DE19629568C1 - Verfahren zur Herstellung von Isopren - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Her­ stellung von Isopren.

Isopren ist ein begehrter ungesättigter Kohlenwasser­ stoff für die Kunststoff- und Kautschukindustrie. Ein Großteil des Rohstoffs Isopren dient der Herstellung von cis-Polyisopren, das als Isoprenkautschuk neben dem aus Bäumen gewonnenen Naturkautschuk für die Rei­ fenindustrie eingesetzt wird. Daneben wird Isopren über die Copolymerisation mit Isobutylen zu Butyl­ kautschuk verarbeitet, aus dem Dichtungen und Schläu­ che hergestellt werden. Isopren oder durch Polymeri­ sation von Isopren herstellbare längerkettige Isopre­ noide spielen darüber hinaus auch als Basissubstanzen in der Parfumindustrie eine wichtige Rolle.

Bislang wird der Rohstoff Isopren nur in geringer Menge über Raffination aus Erdöl oder Rohkautschuk gewonnen. Neben der direkten Raffination aus Erdöl wird Isopren auch durch die aufwendige katalytische Dehydrierung von Paraffinen oder Olefinen mit 5 C- Atomen gewonnen. Etwa vergleichbar aufwendig kann Isopren auch aus Isobuten und Formaldehyd oder über die Propendimerisierung dargestellt werden.

Nachteilig an diesen herkömmlichen Herstellungsver­ fahren für Isopren ist der große technische und ener­ getische Aufwand.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein ein­ faches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Isopren zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren zur Herstel­ lung von Isopren nach dem Oberbegriff des Anspru­ ches 1 in Verbindung mit seinen kennzeichnenden Merk­ malen gelöst.

Der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Mikroorganismus erzeugt auch schon ohne das Gen für die Isoprensynthase im Wege seines gewöhnlichen Stoffwechsels bereits die Vorstufen für die Isopren­ synthese durch die Isoprensynthase. Daher erzeugt der Mikroorganismus, der das Gen für eine Isoprensynthase enthält, bei seiner gewöhnlichen Anzucht, beispiels­ weise mit Zucker, gasförmiges Isopren und setzt die­ ses frei. Der Organismus kann daher erfindungsgemäß in einem Fermenter in kontinuierlicher Kultur angezo­ gen werden, und das von dieser Kultur freigesetzte Gas kann aufgefangen und einer fraktionierten Kühlung unterworfen werden. Isopren besitzt einen Siedepunkt von 34°C, so daß es einfach aus dem Abluftgemisch des Fermenters kondensiert und gesammelt werden kann.

Als Ausgangssubstanzen für eine kontinuierliche iso­ prenproduzierende Fermenter-Kultur mit dem Mikroorga­ nismus werden nur Nährsalze und z. B. Saccharose als Kohlenstoffquelle und eine Begasung mit Umgebungsluft benötigt. Alle diese Substanzen sind kostengünstig verfügbar. Nach dem Ansatz kann die Kultur des iso­ prenproduzierenden Mikroorganismus über lange Zeit unter geringem Arbeitsaufwand aufrechterhalten wer­ den. Da Isopren weiterhin nicht gesundheitsschädlich ist und als Gas ohnehin von einer Reihe von verholz­ ten Pflanzen freigesetzt wird und daher in der Umwelt auch natürlich vorhanden ist, ist eine Produktion unter geringer Sicherheitsstufe möglich.

Vorteilhafterweise wird als Mikroorganismus ein Bak­ terium, beispielsweise Escherichia coli, oder eine Hefezelle, beispielsweise Schizosaccharomyces pombe, verwendet. Diese Mikroorganismen sind auf einfache Art und Weise in Kultur zu ziehen. Wird vor dem Iso­ prensynthasegen ein Promotor für eine starke Expres­ sion eingefügt, so wird die Erzeugung von Isopren aufgrund des erhöhten Isoprensynthasegehaltes der Mikroorganismen gesteigert.

Die Herstellung des Mikroorganismus erfolgt vorteil­ hafterweise, indem eine cDNS-Genbank einer Pflanze, die eine Isoprensynthase exprimiert, hergestellt wird, und daß mit dieser cDNS-Genbank eine Mikroorga­ nismenkultur transformiert wird. Anschließend wird mit Hilfe einer Gensonde derjenige Mikroorganismus ausgewählt, der das Isoprensynthasegen enthält. Zur Erzeugung der Gensonde kann aus der DNS der jeweili­ gen Pflanze mit Hilfe geeigneter Oligonukleotide und einer Polymerase-Kettenreaktion ein Segment des Iso­ prensynthasegens vervielfältigt werden.

Sollte der transformierte Mikroorganismus sich nicht zur Anzucht in einer Kultur in großer Menge eignen, so kann in ansonsten bekannter Weise das Isoprensyn­ thasegen nunmehr auf einen geeigneten Mikroorganismus übertragen werden.

Als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion eignen sich Oligonukleotide, deren Nukleotidsequenz entspre­ chend bekannten Aminosäuresequenzsegmenten von Iso­ prensynthasen auch anderer Pflanzen ausgewählt wurde.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel eines Ver­ fahrens zur Herstellung eines Mikroorganismus erläu­ tert.

Zur Herstellung eines Mikroorganismus muß ein Iso­ prensynthasegen aus Pflanzen auf einen Mikroorganis­ mus übertragen werden. Dies erfolgt, indem in anson­ sten bekannter Weise eine Expressions-cDNS-Genbank der Stieleiche (Quercus robur), d. h. eine Sammlung von DNS-Fragmenten der Stieleiche enthaltende Vekto­ ren, beispielsweise mit einem Gen für Antibiotikare­ sistenz versehene Plasmide oder geeignete Bakterio­ phagen, hergestellt wird. Die Phagen werden in einem Bakterienrasen ausplattiert bzw. die Plasmide zu­ nächst in den geeigneten Mikroorganismus transfor­ miert und diese dann auf Antibiotika-haltigen Nähr­ böden ausgestrichen. Im Falle der Phagen entstehen an den Stellen, an denen die Bakterien durch die Gegen­ wart des Phagen lysiert wurden, kreisrunde sogenannte Plaques. Im Falle der Plasmidvektoren können nur die­ jenigen Mikroorganismen überleben und zu einer kreis­ runden Kolonie heranwachsen, die mit einem der Anti­ biotikaresistenzvektoren transformiert wurden. Nach Anwachsen der Kulturen bzw. der Ausbildung der Pla­ ques auf dem Nährboden stellt man nun einen Abdruck dieser Kultur auf einer geeigneten Filterfolie wie Nylon oder Nitrocellulose her. Dadurch haftet die DNS der Kultur bzw. des Phagen an der Filterfolie. Inku­ biert man die Folie nun mit einem DNS-Fragment, das mit dem gesuchten Isoprensynthasegen hybridisiert (einer Gensonde) wurde, so bindet diese Sonde an die­ jenigen Stellen des Abdrucks, an denen die DNS des Isoprensynthasegens haftet. Diejenigen Mikroorganis­ men oder Phagen, die der markierten Stelle entspre­ chen, besitzen folglich das Isoprensynthasegen. Bei der Verwendung der Plasmidvektoren sind diese Orga­ nismen bereits in der Lage, Isopren freizusetzen. Bei Phagenvektoren muß das Gen zunächst aus dem identifi­ zierten Phagen isoliert und in ein Plasmid kloniert werden. Erst nach Transformation dieses Plasmids in einen Mikroorganismus entsteht dann der isoprenprodu­ zierende Stamm.

Für die Auswahl geeigneter Oligonukleotide zur Erzeu­ gung der Gensonde wurden die von Silver und Fall "The Journal of Biological Chemistry" (1995, 270, Seiten 13010-13016) publizierten partiellen Aminosäurese­ quenzen einer Isoprensynthase aus Zitterpappel (Popu­ lus tremuloides) in die entsprechenden kodierenden Nukleinsäuresequenzen übersetzt. Infolge der Degene­ riertheit des genetischen Codes ergeben sich an vie­ len Stellen der Sequenz verschiedene Möglichkeiten der Übersetzung. Für die Synthese der Oligonukleotide wurde daher ein Bereich ausgesucht, der eine hinrei­ chend genaue Übersetzung zuläßt.

Für eine selektive und effiziente Vervielfältigung war es einerseits notwendig, nur möglichst wenige variable Stellen in den als Primer verwendeten Oligo­ nukleotiden zuzulassen. Andererseits war für den Start der Polymerase-Kettenreaktion am 3′-Ende der Oligonukleotide eine 100%ige Übereinstimmung unerläß­ lich. Deshalb wurden nur am 3′-Ende verschiedene Übersetzungsvarianten für die Synthese der Oligonu­ kleotide beibehalten.

Insgesamt wurden auf diese Art und Weise die folgen­ den drei verschiedene Oligonukleotide mit Variationen als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion in an­ sonsten bekannter Weise durch kommerzielle Oligonu­ kleotidsynthesizer hergestellt:

Oligonukleotid 1:
5′ AAT TAT GAG CCC CTC ACC TCS GAY TAY GAY TA 3′

Oligonukleotid 2:
5′ TCG TGC CAG TTG TCG TAN GCD ATY TCR TT 3′

Oligonukleotid 3:
5′ GCG GTC TCG ACG AAN GGY TTN GCR AA 3′

wobei Y C oder T, D G oder A oder T, R A oder G, S C oder G und N A, C, T oder G bedeuten.

Durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung zweier dieser Oligonukleotide bzw. ihrer Komplemente war es möglich, aus der DNS der Stieleiche (Quercus robur) Segmente des Isoprensynthasegens zu verviel­ fältigen.

In einem ersten Ausführungsbeispiel wurde mit Oligo­ nukleotid 1 in Kombination mit Oligonukleotid 2 und mit 1 µg isolierter Gesamt-DNS aus der Stieleiche eine Polymerase-Kettenreaktion unter folgenden Bedin­ gungen gestartet:
36 Zyklen mit je 30 s Denaturierung bei 94°C, 30 s Anlagerung bei 52°C und 60 s Polymerisationsreaktion bei 72°C.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde eine Po­ lymerase-Kettenreaktion mit Oligonukleotid 1 in Ver­ bindung mit Oligonukleotid 3 unter denselben Bedin­ gungen gestartet. Es wurde ein Segment der Stielei­ chen-DNS vervielfältigt, das eine Größe von ca. 740 Basenpaaren besaß. Dieses Segment von 740 Basenpaaren wurde zur Identifikation in einen Vektor (pCR II, Invitrogen Corporation) kloniert und sequenziert. Dieses Segment eignet sich nun als Gensonde zur Iden­ tifikation von Mikroorganismen, auf die in ansonsten herkömmlicher Weise das Gen der Isoprensynthase der Stieleiche übertragen wurde.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Isopren, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Mikroorganismus, der ein Gen einer Pflanze enthält, das für eine Isoprensynthase kodiert, in einem Behälter bei über 34°C kultiviert und
daß das gasförmige Stoffwechselprodukt Isopren aus dem Abluftgemisch aufgefangen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gasförmigen Stoffwechselprodukte einer fraktionierten Küh­ lung unterworfen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus das Gen für die Isoprensynthase aus Quercus robur enthält.