5096
ATU: Alu2769(atoB) Atu3475
ATU: AGR_U_5022(phbA) AGR_L_2713
RET: RUE C1IC4018(plibAch)
RIIE_PU0(X)68(ypcOOO4O)
RIIE_PF00014(phbAf)
RLE: RL4621(phaA) pRL-100301 pRL 120369
BME; BMEI0274 ΒΜΕΙΓ0817
BME: BABl_1783(plibA-l)BAB2.079(XphbA2)
BMS: BR1772(plibA-l) BRAO448fphbA-2)
DMB: BruAbl_1756(phbA-l)
B ni A b2_0774(phbA-2)
BOV: BOV_17G7(plibA-1)
ΟΛΝ: Oanl_l 130 Oant_31 07 Oanl_3718
Oant_4O20
BJA: hllO226(atnB) 11113949 bll74Ü() 11117819 blr3724(piibA)
BRA: BRAD00562(phbA) BRADO0983(piniB)
BRADO3110 BRAD03134(aioB)
BBT: BBla_3558 BBla_3575(atoB)
BBta_5 I 47(pimB) BBla_7072(pimB)
BB[a_7614(phbA)
RPA: RPA0513(pcaF) RPA0531
RPA3715(pimB)
RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748
RPC: RPC_05(14 RPCJ1636 RPC_0641
RPC_0832 RPC_l050 RPC_2005
RPC 2194RPC^2228
RPD: RPI)_0306 RPD_032() RPI)_3105
RPD.3306
RPE; RPE_O168 RPE_0248 RPE_3827
NW] Nwi 3060
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 337/355
333/343
ΧΛΙ J: Xaul.3 108 Xaul_4665
CCR; CC.0510 UC.0894 CC.3462
SIL; SPOOU2(bklB) SPO0326(phbA) SPOÜ773
SPO3408
Si l ; TM 1(.)40.0067 TM1040_2790 'I'M 1()40.3026 I'M I 040.3735
RSP: RSPJJ745 RSP.1354RSP.3I84
RS I1: Rsph 17029.0022 Rsph17029 2401
Rsph 17029.3179 Rsph 17029.3921
RSQ; Rsph17025.00J2 Rsph17025.2466
Rsph17025 2833
JAN: Janii.0262 Jann.0493 Jann.4050
RDE: RD 1.0025 RD 1.020 l(bktB)
RDl_3394(phbA)
PDE; Pden 2026 Pden 2663 Pdcn 2870
Pden.2907 Pden_4811 Pden.5022
DSH: l)shi_0074 IJshi_3066 l>shi_3331
VMK Minar 10.0697
HNE: UN I ..2706 UN] -:.3()65 11N1 ;_3 133
NAR: Saio.0809 Sum. 1069 Saro.1222
Sarn.2306 Saro.2349
SAL: Sala.0781 Sala.1244 Sala.2896
Sala_3158
SWh Swii-0632 SwilJ)752 Swii.2893
Swii.3602 Swil.4887 Swil.5019
Swi [.53()9
ELI: ΕΓ.Γ.01475 ΕΙ.Γ_06705 ELI.12035
GBE: GbCGDNII 11.0447
ACR: Acry.1847 Acry.2256
RRIJ: Rru_A0274 Rru.A 1380 Rni_A1469
Rru_A1946 Rru_A3387
MAG: amb0842
MGM: Mme 1.1165
Λ BA: Acid345_3239
BSU; BG113L9(mnigA) BG 13063(ylilS)
B1IA: BUI997 Bl 12029 BI 13801 (intiigA)
BAN: ΒΛ3687 ΒΛ4240 Ε1Λ5589
BAR: GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589
BAA: ΒΛ.0445 ΒΛ.4172 ΒΛ.4700
BA I’: BAS34I8 BAS3932 BAS5193
BCE: BC3627 BC4023 RC5344
BCA; BCE-3646 BCE.4Ü76 BCE.5475
BCZ; BCZK3329(innigA) BCZK3780(llil) BCZK5044(atnB)
BCY: Bccr98_2722 Bcer98_3865
R I K: RT9727_3379(niiiigA) FVIO727_3765(thl)
BT9727_5028(aloB)
BTL:BAL11 3262(mmgA) BALll 3642(fadA)
BALlI_4K43fataB)
Bid: BI.03925(nimgA)
BLD; BLiO3968( tiling A)
BCT.: ABC0345 ABC2989 ABC3617
ADC3891(mmgA)
BAY: RBAM_022450
BPU; BPUM 2374(yhlh) BPUM 2941
BP(JM_3373
OIH: OB0676 OBU689 OB2632 OB3013
GKA: GK1658GK3397
SAU: SA0342SA0534(vraB)
SAV; SÀV0354 SAV0576(vraB)
SAM: MW0330 MW0531(vraB)
SAR: SAR0351(ihl) SAR05S1
SAS: SAS0330 SAS0534
SAC; SACOIO426 SAC(JL0622(aloB)
SAB: SAB0304(ihl) SAB0526
SAA: SAUSA3WJ)355
SA US A300_0560( vraB)
SAO: SAOUI 1SC.OO336 SAOUI1SC.00558
SAJ: ,SaurJH9J)402
SA1I: SaurJIll.0412
SEP: SE0346 SE2384
SER: SERPOÜ32 SERP0220
SHA: SII0510(mvaC) SI 12417
SSP: SSP0325SSP2145
LMO: liiK,1414
I.MI'l ΕΜΟΓ2365.Ι433
LIN: 11111453
I.WE: Lwe 1431
LLA: 1.11745CU1ÍL) L25946(fadA)
LLC: LACR.Í665 LACR.1956
I .[.M: Unig_0930(ihil.)
SPY: SPy.0140 SPy_1637(aloB)
SPZ-: M5005_SpyJ)l 19 M5(X)5_Spv_0432
M5005_Spy_l344(atoB)
Sl’M: s py Μ18-0136 spy Μ18 _ 1645(aroB)
SPG: SpyM3JJJO8 SpyM3_l378(atoB)
SPS: SPsOJ 10 SPsO484
SP1I: MGAS10270_Spy0121
MGASIO27O_SpyO433
MG AS 10270_Spy 14611 atoB)
SPI:MGAS10750_Spy()l24
MGASJO75O_SpyO452
M< JA S10750_Spy 145 3(atoB)
SPJ: MGAS2096_Spy0123
MGAS2096_Spy0451
MGAS2(W6_Spy 1365(atoR)
SPK: MGAS9429_SpyOI2l
MGAS9429_Spy()431
MGAS9429_Spyl 339(aioB)
SPF: SpyM50447(uloB2)
SPA: Mó.SpyOJ 66 M6_SpyO466 M6_Spyl390
SPB: M28_Spy0117 M28_Spy0420
M28_Spyl 385(aioR)
SAK: SAK.0568
EJÜ:LJ16O9
LAC: LBA0626(lliiL)
LSA: LSA1486
LDB; Ldb0879
LBU: I.BUL.0804
LBR: LV1S-22I8
LUA: I.SEI.1787
LGA: I.GAS.1374
LRE; Lreu_0052
EI A: EFl364
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 338/355
334/343
OOE; OEOE_()529
STU: STI 12913 STI 1725 STI 1804 ('AC: CAC2873 CA_POO78(lhiL)
CPE: CPE2195(aroB)
CPI·: CPI _2460
CPR: CPR_2170
CTC; CTC003J2
CNO: NT01CX 0538 NT01CX 0603
CDF; CD1059(thlAl) CD2676(thlA2)
CBO: CB03200(ihl)
CBE: Cbci 0411 Cbci 3630
CKL: CKL_36%(lhlAL) OKI _3697(lhlA2)
CKL 3698(tlilA3)
AM I : Amet_4630
AOE: Clos_()084 C]<»s_0258
CHY: CHY_l2«8CIlY_1355(atoB)CHY_l604
CHY_1738
DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567 DSY 1710
DSY2402 DSY3302
DRM: Drcd_(MOO Dred_1491 Drcd_1784 ] )red_l 892
SWO: Sw01_O3O8 Swol_0675 Swol_0789
Swnl_1486 Sw»l_1934 Swo]_2051
TTE: TTE()549(paaJ)
ΜΤΛ: Mi>lh_126O
MTU: Rvll35A Rv] 323(fadA4)
Rv3546(iadA5)
MTC: MT1365(plibAl
MBO; Mbl 167 Mbl 358(fadA4)
Mb3576(fadA5) Mb3586c(fadA6)
MBB B('G_1197 BCG_1385(fadA4)
BCG_36IO(fadA5) BCCr_3620c(fadA6)
MLE: ML1158(fadA4)
MPA: MAP24()7c(fadA3) MAP2436c(fadA4)
MAV: MAV_1544MAV_1573 MAV_1863
MAV_50Rl
MSM: MSMEG_2224 MSMKt_492()
Ml IL: MUL_0357
MVA: Mvan_l976 Mvati_1988 Mvan_4305
Mvan_4677 Mvan_489l
MG I: M(1v_I347 Mflv_l 484 Mflv_2()40
MHv_234O MHv_4356 Mllv_4368
MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796
Mmcs_3864
MKM: Mkms_0251 Mkms_1540 MkmsJSOi
Mkms_l 816 Mkms_2836 Mkms_3 ] 59
Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938
Mkms_4227 Mkms_4411 Mkms_458Ü
Mki»$_4724 Mkms_4764 Mkms_4776
MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 MjJs_1750
Mjk_2819 Mjls_3119 Mj]s_3235
Mjk_3800 Mjls_3850 MjJs_4110 Mjls_4383
Mjk_4705 Mjls_4876
MjlOOlB Mjls_5O63 Mjls_5075
CGL: N( gl2309(cgl23921
CGB; tg2625(pcal·')
CEF: Cl 10731 CE2295
CJK; jkl543(fadA3)
NI-’A: nla 10750( fadA4)
RHA: RHAl_ro01455 RHA1_rO1623
Rl ] AI _m()l 876 Rl IAl_r<>()2517(calP)
R] IAl_m03022 R[lAl_r()03024
R|]AI_ro03391 Rl IAl_m03892
RIIA l_m04599 Rl ΙΑ J _n»05257
R1IA1 ro08871
SCO: SCO5399(SC8F4,l)3)
SMA: SAVJ384(fadA5) SAV2S56(fadAl)
ART: Artli 1160 Art]) 2986 Artli 3268
Arlh_4073
NC’A: N<xa_1371 Noca_ 1797 Nora 1828
Noca_2764 Noca_4142
TI’ll: 4Tu_1520 Tfu 2394
I RA: Fraucd3_36R7
I RE: lTaneanl_IO44 P'raneatil_271 I
Erani!aiil_2726 Fraiieaii l_3929
I Tanean ]_4037 Franean I_45?7
PAL: I;RAAI.25I41’’RAAI.26J8 hRAAlAOIO(atoB)
ACE: Accl_0626 Accl_0672
SEN: SA('E_1192(iiiingA) SACE_2736(fadA6)
SACE_401 l(caiF)
SAClL6236(radA4)
S I P: Slmp_36l0
SAQ: Sare_1316Sarc_3991
RXY: Rxyl 1582 Rxyl_1842 Rxyl.2389
Rxyl_2530
FNU: FN0495
BGA: BGOllO(fadA)
BAF: BAPKClOL lO(fadA)
LIL: LA0457(tliiLl 1 LA0828(lliiL2)
I.Λ4139( fad A)
T,IC: LlCJ0396(plibA)
LB.1: LB.I_2862(paaJ-4)
I.HL: I,BI._02()9(paaJ-4)
SYN: slrl993(phaA)
SRU: SRU_12Ll(atoB)SRU_l547
CHU: CHU_19JO(atcB)
GHO: GFO_1507(atoB)
I JO: Fjoli_4612
EPS: EP0770 FP1586 EPI725
RRS: RoscRS_3911 RoscRS_4348
RCA: Rcas_[l7O2 Rcas_32t)6
IIAU: Haul J)522
DR A: DR_IO72 DR_1428 DR_l960 DR_2480
DR Λ0053
DGE: Dgco_0755 Dgco_1305 Dgeo_1441
Dgeo_l883
Τ1Ί I: 1TC0191 TTCO33O
TTJ: ΤΤΤΓΑ0559
TME:Tmcl 1134
I NO: Piiod_03l4
PMO: l’mob_0515
I IMA: nnAC0896(acaB3)niiAC2815(aca2) rmAC3497(yqcl·’)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 339/355
335/343 miB0240(acal) rniBO242(iicaB2) rmB0309(acaBI)
TAG: TaO5K2 'I VO: TVN0649
1ΊΌ: ΓΓΟ1505
APE: ΛΡΙ·_21Ο8
SSO: SSO2377(acaB-4)
STO: STÜ514
SAI; Sad_0963 Saci_1361(acaBl)
MSE: Mset1_0656
ΡΛΙ: PAE1220
PIS: Pisl_(X)2‘) PisL_l3t)l
PCL·: Pcnl_O781
PAS: Pars_0309 Pari_ 1071
CMA: Cmaq_l94l
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplificadores de HMG-CoA sintase
USA: 3157(HMGCSJ) 3158(ITMGCS2)
PTR: 457169(IIMGCS2) 46 J 892(1 IMGCS 1)
MCC; 702553(1 IMGCS 1) 713541(1 IMGCS2)
MMU; 15360(1 lmgcs2j 208715( Hinges 1) RNO; 24450( Hinge s2) 29637( Hinges!)
CFA; 479344( IIMGCS1) 6Ü7923ÍHMGCS2)
ΒΤΛ; 407767(1 IMGCS 1)
SSC; 397673(0 (1242-38B5.1)
GGA; 396379(1 IMGCS 1)
XI A: 380091 (hinges I) 447204(MGC :808 ] 6) DRE: 394060(11mges I)
SPU: 578259(1.00578259)
DME: Djiiel_(’G4311 (Hmgs)
CEL: E25B4.6
ATI I: AT4G1182(J(BAPI)
OSA: 4331418 4347614
CME:CMM]89C
SCE: YMT.1260(1 ÍRG13)
ACK): AGOS_A I )1.3560
PIC: PTCST_83020
CAL: CaO19_7312(CaO19.7312)
CGR: CAGLOIKMOKJg
SPO: SPAC4F8.14e(hes)
MGR: MGG_01026
ΑΝΓ: AN4923.2
AI M: AFUA 3G10660A1UA 8G07210
AOR; Λ009(Χ)0300()611 Λ0090010000487 ONE; CNCÜ508Ü CNG02670
UMA; (JMO5362.1
ECU: ECU10_()5l0
DOI; DDBDRAFT_0217522
DI)H_()2l9924(ligsA)
TET: TTHERM_()069l 190
IBR; Tb927.8.611(1
YPE: YPOI457
YPK: y2712(pk.sG)
YPM: YP_1349(pksG)
ΥΙ’Λ: ΥΡΛ_0750
YPK: YPN.2521
YPP: YPDSF_1517
Yl’S: Y1TB1475
CBD: COXBU7E912_J931
TCX: Ter_l7l9
DNO; DN0_()799
ΒΜΛ: ΒΜΛΛ12.Ι2
BPS: BPSSI002
BPM: BURPSJ710b_A2613
DPL: BURI’S 1106A A1384
BPD; BlJRPS668_A1470
DTE:BTI1 111670
ΜΧΛ; MXAN_3948(tae) MXAN_4267(iuvaS)
HSU: BGlO926(pks(T)
Olli; OB2248
SA (J: SA2334( m vaS)
SAV: SAV2546(mvaS)
SAM: MW2467(mvaS)
SAR: SAR2626(mvaS)
SAS: SAS2432 .SAC: SACOL256J
SAB: SAB2420(mvaS)
SAA: SAi:SA3(X)_2484
SAG; SAOIJ[]S(’J)2860
SAJ: SaurJI I9_2569
3ΛΠ: SaurJHl_2622
SEP: SE2110
SER; SERP2122
SHA: SI 10508(mvaS)
SSP: SSl’0324
l.MO: Imo 1415
LME; LMOÍ2365_1434tmvaS)
LIN: 11111454
LWE: lwel432(mvaS)
LLA; L13187(hnicM)
1.( .C: ( ACR_I666
LI.M: lling_0929(lnntM)
SPY: SPy_O88](mvaS.2)
SPZ; M5(M)5_Spy_O687(mvaS. 1)
SPM; spyM 18_0942(invaS2)
SPG: SpyM3J)600(mvaS,2)
SI’S: SPs1253
SPU: MGASl()270_Spy0745(mvaSl)
S p]: MGAS10750_Spy0779(mvaS 1)
SPJ: MGAS2096JSpy0759(mvaS 1)
SPK; MGAS9429_SpyO743(mvaS 1)
Sl’l·: SpyM51121(mvaS)
SPA; M6_Spy()7O4
SPB: M28_SpyO667(mvaS I)
SPN; SP.1727
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 340/355
336/343
SPR; sprl571(mvaS) EBR: EVIS.l363
SPD: Sl’D_l537(mvaS) EGA: LSE1.I785
SAG: SAG 1316 EGA: IGAS.l 372
SAN: gbsl386 ERE: Lreu_0676
SAK: SAK_1347 PPE: PEPE.O868
SMIT: SMU.943c EFA: EFI363
STC: strt)577(mvaS) ÍXJE: OEOE.0968
STL: sruÜ577(mvaS) LMEiLLUM 1184
STE; STER.062I NEA; nfa22120
SSA: SSA_O338(mvaS) SEN: SACE_4570(pksG)
SSU: SSUÜ5 1641 BBU: BB0683
SSV: SSU98.1652 BGA: 15(10706
SGO: SGO_Ü244 BAF: BAPKO_Ü727
LPL; lp_2067(iuvaS) 1 IO: l;joh_0678
I.JO: ]J1607 UAE: VNG1615G!invaB)
I.AC; EBA(162S(brucS) []MA; miACI740(invaS)
l.SA: LSAI484(mvaS) 1IWA: HQ2868A(mvaB)
I.SE: I.SL.0526 NPH: NP2608A(invaB_J) NP4836A(mvaB_2)
] .1311: 1x16088 l(invaS)
LBE: EBU1 ,_Ü806
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de
hidroximetilqlutaril-CoA reductase
USA: 3156(1 IMGCR) PA E: Pai1-0427
PTR: 471516(IIMGCR) CBU: CBU-0030 CBU_0610
MCC: 705479(1 IMGCR) CBD: COXBU7E912.0151
MMU: 15357(Hmgcj·) COXBl T7E912.0622(11mg A)
RNO: 25675(1 linger) TCX: Tcr_1717
CFA; 479182(1 IMGCR) DNO: DNO-0797
BTA: 407159(1 IMGCR) CVl: CV. I806
GGA: 395145(RCJMD04_14ni24) SUS: Acid 5728 Acid.6132
SRl373355(1 <O(373355) SAU: SA2333(mvaA)
DME: Dmel CG 10367(1 linger) SAV: SAV2545(mvaA)
CEL: 1Ό8Ε8.2 SAM: MW2466(mvaA)
OSA: 4347443 SAB: SAB2419c(mvaA)
S( Έ: Y1 JR450W(l 1MG2) YMI O75( I( HMG1) SEP: SE2109
AGO: AGOS.AER I52W EWE: lwe08l9(mvaAj
CGR: CAGLOI.l 1506g LI.A: 1,10433(111 vaA)
SIO: SlA:X']62O9c(hnig]) LLC: LACR-1664
ΛΝΙ: AN3S17.2 LLM: lling_O931(mvaA)
ARM: AEUA.lGl 1230 AF1JA_2G()3700 SPY: SPy_O88O(iuvaS.l)
AOR: AO09(J 10300(1311 AOÜ9ÜI20ÍW2I7 S PM: spyM 18.0941 (mvaS 1)
CNE: CNI;O4R3(1 S l*G: SpyM3-0599(mvaS 1)
DMA: UM03014.1 SI’S: SPsl254
ECU: ECU 10.1720 SPII: MGAS10270_Spy0744
1)1)1: ])l)B_0191125dtmgA) SPI: MGAS10750_Spy0778
DDB_0215357(hmgB) SPJ: MGAS2096_Spy0758
TBR: ΊΕ)927.6.4540 SPK: MGAS9429_Spy0742
TCR: 506831.40509167.20 SPA: M6_Spy0703
I.MA: LnijF303190 SPN: SP-1726
VGU; VCAO723 SAG; SAG1317
VCO: VCO395J)(>62 SAN: ght]387
VVU:VV2 0117 SEC: suO576(invaA)
VVY; VVA0625 S I L; sLu0576(uivaA)
VPA: VPA0968 SEE: STERJJ62O
VI I: VFA0841 SSA: SSA_O337(mvaA)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 341/355
337/343
I.PL; lp_0447(invaA) AFU; AF1736(iuvaA)
JJO: 1J1608 IIAL: VNG1875G(mvaA)
LSI.: LSI._0224 HMA: niiAC3412(rnvaA)
1 RR: 1 ,VLS_0450 IIWA: E K)3215AlhnigR)
LUA: 1OAS_1373 NPII: NlO368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_l)
EFA:EF1364 1 AC: Ta0406nt
NFA: nra2211Ü TVOrTVNI 168
BGA: DG0708(mvaA) 1ΊΌ: ΙΊΌ1143
SRU; SRU_2422 ΡΛΒ: PAB2106(mvaA)
FPS: FP2341 PFU: PF1848
MM1’: MMl’Ü087(JimgA) TKO: TK0914
MMQ: MinarCS-1589 Rt ]: RC[XlO27(hmgA) RClX376(hingA)
MAC: MA3O73(hmgA) APE: APE_1869
ΜΒΛ: Mbar_A1972 II10: Ign i_0476
MMA: MM 0335 IIBU: Ubut 1531
MBU; Mbiir_1098 SSO; SSO053I
MHU: Mhun_3(X)4 S IO: ST 1352
MPM: ΜυιικΐΓ_2365 SAI: Saci_1359
MBN: Mho()_0] 37 ΡΛΕ: PA 1/2182
ΜΊΉ: ΜΊΉ562 PIS: Pisl_08l4
MST: Msp_0584(htiigA) PCE : PcaL_IO85
MSI: MsmJ)227 PAS: ]’ars_0796
ΜΚΛ: MKO355(HMG1)
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de mevalonato quinase
HSA: 4598ÍMVK)
MCC: 707645(MVK)
MMU: 17855( Mvk)
RNO: 81727(Mvk)
CFA: 486309(MVK)
ΒΤΛ: 505792(MV K)
GGA: 768555CMVK)
ORE: 492477(zgc; 103473)
SPU: 585785CLOC585785)
DME: Dmel_CG33671
OS A: 4348331
SCE; YMR208W(ERG12) AGO: AGOS_AER335W
PIC: P1CST_4O742(ERGJ2)
CGR: CAGU)FO386lg
SPO: SPACI3G6.1Jc
MGR: MGGJ)6946
A NI: ΛΝ3869.2
ΑΓΜ: AFUA_4G07780
A OR: ΛΟ()9(Χ)23000793 (’NE: CNKD1740
ECU: ECU09_1780
DDL DDBDRA1T_0168621
TET: TTT1ERM_OO63768O
TBR: 'Ib927.4.4070
TCR: 436521.9 509237.10
I.MA: LinjFS 1.0560
CBU: í’BU_0608 CBU_0609
CBD; COXBU7E912_(J62U(mvk)
I.PN; lpg2039
LPF: lp!2017
I.PP: lpp2022
BBA: Bd 1()27( InibP) Bdl63O(mvk)
MXA: MXAN_5019(iuvk)
O11I: OBÜ225
SAU: SA0547(mvaK I)
SAV: SAVD590(mvaKJ)
SAM: MW0545(ihvíiK1)
SAR: SAR0596(invaKI)
SAS: SAS0549
SAC: SACOí 0636(mvk)
SAB; SAB0540(mvaK1)
SAA: SAi:SA300_0572(irivk)
SAO: SADUHSC_ÜO577
SEP; SE0361
SER: SERPO238(mvk)
SUA: SII24(12(mvaK1)
SSP: SSP2122
I.MC>: JmoOOlO
I.MI·: T.MOf2365_OOl 1
LINrlinOOlO
LWE: IwcOOl l(mvk)
LLA: L7866(ycaG)
LLC: LACR.0454
LLM: lluig_0425(mvk)
SPY: SPy_O876(mvaKI)
SFZ: M5OO5_Spy_O682( jnvaKl)
SPM: spyM18_0937(mvaKn
5PG: SpyM3_0595(mvaKl)
SPS; SPsl258
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 342/355
338/343
SPH; MGAS1027()_Spy0740(mvaKl) BGA: BG0711
SPI: MGAS IO75O_SpyO774(mvíiKl) BAE; BAPKOJJ732
SPE MGAS2O96_SpyO753(m vaKl) EPS: FP0313
SPK: MGAS9420_Spy()737(iiivíiKl) MVIP: MM PI 335
SPI·’: SpyM51126(mvaK1) ΜΛΕ: Main>_D775
SPA: M6_SpyO(>99 MAU: MA0602(mvk)
SPB: M28_SpyO662(mvaKl) MB A: Mbar_AI421
SPN: Sl’_0381 MVIA: MM_1762
SPR; spr()338(i»vk) MBU; Mbur_2395
SPD: SPD_0346(mvk) MI1U: Mhun_2890
SAG: SAG 1326 MEM: Mcniat_1812
SAN: ghsl3% MBN: Mboo_2213
SAK: SAK 1357(mvk) MST: Msp_0858(nivk)
SMU; SMU.181 MSI: Msni_1439
S'JX'i slrí}559(mvaKl) MKA: MK0993(ERG12)
S’H,; slu(1559(ruvaKl) 11ΛΕ: VNG1145G(nivk)
STE: STERJ1598 ΙΙΜΛ: miAC0077(mvk)
SSA; SSA_0333(mvaKI) HWA; HQ2925A(nivk)
SSU: SSU05_()289 NPE1: NP2850A(mvk)
SSV: SS(J98_D285 Ρ1Ό: ΡΊΌ1352
SGO SGO_0239(mvk) 1’1 IO: PI 11625
J.PL: lp_ 1735( in va K1.) ΡΛΒ: ΡΛΒ0372(uivk)
JJO: 1J12O5 PFU: PF1637(mvk)
] AC: I.BA1167(mvaK) TKO:TK]474
J.SA: I.SA0908(mvaKl) R(’I: I.R(’399(mvk)
] .SI.: I SL_0685(cRG) A PE: APE_2439
J.DB: Li1b0999(mvk) IIBU: IIbut_O877
LBU: LDUL_0906 SSO: SSO0383
J.BR; J.VIS_0858 STO:ST2J85
T.CA: LSEI_1491 SAI: $ací_2365(nivk)
LGA: LGAS_1033 MSE: Mscd_1602
I RE: Ereu_09E5 PAI: PAE3108
PP13: PEPE 0927 PIS: Pis] 0467
EFA: EI W04(mvk) PCI.: PcaL_1835
OOE: ΟΕΟΕ.1ΠΧ)
L.ME; LEUM_1385
NI Λ: n6122070
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de fosfomevalonate quinase
HSA: 1()654(PMVK) PTR: 45735Ü(PMVK) MCC: 717O14(PMVK)
VI MU: 6 8603( Pm vk)
CFA: 61225 l(PMVK)
RIA: 513533(PMVK)
DME: Dmel_GG 10268
ATH: AT1G3191Ü
OSA; 4332275
SCE: YMR220W(ERG8)
AGO: AGOS_AER354W
PIC: PICST_52257(ERG8)
CGR: CAGL0I'O3993g
SPO: SPAC343.01c
VIGR: MGGJJ5812
ΛΝΙ; AN231L2
AFM; AFUA_5G10680
AOR: A0090010000471
CNE: CNMOmOO
UMA: UM00760.1
DDE DDBDRAFT_0184512 JBR: 11/)9.16().3600
TOR: 507913.20 508277.140
LMA: LmjF15.146Ü
ΜΧΛ: MXAN_5017
OITI: OB0227
SAU: SA0549(invaK2)
SAV: SAV()592(iiivíiK2)
SAM: MW0547(mvaK2)
SAR: SARÜ59K(jiivaK2)
SAS: SASÜ55I
SAC: SACOI.0638
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 343/355
339/343
SAB; SAB0542(invaK2)
SAA: SAUSA300_0574
SAG; SAOLHSCJXB79
SAJ: SaurJI IO_O615
SEP: SEO363
SHR: SFRIO240
SHA: SH2400(mvaK2)
SSP: SSP212O
J.MO; ImoOOl2
J .MF: LMOf2365_Q013
LIN: L110012
LWli: lwcOQ13
LLA: LlOO14(ycbA)
LLC: LACRJJ456
J.J.M: llmg_O427
SPY; SPy_O878(mvaK2)
SPZ: M5005_Spy_0684(iiivaK2)
SPM: spyM18_O939
SPG: .SpyM3_O597(mvaK2)
SPS: SPsl256
SP11: MGA$l027()_Spy0742(mviiK2)
SPI: MGAS IO75O_SpyO776(mvaK2)
SPJ: MGAS2l'W6_Sp_yO755(invaK2)
SPK: MGAS0420_Spy0730(nivaK2)
SPF: SpyM51124(mvaK2)
SPA: M6_Spy070l
SPB: M28_Spy0664(iuvaK2)
SPN: SP.O383
SPR; sprO34O(mvaK2)
SPD: SPD_0348(mvaK2)
SAG: SAG 1324
SAN: gbsl394
SAK; SAK_1355
SMU: SMU.938
STC: slrO561(riivnK2)
SIL: stuO56l(nivaK2)
STI’: STER_OÓOO
SSA: SSA_0335(mvaK2)
SSI J: SSU05JJ29 I
SSV: SSU98_O287
SGO: SCK>_D24I
I .PI.: Jp_ I 733(nivaK2)
LJO: LJ1207
LAC: LBAI169
LSA: LSA0906(mvaK2)
LSL; LSL_O683
LDB: L<JbO997(mvaK)
LBU; LBUL_O9O4
LBR: LVIS_O86O
LCA: LSELIO92
IGA: LGAS_1035
ERE: 1 jcu_CJ913
PPK: PEPE_O925
IÍI-’Λ: ΕΙ-Ό9Ο2
NFA; ιιΓιι2209()
BGA: RG07JQ
ΒΛΕ: BAPKO_0731
NP1I: ΝΡ2852Λ
SSO: SSO2988
S TO: STO978
SAI: Saci 1244
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplificadores de difosfomevalonato decarboxilase
USA: 4597IMVD) TBR: 11)10.05.0010 11)10.61.2745
PI’R:468069(IVIVI)) ICR: 507993.330 511281.40
MCC: 696865(MVD) I .MA; Ln ij Fl 8.0020
MMU: l92156(Mvd) CBU:CBU_0607(nival))
RNO: 81726(Mvd) CBD: COXBU7E9l2_06l9(tnvaD)
CFA: 489663(MVD) LPN; lpg2040
GGA: 425359(MVD) I .Pl’: lpl201K
DME: Dmcl_CG8239 LPP: lpp2O23
SCE: YNR043W(MVni) J’CX: Tcr_1734
AGO: AGOS_AGL232C DNO: DNG_0504(mvaD)
PIC: PICS I’_9O752 ΠΒΛ: 0(11629
CGR: CAGL0tO3630g ΜΧΛ: MXAN_5018(niviiD)
S1O: SPAC24C9.03 Olli: OB0226
MGR: MGG_0975() SAI J; SA0548(invaD)
ANI: AN4414.2 SAV: SAV0591(mvaD)
Λ1 M: AHJA_4G07130 SAM; MW0546(mvaD)
AOR: A009(X)23000862 SAR: SAIi()597(mvaD)
CM·: CNI.04950 SAS: SAS0550
UMA: (JMO5179.1 SAC: SACOL0637(iuvaD)
]^DI: DDBDRAl'TjmWSK SAB: SAB0541(mvaD)
TET: JTIUÍRMJ10849200 SAA: SAUSA3(XL0573(ruvaD)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 344/355
340/343
SAG; SAOUHS('JX)578
SAJ: SaurJl 19.0614
SAH; Saur.THlJ)629
SEP: SH0362
SER: SERIK)239(mvaD)
SI ΙΛ: SI 124()1(nival 1)
SSP: SSP2I2I
LMO: InioOO 11
I .MF; LMOÍ2365 JX) 12(iiivaD)
UN: linOOl I
LWL;: lwcOO12(mvaD)
1.1 .A: l.9089(yeaH)
LLC: LACR 0455
LLM; lling_O426(mvaD)
SPY: SPy_O877(mvaD)
SPZ: M50()5_Spy_0fi83(ruvaD)
SPM: spy M ] 8_O93 8(m vd)
SIX}; SpyM3_0596(mvaD)
SPS: S Ps] 257
SPH: M(IAS 1()270_Spy0741 (mvaO)
SP]: MGASl()750_Spy0775(mval))
SPJ: M( lAS2O96_SpyO754(nival))
SPK; MGAS9429_Spy0738(mvaD)
SPF: SpyM51125(nival))
SPA; M6_Spy0700
SPB: M28_Spy()663(nivaD)
SPN: SPJJ382
SPR; sptO339(mvdl)
SPD; SPD_0347(invaD)
SAG: SAG 1325(mvaD)
SAN; gbsl395
SAX: SAK_l356(invaD)
SMU: SMU.937
SIC: sli0560(mvaü)
SIT: slu(J560(mvaO)
SIL: STLRJ1599
SSA: SSAJ)334(mvaD)
SSI J: SSI 105.0290
SSV: SSI J98.O286
SGO: SGO_()240(nivaD)
I .PL: lp_1734(nivaD)
I JO: LJ12()6
LAC: LBAH68(mvaD)
LSA: LSA0907(mvaD)
LSI.; LSL_0684
I.DB: I.dbO998(mvaD)
LBU: LBUL.O9O5
I .UR: I.VLSJ)859
LCA: LSLI 1492
LGA; LGAS_1O34
I,RE: ljeu_(J9J4
PPli: PEPE.O926
EFA: EFO9O3(mvaD)
1.ME: I .El JM_13«6
Ν1-Λ: nfa22080
BBU: BB0686
EGA: RG0709
ΒΛ1·: BAPK0JJ73O
GFO; GEO_3632
EPS: FlWKXmvaD)
II Al J: I Iaur_l 612
HAL: VNG0593G(dmd) 1ΙΜΛ: rrnAC1489(dnid)
I1WA: IIQ1525A(mvaD) ΝΡΓΙ; NP15K0A(mvaD) PTO: ΡΤΌ0478 PTO1356
SSO: SSO2989
STO: STO977
SAI: Saci. 1245(mvd)
MSE: Msed_L576
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplificadores de isopentenila fosfato quinases (IPK)
Methun&bueferíwn íhertnoamoirophícum gil2621082
Methimococcus junnaschii l)SM 2661 “111590842
Methufíacaidacoccus jartnuschii gill590842
Meihanoikermobcieier ihennattloirofihicus gi!2621082
Picr#philtt:> lorridtts DSM9790 (IG-57) £1148477569
Pyrwoccus abyssi gil 1452()758
Pyroiotcus horiktmhii 01’3 gil3258O52
Archueogiobus fulgidus DSM4-304 gil2648231
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplificadores de isopentenildifosfato Delta-isomerase (IDI)
HSA: 3422(1011) 91734(1012) ri’R: 450262(1012) 450263(1011)
MCC: 710052(LOC71(X)52)
72173()(LOC72173(1)
MMU: 310554( Idil)
RNO: 89784(ldil)
GGA; 42(1459(1011)
XI.A: 494671(1.0('494671)
XTR: 496783(idi2)
SPU: 586184(1.00586184)
Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 345/355
341/343
CEL: K06H7.9(idi-l)
ATI I: AT3G02780ÍIPP2)
OSA; 433X791 4343523
CME:CMB062C
SCE: YPI.117CUDI1)
AGO: AGOS_AI)L268C
PIC; PTCST_68990(IDI I)
CGR: CAGL0J06952g
SPO: SPBCI06.15(idil)
ANI: ANO579.2
Al M: AEUA 6G11160
AOR: A0090023000500
ONE: CNA02550
UMA: UMO4838.1
ECU: ECU02.Ü230
DDE DDB_OI9l342(ipi)
ΤΕΤ:ΊΊΊΙΙ·ΚΜ_0023728()
TTHERM_OO43886O
I HR: 11109.211.0700
I CR; 408799.19 510431.10 ] ΛΙΛ: I .mjF35.5330
EI II: 46.100025
EGO; h2889(idi)
ECJ: JW2857(idi)
ECE: Z4227
ECS: ECs3761
ECC: c3467
ECE UTI89.C3274
ECP: ECP.2882
ECV: APECOl.3638
ECW; EcE24377A_3215(idi)
ECX: EcIIS_A3048
STY: STY3195
SlJ': 12957
SKI: SPA29(J7(idi)
SEC: SC2979(idi)
STM: SlM3039(jdi)
SEI.; SF2875(idi)
SI X: S3074
Sl’V: 51Ύ.2937
SSN: SSON.3042 SSON_3489(yhrK)
SBO: S 00.31()3
SDY; SDY_3193
ECA: ECA2789
Pl.U: plu39S7
ENT: Ein638_33O7
SPE: Spm_2201
VPA: VPA0278
VFI: VFO4O3
PPR: PBPRA0469(mvaD)
PEN: PSEEN4850
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXDU7E912_0619(nivaD)
l.PN: lpg2051
J.14·: lpl2O29
LPP: lpp2()34
TCX: Tcr.1718
ΗΗΛ: Hlial_1623
DNO: DNO_0798
EBA: ebA5678 p2A143
DVU: I>VIJ]679(idi)
UDE: Dde_1991
I.IP: LU 134
BBA: BJJ62Ó
AEW: Anael09.4082
MXA: MXAN_5021(fni)
RPR: RP452
Rl’Y: RT0439(idi)
RCO: RC0744
REE: RI-_O785(fni)
RBE: RBE_0731(fni)
RAK: A1CJJ4I90
RBO: A 11.04755
RCM: A]E_O2555
RRI: AIG.04I95
MEO: mh-6371
R1 iT: RH1 _PD00245iypd(XX)46)
XAU: Xaut_4l34
SIL: SIOÜ131
SIT; TM1040.3442
RSP: RSP.0276
RSI1: R;;phl7029_1919
RSQ: Rsph 17025.1 ¢)19
JAN: Jatiti-OJ 68
RDE: RDl_0147(idi)
DSII: Dshi_-3527
BSU: BG11440(ypgA)
BAN: ΒΛ1520
BAR: GBAA1520
BAA: BA 2041
BAT: BAS 1409
BCE: BC1499
BCA; BCE-1626
BCZ: Βθ/.Κΐ380(Γηί)
BCY: Bcer98_1222
B l K: B 19727-1381 (fni)
BTL: BALE. 1354
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Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplificadores de isopreno sintase
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema para a produção de um copolímero de isopreno, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis; em que a composição inicial de isopreno é compreendida de mais de cerca de 2 mg de isopreno e um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo em etanol, acetona, metanol, acetaldeído, metacroleína, metil vinil cetona, 2-metil-2-viniloxirano, cis- e trans-3-metil-1,3pentadieno, um álcool prenílico C5, 2-heptanona,
    6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5 - trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetil, 2butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1- propanol, 3metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, e (Z)-3,7-dimetil-1,3,6octatrieno; e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma porção do material inicial de isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial de isopreno sofre polimerização com outra molécula não-isopreno para produzir um copolímero.
  2. 2. Sistema para a produção de um copolímero de isopreno, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis; e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma porção do material inicial de isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial de isopreno sofre polimerização com outra molécula não-isopreno para produzir um copolímero, em que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis compreende mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreende mais que, ou cerca de 99,94%, em peso, de isopreno em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na
    Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 349/355
    2/3 composição.
  3. 3. Sistema para a produção de um copolímero de isopreno, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis; e (b) um polímero produzido a partir de pelo menos uma porção do material inicial de isopreno; em que pelo menos uma parte da composição inicial de isopreno sofre polimerização com outra molécula não-isopreno para produzir um copolímero, em que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis compreender mais de cerca de 2 mg de isopreno e compreender um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em etanol, acetona, alcoóis prenil C5, e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
  4. 4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis compreende menos do que 0,5 pg/L por composto de qualquer composto na composição que inibe a polimerização de isopreno.
  5. 5. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polímero é um copolímero selecionado do grupo consistindo em (i) copolímeros de isopreno e 1,3butadieno, (ii) copolímeros de isopreno e estireno, (iii) copolímeros de isopreno, 1,3-butadieno e estireno, e (iv) copolímeros de isopreno e αmetil estireno.
  6. 6. Sistema de acordo, com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polímero produzido a partir do material inicial de isopreno é um polímero de poli-isopreno que é compreendido de unidades de repetição que derivam de monômeros de isopreno, em que o polímero de poli-isopreno tem valor ím superior a 0,9.
  7. 7. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais de:
    Petição 870190087033, de 05/09/2019, pág. 350/355
    3/3 (i) um catalisador para polimerização de isopreno, (ii) um iniciador de polimerização, (iii) um tensoativo iônico, (iv) um solvente orgânico adequado, e (v) um finalizador de cadeia de polimerização.
  8. 8. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição inicial de isopreno inclui etanol.
  9. 9. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis inclui acetona.
  10. 10. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis inclui pelo menos um álcool prenílico C5.
  11. 11. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição inicial de isopreno derivada de recursos renováveis inclui pelo menos um composto isoprenoide com 10 ou mais átomos de carbono.
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