BRPI0906550B1 - Anticorpo anti-tigit, usos de um anticorpo anti-tigit e métodos in vitro para estimular a interação de cd226-pvr e/ou a interação de cd96-pvr, para aumentar ou estimular a proliferação de uma célula t ou a liberação de citocinas proinflamatórias por uma célula dendrítica, para aumentar ou estimular a resposta imune de célula t e para aumentar ou estimular a produção de citocinas proinflamatórias por uma célula dendrítica - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO OU DETECTAÇÃO, MODULAÇÃO, INIBIÇÃO, PARA AUMENTAR OU ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE, PARA MODULAR O TIPO E/OU A QUANTIDADE DA PRODUÇÃO DE CITOCINA, PARA ESTIMULAR A FOSFORILAÇÃO, PARA DIAGNOSTICAR, AVALIAR A GRAVIDADE, PREVENIR E PARA TRATAR OU DIMINUIR A GRAVIDADE DE UMA DOENÇA, POLIPEPTÍDEO, AGENTE ISOLADO, ANTICORPO ANTI-TIGIT, USOS DE PELO MENOS UM DE TIGIT, UM AGONISTA OU ANTAGONISTA DA EXPRESSÃO E/OU ATIVIDADE DE TIGIT OU UM AGONISTA OU ANTAGONISTA DA EXPRESSÃO E/OU ATIVIDADE DE PVR A presente invenção está relacionada a composições e métodos de utilização de composições para o diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas à imunidade.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está relacionada a composições e métodos úteis para o diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas à imunidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As doenças inflamatórias e relacionadas à imunidade são a manifestação ou consequência de múltiplas vias biológicas frequentemente interconectadas e bastante complexas que, em fisiologia normal, são críticas para a resposta a injúrias ou danos, início de um reparo de injúria ou dano e preparo da defesa inata ou adquirida contra organismos estranhos. A doença ou patologia ocorre quando estas vias fisiológicas normais causam uma injúria ou dano adicional tanto diretamente relacionado à intensidade da resposta, como uma consequência de regulação anormal ou estímulo excessivo, como uma auto-reação, ou como uma combinação destes.

[003] Embora a gênese destas doenças muitas vezes envolva vias de múltiplas etapas e muitas vezes múltiplos sistemas biológicos/vias diferentes, a intervenção em pontos críticos em uma ou mais destas vias pode ter um efeito de melhoria ou terapêutico. A intervenção terapêutica pode ocorrer tanto por antagonismo de um processo/via prejudicial ou por estímulo de um processo/via benéfico.

[004] Muitas doenças relacionadas à imunidade são conhecidas e extensivamente estudadas. Tais doenças incluem doenças inflamatórias relacionadas à imunidade, doenças inflamatórias não relacionadas à imunidade, doenças infecciosas, doenças de imunodeficiência, neoplasia, etc.

[005] Os linfócitos T (células T) são um importante componente de uma resposta imune em mamífero. As células T reconhecem os antígenos que estão associados com uma auto-molécula codificada por genes dentro de um complexo de histocompatibilidade maior (MHC). O antígeno pode ser exibido junto com as moléculas MHC sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos, células infectadas por vírus, células de câncer, enxertos, etc. O sistema de células T elimina estas células alteradas que constituem uma ameaça à saúde do mamífero hospedeiro. As células T incluem as células T auxiliares e as células T citotóxicas. As células T auxiliares proliferam extensivamente após o reconhecimento de um complexo antígeno-MHC em uma célula apresentando antígenos. As células T auxiliares secretam uma variedade de citocinas, isto é, linfocinas, que desempenham um papel central na ativação de células B, células T citotóxicas e uma variedade de outras células que participam na resposta imune. Outra subcategoria de células T auxiliares são as células T foliculares (TFh) (para revisão, ver Vineusa et tal., Nat. Rev. Immunol. 5: 853-865 (2005)). Detectáveis por sua expressão característica de receptor 5 CXC-quimiocina (Schaerli et al., J. Exp. Med. 192: 1553-62 (2000)), verifica-se que estas células produzem IL-10 e possivelmente IL-21. As células TFh fornecem assistência a células B centrais germinais, particularmente ajudando na sobrevivência e propagação de células B e induzindo potentemente à produção de anticorpos durante co-cultura com células B. Elas também estão implicadas em tolerogênese.

[006] As células T reguladoras (Treg) são um subconjunto de células T auxiliares que desempenham um papel crítico na inibição de respostas imunes auto-reativas e são muitas vezes encontradas em sítios de inflamação crônica tal como em tecido de tumor (Wang, H.Y. & Wang, R.F., Curr Opin Immunol 19, 217-23 (2007)). Tregs são definidas fenotipicamente pela expressão, em superfície com alto teor de células, de CD25, CLTA4, GITR, e neuropilin-1 (Read, S., Malmstrom, V. & Powrie, F., J Exp Med 192, 295-302 (2000); Sakaguchi, S., et al., J Immunol 155, 1151-64 (1995); Takahashi, T. et al., J Exp Med 192, 303-10 (2000); McHugh, R.S. et al., Immunity 16, 311-23 (2002); Bruder, D. et al., Eur J Immunol 34, 623-30 (2004)), e estão sob o controle do fator de transcrição FOXP3 (Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S., Science 299, 1057-61 (2003)). Tregs realizam sua expressão supressora sobre células T ativadas através de mecanismos dependentes de contato e de produção de citocina (Fehervari, Z. & Sakaguchi, Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004)). Tregs também modulam as respostas imunes pela interação direta com ligantes sobre células dendríticas (DC), tal como a interação de CTLA4 com moléculas B7 sobre DC que elicita a indução de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) (Fallarino, F. et al., Nat Immunol 4, 1206-12 (2003)), e a ligação de CD40L (Serra, P. et al., Immunity 19, 877-89 (2003)). DCs são células apresentadoras de antígenos profissionais capazes de induzir imunidade ou tolerância contra auto ou não auto-antígenos. Tregs expandidas com DC suprimem as respostas de alorreatividade in vitro (Yamazaki, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2758-63 (2006); Ahn, J.S., Krishnadas, D.K. & Agrawal, Int Immunol 19, 227-37 (2007)), e quando transferidas adotivamente, Tregs apropriadas inibiram diabetes em camundongos NOD com imunodefiência combinada severa (SCID) (Tarbell, K.V. et al., J Exp Med 199, 1467-77 (2004)) ou induziram experimentalmente asma (Lewkowich, I.P. et al. J Exp Med 202, 1549-61 (2005)). Interações específicas de ligantes em DC com Tregs também revogam sua função supressora, tal como o comprometimento de GITR em camundongos (Shimizu, J., et al., Nat Immunol 3, 135-42 (2002)), sugerindo que DC pode ter um papel pluralístico na modulação da função de Treg.

[007] As moléculas CTLA4 e GITR são representativas de ligantes definidos dentro das superfamílias CD28-B7 e TNF de moléculas co- estimuladoras/co-inibidoras, respectivamente (Greenwald, R.J., et al., Annu Rev Immunol 23, 515-48 (2005)). Estas moléculas são altas em Tregs, mas também são tipicamente reguladas ascendentemente sobre células T ativadas. A fim de pesquisar novas moléculas co-estimuladoras expressas em células Treg, foram realizadas pesquisas para identificar os genes especificamente expressos em células T (Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005) que tinham tanto os domínios de Ig como os motivos de inibição ou ativação baseados no imunorreceptor de tirosina (ITAM/ITIM). Através da interseção destas duas estratégias de pesquisa de bioinformática de amplo genoma, uma nova proteína ligada à superfície das novas células com a proteína codificadora de um domínio de IgV, um domínio de transmembrana, e dois motivos inibidores do imunorreceptor de tirosina putativo foi identificada (ver patente US 20040121370, incorporada ao presente por referência). A proteína designada TIGIT (para o domínio de Ig de células T e de ITIM) foi mostrada ser expressa em células T, particularmente Treg, e subconjuntos de células de memória - bem como células NK. Há uma necessidade de novas terapêuticas e métodos de tratamento para endereçar os distúrbios imunes, particularmente distúrbios autoimunes. No presente, os requerentes identificam parceiros de ligação de TIGIT e fornecem novas composições, métodos de detecção e métodos de tratamento para distúrbios da imunidade modulados pela interação de TIGIT com os parceiros de ligação e os efeitos de TIGIT elucidados na maturação e atividade de células T.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção refere-se a composições e métodos úteis para o diagnóstico e tratamento de doença relativa à imunidade em mamíferos, incluindo humanos. A presente invenção é baseada na identificação de proteínas envolvidas na regulação negativa da proliferação e função de certos tipos de células imunes. As doenças relacionadas à imunidade podem ser tratadas suprimindo ou aprimorando a resposta imune. As moléculas que melhoram a resposta imune estimulam ou potencializam a resposta imune de um antígeno. As moléculas que estimulam a resposta imune podem ser usadas terapeuticamente onde o aprimoramento da resposta imune pode ser benéfico. Alternativamente, as moléculas que suprimem a resposta imune atenuam ou reduzem a resposta imune para um antígeno (por exemplo, anticorpos neutralizantes) podem ser usadas terapeuticamente onde a atenuação da resposta imune seria benéfica (por exemplo, inflamação). No presente, os requerentes demonstram que a proteína TIGIT (para o “domínio Ig de células T e ITIM”) liga-se especificamente ao receptor de poliomielite (PVR, também conhecido como CD155) e vários outros membros de uma família de proteínas recentemente elucidada, e que esta interação TIGIT-PVR regula negativamente a ativação e proliferação de células T. Consequentemente, os polipeptídeos de TIGIT, agonistas dos mesmos e antagonistas dos mesmos, bem como polipeptídeos de PVR, agonistas dos mesmos e antagonistas dos mesmos são úteis para preparar remédios e medicamentos para o tratamento de doenças relacionadas à imunidade e inflamatórias. A presente invenção também fornece métodos de tratar doenças inflamatórias e relacionadas à imunidade e métodos e composições para detectar e avaliar o estado de doenças relacionadas à imunidade e inflamatórias.

[009] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo um ou mais dos seguintes aminoácidos: uma alanina em uma posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 67 de TIGIT humano, uma glicina em uma posição de aminoácidos correspondente à posição 74 de aminoácidos de TIGIT humano, uma prolina em uma posição de aminoácidos correspondente à posição 114 de aminoácidos de TIGIT humano e uma glicina em uma posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 116 de TIGIT humano. Em um aspecto, o polipeptídeo não é PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, TIGIT, CP96 ou CD226. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ainda um ou mais de: um aminoácido selecionado de valina, isoleucina e leucina em uma posição de correspondente à posição 54 de aminoácido de TIGIT humano, um aminoácido selecionado de serina e treonina em uma posição correspondente à posição 55 de aminoácido de TIGIT humano, uma glutamina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 56 de aminoácido de TIGIT humano, uma treonina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 112 de aminoácido de TIGIT humano, e um aminoácido selecionado de fenilalanina e tirosina em uma posição CE aminoácido correspondente à posição 113 de aminoácido de TIGIT humano. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ainda um ou mais submotivos estruturais selecionados a partir dos seguintes: (a) um aminoácido selecionado de valina e isoleucina na posição 54 de aminoácido - um aminoácido selecionado de serina e treonina na posição 55 de aminoácido - uma glutamina na posição 56 de aminoácido; (b) uma alanina na posição 67 - qualquer aminoácido em cada uma das posições 68-73 de aminoácidos - uma glicina na posição 74 de aminoácido; e (c) uma treonina na posição 112 de aminoácido - um aminoácido selecionado de fenilalanina e tirosina na posição 113 de aminoácido - uma prolina na posição 114 de aminoácido - qualquer aminoácido na posição 115 de aminoácido - uma glicina na posição 116 de aminoácido, em que a numeração das posições de aminoácidos corresponde às posições de aminoácidos de TIGIT humano, embora a numeração absoluta de aminoácidos no polipeptídeo possa diferir.

[010] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para determinar se um polipeptídeo de teste é um membro da família TLP de polipeptídeos, que compreende alinhar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de teste com uma sequência de aminoácidos de um ou mais membros da família TLP de polipeptídeos e avaliar a presença ou ausência na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de teste de uma ou mais de uma alanina na posição de aminoácidos correspondente à posição 67 de aminoácido de TIGIT humano, uma glicina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 74 de aminoácido de TIGIT humano, uma prolina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 114 de aminoácido de TIGIT humano, e uma glicina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 116 de aminoácido de TIGIT humano. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para identificar um ou mais membros da família da proteína TLP, através da identificação das proteínas em uma ou mais bases de dados de sequências, em que as sequências de aminoácidos compreendem pelo menos um aminoácido selecionado a partir de uma alanina na posição de aminoácido correspondente à posição 67 de aminoácido de TIGIT humano, uma glicina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 74 de aminoácido de TIGIT humano, uma prolina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 114 de aminoácido de TIGIT humano, e uma glicina em uma posição de aminoácido correspondente à posição 116 de aminoácido de TIGIT humano.

[011] Em outra modalidade, a invenção fornece um agente isolado que interage especificamente com uma ou mais regiões conservadas ou substancialmente conservadas de membros da família TLP. Em um aspecto, o agente é um antagonista da expressão e/ou atividade de um membro da família TLP. Em outro aspecto, o antagonista é selecionado de um inibidor de molécula pequena, um anticorpo inibidor ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um aptâmero, um ácido nucleico inibidor, e um polipeptídeo inibidor. Em outro aspecto, o agente é um agonista da expressão e/ou atividade de um membro da família TLP. Em outro aspecto, o agonista é selecionado de um anticorpo agonizante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um peptídeo agonizante, e uma molécula pequena ou proteína que ativa a ligação de TIGIT a PVR e/ou a sinalização intracelular de TIGIT mediada por PVR. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para identificar ou detectar um ou mais membros da família TLP, através do contato de um polipeptídeo membro da família TLP putativo com pelo menos um dos agentes acima e determinar a ligação de pelo menos um agente ao membro da família TLP putativo.

[012] Em outra modalidade, a invenção fornece um método de determinar se uma célula imune de teste é uma célula TFh, célula NK, célula T de memória ou Treg ativada ou normal, compreendendo avaliar o nível de expressão de TIGIT na célula imune de teste e comparando o mesmo ao nível de expressão de TIGIT em uma célula TFh, célula NK, célula T de memória ou Treg ativada ou normal conhecidas, ou comparando o nível de expressão de TIGIT na célula imune de teste aos valor (es) de expressão de TIGIT padrão conhecido (s). Em outra modalidade, a invenção fornece um método para modular a função e/ou atividade do sistema imune, que compreende modular a ligação de TIGIT a um ou mais de PVR, PVRL3 e PVRL2.

[013] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos um HVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID NOs: 23 a 28. Em outra modalidade, a invenção fornece uma anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo compreendendo pelo menos um HVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID NOs: 31 a 36. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 21. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 29. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 22 ou uma parte da mesma. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 30 ou uma parte da mesma. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 21 ou uma parte da mesma e a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 22 ou uma parte da mesma. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 29 ou uma parte da mesma e a cadeia pesada de anticorpo compreende a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 30 ou uma parte da mesma. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia leve do anticorpo é codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 50 ou uma parte da mesma. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TIGIT ou um fragmento do mesmo sendo que a cadeia pesada do anticorpo é codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 51 ou uma parte da mesma. Em uma modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo da invenção é selecionado de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo heteroconjugado, e uma imunotoxina.

[014] Em outro aspecto, o pelo menos um HVR da invenção é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um HVR descrito em qualquer uma das SEQ ID NOs: 21-28. Em outro aspecto, o pelo menos um HVR da invenção é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico a um HVR descrito em qualquer uma das SEQ ID NOs: 31-36. Em outro aspecto, a cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 21. Em outro aspecto, a cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 29. Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 22. Em outro aspecto, a cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 30. Em outro aspecto, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 21 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 22. Em outro aspecto, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 29 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 30.

[015] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para modular uma interação de CD226-PVR e/ou uma interação de CD96-PVR que compreende administrar pelo menos um de TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT in vivo ou in vitro. Em um aspecto, TIGIT ou um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT é administrado e a interação de CD226-PVR e/ou a interação de CD96-PVR é inibida ou bloqueada. Em outro aspecto, um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT é administrado e a interação de CD226-PVR e/ou a interação de CD96-PVR é estimulada.

[016] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para modular uma função e/ou atividade de células imunes através da modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT e/ou PVR, ou pela modulação da sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR. Em um aspecto, a modulação está diminuindo ou inibindo a proliferação de uma ou mais células imunes ou a liberação de citocinas pró-inflamatórias por uma ou mais células imunes, tratando as células in vitro ou in vivo com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou estimulando a sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR. Em outro aspecto, a modulação está diminuindo ou estimulando a proliferação de uma ou mais células imunes ou a liberação de citocinas pró- inflamatórias por uma ou mais células imunes, tratando as células in vitro ou in vivo com um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou inibindo a sinalização extracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR.

[017] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para inibir uma resposta imune, através da administração de TIGIT in vitro ou in vivo, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou pela estimulação da sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para aumentar ou estimular uma resposta imune, através da administração in vitro ou in vivo de um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou pela inibição da sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para modular o tipo e/ou quantidade da produção de citocina, a partir de uma célula imune, através da modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT ou de PVR in vitro ou in vivo. Em um aspecto, a produção de citocinas pró-inflamatórias é estimulada e/ou aumentada pela administração de um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou inibindo a sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR. Em outro aspecto, a produção de citocinas pró-inflamatórias é inibida pela administração de um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de PVR, ou estimulando a sinalização intracelular mediada pela ligação de TIGIT a PVR.

[018] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para estimular a fosforilação e/ou sinalização intracelular de ERK através da via de ERK em uma ou mais células imunes, que compreende tratar a uma ou mais células imunes com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR.

[019] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para diagnosticar uma doença relacionada à imunidade, referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, que compreende avaliar a expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra do paciente e comparar a expressão e/ou atividade de TIGIT a uma quantidade de referência da expressão e/ou atividade de TIGIT ou a quantidade da expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente normal. Em um aspecto, a doença relacionada à imunidade é selecionada a partir de psoríase, artrite, doença intestinal inflamatória ou câncer. Em outro aspecto, o câncer é câncer de mama. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para avaliar a gravidade de uma doença relacionada à imunidade referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, que compreende avaliar a expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente e comparar a expressão e/ou atividade de TIGIT a uma quantidade de referência da expressão e/ou atividade de TIGIT ou a quantidade da expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente normal. Em um aspecto, a doença relacionada à imunidade é selecionada a partir de psoríase, artrite, doença intestinal inflamatória ou câncer. Em outro aspecto, o câncer é câncer de mama. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para prevenir uma doença relacionada à imunidade referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, que compreende modular a expressão e/ou atividade de TIGIT no paciente. Em um aspecto, a doença relacionada à imunidade é selecionada de psoríase, artrite, doença intestinal inflamatória ou câncer. Em outro aspecto, o câncer é câncer de mama. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para tratar ou diminuir a gravidade de uma doença relacionada à imunidade referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, que compreende modular a expressão e/ou atividade de TIGIT no paciente. Em um aspecto, a doença relacionada à imunidade é selecionada a partir de psoríase, artrite, doença intestinal inflamatória ou câncer. Em outro aspecto, o câncer é câncer de mama.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] A figura 1 descreve um alinhamento de sequências da proteína TIGIT humana, de camundongo, macacos rhesus e de cão. O sombreamento indica as posições contendo aminoácidos idênticos em três ou quatro espécies. A sequência de sinal é indicada por uma linha tracejada, o domínio do conjunto V de imunoglobulina é indicado por uma linha dupla, os sítios de N-glicosilação são indicados por uma linha fina acima da posição requisitada, o domínio de transmembrana é indicado por uma linha espessa, e o motivo ITIM estendido putativo por uma linha tracejada dupla. TIGIT humano compartilha 88%, 67% e 58% de identidade com sequências de macacos rhesus, cão e camundongo, respectivamente.

[021] As figuras 2A e 2B descrevem um alinhamento de sequências de proteína de domínios de IgV das proteínas da família PVR indicadas. As cadeias laterais que compartilham similaridade através das sequências são marcadas de acordo com a propriedade. Os resíduos de impressão digital do quadro V (círculo preto) e os resíduos de impressão digital relativos a PVR (resíduos em caixa de linha espessa) são indicados. Para fins comparativos, seis sequências do domínio de IgV (descritas sob a linha horizontal) dos membros da família não-PVR também estão alinhadas.

[022] A figura 3 descreve os resultados de análises de biosensor para avaliar a capacidade de TIGIT-Fc (linha cinza claro) ou uma proteína Fc de controle (linha preta) de ligar-se a várias proteínas como descrito no exemplo 2. Os números 1-8 representam, respectivamente, ESAM, OTOR, TEK, TNFRSF10C, IGFBP4, PVR, IL-19 e TEK.

[023] A figura 4A descreve os resultados de ensaios de biosensor para avaliar a ligação de várias proteínas de fusão de Fc a TIGIT-Fc imobilizado, como descrito no exemplo 2. As figuras 4B-1 a 4B-6 representam os resultados das análises FACS para avaliar a ligação de proteínas de fusão de Fc biotiniladas a transfectantes estáveis de CHO expressando o receptor, como descrito no exemplo 2.

[024] As figuras 5A e 5B descrevem os resultados de um ensaio de ligação de radioligando representativo para determinar o Kd para ligação entre células CHO expressando TIGIT-Fc e PVR, como descrito no exemplo 2.

[025] A figura 6 mostra os gráficos representando os resultados dos estudos de ligação de competição entre TIGIT, PVR, CD226 e CD96, como descrito no exemplo 2.

[026] A figura 7 mostra os resultados de experiências avaliando a capacidade de um anticorpo anti-PVR bloquear a ligação de PVR a TIGIT ou CD226, como descrito no exemplo 2. A figura 7A descreve a ligação de PVR- Fc biotinilado a transfectantes CHO expressando CD226 ou TIGIT na presença (linha pontilhada) ou ausência (linha sólida) de um excesso 10 vezes molar do anticorpo D171. Os resultados de um anticorpo de controle de isótipos combinados são indicados pela área sombreada. A figura 7B descreve a ligação de PVR-Fc (linha de topo) a biosensores carregados com CD226-Fc ou TIGIT-Fc. A linha central indica a ligação de PVR-Fc a CD226-Fc ou TIGIT-Fc pré-carregado com o biosensor que foi bloqueado com o anticorpo D171 antes da exposição a PVR-Fc.

[027] A figura 8A descreve os dados de expressão de TIGIT (painel esquerdo) ou os dados de expressão de CD226 (painel direito) em uma variedade de tipos de células imunes, como descrito no exemplo 2 (A). A figura 2B descreve a análise de RT-PCR de TIGIT e a expressão de mRNA em ICOS em células Tfh tonsilares, como descrito no exemplo 2 (A).

[028] As figuras 9A-B descrevem os resultados de experiências testando a capacidade do anticorpo 10A7 anti-TIGIT para se ligar a TIGIT nas superfícies das células, como descrito no exemplo 3. A figura 9A mostra a ligação do anticorpo 10A7 anti-TIGIT a linhagens de células 292 de TIGIT estáveis (linha sólida) e a revogação de que a ligação na presença de PVR-Fc (linha tracejada). A região cinza representa a ligação de um anticorpo de controle de isótipos combinados. A figura 9B mostra os resultados da análise FACS demonstrando que TIGIT co-expressa com FoxP3 em células T GITR+ CD4. Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes.

[029] As figuras 10A-F descrevem os resultados de experiências avaliando a expressão de TIGIT tanto por análise de mRNA como por estudos de ligação na superfície das células, como descrito no exemplo 3. As figuras 10A-1 a 10A-2 descrevem os resultados de experiências de citometria de fluxo para determinar a expressão de TIGIT e CD226 em células T CD4+CD45RA+ (painel esquerdo) ou CD4+CD45RO+ (painel direito), em repouso ou ativadas (durante um ou dois dias), como descrito no exemplo 2 (A). A figura 10B mostra um gráfico de barra indicando a troca em dobro em mRNA de TIGIT em diferentes tipos de células imunes classificadas diretamente ex vivo a partir de PBMC, como comparado aos níveis de mRNA de TIGIT em células CD4+CD45RA+. A figura 10C mostra gráficos de barra indicando o aumento em dobro nos níveis de mRNA de TIGIT sobre células Treg CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+ e CD4+CD25hi classificadas, ativadas com anti-CD3 e anti- CD28 durante 1 ou 2 dias ou células NK CD56+ classificadas, ativadas com IL- 2 durante um dia, como comparado a células não estimuladas. Os traçados em gráfico de FACS mostrados são de uma experiência representativa e os valores de RT-PCR são uma média de três doadores. A figura 10D mostra os resultados de ensaios FACS mostrando que às células PBMC humanos de CD25- falta a expressão de TIGIT. A figura 10E descreve os resultados de experiências FACS avaliando a expressão de TIGIT na superfície de células em células PBMC humanos expressando quantidades baixas ou altas de CD25 e mostra que a expressão de TIGIT correlaciona-se com a expressão de FOXP3. A figura 10F descreve os resultados de experiências FACS avaliando a expressão de TIGIT em células T CD4+CD25hi classificadas, ativadas com anti-CD3 e anti-CD28 durante 24 horas (painel esquerdo) e a análise de RT- PCR complementar dos níveis de mRNA de TIGIT em células CD25- ou CD25hi CD4+.

[030] A figura 11 fornece gráficos mostrando a troca em dobro na expressão de TIGIT ou CD226 em células CD25, CD25-, CD45RA+, CD45RO+ em repouso ou ativadas (durante um ou dois dias), como descrito no exemplo 12 (A).

[031] A figura 12A descreve os resultados de experiências de citometria de fluxo para avaliar a estabilidade da expressão de TIGIT em células T, como descrito no exemplo 3. A figura 12B descreve os resultados dos ensaios baseados em placa para avaliar a expressão de TIGIT em células de TIGI+ e TIGIT- classificadas expostas a concentrações variadas de anti-CD3, como descrito no exemplo 3.

[032] As figuras 13A-C mostram traçados em gráfico descrevendo os resultados de experiências avaliando a capacidade de TIGIT modular a produção de IL-10, IL-12p40 e IL-12p70 em camundongos com imunodeficiência combinada severa (SCID) com falta de células B e T, como descrito no exemplo 5.

[033] A figura 14 descreve os resultados de experiências de citometria de fluxo para avaliar a expressão de TIGIT em células T auxiliares produzindo IL-2 versus a produção de IL-17, como descrito no exemplo 2 (A). Os dados em cada painel são representativos de uma experiência usando PBMC de um doador diferente.

[034] A figura 15 descreve os resultados da análise de mRNA avaliando os níveis de expressão de TIGIT em amostras de tecido doente, como descrito no exemplo 3. O painel mais à direita fornece os dados da expressão de células classificadas tomadas de tecido sinovial de artrite reumatóide. A expressão de PVR e CD226 foi indetectável nestas amostras.

[035] A figura 16 descreve os resultados de experiências de RT- PCR avaliando a expressão de TIGIT (painel de topo) ou CD226 (painel inferior) em tecidos tomados em vários pontos de tempo de modelos de camundongos com artrite induzida por colágeno com relação a amostras normais.

[036] A figura 17 descreve os resultados da análise de mRNA avaliando os níveis de expressão de TIGIT, PVR e CD226 em amostras de tecido de macacos rhesus asmáticos e de controle, como descrito no exemplo 3.

[037] A figura 18A descreve os resultados da análise de mRNA avaliando os níveis de expressão de TIGIT (painel superior) em células normais ou cancerosas ou a expressão de CD4 em várias amostras de tumor de mama (painel inferior). As figuras 18B-18D descrevem os resultados da análise de mRNA avaliando os níveis de expressão de TIGIT (figura 18B), PVR (figura 18C), e CD226 (figura 18D) em várias amostras de câncer, como descrito no exemplo 3. Os painéis inferiores em cada uma das figuras 18B, 18C e 18D mostram os níveis de expressão de TIGIT, PVR ou CD226, respectivamente, em amostras de câncer contendo várias percentagens de células de tumor. As caixas em todos os painéis representam os dados estatisticamente significativos.

[038] As figuras 19A-D descrevem os resultados de experiências avaliando o efeito de TIGIT sobre a ativação de células T, como descrito no exemplo 4. A figura 19A descreve os resultados de ensaios FACS avaliando a expressão de PVR em monócitos de CD14+, iMDDC e MDDC. Experiências anti-PVR são mostradas sem sombreamento e os controles de isótipos combinados são mostrados em cinza. A figura 19B descreve os resultados de ensaios de MLR in vitrousando DC maturado com TNFα e células T CD4+ isoladas, avaliando o efeito de TIGIT-Fc sobre a proliferação de células T. Os dados indicados com asterisco tem um p<0,001. A figura 19C descreve os resultados de experiências avaliando a proliferação de células T pela incorporação de [3H]-timidina (cpm) (painel esquerdo) e produção de IFN-y por ELISA (painel direito) em células T CD4+ ativadas com anti-CD3 solúvel na presença de DCs CD11c+autólogas e anticorpo 10A7 anti-TIGIT (barras pretas) ou controle de isótipos (barras brancas). Um asterisco único indica um p<0,01; um asterisco duplo indica um p<0,001. A figura 19D descreve os resultados de experiências avaliando a proliferação e a produção de IFN-y em células T CD4+CD25- nativas com DC CD11c+autóloga e anti-CD3 solúvel na presença de 100 μg/ml de TIGIT-Fc (barras cinza) ou controle de isótipos (barras brancas). Um asterisco único indica um o<0,01; um asterisco duplo indica um p<0,001.

[039] As figuras 20A e 20B descrevem os resultados de experiências avaliando a capacidade de células T TIGIT+ classificadas inibirem a proliferação de células T TIGIT- em um ensaio MLR, como descrito no exemplo 4.

[040] A figura 21A descreve os resultados de ensaios de proliferação avaliando o efeito de Treg de TIGIT+ sobre a proliferação de outras células T e APC na presença ou ausência do anticorpo (10A7) anti-TIGIT, como descrito no exemplo 4, bem como a produção de IFNy e IL-10 nestas populações de células. A figura 21B descreve os resultados de ensaios de proliferação avaliando o efeito de Treg de TIGIT+ sobre a proliferação de células T nativas em comparação com Treg de TIGIT-, como descrito no exemplo 4A.

[041] As figuras 22A-D descrevem os resultados de experiências avaliando a capacidade de TIGIT modular a produção de citocina em iMDDC e DC maturadas, como descrito no exemplo 5. As figuras 22A-1 e 22A2 mostram os resultados de ensaios ELISA medindo a produção de IL-10 ou IL-12p40 em iMDDC, iMDDC estimulado com TNFα, iMDDC estimulado com CD40L, iMDDC estimulado com LOS, ou iMDDC estimulado com Pam3CDK4. Os resultados mostrados são as médias de três experiências. As linhas em cada painel representam os dados de cada um de três doadores diferentes. A figura 22B mostra os resultados de análise FACS para medir a expressão de marcadores HLA-DR, CD80, CD83 e CD86 de maturação de superfícies de células de superfície de células em células tratadas. Os valores são representados como intensidade de fluorescência média (MFI), e os dados mostrados são representativos de três doadores. A figura 22C mostra os dados de experiências medindo os efeitos de TIGIT sobre outra produção de citocinas pró-inflamatórias de MDDC maturado com TNFα ou maturado com LPS. Os dados mostrados são representativos de três experiências. Os níveis de IL-6, IL-12p70 e IL-18 foram determinados por análise LUMINEX, como descrito no exemplo 5. A figura 22D mostra um gráfico representando as quantidades relativas da secreção de TGFβ em iMDDC em resposta a TIGIT.Fc ou um controle de isótipos combinados, como descrito no exemplo 5.

[042] As figuras 23A-C descrevem os resultados de experiências avaliando o efeito do tratamento com TIGIT sobre a ativação da sinalização a jusante por PVR, como descrito no exemplo 6. A figura 23A mostra a análise Western blot do estado de fosforilação de tirosina de PVR tratado com TIGIT ou um controle. A figura 23B mostra a análise Western blot do estado de dimerização de ERK quando do tratamento de iMDDC com TIGIT-Fc, TIGIT-Fc- DANA, ou controle. A figura 23C mostra a análise Western blot de β-catenina ativa versus total em iMDDC tratado com TIGIT versus tratado com controle.

[043] As figuras 24A-B descrevem os resultados de experiências avaliando o efeito do bloqueio de várias moléculas de sinalização a jusante sobre os decréscimos induzidos por TIGIT na produção de IL-12p40 em MDDC maturado com TNFα, como descrito na figura 6. A figura 24A mostra os gráficos dos resultados de experiências testando o impacto de um inibidor de cinase MAPK sobre os decréscimos induzidos por TIGIT-Fc ou TIGIT-Fc-DANA na produção de IL-12p40. A figura 24B mostra os gráficos dos resultados de experiências avaliando o impacto de um anticorpo (10A7) anti-TIGIT, um anticorpo IL-10, ou um anticorpo anti-CD32 sobre os decréscimos mediados por TIGIT na produção de IL-12p40 de MDDC maturado com INFα.

[044] As figuras 25A-B descrevem os resultados de experiências avaliando o impacto do tratamento com TIGIT-Fc sobre a ativação de células T, como descrito no exemplo 7. Os gráficos dos dados de experiências avaliando a quantidade de proliferação de células T (figura 25A) ou da produção de IL-2 (figura 25B) induzida por/em culturas de MDDC maturadas com iMDDC ou TNFα/CD40L tratadas com TIGIT-Fc ou anticorpo de controle.

[045] A figura 26C descreve os resultados de experiências avaliando o impacto do tratamento com TIGIT-Fc sobre a expressão de ILTs em MDDC humano ativado, como descrito no exemplo 7.

[046] As figuras 27A-H descrevem os resultados de experiências avaliando o efeito do tratamento com TIGIT sobre respostas de hipersensibilidade do tipo retardado em camundongos, como descrito no exemplo 7. A figura 27A mostra um gráfico representando os dados de intumescimento da orelha de camundongos do tipo selvagem ou deficientes de IL-10 com anticorpo anti-erva, TIGIT-Fc ou CTLA4. A figura 27B mostra os dados representando a resposta de proliferação de células do baço de camundongos tratados com TIGIT-Fc, CTLA 4-Fc, ou controle para re-estimular KLH. Os dados mostram como resposta um desvio padrão ± (n=3 por grupo. O ensaio de renovação foi realizado em reservatórios em triplicata). A figura 27C mostra um gráfico representando dados de intumescimento de orelha de camundongos do tipo selvagem tratados com TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA, ou anticorpo 10A7 anti-TIGIT. As figuras 27D e 27E descrevem gráficos indicando a resposta de proliferação de células do baço de camundongos tratados com TIGIT-Fc do tipo selvagem (figura 27D) e deficientes de IL-10 (figura 27E) para estimular KLH. As figuras 27F e 27G descrevem gráficos indicando os níveis de IL-2 e de IFN-y em sobrenadantes de cultura de esplenócitos isolados de camundongos tratados com TIGIT-Fc do tipo selvagem (figura 27F) ou deficientes de IL-10 (figura 27G) que foram reativados com KLH durante dois dias. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão (n=3 por grupo; a renovação in vitro foi realizada em reservatórios em triplicata). Um asterisco indica p<0,001. A figura 27H descreve gráficos mostrando os níveis relativos de mRNA em IL-10 (painel esquerdo), IL-12/23p40 (painel central), e IL-12p35 (painel direito) de esplenócitos de CD11c+ de camundongos deficientes de IL- 10 ou do tipo selvagem tratados com TIGIT-Fc ou controle de isótipos, como determinado por qRT-PCR (n-8). Os níveis de mRNA em IL-10 de esplenócitos esgotados com CD11c- do tipo selvagem também foram determinados como um controle. Os dados representam níveis de mRNA arbitrários relativos aos níveis de mRNA correspondentes de camundongos não imunizados. Um asterisco indica p<0,05.

[047] As figuras 28A-28E descrevem os resultados de experiências avaliando os efeitos da deficiência da expressão de TIGIT por mRNA específico de TIGIT, como descrito no exemplo 4(B). A figura 28A mostra os resultados da análise qRT-PCR da deficiência de TIGIT versus siRNA de controle. Os níveis de mRNA em CTLA4 foram determinados como um controle não alvo. A figura 28B mostra a análise FACS da expressão de TIGIT na superfície em células tratadas com siRNAcontrole e siRNATIGIT (resumidas na tabela 7). As figuras 28C e 28D mostram os resultados da análise FACS de proliferação de células, de células T humanas CD4+CD45RO+ ativadas com anti-CD3 ligado à placa sozinho ou em conjunção com anti-CD28 na presença de siRNAcontrole ou siRNATIGIT+ (figura 27C) ou anticorpo 10A7 anti- TIGIT (figura 27D). A figura 28E descreve os resultados da análise da produção de citocina a partir das células usadas nos ensaios na figura 28C após dois dias de cultura. Os dados mostrados são representativos de quatro experiências e doadores individuais.

[048] As figuras 29A-29E descrevem os resultados de experiências avaliando a expresso de CD226 sobre vários tipos de células e em vários tratamentos. A figura 29A descreve os resultados da análise FACS mostrando a expressão de CD226 na superfície em células CD4+CD45RA+ nativas classificadas (dia 1 e 2) em repouso e ativadas com anti-CD3 e anti- CD28 (painéis de topo) ou células CD4+CD45RO+ da memória (painéis de fundo) usando anti-CD226. A figura 29B fornece gráficos mostrando o aumento em dobro nos níveis de mRNA em células CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+ e CD8+ ativadas com anti-CD3 mais anti-CD28 durante 1 ou 2 dias, e células NK CD56+ classificadas, ativadas com IL-2 mais IL-15 durante um dia, como comparado a células não estimuladas. A figura 29C mostra os níveis de mRNA relativos de uma variedade de marcadores de células sobre células diretamente classificadas ex vivo de PBMC como determinado por qRT-PCR, como um indicador das populações de células CD4+, CD8+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25hiTregs, NK e DC CD11c+ relativas a células CD4+CD45RA+ nativas. Os dados mostrados representam uma média de dados de três doadores. A figura 29D descreve os resultados de análise FACS para determinar a co- expressão de CD226 e de CD25 sobre células CD4+ fechadas tomadas de uma população de PBMC humano total colorido com anti-CD4, anti-CD25 e anti- CD226. O traçado em gráfico mostrado é um representativo de dois doadores. A figura 29E mostra um gráfico descrevendo os níveis de mRNA em TIGIT e CD226 em células CD4+CD25- e CD4+CD25hi ativadas e em repouso isoladas de PBMC. Os níveis de mRNA são representados como a troca em dobro de células CD4+CD25- em repouso e são uma média dos dados de dois doadores.

[049] As figuras 30A-C descrevem os resultados de experiências avaliando a funcionalidade de células imunes em camundongos deficientes de TIGIT, como descrito no exemplo 8. A figura 30A mostra os gráficos comparando a proliferação de células T (TIGIT.KO) deficientes de TIGIT versus células T do tipo selvagem na ausência (painel esquerdo) ou presença (painel central) de células apresentadoras de antígenos do tipo selvagem. O painel direito mostra os gráficos comparando a proliferação de células T TIGIT.KO a células T do tipo selvagem na presença de células apresentadoras de antígeno TIGIT.KO. A figura 30B mostra os resultados de ensaios FACS avaliando os níveis de IFNy e IL-4 em células T TIGIT.KO versus tipo selvagem. A figura 30C apresenta uns gráficos mostrando os níveis medidos das citocinas indicadas nos sobrenadantes de células T TIGIT.KO ou do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[050] TIGIT foi previamente identificado como um modulador putativo da função imune (ver, por exemplo, a patente US20040121370, incorporada ao presente por referência). No presente, os requerentes demonstram que TIGIT é um membro de uma família recentemente descrita de proteínas relacionadas à imunidade que inclui o receptor de poliomielite (PVR, também conhecido como NECL5 ou CD155), 1-4 proteínas como PVR (PVR1- 4), CD96 e CD226. Os requerentes fornecem os elementos estruturais conservados desta nova família, cujos membros desempenham papéis na regulação e função imunes, e fornecem métodos para identificar outros membros da família.

[051] Os requerentes mostram que TIGIT liga-se firmemente com a PVR, e liga-se com um Kd menor a PVRL3 (também conhecido como nectina-3 ou CD113) e a PVRL2 (também conhecido como nectina-2 ou CD112). PVR é receptor de superfície de células altamente expresso em células dentríticas (DC), bem como células FDC, de fibroblastos, endoteliais e algumas células de tumor (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006)). Os requerentes mostram por análises de mRNA e FACS que TIGIT é predominantemente expresso em uma variedade de células T ativadas, particularmente células T reguladoras (Treg), células T da memória e células auxiliares foliculares (Tfh). Os estudos descritos no presente demonstram a interação de TIGIT com PVR em DC, e mostram que esta interação de ligação modula a função de DC, particularmente a produção de citocinas. DC humano ligado a TIGIT secretou altos níveis de citocinas pró-inflamatórias IL-10 e menos (tal como IL-12p40 e IL-12p70). A ligação de TIGIT a células T imaturas (como avaliado usando construções de fusão de TIGIT) inibiu a ativação e a proliferação de células T. Notavelmente, esta inibição foi revertida na presença de um inibidor de ERK, indicando que a ativação de ERK pode ser uma etapa importante no funcionamento de TIGIT para modular a atividade de DC. Os requerentes mostram no presente que células T TIGIT+ suprimem a proliferação não somente de outras células T TIGIT+, mas também de células apresentadoras de antígenos quando presentes em uma população misturada de células imunes, e que TIGIT por si mesmo é responsável por este efeito supressor, uma vez que a inclusão de um anticorpo anti-TIGIT de bloqueio na mistura reduz grandemente a supressão observada.

[052] TIGIT é aumentado na expressão de artrite, psoríase, distúrbio intestinal inflamatório e de tecidos de câncer de mama com relação a tecidos de controle normais, como mostrado no presente. Os requerentes também demonstram diretamente a capacidade de TIGIT modular resposta imune mostrando que a proteína de fusão TIGIT inibiu as respostas de células T humanas in vitro e a ativação de células T de murino em um ensaio in vivo de hipersenbilidade do tipo retardado. TIGIT modificou significativamente DC maduro e, em uma menor extensão, DC imaturo, sugerindo que a interação TIGIT-PVR pode ser importante no ajustamento de uma resposta imune reguladora uma vez que DC torna-se células apresentadoras de antígenos completamente ativadas. As experiências apresentadas presentemente sugerem um mecanismo pelo qual TIGIT inibe a ativação de células T através de um laço de realimentação inibidor através da indução de IL-10 em DC. Consequentemente, a invenção ainda fornece novos métodos de modular a função imune, modulando subconjuntos particulares de citocinas ou subconjuntos particulares de células imunes. Estes e outros aspectos da invenção são descritos em maior detalhe abaixo.

1. DEFINIÇÕES

[053] Os termos “polipeptídeo de TIGIT”, “proteína TIGIT” e “TIGIT” são usados intercambiavelmente no presente e referem-se a sequências de polipeptídeo específicas como descrito no presente. Os polipeptídeos de TIGIT descritos no presente podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tecido humano ou tecido de um organismo não humano, ou preparado por métodos recombinantes ou sintéticos. Em uma modalidade, o polipeptídeo de TIGIT tem a sequência de aminoácidos descrita em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-4. Todas as divulgações neste relatório que se referem a “polipeptídeo de TIGIT” referem-se a cada um dos polipeptídeos individualmente bem como juntamente. Por exemplo, as descrições da preparação de, purificação de, derivação de, formação de anticorpos para ou contra, administração de, composições contendo, tratamento de uma doença com, etc., pertencem a cada um dos polipeptídeos da invenção individualmente. Os termos “polipeptídeo de TIGIT”, “proteína TIGIT” ou “TIGIT” também incluem variantes de polipeptídeos de TIGIT divulgados no presente ou conhecidos na técnica.

[054] Um “polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa” compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos como o polipeptídeo de TIGIT correspondente derivado da natureza. Tais polipeptídeos de TIGIT de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou podem ser produzidos por meio recombinante ou sintético. O termo “polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa” engloba especificamente as formas truncadas ou secretadas ocorrendo naturalmente do polipeptídeo de TIGIT específico (por exemplo, uma sequência do domínio extracelular), formas de variantes ocorrendo naturalmente (por exemplo, formas alternativamente emendadas) e variantes alélicas do polipeptídeo ocorrendo naturalmente. Em várias modalidade da invenção, os polipeptídeos de TIGIT de sequência nativa divulgados no presente são polipeptídeos de sequência madura ou nativa de comprimento completo compreendendo as sequências de aminoácidos de comprimento completo. No entanto, embora seja mostrado que o polipeptídeo de TIGIT descrito nas figuras anexas começa com resíduos de metionina designados no presente como a posição 1 de aminoácido nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos de metionina localizados tanto a montante como a jusante a partir da posição 1 de aminoácido nas figuras podem ser empregados como o resíduo de aminoácido de partida para os polipeptídeos de TIGIT.

[055] O “domínio extracelular” ou “ECD” do polipeptídeo de TIGIT refere-se a uma forma de polipeptídeo de TIGIT que é essencialmente livre dos domínios de transmembrana e citoplásmico. Normalmente, um ECD do polipeptídeo de TIGIT terá menos do que 1% de tais domínios de transmembrana e/ou citoplásmico e, de preferência, terá menos do que 0,5% de tais domínios. Será entendido que quaisquer domínios de transmembrana identificados para os polipeptídeos de TIGIT da presente invenção são identificados de acordo com os critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar que tipo de domínio hidrofóbico. Os limites exatos de um domínio de transmembrana podem variar, mas mais provavelmente por não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer extremidade do domínio como identificado no presente. Opcionalmente, portanto, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TIGIT pode conter de cerca de 5 ou menos aminoácidos em qualquer lado do limite do domínio de transmembrana/ domínio extracelular e tais polipeptídeos, com ou sem o peptídeo de sinal associado, e ácido nucleico codificador dos mesmos, são contemplados pela presente invenção. Em uma modalidade, o ECD de TIGIT engloba 1-139 aminoácidos da proteína TIGIT humana descrita em SEQ ID NO: 1.

[056] Os locais aproximados dos “peptídeos de sinal” dos vários polipeptídeos de TIGIT divulgados no presente podem ser identificados usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a sequência de sinal do polipeptídeo de TIGIT humano descrita em SEQ ID NO: 1 é prevista para alcançar 1-15 aminoácidos (ver, por exemplo, a patente US20040121370). Nota-se, no entanto, que o limite C-terminal de um peptídeo de sinal pode variar, mas mais provavelmente por não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite C-terminal do peptídeo de sinal como inicialmente identificado no presente, sendo que o limite C-terminal do peptídeo de sinal pode ser identificado de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar que tipo de elemento da sequência de aminoácidos (por exemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) e Von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Além do mais, também é reconhecido que, em alguns casos, a clivagem de uma sequência de sinal a partir de um polipeptídeo secretado não é inteiramente uniforme, resultando em mais do que uma espécie secretada. Estes polipeptídeos maduros, onde o peptídeo de sinal é clivado dentro de não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite C-terminal do peptídeo de sinal como identificado no presente, e os polinucleotídeos codificador dos mesmos, são contemplados pela presente invenção.

[057] “Variante de polipeptídeo de TIGIT” significa um polipeptídeo de TIGIT ativo, como definido acima ou baixo, tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento complexo como divulgado no presente, uma sequência de polipeptídeo de TIGIT em que falta o peptídeo de sinal como divulgado no presente, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TIGIT, com ou sem o peptídeo de sinal, como divulgado no presente, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de comprimento completo. Tais variantes de polipeptídeo de TIGIT incluem, por exemplo, polipeptídeos de TIGIT sendo que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, no N- ou C-término da sequência de aminoácido nativa de comprimento completo. Normalmente, uma variante de polipeptídeo de TIGIT terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácido e alternativamente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácido para uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento completo como divulgado no presente, uma sequência de polipeptídeo de TIGIT em que falta o peptídeo de sinal como divulgado aqui, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TIGIT, com ou sem o peptídeo de sinal, como divulgado no presente ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de comprimento completo. Normalmente, as variantes de polipeptídeos de TIGIT são pelo menos cerca de 10 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 30 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 40 aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 60 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 70 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 80 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 90 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 100 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 150 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 200 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 300 aminoácidos em comprimento, ou mais.

[058] “Percentagem (%) da identidade de sequências de aminoácidos” com respeito às sequências de polipeptídeo de TIGIT no presente é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de TIGIT específica, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para obter a percentagem máxima de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinar a percentagem de identidade de sequências de aminoácido pode ser obtido de vários modos que são conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, usando softwares de computador publicamente disponíveis tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter o alinhamento máximo acima do comprimento completo das sequências sendo comparadas. Para os presentes fins, no entanto, os valores % de identidade de sequências de aminoácidos são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2, sendo que o código de fonte completo para o programa ALIGN-2 está publicamente disponível. O programa de computador ALIGN-2 para comparação de sequências foi criado por Genentech, Inc. e o código de fonte foi depositado com a documentação do usuário em U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Copyright Registration no TXU510087. O programa ALIGN-2 também está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, de preferência UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[059] Nas situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequências de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como a seguir:

onde X é o número de resíduos de aminoácidos contados como combinações idênticas pela programa ALIGN-2 de alinhamento de sequências no alinhamento de A e B do programa, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não se igualará à % de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. Como exemplos de % de cálculos de identidade de sequências de aminoácidos usando este método, as tabelas 1 e 2 demonstram como calcular a % de identidade de sequências de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada “Proteína de Comparação” para a sequência de aminoácidos designada “TIGIT”, sendo que “TIGIT” representa a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de TIGIT hipotético de interesse, “Proteína de Comparação” representa a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo contra a qual o polipeptídeo de “TIGIT” de interesse está sendo comparado, e “X”, “Y” e “Z” representam, cada um, resíduos de aminoácidos hipotéticos diferentes. TABELA 1

TABELA 2

[060] A menos que especificamente indicado ao contrário, todas os valores % de identidade de sequências de aminoácidos usados no presente são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente precedente e nas tabelas 1 e 2 usando o programa de computador ALIGN-2. No entanto, os valores % de identidade de sequências de aminoácidos também podem ser obtidos como descrito abaixo usando o programa de computador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) A maior parte dos parâmetros de pesquisa de WU-BLAST-2 é definida como os valores padrão. Os não definidos para os valores padrão, isto é, os parâmetros ajustáveis, são definidos com os seguintes valores: extensão de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = 11, e matriz de contagem = BLOSUM62. Quando WU-BLAST-2 é empregado, um valor % de identidade de sequências de aminoácidos é determinado dividindo (a) o número de resíduos de aminoácidos de combinação idêntica entre a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de TIGIT de interesse tendo uma sequência derivada da sequência de aminoácidos polipeptídeo de TIGIT nativa e da sequência de aminoácidos de comparação de interesse (isto é, a sequência contra a qual o polipeptídeo de TIGIT de interesse está sendo comparada que pode ser variante de polipeptídeo de TIGIT) como determinado por WU-BLAST-2 por (b) o número total de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de TIGIT de interesse. Por exemplo, na declaração “um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos A que tem ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequências de aminoácidos para a sequência de aminoácidos B”, a sequência de aminoácidos A é a sequência de aminoácidos de comparação de interesse e a sequência de aminoácidos B é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de TIGIT de interesse.

[061] A percentagem de identidade de sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-3402 (1997)). O programa de comparação de sequências NCBI- BLAST2 pode ser baixado deHTTP://www.ncbi.nlm.nih.govou de outro modo obtido a partir de National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI- BLAST2 usa vários parâmetros de pesquisa, sendo que todos estes parâmetros de pesquisa são definidos como valores padrão incluindo, por exemplo, desmascarar = sim, filamento = todos, ocorrências expostas = 10, comprimento de complexidade baixa mínimo = 15/5, valor e de múltiplas passagens = 25, entrega para alinhamento final aberto = 25 e matriz de contagem = BLOSUM62.

[062] Nas situações onde NCBI-BLAST2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequências de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como a seguir:

onde X é o número de resíduos de aminoácidos contados como combinações idênticas pela programa NCBI-BLAST2 de alinhamento de sequências no alinhamento de A e B do programa, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não se igualará à % de identidade de sequências de aminoácidos de B para A.

[063] Os termos “polinucleotídeo de TIGIT” e “sequência de nucleotídeo de TIGIT” são usados intercambiavelmente no presente e referem- se a sequências de polinucleotídeo específicas codificando um polipeptídeo de TIGIT. Estes polinucleotídeos podem compreender DNA ou RNA ou tanto DNA como RNA. Os polinucleotídeos de TIGIT descritos no presente podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tecido humano ou tecido de um organismo não humano, ou preparado por métodos recombinantes ou sintéticos. Todas as divulgações neste relatório que se referem a um “polinucleotídeo de TIGIT” referem-se a cada dos polinucleotídeos individualmente bem como juntamente. Por exemplo, as descrições da preparação de, purificação de, derivação de, administração de, composições contento, tratamento de uma doença com, etc, pertencem a cada polinucleotídeo da invenção individualmente bem como coletivamente. Os termos “polinucleotídeo de TIGIT” e sequência de nucleotídeo de TIGIT” também incluem variantes de polinucleotídeos de TIGIT descritas no presente.

[064] Um “polinucleotídeo de TIGIT de sequência nativa” compreende um polinucleotídeo tendo a mesma sequência de ácido nucleico como o polinucleotídeo de TIGIT correspondente derivado da natureza. Tais polinucleotídeos de TIGIT de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meio recombinante ou sintético. O termo “polinucleotídeo de TIGIT de sequência nativa” engloba especificamente os polinucleotídeos codificando as formas truncadas ou secretadas ocorrendo naturalmente do polipeptídeo de TIGIT (por exemplo, um sequência do domínio extracelular), formas de variantes ocorrendo naturalmente (por exemplo, formas alternativamente emendadas) e variantes alélicas do polipeptídeo ocorrendo naturalmente. Em várias modalidades da invenção, os polinucleotídeos de TIGIT de sequência nativa descritos no presente são polinucleotídeos de sequência nativa maduros ou de comprimento completo compreendendo as sequências de ácido nucleico de comprimento completo.

[065] Uma “variante de polinucleotídeo de TIGIT” ou “sequência de ácido nucleico de variante de polinucleotídeo” significa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de TIGIT como definido abaixo e que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequências de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento completo como divulgado no presente, uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento completo em que falta o peptídeo de sinal como divulgado no presente, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TIGIT, com ou sem o peptídeo de sinal, como divulgado no presente ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de comprimento completo. Normalmente, uma variante de polipeptídeo de TIGIT terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequências de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequências de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento completo, uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de sequência nativa de comprimento completo em que falta o peptídeo de sinal, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TIGIT, com ou sem a sequência de sinal, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo de TIGIT de comprimento completo. As variantes não englobam a sequência de nucleotídeo nativa.

[066] Normalmente, as variantes de polinucleotídeos de TIGIT cerca de 900 nucleotídeos em comprimento, ou mais

[067] “Percentagem (%) de identidade de sequências de ácido nucleico” com respeito às sequências de ácido nucleico codificando TIGIT identificadas no presente é definida como a percentagem de nucleotídeos em uma sequência candidata que são iguais aos nucleotídeos na sequência de ácido nucleico de TIGIT de interesse, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para obter a percentagem de identidade de sequências máxima. O alinhamento para fins de determinar a percentagem de identidade de sequências de ácido nucleico pode ser obtido de vários modos que são conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, usando softwares de computador publicamente disponíveis tais como Os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código de fonte foi depositado com a documentação do usuário em U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Copyright Registration no TXU510087. O programa ALIGN-2 também está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código de fonte publicamente disponível. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, de preferência UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN- 2 e não variam.

[068] Nas situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de ácido nucleico, a % de identidade de sequências de ácido nucleico de uma dada sequência de ácido nucleico C para, com ou contra uma sequência de ácido nucleico D (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácido nucleico a, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D) é calculada como a seguir:

onde W é o número de nucleotídeos contados como combinações idênticas pelo programa ALIGN-2 de alinhamento de sequência no alinhamento de C e D do programa, e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequências de ácido nucleico de C a D não igualará a % de identidade de sequências de ácido nucleico de D para C. Como exemplos de % de identidade de sequências de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico designada “DNA de Comparação” para a sequência de ácido nucleico designada “TIGIT- DNA”, sendo que “TIGIT-DNA” representa uma sequência de ácido nucleico codificando TIGIT de interesse, “DNA de Comparação” representa a sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molécula de ácido nucleico de “TIGIT-DNA” de interesse está sendo comparada, e “N”, “L” e “V” representam, cada um, nucleotídeos hipotéticos diferentes. TABELA 3

TABELA 4

[069] A menos que especificamente indicado ao contrário, todos os valores % de identidade de sequências de ácido nucleico usados no presente são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente precedente e nas tabelas 3 e 4 usando o programa de computador ALIGN-2. No entanto, os valores % de identidade de sequências de ácido nucleico também podem ser obtidos como descrito abaixo, usando o programa de computador WU-BLAST- 2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). A maior parte dos parâmetros de pesquisa é definida para os valores padrão. Os valores padrão não definidos, isto é, os parâmetros ajustáveis, são definidos com os seguintes valores: extensão de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = 11, e matriz de contagem = BLOSUM62. Quando WU-BLAST-2 é empregado, um valor % de identidade de sequências de ácido nucleico é determinado dividindo (a) o número de nucleotídeos de combinação idêntica entre a sequência de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico de interesse codificador dos polipeptídeos de TIGIT tendo uma sequência derivada da molécula de ácido nucleico codificador dos polipeptídeos de TIGIT de sequência nativa e a molécula de ácido nucleico de comparação de interesse (isto é, a sequência contra a qual a molécula de ácido nucleico de interesse codificador dos polipeptídeos de TIGIT está sendo comparada que pode ser uma variante de polinucleotídeo de TIGIT) como determinado por WU-BLAST-2 por (b) o número total de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico de interesse codificador dos polipeptídeos de TIGIT. Por exemplo, na declaração “uma molécula de ácido nucleico Isolada compreendendo uma sequência de ácido nucleico A que tem ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequências de ácido nucleico para a sequência de ácido nucleico B”, a sequência de ácido nucleico A é a molécula de ácido nucleico de comparação de interesse e a sequência de ácido nucleico B é a sequência de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico de interesse codificador dos polipeptídeo de TIGIT.

[070] A percentagem de identidade de sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando o programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). O programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 pode ser baixado dehttp://www.ncbi.nlm.nih.govou de outro modo obtido do National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 usa vários parâmetros de pesquisa, sendo que todos estes parâmetros de pesquisa são definidos para valores padrão incluindo, por exemplo, desmascarar = sim, filamento = todos, ocorrências expostas = 10, comprimento de complexidade baixa mínimo = 15/5, constante para múltiplas passagens = 25, entrega para alinhamento final aberto = 25 e matriz de contagem = BLOSUM62.

[071] Nas situações onde NCBI-BLAST2 é empregado para comparações de sequências, a % de identidade de sequências de ácido nucleico de uma dada sequência de ácido nucleico C para, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequências de ácido nucleico para, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico (D) é calculada como a seguir:

onde W é o número de nucleotídeos contados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências NCBI-BLAST2 no alinhamento de C e D do programa, e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequências de ácido nucleico de C para D não se igualará à % de identidade de sequências de ácido nucleico de D para C.

[072] Em outras modalidades, as variantes de polinucleotídeos de TIGIT são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo de TIGIT nativo e que são capazes de hibridizar, de preferência sob condições de hibridização estringente e de lavagem, em sequências de nucleotídeo codificador do polipeptídeo de TIGIT de comprimento completo como divulgado no presente. As variantes de polipeptídeos de TIGIT podem ser as que são codificadas por uma variante de polinucleotídeo de TIGIT.

[073] “Isolado”, quando usado para descrever os vários polipeptídeos divulgados no presente, significa um polipeptídeo que é identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que tipicamente poderiam interferir com os usos de diagnóstico ou terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Nas modalidades preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal pelo uso de um sequenciador de ventosa giratória, ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução e de não redução usando coloração Coomassie blue ou, de preferência, prata. O polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, no entanto, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[074] Um ácido nucleico codificador do polipeptídeo de TIGIT ou outro ácido nucleico codificando polipeptídeo “isolado” é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela está normalmente associada na fonte natural de ácido nucleico codificando polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico codificador do polipeptídeo isolado é diferente na forma ou configuração em que ela é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeo isoladas são, portanto, distinguidas a partir da molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo específica como existem nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo isolada inclui moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeo contidas em células que expressam naturalmente o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um sítio cromossômico diferente do das células naturais.

[075] O termo “sequências de controle” refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operativamente em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são apropriadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operativa, e um sítio de ligação de ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e aprimoradores.

[076] O ácido nucleico é “ligado operativamente” quando ele está colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência líder ou secretório é ligado operativamente a DNA por um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou aprimorador é ligado operativamente a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossoma é ligado operativamente a uma sequência de codificação se ele está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, “ligado operativamente” significa que as sequências de DNA estando ligadas são contíguas e, no caso de um secretório líder, contíguas e na fase de leitura. No entanto, os aprimoradores não devem ser contíguos. A ligação é obtida pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[077] O termo “anticorpo” é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-TIGIT únicos ou anticorpos que se ligam especificamente a qualquer um de outros polipeptídeos descritos no presente (incluindo anticorpos agonista, antagonista e neutralizante), composições de anti-TIGIT ou de anticorpos com especificidade poliepitópica, anti-TIGIT de cadeia única ou outros anticorpos, e fragmentos de anti-TIGIT ou de outros anticorpos (ver abaixo).

[078] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado aqui, refere- se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações ocorrendo naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores.

[079] “Estringência” de reações de hibridização é prontamente determinável por um técnico no assunto, e, geralmente, é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, as sondas mais longas requerem temperaturas mais altas para recozimento apropriado, enquanto as sondas mais curtas precisam de temperaturas mais baixas. A hibridização depende geralmente da capacidade do DNA desnaturado recozer quando filamentos complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada. Como um resultado, segue-se que as temperaturas relativas mais altas poderiam tender a tornar as condições da reação mais estringentes, enquanto as temperaturas mais baixas menos. Para detalhes e explicação adicionais de estringência das reações de hibridização, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).

[080] “Condições estringentes” ou “condições de estringência elevadas”, como definido aqui, podem ser identificadas pelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50oC; (2) empregam, durante a hibridização, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio, em pH 7,5, com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42oC; ou (3) empregam 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/ml), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42oC, com lavagens a 42oC em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio e 50% de formamida a 50oC, seguido por uma lavagem com alta estringência consistindo de 0,1 x SSC contendo EDTA a 55oC.

[081] “Condições moderadamente estringentes” podem ser identificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, resistência iônica e % de SDS) menos estringentes que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é a incubação durante a noite, a 37oC, em uma solução compreendendo 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguida por lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50oC. Os técnicos no assunto reconhecerão como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc., como necessário para acomodar os fatores tais como comprimento de sonda e outros.

[082] O termo “epítopo etiquetado”, quando usado no presente, refere-se a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo de interesse (como um exemplo não limitante, um polipeptídeo de TIGIT) fundido a um “polipeptídeo de etiqueta”. O polipeptídeo de etiqueta tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser produzido, ainda suficientemente curto de modo que ele não interfere com a atividade do polipeptídeo ao qual está fundido. O polipeptídeo de etiqueta de preferência também é bastante singular de modo que o anticorpo não trans-reage substancialmente com outros epítopos. Os polipeptídeos de etiqueta apropriados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos).

[083] Como usado no presente, o termo “imunoadesina” designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma “adesina”) com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do reconhecimento de antígenos e do sítio de ligação de um anticorpo (isto é, é “heteróloga”), e uma sequência do domínio constante de imunoglobulina. A parte da adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos um sítio de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode obtida de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[084] “Ativo” ou “atividade” para os presentes fins refere-se a forma(s) de um polipeptídeo (como um exemplo não limitante, um polipeptídeo de TIGIT) que retém uma atividade biológica e/ou imunológica da forma nativa ou ocorrendo naturalmente daquele polipeptídeo (no exemplo anterior, uma atividade de TIGIT), sendo que atividade “biológica” refere-se a uma função biológica (tanto inibidora como estimuladora) causada por um polipeptídeo nativo ou ocorrendo naturalmente salvo a capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico possuído por um polipeptídeo nativo ou ocorrendo naturalmente, e uma atividade “imunológica” refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico possuído por um polipeptídeo nativo ou ocorrendo naturalmente (no exemplo anterior, um epítopo antigênico de TIGIT).

[085] O termo “aptâmero” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é capaz de ligação a uma molécula alvo, tal como um polipeptídeo. Por exemplo, um aptâmero da invenção pode ligar-se especificamente a um polipeptídeo de TIGIT ou a uma molécula em uma via de sinalização que modula a expressão de TIGIT. A geração e uso terapêutico de aptâmeros estão bem estabelecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 5.475.096, e a eficácia terapêutica de Macugen® (Eyetech, New York) para tratar a degeneração macular relacionada à idade.

[086] O termo “antagonista” é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que parcialmente ou completamente bloqueia, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo divulgado no presente. De um modo similar, o termo “agonista” é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imita uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo divulgado no presente. Moléculas agonistas ou antagonistas apropriadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos agonistas e antagonistas, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipeptídeos, peptídeos, oligonucleotídeos antisense, moléculas orgânicas pequenas, etc. Os métodos para identificar os agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo podem compreender contatar um polipeptídeo com uma molécula agonista ou antagonista candidata e medir uma troca detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo.

[087] Os termos “antagonista de TIGIT” e “antagonista da atividade de TIGIT ou da expressão de TIGIT” são usados intercambiavelmente e referem-se a um composto que interfere com o funcionamento normal de TIGIT, tanto diminuindo a transcrição e tradução de ácido nucleico codificando TIGIT, como inibindo ou bloqueando a atividade do polipeptídeo de TIGIT, ou ambos. Exemplos de antagonistas de TIGIT incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos antisense, RNAs interferentes, RNAs catalíticos, quimeras de RNA-DNA, aptâmeros específicos de TIGIT, anticorpos anti-TIGIT, fragmentos de ligação de TIGIT de anticorpo anti-TIGIT, moléculas pequenas de ligação de TIGIT, peptídeos de ligação de TIGIT, e outros polipeptídeos que ligam especificamente TIGIT (incluindo, mas não limitados a, fragmentos de ligação de TIGIT de um ou mais ligantes de TIGIT, opcionalmente fundidos a um ou mais domínios adicionais), de modo que a interação entre o antagonista de TIGIT e TIGIT resulta em uma redução ou cessação da atividade ou expressão de TIGIT. Será entendido por um dos técnicos no assunto que em alguns casos, um antagonista de TIGIT pode antagonizar uma atividade de TIGIT sem afetar outra atividade de TIGIT. Por exemplo, um antagonista de TIGIT desejável para uso em alguns dos presentes métodos é um antagonista de TIGIT que antagoniza a atividade de TIGIT em resposta a uma da interação de PVR, interação de PVRL3, ou interação de PVRL2, por exemplo, sem afetar ou afetar minimamente quaisquer das outras interações de TIGIT.

[088] Os termos “antagonista de PVR” e “antagonista da atividade de PVR ou expressão de PVR” são usados intercambiavelmente e referem-se a um composto que interfere com o funcionamento normal de PVR,tanto diminuindo a transcrição ou a tradução de ácido nucleico codificando PVR, como inibindo ou bloqueando a atividade do polipeptídeo de PVR, ou ambos. Exemplos de antagonistas de PVR incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos antisense, RNAs interferentes, RNAs catalíticos, quimeras de RNA-DNA, aptâmeros específicos de PVR, anticorpos anti-PVR, fragmentos de ligação de PVR de anticorpos anti-PVR, moléculas pequenas de ligação de PVR, peptídeos de ligação de PVR e outros polipeptídeo que ligam especificamente PVR (incluindo, mas não limitados a, fragmentos de ligação de PVR de um ou mais ligantes de PVR, opcionalmente fundidos a um ou mais domínios adicionais), de modo que a interação entre o antagonista de PVR e PVR resulta em uma redução na cessação da atividade ou expressão de PVR. Será entendido por um dos técnicos no assunto que, em alguns casos, um antagonista de PVR pode antagonizar uma atividade de PVR sem afetar outra atividade de PVR. Por exemplo, um antagonista de PVR desejável para uso em alguns dos presentes métodos é um antagonista de PVR que antagoniza a atividade de PVR em resposta à interação de TIGIT sem impactar as interações de PVR-CD96 e/ou PVR-CD226.

[089] Os termos “agonista de TIGIT” e “agonista da atividade de TIGIT ou da expressão de TIGIT” são usados intercambiavelmente e se referem a um composto que aprimora ou estimula o funcionamento normal de TIGIT, aumentando a transcrição ou tradução de ácido nucleico codificando TIGIT e/ou inibindo ou bloqueando a atividade de uma molécula que inibe a expressão de TIGIT ou a atividade de TIGIT, e/ou aprimorando a atividade de TIGIT normal (incluindo, mas não limitado a, aprimorar a estabilidade de TIGIT ou aprimorar a ligação de TIGIT a um ou mais ligantes alvos). Por exemplo, o agonista de TIGIT pode ser selecionado de um anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno, um aptâmero, um RNA interferente, uma molécula pequena, um peptídeo, uma molécula antisense, e outro polipeptídeo de ligação. Em outro exemplo, o agonista de TIGIT pode ser um polinucleotídeo selecionado de um aptâmero, RNA interferente, ou molécula antisense que interfere com a transcrição e/ou tradução de uma molécula inibidora de TIGIT. Será entendido por um técnico no assunto que em alguns casos, um agonista de TIGIT pode agonizar uma atividade de TIGIT sem afetar outra atividade de TIGIT. Por exemplo, um agonista de TIGIT desejável para uso em alguns dos presentes métodos é um agonista de TIGIT que agoniza a atividade de TIGIT em resposta a uma da interação de PVR, interação de PVRL3, ou interação de PVRL2, por exemplo, sem afetar ou minimamente afetar qualquer uma das outras interações de TIGIT.

[090] Os termos “agonista de PVR” e “agonista da atividade de PVR ou da expressão de PVR” são usados intercambiavelmente e se referem a um composto que aprimora ou estimula o funcionamento normal de PVR, aumentando a transcrição ou tradução de ácido nucleico codificando PVR, e/ou inibindo ou bloqueando a atividade de uma molécula que inibe a expressão de PVR ou a atividade de PVR, e/ou aprimorando a atividade de PVR normal (incluindo, mas não limitado a, aprimorar a estabilidade de PVR ou aprimorar a ligação de PVR a um ou mais ligantes alvos). Por exemplo, o agonista de PVR pode ser selecionado de um anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno, um aptâmero, um RNA interferente, uma molécula pequena, um peptídeo, uma molécula antisense e outro polipeptídeo de ligação. Em outro exemplo, o agonista de PVR pode ser um polinucleotídeo selecionado de um aptâmero, RNA interferente, ou molécula antisense que interfere com a transcrição e/ou tradução de uma molécula inibidora de PVR. Será entendido por um técnico no assunto que, em alguns casos, um agonista de PVR pode agonizar uma atividade de PVR sem afetar outra atividade de PVR. Por exemplo, um agonista de PVR desejável para uso em alguns dos presentes métodos é um agonista de PVR que agoniza a atividade de PVR em resposta à interação de TIGIT, ou que imita TIGIT em interação com PVR, por exemplo, sem afetar ou minimamente afetar as interações de PVR-CD96 ou PVR-CD226.

[091] “Tratamento” refere-se tanto a tratamento terapêutico como medidas preventivas, sendo que o objetivo é prevenir ou abrandar (diminuir) a condição ou distúrbio patológico alvo. Os que precisam do tratamento incluem os já com o distúrbio bem como os que tendem a ter o distúrbio ou os em que o distúrbio deve ser prevenido.

[092] Administração “crônica” refere-se à administração do(s) agente(s) de um modo contínuo como oposto a um modo agudo, para manter o efeito terapêutico inicial (atividade) durante um período prolongado de tempo. Administração “intermitente” é o tratamento que não é consecutivamente feito sem interrupção, mas certamente é cíclico por natureza.

[093] "Mamífero"para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e agrícolas, e animais de zoo, de esportes ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. De preferência, o mamífero é humano.

[094] A administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem.

[095] "Veículos", como usado no presente, incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores que são não tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Muitas vezes o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada em f aquoso. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos do que 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contraíons formando sal tal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.

[096] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anticorpo intacto, de preferência a região variável ou de ligação de antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos de Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); molécula de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[097] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos “Fab”, cada um com um sítio de ligação de antígeno único, e um fragmento "Fc" residual, uma designação refletindo a capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com papaína deu um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de combinação de antígenos e é capaz de reticular o antígeno.

[098] "Fv"é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação reconhecimento e de ligação de antígeno completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve em associação firme, não covalente. É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero VHVL. Coletivamente, os seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.

[099] O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab’ pela adição de alguns resíduos ao término carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas de uma região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação presente para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas na articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.

[0100] As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, baseado na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0101] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes. Existem cinco classes maiores de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.

[0102] Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única"ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, sendo que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. De preferência, o polipeptídeo de Fv ainda compreende um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita sFv a formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Anticorpoes, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0103] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos pequenos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Usando um ligador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0104] Um anticorpo “isolado” é um que é identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com os usos de diagnóstico e terapêutico para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em certas modalidade, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais de preferência mais do 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de ventosa giratória, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução e de não redução usando um corante ou colorante tal como, mas não limitado a, corante Coomassie blue ou prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0105] Um anticorpo que “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo particular é um que se liga àquele polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo particular sem substancialmente ligar-se a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.

[0106] O termo “região hipervariável,” “HVR,” ou “HV,” quando usado no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam laços estruturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior parte da diversidade dos seis HVRs, e acredita-se que H3, em particular, desempenha um papel único em que conferem uma excelente especificidade aos anticorpos. Ver, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Naturalmente, anticorpos de camelídeos ocorrendo naturalmente consistindo de uma cadeia pesada são somente funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0107] Um número de delineações de HVR está em uso e são englobadas no presente. As regiões de determinação complementares de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5aEd. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se, em vez disso, ao sítio dos laços estruturais (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Os HVRs de AbM representam um compromisso entre os HVRs de Kabat e laços estruturais de Chothia, e são usados pelo software de modelação do anticorpo AbM de Oxford Molecular. Os HVRs de “contato” são baseados em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos de cada um destes HVRs são indicados abaixo.

[0108] HVRs podem compreender “HVRs estendidos” como a seguir:: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra, para cada uma destas definições.

[0109] Os resíduos de "quadro" ou resíduos de "FR"são os resíduos de domínio variável salvo os resíduos de HVR como definido no presente.

[0110] O termo “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” ou “numeração da posição de aminoácidos como em Kabat,” e variações do mesmo, refere-se ao sistema de numeração usado para os domínios variávels de cadeia pesada ou os domínios variávels de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear atual pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada pode incluir um inserto de aminoácidos único (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, os resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 FR de cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência de anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[0111] O sistema de numeração de é geralmente usado quando se referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente 1-107 resíduos de cadeia leve e os resíduos 1-113 de cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequências of Immunological Interest. 5aEd. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice EU” é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU descrito em Kabat et al., supra). O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo EU de IgG1 humano. A menos que descrito de outro modo no presente, referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de Kabat. A menos que indicado de outro modo no presente, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpo significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU (por exemplo, ver o pedido provisório US no 60/640.323, figuras para a numeração EU).

[0112] Um anticorpo “maturado por afinidade” é um com uma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta em uma melhora na afinidade do anticorpo para antígeno, comparado a um anticorpo parente que não possui esta (s) alteração (ões). Em uma modalidade, um anticorpo maturado por afinidade tem afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos usando certos procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade misturando o domínio de VH e de VL. Mutagênese aleatória de HVR e/ou resíduos de quadro é descrito, por exemplo, por Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0113] Um anticorpo “de bloqueio” ou um anticorpo “antagonista” é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que ele liga. Certos anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno. Um “anticorpo agonista”, como usado no presente, é um anticorpo que imita parcialmente ou completamente pelo menos uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.

[0114] A palavra "rótulo"quando usada no presente refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente ao anticorpo de modo a gerar um anticorpo “marcado”. O rótulo pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, rótulos radioisotópicos ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.

[0115] Por "fase sólida"entende-se uma matriz não aquosa à qual o anticorpo da presente invenção pode aderir. Exemplos de fases sólidas englobadas no presente incluem, mas não estão limitados às formadas parcialmente ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro com poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas modalidades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o reservatório de uma placa de ensaio; em outras, ela é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tal como as descritas na Patente US 4.275.149.

[0116] Um "lipossoma"é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para a liberação de uma droga (tal como um polipeptídeo descrito no presente ou anticorpo do mesmo) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente dispostos em uma formação em bicamada, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.

[0117] Uma “molécula pequena” é definida no presente para ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dalton.

[0118] O termo "doença relacionada à imunidade" significa uma doença em que um componente do sistema imune de um mamífero causa, media ou de outro modo contribui para a morbidez no mamífero. Também incluídas são doenças em que o estímulo ou intervenção da resposta imune tem um efeito de melhora sobre a progressão da doença. Incluídas dentro deste termo estão doenças inflamatórias mediadas por imunidade, doenças inflamatórias não mediadas por imunidade, doenças infecciosas, doenças da imunodeficiência, neoplasia, etc.

[0119] O termo "doença mediada por células T” significa uma doença relacionada à imunidade em que as células T diretamente ou indiretamente mediam ou de outro modo contribuem para uma morbidez em um mamífero. A doença mediada por células T pode estar associada com efeitos mediados por células, efeitos mediados por linfocinas, etc., e ainda efeitos associados com células B se as células B são estimuladas, por exemplo, pelas linfocinas secretadas por células T.

[0120] Exemplos de doenças relacionadas à imunidade e inflamatórias, algumas das quais são imunes ou mediadas por células T, que podem ser tratadas de acordo com a invenção, incluem lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, artrite crônica juvenil, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (esclerodérmica), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjogren, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria noturna paroxismal), trombocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia mediada por imunidade), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal mediata imune (glomerulonofrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinizantes dos sistemas nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tal como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotróficos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, distúrbio intestinal inflamatório (IBD) (colite ulcerativa: doença de Crohn), enteropatia sensível a glúten, e doença de Whipple, doenças de pele mediadas por imunidade incluindo doenças de pele com bolhas, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tal como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade a alimentos e urticária, doenças imunológicas do pulmão tal como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplantes incluindo rejeição a enxerto e doença de enxerto versus hospedeiro. Doenças infecciosas incluindo doenças virais tal como AIDS (infecção por HIV), hepatites A, B, C, D e E, herpes, etc., infecções bacterianas, infecções fúngicas, infecções por protozoários também podem ter componentes imunes e/ou inflamatórios e/ou etiologia.

[0121] Várias doenças de pele estão correlacionadas com uma resposta imune aberrante e à autoimunidade. Doenças tal como psoríase são acentuadas por empolação da pele, descamação da pele, edema e a presença de autoanticorpos que se ligam a proteínas da pele. Neste pedido, as experiências determinam que a expressão de TIGIT é regulada ascendentemente em pele com psoríase vs. pele normal. A modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT pode ser útil no tratamento de sintomas ou causas subjacentes de psoríase.

[0122] O termo distúrbio intestinal inflamatório (“IBD”) descreve um grupo de distúrbios inflamatórios crônicos de causas desconhecidas em que o intestino (víscera) torna-se inflamado, muitas vezes causando câimbras recorrentes ou diarréia. A prevalência de IBD nos US é estimada estar em uma população de cerca de 200 por 100.000. Os pacientes com IBD podem ser divididos em dois grupos maiores, os com colite ulcerativa (“UC”) e os com doença de Crohn (“CD”).

[0123] Nos pacientes com UC, existe uma reação inflamatória envolvendo primeiramente a mucosa do cólon. A inflamação é tipicamente uniforme e contínua com nenhuma área interveniente da mucosa normal. As células da mucosa de superfície bem como do epitélio de cripta e da submucosa estão envolvidas em uma reação inflamatória com infiltração de neutrófilos. Ultimamente, esta situação progride tipicamente para dano epitelial com perda de células epiteliais resultando em múltiplas ulcerações, fibrose, displasia e retração longitudinal do cólon. CD difere de DC em que a inflamação se estende através de todas as camadas da parede intestinal e envolve o mesentério bem como os nodos linfáticos. CD pode afetar qualquer parte do canal alimentar da boca ao ânus. A doença é muitas vezes descontínua, isto é, os segmentos gravemente adoentados do intestino são separados de áreas aparentemente livres da doença. Em CD, a parede intestinal também se espessa, o que pode levar a obstruções. Além disso, fístulas e fissuras não são incomuns.

[0124] Clinicamente, IBD é caracterizado por diversas manifestações resultando muitas vezes em um curso crônico, imprevisível. Diarréia sangrenta e dor abdominal são muitas vezes acompanhadas por febre e perda de peso. Anemia não é incomum, como fadiga severa. Manifestações nas juntas na faixa de artralgia a artrite aguda bem como anormalidades na função do fígado estão comumente associadas com IBD. Os pacientes com IBD também têm um risco aumentado de carcinomas do cólon comparados à população geral. Durante os “ataques” agudos de IBD, trabalhar e outra atividade normal são usualmente impossíveis, e muitas vezes um paciente é hospitalizado.

[0125] Embora a causa de IBD permaneça desconhecida, vários fatores como suscetibilidade genética, infecciosa e imunológica estão implicados. IBD é muito mais comum em Caucasianos, especialmente os de ascendência judaica. A natureza inflamatória crônica da condição levou a uma intensa pesquisa para uma possível causa infecciosa. Embora fossem encontrados agentes que estimulam a inflamação aguda, não se encontrou nenhum que cause a inflamação crônica associada com IBD. A hipótese de que IBD é uma doença autoimune é suportada pela manifestação extra- intestinal mencionada anteriormente de IBD como artrite das juntas, e a resposta positiva conhecida para IBD por tratamento com agentes terapêuticos tal como glicocorticóides adrenais, ciclosporina e azatioprina, que são sabidos suprimir resposta imune. Além do trato GI, mais do que um órgão do corpo é continuamente exposto a substâncias antigênicas potenciais como proteínas de alimento, subprodutos bacterianos (LPS), etc.

[0126] Além disso, o risco de câncer de cólon é altamente elevado em pacientes com colite ulcerativa grave, particularmente se a doença existe durante vários anos. Cerca de 20-25% dos pacientes com IBD eventualmente requerem cirurgia para a remoção do cólon devido à reprodução maciça, enfermidades debilitantes crônicas, perfuração do cólon ou risco de câncer. A cirurgia também é algumas vezes realizada quando outras formas de tratamento médico falham ou quando os efeitos colaterais de esteróides ou outros medicamentos ameaçam a saúde do paciente. Como a cirurgia é invasiva e altera drasticamente a vida, ela não é um regime de tratamento altamente desejável, e é tipicamente o tratamento de último recurso. A fim de melhor entender esta doença e possivelmente tratar a mesma, experiências determinaram que TIGIT foi regulada ascendentemente tanto em CD como em UC quando comparado ao tecido normal. A modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT pode provar ser útil no tratamento de uma ou mais formas de IBD.

[0127] Artrite reumatóide (RA) é uma doença inflamatória autoimune sistêmica crônica que envolve principalmente a membrana sinovial de múltiplas juntas com dano resultante à cartilagem articular. A patogênese é dependente de linfócitos T e está associada com a produção de fatores reumatóides, auto-anticorpos dirigidos contra auto IgG, com a formação resultante de complexos imunes que obtém altos níveis no fluido e sangue das juntas. Estes complexos da junta podem induzir o infiltrado acentuado de linfócitos e monócitos na sinóvia e subsequentes trocas sinoviais acentuadas; o espaço/fluido das juntas, se infiltrado por células similares com a adição de numerosos neutrófilos. Os tecidos afetados são primeiramente as juntas, muitas vezes em padrão simétrico. No entanto, doença extra-articular também ocorre em duas formas maiores. Uma forma é o desenvolvimento de lesões extra-articulares com doença da junta progressiva em curso e lesões típicas de fibrose pulmonar, fibrose, vasculite e úlceras cutâneas. A segunda forma da doença extra-articular é a denomina síndrome de Felty que ocorre depois no curso da doença RA, algumas vezes após a doença da junta ter se tornado quiescente, e envolve a presença de neutropenia, trombocitopenia e esplenomegalia. Isto pode ser acompanhado por vasculite em múltiplos órgãos com a formação de infartos, úlceras da pele e gangrena, Os pacientes muitas vezes também desenvolvem nódulos reumatóides no tecido da subcútis sobrepondo as juntas afetadas; o estágio final dos nódulos tem centros necróticos circundados por células inflamatórias misturadas infiltradas. Outras manifestações que podem ocorrer em RA incluem: pericardite, pleurite, artrite coronariana, pneumonite intestinal com fibrose pulmonar, ceratoconjuntivite seca, e nódulos reumatóides.

[0128] A artrite crônica juvenil é uma doença inflamatória idiopática crônica que começa muitas vezes com menos de 16 anos de idade. Seu fenótipo tem algumas similaridades a RA; alguns pacientes que são positivos para fator reumatóide são classificados como artrite reumatóide juvenil. A doença é subclassificada em três categorias maiores: pauciarticular, poliarticular e sistêmica. A artrite pode ser grave e é tipicamente destrutiva e leva à ancilose das juntas e crescimento retardado. Outras manifestações podem incluir uveíte anterior crônica e amiloidose sistêmica.

[0129] O termo “quantidade eficaz” é uma concentração ou quantidade de um polipeptídeo e/ou agonista/antagonista que resulta na obtenção de determinado propósito. Uma “quantidade eficaz” de um polipeptídeo ou agonista ou antagonista do mesmo pode ser determinada empiricamente. Além disso, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma concentração ou quantidade de um polipeptídeo e/ou agonista/antagonista que é eficaz na obtenção de um determinado efeito terapêutico. Esta quantidade pode ser determinada empiricamente.

[0130] O termo “agente citotóxico”, como usado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tal como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, ou fragmentos das mesmas.

[0131] Um “agente quimioterapêutico” é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem adriamicina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracila, citosina arabinosídeo (“Ara-C”), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxóides, por exemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers, Squibb Oncology, Princeton, NJ), e doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposida, daunomicina, carminomicina, aminopterina, esperamicinas (ver Patente US 4.675.187), melfalan e outras mostradas nitrogenadas relacionadas. Também incluídos nestas definições estão agentes hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tal como tamoxifen e onapristona.

[0132] Um “agente inibidor de crescimento” quando usado no presente refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente células de câncer superexpressando qualquer um dos genes identificados no presente, tanto in vitro como in vivo. Assim, o agente inibidor de crescimento é um que reduz significativamente a percentagem de células superexpressando tais genes na fase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em uma placa salvo a fase S), tais como os agentes que induzem a interrupção de G1 e a interrupção da fase M. Os bloqueadores da fase M clássicos incluem os inibidores vincas (vincristina e vinblastina), taxol e topo II tal como doxorrubicina, epirrubibina, daunorrubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que interrompem GI também extravasam para dentro da interrupção da fase S, por exemplo. Os agentes de alquilação de DNA tal como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. Outra informação pode ser encontrada, por exemplo, em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente página 13.

[0133] O termo “citocina” é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que agem em outra célula como mediadores intercelulares. Certos exemplos de tais citocinas são linfoncinas, monocinas, e hormônios de polipeptídeo tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão, por exemplo, hormônio de crescimento tal como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila, e hormônio do crescimento bovino; hormônio da paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tal como hormônio estimulante de folículos (FSH), hormônio estimulante da tiróide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-α e -β de necrose de tumor; substância inibidora mileriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nervos tal como NGF-β; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformantes (TGFs) tal como TGF-α e TGF-β; fator-I e -II de crescimento como insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tal como interferon-α, -β e -y; fatores de estímulo de colônias (CSFs) tal como macrófago- CSF (M-CSF); granulócito-macrofago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G- CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um fator de necrose de tumor tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e o ligando kit (KL). Como usado no presente, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos de citocinas de sequência nativa.

[0134] Como usado no presente, o termo “imunoadesina” designa moléculas semelhantes a anticorpos que combina, a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma “adesina”) com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma função de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do sítio de reconhecimento e de ligação de antígeno de um anticorpo (isto é, é “heteróloga”), e uma sequência do domínio constante de imunoglobulina. A parte da adesina de uma molécula de imunoadesina é particularmente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida de uma imunoglobulina, tal como os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[0135] Como usado aqui, o termo “células inflamatórias” designa células que aprimoram a resposta inflamatória tais como células mononucleares, eosinófilos, macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares (PMN).

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA INVENÇÃO

[0136] TIGIT foi anteriormente identificado como um modulador putativo da função imune (ver, por exemplo, pedido de patente US 20040121370, incorporada ao presente por referência). Presentemente, os requerentes demonstram que TIGIT é um membro de uma família recentemente descrita de proteínas relacionadas à imunidade denominadas família de “proteína semelhante a TIGIT” (TLP) que inclui o receptor de poliomielite (PVR, também conhecido como NECL5 ou CD155), 1-4 proteínas semelhantes a PVR (PVRL1-4), CD96 e CD226. Os requerentes fornecem os elementos estruturais conservados desta nova família de TLP, cujos membros desempenham papéis na regulação e função imunes, e fornecem métodos para identificar outros membros da família. PVRL1-4 e PVR compartilham uma arquitetura de domínio comum (IgV-IgC-IgV), enquanto que CD226 e CD96 são desprovidos do domínio IgV proximal da membrana. Os segmentos intracelulares destas oito proteínas mostram somente uma similaridade limitada de uma com a outra fora do motivo de ligação de afadin compartilhado entre PVRL1-3; PVRL4 é desprovido desta sequência, mas ainda é sabido ainda ligar afadina. Baseado na estrutura de cristal do domínio de IgV relacionado de NECL-1 (Dong et al., J. Biol. Chem. 281: 10610-17 (2006)) o primeiro e o terceiro motivos são previstos estar em laços de hairpin entre os beta- filamentos B e C e F e G, respectivamente. Estes dois laços são adjacentes um ao outro em uma extremidade da dobra de IgV. O segundo motivo compreende os beta-filamentos C’ e C” que estão envolvidos, formando parte da interface homodimética para NECL-1. Assim, estes motivos de sequências podem desempenhar um papel em interações homo- e heterotípicas específicas observadas entre os membros da família PVR.

[0137] Os membros da família TLP compreendem um número de aminoácidos absolutamente conservados, incluindo alanina67, glicina74, prolina114, e glicina116. Adicionalmente, os membros da família TLP compreendem vários aminoácidos que são substancialmente conservados (por exemplo, encontrados na maioria dos membros da família, mas não em cada membro da família), incluindo um aminoácido selecionado de valina, isoleucina e leuxina na posição 54, um aminoácido selecionado de serina e treonina na posição 55, uma glutamina na posição 56, uma treonina na posição 112 e um aminoácido selecionado de fenilalanina e tirosina na posição 113. Os membros da família TLP também compreendem três submotivos estruturais: valina/isoleucina54-serina/treonina55-glutamina56; alanina67-X68-73-glicina74 (onde X é qualquer aminoácido); e treonina112-fenialanina/tirosina113-prolina114-x115- glicina116 (onde X é qualquer aminoácido). Será entendido por um técnico no assunto que a numeração usada acima é com respeito à sequência da proteína TIGIT humana, e enquanto a posição relativa destes resíduos conservados e dos motivos nos diferentes membros da família da proteína TLP é idêntica à posição dos aminoácidos na sequência de TIGIT humana, a numeração absoluta destes resíduos em outros membros da família TLP pode diferir.

[0138] Dado o envolvimento dos membros da família TLP identificados na regulação e função imunes, outros membros desta família de proteínas também são prováveis de estarem envolvidos na regulação e função imunes. Consequentemente, a invenção fornece métodos de determinar se uma dada proteína é um membro da família TLP alinhando a sequência da proteína às sequências de um ou mais membros da família identificados acima e avaliando a presença ou ausência na dada sequência de proteínas dos resíduos absolutamente conservados identificados acima, dos resíduos substancialmente conservados identificados acima e/ou dos submotivos estruturais identificados acima. A invenção também fornece métodos de identificar outros membros da família de proteínas TLP pesquisando uma ou mais bases de dados das sequências para proteínas cujas sequências de aminoácidos compreendem os resíduos absolutamente conservados identificados acima, os resíduos substancialmente conservados identificados acima e/ou os submotivos estruturais identificados acima.

[0139] A identificação da família TLP pelos requerentes, no presente, também apresenta a possibilidade de que os aspectos estruturais comuns dos membros da família TLP podem permitir dois ou mais membros da família TLP serem similarmente modulados. Por exemplo, se os resíduos e submotivos de aminoácidos conservados e substancialmente conservados em cada membro da família TLP dão origem a estruturas tridimensionais similares nestes membros da família em um ou mais domínios de cada proteína, então as estruturas tridimensionais similares podem ser objetivadas a fim de modular simultaneamente mais do que um membro da família TLP, ou mesmo todos os membros da família TLP ao mesmo tempo. Assim, a invenção também fornece também agentes (“agentes de interação com TLP”) que interagem especificamente com tais regiões substancialmente conservadas de membros da família TLP. Tais agentes podem ser usados para identificar um ou mais outros membros da família TLP avaliando se uma proteína candidata interage com um agente de interação com TLP. A interação da proteína candidata com o agente de interação com TLP pode indicar que a proteína também pode ser um membro da família TLP. Os agentes de interação com TLP podem modular a atividade de TLP. Por exemplo, um agente de interação com TLP pode ser um antagonista da atividade de TLP, incluindo, mas não limitado a, um inibidor de molécula pequena, um anticorpo inibidor ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um aptâmero, e um peptídeo inibidor. Em outro exemplo, um agente de interação com TLP pode ser um agonista da atividade de TLP, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo agonizante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um peptídeo agonizante, e uma molécula pequena que estabiliza uma estrutura da proteína TLP para facilitar a atividade da proteína TLP. Os agentes de interação com TLP podem ser identificados em uma variedade de modos conhecidos na técnica, por exemplo, usando os métodos de triagem descritos no presente.

[0140] Os requerentes mostram por análises de mRNA e FACS que TIGIT é predominantemente expresso em uma variedade de células T ativadas, particularmente, célula T reguladoras (Treg), célula T da memória, células NK, e células T auxiliares (Tfh) de células B foliculares isoladas do tecido tonsilar. Assim, a invenção fornece métodos de identificar se ou não uma célula selecionada é uma Treg, célula T da memória, célula NK, ou célula Tfh baseado em se ou não TIGIT expressa células. A invenção também fornece métodos de usar TIGIT para purificar Treg, células T da memória, células NK e células Tfh fora de outros tipos de células imunes que não expressam TIGIT usando qualquer um dos métodos de purificação conhecidos na técnica e/ou descritos no presente (como um exemplo não limitante, por citometria de fluxo). Os requerentes também demonstram que a expressão mais alta de TIGIT nestas populações de células ocorre em Treg ativadas. Assim, a invenção também fornece métodos de identificar se uma dada célula em uma Treg ativada baseada em seu nível de expressão de TIGIT com relação aos níveis de expressão de TIGIT em uma ou mais amostras de controle (onde as amostras de controle podem ser valores predeterminados de populações de subconjuntos de células T exemplares, ou as amostras de controle podem ser outras amostras de subpopulações de células T conhecidas tal como Treg ativada, Treg não ativada, células T nativas, células T da memória, células Tfh, ou outras populações de células T). Também são fornecidos métodos de determinar se uma dada célula Treg é ativada, determinando seu nível de expressão de TIGIT com relação a níveis de expressão de TIGIT em uma ou mais amostras de Treg ativadas ou não ativadas de controle ou com relação a valores de expressão de TIGIT em populações de células Treg ativadas ou não ativadas conhecidas. São ainda fornecidos métodos de isolar separadamente células Treg ativadas de outras células T usando qualquer um dos métodos de purificação conhecidos na técnica e/ou descritos no presente onde a quantidade de TIGIT expresso na célula pode ser usada para separar a célula de outras células (como um exemplo não limitante, por citometria de fluxo).

[0141] Os requerentes demonstram no presente que TIGIT liga-se firmemente a PVR, e liga-se com Kd menor de PVRL3 (também conhecido como nectin-3 ou CD113) e PVRL2 (também conhecido como nectin-3 ou CD112). Como exemplificado pelos requerentes, a ligação de TIGIT a PVR bloqueia a interação de PVR com dois outros ligantes, CD226 e CD96, e CD226 é um inibidor menos eficaz da interação de TIGIT-PVR do que TIGIT é da interação PVR-CD226. Os requerentes produziram anticorpos anti-TIGIT (por exemplo, o anticorpo 10A7 anti-TIGIT descrito no presente) que inibe a ligação de TIGIT ou uma proteína de fusão de TIGIT a PVR expresso na superfície das células. Os requerentes ainda produziram outros anticorpos, tal como o anticorpo IF4 descrito no presente, com especificidades de epítopos diferentes em TIGIT do que 10A7. Notavelmente, CD226 não é significativamente expresso em Tregs ou Tfh, dois tipos de células que expressam altamente TIGIT.

[0142] Suportada por estas descobertas, a invenção fornece agonistas e antagonistas da interação de TIGIT-PVR, da interação de TIGIT- PVRL2 e da interação de TIGIT-PVRL3, e métodos de modular a ligação de TIGIT-PVR, a ligação de TIGIT-PVRL2 e a ligação de TIGIT-PVRL3 in vitro ou in vivo usando tais agonistas e antagonistas. Também são fornecidos métodos de modular a interação de CD226-PVR e/ou a interação de CD96-PVR administrando TIGIT (um competidor para a ligação de PVR) ou um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo in vitro ou in vivo. A invenção inclui ainda anticorpos anti-TIGIT e fragmentos dos mesmos, ambos agonizantes e antagonizantes, e em particular anticorpos anti-TIGIT 10A7 e IF4 e tipos alternativos de anticorpos compreendendo os CDRs do anticorpo anti- TIGIT 10A7 e/ou IF4.

[0143] Os estudos descritos no presente demonstram a interação de TIGIT com PVR em DC, e mostram que esta interação de ligação modula a função de DC, particularmente a produção de citocina. PVR é um receptor de superfície de células sabido ser altamente expresso em células dendríticas (DC), bem como FDC, fibroblastos, células endoteliais, e algumas células de tumor (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006)). DC humano ligado a TIGIT secretou altos níveis de IL-10 e citocinas menos pró-inflamatórias e outras citocinas (como IL-12p40, IL-12p70, IL-6, IL-18, e IFNY). TIGIT não teve nenhum efeito sobre a produção de certas citocinas tal como IL-23. Esta citocina inclinando-se na ligação de TIGIT somente foi observada em células que foram estimuladas por TNFa ou CD40/LPS, e não em células estimuladas por TLR2 ou Pam3CSK4, sugerindo que TIGIT é um meio pelo qual o sistema imune pode ajustar a função de DC. A ligação de TIGIT a células T imaturas (como avaliado usando construções de fusão de TIGIT) inibiu a ativação e proliferação de células T. No entanto, o tratamento com TIGIT não afetou a capacidade de DC derivado de monócitos imaturos (iMDDC) maturar, nem induziu diretamente a maturação destas células. Notavelmente, esta inibição foi revertida na presença de um inibidor de ERK, indicando que a ativação de ERK pode ser uma etapa importante no funcionamento de TIGIT para modular a atividade de DC. De fato, os requerentes demonstram que a ligação de TIGIT a PVR resulta na fosforilação de PVR e na fosforilação aumentada do dímero de pERK, mas não no monômero de pERK. Este não foi um efeito generalizado, uma vez que, por exemplo, a via de sinalização intracelular p38 não foi modulada com tratamento de células com TIGIT-Fc. Os requerentes mostram no presente que células T TIGIT+ suprimem a proliferação não somente de outras células T TIGIT-, mas também de células apresentadoras de antígenos quando presentes em uma população misturada de células imunes. Os requerentes demonstram ainda que a interação de TIGIT-PVR media os efeitos observados acima, uma vez que a inclusão de um anticorpo anti-TIGIT ou de um anticorpo anti-PVR nas experiências reduziu grandemente a inibição observada da proliferação, modulação da produção de citocina em DC e a supressão da proliferação de outras células imunes. De um modo geral, os dados fornecidos pelos requerentes no presente sugerem que TIGIT fornece um mecanismo de realimentação do sistema imune regulando negativamente a resposta imune.

[0144] Consequentemente, a invenção fornece métodos de modular a função celular (por exemplo, DC), modulando a expressão e/ou atividade de TIGIT ou PVR. Por exemplo, são fornecidos métodos para diminuir ou inibir a proliferação de células imunes (por exemplo, DC ou células apresentadoras de antígenos) tratando as células imunes in vitro ou in vivo com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR. Também são fornecidos métodos para aumentar a proliferação de células imunes (por exemplo, DC ou células apresentadoras de antígenos) tratando as células imunes in vitro ou in vivo com um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR. A invenção também fornece métodos para aumentar/estimular uma resposta imune administrando um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR. Similarmente, são fornecidos métodos para diminuir/inibir uma resposta imune administrando TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR.

[0145] Também são fornecidos pela invenção métodos de modular o tipo e/ou a quantidade de produção de citocina a partir de uma célula imune (por exemplo, DC) modulando a expressão e/ou atividade de TIGIT ou de PVR. Especificamente, a invenção fornece métodos para aumentar a produção de IL-10 por células imunes, por exemplo, DC, tratando as células in vitro ou in vivo com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR. Também são fornecidos métodos de diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias e/ou liberação por células imunes, por exemplo, DC, tratando as células in vitro ou in vivo com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR. Similarmente, métodos para diminuir a produção de IL-10 por células imunes, por exemplo, DC, tratando as células in vitro ou in vivo com um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR também são fornecidos. A invenção ainda fornece métodos de aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias e/ou liberação por células imunes, por exemplo, DC, tratando as células in vitro ou in vivo com um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR. Também são fornecidos métodos para estimular a fosforilação de ERK e/ou a sinalização intracelular através da via de ERK em uma ou mais células, tratando as células com TIGIT, um agonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um agonista da expressão e/ou atividade de PVR. Similarmente, a invenção fornece métodos de inibir ou diminuir a fosforilação de ERK e/ou a sinalização intracelular através da via de ERK em uma ou mais células, tratando as células com um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT, ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR.

[0146] TIGIT é aumentado na expressão em artrite, psoríase, distúrbio intestinal inflamatório e tecidos de câncer de mama com relação aos tecidos de controle normais como é mostrado no presente. Com relação aos tecidos de câncer de mama, os requerentes mostram que a expressão de TIGIT não se correlaciona com células de tumores per se, mas certamente com células imunes CD4+ infiltradas em tumores. Os requerentes também demonstram diretamente a capacidade de TIGIT modular a resposta imune mostrando que uma proteína de fusão de TIGIT inibiu as respostas de células T humanas in vitro e a ativação de células de murinos em um ensaio in vivo de hipersensibilidade do tipo retardado. Consequentemente, a invenção fornece métodos de diagnosticar doenças/distúrbios envolvendo resposta de células imunes aberrante em um paciente, avaliando a expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra do paciente e comparando a expressão e/ou atividade a uma quantidade de referência da expressão e/ou atividade de TIGIT ou a quantidade da expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente normal. A invenção também fornece métodos de avaliar a gravidade de uma doença ou distúrbio envolvendo resposta de células imunes aberrante (isto é, uma doença relacionada à imunidade) em um paciente avaliando a expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra do paciente e comparando a expressão e/ou atividade a uma quantidade de referência da expressão e/ou atividade de TIGIT ou a quantidade da expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente normal. Também são fornecidos métodos de prevenir uma doença ou distúrbio envolvendo resposta de células imunes aberrante (isto é, uma doença relacionada à imunidade), modulando a expressão e/ou atividade de TIGIT. Também são fornecidos métodos de tratar ou diminuir a gravidade de uma doença ou distúrbio envolvendo resposta de células imunes aberrantes (isto é, uma doença relacionada à imunidade), modulando a expressão e/ou atividade de TIGIT. A modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT pode tomar a forma de inibir a expressão e/ou atividade de TIGIT (isto é, com um antagonista de TIGIT ou um antagonista de PVR) quando as atividades reguladoras negativas de TIGIT estão contribuindo para o estado da doença. Por exemplo, a expressão e/ou atividade de TIGIT antagonizante pode ser desejável quando um aumento na proliferação de DC e/ou a produção aumentada de citocinas pró-inflamatórias por DC é desejável. A modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT pode tomar a forma de ativar ou aumentar a expressão e/ou atividade de TIGIT (isto é, administrando TIGIT, um agonista de TIGIT ou um agonista de PVR) quando as atividades reguladoras negativas de TIGIT são desejáveis para controlar um estado da doença. Por exemplo, a expressão e/ou atividade de TIGIT agonizante pode ser desejável quando um decréscimo na proliferação de DC e/ou na liberação diminuída de citocinas pró-inflamatórias por DC é desejável. Estes e outros aspectos da invenção são descritos em maior detalhe abaixo.

A. POLIPEPTÍDEOS DE TIGIT DE COMPRIMENTO COMPLETO

[0147] A presente invenção fornece sequências de nucleotídeo isoladas codificando polipeptídeos referidos na presente invenção como polipeptídeos de TIGIT. Em particular, cDNAs codificando vários polipeptídeos de TIGIT foram identificados e isolados, como divulgado em mais detalhe no relatório e nos exemplos abaixo. Será entendido por um técnico no assunto que a invenção também fornece polipeptídeos úteis nos métodos da invenção (isto é, PVR) e que quaisquer das descrições especificamente extraídas para o método de criação, produção, marcação, modificação pós-translacional, uso ou outros aspectos de polipeptídeos de TIGIT também serão aplicáveis a outros polipeptídeos não TIGIT.

B. VARIANTES DE POLIPEPTÍDEOS DE TIGIT

[0148] Além da sequência nativa de comprimento completo descrita aqui, é contemplado que as variantes de TIGIT podem ser preparadas. As variantes de TIGIT podem ser preparadas introduzindo trocas de nucleotídeo apropriadas no polinucleotídeo de TIGIT, e/ou por síntese do polipeptídeo de TIGIT desejado. Os técnicos no assunto apreciarão que as trocas de aminoácidos podem alterar os processos pós-translacionais de TIGIT, tal como trocando o número ou posição de sítios de glicosilação ou alterando as características de ancoragem de membrana do polipeptídeo.

[0149] As variações na sequência de comprimento completo de TIGIT ou em vários domínios de TIGIT descritos no presente, podem ser feitas, por exemplo, usando qualquer uma das técnicas e orientações para mutações conservativas e não conservativas descritas, por exemplo, na patente US 5.364.934. As variações podem ser uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais códons codificador do TIGIT que resulta em uma troca na sequência de aminoácidos de TIGIT como comparada com a sequência nativa de TIGIT. Opcionalmente, a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios de TIGIT. A orientação na determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser inseridos, substituídos ou deletados sem afetar adversamente a atividade desejada pode ser encontrada comparando a sequência de TIGIT com a de moléculas de proteínas conhecidas homólogas e minimizando o número de trocas de sequência de aminoácidos feitas nas regiões de alta homologia. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares, tal como a substituição de uma leucina com uma serina, isto é, substituições de aminoácidos conservativos. As inserções ou deleções podem estar opcionalmente na faixa de cerca de 1 a cerca de 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes para a atividade exibida pela sequência de comprimento completo ou nativa madura.

[0150] Fragmentos do polipeptídeo de TIGIT também são presentemente fornecidos. Tais fragmentos podem ser truncados no N-término ou no C-término, ou podem ser desprovidos de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com uma proteína nativa de comprimento completo. A certos fragmentos faltam resíduos de aminoácido que não são essenciais para a atividade biológica desejada do polipeptídeo de TIGIT.

[0151] Os fragmentos de TIGIT podem ser preparados por qualquer uma de um número de técnicas convencionais. Os fragmentos de peptídeos desejados podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de TIGIT por digestão enzimática, por exemplo, tratando a proteína com uma enzima sabida clivar as proteínas em sítios definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou digerindo o DNA com as enzimas de restrição apropriadas e isolando o fragmento desejado. Ainda outra técnica apropriada envolve isolar e ampliar um fragmento de DNA codificando um fragmento de polipeptídeo desejado, por reação de cadeia de polimerase (PCR). Os oligonucleotídeos que definem os términos desejados do fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5’ e 3’ em PCR. Os fragmentos de polipeptídeo de TIGIT compartilham pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com o polipeptídeo de TIGIT nativo descrito no presente.

[0152] Em certas modalidades, as substituições conservativas de interesse são mostradas na tabela 5 sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma troca na atividade biológica, então mais trocas substanciais denominadas substituições exemplares na tabela 5, ou como ainda descrito abaixo com referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos triados. TABELA 5

[0153] Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipeptídeo são realizadas selecionando as substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura da estrutura dorsal do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação de chapa ou de hélice; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) no volume da cadeia lateral. Os resíduos ocorrendo naturalmente são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeias laterais comuns: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, Val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acídico: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação das cadeias: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.

[0154] Substituições não conservativas implicam em trocar um membro de uma destas classes por outra classe. Os resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição conservativa, mais preferivelmente, nos sítios restantes (não conservados).

[0155] As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na técnica tal como mutagênese mediada por oligonucleotídeos (dirigida ao sítio), varredura de alanina, e mutagênese de PCR. Mutagênese dirigida ao sítio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagênese de cassete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagênese de seleção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. Londres SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante.

[0156] A análise de aminoácidos de varredura também pode ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos junto a uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varredura preferidos estão aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido entre este grupo porque ela elimina a cadeia lateral além do beta-carbono e é menos provável de alterar a conformação de cadeia principal da variante [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. A alanina também é tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Além disso, ela é frequentemente encontrada tanto nas posições enterrada como exposta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição de alanina não rende as quantidades adequadas da variante, um aminoácido isotérico pode ser usado.

C. MODIFICAÇÕES DE TIGIT

[0157] As modificações covalentes de TIGIT estão incluídas dentro do escopo desta invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir os resíduos de aminoácidos alvos de um polipeptídeo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos N- ou C-terminal do polipeptídeo de TIGIT. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular o polipeptídeo de TIGIT em uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso no método de purificar anticorpos anti-TIGIT, e vice-versa. Agentes de reticulação comumente usados incluem, por exemplo, 1,1- bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidoalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidila tal como 3,3’- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais, tal como bis-N- maleimido-1,8-octano e agentes como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

[0158] Outras modificações incluem a desamidação de glutaminila e resíduos de asparaginila nos correspondentes resíduos de glutamila e de aspartila, respectivamente, a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, a metilação de grupos a- amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], a acetilação de amina N-terminal, e a amidação de qualquer grupo carboxila N-terminal.

[0159] Outro tipo de modificação covalente dos polipeptídeos de TIGIT incluídos no escopo da invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do polipeptídeo. “Alterar o padrão de glicosilação nativo” é pretendido para os presentes fins significar deletar uma ou mais porções de carboidrato encontradas em uma sequência nativa de TIGIT (tanto removendo o sítio de glicosilação subjacente como deletando a glicosilação por meio químico e/ou enzimático), e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na sequência nativa de TIGIT. Além disso, a frase inclui trocas qualitativas na glicosilação de proteínas nativas, envolvendo uma troca na natureza e as proporções de várias porções de carboidratos presentes. A adição de sítios de glicosilação a um polipeptídeo pode ser realizada alterando a sequência de aminoácido. A alteração pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou de treonina à sequência nativa do polipeptídeo (para os sítios de ligação ligados a O). A sequência de aminoácidos do polipeptídeo pode, opcionalmente, ser alterada através de trocas no nível de DNA, particularmente por mutação do DNA codificador do polipeptídeo em bases pré-selecionadas de modo que são gerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados.

[0160] Outro meio de aumentar o número de porções de carboidrato no polipeptídeo é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos no polipeptídeo. Tais métodos são descritos na técnica, por exemplo, em WO 87/05330, publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

[0161] A remoção das porções de carboidrato presentes no polipeptídeo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou por substituição mutacional de códons codificando resíduos de aminoácidos que servem como alvos de glicosilação. As técnicas de desglicosilação químicas são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática das porções de carboidrato nos polipeptídeos pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

[0162] Outro tipo de modificação covalente de um polipeptídeo divulgado no presente compreende ligar o polipeptídeo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), propileno glicol ou polioxialquilenos, do modo descrito nas patentes US 4.640.835; US 4.496.689; US 4.301.144; US 4.670.417; US 4.791.192 ou US 4.179.337.

[0163] Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser modificados em um modo para formar uma molécula quimérica compreendendo um polipeptídeo fundido a outro, polipeptídeo heterólogo ou sequência de aminoácidos.

[0164] Em uma modalidade, tal molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo de interesse com um polipeptídeo de etiqueta que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-etiqueta pode ligar-se seletivamente. O epítopo de etiqueta é geralmente colocado no término amino ou carboxila do polipeptídeo de interesse. A presença de tais formas etiquetadas de epítopo do polipeptídeo de interesse pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo de etiqueta. Também, o fornecimento da etiqueta do epítopo capacita o polipeptídeo de interesse ser prontamente purificado por purificação de afinidade usando um anticorpo anti-etiqueta ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga à etiqueta do epítopo. Vários polipeptídeos de etiqueta e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem etiquetas de poli-histidina (poly- his) ou poli-histidina-glicina (poly-his-gly); o polipeptídeo de etiqueta flu HA e seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];a etiqueta c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 da mesma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e a etiqueta de glicoproteína D do vírus Simplex de herpes (gD) e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos de etiqueta incluem, mas não estão limitados a, peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o peptídeo do epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um peptídeo de epítopo de alfa-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e a etiqueta do peptídeo da proteína 10 do gene T7 [Lutz- Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

[0165] Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipeptídeo com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente de molécula quimérica (também referida como uma “imunoadesina”), tal fusão poderia ser a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de IgG de preferência incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio de transmembrana deletado ou inativado) de um polipeptídeo em lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de Ig. Em uma modalidade, a fusão de imunoglobulina inclui a articulação, CH2 e CH3, ou a articulação, regiões CH1, CH2 e CH3 de uma molécula de IgG. Para a produção de fusões de imunoglobulina ver também a patente US 5.428.130 expedida em 27 de junho de 1995.

D. PREPARAÇÃO DO POLIPEPTÍDEO

[0166] A descrição abaixo se refere primeiramente à produção de polipeptídeos cultivando células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico codificador do polipeptídeo de interesse. Naturalmente, é contemplado que os métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem ser empregados para preparar polipeptídeos. Por exemplo, a sequência de polipeptídeo, ou partes da mesma, pode ser produzida por síntese de peptídeos direta usando técnicas de fase sólida [ver, por exemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteínas in vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou por automação. Síntese automática pode ser realizada, por exemplo, usando um Sintetizador de Peptídeo de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando as instruções do fabricante. Várias porções do polipeptídeo podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o polipeptídeo de comprimento completo.

1. ISOLAMENTO DE DNA CODIFICADOR DO POLIPEPTÍDEO

[0167] O DNA codificando um polipeptídeo de interesse pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido que se acredita possuir o mRNA do polipeptídeo e expressar o mesmo em um nível detectável. Consequentemente, DNA humano codificador do polipeptídeo pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA de tecido humano. O gene codificador do polipeptídeo também pode ser obtido de uma biblioteca genômica ou procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese automática de ácido nucleico). As bibliotecas podem ser triadas com sondas (tal como anticorpos para o polipeptídeo, ou oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) designadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada pelo mesmo. A triagem do cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzida usando procedimentos padrão, como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene codificador do polipeptídeo é usar a metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

[0168] Os exemplos abaixo descrevem técnicas para triar uma biblioteca de cDNA. As sequência de oligonucleotídeo selecionadas como sondas deveriam ser de comprimento suficiente e suficientemente inambíguas que os falsos positivos são minimizados. O oligonucleotídeo é de preferência marcado de modo que possa ser detectado quando da hibridização para DNA na biblioteca sendo triada. Métodos de marcação são bem conhecidos na técnica, e incluem o uso de radiorrótulos como ATP marcado com 32P, marcação com biotinilação ou com enzima. As condições de hibridização, incluindo estringência moderada e estringência elevada, são fornecidas em Sambrook et al., supra.

[0169] As sequências identificadas em tais métodos de triagem de biblioteca podem ser comparadas e alinhadas a outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas tal como GenBank ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade de sequências (tanto no nível de aminoácido como de nucleotídeo) dentro das regiões definidas da molécula ou através da sequência de comprimento completo pode ser determinada usando os métodos conhecidos na técnica e conforme descrito no presente.

[0170] Ácido nucleico tendo sequência codificando proteína pode ser obtido triando as bibliotecas de cDNA ou genômicas usando a sequência de aminoácidos deduzida divulgada no presente pela primeira vez, e, se necessário, usando procedimentos de extensão de iniciador convencionais como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de mRNA que podem não ter sido transcritos reversamente no cDNA.

2. SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[0171] Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com a vetores de expressão ou de clonagem descritos no presente para a produção de polipeptídeos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou ampliar os genes codificando as sequências desejadas. As condições de cultura, tal como meios, temperatura, pH e outros, podem ser selecionadas pelo técnico no assunto sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.

[0172] Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidos dos técnicos no assunto, por exemplo, CaCl2, CaPO4, mediadas por lipossomas e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando técnicas-padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou eletroporação é geralmente usado para procariotos. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de certas células de planta, como descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem tais paredes de células, o método de precipitação com cloreto de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) pode ser empregado. Os aspectos gerais destas transfecções no sistema hospedeiro de células de mamífero são descritos na patente US 4.399.216. As transformações em leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). No entanto, outros métodos para introduzir DNA em células, tal como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, também podem ser usados. Para várias técnicas para transformar células de mamífero, ver Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

[0173] Células hospedeiras apropriadas para clonar e expressar o DNA nos presentes vetores incluem células de procariotos, de levedura ou células com alto teor de eucariotos. Procariotos apropriados incluem, mas não estão limitados a eubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram- positivos, por exemplo, Enterobacteriáceas tal como E. coli. Várias cepas de E. coliestão publicamente disponíveis, tal como cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem Enterobacteriáceas tal como Escherichia, por exemplo, E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia mascescans, e Shigella, bem como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgada em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. A cepa W3110 é um hospedeiro particularmente preferido porque ela é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante. De preferência, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo a cepa W3110 de E. coli 1A2, que tem o genótipo tonA completo; cepa 3110 de E. coli 9E4, que tem o genótipo tonA ptr3 completo; cepa 3110 de E. coli 27C7 (ATCC 55.244), que tem o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr completo; cepa 3110 de E. coli 37D6, que tem o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr completo; cepa 3110 de E. coli 40B4, que é uma cepa37D6 com uma deleção de degPnão resistente a canamicina; e uma cepa de E. coli tendo protease periplásmica de mutantes divulgada na Patente US 4.946.783 expedida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, métodos de clonagem in vitro, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico, são apropriadas.

[0174] Além dos procariotos, os micróbios eucarióticos tal como fungos ou leveduras filamentosas são hospedeiros de clonagem e expressão apropriados para vetores codificador do polipeptídeo. Saccharomyces cerevisiaeé um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicado em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente US 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos tal como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tal como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). As leveduras metilotrópicas são apropriadas no presente e incluem, mas não estão limitadas a, levedura capaz de crescer em metanol selecionado dos gêneros consistindo de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

[0175] Células hospedeiras apropriadas para a expressão de polipeptídeo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de inseto tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células de planta. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS. Exemplos mais específicos incluem llinhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51). A seleção da célula hospedeira apropriada é considerada estar dentro do conhecimento do técnico no assunto.

3. SELEÇÃO E USO DE UM VETOR REPLICÁVEL

[0176] O ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) codificador do polipeptídeo pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (ampliação de DNA) ou para expressão. Vários vetores estão disponíveis publicamente. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um sítio (s) de endonuclease de restrição apropriado usando técnicas conhecidas na técnica. Os componentes de vetor incluem geralmente, mas não estão limitados a, uma ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento aprimorador, um promotor, e uma sequência de término de transcrição. A construção de vetores apropriados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas dos técnicos no assunto.

[0177] O polipeptídeo pode ser produzido recombinantemente não somente diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no N-término da proteína ou polipeptídeo maduro. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA codificador do polipeptídeo que é inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, 1pp, ou enterotoxinas II líderes estáveis em aquecimento. Para a secreção de levedura, a sequência de sinal pode, por exemplo, ser a levedura invertase líder, fator alfa líder (incluindo a-fatores líderes Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Patente US 5.010.182), ou ácido fosfatase líder, a C. albicans glicoamilase líder (EP 362.179 publicado em 4 de abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Na expressão de células de mamífero, sequências de sinal de mamífero podem ser usadas secreção da proteína direta, tal como sequências de sinal de polipeptídeos secretados de mesma espécie ou de espécie relacionada, bem como líderes secretórios virais.

[0178] Ambos os vetores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que capacita o vetor a replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é apropriada para leveduras, e as várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero.

[0179] Os vetores de expressão e de clonagem conterão tipicamente um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam as deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli.

[0180] Exemplos de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamífero são os que possibilitam a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico codificador do polipeptídeo, tal como DHFR ou timidina cinase. Uma célula hospedeira apropriada, quando DHFR do tipo selvagem é empregado, é a linhagem de células CHO deficientes em atividade de DHFR, preparadas e propagadas como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Um gene de seleção apropriado para uso na levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo YRp7 de levedura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura em que falta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC no 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

[0181] Os vetores de expressão e de clonagem contêm usualmente um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico codificador do polipeptídeo para síntese de mRNA direta. Os promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas de promotor de β-lactamase e lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], e promotores híbridos como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine- Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao DNA codificando polipeptídeos.

[0182] Exemplos de sequências de promotores apropriadas para uso com hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato cinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofructocinase, glicose- 6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicocinase.

[0183] Outros promotores de leveduras, que são promotores induzíveis tendo a vantagem de transcrição adicional controlada por condições de crescimento, são as regiões de promotor para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, enzimas degradantes associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores apropriados para uso na expressão de levedura são ainda descritos em EP 73.657.

[0184] A transcrição de polipeptídeo de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus tal como vírus polioma, vírus fowlpox (UK 2.211.504, publicado em 5 de julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de ave, citometalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B e vírus de símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, com a condição de que tais promotores são compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[0185] A transcrição de um DNA codificando um polipeptídeo por eucariotos superiores pode ser aumentada inserindo uma sequência aprimoradora no vetor. Os aprimoradores são elementos de ação cis de DNA, usualmente cerca de 10 a 300 bp, que agem em um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas sequências aprimoradoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, será usado um aprimorador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o aprimorador de SV40 no último lado da origem de replicação (100-270 bp), o aprimorador do promotor precoce de citomegalovírus, o aprimorador de polioma no último lado da origem de replicação, e aprimoradores de adenovírus. O aprimorador pode ser emendado no vetor em uma posição 5’ ou 3’ na sequência de codificação de polipeptídeo, mas está de preferência localizado em um sítio 5’ a partir do promotor.

[0186] Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungo, inseto, planta, animal, humano ou nucleadas a partir de organismos multicelulares) também conterão as sequências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o mRNA. Tais sequências estão comumente disponíveis a partir de 5’ e, ocasionalmente 3’, regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificador do polipeptídeo.

[0187] Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriadas para adaptação à síntese de um polipeptídeo de interesse em cultura de células de vertebrado recombinantes são descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; e EP 117.058.

4. DETECÇÃO DE AMPLIAÇÃO/EXPRESSÃO DE GENES

[0188] A ampliação e/ou expressão de genes pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda marcada apropriadamente, baseado nas sequências fornecidas no presente. Alternativamente, os anticorpos podem ser empregados, que pode reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de DNA, duplexes de RNA, e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de proteína de DNA. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de modo que na formação do duplex sobre a superfície, a presença de anticorpo ligado ao duplex pode ser detectada.

[0189] A expressão de genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imuno-histológica de células ou seções do tecido e ensaio de cultura de células ou fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto dos genes. Anticorpos utilizáveis para coloração imuno-histológica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser tanto monoclonais como policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo de sequência nativa ou contra um peptídeo sintético baseado nas sequências de DNA fornecidas no presente ou contra sequência exógena fundida a DNA codificador do polipeptídeo e codificando um epítopo de anticorpo específico.

5. PURIFICAÇÃO DE POLIPEPTÍDEO

[0190] As formas de um polipeptídeo de interesse podem ser recuperadas de um meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se ligadas à membrana, elas podem ser liberadas a partir da membrana usando uma solução detergente apropriada (por exemplo, Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células empregadas na expressão do polipeptídeo podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tal como ciclo de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico ou agentes de lise celular.

[0191] Pode ser desejado purificar o polipeptídeo de proteínas de células recombinantes ou polipeptídeos. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação apropriados: por fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; filtração de gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de Sepharose de proteína A para remover contaminantes tal como IgG; e colunas de quelação de metal para ligar as formas de polipeptídeo etiquetadas no epítopo. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionadas depender (ão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do polipeptídeo particular produzido.

E. DISTRIBUIÇÃO DE TECIDOS

[0192] O sítio dos tecidos expressando o polipeptídeo pode ser identificado determinando a expressão de mRNA em vários tecidos humanos. O sítio de tais genes fornece informação sobre quais tecidos são mais prováveis de serem afetados pelas atividades estimulantes e de inibição dos polipeptídeos. O sítio de um gene em um tecido específico também fornece tecido de amostra para os ensaios bloqueando/ativando a atividade discutida abaixo.

[0193] Como notado antes, a expressão de genes em vários tecidos pode ser medida por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente marcada, baseado nas sequências fornecidas no presente. Alternativamente, os anticorpos podem ser empregados, que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de DNA, duplexes de RNA, e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de proteína de DNA.

[0194] A expressão de genes em vários tecidos, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imuno- histoquímica de seções do tecido e ensaio de cultura de células ou fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto dos genes. Anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser tanto monoclonais como policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra uma sequência nativa de um polipeptídeo ou contra um peptídeo sintético baseado nas sequências de DNA codificador do polipeptídeo ou contra uma sequência exógena fundida a um DNA codificando um polipeptídeo e codificando um epítopo de anticorpo específico. As técnicas gerais para gerar anticorpos, e protocolos especiais para Northern blotting e hibridização in situsão fornecidas abaixo.

F. ESTUDOS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS

[0195] A atividade de um polipeptídeo da invenção pode ser verificada ainda por estudos de ligação de anticorpos. Em que a capacidade de anticorpos anti-polipeptídeo inibir o efeito do polipeptídeo sobre as células de tecidos é testada. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados, a preparação dos quais será descrita abaixo.

[0196] Os estudos de ligação de anticorpos podem ser realizados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitivos, ensaios de intercalação diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Ver, por exemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

[0197] Os ensaios de ligação competitivos dependem da capacidade de um padrão marcado competir com o analito da amostra de teste para se ligar com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade da proteína alvo na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade do padrão que ficam ligados aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligado, os anticorpos de preferência são insolubilizados antes ou após a competição, de modo que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

[0198] Os ensaios intercalados envolvem o uso de dois anticorpo, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epítopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio intercalado, o analito da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado com um suporte sólido, e, portanto, um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo de três partes insolúvel. Ver, por exemplo, Patente US 4.376.110. O segundo anticorpo pode por si mesmo ser marcado com uma porção detectável (ensaios intercalados diretos) ou pode ser medida usando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ensaio intercalado indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio intercalado é um ensaio ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima.

[0199] Para imuno-histoquímica, a amostra de tecido pode ser nova ou congelada ou pode ser embutida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo,.

G. ENSAIOS BASEADOS EM CÉLULA

[0200] Os ensaios baseados em célula e modelos de animais para doenças relacionadas à imunidade podem ser usados para ainda entender a relação entre os genes e os polipeptídeos identificados no presente e o desenvolvimento e patogênese da doença relacionada à imunidade.

[0201] Em uma abordagem diferente, as células de um tipo de células conhecido a serem envolvidas em uma doença relacionada à imunidade particular são transfectadas com os cDNAs descritos no presente, e a capacidade destes cDNAs estimularem ou inibirem infecção imune é analisada. As células apropriadas podem ser transfectadas com o gene desejado, e monitoradas para a atividade da função imune. Tais linhagens de células transfectadas podem então ser usadas para testar a capacidade de anticorpos poli- ou monoclonais ou composições de anticorpos de inibir ou estimular a função imune, por exemplo, modular a proliferação de células T ou infiltração de células inflamatórias. As células transfectadas com as sequências de codificação dos genes identificados no presente podem ainda ser usadas para identificar candidatos a drogas para o tratamento de doenças relacionadas imunes.

[0202] Além disso, as culturas primárias derivadas de animais transgênicos (como descrito abaixo) podem ser usadas nos ensaios baseados em célula, embora linhagens de células estáveis sejam mais comumente usadas na técnica. Técnicas para derivar as linhagens de células contínuas de animais transgênicos são bem conhecidas na técnica Small et al., Mol. Cell. Biol. 5: 642-648 [1985]).

[0203] Um ensaio baseado em célula apropriado é a reação de linfócitos misturada (MLR). Current Protocols in Immunology, unidade 3.12; editado por J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc. Neste ensaio, a capacidade de um composto de teste estimular ou inibir a proliferação de células T ativadas é ensaiada. Uma suspensão de células T responsivas é cultivada com células estimuladoras alogenéticas e a proliferação de células T é medida pela captação de timidina tritiada. Este ensaio é uma medida geral da reatividade de células T. Uma vez que a maioria das células T responde a e produz IL-2 quando em ativação, diferenças na capacidade de resposta neste ensaio refletem em parte as diferenças na produção de IL-2 pelas células respondentes. Os resultados de MLR podem ser verificados por um ensaio de detecção de linfocina padrão Current Protocols in Immunology, supra, 3,15, 6,3.

[0204] Uma resposta de células T proliferativa em um ensaio MLR pode ser devido às propriedades mitogênicas diretas de uma molécula ensaiada ou à ativação induzida com antígeno externo. Verificação adicional da atividade estimuladora de células T do polipeptídeo pode ser obtida por um ensaio de co-estímulo. A ativação de células T requer um sinal específico de antígeno mediado através de um receptor de células T (TCR) e um sinal co- estimulador mediado através de uma segunda interação de ligação de ligando, por exemplo, a interação de ligação B7 (CD80, CD86) CD28. Reticulação de CD28 aumenta a secreção de linfocina por células T ativadas. A ativação de células T tem tanto o controle negativo como positivo através da ligação de ligantes que tem um efeito negativo ou positivo. CD28 e CTLA-4 são glicoproteínas relacionadas na superfamília Ig que se ligam a B7. A ligação de CD28 a B7 tem um efeito de co-estímulo positivo da ativação de células T; inversamente, a ligação de CTLA-4 a B7 tem um efeito de desativação de células T. Chambers, C. A. e Allison, J. P., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P. S. e Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C. H. et al, Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405. Em um ensaio de co-estímulo, os polipeptídeos são ensaiados para a atividade co-estimuladora ou inibidora de células T.

[0205] O uso direto de um composto estimulante, como na invenção, é validado em experiências com a glicoproteína 4-1BB, um membro da família do receptor do fator de necrose de tumor, que se liga a um ligando (4-1BBL) expresso em células T iniciadas e sinaliza a ativação e crescimento de células T. Alderson, M.E. ET al., J. Immunol. (1994) 24: 2219.

[0206] O uso de um agonista estimulando o composto também é validado experimentalmente. Como um exemplo, a ativação de 4-1BB por tratamento com um anticorpo anti-41BB agonista aprimora a erradicação de tumores. Hellstrom, I. e Hellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1. Terapia com imunoadjuvante para tratamento de tumores, descrita em mais detalhe abaixo, é outro exemplo do uso dos compostos estimulantes da invenção.

[0207] Alternativamente, uma simulação imune ou efeito de aprimoramento também podem ser obtidos pela administração de um polipeptídeo que tem propriedades de aprimoramento da permeabilidade vascular. A permeabilidade vascular aprimorada poderia ser benéfica em distúrbios que podem ser atenuados por infiltração sítio de células imunes (por exemplo, monócitos, eosinófilos, PMNs) e inflamação.

[0208] Por outro lado, polipeptídeos de TIGIT, bem como outros compostos da invenção, que são inibidores diretos de proliferação/ativação de células T, secreção de citocinas pró-inflamatórias, e/ou permeabilidade vascular podem ser usados diretamente para suprimir a resposta imune. Estes compostos são úteis para reduzir o grau da resposta imune e para tratar doenças relacionadas à imunidade caracterizadas por uma resposta hiperativa, superótima ou autoimune. Este uso dos compostos da invenção é validado pelas experiências descritas acima em que a ligação de CTLA-4 ao receptor de B7 desativa células T. Os compostos inibidores diretos da invenção funcional de um modo análogo. Poderia se esperar que o uso de um composto que suprime a permeabilidade vascular reduzisse inflamação. Tais usos poderiam ser benéficos no tratamento de condições associadas com inflamação excessiva.

[0209] Similarmente, compostos, por exemplo, anticorpos, que se ligam a polipeptídeos inibidores de TIGIT e bloqueiam o efeito destes polipeptídeos inibidores de TIGIT produzem um efeito inibidor líquido e podem ser também usados para suprimir a resposta imune mediada por células T deixando TIGIT livre para inibir a proliferação/ativação de células T e/ou a secreção de linfócitos. O bloqueio do efeito inibidor dos polipeptídeos suprime a resposta imune do mamífero.

[0210] Alternativamente, para as condições associadas com resposta e/ou inflamação imune mediada por células T insuficiente, a inibição ou diminuição da expressão e/ou atividade de TIGIT ou interferência com a capacidade de TIGIT ligar-se a e/ou sinalizar através de PVR podem ser benéficas para o tratamento. Tal inibição ou diminuição podem ser fornecidas pela administração de um antagonista da expressão e/ou atividade de TIGIT e/ou um antagonista da expressão e/ou atividade de PVR.

H. MODELOS DE ANIMAIS

[0211] Os resultados dos ensaios in vitro baseados em célula podem ser ainda verificados usando modelos de animais e ensaios in vivo para a função de células T. Uma variedade de modelos de animais bem conhecidos pode ser usada para ainda entender o papel dos genes identificados no presente no desenvolvimento e patogênese de doença relacionada à imunidade, e para testar a eficácia de agentes terapêuticos candidatos, incluindo anticorpos, e outros organismos dos polipeptídeos nativos, incluindo antagonistas de moléculas pequenas. A natureza in vivo de tais modelos torna os mesmos previsíveis de respostas em pacientes humanos. Os modelos de animais de doenças relacionadas à imunidade incluem tanto animais não recombinantes como recombinantes (transgênicos). Os modelos de animais não recombinantes incluem, por exemplo, roedor, por exemplo, modelos de murino. Tais modelos podem ser gerados introduzindo as células em camundongos singeneicos usando técnicas padrão, por exemplo, injeção subcutânea, injeção na veia da cauda, implante de baço, implante intraperitoneal, implante sob a cápsula renal, etc.

[0212] A doença de enxerto versus hospedeiro ocorre quando células imunocompetentes são transplantadas em pacientes imunossuprimidos ou tolerantes. As células do doador reconhecem e respondem os antígenos hospedeiros. A resposta pode variar de inflamação grave ameaçando a vida a casos brandos de diarréia e perda de peso. Os modelos de doenças de enxerto versus hospedeiro fornecem um meio de avaliar a reatividade de células T contra antígenos de MHC e antígenos de transplante menores. Um procedimento apropriado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, acima, unidade 4.3.

[0213] Um modelo de animal para rejeição a aloenxerto na pele é um meio de testar a capacidade de células T mediarem a destruição do tecido in vivo e uma medida de seu papel na rejeição a transplante. Os modelos mais comuns e aceitos são enxertos na pele da cauda de murino. Experiências repetidas mostram que a rejeição a aloenxerto na pele é mediada por células T, células T auxiliares e células T exterminadoras-efetoras, e não anticorpos. Auchincloss, H. Jr. e Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2a ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992. Um procedimento apropriado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, supra, unidade 4.4. Outros modelos de rejeição a transplante que podem ser usados para testar os compostos da invenção são modelos de transplantes de coração alogeneico descritos por Tanabe, M. et al, Transplantation (1994) 58:23 e Tinubu, S. A. et al, J. Immunol. (1994) 4330-4338.

[0214] Os modelos de animais para hipersensibilidade do tipo retardado fornece um ensaio de função imune mediada por células também. As reações de hipersensibilidade do tipo retardado são uma resposta imune in vivo mediada por células T caracterizada por inflamação que não alcança um pico até depois um período de tempo ter decorrido após ensaio com um antígeno. Estas reação também ocorrem em doenças autoimunes específicas de tecidos tal como esclerose múltipla (MS) e encefalomielite autoimune experimental (EAE, um modelo para MS). Um procedimento apropriado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, acima, unidade 4.5.

[0215] EAE é uma doença autoimune mediada por células T caracterizada por inflamação de células T e células mononucleares e, subsequente, desmielinação de axons no sistema nervoso central. EAE geralmente é considerada ser um modelo de animal relevante para MS em humanos. Bolton, C., Multiple Sclerosis (1995) 1:143.

[0216] Ambos os modelos agudos e em recaída-remissão são desenvolvidos. Os compostos da invenção podem ser testados para a atividade estimuladora ou inibidora de células T contra doença desmielinante mediada por imunidade usando o protocolo descrito em Current Protocols in Immunology, acima, unidades 15.1 e 15.2. Ver também os modelos para doença de mielina em que células oligodendrócitas ou de Schwann são enxertadas no sistema nervoso central como descrito em Duncan, I.D. et al., Molec. Med. Today (1997) 554-561.

[0217] A hipersensibilidade de contato é um ensaio in vivo de hipersensibilidade simples do tipo retardado da função imune mediada por células. Neste procedimento, a exposição cutânea a haptenos exógenos que dá origem a uma reação de hipersensibilidade do tipo retardado que é medida e quantificada. A sensibilidade de contato envolve uma fase de sensibilização inicial seguida por uma fase de elicitação. A fase de elicitação ocorre quando os linfócitos T encontram um antígeno com o qual tiveram contato anterior. Intumescimento e inflamação ocorrem, tornando este um excelente modelo de dermatite de contato alérgica humana. Um procedimento apropriado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach e W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unidade 4.2. Ver também Grabbe, S. e Schwarz, T, Immun. Today 19 (1): 37-44 (1998).

[0218] Um modelo de animal para artrite é artrite induzida com colágeno. Este modelo compartilha características clínicas, histológicas e imunológicas de artrite reumatóide autoimune humana e é um modelo aceitável para artrite autoimune humana. Modelos de camundongo e rato são caracterizados por sinovite, erosão da cartilagem e do osso subcondral. Os compostos da invenção podem ser testados para atividade contra artrite autoimune usando os protocolos descritos em Current Protocols in Immunology, acima, unidades 15.5. Ver também o modelo usando um anticorpo monoclonal de integrinas CD18 e VLA-4 descrito em Issekutz. A.C. et al., Immunology (1996) 88:569.

[0219] O modelo de artrite induzido por colágeno (CIA) é considerado um modelo apropriado para estudar drogas ou potenciais ou biológicos ativos em artrite humana devido a muitas similaridades imunológicas e patológicas com artrite reumatóide humana (RA), o envolvimento de histocompatibilidade maior localizada, a ativação de linfócitos T auxiliares restritos de classe II completos, e a similaridade de lesões histológicas. Os aspectos deste modelo de CIA que são similares ao encontrado em pacientes com RA incluem: erosão da cartilagem e do osso nas bordas das juntas (como pode ser visto em radiografias), sinovite proliferativa, o envolvimento simétrico de juntas periféricas de tamanho pequeno e médio no esqueleto apendicular, mas não no axial. Jamieson et al., Invest. Radiol. 20: 324-9 (1985). Além disso, IL-1 e TN-α parecem estar envolvidos em CIA como em RA. Joosten et al., J. Immunol. 163:5049-5055 (1999). Os anticorpos neutralizantes de TNF e separadamente, TNFR:Fc reduziu os sintomas de RA neste modelo (Williams et al., PNAS, 89: 9784-9788 (1992); Wooley et al., J. Immunol. 151: 6602-6607 (1993)).

[0220] Neste modelo de RA, colágeno tipo II é purificado a partir de cartilagem articular de bovinos (Miller, Biochemistry 11:4903 (1972)) e usado em camundongos imunizados (Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2762 (1994)). Os sintomas de artrite incluem eritema e/ou intumescimento dos membros bem como erosões ou defeitos na cartilagem e no osso como determinado por histologia. Este modelo amplamente usado também é descrito, por exemplo, por Holmdahl et al., APMIS 97:575 (1989) and in Current Protocols in Immunology, supra, unidades 15.5, e em Issekutz et al., Immunology, 88:569 (1996), bem como nos exemplos descritos abaixo.

[0221] Um modelo de asma é descrito, em que a hiper-reatividade aérea induzida por antígeno, eosinofilia pulmonar e inflamação são induzidas sensibilizando um animal com ovalbumina e então desafiando o animal com a mesma proteína liberada por aerossol. Vários modelos de animais (porquinho- da-índia, rato, primata não humano) mostram sintomas similares à asma atópica em humanos em desafio com antígenos de aerossol. Modelos de murinos têm muitos dos aspectos de asma humana. Os procedimentos apropriados para testar os compostos da invenção para atividade e eficácia no tratamento de asma são descritos por Wolyniec, W.W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777 e as referências citadas nos mesmos.

[0222] Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser testados em modelos de animais para psoríase como doença. A evidência sugere uma patogênese de células T para psoríase. Os compostos da invenção podem ser testados no modelo de camundongo scid/scid por Schon, M.P. et al., Nat. Med. (1997) 3: 183, em que os camundongos demonstram lesões de pele histopatológicas semelhantes a psoríase. Outro modelo apropriado é a quimera de pele humana/camundongo scid preparada como descrito por Nickoloff, B.J. et al., Am. J. Path. (1995) 146:580.

[0223] Os modelos de animais recombinantes (transgênicos) podem ser modificados por engenharia genética introduzindo a porção de codificação dos genes identificados no presente no genoma de animais de interesse, usando técnicas padrão para produzir animais transgênicos. Os animais que podem servir como alvos para manipulação transgênica incluem, sem limitação, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, ovelhas, cabras, porcos e primatas não humanos, por exemplo, babuínos, chimpanzés e macacos. As técnicas conhecidas para introduzir um transgene em tais animais incluem microinjeção pronucleica (Hoppe e Wanger, Patente US 4.873.191); transferência de genes mediada por retrovírus para linhagens embrionárias (e.g., Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]); gene alvo em células tronco embrionárias (Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]); eletroporação de embriões (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]); transferência de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]). Para estudo, ver, por exemplo, Patente US 4.736.866.

[0224] Para os fins da presente invenção, os animais transgênicos incluem os que transportam o transgene somente em parte de suas células (“animais de mosaico”). O transgene pode ser integrado tanto como um transgene único, como em concatâmeros, por exemplo, em tandem da cabeça- para-cabeça ou cabeça-para-cauda. A introdução seletiva de um transgene em um tipo de célula particular também é possível pelo seguinte, por exemplo, a técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).

[0225] A expressão do transgene em animais transgênicos pode ser monitorada por técnicas padrão. Por exemplo, análise Southern blot ou ampliação PCR podem ser usadas para verificar a integração do transgene. O nível da expressão de mRNA pode então ser analisado usando técnicas como hibridização in situ, análise Northern blot, PCR, ou imunocitoquímica.

[0226] Os animais podem ser ainda examinados para sinais de patologia de doença imune, por exemplo, por exame histológico para determinar a infiltração de células imunes em tecidos específicos. Experiências de bloqueio também podem ser realizadas em que os animais transgênicos são tratados com os compostos da invenção para determinar a extensão do estímulo ou inibição de proliferação de células T dos compostos. Nestas experiências, os anticorpos de bloqueio que se ligam a um polipeptídeo da invenção, preparados como descrito acima, são administrados ao animal e o efeito da função imune é determinado.

[0227] Alternativamente, os animais eliminados podem ser construídos, os quais têm um gene defeituoso ou alterado codificando um polipeptídeo identificado no presente, como um resultado da recombinação homóloga entre o gene endógeno codificador do polipeptídeo e o DNA genômico alterado codificando o mesmo polipeptídeo introduzido em uma célula embrionária do animal. Por exemplo, cDNA codificando um polipeptídeo particular pode ser usado para clonar o DNA genômico codificando esse polipeptídeo de acordo com as técnicas estabelecidos. Uma porção do DNA genômico codificando um polipeptídeo particular pode ser deletada ou substituída com outro gene, tal como um gene codificando um marcador selecionável que pode ser usado para monitorar a integração. Tipicamente, vários kilobases de DNA de flanco não alterado (tanto nas extremidades 5’ como 3’) são incluídos no vetor [ver, por exemplo, Thomas e Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para uma descrição de vetores de recombinação homólogos]. O vetor é introduzido em uma linhagem célula tronco embrionária (por exemplo, por eletroporação) e as células nas quais o DNA introduzido recombina homologamente são selecionadas [ver, por exemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. As células selecionadas são então injetadas em um blastócito de um animal (por exemplo, um camundongo ou um rato) para formar quimeras de agregação [ver, por exemplo, Bradley, em Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode então ser implantado em um animal de criação fêmea e o embrião levado a termo para criar um animal eliminados. A progênie abrigando o DNA homologamente recombinado em suas células tronco pode ser identificada por técnicas padrão e usada para reproduzir os animais em que todas as células do animal contêm o DNA homologamente recombinado. Os animais eliminados podem ser caracterizados, por exemplo, por sua capacidade de se defender contra certas condições patológicas e para seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipeptídeo.

I. TERAPIA COM IMUNOADJUVANTE

[0228] Em uma modalidade, os compostos imunoestimulantes da invenção podem ser usados em terapia com imunoadjuvante para o tratamento de tumores (câncer). É agora bem estabelecido que células T reconhecem antígenos específicos de tumor humano. Um grupo de antígenos de tumor, codificado pelas famílias MAGE, BAGE e GAGE de genes, é silencioso em todos os tecidos normais adultos, mas é expresso em quantidades significativas em tumores, tais como melanomas, tumores de pulmão, tumores de cabeça e pescoço e carcinomas da bexiga. DeSmet, C. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7149. Foi mostrado que o co-estímulo de células T induz a regressão de tumores e uma resposta antitumor tanto in vitro como in vivo. Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 8099; Lynch, D. H. et al, Nature Medicine (1997) 3:625; Finn, O. J. e Lotze, M. T., J. Immunol. (1998) 21:114. Os dados fornecidos no presente demonstram que a expressão de TIGIT correlaciona-se com células imunes infiltradas em tumores de câncer de mama. TIGIT também é demonstrado no presente para inibir a proliferação de DC e outras células imunes e para inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias de tais células. Assim, a super expressão de TIGIT em células infiltradas imunes em tumores pode ser aberrante, uma vez que a atividade de células T diminuída em tumores pode ser indesejável. Antagonistas de TIGIT e/ou antagonistas da interação da sinalização de TIGIT-PVR (isto é, antagonistas de PVR) podem ser administrados como adjuvantes sozinhos ou junto com um agente de regulação de crescimento, agente citotóxico ou agente quimioterapêutico, para estimular a proliferação/ativação de células T e uma resposta antitumor em antígenos de tumor. O agente de regulação de crescimento, citotóxico ou quimioterapêutico pode ser administrado em quantidades convencionais usando regimes de administração conhecidos. A atividade imunoestimulante por compostos antagonísticos de TIGIT e antagonísticos da atividade de TIGIT da invenção permite quantidades reduzidas dos agentes de regulação de crescimento, citotóxicos ou quimioterapêuticos deste modo diminuindo potencialmente a toxicidade ao paciente.

J. ENSAIOS DE TRIAGEM PARA CANDIDATOS A DROGA

[0229] Ensaios de triagem para candidatos a droga são projetados para identificar os compostos que se ligam a ou complexam com os polipeptídeos codificados pelos genes identificados no presente ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos, ou de outro modo interferem com a interação dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares. Tais ensaios de triagem incluem ensaios receptivos a triagem de alta produtividade de bibliotecas de produtos químicos, tornando os mesmos particularmente apropriados para identificar candidatos a droga de moléculas pequenas. As moléculas pequenas contempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos, peptídeos incluindo, de preferência, peptídeos solúveis, fusões de (poli) peptídeo-imunoglobulina e, em particular, anticorpo incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpo de cadeia única, anticorpo anti-idiopáticos, e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos; Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formas, incluindo ensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímicos, imunoensaios e ensaios baseados em células, que são bem caracterizados na técnica. Todos os ensaios são comuns em que eles chamam para contato o candidato a droga com um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico identificado no presente sob as condições e durante um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.

[0230] Nos ensaios de ligação, a interação é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo codificado pelo gene identificado no presente ou o candidato a droga é imobilizado em uma fase sólida, por exemplo, em uma placa de microtítulo, por fixações covalentes ou não covalentes. A fixação não covalente geralmente é realizada revestindo a superfície sólida com uma solução de polipeptídeo e secando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo a ser imobilizado pode ser usado para ancorar o mesmo em uma superfície sólida. O ensaio é realizado adicionando o componente não imobilizado, que pode ser marcado por um rótulo detectável, ao componente imobilizado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, os componentes não reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente não imobilizado originalmente transporta um rótulo detectável, a detecção do rótulo imobilizado na superfície indica que o complexo ocorreu. Onde o componente não imobilizado originalmente não transporta o rótulo, o complexo pode ser detectado, por exemplo, usando um anticorpo marcado ligando especificamente o complexo imobilizado.

[0231] Se o composto candidato interage com, mas não se liga a uma proteína particular codificada por um gene identificado no presente, sua interação com essa proteína pode ser ensaiada por métodos bem conhecidos para detectar interações de proteína-proteína. Tais ensaios incluem as abordagens tradicionais, tal como, reticulação, co-imunoprecipitação e co- purificação através de gradientes ou de colunas cromatográficas. Além disso, as interações de proteína-proteína podem ser monitoradas usando um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores [Fields e Song, Nature (Londres) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)] como descrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Muitos ativadores transcricionais, como GAL4 de levedura, consistem de dois domínios modulares fisicamente discretos, um agindo como o domínio de ligação de DNA, enquanto o outro funcionando como o domínio de ativação de transcrição. O sistema de expressão em levedura descritos nas publicações acima (geralmente referidos como o “sistema de dois híbridos”) toma vantagem desta propriedade e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteína é fundida ao domínio de GAL4 ligação de DNA e a outra, na qual as proteínas de ativação de candidatos são fundidas ao domínio de ativação. A expressão do gene repórter GAL1-lacZ sob o controle de um promotor ativado com GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 através da interação de proteína-proteína. Colônias contendo polipeptídeos de interação são detectadas com um substrato cromogênico para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER™) para identificar as interações de proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando a técnica de dois híbridos está comercialmente disponível de Clontech. Este sistema também pode ser estendido para mapear os domínios de proteína envolvidos nas interações de proteínas específicas bem como localizar resíduos de aminoácidos qUE são cruciais para estas interações.

[0232] A fim de encontrar compostos que interfere com a interação de um gene identificado no presente e outros componentes intra- ou extracelulares possam ser testados, uma mistura de reação é usualmente preparada contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob as condições e durante um tempo permitindo a interação e ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto de teste inibir a ligação, a reação é realizada na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, um placebo pode ser adicionado a uma terceira mistura de reação, para servir como controle positivo. A ligação (formação de complexo) entre os compostos de teste e o componente intra- e extracelular presentes na mistura é monitorada como descrito acima. A formação de um complexo na(s) reação(ões) de controle, mas não na mistura de reação contendo o composto de teste, indica que o composto de teste interfere com a interação do composto de teste e seu parceiro de reação.

K. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS RELACIONADAS À IMUNIDADE

[0233] As composições úteis para o tratamento de doenças relacionadas à imunidade incluem, sem limitação, proteínas, anticorpos, moléculas orgânicas pequenas, peptídeos, fosfopeptídeos, moléculas antisense e de ribozima, moléculas de tríplices hélices, etc., que inibem ou estimulam a função imune, por exemplo, proliferação/ativação de células T, liberação de linfocinas, ou infiltração de células imunes.

[0234] Por exemplo, RNA antisense e moléculas de RNA agem para bloquear diretamente a tradução de mRNA por hibridização em mRNA alvo e prevenindo a tradução de proteínas. Quando o DNA antisense é usado, os oligodeoxirribonucleotídeos derivados do sítio de início de tradução, pés entre as posições -10 e +10 da sequência de nucleotídeo do gene alvo, são preferidos.

[0235] As ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes de catalisar a clivagem específica de RNA. As ribozimas agem por hibridização específica de sequência no RNA alvo, seguida por clivagem endonucleolítica. Os sítios de clivagem de ribozima específicos dentro de um alvo de RNA potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para outros detalhes ver, por exemplo, Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), e publicação WO 97/33551 (publicado em 18 de setembro de 1997).

[0236] As moléculas de ácido nucleico na formação de tríplices hélices usadas para inibir a transcrição deveriam ser de filamento único e compostas de deoxinucleotídeos. A composição base destes oligonucleotídeos é projetada de modo que ela promove a formação de tríplices hélices através de regras de pares de bases de Hoohsteen, que requerem geralmente estiramentos bastante grandes de purinas ou pirimidinas em um filamento de um duplex. Para outros detalhes ver, por exemplo, publicação WO 97/33551, supra.

[0237] Estas moléculas podem ser identificadas por todas ou por qualquer combinação dos ensaios de triagem discutidos acima por quaisquer outras técnicas de triagem bem conhecidas dos técnicos no assunto.

L. ANTICORPOS ANTI-TIGIT

[0238] A presente invenção fornece ainda anticorpos anti-TIGIT. Os anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados. Será entendido pelo técnico no assunto que a invenção também fornece anticorpos contra outros polipeptídeo (isto é, anticorpos anti-PVR) e que qualquer uma das presentes descrições extraídas especificamente para o método de criação produção, variedades, uso ou outros aspectos de anticorpos anti-TIGIT também será aplicável a anticorpos específicos para outros polipeptídeos não anti-TIGIT.

1. ANTICORPOS POLICLONAIS

[0239] Os anticorpos anti-TIGIT podem compreender anticorpos policlonais. Métodos de preparar anticorpos policlonais são conhecidos dos técnicos no assunto. Os anticorpos policlonais podem ser aumentados em um mamífero, por exemplo, por uma ou mais injeções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante será injetado no mamífero por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir um polipeptídeo de TIGIT ou uma proteína de fusão do mesmo. Ele pode ser útil para conjugar o agente imunizante a uma proteína sabida ser imunogênica no mamífero sendo imunizado. Exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem, mas não estão limitados a hemocianina de lapa, albumina de soro, tiroglobulina de bovino, e inibidor de tripsina de soja. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante MPL-TDM (Lipídio A de monofosforila, dicorinomicolato trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por um técnico no assunto sem experimentação indevida.

2. ANTICORPOS MONOCLONAIS

[0240] Os anticorpos anti-TIGIT podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridoma, tal como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para elicitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[0241] O agente imunizante incluirá tipicamente o polipeptídeo de TIGIT ou uma proteína de fusão do mesmo. Geralmente, quaisquer linfócitos do sangue periférico (“PBLs”) são usados se células de origem humana são desejadas, ou células do baço ou células de nodos linfáticos são usadas se fontes de mamíferos não humanos são desejadas. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células imortalizadas usando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academid Press, (1986) pp. 59-103]. As linhagens de células imortalizadas são usualmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origem em roedores, em bovinos e humanas. Usualmente, são empregadas linhagens de células de mieloma de camundongo. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contenha de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se nas células parentais falta a enzima hipoxantina guanina fosforilbosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (“meio HAT”), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

[0242] Linhagens de células imortalizadas preferidas são as que fundem eficientemente, suportam expressão de nível elevado estável de anticorpo pelas células que produzem anticorpos selecionados, e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens de células imortalizadas mais preferidas são linhagens de mieloma de murino, que podem ser obtidas, por exemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. As linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

[0243] O meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas pode então ser ensaiado para a presença de anticorpos monoclonais contra o polipeptídeo. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por análise de Scatchard Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0244] Após as células de hibridoma desejadas serem identificadas, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão [Goding, supra]. Meios de cultura apropriados para este fim incluem, por exemplo, Meio de Eagle modificado com Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como ascite em um mamífero.

[0245] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou fluido de ascite por procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais tal como, por exemplo, proteína de A-Sepharose, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografia de afinidade.

[0246] Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinantes, tais como os descritos na Patente US 4.816.567. O DNA codificador dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser prontamente isolados e sequenciados usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado dentro de vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que ao contrário não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo as sequências de codificação por domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das sequências de murino homólogas [Patente US 4.816.567; Morrison et al, supra] ou unindo covalentemente a sequência de codificação de imunoglobulina em toda ou em parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina. Tal polipeptídeo não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.

[0247] Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos para preparar anticorpos monovalentes serão conhecidos na técnica. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc de modo a prevenir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácidos ou são deletados de modo a evitar a reticulação.

[0248] Métodos in vitrotambém são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir os fragmentos dos mesmos, particularmente, fragmentos Fab, pode ser realizada usando técnicas de rotina conhecidas.

3. ANTICORPOS HUMANOS E HUMANIZADOS

[0249] Os anticorpos anti-TIGIT da invenção podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo de recipientes) em que os resíduos de uma região determinante complementar (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDR ou uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de quadro Fv de imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo do recipiente nem no CDR importado ou sequência de quadro. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá otimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente as de uma imunoglobulina [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

[0250] Os métodos para humanizar os anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, o anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de “importação”, que são tipicamente tomados de um domínio variável de “importação”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo os CRDs ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), sendo que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto é substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0251] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas, incluindo bibliotecas de exibição de fago Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. and Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, os anticorpos humanos podem ser produzidos introduzindo loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou parcialmente inativados. Em desafio, a produção de anticorpo humano é observada, que se assemelha intimamente à observada em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas patentes US no 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

[0252] Os anticorpos também podem ser maturados por afinidade usando métodos de seleção e/ou de mutagênese conhecidos como os descritos acima. Os anticorpos maturados por afinidade preferidos têm uma afinidade que é cinco vezes, mais preferivelmente 10 vezes, ainda mais preferivelmente 20 ou 30 vezes maior do que o anticorpo de partida (geralmente de murino, humanizado ou humano) do qual o anticorpo maturado é preparado.

4. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[0253] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência anticorpos humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para TIGIT, a outra é para qualquer outro antígeno, e de preferência para uma proteína de superfície de célula ou receptor ou subunidade de receptor.

[0254] Os métodos para preparar os anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido à variedade de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta é usualmente realizada por etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, publicado em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0255] Os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo- antígeno) podem ser fundidos a sequência do domínio constante de imunoglobulina. A fusão de preferência é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e co- transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Para mais detalhes de geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[0256] De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada por engenharia genética para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas a partir da interface da primeira molécula de anticorpo é substituída com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar às cadeia(s) lateral(ais) grandes são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo substituindo as cadeia laterais de aminoácidos grandes com as pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre produtos finais indesejados tal como homodímeros.

[0257] Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’)2. As técnicas para gerar os anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpos são descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento sendo que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar os fragmentos F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente sódio e arsenita complexante de ditiol, para estabilizar os ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados são então conservados em derivados de tionitribenzoato (TNB). Um dos derivados de TNB Fab’ é então reconvertido em Fab’-tiol com redução mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado de TNB Fab’ para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0258] Os fragmentos Fab’ podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab’)2 biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ foi separadamente secretado de E. coli e submetido a acoplamento químico in vitro direto para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células superexpressando o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.

[0259] Várias técnicas para produzir e isolar os fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura de célula recombinante também são descritas. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos são produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíperes de leucina a partir de proteínas Fos e Jun foram ligados às porções de Fab’ de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros dos anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e então re-oxidados para formar os heterodímeros dos anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir os fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, deste modo formando dois sítios de ligação de antígeno. Outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros de Fv de cadeia única (sFv) também é relatada. Ver, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

[0260] Os anticorpos com mais do que duas valências são contemplados. Como um exemplo não limitante, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Ver, por exemplo, Tutt et al., J. Immunol. 147-60 (1991).

[0261] Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes em um dado polipeptídeo de TIGIT. Alternativamente, um braço do polipeptídeo de TIGIT pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula de disparo em um leucócito tal como uma molécula do receptor de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28, ou B7), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a focalizar os mecanismos de defesa celular na célula expressando o polipeptídeo de TIGIT particular. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam um polipeptídeo de TIGIT particular. Estes anticorpos possuem um braço de ligação de TIGIT e um braço que liga um agente citotóxico ou um quelante de radionuclídeo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecífico de interesse liga o polipeptídeo de TIGIT e ainda liga o fator de tecido (TF).

5. ANTICORPOS HETEROCONJUGADOS

[0262] Os anticorpos heteroconjugados também estão dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos são, por exemplo, propostos para orientar as células do sistema imune em células indesejadas [Patente US no 4.676.980], e para o tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 02/200373; EP 03080]. É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo os envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou formando uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os descritos, por exemplo, na patente US 4.676.980.

6. MODIFICAÇÃO POR ENGENHARIA GENÉTICA A FUNÇÃO EFETORA

[0263] Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, de modo a aprimorar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer. Por exemplo, o(s) resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, deste modo permitindo a formação ligada a dissulfeto na intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou extermínio de células mediado por complemento aumentado e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med., 176: 11911195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral melhorada também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser modificado por engenharia genética que tem regiões Fc duplas e pode deste modo ter capacidades de lise de complemento aprimorado e de ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

7. IMUNOCONJUGADOS

[0264] A invenção também pertence a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, em placa, ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[0265] A invenção também fornece imunoconjugados (referidos intercambiavelmente como “conjugados anticorpo-droga”, ou “ADCs”) compreendendo um anticorpo conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tal como um agente quimioterapêutico, uma droga, um agente inibidor de crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, em placa, ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[0266] Os imunoconjugados são usados para a liberação local de agentes citotóxicos, isto é, drogas que exterminam ou inibem o crescimento ou proliferação de células, no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) 3:207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; patente US no 4.975.278). Os imunoconjugados permitem a liberação objetivada de uma porção da droga em um tumor, e o acúmulo intracelular da mesma, onde a administração sistêmica de drogas não conjugadas pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade em células normais bem como em células de tumor que se procura eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Ambos os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são relatados como úteis nestas estratégias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem danomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) supra). As toxinas usadas nos conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tal como toxina de difteria, toxinas de planta tal como ricina, toxinas de moléculas pequenas tal como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), and caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos por mecanismos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA, ou inibição de topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativa quando conjugadas a anticorpo grandes ou ligantes de receptor de proteína.

[0267] ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) é um conjugado de anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal kappa IgG1 de murino dirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos B normais e malignos e o radioisótopo 111ln ou 90Y ligado por um quelante ligador de tiouréia (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora ZEVALIN® tem atividade contra linfoma não Hodgkin de célula B (NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maior parte dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de anticorpo-droga composto de um anticorpo huCD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por injeção Drugs da Future (2000) 25(7):686; Patentes US nos 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo-droga composto do anticorpo huC242 ligado através do ligador SPP de dissulfeto à porção da droga maitansinóide, DM1, está avançando em tentativas de Fase II para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, como câncer de cólon, pancreático, gástrico, e outros cânceres. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado de anticorpo-droga composto do anticorpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado à porção da droga maitansinóide, DM1, está em desenvolvimento para o tratamento de tumores de próstata. Os peptídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAC10 (específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnol 21(7): 778-784) e estão sob desenvolvimento terapêutico.

[0268] Em certas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados são descritos no presente (por exemplo, acima). As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usadas incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de dianthin, proteínas americanas de Phytolaca (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 131I, 131In, 90Y, e 186Re. Os conjugados de anticorpo e agente citotóxico são preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tal como propionato de N- succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoíla)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis- ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com Carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Ver WO 94//11026.

[0269] Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tal como caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, um tricoteceno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, também são contemplados no presente.

A. MAITANSINA E MAITANSINÓIDES

[0270] Em algumas modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo (comprimento completo ou fragmentos) conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóide. Os maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem inibindo a polimerização de tubulina. Maitansina foi primeiramente isolada de east African shrub Maytenus serrata (Patente US no 3.896.111). Subsequentemente, descobriu-se que certos micróbios também produzem maitansinóides, tal como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (Patente US no 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos do mesmo são divulgados, por exemplo, nas patentes US nos 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; and 4.371.533.

[0271] Porções da droga maitansinóide são porções de droga atrativa em conjugados de anticorpo droga porque elas são: (i) relativamente acessíveis para preparar por fermentação ou modificação química, derivatização de produtos de fermentação, (ii) receptivas para derivatização com grupos funcionais apropriados para a conjugação através de ligadores não dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis em plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células de tumor.

[0272] Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos de preparar os mesmos, e seu uso terapêutico são descritos, por exemplo, nas patentes nos 5.208.020, 5.416.064 e Patente européia EP 0 425 235 B1, cujas descrições são expressamente incorporadas ao presente por referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra câncer colorretal humano. Verificou- se que o conjugado é altamente citotóxico para células de câncer de cólon cultivadas, e mostrou atividade antitumor em um ensaio de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado através de um ligador de dissulfeto ao anticorpo de murino A7 ligando-se a um antígeno em linhagens de células de câncer de cólon, ou a outro anticorpo monoclonal de murino TA.1 que liga o oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado de TA.1-maitansinóide foi testado in vivo sobre a linhagem SK-BR-3 de células de câncer de mama humanas, que expressa 3 x 105 antígenos de superfície HER- 2 por célula. O conjugado de droga obteve um grau de citotoxicidade similar à droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentada aumentando o número de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7- maintasinóide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

[0273] Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparados ligando quimicamente um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem diminuir significativamente a atividade biológica tanto do anticorpo como na molécula de maitansinóide. Ver, por exemplo, a Patente US no 5.208.020 (cuja descrição é expressamente incorporada no presente por referência). Uma média de 3-4 moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia, aprimorando a citotoxicidade das células alvo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora pudesse ser esperado que mesmo uma molécula de toxina/anticorpo poderia melhorar a citotoxicidade sobre o uso de anticorpo nu. Os maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Os maitansinóides apropriados são descritos, por exemplo, na Patente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentes referidas acima. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres de maitansinol.

[0274] Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para produzir conjugados de anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, os descritos nas patentes US 5.208.020 ou Patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), e Pedido de Patente US 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004, cujas divulgações são expressamente incorporadas ao presente por referência. Os conjugados de anticorpo- maisantenóide compreendendo o componente SMCC de ligador podem ser preparados como divulgado no pedido de patente US no 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter e grupos lábeis de ácido, grupos fosfo lábeis, grupos peptidase lábeis ou grupos esterase lábeis, como divulgado nas patentes identificadas acima, os grupos dissulfeto e tioéter sendo preferidos. Grupos de ligação adicionais são descritos e exemplificados no presente.

[0275] Os conjugados de anticorpo e maitansinóide podem ser preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio (SPDP), ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazoniobenzoíla)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem propionato de N-succinimidila-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação de dissulfeto.

[0276] O ligador pode ser fixado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação de éster pode ser formada por reação com um grupo hidroxila usando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendo um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 tendo um grupo hidroxila. Em uma modalidade preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.

B. AURISTATINAS E DOLOSTATINAS

[0277] Em algumas modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a dolostatinas ou análogos e derivados peptídicos de dolostatina, as auristatinas (patentes US nos 5.635.483; 5.780.588). É mostrado que as dolostatinas e auristatinas interferem com dinâmicas de microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm atividade anticâncer (US 5663149) e antifungos (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A porção da droga dolostatina ou auristatina pode ser fixada ao anticorpo através do término N (amino) ou do término C (carboxila) da porção de droga peptídica (WO 02/088172).

[0278] As modalidades de auristatina exemplares incluem porções DE e DF da droga monometilauristatina ligada ao N-término, descritas em “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, US Ser. no 10/983.340, depositado em 5 de novembro de 2004, cuja descrição é expressamente incorporada integralmente por referência.

[0279] Tipicamente, as porções de droga baseada em peptídeo podem ser preparadas formando um peptídeo ligado entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais peptídeos ligados podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (ver E. Schroder e K. Lubke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química de peptídeo. As porções da droga auristatina/dolostatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Ver também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, US Ser. no 10/983,340, depositado em 5 de novembro de 2004 incorporados integralmente ao presente por referência (descrevendo, por exemplo, ligadores e métodos de preparar compostos de monometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados a ligadores).

C. CALIQUEAMICINA

[0280] Em outras modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de calqueamicina é capaz de produzir quebras de DNA de duplo filamento em concentrações subpicomolares. Para a preparação dos conjugados da família de caliqueamicina, ver patentes US nos 5.712.374. 5.714.586. 5.739.116. 5.767.285. 5.770.701. 5.770.710. 5.773.001. 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a y1I, α2I, α3I, N-acetil-YlI, PSAG e θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:33363342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes US mencionadas acima para American Cyanamid). Outra droga antitumor à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA têm sítios de ação intracelulares e não atravessam prontamente a membrana do plasma. Portanto, a captação celular destes agentes através do de internalização mediada por anticorpo aprimorou grandemente seus efeitos citotóxicos.

D. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS

[0281] Outros agentes antitumor que podem ser conjugados aos anticorpos incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracila, a família dos agentes do complexo LL-E33288 conhecidos coletivamente descritos nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (patente US 5.877.296).

[0282] Toxinas e fragmentos enzimaticamente ativos das mesmas que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de dianthin, proteínas americanas de Phytolaca (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

[0283] A presente invenção contempla ainda uma imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou um DNA endonuclease tal como deoxiribonuclease, DNase).

[0284] Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para detecção, pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um rótulo giratório para formação de imagem de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como formação de imagem de ressonância magnética, mri) tal como iodo-123 novamente, iodino-131, índio- 111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[0285] Os radiorrótulos ou outros podem ser incorporados no conjugado de modos conhecidos. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese de química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos apropriados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em lugar de hidrogênio. Rótulos como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser fixados através de um resíduo de cisteína no peptídeo. Ítrio-90 pode ser fixado através de um resíduo de lisina. O método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.

[0286] Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tal como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio (SPDP), ciclo- hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolato (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazoniobenzoíla)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com Carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Ver WO 94//11026. O ligador pode ser um “ligador clivável” facilitando a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligador de ácido lábil, ligador sensível a peptidase, ligador fotolábil, ligador de dimetila ou ligador contendo dissulfeto Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente no 5.208.020) pode ser usado.

[0287] Os compostos contemplam expressamente, mas não estão limitados a, ADC preparado com os reagentes reticuladores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo- SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfone)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

E. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO DROGA

[0288] Nos conjugados anticorpo droga (ADC), um anticorpo (Ab) é conjugado a uma mais porções de droga (D), por exemplo, cerca de a cerca de 20 porções de droga por anticorpo, através de um ligador (L). O ADC da fórmula I pode ser preparado por diversas vias, empregando reações de química orgânica, condições, e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, incluindo: (1) reação de uma droga nucleofílica de um anticorpo com um reagente ligador bivalente, para formar Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com uma porção de droga D, e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma porção de droga com um reagente ligador bivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para preparar ADC são descritos no presente.

[0289] O ligador pode ser composto de um ou mais componentes de ligador. Componentes de ligador exemplares incluem 6-maleimidocaproíla (“MC”), maleimidopropanoíla (“MP”), valina-citrulina (“val-cit”), alanina- fenilalanina (“ala-phe”), p-aminobenziloxicarbonila (“PAB”), pentanoato de N- succinimidil 4-(2-piridiltio) (“SPP”), ciclo-hexano-1 carboxilato de N-succinimidil 4-(N-maleimidometila) (“SMCC’), e aminobenzoato de N-succinimidil (4-iodo- acetil) (“SIAB”). Componentes de ligador adicionais são conhecidos na técnica e alguns são descritos aqui. Ver também “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, US Ser. no 10/983.340, depositado em 5 de novembro de 2004, cujo conteúdo é incorporado ao presente por referência integralmente.

[0290] Em algumas modalidades, o ligador pode compreender resíduos de aminoácidos. Componentes de ligador de aminoácidos incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplares incluem: valine-citruline (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplars incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Os resíduos de aminoácidos que compreendem um componente de ligador de aminoácidos incluem os que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos ocorrendo não naturalmente, tal como citrulina. Os componentes de ligador de aminoácidos podem ser designados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por enzimas particulares, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.

[0291] Os grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv) hidroxil açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções de ligador e reagentes de ligador incluindo: (i) ésteres ativos tal como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e halogenetos de ácidos; (ii) halogenetos de alquila e de benzila tal como haloacetamidas; (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida. Certos anticorpos têm dissulfetos com intercadeias redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem se tornar reativos para conjugação com os reagentes de ligador por tratamento com um agente de redução tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará, assim, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílico adicionais podem ser introduzidos em anticorpo através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em tiol. Os grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) introduzindo um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos do aminoácido cisteína não nativo). Os conjugados de anticorpo droga também podem ser produzidos por modificação do anticorpo para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos no reagente de ligador ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidando periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina dos reagentes de ligador ou porções de droga. Os grupos imina de base de Schiff podem formar uma ligação estável, ou podem ser introduzidos, por exemplo, por reagentes de boroidreto, para formar ligações amina estáveis. Em uma modalidade, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado tanto com galactose oxidase como meta-periodato de sódio pode dar grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com grupos apropriados sobre a droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra modalidade, proteínas contendo resíduos de serina ou de treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído em lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Tal aldeído pode ser reagido com uma porção de droga ou nucleófilo ligador.

[0292] Do mesmo modo, grupos nucleofílicos em uma porção de droga incluem, mas não estão limitados a: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções de ligador e reagentes de ligador incluindo: (i) ésteres ativos tal como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos e halogenetos de ácido; (ii) halogenetos de alquila e de benzila tal como haloacetamidas, (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxila e maleimida.

[0293] Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e agente citotóxico pode ser preparada, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. O comprimento de DNA pode compreender as respectivas regiões codificando as duas porções do conjugado tanto adjacente uma à outra como separadas por uma região codificando um peptídeo ligador que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

[0294] Ainda em outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização em pré-alvo de tumor sendo que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado de circulação usando um agente de compensação e então administração de um “ligando” (por exemplo, avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

8. IMUNOLIPOSSOMAS

[0295] Os anticorpos descritos no presente também podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como o descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); e patentes US nos 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aprimorado são descritos na Patente US no 5.013.556.

[0296] Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivarizada de PEG (PEG- PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para dar lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab’ do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas como escrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) através de uma reação de intertroca de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

M. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0297] As moléculas ativas da invenção (por exemplo, polipeptídeos de TIGIT, anticorpos anti-TIGIT, variantes de cada, agonistas de TIGIT, antagonistas de TIGIT, agonistas de PVR e antagonistas de PVR) bem como outras moléculas identificadas pelos ensaios de triagem divulgados acima, podem ser administradas para o tratamento de doenças relacionadas à imunidade, na forma de composições farmacêuticas.

[0298] As formulações farmacêuticas de uma molécula ativa, por exemplo, um polipeptídeo ou anticorpo da invenção, são preparadas para armazenagem misturando a molécula ativa tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagems e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzotônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico;alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, mannose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares tal como sacarose, mannitol, trealose ou sorbitol; contraíons formando sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[0299] Os compostos identificados pelos ensaios de triagem divulgados no presente podem ser formulados de um modo análogo, usando técnicas padrão bem conhecidas.

[0300] Lipofecções ou lipossomas também podem ser usados para liberar a molécula ativa nas células. Quando fragmentos de anticorpo são usados, o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo é preferido. Por exemplo, baseado nas sequências de região variável de um anticorpo, as moléculas de peptídeo podem ser designadas, que reteem a capacidade de ligar a sequência de proteína alvo. Tais peptídeos podem ser quimicamente sintetizados e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante (ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]).

[0301] A presente formulação também pode conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência as com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente citotóxico, citocina ou agente inibidor de crescimento. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

[0302] As moléculas ativas também podem ser aprisionadas em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microglóbulos de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em microemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16aedição, Osol, A. Ed. (1980).

[0303] As formulações a serem usadas para administração in vivo precisam ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[0304] As preparações de liberação sustentada das moléculas ativas podem ser preparadas. Exemplos apropriados de preparação de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil)-metacrilato), ou álcool polivílico, polilactídeos (patente US no 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y-etil-L-glutamina, acetato de vinil etileno não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostos de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Apesar de polímeros tais como acetato de vinil etileno e ácido láctico-ácido glicólico possibilitarem a liberação de moléculas durante mais de 100 dias, certas proteínas liberam de hidrogéis durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37oC, resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis trocas em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é a formação da ligação S-S intermolecular através de intertroca de tiossulfeto, a estabilização pode ser obtida modificando os resíduos de sulfidrila, liofilizando a partir de soluções acídicas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz de polímero específica.

N. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0305] É contemplado que os polipeptídeos, anticorpos e outros compostos ativos da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças e condições imunes, tal como doenças mediadas por células T, incluindo as caracterizadas por infiltração de células inflamatórias em um tecido, estímulo de proliferação de células T, inibição de proliferação de células T, produção de citocinas aumentada ou diminuída, e/ou permeabilidade vascular aumentada ou reduzida ou a inibição dos mesmos. Dado as presentes divulgações do papel de TIGIT na modulação da proliferação de células T e produção de citocina, a modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT pode ser eficaz na prevenção e/ou tratamento destas doenças.

[0306] Condições ou distúrbios exemplares a serem tratados com os polipeptídeos, anticorpos e outros compostos da invenção, incluem, mas não estão limitados a lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (escleroderma), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjogre, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (panticopenia imune, hemoglobinúria noturna paroxismal), trombocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia mediada por imunidade), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal mediata imune (glomerulonofrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinizantes dos sistemas nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tal como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotróficos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, distúrbio intestinal inflamatório (colite ulcerativa: doença de Crohn), enteropatia sensível a glúten, e doença de Whipple, doenças de pele mediadas por imunidade incluindo doenças de pele com bolhas, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tal como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade a alimentos e urticária, doenças imunológicas do pulmão tal como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplantes incluindo rejeição a enxerto e doença de enxerto versus hospedeiro.

[0307] Em lúpus eritematoso sistêmico, o mediador central da doença é a produção de anticorpos auto-reativos a auto proteínas/tecidos e a subsequente geração de inflamação mediada por imunidade. Os anticorpos tanto diretamente como indiretamente mediam dano aos tecidos. Embora os linfócitos T não mostram estar diretamente envolvidos no dano ao tecido, os linfócitos T são requeridos para o desenvolvimento de anticorpos auto-reativos. A gênese da doença é assim dependente de linfócitos T. Múltiplos órgãos e sistemas são afetados clinicamente incluindo rim, pulmão, sistema músculo esqueletal, mucocutâneo, olhos, sistema nervoso central, sistema cardiovascular, trato gastrointestinal, medula óssea e sangue.

[0308] Artrite reumatóide (RA) é uma doença inflamatória autoimune sistêmica crônica que envolve principalmente a membrana sinovial de múltiplas juntas com dano resultante à cartilagem articular. A patogênese é dependente de linfócitos T e está associada com a produção de fatores reumatóides, auto-anticorpos dirigidos contra auto IgG, com a formação resultante de complexos imunes que alcançam altos níveis no fluido das juntas e no sangue. Estes complexos na junta podem induzir o infiltrado acentuado de linfócitos e monócitos na sinóvia e subsequentes trocas sinoviais acentuadas; o espaço das juntas/fluido, se infiltrado por células similares com a adição de numerosos neutrófilos. Os tecidos afetados são primeiramente as juntas, muitas vezes em padrão simétrico. No entanto, doença extracelular também ocorre em duas formas maiores. Uma forma é o desenvolvimento de lesões extracelulares com doença progressiva em curso e lesões típicas de fibrose pulmonar, vasculite e úlceras cutâneas. A segunda forma da doença extracelular é a denominada síndrome de Felty que ocorre depois no curso da doença RA, algumas vezes após a doença da junta ter se tornado quiescente, e envolve a presença de neutropenia, trombocitopenia e esplenomegalia. Isto pode ser acompanhado por vasculite em múltiplos órgãos com a formação de infartos, úlceras de pele e gangrena, Os pacientes muitas vezes também desenvolvem nódulos reumatóides no tecido da subcútis sobrepondo as juntas afetadas; o estágio final dos nódulos tem centros necróticos circundados por células inflamatórias misturadas infiltradas. Outras manifestações que podem ocorrer em RA incluem: pericardite, pleurite, artrite coronariana, pneumonite intestinal com fibrose pulmonar, ceratoconjuntivite seca, e nódulos reumatóides.

[0309] A artrite crônica juvenil é uma doença inflamatória idiopática crônica que começa muitas vezes com menos de 16 anos de idade. Seu fenótipo tem algumas similaridades a RA; alguns pacientes que são positivos para fator reumatóide são classificados como artrite reumatóide juvenil. A doença é subclassificada em três categorias maiores: pauciarticular, poliarticular e sistêmica. A artrite pode ser grave e é tipicamente destrutiva e leva à ancilose das juntas e crescimento retardado. Outras manifestações podem incluir uveíte anterior crônica e amiloidose sistêmica. As espondiloartropatias são um grupo de distúrbios com alguns aspectos clínicos comuns e a associação comum com a expressão do produto de genes HLA- B27. Os distúrbios incluem: espondilite anquilosante, síndrome de Reiter (artrite reativa), artrite associada com doença intestinal inflamatória, espondilite associada com psoríase, espondiloartropatia e espondiloartropatia não diferenciada com início da juventude. Os aspectos distintivos incluem sacroileíte com ou sem espondilite, artrite assimétrica inflamatória; associação com HLA-B27 (um alelo serologicamente definido do sítio HLA-B de MHC classe I); inflamação ocular, e ausência de autoanticorpos associados com outra doença reumatóide. A célula mais implicada como a chave para indução da doença é o linfócito T CD8+, uma célula que marca o antígeno apresentado pelas moléculas MHC classe 1. As células CD8+ podem reagir contra HLA-B27 do alelo de MHC classe I como se fossem um peptídeo estranho expresso por moléculas de MHC classe I. Supõe-se que um epítopo de HLA-B27 pode imitar um epítopo antigênico bacteriano ou microbiano e, assim, induzir uma resposta de células T CD8+. Como mostrado no presente, TIGIT é expresso em células T CD8+, e a modulação da expressão e/ou atividade de TIGIT nestas células pode modular os sintomas de e/ou prevenir esta doença.

[0310] Esclerose sistêmica (escleroderma) tem uma etiologia desconhecida. Uma marca da doença é o endurecimento da pele; provavelmente isto é induzido por um processo inflamatório ativo. O escleroderma pode ser localizado ou sistêmico; lesões vasculares são comuns e dano às células endoteliais na microvasculatura é um evento precoce e importante no desenvolvimento de esclerose sistêmica; o dano vascular pode ser mediado por imunidade. Uma base imunológica é implicada pela presença de infiltrados de células mononucleares nas lesões cutâneas e a presença de anticorpos nucleares em muitos pacientes. ICAM-1 é muitas vezes regulado ascendentemente na superfície das células de fibroblastos nas lesões da pele sugerindo que a interação de células T com estas células pode ter um papel na patogênese da doença. Outros órgãos envolvidos incluem: o trato gastrintestinal: atrofia do músculo liso e fibrose resultantes de peristalsia/motilidade anormal; rim: proliferação íntima subendotelial concêntrica afetando as artérias arqueadas e interlobulares pequenas com o fluxo do sangue cortical renal reduzido, resulta em proteinuria, azotemia e hipertensão; músculo esqueletal: atrofia, fibrose intersticial; inflamação; pulmão: pneumonite intersticial e fibrose intersticial; e coração: necrose da banda de contração, cicatrização/fibrose.

[0311] Miopatias inflamatórias idiopáticas incluindo dermatomiosite, polimiosite e outros são distúrbios da inflamação muscular crônica de etiologia desconhecida resultando em fraqueza muscular. Dano/inflamação do músculo é muitas vezes simétrico e progressivo. Os auto- anticorpos estão associados com a maioria das formas. Estes auto-anticorpos específicos de miosite são dirigidos contra e inibem a função dos componentes, proteínas e RNA’s, envolvidos na síntese de proteína.

[0312] A síndrome de Sjogren é devido a inflamação mediada por imunidade e subsequente destruição funcional das glândulas lacrimais e glândulas salivares. A doença pode estar associada com ou acompanhada por doenças inflamatórias do tecido conectivo. A doença está associada com a produção de anticorpos contra os antígenos Ro e La, ambos sendo complexos de RNA-proteína. As lesões resultam em ceratoconjuntivite seca, xerostomia, com outras manifestações ou associações incluindo cirrose biliar, neuropatia periférica ou sensória e púrpura palpável.

[0313] Vasculites sistêmicas são doenças em que a lesão primária é a inflamação e subsequente dano a vasos sanguíneos que resulta em isquemia/necrose/degeneração em tecidos supridos pelos vasos afetados e eventual disfunção de órgãos terminais em alguns casos. As vasculidites também podem ocorrer como uma lesão secundária ou sequela em outras doenças inflamatórias mediadas por imunidade tal como artrite reumatóide, esclerose sistêmica, etc., particularmente em doenças também associadas com a formação de complexos imunes. As doenças no grupo de vasculite sistêmica primária incluem: vasculite necrosante sistêmica; poliarterite nodosa, angilite e granulomatose alérgicas, poliangite; granulomatose de Wegener; granulomatose linfomatóide; e arterite de células gigantes. Vasculidites miscelâneas incluem: síndrome de nodos linfáticos mucocutâneos (MLNS ou doença de Kawasaki), vasculite do CNS isolada, doença de Beher, obliterações de tromboangilite (doença de Buerger) e venulite necrosante cutânea. Acredita- se que o mecanismo patogênico da maior parte dos tipos de vasculites listada seja primeiramente devido à deposição de complexos de imunoglobulina na parede dos vasos e a subsequente indução de uma resposta inflamatória tanto através de ADCC, ativação do complemento ou ambos.

[0314] Sarcoidose é uma condição de etiologia desconhecida que é caracterizada pela presença de granulomas epitelóides em quase todos os tecidos do corpo; o envolvimento do pulmão é mais comum. A patogênese envolve a persistência dos macrófagos ativados e células linfóides nos sítios da doença com subsequentes sequelas crônicas resultantes da liberação de produtos localmente e sistemicamente ativos liberados por estes tipos de células.

[0315] Anemia hemolítica autoimune incluindo anemia hemolítica autoimune, pancitopenia imune e hemoglobinúria noturna paroxismal é um resultado da produção de anticorpos que reagem com os antígenos expressos sobre a superfície das células do sangue vermelho (e em alguns casos outras células do sangue incluindo plaquetas também) e é uma reflexão da remoção destas células revestidas com anticorpos através dos mecanismos de lise mediada por complemento e/ou mediados por receptor ADCC/Fc.

[0316] Uma trombocitopenia autoimune incluindo trombocitopenia púrpura, e trombocitopenia mediada por imunidade em outras configurações clínicas, destruição/remoção de plaquetas ocorre como um resultado de qualquer anticorpo ou complemento fixando-se em plaquetas e a subsequente remoção por mecanismos de lise de complemento, ADCC ou mediados por FC.

[0317] Tiroidite incluindo doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, e tiroidite atrófica) são um resultado de uma resposta autoimune contra os antígenos da tiróide com a produção de anticorpos que reagem com as proteínas presentes em e muitas vezes específicas para a glândula da tiróide. Existem modelos experimentais incluindo modelos espontâneos: ratos (ratos BUF e BB) e frangos (filamento de frango obeso); modelos induzíveis: imunização de animais com qualquer tiroglobulina, antígeno microssômico da tiróide (tiróide peroxidase).

[0318] Diabetes mellitus tipo I ou diabetes dependente de insulina é a destruição autoimune de células de ilhotas 3 pancreáticas, esta destruição é mediada por auto-anticorpos e células T auto-reativas. Anticorpos para insulina ou o receptor de insulina também podem produzir o fenótipo de insulina sem capacidade de resposta.

[0319] Doenças renais mediadas por imunidade, incluindo glomerulonefrite e nefrite tubulointersticial são o resultado de dano mediado por anticorpo ou linfócitos T em tecido renal tanto diretamente como um resultado da produção de anticorpos auto-reativos ou células T contra antígenos renais como indiretamente como um resultado da deposição de anticorpos e/ou complexos imunes no rim, que são reativos contra outros antígenos não renais. Assim, outras doenças mediadas por imunidade que resultam na formação de complexos imunes também podem induzir doença renal mediada por imunidade como uma sequela indireta. Ambos os mecanismos imunes diretos e indiretos resultam em resposta inflamatória que produz/induz o desenvolvimento de lesão em tecidos renais com o resultante prejuízo da função do órgão e em alguns casos a progressão para falha renal. Ambos os mecanismos imunes humoral e celular podem estar envolvidos na patogênese das lesões.

[0320] Doenças desmielinizantes dos sistemas nervoso central e periférico, incluindo esclerose múltipla; acredita-se que polineuropatia desmielinante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré; e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica tenham uma base autoimune e resulta na desmielinação dos nervos como um resultado do dano causado a oligodendrócitos ou à mielina diretamente. No MS há evidência para sugerir que a indução e a progressão da doença dependem de linfócitos T. A esclerose múltipla é uma doença desmielinante que é dependente de linfócitos T e tem tanto um curso de recaída-remissão como um curso progressivo crônico. Etiologia é desconhecida, no entanto, infecções virais, predisposição genética, ambiente e autoimunidade todos contribuem. As lesões contêm infiltrados de predominantemente linfócitos T mediados, células microgliais e infiltrando macrófagos; os linfócitos T CD4+ são o tipo de células predominantes nas lesões. O mecanismo da morte de células de oligodendrócitos e a subsequente desmielinação não é conhecido, mas está provalmente acionando os linfócitos T.

[0321] Doença do pulmão inflamatória e fibrótica, incluindo pneumonias eosinofílicas; fibrose pulmonar idiopática; e pneumonite de hipersensibilidade podem envolver uma resposta inflamatória imune desregulada. A inibição dessa resposta poderia ser de benefício terapêutico.

[0322] Doença de pele autoimune ou mediada por imunidade incluindo doenças de pele com bolhas, eritema multiforme e dermatite de contato são mediadas por auto-anticorpos, a gênese da qual depende de linfócitos T.

[0323] Psoríase é uma doença inflamatória mediada por linfócitos T. As lesões contêm infiltrados de linfócitos T, macrófagos e células de processamento de antígenos, e alguns neutrófilos.

[0324] Doenças alérgicas, incluindo asma; rinite alérgica; dermatite atópica; hipersensibilidade a alimentos; e urticária são dependentes de linfócitos T. Estas doenças são predominantemente mediadas por inflamação induzida por linfócitos T, inflamação mediada por IgG ou uma combinação de ambas.

[0325] Doenças associadas a transplantes, incluindo rejeição a enxerto e doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD) são dependentes de linfócitos T; a inibição da função de linfócitos T é melhorativa.

[0326] Outras doenças nas quais a intervenção de resposta imune e/ou inflamatória tem benefício são doenças infecciosas incluindo, mas não limitadas a infecção viral (incluindo, mas não limitada a AIDS, hepatites A, B, C, D, E e herpes), infecção bacteriana, infecções fúngicas, e infecções por protozoários e parasíticas (moléculas (ou derivados/agonistas) que estimulam o MLR podem ser utilizadas terapeuticamente para melhorar a resposta imune a agentes infecciosos), doenças da imunodeficiência (moléculas/derivados/agonistas) que estimulam o MLR podem ser utilizadas terapeuticamente para aprimorar a resposta imune para condições de imunodeficiência hereditária, adquirida, infecciosa induzida (como em infecção por HIV), ou iatrogênica, isto é, como de quimioterapia), e neoplasia.

[0327] É demonstrado que alguns pacientes de câncer humanos desenvolvem um anticorpo e/ou resposta de linfócitos T para antígenos em células neoplásicas. Também é mostrado em modelos de animais de neoplasia que a aprimoramento da resposta imune pode resultar em rejeição ou regressão de neoplasma particular. Moléculas que aprimoram a resposta de linfócitos T em MRL têm utilidade in vivo para aprimorar a resposta imune contra neoplasia. Moléculas que melhoram a resposta proliferativa de linfócitos T no MLR (ou agonistas de moléculas pequenas ou anticorpos que afetaram o mesmo receptor em um aspecto agonista) podem ser usadas terapeuticamente para tratar câncer. Moléculas que inibem a resposta de linfócitos no MLR (isto é, TIGIT) também funcionam in vivo durante a neoplasia para suprimir a resposta imune para um neoplasma; tais moléculas tanto podem ser expressas pelas células neoplásicas por si mesmas como sua expressão pode ser induzida pelo neoplasma em outras células. O antagonismo de tais moléculas inibidoras (tanto com anticorpo, antagonistas de moléculas pequenas, como outro meio) aprimora a rejeição de tumor mediada por imunidade.

[0328] Adicionalmente, a inibição das moléculas com propriedades pró-inflamatórias pode ter benefício terapêutico em dano de reperfusão; derrame; infarto do miocárdio; aterosclerose; dano ao pulmão agudo; choque hemorrágico; queimadura; sepsia/choque séptico; necrose tubular aguda; endometriose; doença da junta degenerativa e pancreatite.

[0329] Os compostos da presente invenção, por exemplo, polipeptídeos, moléculas pequenas ou anticorpos, são administrados a um mamífero, de preferência um humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias intramusculares, intraperitoneais, intracerebroespinhais, subcutâneas, intraarticulares, intra-sinoviais, intratecal, oral, tópica, ou inalação (intranasal, intrapulmonar). A administração de polipeptídeos e de anticorpos intravenosa, subcutânea ou inalada é mais comumente usada.

[0330] Uma terapia com imunoadjuvante, outros regimes terapêuticos, como a administração de um agente anticâncer, podem ser combinados com a administração de proteínas, anticorpos ou compostos da presente invenção. Por exemplo, o paciente a ser tratado com, por exemplo, um imunoadjuvante da invenção também pode receber um agente anticâncer (agente quimioterapêutico) ou terapia de radiação. Os programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções dos fabricantes ou como empiricamente determinado pelo clínico. Os programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O agente quimioterapêutico pode preceder, ou seguir a administração do imunoadjuvante ou pode ser dado simultaneamente com o mesmo. Adicionalmente, um composto anti-estrogênio tal como tamoxifen ou um anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616812) pode ser dado em dosagens conhecidas para tais moléculas.

[0331] Pode ser desejável também administrar anticorpos contra outra doença imune associada ou antígenos associados a tumor, incluindo, mas não limitados a anticorpos que se ligam a CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou fator endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou além disso, duas ou mais ligações de anticorpos aos mesmos ou a dois ou mais antígenos deferentes divulgados no presente podem ser co-administradas ao paciente. Às vezes pode ser benéfico administrar também uma ou mais citocinas ao paciente. Por exemplo, em uma modalidade, os polipeptídeos de TIGIT são co-administrados com um agente inibidor de crescimento. Por exemplo, o agente inibidor de crescimento pode ser administrado primeiro, seguido por um polipeptídeo de TIGIT. No entanto, a administração simultânea ou administração principal é também contemplada. As dosagens apropriadas para o agente inibidor de crescimento são as presentemente usadas e podem ser diminuídas devido à ação combinada (sinergia) do agente inibidor de crescimento e, por exemplo, do polipeptídeo de TIGIT.

[0332] Para o tratamento ou redução da gravidade da doença relacionada à imunidade, a dosagem apropriada de um composto da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêutico, terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao composto, e do discernimento clínico atendente. O composto pode ser apropriadamente administrado ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.

[0333] Por exemplo, dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de polipeptídeo ou anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administração repetida durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. No entanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

O. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[0334] Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo os materiais (por exemplo, compreendendo uma molécula de TIGIT, agonista de TIGIT, antagonista de TIGIT, agonista de PVR ou antagonista de PVR) úteis para o diagnóstico ou tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um contêiner e uma instrução. Alguns contêineres incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de teste. Os contêineres podem ser formados de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O contêiner retém uma composição que é eficaz para o diagnóstico ou tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o contêiner pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é usualmente um polipeptídeo ou um anticorpo da invenção. Uma instrução ou rótulo sobre, ou associado com, o contêiner indica que a composição é usada para diagnóstico ou tratamento da condição de escolha. A artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo contêiner compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e insertos de acondicionamento com as instruções para uso.

P. DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO DA DOENÇA RELACIONADA À IMUNIDADE

[0335] As proteínas de superfície de células, tal como proteínas que são superexpressas em certas doenças relacionadas à imunidade (isto é, TIGIT), são excelentes alvos de modulação para candidatos a droga ou tratamento da doença. As mesmas proteínas junto com proteínas secretadas codificadas pelos genes ampliados em estados da doença relacionada à imunidade encontram uso adicional no diagnóstico e prognóstico destas doenças. Por exemplo, os anticorpos dirigidos contra os produtos das proteínas dos genes ampliados em artrite reumatóide ou outras doenças relacionadas à imunidade podem ser usados como diagnósticos ou prognósticos.

[0336] Por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, podem ser usados para detectar qualitativamente ou quantitativamente a expressão de proteínas codificadas pelos genes ampliados ou superexpressos (“produtos de gene marcador”). O anticorpo de preferência é equipado com um rótulo detectável, por exemplo, fluorescente, e a ligação pode ser monitorada por microscopia de luz, citometria de fluxo, fluorimetria, ou outras técnicas conhecidas na técnica. Estas técnicas são particularmente apropriadas, se o gene superexpresso codifica uma proteína de superfície de célula. Tais ensaios de ligação são realizados essencialmente como descritos acima.

[0337] A detecção in situ da ligação do anticorpo aos produtos de gene marcador pode ser realizada, por exemplo, por imunofluorescência ou microscopia de imunoelétron. Para este fim, um espécime histológico é removido do paciente, e um anticorpo marcado é aplicado ao mesmo, de preferência sobrepondo o anticorpo em uma amostra histológica. Este procedimento também permite determinar a distribuição do produto de gene marcador no tecido examinado. Será aparente aos técnicos no assunto que uma ampla variedade de métodos histológicos está prontamente disponível para a detecção in situ. Outras técnicas também são bem conhecidas na arte, por exemplo, classificação de células auxiliada por fluorescência (FACS).

[0338] Os seguintes exemplos são oferecidos somente para fins ilustrativos, e não são pretendidos para limitar o escopo da presente invenção de modo algum.

[0339] Todas as referência de patente, publicação de patente e literatura citadas no presente relatório são incorporadas ao presente por referência integralmente.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: OUTRA CARACTERIZAÇÃO DE TIGIT

[0340] TIGIT foi anteriormente identificado (ver, por exemplo, publicação de patente no US20040121270, incorporado ao presente por referência integralmente) em estratégias de ampla pesquisa de genomas objetivando genes especificamente expressos por células imunes que têm uma estrutura de domínio consistindo de domínios de Ig extracelulares, um tipo de região de transmembrana, e motivo (s) de ativação ou inibição (ITAM/ITIM) baseado(s) em tirosina do imunorreceptor intracelular (Abbas, A.R. et al. Genes Immun 6, 319-31 (2005); Burshtyn, D.N. et al., J Biol Chem 272, 13066-72 (1997); Kashiwada, M. et al., J Immunol 167, 6382-7 (2001)). A sequência de TIGIT humano e homólogos de camundongo (submetido ao GenBank), macaco rhesus (GenBank no de acesso XP_001107698) e cão (GenBank no de acesso XP_545108) são mostrados na figura 1. Para ainda elucidar o papel de TIGIT na função imune, uma pesquisa de homologia foi realizada, que identificou o domínio de Ig de TIGIT como sendo similar aos domínios de IgV N-terminais da proteína do receptor de poliomielite (PVR) e 1-4 proteínas como PVR (PVRL1- 4), bem como os domínios de IgV N-terminais de CD96 e CD226 (ver figuras 2A-2B). O alinhamento destas proteínas mostrou que os resíduos altamente conservados que definem o domínio de IgV canônico foram conservados em TIGIT, e sugeriu ainda que estas oito proteínas podem compreender um subconjunto relacionado da família Ig. Os resíduos de quadro V conservados mostram ser importantes para estabelecer a dobra de quadro V (Wiesmann, C. & de Vos, A.M. Cell Mol Life Sci 58, 748-59 (2001)). Um número de resíduos foi identificado próximo à dobra do quadro V, que foram conservados entre as oito proteínas, incluindo quatro resíduos absolutamente conservados (A67, G74, P114, e G116) e cinco resíduos conservados (V/I/L54, S/T55, Q56, T112 e F/Y113) que c (V/I/L54, S/T55, Q56, T112 and F/Y113) que compreendem três submotivos (V/I54- S/T55-Q56), (A67-X(6)-G74) e (T112-F/Y113-P114-X-G116). No caso de TIGIT, estes submotivos parecem ser conservados através de espécies (ver a figura 1) e não estão presentes em outro domínio de IgG contendo proteínas, atualmente descrito. Estes resíduos conservados podem definir uma classe de proteínas como PVR incluindo PVR, 1-4 proteínas como PVR, CD96, CD226 e TIGIT.

[0341] PVRL1-4 e PVR compartilham uma arquitetura de domínio comum (IgV-IgC-IgV), enquanto CD226 e CD96 são desprovidos do domínio IgV proximal de membrana. TIGIT é o membro da família mais econômico, consistindo de um único domínio de IgV. Os segmentos intracelulares destas oito proteínas mostram somente uma similaridade uma com a outra limitada fora do motivo de ligação de afadina compartilhado entre PVRL1-3. Baseado na estrutura de cristal do domínio de IgV relacionado de NECL-1 (Dong, X. et al., J Biol Chem 281, 10610-7 (2006)), o primeiro e terceiro motivos são previstos estar em laços de hairpin entre os beta-filamentos B e C e F e G, respectivamente. Estes dois laços adjacentes um ao outro em uma extremidade da dobra de IgV. O segundo motivo compreende os beta- filamentos C’ e C” que estão envolvidos na parte de formação da interface homodimérica para NECL-1. Assim, os motivos de sequência observados na família TIGIT/PVR podem desempenhar um papel em interações homo- e heterotípicas específicas observadas entre os membros da família PVR. PVR foi anteriormente caracterizado como uma proteína como nectina, mas a análise de sequência acima sugere que ele deveria, em vez disso, ele ser considerado um membro da família PVR, com certas nectinas (isto é PVRL1-4) sendo categorizadas como um ramo da família PVR.

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DO LIGANTE DE PVR

[0342] Os parceiros de ligação potenciais para TIGIT foram identificados triando uma grande biblioteca de proteínas secretadas para buscar proteínas que ligaram TIGIT imobilizado. Resumidamente, uma fusão de Fc de TIGIT (TIGIT-Fc) foi construída clonando 1-138 aminoácidos de TIGIT humano em um vetor imediatamente precedendo a região Fc de IgG1 humanizado (TIGIT-Fc). Uma versão alternativa de TIGIT-Fc em que a ligação de FcyR foi abolida também foi construída pela introdução de duas mutações na cauda de Fc de TIGIT-Fc a D256A e N297A usando técnicas padrão de mutagênese dirigida ao sítio (TIGIT-Fc-DANA). A proteína de fusão resultante foi expressa transientemente em e purificadas a partir de células CHO usando técnicas de cromatografia de afinidade padrão. Uma biblioteca de proteínas individuais secretadas fundida a etiquetas de hexa-histidina e de Fc foi triada para ligação a TIGIT-Fc usando o sistema de Octet (ForteBio). As proteínas foram testadas para ligação em HBS-P (10 mM Hepes, pH 7,4; 0,15 M NaCl; 0,05% de tensoativo P20). TIGIT-Fc ou uma proteína de fusão de Fc de controle foi carregado sobre biosensores de Fc anti-humanos para saturação. Os biosensores foram lavados em tampão (30 segundos), colocados em reservatórios contendo 5 μg/ml de proteína durante três minutos, e lavados novamente durante 30 segundos. Os sensores foram recarregados e lavados após cada dois ciclos de ligação. A ligação foi indicada como um aumento no nível de resposta maior do que 0,2 nm, e a especificidade foi determinada por comparação a uma proteína de fusão de Fc de controle. Uma proteína única que ligou TIGIT foi identificada em mais de 1000 proteínas analisadas. Como mostrado na figura 3, uma proteína de fusão de TIGIT-Fc imobilizada sobre um biosensor de Fc anti-humano interagiu especificamente com uma proteína de fusão de TIGIT-Fc. A especificidade desta interação foi suportada pela falta de interação específica de TIGIT com qualquer outra proteína na biblioteca, e ainda pelo fato de que os biosensores carregados com proteínas contendo o domínio de Ig não elicitam uma resposta para PVR.

[0343] Devido a saber anteriormente que PVR, PVLR1-4, CD96 e CD226 interagem um com o outro (He, Y. et al., J Virol 77, 4827-35 (2003); Satoh-Horikawa, K. et al., J Biol Chem 275, 10291-9 (2000); Bottino, C. et al. J Exp Med 198, 557-67 (2003); Fuchs, A. et al., J Immunol 172, 3994-8 (2004); Reymond, N. et al., J Exp Med 199, 1331-41 (2004)), a interação de TIGIT com cada uma destas proteínas foi avaliada usando o sistema de biosensor descrito acima. As proteínas de fusão de Fc foram construídas e purificadas para cada uma das proteínas a serem testadas como descrito acima para TIGIT- Fc. Especificamente, 1-343 aminoácidos de proteína 1 como PVR (PVRL1), 1-360 aminoácidos de proteína 2 como PVR (PVRL2), 1-411 aminoácidos de proteína 3 como PVR (PVRL3), 1-349 aminoácidos de proteína 4 como PVR (PVRL4), 1-259 aminoácidos de CD226, ou 1-500 aminoácidos de CD96 foram fundidos precedendo imediatamente a região Fc de IgG1 humano. As proteínas de fusão de Fc resultantes foram testadas para ligação a TIGIT-Fc. PVR-Fc, PVRL3-Fc e TIGIT-Fc ligado a PVRL2-Fc, enquanto CD226-Fc, CD96-Fc, PVRL1-Fc, e PVRL4-Fc não liga TIGIT- Fc(Figura 4A). De três aglutinantes observados, PVR-Fc mostrou a maior ligação a TIGIT-Fc, seguido por PVRL3-Fc, e a menor quantidade de ligação dos três a TIGIT-Fc foi observada com PVRL2-Fc.

[0344]Análises FACS também foram realizadas para avaliar a ligação das fusões de Fc a membros da família PVR construídos acima para TIGIT expressando células CHO. As proteínas de fusão foram biotiniladas através de acoplamento de amina usando NHS-PEO4-Biotin (Pierce) em PBS. A ligação dos ligantes biotinilados foi detectada usando estreptavidina conjugada a ficoeritrtina (Caktag). Anticorpo monoclonal de camundongo para etiquetar gD (Genentech) foi conjugado a AlexaFluor 647 (Invitrogen). Os anticorpos foram conjugados a rótulos de flúor apropriados usando técnicas padrão. As células foram coloridas pelas instruções do fabricante. Antes da coloração, as células foram bloqueadas com soro apropriado de IgG purificado. A aquisição foi realizada em um FACSCalibur (BD Biosciences) e analisada com o software JoFlo (Tree Star, Inc.). O dispersador dianteiro e lateral fechou as células viáveis. Os resultados são descritos nas figuras 4B-1 a 4B-6, e mostram que o padrão de ligação observado no ensaio de biosensor artificial foi igual ao observado em uma configuração mais fisiológica na superfície das células.

[0345] Para determinar a resistência de das interações de ligação de PVR-TIGIT, PVRL2-TIGIT e PVRL3-TIGIT, ensaios de ligação de radioligantes foram realizados usando células CHO estavelmente transfectadas com estas proteínas. Para expressão na superfície de células CHO, DNAs de comprimento completo de TIGIT, PVR, PVRL2, PVRL3, CD226 e CD96 foram clonados em um vetor imediatamente após uma sequência de sinal gD (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRG (SEQ ID NO: 19)) e a etiqueta gD (KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL (SEQ ID NO: 20)). Os plasmídeos foram transfectados em células CHO usando Lipofectamine LTX (Invitrogen). A expressão de proteínas etiquetadas com gD foi verificada por citometria de fluxo usando o conjugado Alexa-647 anti-gD. As linhagens de células estavelmente transfectadas foram classificadas duas vezes por FACS para purificar antes de usar. As proteínas de fusão de Fc, construídas como descrito acima, foram iodadas (123I) usando o método de Iodogen. Os estudos de ligação foram realizados em transfectantes estáveis em triplicata com 0,1-3 nM de ligando iodado. As proteínas iodadas foram incubadas com 1x105 - 2x105células na presença de uma série de diluições de proteína competidora não marcada (25 pM-5 μM) durante quatro horas a 4oC. As suspensões de células foram coletadas sobre membranas de nitrocelulose (Millipore) e lavadas extensivamente. Os filtros secados foram contados e análises de Scatchard foram realizadas usando o software New Ligand 1.05 (Genentech) para determinar a afinidade de ligação (Kd).

[0346]As figuras 5A e 5B mostram a ligação da proteína TIGIT-Fc radiormarcada a células CHO expressando PVR. O Kd médio para a interação de TIGIT-Fc-PVR acima de 4 experiências foi 3,15 nM. A tabela 6 mostra os resultados de todas as análises e forma tabular. TABELA 6:

[0347] Ligação de células de proteínas da família PVR. Os receptores foram expressos em células CHO, e todos os ligantes são constructos Fc. MF1 foi determinado por citometria de fluxo com ligantes de Fc biotinilados, após fechamento nas células positivas no receptor. A afinidade de ligação (Kd) foi determinada por ensaio de ligação de radioligando por competição. Kd é indicado (nM) e é o valor médio de pelo menos 3 ensaios independentes, exceto onde indicado (*).

[0348] A interação de TIGIT com PVR demonstrou a afinidade mais alta (Kd = 1-3 nM) enquanto a afinidade da ligação de TIGIT a PVRL3 foi aproximadamente 10-30 vezes menor (Kd = 38,9 nM) (ver tabela 6). Devido ao fraco ajustamento no ensaio de radioligando, a constante de ligação para a interação de PVRL2-TIGIT poderia não ser determinada, mas a ligação específica foi contudo observada e estava consistente com os dados de FACS descritos acima mostrando a ligação modesta de PVRL2-Fc a CHO-TIGIT, e ainda apoiado na descoberta de que a ligação entre PVRL2 e TIGIT é uma interação de baixa afinidade. A proteína de fusão de Fc iodada (ligando) foi ligada a células CHO expressando o receptor em uma concentração indicada, e competiu com diluições em série de 10 vezes de CD226-Fc (8 μM sobre CHO-TIGIT; 5 μM sobre CHO- PVR), TIGIT-Fc (2 μM sobre CHO-PVR; 6 μM sobre CHO-CD226 e CHO-CD96). Ligação não específica foi determinada usando um excesso de 2000 vezes de ligando frio e subtraído da ligação total. Os estudos de competição mostraram que TIGIT bloqueou eficazmente a interação de PVR para seus outros co-receptores CD226 e CD96, enquanto CD226 foi um inibidor menos eficaz da interação de TIGIT-PVR (figura 6). Estes dados estavam de acordo com a mais alta afinidade observada da interação de PVR-TIGIT (1-3 nM) como comparada à interação de PVR-CD226 (aproximadamente 115 nM, de acordo com Tahara-Hanaoka, S. et al. Int Immunol 16, 533-8 (2004)). Estudos de competição direta com CD96 não foram possíveis devido à baixa expressão dessa proteína, embora TIGIT tenha inibido completamente a ligação de PVR a células CHO expressando CD96. Os estudos de competição acima demonstraram que TIGIT, CD226, e CD96 compartilham um sítio de ligação comum ou sítios de ligação de sopreposição em PVR. Esta descoberta foi ainda suportada pela observação de que o anticorpo D171 anti-PVR, que se liga ao domínio de IgG N-terminal de PVR, bloqueia a ligação de TIGIT e CD226 a PVR (figura 7).

EXEMPLO 3 - EXPRESSÃO DE TIGIT E PVR (A) EXPRESSÃO DE TIGIR E PVR EM CÉLULAS IMUNES EM REPOUSO E ATIVADAS

[0349] A distribuição relativa e a expressão de TIGIT e PVR em células imunes foram avaliadas como um indicador do papel destas duas moléculas na função imune normal, e comparadas à expressão de CD226, uma molécula anteriormente conhecida e mostrada no exemplo 2 para interagir com PVR in vivo. Um estudo anterior mostrou que a expressão de TIGIT foi específica para células T e NK, através de múltiplos tipos de células imunes bem como um arranjo de tecidos (Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005)). Uma outra análise da expressão de TIGIT em uma variedade de células e tecidos imunes ex vivo e após a ativação foi realizada. Como mostrado nas figuras 8A e 8B, TIGIT é mais fortemente expresso em células T reguladoras (Treg), e é também altamente expresso em células NK e células Tfh de tecido tonsilar humano. TIGIT é expresso em uma menor extensão em células NK não estimuladas, em células T da memória ativadas e em repouso, em células T CD8+ e em células Th2 e Th1. Estes dados correlacionam-se com os dados mostrados na publicação de patente US2004121370, onde foi mostrado que TIGIT é significativamente superexpresso em células T CD4+ isoladas, ativadas por anti-CD3/ICAM-1 e anti-CD3/anti-CD28 como comparado a células T CD4+ isoladas,em repouso. Em contraste, foi relatado que PVR é expresso em células endoteliais, fibroblastos, osteoclastos, células dendríticas foliculares, células dendríticas e células de tumor (Sakisaka, T. & Takai, Y., Curr Opin Cell Biol 16, 513-21 (2004); Fuchs, A. & Colonna, M., Semin Cancer Biol 16, 359-66 (2006)). Estes dados realçam que TIGIT está associado com células T que produzem citocinas reguladoras que podem suprimir a resposta imune.

[0350] Análises citométricas de fluxo complementares também foram realizadas, usando os mesmos métodos descritos no exemplo 2. Células T ex vivo humanas foram examinadas após a ativação para expressão de TIGIT na superfície usando um anticorpo (10A7) de TIGIT anti-murino de hamster que trans-reage em TIGIT humano e bloqueia a interação de TIGIT com PVR (ver a figura 9). Os anticorpos anti-TIGIT foram gerados por hamsters imunizantes com proteína de fusão de TIGIT-Fc de murino e obtendo os anticorpos anti-camundongo de hamster dos mesmos usando técnicas padrão. Dois anticorpos, 10A7 e 1F4, também ligados especificamente a TIGIT humano (dados não mostrados) e foram usados para outras experiências. Notavelmente, 10A7 e 1F4 ligam-se a epítopos diferentes em TIGIT humano, como evidenciado pelo fato de que a ligação de 1F4 a TIGIT não bloqueia a ligação de 10A7 a TIGIT sobre a superfície de células 293 expressando TIGIT (dados não mostrados). As sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas do anticorpo 10A7 foram determinadas usando técnicas padrão. A sequência de cadeia leve deste anticorpo é: DIVMTQSPSSLAVSPGEKVTMTCKSSQSLYYSGVKENLLAWYQQKPGQSPK LLIYYASIRFTGVPDRFTGSGSGTDYTLTITSVQAEDMGQYFCQQGINNPLTFG DGTKLEIKR (SEQ ID NO: 21) e a sequência de cadeia pesada deste anticorpo é EVQLVESGGGLTQPGKSLKLSCEASGFTFSSFTMHWVRQSPGKGLEWVAFIR SGSGIVFYADAVRGRFTISRDNAKNLLFLQMNDLKSEDTAMYYCARRPLGHN TFDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22), onde as regiões determinantes complementares (CDRs) de cada cadeia são representadas por texto em negrito. Assim, CDR1 da cadeia leve dev10A7 tem a sequência KSSQSLYYSGVKENLLA (SEQ ID NO: 23), CDR2 da cadeia leve de 10 A7 tem a sequência ASIRFT (SEQ ID NO: 24), e CDR3 da cadeia leve de 10A7 tem a sequência QQGINNPLT (SEQ ID NO: 25). CDR1 da cadeia pesada de 10A7 tem a sequênciaGFTFSSFTMH (SEQ ID NO: 26), CDR2 de cadeia pesada de 10A7 tem a sequência FIRSGSGIVFYADAVRG (SEQ ID NO: 27), e CDR3 da cadeia pesada de 10A7 tem a sequência RPLGHNTFDS (SEQ ID NO: 28).

[0351] As sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas do anticorpo 1F4 foram determinadas usando 5’ RACE (ver, por exemplo, Ozawa et al., BioTechniques 40(4): 469-478 (2006)). A sequência de cadeia leve deste anticorpo é: DVVLTQTPLSLSVSFGDQVSISCRSSQSLVNSYGNTFLSWYLHKPGQSPQLLI FGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPPTFGPG TKLEVK (SEQ ID NO: 29) e a sequência de cadeia pesada deste anticorpo é: EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTGHLMNWVKQSHGKNLEWIGLII PYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSDDSAVYFCSRGLRGFY AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 30), onde as regiões determinantes complementares (CDRs) de cada cadeia são representadas pelo texto em negrito. Assim, CDR1 da cadeia leve de 1F4 tem a sequência RSSQSLVNSYGNTFLS (SEQ ID NO: 31), CDR2 da cadeia leve de 1F4 tem a sequência GISNRFS (SEQ ID NO: 32), e CDR3 da cadeia leve de 1F4 tem a sequência LQGTHQPPT (SEQ ID NO: 33). CDR1 da cadeia pesada de 1F4 tem a sequência GYSFTGHLMN (SEQ ID NO: 34), CDR2 da cadeia pesada de 1F4 tem a sequência LIIPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 35), e CDR3 da cadeia pesada de 1F4 tem a sequência GLRGFYAMDY (SEQ ID NO: 36). Os iniciadores usados para a metodologia de sequenciamento RACE foram como a seguir: iniciadores específicos dos genes RT-PCR: (i) IgGRace de cadeia pesada: TTTYTTGTCCACCKTGGTGCTGC (SEQ ID NO: 37); IgGRace2: CTGGACAGGGATCCAGAGTTCC (SEQ ID NO: 38); IgGRace7: CARGTCAMDGTCACTGRCTCAG (SEQ ID NO: 39); IgGRace1: GAARTARCCCTTGACCAGGC (SEQ ID NO:64); (ii) cadeia leve: KapRace3: GTAGAAGTTGTTCAAGAAG (SEQ ID NO: 40); KapRace2: GAGGCACCTCCAGATGTTAAC (SEQ ID NO: 41); KapRace7: CTGCTCACTGGATGGTGGGAAG (SEQ ID NO: 42); KapRace1: GAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 43); e iniciadores de PCR da cauda 5’ RACE: ODC2: GATTCAAATCTCAATTATATAATCCGAATATGTTTACCGGCTCGCTCATGGA CCCCCCCCCCCCDN (SEQ ID NO: 44); ODC3: GAATTCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 45); ODC4: CTCATGGACCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 46); ODC5: AAATATAATACCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 47); ADC5: AAATATAATACCCCCCC (SEQ ID NO: 48), e ADC5X: CTCATGGACCCCCCC (SEQ ID NO: 49).

[0352] A sequência de nucleotídeo codificando a cadeia leve de 1F4 foi determinada ser: GATGTTGTGTTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGCTTTGGAGAT CAAGTTTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGTAAACAGTTATGGG AACACCTTTTTGTCTTGGTACCTGCACAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTC CTCATCTTTGGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGT GGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCACAATAAAGCC TGAGGACTTGGGAATGTATTACTGCTTACAAGGTACGCATCAGCCTCCCAC GTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAGGTGAAA (SEQ ID NO: 50) e a sequência de nucleotídeo codificando a cadeia pesada de 1F4 foi determinada ser: GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAACTTC AATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCCATCTTAT GAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTA TTATTCCTTACAATGGTGGTACAAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGG CCACATTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCA GTCTGACTTCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTTCAAGAGGCCTTAGGG GCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCT CA (SEQ ID NO: 51).

[0353] Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas da crosta inflamatória por centrifugação sobre Ficoll- Paque Plus (Amersham Biosciences). Os subconjuntos indicados de células foram purificados com kits MACS correspondentes (Milteenyi). A pureza das células classificadas foi verificada por citometria de fluxo e estavam na faixa de mais do que 93% para células purificadas por classificação de células magnéticas em mais do que 98% para células purificadas por citometria de fluxo. Todas as células foram bloqueadas com 10-20% de soro apropriado ou purificadas com IgG antes da coloração. Análises de PCR quantitativas foram realizadas para avaliar os níveis de mRNA de proteínas de interesse nas populações de células classificadas. O RNA total das células classificadas foi isolado com um kit RNeasy (Qiagen) e digerido com DNAse I (Qiagen). O RNA celular total foi transcrito reverso e analisado em tempo real por PCR TaqMan™ em triplicata de acordo com as instruções do fabricante, usando um 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystem). As unidades de expressão arbitrárias são dadas como a expressão de dobra sobre as células não estimuladas. Os iniciadores dianteiros e reversos usados para detectar TIGIT foram: TGCCAGGTTCCAGATTCCA (SEQ ID NO: 52) e ACGATGACTGCTGTGCAGATG (SEQ ID NO: 53), respectivamente, e a sequência de sonda de TIGIT usada foi AGCCATGGCCGCGACGCT (SEQ ID NO: 54).

[0354] As células T CD4+ foram isoladas de PBMC e ativadas com anti-CD3 e anti-CD8. TIGI expresso na superfície das células foi não detectável em células CD4+CD45RA+ nativas não estimuladas, enquanto as células CD4+CD45RO+ não estimuladas tiveram uma expressão baixa, mas detectável (figuras 10A-1 e 10A-2). Como mostrado nas figuras 10A-1 e 10A-2, a expressão de TIGIT diferiu significativamente da expressão de CD226 nos subconjuntos RA+ versus RO+ de células CD4. As análises de mRNA em populações de células imunes classificadas diretamente ex vivo a partir de PBMC mostraram maior expressão de TIGIT em Treg, RO e células NK do que em outros tipos de células estudados com relação à expressão de TIGIT em células CD4+CD45RA+ nativas (figura 10B). Toda a ativação com anti-CD3 e anti-CD8, TIGIT foi expresso em superfície de células foi regulado ascendentemente tanto nas populações nativas como de células T da memória, como mostrado nas figuras 10A-1 e 10A-2. Células da memória CD4+CD45RO+ tiveram níveis significativamente mais altos de expressão em 24 e 48 horas pós-ativação como comparado a células CD4+CD45RA+ nativas (figuras 10A-1 e 10A-2). As células da memória CD4+CD45RO+ expressaram 5,3 vezes mais mRNA de TIGIT no dia 1 do que no dia 0, enquanto as células nativas somente aumentaram a expressão de TIGIT 1,4 vezes com relação ao dia 0 (figura 10C). A expressão de TIGIT não foi detectável pelo dia 6.

[0355] A estabilidade da expressão de TIGIT em células T também foi avaliada. Resumidamente, as células CD4+CD45RO+ foram isoladas e ativadas com anti-CD3/anti-CD8 durante um dia. As células foram classificadas por fluxo por FACS para as populações CD+ e CD4+TIGIT+. Após repousarem durante cindo dias pós-classificação, as células foram re- estimuladas com anti-CD3/anti-CD8 durante até três dias e a expressão de TIGIT na superfície das células foi determinada por FACS. Em uma experiência separada, células TIGIT+ e células CD4+ classificadas foram depositadas em placa em uma densidade de 2 x 105células/reservatório sobre placas de 96 reservatórios revestidos com várias concentrações de anti-CD3 (0-0,8 μg/ml), volume de 100 μL e cultivadas durante 4 dias sob condições padrão. 3H- timidina foi adicionada durante as 18 horas finais de incubação, seguido por lavagem. Ao fim de 4 dias, as células foram solubilizadas e a radioatividade associada com cada amostra foi medida por contagem de cintilação. Como mostrado nas figuras 12A e 12B, a expressão de TIGIT foi induzida em ambas as células de TIGIT+ e células TIGIT-, indicando que as células TIGIT- podem expressar TIGIT sob certas circunstâncias e que as células TIGIT+ não são uma população de células fixa.

[0356] Dado o alto nível de expressão de TIGIT sobre células da memória efetoras, a expressão em subconjuntos de células T foi ainda dissecada. Dado que as moléculas co-estimuladoras ou co-inibidoras expressas sobre células efetoras ativadas/células T de memória são muitas vezes expressas em Tregs induzidas, a expressão de TIGIT em Tregs foi avaliada. Tregs são definidas fenotipicamente como células CD25hi e é sabido que expressam o fator de transcrição FoxP3 Fontenot, J.D. et al., Immunity 22, 329-41 (2005)). Em camundongos, o fator de transcrição FoxP3 é usado para co-definir populações de Treg (Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992)). No entanto, esta associação não é mantida em células T humanas, uma vez que todas as células T humanas ativadas expressam FoxP3 (Ziegler SF., Eur J Immunol. 37(1): 21-3 (2007))). Células CD4+CD25hi recentemente isoladas expressaram TIGIT, enquanto células CD25- foram negativas para expressão de TIGIT na superfície de células (figura R(D)). As células T TIGIT+também co- expressaram FoxP3 e GITR (figuras 9 e 10E). A ativação de células CD25+ classificadas em uma regulação ascendente da expressão da proteína TIGIT (figura 10F) e um aumento de 6,5 vezes nos níveis de mRNA (figuras 10C e 10F). O aumento em mRNA de TIGIT foi equivalente em células T da memória e Treg.

[0357] A comparação dos níveis de mRNA de células imunes classificadas diretamente ex vivo de PBMC doador mostrou que células Tregs CD4+CD25hi, CD4+CD45RO+, e NK, cada uma, tiveram expressão de TIGIT significativa, com Tregs demonstrando a maior expressão (figura 10C). A expressão de TIGIT não foi observada em células B em repouso ou ativadas ou em monócitos (figura 10C e dados não mostrados). Notavelmente, CD226, outro co-receptor para PVR, não foi regulado em células Tregs, CD4+CD25hi, sugerindo papéis reguladores divergentes de TIGIT versus CD226 (figura 1).

[0358] Em outras experiências, a expressão de TIGIT em células T (THf) tonsilares humanas foi examinada usando citometria de fluxo, seguida por protocolos padrão como descrito acima, com a exceção de que para os ensaios envolvendo FoxP3, as células foram coloridas com anticorpos após o protocolo acima, seguido por fixação e permeabilização das células e coloração com anti-FoxP3 ou IgG de controle. A expressão de TIGIT correlacionou com altos de níveis de co-expressão de CXCR5 e ICOS em células T, marcadores que são tipicamente observados em células TFH (figura 8A). Em contraste, a expressão de CD226 (DNAM) nestas células foi baixa a não existente (figura 8A). Altos níveis de expressão de TIGIT foram também observados em células Th produzindo CD4+CCR4+CCR6+ IL-17 (figura 14). No todo, TIGIT não mostrou ser expresso por células T reguladoras em repouso e ativadas, células Tfh tonsilares humanas, células T auxiliares produzindo IL-17, células efetoras em repouso e ativadas/células T da memória auxiliares (células CD4+CD45RO+) e células NK, e pode ser ainda regulado ascendentemente quando da ativação destas células. Células CD8+também expressam TIGIT e esta expressão é somente levemente reguladas ascendentemente na ativação das células. CD266 é mostrado no presente e é conhecido na arte ser expresso por células T CD8+, em células CD45RA+, mastócitos, plaquetas, células exterminadoras naturais (NK), células T CD4+CD45RO+. TIGIT é especificamente expresso em Treg e TFh e células CD4+CD45RO+; enquanto CD226 não é expresso nestas células.

(B) EXPRESSÃO DE TIGIT E PVR EM DOENÇAS HUMANAS

[0359] Tendo determinado que TIGIT é altamente expressado em populações selecionadas de células imunes, os níveis de expressão de TIGIT, PVR e CD226 foram em seguida avaliados em tecidos de diferentes estados de doença relacionados à imunidade, incluindo psoríase, doença intestinal inflamatória, artrite, asma e câncer. Um sistema baseado em microarranjo foi usado para os estudos, e a descrição do protocolo de microarranjos apropriado pode ser encontrada na literatura, por exemplo, na publicação de patente US20080038264, incorporada ao presente por referência. Como mostrado na figura 15, a expressão significativa de TIGIT foi observada em tecido sinovial humano inflamado com relação a tecido não inflamado, particularmente notável no caso de tecido de artrite reumatóide. Nas amostras de tecido de artrite inflamado, a expressão de TIGIT foi correlacionada principalmente com células T como oposto a macrófagos ou fibroblastos (ver figura 15, painel direito). Estes dados foram ainda confirmados em modelos de artrite induzida por colágeno em murino (CIA) por análises RT-PCR dos níveis de mRNA de TIGIT (ver figura 16). No modelo CIA usado no presente, camundongos DBA-1J foram imunizados com 100 μg de colágeno bovino do tipo II em 100 μL de Adjuvante de Freund Completo (CFA) no dia 0 e dia 21 intradermicamente. O RNA foi extraído das juntas das patas traseiras no dias 28, 30 e 40 e avaliados para a expressão de TIGIT e CD226 como descrito acima. Como visto na figura 16, expressão de TIGIT aumentada foi observada no dia 40, enquanto a expressão de CD226 foi significativamente regulada descentemente no dia 40.

[0360] Aumentos menores na expressão de TIGIT com relação a tecidos normais foram observados em amostras de tecido de psoríase e amostras de tecido de doença intestinal inflamatória. Análises similares em amostras de tecido de asma de macacos rhesus mostraram que a expressão de TIGIT é significativamente elevada no tecido doente como comparado a tecido de controle normal (figura 17). Amostras de câncer de mama também demonstraram expressão grandemente aumentada de TIGIT com relação a tecido de mama normal, com quantidades variadas nos diferentes tipos de tecido de câncer de mama. Como mostrado no painel superior da figura 18B, a maior expressão de TIGIT é observada em amostras de tumor com a percentagem mais baixa de células de tumor, sugerindo que a expressão de TIGIT está correlacionada com outras células infiltrando o tumor em vez de com as células de tumor propriamente ditas. O painel inferior da figura 18A indica que as células CD4+ são aumentadas nas amostras de tumor tendo baixas percentagens de células de tumor. Pelos dados apresentados no presente com respeito à expressão de TIGIT em Treg e outros subconjuntos de células T, os altos níveis observados de expressão de TIGIT nas amostras de tumor de mama com a percentagem mais baixa de células de tumor sugerem que TIGIT está sendo expresso por infiltrados de tumor de células imunes, mas provalmente infiltrados de Treg. A correlação da expressão de TIGIT com células T em amostras de câncer de mama sugere que TIGIT pode desempenhar um papel na regulação de tumores. Por exemplo, um tumor pode evadir a resposta imune do hospedeiro recrutando/ativando Treg TIGIT+.

EXEMPLO 4: PAPEL DE TIGIT NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T

[0361] Dado os altos níveis de expressão de TIGIT por células T da memória e Treg mostrados acima, e a expressão de PVR conhecida em células dendríticas (Pende, D. et al., Blood 107, 2030-6 (2006), a possibilidade de que TIGIT possa modificar a função de DC e realizar a ativação de células T foi investigada.

(A) FUNÇÃO DE TIGIT NA MODULAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T

[0362] O efeito de TIGIT-Fc em um ensaio de proliferação da reação de linfócito misturado (MLR) foi avaliado usando DCs derivados de monócitos maduros com TNFa. Resumidamente, os monócitos foram isolados por seleção negativa de PBMC total humano (Miltenyi Biotec). DCs derivados de monócitos imaturos foram gerados incubando os monócitos (3 x 105 células/ml) em meio RPMI 1640 completo contendo 10% de FBS, penicilina e estreptomicina, suplementado com IL-4 recombinante humano (125 ng/ml, R&D Biosystems) em uma atmosfera umidificada a 37oC, 5% de CO2 durante 5 dias. GM-CSF e IL-4 foram adicionados novamente no dia 2 e no dia 4 com meio RPMI 1640 completo novo. Após cinco dias de cultura, mais de 90% das células demonstraram um fenótipo de DC imaturo (CD14-, MHC classe II+, CD80+, CD86+ e CD83baixo) como verificado por análises FACS. Estes DCs imaturos foram usados no presente para tratamento com LPS, CD40L, TNFa, Pam3CSK4 e TSLP e as proteínas de fusão indicadas para induzir sua maturação. Análise fenotípica de MDDCs e de linhagens de células foi realizada por imunofluorescência. Os anticorpos monoclonais usados para colorir as superfícies de células incluíram anti-CD83 marcado com PE, FITC- HLA-DR, PE-anti-CD86, e FITC-anti-CD80. Todas as incubações foram realizadas na presença de 10% de soro de AB humano para prevenir a ligação através da porção Fc dos anticorpos de fusão. Estudos do inibidor foram realizados por pré-incubação das moléculas indicadas com 10 μM de um inibidor MEK1 (PD98059), 1 μg/ml de anticorpo anti-IL-10, 10 μg/ml de anticorpo anti-CD32 ou 10 μg/ml de anticorpo anti-TIGIT antes do estímulo com TNFα (0,1 μg/ml). O solvente DMSO ou IgG humano foi usado como um controle. Os sobrenadantes de cultura de células foram coletados após 16 horas e ensaiados para a produção de IL-12 p40 por ELISA.

[0363] O efeito de bloquear o anticorpo 10A7 anti-TIGIT na proliferação e ativação de células T foi avaliado. Nenhum efeito foi observado quando da incubação de células T CD4+ CD45RO+ ativadas com anti-CD3 com 10A7. Quando as células T foram cultivadas com anti-CD3 junto com CD11c+DC autólogo, a proliferação de células T aumentou duas vezes (p<0,01) e a produção de IFNy aumentou 4 vezes (p<0,001) (figura 19C). Esta exacerbação da atividade de células T foi observada em um grau menor em PBMC total. Em contraste, a ativação de células T inibiu significativamente TIGIT-Fc (p<0,01) e a produção de IFNy (p<0,001 > na presença de CD11 c+ DC (figura 19D). Quando PBMC total foram ativados com anti-CD3, TIGIT-Fc teve um efeito mais branco do que o observado na experiência anterior, sugerindo que a quantidade de PVR presente nas células pode ser importante para a atividade. Nenhum efeito foi observado em células T sozinhas, como esperado, dado que TIGIT não se liga a tais células. Verificou-se que o tratamento do anticorpo anti-TIGIT também bloqueia a supressão de Treg de proliferação de células T somente na presença de APC. Verificou-se ainda que TGIT-Fc regula a função da célula CD11c+ e inibe a proliferação de células nativas em ensaios em trans-reservatórios, indicando que as modificações observadas no comportamento celular e a proliferação foram especificamente devido à ligação de TIGIT. Tomados juntos, estes dados sugeriram que TIGIT regula a ativação de células T através da interação com um ligando em APC, mais provavelmente PVR.

[0364] Tanto iMDDC como MCCD maduro de TNFα, expressaram PVR da superfície, com o MDDC expressando os níveis mais altos de PVR do que iMDDC (figura 19A). MDDC maduro de TNFα também aumentaram a proliferação de células T sobre iMDDC não estimulado (figura 19B). Nos ensaios de MLR, a adição de TIGIT-Fc resultou em um decréscimo significativo ainda modesto na proliferação, enquanto TIGIT-Fc adicionado a MDDC maduro de TNFα reduziu a proliferação aos níveis da linha de base. A inibição da proliferação induzida por TIGIT foi prevenida de outra oclusão do anticorpo 10A7 anti-TIGIT ou anticorpo TX21 anti-PVR. Os níveis de IL-10 secretados medidos no dia 3 foram significativamente maiores nas culturas contendo TIGIT-Fc do que os contendo o controle de isótipo (45 ± 5 pg/ml versus 29 ± 8 pg/ml, respectivamente, com um p=0,04). A inclusão do anticorpo anti-TIGIT ou do anticorpo anti-PVR também bloqueou o aumento induzido por TIGIT-Fc em IL-10 secretado (dados não mostrados). Os níveis de IFNy foram reduzidos por tratamento dom TIGIT-Fc (dados não mostrados). Tomados juntos, estes dados sugerem que TIGIT modula a ativação de células T.

[0365] Para examinar o efeito de células T TIGIT+ na proliferação de células T TIGIT- em co-cultura, outros ensaios de MLR foram realizados. Resumidamente, células T CD4+CD45RO+ foram isoladas de PBMC humanos e ativadas durante cinco dias. No dia seis, as células foram re-estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 durante a noite e células TIGIT+ foram classificadas separadamente de células TIGIT- por FACS. Células TIGIT foram marcadas com CFSE e misturadas em uma relação de 10:1 com células CD11c+ isoladas de um segundo doador com ou sem o mesmo número de células TIGIT+ em cultura. Os sobrenadantes da cultura foram coletados no dia sete para análise luminex da produção de citocina (IFNy ou IL-17). A proliferação de células foi analisada por FACS, fechando para células vivas CFSE+, no dia oito. Os resultados são mostrados nas figuras 20A e 20B. Como mostrado na figura 20A, células T TIGIT+ expressaram níveis mais baixos de IFNy e de IL-17 do que as células T de TIGIT-. Quando as células T de TIGIT+ foram examinadas com células T TIGIT-, a cultura resultante diminuiu significativamente na produção destas duas citocinas, indicando que células T TIGIT+ inibem células T de TIGIT- destas duas citocinas.As células TIGIT+ também inibiram a proliferação de células T de TIGIT- (figura 20B). Isto ainda suporta a idéia de que as células TIGIT+ são naturalmente células reguladoras e podem agir sobre células CD4+ para inibir sua resposta tanto diretamente através da secreção de citocinas inibidoras como indiretamente através do comprometimento de PVR sobre as células apresentadoras de antígeno.

[0366] Baseado na observação no exemplo 3(A) de que as células Treg CD4+CD25hi em particular expressam altamente TIGIT, foram realizados ensaios para examinar a capacidade do subconjunto de células T Treg inibir a proliferação de outras células imunes. Resumidamente, as células Treg CD4+CD25hi foram isoladas da crosta inflamatória com um kit MACS (Miltenyi) seguindo as instruções do fabricante. As células CD4+CD25- também foram preparadas como as células T efetoras para serem usadas no ensaio. Populações de células (APC) apresentando antígenos foram isoladas por métodos padrão, irradiando PBMC que foi anteriormente esgotado em células T usando microglóbulos (Miltenyi). Treg isolado, células T efetoras e APC foram misturadas juntos em uma proporção de 1:4:4 e incubadas com 0,5 μg/ml solúvel anti-CD3. As misturas de células foram depositadas em placas em reservatórios revestidos com 10 μg/ml tanto de anticorpo 10A7 anti-TIGIT ou um IgG de controle e cultivadas durante quadro dias com [3H]-timidina adicionada durante as 18 horas finais de incubação. As células de cada reservatório foram solubilizadas e a quantidade de radioatividade em cada amostra de célula foi quantificada. Os valores de proliferação percentuais indicados foram calculados com relação à quantidade de radioatividade observada nas células efetoras na ausência de células Treg. Os resultados são mostrados na figura 21A. Nos reservatórios revestidos com o IgG de controle, aproximadamente 55% de proliferação de células foram observados, em consonância com a descoberta experimental acima de que células T TIGIT+ inibiram a proliferação de células T TIGIT-. A inclusão de um anticorpo anti- TIGIT nos reservatórios aumentou significativamente a proliferação observada, confirmando que TIGIT media o efeito supressor. Esta evidência sugere ainda que Treg TIGIT+ pode agir como reguladores negativos da proliferação e função de células imunes. De fato, Treg CD4+CD25hiTIGIT+ Treg e Treg CD4+CD25hiTIGIT- foram isolados e examinados separadamente para sua capacidade de suprimir a proliferação de células nativas, verificou-se que Treg TIGIT foram mais potentes na supressão de proliferação de células T nativas do que Treg TIGIT-. Resumidamente, TIGIT+ e Treg TIGIT- foram isoladas por FACS. As células CD11c+ foram selecionadas positivamente usando CD11c- PE (BD Biosciences) e microglóbulos anti-PE (MACS).Células T nativas foram depositadas em placa em placa de 96 reservatórios de fundo em U a uma densidade de 4 x 105, junto com 2 x 105 Treg e 0,8 x 105 de células apresentadoras de o antígeno CD11c+. Como mostrado na figura 21B, Tregs de TIGIT+ foram quase duas vezes tão potentes na supressão da proliferação de células T nativas como foram Treg TIGIT-, suportando ainda a descoberta de que Treg TIGIT+ pode agir como reguladores negativos da proliferação e da função de células imunes.

B. ELIMINAÇÃO DE TIGIT

[0367] Usando a linhagem de células estáveis expressando TIGIT etiquetado com gD (células 293-TIGIT) construída acima, verificou-se que estas células não demonstram fosforilação de TIGIT em interação com PVR exógeno, anticorpo 10A7 anti-TIGIT reticulado, ou com tratamento com pervanadato. Adicionalmente, o tratamento destas células com 10A7 resultou em nenhum efeito significativo sobre a sinalização de TCR. Estes dados sugeriram que tanto os motivos ITIM no TIGIT expresso nas células construídas não foram funcionais como que a linhagem de células estáveis era desprovida de um ou mais componentes necessários para a ativação de TIGIT.

[0368] Para ainda elucidar as funções intrínsecas das células, estudos de RNA inibidor (RNAi) foram realizados. siRNAs específicos do gene On-Targetplus e siRNA de controle negativo foram obtidos de Dharmacon RNAi Technology. Células T CD45RO+ humanas foram purificadas de crosta inflamatória com um kit MACS™ (Miltenyi Biotec) e marcadas com CFSE. siRNAs (siRNAcontrole ou siRNATIGIT) foram transfectados com a tecnologia Nucleofector™ (Amaxxa) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 horas, as células transfectadas foram ativadas com anti-CD3 (5 μg/ml) ligado à placa, sozinhas ou mais 2 μg/ml de anti-CD28 solúvel. Algumas células foram coletadas no dia 2 ou no dia 5 após ativação para análise RT-PCR (qRT-PCR) ou FACS. A proliferação de células T foi determinada por FACS no dia 5, como descrito acima, qRT-PCR foi realizado como descrito acima no exemplo 3(A), e os de mRNA de RPL-19 em cada amostra foram usados como controles internos. Os iniciadores de TIGIT são dados abaixo; os iniciadores de CTLA4 e CD226 humanos e os problemas foram obtidos de Applied Biosystems. As sequências de iniciador e de sonda usadas para detectar espécies diferentes de IL- 12 e IL-10 de murino foram como a seguir: mIL-12p40: iniciador dianteiro:

[0369] 5’- ACATCTACCGAAGTCCAATGCA-3’ (SEQ ID NO: 55); iniciador reverso: 5’-GGAATTGTAATAGCGATCCTGAGC-3’ (SEQ ID NO: 56); sonda: 5’-TGCACGCAGACATTCCCGCCT-3’ (SEQ ID NO: 57); mIL-12p35: iniciador dianteiro: 5’-TCTGAATCATAATGGCGAGACT-3’ (SEQ ID NO: 58); iniciador reverso: 5’-TCACTCTGTAAGGGTCTGCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 59); sonda: 5’-TGCGCCAGAAACCTCCTGTGG-3’ (SEQ ID NO: 60); mIL-10: iniciador dianteiro: 5’-TGAGTTCAGAGCTCCTAAGAGAGT-3’ (SEQ ID NO: 61); iniciador reverso: 5’-AAAGGATCTCCCTGGTTT

[0370] CTC-3’ (SEQ ID NO: 62); sonda: 5’- TCCCAAGACCCATGAGTTTCTTCACA-3’ (SEQ ID NO: 63).

[0371] RNAi específico para TIGIT foram empregados para eliminar especificamente a expressão de TIGIT em células T CD45RO+ humanas primárias, que expressam normalmente altos níveis de TIGIT (figuras 10A-1 a 10A-2). A eficácia de eliminação TIGIT usando este método foi avaliada por análises qRT-PCR e FACS (figuras 28A, 28B e tabela 7). No segundo dia de tratamento, a transcrição de TIGIT foi reduzida em >90% pelo tratamento com siRNATIGIT como comparado a um siRNAcontrole revolvido, enquanto mRNA de CTLA4 (uma proteína de controle) não foi alterado pelo tratamento. A redução em mRNA de TIGIT resultou em um decréscimo de TIGIT na superfície das células de uma média de 25% a <2% das células T (figura 28B). No dia 5, a expressão de TIGIT nestas mesmas células foi reduzido em 70% como comparado à expressão nas células de controle (figura 28A e 28B e tabela 7). A eliminação de TIGIT não teve nenhum efeito significativo sobre a proliferação de células T em resposta a anti-CD3 (tanto nas concentrações subótimas como ótimas) ou a anti-CD3 mais anti-CD28 (figura 28C). Similarmente, a eliminação de TIGIT também não teve nenhum efeito observado sobre a produção de citocinas IL-2, IL-4, IL-10 ou IFN-y (figura 28E). Além disso, o tratamento das células com o anticorpo 10A7 anti-TIGIT não teve nenhum efeito observado sobre a ativação de células T expressando TIGIT sob as mesmas condições como descrito acima (figura 28D). TABELA 7: EFICÁCIA DA ELIMINAÇÃO DE RNAI DE TIGIT

Valores de CT são dados como o valor CT + desvio padrão para TIGIT ou ctla4.

EXEMPLO 5: EFEITO DE TIGIT NA PRODUÇÃO DE CITOCINA

[0372] Para determinar se TIGIT tem um efeito direto sobre DCs salvo o efeito geral descrito acima sobre a maturação de células T, a maturação e a função de DC na presença e ausência de TIGIT-Fc foi avaliada. O resultado no exemplo 4 com respeito à capacidade de TIGIT para modular a produção de IFNy e IL-17 e, populações de células T misturadas sugeriu que outros estudos da produção de citocina por DC tratado com TIGIT-Fc deveriam ser realizados. Células T não tratadas foram purificadas pela seleção negativa (kit de isolamento de células T CD4, Miltenyi Biotec) em uma pureza de >95%. As células foram recolocadas em suspensão em meio RPMI 1640 completo por suplementos nutricionais padrão. Células T alogênicas (2x105 foram cultivadas na ausência (meio sozinho) ou presença de iMDDCs e MDDCs, na proporção indicada em μplacas (microplacas) de fundo em U de 96 reservatórios em 200 μL do meio por reservatório. As células foram cultivadas durante 72 horas seguidas por um pulso de 18 horas com μCi (0,037 MBq) de [3H] timidina (Amersham). As células foram transferidas para uma placa de 96 Unifiltros GF/C usando um coletor de células e a incorporação de [3H] timidina foi medida em fluido de cintilação usando um contador de cintilação (Canberra Packard Ltd.). Todas as determinações foram realizadas em triplicata. A produção de citocina por iMDDCs foi analisada em sobrenadantes coletados no dia 5 da cultura e armazenados a -80oC. Os mesmos MDDCs foram maturados na presença ou ausência de estímulos indicados durante 24 horas na presença ou ausência de TIGIT-Fc ou TIGIT-Fc-DNA. Após 48 horas de estímulo, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -80oC. As concentrações de citocina foram medidas por ELISA (R&&D Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, ou usando glóbulos imobilizados por anticorpo LINCOplex (LINCO Research) com detecção por um instrumento Luminex 100 (Luminex) de acordo com as instruções do fabricante.

[0373] Quando TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA ou CD226-Fc foram adicionados a iMDDC durante maturação com TNFα ou CD40L solúvel, a produção de IL-12/23p40 e a produção de L-12p70 foram significativamente reduzidas, como comparado a tratamento com controle combinado com isótipo (p=0,007 e p=0,03, respectivamente), a níveis comparáveis para iMDDC (figuras 22A-1 a 22A-3). Inversamente, IL-10 secretado foi aumentado por tratamento com TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA ou CD226-Fc com relação a tratamento com o controle combinado de isótipo (p=0,027 e p=0,18, respectivamente) (figuras 22A-1 a 22A-3). A secreção de TGBβ também foi aumentada em iMDDC em resposta a tratamento com TIGIT-Fe (ver figura 22D). TIGIT-Fc, no entanto, não afetou a capacidade de iMDDC maturar em MDCC, uma vez que CD80, CD86, CD83 e HLA-DR foram equivalentemente regulados ascendentemente em culturas de controle de isótipo (figura 22B). Notavelmente, a interação de TIGIT-PVR não induziu diretamente a maturação de DC.

[0374] O efeito de TIGIT-Fcm TIGIT-Fc-DANA e CD226-Fe sobre as vias de maturação de DC mediadas por TLR também foi examinado. O tratamento com cada uma das três proteínas Fc demonstrou aumento similar, embora menos robusto, da produção de IL-10 a partir de LPS (MDDC maturado com TLR4 (p<0,01>, um decréscimo em IL-12/23p40 (p=0,07 a 0,18) e decréscimo significativo na produção de IL-12p70 (p<0,05 para todas as proteínas de fusão) (ver figuras 22A-1 a 22A-3), e não teve nenhum efeito sobre a via de maturação de TLR2. Esta modulação da produção de IL-10 e IL- 12p40 por tratamento de DC com TIGIT foi similar se TIGIT-Fc foi adicionado a monócitos durante diferenciação com GM-CSF e IL-4, ou quando somente adicionado durante a fase de maturação (dados não mostrados). Os efeitos de TIGIT-Fc sobre a produção de IL-10 e IL-12p40 em iMDDC não passando por maturação foram modestos, mas uma vez que os níveis observados destas citocinas em iMDDC foram baixos, estatisticamente os efeitos significativos podem ter sido difíceis de detectar (figura 22B)m CD226 funcionou similarmente para TIGIT nestes ensaios, suportando um papel para PVR em MDDC. Dado que CD226 tem um motivo ITAM e pode agir para aprimorar os sinais de TCR (Dalhardon ET al, J. Immunol. 175: 1558-1565 (2005), o grau de expressão de TIGIT e/ou CD226 em subconjuntos diferentes pode contribuir para a regulação diferencial de respostas inflamatórias locais in vivo (figura 10, figura 29).

[0375] Os níveis de produção de outras citocinas pró-inflamatórias por DC tratado com TIGIT-Fc também foram determinados. Ambas as produções de IL-6 e de IL-18 foram significativamente reduzidas por tratamento com TIGIT-Fc em todas as populações de MDDC maturado. IL-12p40 é uma subunidade conhecida tanto de IL-12p70 como de IL-23, assim os níveis de produção de ambas as citocinas foram medidos em culturas de MDDC tratadas com TIGIT-Fc. Comparado a culturas de controle, o tratamento com TIGIT-Fc resultou em uma produção significativamente diminuída de IL-12p70 por MDDC maturado com INFα ou CD40L (figura 22C). Os níveis de IL-23 foram relativamente baixos e apenas detectáveis sob as condições de ensaio. TIGIT- Fc reduziu tanto IL-16 como IL-18 sob todas as condições de MDDC maturado, mas devido à variabilidade de doador a redução observada não foi estatisticamente significativa.

[0376] Para avaliar se o efeito observado de TIGIT-Fc requereu reticulação de PVR, uma versão alterada de Fc de TIGIT-Fc em que a ligação de FcyR foi completamente abolida (TIGIT-Fc-DANA, descrito no exemplo 1) foi usada. Como mostrado nas figuras 22A-1 a 22A-3, tanto TIGIT-Fc como TIGIT- Fc-DANA inibiram igualmente e significativamente IL-12p40 e aprimoraram a produção de IL-10 a partir de DC maturado com TNFα. Este resultado indicou que a inclinação de citocina pela proteína de fusão de TIGIT não dependeu de reticulação mediada por Fc.

[0377] A capacidade de TIGIT modificar a produção de citocina padrão a partir de DC não foi observada sob todas as condições de maturação in vitro. O efeito foi mais pronunciado em TNFα, CD40L solúvel e nas vias de maturação induzida por LPS (TLR4), enquanto que a maturação mediada por TLR2 permaneceu não afetada. É mostrado que LPS e Pam3CSK4 ativam ERK e p38 em várias extensões: LPS ativa principalmente p38 e o tratamento com Pam3CSK4 resulta na alta atividade de cinase ERK. Assim não é surpreendente que o tratamento com TIGIT-Fc de DC maturado com Pam3CSK4 mostrasse pouco efeito (ver figuras 22A-1 a 22A-3). A capacidade diferencial destes e de outros estímulos tais como TNFα e CD40L para regular as vias de ERK/p38 é significativa na determinação do resultado da função de MDDC. DC não somente demonstra expandir Tregs, mas DC também pode romper a tolerância a Treg e induzir a ativação e a produção de IL-2 (Fehervari, Z. & Sakaguchi, Curr Opin Immunol 16, 203-8 (2004)). A capacidade de TIGIT modificar DC sob as mesmas condições de maturação, mas não outras, sugere que a modulação de TIGIT é um método pelo qual Treg e células T ativadas podem ajustar a função de DC.

[0378] Estudos da função de TIGIT também foram realizados em um modelo de camundongo desprovido de células B e T, mas que tem macrófagos e células dendríticas (camundongo sci). Resumidamente, camundongos CD17/SCID (6-8 semanas de idade) foram tratados uma vez intravenosamente com 200 μg de TIGIT.Fc, TIGIT.DNA, ou um anticorpo anti-erva. O anticorpo monoclonal anti-CD40 ou controle de isótipo (200 μg/camundongos) foi administrado seis horas depois. O soro foi coletado 16 horas depois para analisar os níveis de IL-10, MCP-1, IL-12p40 e IL-12p70 por ensaio ELISA. A administração de TIGIT-Fc ou TIGIT-Fc-DANA em camundongos sci estimulou IL-10, e a produção de IL-12p40, e a produção de IL- 12p70 diminuiu (figuras 13A-C). Esta descoberta foi consistente com os dados in vitro acima, e sugere que TIGIT não requer células B ou T para exercer seus efeitos moduladores de citocina.

[0379] A partir dos exemplos precedentes, a expressão de TIGIT foi restrita a células T e células NK, com a expressão mais alta encontrada em Tregs. CD226, o ligando de baixa afinidade para PVR, não é expresso em Tregs, apesar da expressão sobre células T ativadas (Abbas, A.R. et al., Genes Immun 6, 319-31 (2005); Dardalhon, V. et al., J Immunol 175, 1558-65 (2005)). Embora o equilíbrio de TIGIT e CD226 in vivo permanece para ser determinada, a afinidade mais alta de TIGIT para PVR sugere que ele desempenha um papel dominante quando ambos são co-expressados. Tomados juntos, a alta expressão de TIGIT em células T ativadas e Treg e a interação de TIGIT com PVR para induzir IL-10 e para inibir a liberação de citocinas pró-inflamatórias de DC madura sugere que TIGIT fornece um mecanismo de realimentação para regular descendentemente a resposta imune.

EXEMPLO 6: EFEITO DE TIGIT SOBRE A SINALIZAÇÃO DE PVR

[0380] Uma vez que a via de sinalização de MAPK é importante na regulação da via de IL-10 (Xia, C.Q. & Kao, K.J., Scand J Immunol 58, 23-32 (2003)), a atividade de vários membros da via de MAPK foi avaliada em MDDC tratado com TIGIT. CHO-PVR foram privados de alimento no soro durante três horas, então tratados com 50 μg/ml de TIGIT-Fc ou não tratados durante 15 minutos a 37oC. As células foram homogeneizadas e as proteínas de membrana foram extraídas usando um Plasma Membrane Extraction Kit (Bio Vision) e submetidas a eletroforese de gel poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) sob condições de não redução, seguido por transferência para membranas de nitrocelulose (BioRad). As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA em 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20, e então sondadas com anti-fosfotirosina-HRP (BD Bioscience), extraídas com Restore Buffer (Pierce) e re-sondadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-PVR (R&D Systems). No dia 5 iMDDCs foram tratados com 10 μg/ml de TIGIT-Fc ou IgG humano de controle durante o período de tempo indicado, a 37oC. Os lisados de células totais foram preparados em tampão RIPA e submetidos a SDS-PAGE sob condições de redução e transferidos para a membrana de difluoreto de polivinilideno Immobilon (PVDF, Millipore). Após bloquear com 1% BSA em 50 mM de Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20, seguido por detecção de proteína quimioluminescente. Para re-sondagem, as membranas foram incubadas em tampão de extração (62,5 mM Tris-HCl pH 6,7, 100 mM β-mercaptoetanol, 2% de SDS) durante 30 minutos a 50°C com agitação ocasional. A detecção de fosfotirosina, fosfor-p38MAPK e fosfor-ERK foi realizada usando anticorpos policlonais específicos para anti-fosfotirosina (Upstate), anti-fosfo-p38MAPK (Cell Signaling Technology), e um anti-fosfo-p44/42 MAPK monoclonal (Cell Signaling Technology). Como um controle para carregamento de proteína, os blots foram re-sondados com anti-soro policlonal contra ERK (Cell Signaling Technology) ou β-actina (NeoMarkers), β-catenina (BD Pharmingen) ou β- catenina ativa (Upstate).

[0381] Os dados mostrados na figura 23A demonstram que PVR é fosforilado quando em ligação a TIGIT (comparar a banda de tirosina fosforilada esmaecida observada em células tratadas com TIGIT versus controle de combinação de isótipos, enquanto quantidades totais de PVR permaneceram constantes como indicado pelas bandas equivalentemente pretas na porção superior da figura). Isto sugeriu que a ligação de TIGIT inicia uma função de sinalização mediada por PVR.

[0382] A fosforilação aumentada do dímero pERK (91 KD), mas não o monômero (42KD) foi observada em iMDDC tratado com TIGIT-Fc e TIGIT-Fc-DANA (figura 23B). Em contraste, a atividade de p38 não foi afetada (figura 23B). Um informe recente sugeriu que o estímulo de E-cadherina e a indução de β-catenina ativa fez com que DC derivada da medula óssea de murino amadurecesse em DC tolerogênica capaz de inibir respostas imunes in vivo (Jiang, A. et al., Immunity 27, 610-24 (2007)). No presente, quando MDDCs humano foram tratados com TIGIT-Fc, a forma ativa da via de β- catenina foi induzida, um efeito não observado com o controle combinado de isótipo (figura 23C).

[0383] Estes resultados sugeriram que TIGIT, através de sua interação com PVR, modula a atividade de ERK e, assim, a produção de citocina por MDDC. Para confirmar esta observação, um inibidor específico de cinase ERK foi adicionado junto com TIGIT-Fc a culturas de MDDC, e os níveis de IL-12 secretado destas culturas foram determinados. A regulação descendente da produção de IL-12p40 mediada por TIGIT-Fc foi revertida na presença do inibidor de ERK (figura 24A). Um efeito similar foi observado quando um anticorpo anti-IL-10 neutralizante foi incluído na cultura (ver a figura 24B). A produção de citocina modulada com TIGIT a partir de MDDC também foi bloqueada pelo anticorpo 10A7 anti-TIGIT ou um anticorpo anti-PVR de bloqueio (figura 24B). Juntos, estes resultados indicaram que a ligação de TIGIT-PVR afeta a atividade de cinase ERK e aumenta a proporção da produção de citocina IL-10/IL-12 em DC com relação a outras citocinas produzidas.

EXEMPLO 7: IMPACTO DE MDCC MODULADO COM TIGIT SOBRE CÉLULA T

[0384] Para determinar se o efeito de TIGIT sobre a produção de citocina DC teve consequências funcionais, experiências foram realizadas para avaliar o efeito da modulação de MDDC com TIGIT sobre proliferação de células T e produção de citocina. MDDCs tratados com TIGIT-Fe (maturado tanto com TNFa como com sCD40L) foram cultivados com células T em uma resposta de MLR como descrito acima, e o efeito sobre células T foi monitorado. A proliferação de células T foi inibida por uma média de 50% (p<0,05) quando culturas contendo DC modificadas com TIGIT foram comparadas com DC de controle (figura 25A). Adicionalmente, os níveis de IL-2 nas culturas foram reduzidos duas vezes (p<0,01) (figura 25B). Estes dados correlacionam-se com um decréscimo em IL-12 e aumento na produção de IL- 10 em DC testadas com TIGIT, como descrito nos exemplos precedentes. No todo, MDDCs modulados com TIGIT inibiram células T, que sugere que TIGIT pode regular as capacidades funcionais de DC uma vez que D são completamente maturadas. Notavelmente, a adição de TIGIT-Fc a MDDC em culturas de células T inibiu a proliferação de células T, que indica que TIGIT-Fc não precisa estar presente no início da maturação de DC para modificar DC.

[0385] O impacto do tratamento com TIGIT sobre a expressão de outras moléculas de superfície de células em MDDC humano ativado também foi investigado. Sabe-se que a expressão de certos receptores de transcritos como imunoglobulina (ILT) sobre DC é modulada em resposta à ativação destas células (Velten et al., Eur. J. Immunol. 34: 2800-2811 (2004); Ju et al., Gene 331: 1590164 (2004)). Por exemplo, a expressão dos receptores de ILT2 e ILT3 é regulada descendentemente em DC ativadas com DNA-CPG, e a expressão de ILT2, ILT3, ILT4 e ILT5 é regulada ascendentemente em DC induzidas com IL-10. Dado que TIGIT estimula a produção de IL-10 em DC, o impacto de TIGIT sobre a expressão de ILT em DC ativadas foi examinado. iMDDCs foram isolados como descrito acima. Certas populações de iMDDC foram ativadas com TNF ou CD40L, e também tratadas com TIGIT-Fe ou um controle combinado de isótipos. As células tratadas foram classificadas por FACS baseado em sua expressão de transcrito 2, 3, 5 como imunoglobulina (ILT2, ILT3, ou ILT5). Como mostrado na figura 26, a ativação de iMDDC regula descendentemente a expressão de ILT2, ILT3 e ILT5. Em contraste, a ativação e tratamento simultâneo com TIGIT-Fe resulta em uma regulação descendente diminuída da expressão de ILT2, ILT3 e ILT5 com relação à regulação descendente vista em iMDDC ativado, mas não tratado com TGIT- Fe. Este efeito observado pode ser devido à capacidade de TIGIT estimular a produção de IL-10 em DC; sabe-se que DC expressando IL-10 são telorogênicos e expressam níveis mais altos de ILTs. No entanto, a regulação descendente de ILTs tal como ILT2, 3 e 5 também pode ser um efeito direto de TIGIT, e fornecem outro método pelo qual TIGIT induz tolerância.

[0386] Para determinar se os efeitos in vitro do tratamento com TIGIT sobre a ativação de células T observados poderiam ser traduzidos para uma situação in vivo, os efeitos do tratamento com TIGIT-Fc foram comparados a estas CTLA4-Fc, um inibidor bem documentado da resposta de células T (Linsley, P.S. et al., Science 257, 792-5 (1992)) em uma resposta (DTH) de hipersensibilidade do tipo retardado. Resumidamente, camundongos C57BL/6 de 8-10 semanas de idade foram imunizados subcutaneamente na base da cauda com 100 μg de hemocianina de lapa (KLH) (Sigma) em 100 μl de CFA (Difco Laboratories). Uma coorte de animais (n=10) foi tratada nos dias 1, 4 e 6 com 100 μg de TIGIT-Fc, TIGIT-Fc-DANA, CTLA-4Fc ou IgG2a anti-erva de controle de isótipo negativo por injeção intraperitoneal. No dia 6, a espessura da orelha direita e esquerda foi medida. A orelha direita foi injetada com 25 μL de solução salina e a orelha esquerda foi desafiada com 30 μg de KLH em 25 μl de solução salina. No dia 7, as espessuras da orelha direita e esquerda foi novamente medida, e a diferença entre as espessuras no dia 7 e o dia 6 foi definida como intumescimento da orelha. O intumescimento da orelha nas orelhas injetadas com solução salina sozinha foi menos do que 0,02 mm para cada grupo de tratamento. Após medir o intumescimento da orelha, os camundongos foram eutanizados e os baços coletados. Suspensões de célula única foram preparadas e cultivadas em placas de fundo plano com 96 reservatórios em uma densidade de 1 x 106 células/ml (200 μl/reservatório) em DMEM contendo 10% de FBS, 2 nM de glutamina, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml). As células foram cultivadas em meio sozinho ou na presença de carias concentrações de KLH. Como um controle positivo para a ativação de células T, as células foram cultivadas em reservatórios pré- revestidos com 5 μg/ml de anti-CD3 (BD Biosciences) com 2 μg/ml de anti- CD28 solúvel (BD Biosciences). Para análise de proliferação, 1 μCi [3H] timidina (Perkin Elmer) foi adicionado a cada reservatório em um volume de 50 μl durante as últimas 18 horas de uma cultura de quatro dias, as células foram coletadas e a incorporação de [3H] timidina foi medida por contagem de cintilação líquida.

[0387] O intumescimento da orelha signicativamente menor foi medido em TIGIT-Fc e em camundongos tratados com CTL4-Fc como comparado ao tratamento de controle, e a potência foi similar para ambos os grupos de tratamento (p<0,0001 para ambos os grupos). Não houve nenhuma diferença estatística entre TIGIT-Fc e CTLA-Fc (p = 0,07). Significativamente, em camundongos deficientes de IL-10, TIGIT-Fc não teve nenhum efeito sobre as resposta de DTH, a despeito da inibição de DTH com CTLA4-Fe (p=0,004), suportando o papel de IL-10 na função de TIGIT-PVR. TIGIT-Fc-DANA foi similar em seus efeitos na inibição de DTH como TIGIT-Fc, demonstrando que TIGIT-Fc mão requer reticulação de PVR mediada por Fc. Anti-TIGIT não teve nenhum efeito sobre DTH (figura 27C). Os ensaios foram realizados para determinar in vitro respostas de renovação para KLH em camundongos tratados e demonstraram que a proliferação, a produção de citocina IL-2 e IFNy foi significativamente diminuída em camundongos do tipo selvagem tratados com TIGIT-Fc, mas não em camundongo deficientes de IL-10 (figura 27D-G).

[0388] DC CD11c+ foram isolados dos baços em camundongos DTH ao término do estudo (dia 7) e o efeito de TIGIT-Fc sobre a proliferação de DC e os perfis de citocina foi avaliado por qRT-PCR, como descrito acima. Células T de baço isoladas de animais tratados com de TIGIT-Fc e CTLA4-Fc não proliferam em resposta para KLH em ensaios de renovação como comparado a animais de controle tratados com isótipo (p,0,01) para ambos os grupos de tratamento) (figura 27B). Este resultado indica que TIGIT pode ser importante tanto durante a iniciação de células T e o acionamento da fase efetora de respostas imunes conduzidas por células T. Similar aos dados in vitro obtidos acima a partir dos estudos de MDDC, células CD11c+ isoladas de camundongos tratados com TIGIT-Fc tinham mRNA de IL-10 aumentado (p<0,05) e mRNA de IL-12/23p40 e IL-12p35 diminuído, embora estas últimas medições não alcance significância estatística (p=0,07 e 0,08, respectivamente) (figura 27H). No entanto, o tratamento com TIGIT-Fc teve somente um efeito menor sobre a transcrição de IL-12p40/p35 em células CD11c+ derivadas de camundongos IL-10 KO, indicando que a regulação descendente mediada por TIGIT dos níveis de mRNA de IL-12p40/p35 é específica e a regulação ascendente mediada por TIGIT de IL-10 é requerida para regulação descendente de citocinas IL-12 pró-inflamatórias neste modelo.

EXEMPLO 8: CAMUNDONGOS DEFICIENTES DE TIGIT

[0389] Camundongos eliminados com TIGIT foram gerados usando técnicas padrão. Para confirmar a ausência de um gene de TIGIT funcional nestes camundongos, células T totais foram isoladas de baços de camundongo eliminados ou do tipo selvagem, e subsequentemente incubadas com anticorpos anti-CD3 e anticorpos anti-CD28 durante três dias. O RNA total foi isolado das células usando um kit Rneasy (Qiagen) e submetidas a RT-PCR em tempo real para medir mRNa de TIGIT. Os níveis de CD96 também foram avaliados como um controle. O resultado do estudo demonstraram que os camundongos eliminados eram deficientes na expressão de TIGIT.

[0390] As populações de células imunes de nodos linfáticos mensetéricos foram examinadas em camundongos eliminados com TIGIT, de 9 meses de idade em comparação com camundongos do tipo selvagem, usando análises FACS como descrito no exemplo 3A. Os camundongos eliminados com TIGIT exibiram números aumentados de células T CD4+ da memória, mDC, pDC, monócitos, células T CD11c+ PVRhi, e as células B totais como comparado a camundongos do tipo selvagem. As populações de células CD4+ nativas e maduras eram similares entre camundongos do tipo selvagem e eliminados. Verificou-se também que os camundongos eliminados têm números aumentados de MZB (B220+CD21hi), NKT (DX5+CD4+ ou DX5+CD8+), e células T CD8+ da memória no baço, com relação a camundongos do tipo selvagem. Este nível aumentado de células T CD8+ da memória também foi observado em nodos linfáticos mesentéricos e células de curativo de Peyer nos camundongos eliminados. O aumento em pDC e os números de células de monócitos observados no nodo linfático mesentérico de camundongos eliminados também foram observados no baço e em curativos de Peyer destes camundongos, embora a diferença em níveis com relação aos camundongos do tipo selvagem fosse menos pronunciado do que no nodo linfático mensetérico.

[0391] A atividade de células T isoladas de camundongos deficientes de TIGIT também foi investigada. Resumidamente, os esplenócitos totais foram isolados de camundongos deficientes de TIGIT, de 9 meses de idade e de ninhadas do tipo selvagem. 106células de cada tipo de camundongo foram semeados sobre placas de 96 reservatórios de fundo plano e estimulados com anti-CD3 (10 μg/ml) ligado à placa mais anti-CD8 (2 μg/ml). No segundo dia, os sobrenadantes foram colecionados e a produção de citocina foi analisada por Luminex. As células foram coletadas e submetidas a FACS, classificando pela presença de IFNy e IL-4 intracelular. A proliferação de células foi medida pela incorporação de 3H-Timidina, como descrito no exemplo 3A. Ensaios de MLR foram realizados geralmente de acordo com métodos descritos no exemplo 4. Especificamente, as células T CD4+ foram isoladas de baços de camundongos deficientes de TIGIT ou de ninhadas do tipo selvagem por isolamento negativo (MACS). Esplenócitos de Balb/c esgotados de células T foram irradiados a 3000 rad e usados como células apresentadoras de antígenos. 2x105 células T CD4+ foram estimulados com 1 μg/ml, anti-CD3 solúvel (células T somente) ou misturadas com antígenos alogênicos apresentando células em uma proporção de 1:2. S proliferação foi medida no terceiro dia por incorporação de 3 Timidina, como descrito no exemplo 3a. Em uma segunda experiência, o ensaio MLR foi realizado identicamente, mas as células T CD4+foram isoladas de camundongos Balb/c e s células apresentadoras de antígenos foram preparadas de camundongos deficientes de TIGIT ou de camundongos do tipo selvagem.

[0392] As células T de camundongos deficientes de TIGIT proliferaram similarmente a camundongos do tipo selvagem em um ensaio de proliferação padrão (figura 30A, painel direito). No entanto, na presença de células apresentadoras de antígenos, células T deficientes de TIGIT aumentaram com relação a células T do tipo selvagem (figura 30A, painel central). Notavelmente, as células apresentadoras de antígenos da proliferação estimulada de baço de camundongo deficiente de TIGIT de células T do tipo selvagem na mesma extensão como as células apresentanto antígenos tomadas de camundongos do tipo selvagem (figura 30a, painel direito. Combinadas, estes dados sugerem que as células T são reguladas descendentemente em proliferação por um mecanismo envolvendo TIGIT expressado nestas células T, em vez de nas células apresentadoras de o antígeno, e ainda confirma a atividade de TIGIT na regulação descendente de resposta de células T. Uma proporção maior de camundongos deficientes de células T de camundongo deficiente de TIGIT tinha níveis intracelulares altos de IFNy do que células T de camundongo do tipo selvagem (figura 30B). Análises da produção de citocina de supernates de células T deficientes de TIGIT e do tipo selvagem mostrou que a produção/secreção de IFNy e TNFa foi aumentada nas células T deficientes de TIGIT com relação a células T do tipo selvagem, enquanto os níveis IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IL12p70 permaneceram consistentes entre as duas populações de células.

Claims (20)

1. ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por compreender: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

2. ANTICORPO ANTI-TIGIT, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: (a) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 21, e a cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 22, ou (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 29, e a cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 30.

3. ANTICORPO ANTI-TIGIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo anticorpo anti-TIGIT ser selecionado a partir de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo heteroconjugado e uma imunotoxina.

4. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumentar função e/ou atividade do sistema imune em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

5. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para que a interação de CD226-PVR e/ou a interação de CD96-PVR seja estimulada em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

6. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumentar ou estimular a proliferação de uma célula T ou a liberação de citocinas pró-inflamatórias por uma célula dendrítica em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

7. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumentar ou estimular uma resposta imune de célula T em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

8. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumentar ou estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias por uma célula dendrítica em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

9. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou diminuir a gravidade de uma doença relacionada à imunidade referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, o anticorpo anti-TIGIT compreendendo: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35 e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

10. MÉTODO IN VITRO PARA ESTIMULAR A INTERAÇÃO DE CD226-PVR E/OU A INTERAÇÃO DE CD96-PVR in vitro, caracterizado por compreender colocar em contato uma co-cultura de células T e células dendríticas com um anticorpo anti-TIGIT, conforme definido na reivindicação 1.

11. MÉTODO IN VITRO PARA AUMENTAR OU ESTIMULAR A PROLIFERAÇÃO DE UMA CÉLULA T OU A LIBERAÇÃO DE CITOCINAS PROINFLAMATÓRIAS POR UMA CÉLULA DENDRÍTICA in vitro, caracterizado por compreender colocar em contato uma co-cultura de células T e células dendríticas com um anticorpo anti-TIGIT, conforme definido na reivindicação 1.

12. MÉTODO IN VITRO PARA AUMENTAR OU ESTIMULAR A RESPOSTA IMUNE DE CÉLULA T in vitro, caracterizado por compreender colocar em contato uma co-cultura de células T e células dendríticas com um anticorpo anti-TIGIT, conforme definido na reivindicação 1.

13. MÉTODO IN VITRO PARA AUMENTAR OU ESTIMULAR A PRODUÇÃO DE CITOCINAS PROINFLAMATÓRIAS POR UMA CÉLULA DENDRÍTICA in vitro, caracterizado por compreender colocar em contato uma co-cultura de células T e células dendríticas com um anticorpo anti-TIGIT, conforme definido na reivindicação 1.

14. USO DE UM ANTICORPO ANTI-TIGIT, caracterizado por ser em um método para diagnosticar uma doença relacionada à imunidade referente à resposta de células imunes aberrante em um paciente, em que o método compreende avaliar a expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra do paciente e comparar a expressão e/ou atividade de TIGIT a (i) uma quantidade de referência da expressão e/ou atividade de TIGIT ou (ii) a uma quantidade da expressão e/ou atividade de TIGIT em uma amostra de um paciente normal, em que o anticorpo compreende: (a) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 23, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 24, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 25, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 26, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 27, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 28, ou (b) uma cadeia leve que compreende um HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 31, um HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 32, e um HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 33, e uma cadeia pesada que compreende um HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 34, um HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 35, e um HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 36.

15. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9 ou 14, caracterizado pelo anticorpo anti-TIGIT compreender: (a) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 21, e a cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 22, ou (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 29, e a cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 30.

16. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9 ou 14 a 15, caracterizado pelo anticorpo anti-TIGIT ser selecionado a partir de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo heteroconjugado, e uma imunotoxina.

17. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9 ou 14 a 16, caracterizado pelo paciente ser um mamifero.

18. USO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo mamífero ser um humano.

19. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela célula T ser uma célula T ativada.

20. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo método bloquear a supressão da proliferação de células T mediada por células T reguladoras (Treg).

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