JPH04501201A - 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換本発明は植物の発芽種子を形 質転換する方法および形質転換した植物、特に双子葉植物を生産するための該方 法の使用に関する。

発明の背景 植物種についての単一遺伝子移入技術の発展は植物育成者にとって非常に興味深 く、かつ価値あるものである。何故ならば、それは有用な遺伝的特性を植物に迅 速に移入するのに用いることができるからである。遺伝子を植物組織に移入する ための多数の方法が開発されてきた；アグロバクテリウム媒介移入（ムライら（ Ｍｕｒａｉ　ｅｔ　ａｌ）１９８３　、フラレイら（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ ）、１９８３）、直接的ＤＮＡ摂取（バスズコスキイら（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ 　ｅｔ　ａｌ）、１９８４　；ポトリヵスら（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ） 、１９８５）、マイクロインジェクション（クロスウェイら（Ｃｒｏｓｓｗａｙ 　ｅｔ　ａｌ）、１９８６）、高速ミクロブロジェクティール（ｍｉｃｒｏｐｒ ｏｊｅｃｔｉｌｅ）　（フレインら（Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｔ）、１９８７）お よび電気穿孔（フロムら（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ）、１９８５；フロムら（Ｆ ｒｏｍａ＋　ｅｔ　ａｌ）、１９８６）、これらの遺伝子移入技術のほとんどに 関連する一般的な問題点は、完全な植物体を得ることができるまでにかなりの時 間を要するいくつかの再生工程に形質転換組織、葉片または細胞プロトプラスト いずれかを付さなければならないことである。さらに、このプロセスは複雑であ る。何故ならば、組織培養法が多くの穀類種で確立されていないからである。は とんどの場合、穀類種への遺伝子移入は完全な穀類植物体ではなく、形質転換カ ルスに限定されていた。加えて、組織培養法の結果、挿入されたＤＮＡの再配置 が起こり；あるいは体細胞突然変異が起こる可能性があり、何年間もの植物育成 の努力によって蓄積された所望の遺伝特性の喪失または変化が起こりかねない。

アグロバクテリウム媒介遺伝子移入はずば抜けて最も広く用いられている遺伝子 移入技術であるが、アグロバクテリウム株の使用は限定されている。何故なら、 それらは単子葉植物禾穀類種には効果的に感染しないからである。しかしながら 、最近の報告（フーイカースーバン・スログテレンら（Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａ ｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ）１９８４、ヘルナルスティーンズら（Ｈ ｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ）　１９８４　；グレイブズおよびゴール ドマン（Ｇｒａｖｅｓ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｍａｎ）、１９８６゜グリムスレイら （Ｇｒｉａ＋５ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）、１９８７．シャファーら１９８７）によ って、アグロバクテリウム株が単子葉植物細胞に結合し、そのＴ−ＤＮＡ領域を これらの細胞に移入する条件が存在することが示唆されている。興味深いことに は、グレイブズおよびゴールドマン（Ｇｒａｖｅｓ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ＋５ａｎ ）　（１９８６）による報告は、アグロバクテリウムが発芽中のトウモロコシ（ ゼア・マイズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ））種子の杯盤細胞および中胚軸細胞に感染で き、得られた形質転換植物は扇形に分けられているものの、該植物体は形質転換 されていることを示唆している。この技術は、アグロバクテリウム媒介遺伝子移 入はいずれの組織培養中間工程の必要なくして実行できることを示唆する。さら に、発芽種子の中胚軸細胞の形質転換についての支持がフェルトマンおよびマー クス（Ｆｅｌｄｍａｎ　ａｎｄ　ＭａｒｋｓＸ　１９８７　）によって得られて おり、彼らは、そのＴ−ＤＮＡ領域における植物発現可能ネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ（ＮＰＴ）ｎ遺伝子を有するバイナリプラスミドを含有するア グロバクテリウムと一緒に発芽種子を共培養することによってＧ４１８耐性アラ ビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）植物を得 ることができている。

マメ科植物についての遺伝子移入技術の発展は商業的興味がある。

何故ならば、それにより、病気耐性の改良、特定の除草剤に対する耐性および栄 養価値の増大を伴う新しい栽培品種の開発が容易となるからである。不幸なこと に、これらの双子葉植物種はアグロバクテリウム感染に罹りやすいが（ファキオ ッティら（ＦａｃｃｉｏｔＬｉ　ｅｔ　ａｌ）、１９８５；オウエンスおよびク レス（Ｏｖｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃｒｅｓｓ）、１９８５；ビルンら（Ｂｙｒｎｅ　 ｅｔ　ａｌ）、１９８７Ｌ形質転換についてのその使用は、特に形質転換組織に ついての、利用可能で有効な再生手法がないため限定されている。

この技術のファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ ）のごときマメ科植物、インゲンマメの発芽種子への拡大は非常に重要である。

何故ならば、形質転換した未分化組織の再生を除いては、再生手法が利用できな いからである。

遺伝物質の植物種への移入、安定な組み込み、および有性伝達についての簡単で 組織培養に依存しない方法の開発は非常に興味があり、かつ重要である。グレイ ブズおよびゴールドマン（Ｇｒａｖｅｓ　ａｎｄＧｏｌｄｍａｎ）（１９８６） およびフェルトマンおよびマークス（Ｆｅｌｄｍａｎｎａｎｄ　Ｍａｒｋｓ）　 （１９８７）からの報告は、発芽種子の中胚軸細胞のアグロバクテリウム媒介形 質転換を介し、形質転換した完全な植物体を得ることができる証拠を提示してい る。

本発明の方法は、（１）単子葉植物の種子の形質転換についてのグレイブズおよ びゴールドマン（Ｇｒａｖｅｓ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｍａｎ）技術（１９８６）の 改良および（２）その双子葉植物への拡大を提供する。

アン・シイ・ワトソンら（Ａｎ　Ｇ、　Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ）　、（１９ ８５）、高等植物の形質転換についての新しいクローニングビヒクル（Ｎｅｗｃ ｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）ＥＭＢＯＪ、４：２７７〜２８４、 ビルネ・エム・シイら（Ｂｙｒｎｅ　Ｍ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ）、（１９８７）、 アグロバクテリウム−大豆相互干渉における株および栽培品種の特異性（Ｓｔｒ ａｉｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　−５ｏｙｂｅａｎ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）　 、植物細胞組織および器官の培養（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ 　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　８　：　３〜１５、ピテビｘ−ビイら（Ｂｙ ｔｅｂｉｅｒ　Ｂ、　ｅｔ　ａｔ）、（１９８７）、単子葉植物アスパラガス・ オフィシナリスの腫瘍培養および遺伝子導入植物におけるＴ−ＤＮＡ組織化（Ｔ −ＤＮＡ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｕｌ−ｔｕｒｅｓ 　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｏ ｔｙｌｅｄｏｎ　ＡｓｐａｒａｇｕｓｏＨｉｃｉｎａｌｉｓ）、プロシーデイン グズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｔ’ｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　８４　：５３４５〜５３４９ 、 チイー・ビイ・ビイら（Ｃｈｅｅ　Ｐ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８６）、 外来植物組織における豆類貯蔵蛋白「ファゼオリン・ミニ遺伝子」の発現（Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｅａｎ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　” ｐｈａｓｅｏｌｉｎ　ｍｉｎｉｇｅｎｅ”ｉｎ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｐｌａｎｔ　 ｔｉｓｓｕｅ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）４１　：　４７〜５７、クロスウェイ・エ イら（Ｃｒｏｓｓｗａｙ＾、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８６）、タバコ葉肉プロト プラストのマイクロインジェクションによる外来性ＤＮＡの組み込み（Ｉｎｔｅ ｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ＤＮＡ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｍ１ｃ ｒｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ　ｐｒ ｏｔｏｐｌａｓｔｓ）、モレキュラー〇アンド・ジェネラル・ジェネテイックス （Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）２０２：１７９〜１８５、 ファキｔ　ソテイ・ディら（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９ ８５）アグロバクテリウムで形質転換した大豆組織におけるキメラ遺伝子の光誘 導可能な発現（Ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ 　ａ　ｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅ　ｉｎ　５ｏｙｂｅａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｔｒ ａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、　／’イオテ クノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３　：　２４１〜２４６、フェル トマン・ケイ・エイら（Ｆｅｌｄｍａｎｎ　Ｋ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９ ８７）、アラビドプシス・サリアナの発芽種子のアグロノ＜クテリウム媒介形質 転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ　ｏｆｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　５ｅｅｄｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）　：非組織培養アプローチ（Ａ　ｎｏｎ−ｔｉｓｓ ｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｐｐｒｏａｃｈ）　、モレキュラー〇アンド・ジェネ ラル・ジエネティックス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｔ、）、２０８：１〜９ 、 フラレイ・アール・ティら（Ｆｒａｌｅｙ　Ｒ，Ｔ、　ｅｔ　ａｔ）、（１９８ ３）植物細胞における細菌遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃ ｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ）、プロシーデイング ズ・オブ・ナシヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８０：　４８０３〜４８０７、 フロム・エム・イーら（Ｆｒｏｍｍ　Ｍ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５） 、電気穿孔による遺伝子移入後のトウモロコシの安定な形質転換（Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ａｆｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｔ ｒａｎｓｆｅｒ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ−ｔ　１ｏｎ）、ネイチ＋−（ Ｎａｔｕｒｅ）３１９　：　７９１〜７９３、フロム・エムら（Ｆｒｏｍｍ　Ｍ 、　ｅｔ　ａｌ）、　（１９８５）　、電気穿孔により単子葉植物および双子葉 植物細胞へ移入した遺伝子の発現（Ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ 　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　１ｎｔｏ　ｍｏｎｏｃｏｔ　ａｎｄ　ｄｉｃｏｔ　 ｐｌａｎｔｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロシーデ ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８２　：　５８２４〜５８２８、グ レイブズ・エイ・シイ・エフら（Ｇｒａｖｅｓ　Ａ、　Ｃ，Ｆ、　ｅｔ　ａｌ） 、（１９８６）、アグロバクテリウム・チュメファシェンスでのゼア・マイズ実 生の形質転換（Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｍａｙ ｓ　ｓｅｅｄ−１ｉｎｇｓ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｌｓ）、プラント０モレキ二ラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、７：４３〜５０、グリムスレイ・エフら（Ｇｒｉｍｓｌ ｅｙ　Ｎ、　ｅｔ　ａｔ）、（１９８７）、感染性トウモロコシ・ストリーク・ ウィルスのトウモロコシ植物へのアグロバクテリウム媒介伝達（Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕ ｓ　ｍａｉｚｅ　５ｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ　１ｎｔｏ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎ ｔｓ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３２５：１７７〜１７９、フーイカー スーバン・スログテレン・シイ・エム・ニスら（Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ　Ｓ ｌｏｇｔｅｒｅｎ　Ｇ、　Ｍ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８４）、アグロバ クテリウム・チュメファシエンスで感染した単子葉植物におけるＴｉプラスミド 遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｇｅｎｅ ｓｉｎ　ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ 　ｗｉｔｈ　ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕＩＩｌｅｆａｃｉｅｎｓ）、ネイ チ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１１　：　７６３−７６４、ヘルナルスティーン ズ・ジェイ・ビイら（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ　Ｊ、　Ｐ、　ｅｔａｌ）、（ １９８４）、単子葉植物アスパラガス・オフィシナリスからのアグロバクテリウ ム形質転換細胞培養（Ａｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　−ｔｒａｎｓｆｏｒ ｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｏｔ　Ａｓ ｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉ−ｎａｌｉｓ）、ＥＭＢＯＪ　３：３０３９〜３ ０４４、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）　（１９８６）　、遺伝子融合 マーカートシてのエシェリヒア・コリからのＢ−グルクロノロース（Ｂ−Ｇｌｕ ｃｕｒｏｎｏｌｏｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｓ　 ａ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｍａｒｋｅｒ）、プロシーディングズΦオブ・ナシ ョナル舎アカデミ一オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　８３　：８４４７〜８４５１、 フレイン・ティーｘムら（Ｋｌｅｉｎ　Ｔ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８７ ）、核酸を生きた細胞に輸送するだめの高速マイクロプロジェクテイール（Ｈｉ ｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｍ１ｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｌ ｉｖｅｒｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ　１ｎｔｏ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌ ｌｓ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２７　：　７０〜７３、 ムライ・エフら（Ｍｕｒａｉ　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８３）、腫瘍誘導プ ラスミドベクターを介するヒマワリへの移入後に豆類からのファセオリン遺伝子 が発現される（Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｂｅａｎ　ｉｓ　Ｅ ｘｐｒｅｓｓｅｄａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　 ｖｉａ　Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｖｅｃ−ｔｏｒｓ） 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２２　＋　４７６〜４８２、オウエンス・ エル・ディら（Ｏｖｅｎｓ　Ｌ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｔ）、（１９８５）、Ｔｉま たはＲｉプラスミドを有するアグロバクテリウム株に応答する遺伝子型変異性（ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　５ｏｙｂｅａｎ　ｒｅｓ ｐｏｎｓｅｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔｒａｉｎｓ　ｈａｒｂｏｒ ｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔｉ　ｏｒ　Ｒｉ　ｐｌａｓｍｉｄｓ）、プラント・フィジオ ロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）７７　：　８７〜９４、パスズコフス キイ・ジェイら（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８４）、 植物への直接的遺伝子移入（Ｄｉｒｅｃｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ 　ｐｌａｎｔｓ）、ＥＭＢＯＪ　３：２７１７〜２７２２、ペダーセ７−ケイら （Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８６）、分子量１５．０００ の高硫黄ゼイン蛋白をコード付けするトウモロコシ遺伝子の配列分析およびキャ ラクタライゼーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ　ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍａｉｚｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎ ｇ　ａ　ｈｉｇｈ−ｓｕｌｆｕｒｚｅｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＭＷ１５０ ００）。ジャーナル・オブ・ノくイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｔ）２６１　：　６２７９〜６２８４、ポトリカス・アイら（Ｐｏｔ ｒｙｋｕｓ　１．　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）イネ１斗単子葉植物の細胞への 直接的遺伝子移入（Ｄｉｒｅｃｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔ。

ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ａ　ｇｒａｍｉｎａｃｅｏｕｓ　ｍｏｎｏｃｏｔ、）、モレ キュラー〇アンド６ジエネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ ｎｅｔ、）１９９　：　１８３〜１８８、 レイス・ビイら（Ｒｅｉｓｓ　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８４）、粗製細月包 抽出物ニおけるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの定性およヒ定量アッセ イについての新しい高感度分析（Ａ　ｎｅｗ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏ ｄｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｓ ｓａＹ　ｏｆ　ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　 ｉｎ　ｃｒｕｄｅ　ｃｅｌｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３ｏ ：２１１〜２１８、 シャファー・ダブり二一ら（Ｓｃｈａｆｅｒ　Ｗ、ｅｔ　ａｌ）、　（１９８７ ）、Ｔ−ＤＮＡ組み込みおよびアグロバクテリウムの誘導後の単子葉穀類植物に おける発現（Ｔ−ＤＮＡ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｉｎ　ａｍｏｎｏｃｏｔ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔ　ａｆｔｅｒ　１ｎｄｕ ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒ ｅ）、３２８：　５３９〜５３２、スライトム・ジエイ・エルら（Ｓｌｉｇｈｔ ｏｍ　Ｊ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）、（１９８３）、インゲンマメ貯蔵蛋白遺伝子 ファゼオリンの完全なヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　Ｆｒｅｎｃｈｂｅａｎ　ｓｔｏｒａｇｅ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ、　Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、プロシーディングズφオ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　８０：　１８９７〜ｌ　９０１゜形質転換アラ ビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）種子を生 産するための非組織培養アプローチはフェルトマンおよびマークス（Ｆｅｌｄｍ ａｎｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｋｓ）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ ィノクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）　（１９８７）　２０８　：　 １９に記載されてる。しかしながら、本発明者らの知る限り、非組織培養移入の 適用はマメ科植物および大豆、インゲンマメ、カポチャ、ズッキーニ、コシヨウ 等の他の大きな種子の双子葉植物に首尾よく適用されたことがない。

二匪悶栗り 本発明は、 （ａ）植物の種子を発芽させ、 （ｂ）その分化に先立って、発芽中に産生された分裂細胞および中胚軸細胞を、 アグロバクテリウム由来ベクター中の移入可能な遺伝子を含有するピルレントま たは非ビルレントアグロバクテリウム株で接種し；次いで （Ｃ）該細胞を植物成体に分化させることよりなり、ただし、該植物はアラビド プシスーサリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）でないことを 特徴とする遺伝子導入植物の生産方法；を提供するものである。

発芽後における発芽ビイ・ブルガリ、ス種子をアグロバクテリウム・ベースのベ クターで感染させる時期は臨界的であることが判明した。

アゲロバクチリア感染に先立って種子を発芽できる時期の長さは、分裂組織を感 染させるアゲロバクチリアの能力に大いに影響を与える。何故ならば、繊管束組 織の量は分化が進行するに従い急速に増大するからである。しかしながら、中胚 軸領域へ物理的に接近するためには、種子の発芽が起こらなければならない。従 って、本発明を実施する好ましい方法は、接種工程を発芽から１６ないし９６時 間内、好ましくは２４ないし４８時間内に行うことである。発芽種子を感染させ る最適時期を決定するために、ビルレント・アグロバクテリウム株Ａ２０８での 接種を発芽開始浸種々の時期、６および９６時間間に行った。成功した形質転換 は実生の発育中のゴール形成により得点をつけ、各時期間隔について５０の種子 を接種した結果を第１表に示す。２４ないし４８時間の間に発芽できる種子はア グロバクテリウム感染に最も感受性であることが判明した。これらの接種種子の ７０％ないし８０％が、下胚軸、上胚軸、子葉節いずれか上に形成された、ある いは植物の基部全体に分散したゴールを伴う実生を生じた。接種の好ましい方法 は、移入可能なりＮＡシスまたはトランスプラスミドを含有するビルレントまた は非ビルレント・アグロバクテリウム株で行うものである。

双子葉植物について該プロセスを行う特に好ましい方法は、接種に先立って子葉 の１つを取り除くことを含む。この工程は、分裂細胞が生じている中胚軸領域に 対する該株の接近を増大させる。

本発明の方法は簡明で、迅速で、いずれの組織培養技術も排除し、かつ形質転換 植物を直接に得ることができる。

また、本発明の方法によって生産された遺伝子導入植物も提供する。好ましいも のは双子葉植物遺伝子導入植物である。特に好ましいのはファゼオラス・ブルガ リス（ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびグリシナス・マックス（ Ｇｌｙｃｉｎｕｓ　ｍａｙ、）のごときマメ科の双子葉植物である。

好ましい具体例の記載 バイナリプラスミドｐＧＡ４７２またはＰＧＡ４８２あるいはその誘導体を含有 するピルレントまたは非ビルレントのアグロ、（クテリウム・チュメファシエン ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またＣよアグロバ クテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）株いずれかで発芽種子を接種する。両者はシイ・アン（Ｇ、　Ａｎ）博士、ワ シントン州、プルマン（Ｆｕｌｌｍａｎ）、ワシントン州立大学、から入手可能 である。このバイナリプラスミドはそのＴ−ＤＮＡ領域内の植物発現可能ＮＰＴ ＩＩ遺伝子をコード付けし、それらの誘導体は有用な特性を形質転換種に付与す る遺伝子を含有する。やはりノくイナリプラスミドを含有するビルレント・アグ ロバクテリウム株で接種した種子から得られたほとんどの植物は、典型的なりラ ウンゴールを生じる。しかしながら、ＮＰＴｎ活性はいくらかの接種した完全植 物体の葉で見い出されており、これはノＸＪイナリＴ−ＤＮＡ領域も移入された ことを示す。また、エイ・チュメファシエンスまたはり・／ゲネスのアビルレン ト株を用いてバイナリニーＤＮＡ領域の移入を達成することもできた。ここに得 られた結果は、形質転換をＮＰＴ■酵素活性の存在で決定して、ビイ・ブルガリ スの１．６％およびグリシン・マックス（大豆）植物の約１％が形質転換された ことを示す。

ファゼオラス・ブルガリス品種オラセ（Ｏｌａｔｈｅ）またはグリシン・マック ス（品種Ａ０９４９）の種子を１５％クロロックス（Ｃ１ｏｒｏｘ）で１０分間 表面殺菌し、続いて蒸留水で４〜５回すすぎ、次いで、２８℃に温度制御したベ ルシバル（Ｐｅｒｃｉｖａｌ）インキュベーター中ノ湿した紙タオル上に置き、 １６ないし９６時間の種々の時間の間、発芽させた。種子外皮を取り除き、脱外 及種子を２つに開いた（これは主要種子体から子葉を取り出した方法である）。

その幼芽がまだ付着している発芽種子の中胚軸領域を、２７・１／２ゲージ・ニ ードル付きのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ピペットを用い、種々のア グロバクテリウム株の液体培養物で一晩感染させた。ビルレントまたはアビルレ ントなエイ・チュメファシエンス株（Ａ２０８、Ｃ５８、Ｃ５８ｚ７０７および Ａ　２０８　／　ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ）またはエイ・リゾゲネス株［Ａ４Ｒ３お よびＡ４Ｒ３（ｐＲ：Ｂ２７８ｂ）ｐｕ３．３ｃｍ１１で種子を感染させた。通 常のエイ・チュメファシエンスおよびエイ・リゾゲネス株は、メリーランド州、 ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗ ｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１、ＡＴＣＣから入手可能である。無害化エイ・リ ゾゲネス株Ｒ８（ｐ　Ｒｉ　Ｂ２７８ｂ）はビライネおよびカツセーデルバート （Ｖｉｌａｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）（１９８７）、モレ キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ ｎｅｔ、）、２０６１７によって記載されており、エフ・カツセーデルバート（ Ｆ、　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）、Ｃ，Ｎ、　Ｒ，Ａ１、フランス国、ベル サイユ（Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ）、Ｆ７８０００、レテド・サーノ・シル（Ｒｏ ｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ、）から入手可能である。無害化エイ・チュメ ファシエンス株Ｃ５８２０７はバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ大学から入手で きる。次いで、接種した種子をベトリ皿中の湿した紙タオル上に置き、２８℃で インキュベートした。４日後、これらの実生を土壌に移し、温室で成熟するまで 発育させた。エイ・チュメファシエンスのビルレント株で感染させた植物を、発 芽時間の関数としてゴール形成の効率について得点を取った。

レイスら（Ｒｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８４）によって報告されているご とく、ｉｎ　５ｉｔｕゲルアツセイによってＮＰＴＩＩ酵素活性を検定した。

簡単に述べると、葉組織１００ｍｇを１．５ｍＱエッベンドルフ試験管中の抽出 緩衝液２０ｍ＋２と混合した。組織試料をＫｏｎｔｅ乳棒で解離させ、４°Ｃで ２０分間遠心した。上澄み溶液３５μＱ分を非変性１０％ポリアクリルアミドゲ ル上の電気泳動に付した。該ゲルを、５７ｍＭ）リス−マレイン酸塩（ｐＨ７， １）、４２ｍＭ　ＭｇＣＱ、、４００ｍＭ　ＮＨ，Ｃ（１，２０ｔｔｇカナマイ シン硫酸塩および２００μＣｉガンマ−［”Ｐ］　ＡＴＰを含有する１％アガロ ースゲルで覆った。室温で３０分間インキュベートした後、該アガロースゲルを 一晩ワットマンＰ８１ホスホセルロースペーパー上にプロットした。

該Ｐ　８１ベーパーを取り出し、熱水（８０″Ｃ）で数回洗浄し、オートラジオ グラフィーに付した。

以下の実施例では、分子生物学分野の当業者によく知られかつ利用できる多くの 技術ならびにアグロバクテリウム株およびプラスミド（ビルレント、アビルレン ト、シス−またはトランス−立体配ａ＞を用いる。酵素は商業的源から入手し、 販売業者の推奨法および当該分野で公知の変法に従って用いる。試薬、緩衝液お よび培養条件もまた当該分野で公知である。かかる標準的な技術を含有する一般 的な文献は以下の二アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ）ｉｉ　（１９７９）　、メス・エ ンザイモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）６８巻；ジエイ・エイチ・ミラ ー（Ｊ。

Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ）　（１９７２）分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉａ＋ ｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　；ティ６マニアテイ スら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）（１９８２）分子クローニング； 実験室的マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　；およびディーｃム・グロバー（Ｄ。

Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ）ｍ　（１９８５）　、ディ・エフ・エイ・ク ローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ｎＩ巻を包含し、それらすべてをここ に参照のために挙げる。

これらの実施例の目的は、本発明者らあるいは他の者によって構築された遺伝子 構築体が、植物に移入され、組み込まれ、発現されると、その植物に有用な特性 を付与することを示すことにある。

［ゲンタマイシン−（３）−Ｎ−アセチルーベンフェローゼ（ｂｅｎｆｅｒｏｓ ｅ）　ｎＩを含有し、ダブリュー・ピーペルスベルブ（Ｗ。

Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ連邦共和国、ムニヒ（Ｍｕｎｉｃｈ）、Ｐ− ８０８０から入手可能なｐｗｐ　８６６からの５ａｌＦ断片を切り出し、［ビイ ・ブルガリス種子貯蔵蛋白遺伝子プロモーター（スライトムら（Ｓｌｉｇｈｔｏ ｉ　ｅｔ　ａｔ）、１９８３）または［ファゼオリンミニ遺伝子（チイーら（Ｃ ｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ）　１９８５）を含有し、アグリジェネティックス・コーポ レーション（＾ｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、）、マジソン、ライスコン シン州から入手可能な］ｐｕ３．３ｃｍ１に転写可能に連結したトウモロコシ・ ベーターゼイン遺伝子（ペダーセンら（Ｐｅｄｅｒｇｅｎｅｔ　ａｌ）、１９８ ７、ビイ・ラーキンス（Ｂ、　Ｌａｒｋｉｎｓ）、プルドウ（Ｐｕｒｄｕｅ）大 学、ウェスト・ラフアイエツト（Ｗｅｓｔ　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）から入手可能 ）を含有する］ｐＧＡ４８２ベースのバイナリベクター構築体ｐＰｈａｓ−ｚｅ 　ｉｎの１つの５ａｌＩ部位に入れることによって構築したつ修飾ｐＧＡ４８２ Ｇを含有するビルレントまたはアビルレントなアグロバクテリウム株で発芽ビイ ・ブルガリスおよびシイ・マックス種子を発芽後約２４時間に接種した。これら のバイナリプラスミドの物理マツプをチャート２に示す。

ＰＧＡ４８２Ｇ（アンら（Ａｎ　ａｔ　ａｌ）、１９８４）のＴ−ＤＮＡ領域内 に含有された植物発現可能ＮＰＴｎ遺伝子の移入および発現は（通常、発芽種子 を接種することから得られる癒傷部位の１０インチまたはそれ以上から得られる ）、２枚または３枚の若葉を取り出し、可溶性蛋白を抽出し、ＮＰＴｎ活性につ いてテストすることによって決定した。テストした全部で６９５の植物体から、 １１の植物体だけがこれらの蛋白抽出物でＮＰＴｎ活性を示した。それらを第■ 表に示し、ＮＰＴＩＩ陽性結果をチャート■に示す。生存する接種種子の約１． ６％がＮＰＴＩＩ活性を示し、これはバイナリプラスミドｐＧＡ４８２ＧのＴ− ＤＮＡ領域がこれらのビイ・ブルガリス植物のゲノムに組み込まれたことを示唆 する。

マイクロインジェクションおよび高速マイクロプロジエクティールのごとき当業 者によく知られた他の手法を用いてＤＮＡを中胚軸領域に移入することができ、 その形質転換植物を得られるはずである。

第１表 アグロバクテリウム株Ａ２０８で接種した実生上のゴール形成の６時間　０ １２時間　０ ２４時間　８０ ３６時間　７０ ４８時間　４０ ７２時間　１０ ９０時間　１０ 第■表 ＮＰＴ陽性形質転換植物 植物ＮＯバイナリ構築　ゴール ４０　Ｃ５８／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　＋４１　Ｃ５８／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　＋ ４６　Ｃ５８／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　＋６１　Ｃ５８／　ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　 −６５Ｃ５８／　ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　−１５１Ｃ５８／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　 ＋２５８　Ａ４ＲＳ（ｐＲ：Ｂ２７８ｂ）ｐｕ３．３ｃ（−２６９Ａ４Ｒ３（ｐ Ｒ：Ｂ２７８ｂ）ｐｕ３．３ｃｍ１　−２９６　Ａ４Ｒ３（ｐＲ：Ｂ２７８ｂ） ｐｕ３．３ｃｍ１　−４７０　Ａ　２０８／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　−５５２Ｃ５ ８Ｚ７０７／ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　一実施例２ ｐｈａｓｅｏｌｉｎミニ遺伝子の発現用ミクロ−Ｔｉプラスミドの構築。

この遺伝子の移入および発現により形質転換植物における種子貯蔵蛋白のレベル が増大する。

スーＬ ビイ・ブルガリス種子貯蔵遺伝子ｐｈａｓｅｏｌｉｎおよびそのｃ　ＤＮＡ片わ れを用い、その５のイントロンを欠く突然変異体ｐｈａｓｅｏｌ　ｉｎ遺伝子を 構築した。この突然変異体ｐｈａｓｅｏｌｉｎ遺伝子（ｐｈａｓ−ミニ遺伝子） はその天然５′および３゛植植物節配列を保持し、このプラスミド（ｐ　Ｐｖ　 ３．３−ｃ　ＤＮＡ）の構築はチイーら（Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ）（１９８６） 、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４１：４７およびクラマーら（Ｃｒａｍｅｒｅｔ　ａｌ ）　（１９８５）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８２　；３３４ によって記載されており、アグリジェネティツクス・コーポレイション（Ａｇｒ ｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、）、マジソン、ウィスコンシン州より入手でき る。プラスミドｐＰｖ　３．３−ｃ　ＤＮＡを制限酵素消化、ＢａｍＨＩおよび Ｈｉｎｄｎ［に付し、３．６ｋ　ｂ断片を取り出し、バイナリベクターｐＧＡ４ ８２のＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩ［［部位にクーロン化した（アンら（Ａｎ　 ｅｔ　ａｌ）　（１９８５）　ＥＭＢＯ，Ｊ　。

４：２７７）。この構築により、この突然変異体ｐｈａｓｅｏｌｆｎ遺伝子は、 該バイナリプラスミド（今や、ｐμ３．３ｃｍ１という）の左右境界内であって 、形質転換植物の選択および同定に用いる植物発現可能ＮＰＴ　ＩＩ遺伝子と並 んで置かれる。バイナリプラスミドｐｕ　３．３ｃｍ１の構造をチャート１に示 す。

２．２　ｕ　３．３ｃ　−１の使用 このバイナリプラスミドを種々のアグロバクテリウム株、すなわちＡ２０８、Ｃ ５８、Ｃ５８：　７０７、ＬＢＡ４４０４およびＡ４Ｒ９等に移入しなければな らない。本明細書中に記載する方法を用いて該バイナリプラスミドｐｕ　３．３ ｃ　−１を種々の植物種（例えば、インゲンマメ、大豆および他の大きな種子を つける植物）に移入することができる。加えて、ｐＰ　ｖ　３．３−ＣＤＮＡか らのＮｃｏＩないしＢａｍＨＩ断片（３ｋｂ断片）を、ゲノミック部分をｐ　Ｐ Ｖ３．３−ｃ　ＤＮＡＬ：１）ＣＤＮＡ領域で置き換える（ジェイ・スライトム （Ｊ、　Ｓｌｉｇｈｔｏｍ）、ジ・アップジョン・カンパニー（ＴｈｅＵｐｊｏ ｈｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、カラマズー（Ｋａｌａｍａｚｏｏ）、ミシガン州から 入手可能な）ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ消化のクローンｐ　Ｐ　ｒ　８．８ｇに 継代クローン化することによって、ｐｈａｓｅｏｌｉｎミニ遺伝子のマルチコピ ーを該バイナリプラスミドに入れることができる。このクローニング実験の結果 、ＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＰｖ３．３−ｃ　ＤＮＡに再クローン化したＢ ｇｌ　ｌｌ−ＢａｍＨＩ３．３，５ｋｂ断片の単離を可能とする上流ＢｇｌＩ［ 部位（スライトムら（Ｓｌ　ｉｇｈｔｏｍ。

ｅｔ　ａｌ）、（１９８３）プロシーディングズ・才ブ・ナショナル。

アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、）、８０：　１８９８）を含有する継代クローンｐ　Ｐ　ｖ　８．３−ｃ　 ＤＮＡを得る。新しいｐｈａｓｅｏｌｉｎインサートの向きはチェックすること ができ、第１のｐｈａｓｅｏｌｉｎ遺伝子に関して５°および３°の向きのもの だけをさらに挿入に用いる。３’ＢａｍＨ１部位のみが保持されていたので（Ｂ ｇ　Ｉ　Ｌ’Ｂａ　ｍ　ＨＩ結び部位はいずれの酵素によっても消化不能）、プ ラスミドの安定性および、依然イー・コリおよびアゲロバクチリアを形質転換で きる能力に応じて、この工程を何度か繰り返すことができた。この手法を繰り返 して４つものｐｈａｓｅｏｌｉｎ遺伝子インサートを得、これを、ＨｉｎｄＩ［ ［およびＢａｍＨＩ消化を用いて、バイナリプラスミドｐＧＡ４８２Ｇにクロー ン化した。

種々の数のｐｈａｓｅｏｌｉｎ遺伝子をもつ一連のこれらのプラスミド（これは 遺伝子ファミリーと呼ぶこともできる。というのは、同様の遺伝子のファミリー は単一の試行で移入されるからである）を有することによって、形質転換植物の 種子中の貯蔵蛋白のレベルが増大される。

実施例３ 本実施例の目的は、高パーセントの含硫黄アミノ酸をコード付けする修飾種子貯 蔵蛋白を取り込むことにあり；かかる遺伝子を高硫黄貯蔵蛋白（Ｈ９ＳＰ）−遺 伝子と呼ぶ。この遺伝子は、発育に際し双子葉植物の種子で発現されるように構 築し：これはｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーターを用いることによって達成された 。この修飾遺伝子はかなりの数の含硫黄アミノ酸をコード付けするにちがいない 。天然に生じるＨ３ＳＰ−遺伝子も用いることができる。２種の最良の天然に生 じるＨ３ＳＰ−遺伝子はベータゼイン遺伝子（１５ｋＤ）（ペダーセンら（Ｐｅ ｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８６）　、ジャーナル・オブ。

バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２０１：６ ２７９）およびブラジルナツト蛋白（アルテンバッハら（Ａｌｔｅｎｂａｃｈｅ ｔ　ａｌＸｌ　９８７）プラント・モレキュラー・バイオロジー（ＰｌａｎｔＭ ｏｌ、　Ｂｉｏ、）８　：　２３９）である。しかしながら、Ｈ３ＳＰ−遺伝子 のいずれの他の天然または合成誘導体も種子の栄養価の改良に用いることができ る。

３４　Ｈ３ＳＰ−遺伝子の構築 ゼイン誘導体Ｈ３ＳＰ−遺伝子の構築には、［ｐＰｖ８．８ｇの部位特異的修飾 を行うことによって組み立てたコクローンｐＰｖ８．８−Ｂｇからのｐｈａｓｅ ｏｌｉｎ遺伝子プロモーターを用いる。ｐＰｖ８６８ｇについてのＢｇｌＩＩな いしＸｂａＩ断片をＭ１３ｍｐ１７（商業的に入手可能）にクローン化し、１３ ｍｐ１８Ｐｖ１．６としてのクローンを得る。次いで、これを用いて一本鎖ＤＮ Ａを生成し、もとのｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーター領域から２塩基対変化した オリゴマー（３０残基）にアニールした。該オリゴマーの配列は５’　ＣＡＴＣ ＾ＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＧＡＧ−３°（コーディング 鎖に対向）であった。

アニーリングの後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を添加し、Ｍｌ　３ ＭＰ　１８ｐ　ｖ　１．６の残りの対向鎖を合成した。＠宜　ｐ標識オリゴマー およびディファレンシャル（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）温度ハイブリダイゼー ションを用いて、ｐｈａｓｅｏｌｉｎ遺伝子の翻訳開始部位からの新しいＢｇ１ 部位７ｂｐを含有する突然変異体Ｍ１３クローン（スライトムら（Ｓｌｉｇｈｔ ｏｍ　ｅｔ　ａ１％１９８３、同上）をスクリーニングした。ＢｇｌＩ［消化お よびアガロース電気泳動を行うことによって、クローン化した候補物をさらに分 析して余分なりｇｌＩＩ部位を含有する特別のクローン、ＢｇｌＩＩないしＢｇ ｌｎ８００ｂｐ断片の様子を同定した。単離したＤＮＡからＮｃｏＩないしＸｂ ａ断片を取り出し、ＮｃｏＩおよび部分的ＸｂａＩ消化のｐ　８．８ｇにクロー ン化した。８００ｂｐＢｇｌｌＩないしＢｇｌＩＩ断片上にｐｈａｓｅｏｌ　Ｌ ｎプロモーターを含有する新しいクローンをｐ　Ｐｖ　８．８ｇ　Ｂｇ　、と命 名し、種子貯蔵蛋白、およびベータゼインクローンｐＺＧ１５ＲＸ（ペダーセン ら（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）、同上）について予測される適当な向きお よびレベルを確認した。ＢｇｌＩ［部位を生じる一７位での部位特異的突然変異 によってｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーターを利用可能とし、かくして、ＢｇＩＩ ［消化の後、ｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーターを８００ｂｐ断片として取り出す ことができる。この断片を（商業的源から入手可能な）ｐＵｃｌＢのＢａｍＨＩ 部位に継代クローン化し、ｐＵＣ−Ｐｖｐｒｏと命名するプラスミドを得た。Ｔ ａｇＩ消化の後、シグナルペプチド、コーディング領域、およびポリ　（Ａ）付 加シグナルを包含するベータゼイン構造遺伝子を（ビイ・ラーキンス（Ｂ、　Ｌ ａｒｋｉｎｓ）、プルドウ（Ｐｕｒｄｕｅ）大学、ウェスト・ラフアイエツト（ Ｗｅｓｔ　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、イリノイ州から入手可能な）プラスミドｐｚ ｃ１５ＥＸから取り出し、この断片をｐＵＣ−ＰｖｐｒｏのＡｃｃＩ部位にクロ ーン化し、クローンｐＵＣ−Ｐｈａｓ−ｚｅｉｎを得た。

Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍおよびＥｃｏＲＩでの消化によって、このＰｈａｓ　−ｚｅｉ ｎを取り出し、この断片をあらかじめ）（ｉｎｄＩ［［およびＥｃｏＲＩで消化 したバイナリベクターにクローン化した。この新しいバイナリプラスミドをｐＧ Ａ４８２Ｇ−Ｐｈａｓ−ｚｅｉｎ　（チャート２参照）と命名し、それをアグロ バクテリウム株：Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、および Ａ４Ｒ５に移入したがこれは本発明の方法に従って形質転換植物を産生ずるのに 用いることができる。

前記したのと同様のｐｈａｓｅ　ｚｅｉｎ構築体は双子葉植物に移入されており 、形質転換植物の種子において発育の際しその発現が観察されている；ホフマン ら（Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８７）ＥＭＢＯＪ、６：　３２１３参 照。Ｐｈ　ａ　ｓ　−ｚ　ｅ　ｉ　ｎ遺伝子構築体に対してさらに修飾がなされ ている。これらの修飾はＢｇｌＩ［リンカ＝をその５°末端におよびＢａｍＨＩ リンカ−をその３゛末端に結ぶことを含み、それによりｐｈａｓｅｏｌｉｎミニ 遺伝子について前記ごとく、ｐｈａｓｅ　ｚｅｉｎ遺伝子のマルチコピーの構築 が可能となる。

これにより、単一の形質転換試行によるＨＳＳＰ−遺伝子マルチ遺伝子ファミリ ーの植物種への移入およびＨＳＳＰ−遺伝子産物の高レベルの発現が可能となる 。これにより、栄養的に改良されたインゲンマメ、大豆および他の大きな種子を もつ植物のごとき双子葉植物品種の育種が可能となる。

実施例４　ウィルス耐性の移入 本実施例の目的は、双子葉植物で発現された場合、植物ウィルスによる後の感染 に対する兆候の軽減および耐性を生じる、植物ウィルス外皮蛋白遺伝子の発現用 の構築体を得ることにある（ポウェルーアベルら（Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ）　（１９８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２ニア２９参照） 。ウィルス外皮蛋白はいずれのナンバーの植物ウィルスクラス（ｔａｂａｍｏ、 ｃｕｃｕｍｏｓ　ｐｏｔｙ、　ｔｏｂｒａ、　ＡＭＰ等）からも単離され、それ らはＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターを取り付けた後、植物において構成的に発現 される。加えて、植物ポリ（Ａ）シグナルを３゛領域に付加して適当な発現を確 実とする。

いずれかの特定のウィルス外皮蛋白遺伝子を含有するクローンは植物ＤＮＡおよ びＲＮＡ両ウィルスについて得ることができる。キ二ウリモザイクウイルス株Ｃ （ＣＭＶ−Ｃ）がそのような場合であり；そのＲＮＡゲノムを二本鎖ｃ　ＤＮＡ にコピーし、外皮蛋白遺伝子を単離し、以下のごとくに特性をめた。イー・コリ ・ボリアデニロースを用いて、ＣＭＶ−Ｃ全ＲａＨの３°末端に残基を付加した 。

このポリ（Ａ）領域を用いてオリゴｄＴプラスマーをアニールし、これを１リバ ース・トランスリブトス（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｒｖｒｉｐｔｏｓ）およびＣ ＭＶ−ＣＳＳ　−ｃ　ＤＮ、Ａの適当な緩衝液を用いて一本鎖（ＳＳ）ｃ　ＤＮ Ａの合成起点とし、ＲＮａ　ｓ　ｏ　Ｈを添加してデュプレックスからＲＮＡを 除去することによって二本鎖ｃ　ＤＮＡを合成し、イー・コリＤＮＰポリメラー ゼＩ　（クレノー断片）および適当な緩衝液を添加することによって第二鎖を作 成した。ＣＭＡ−Ｃｄｓ−ＤＮＡの合成の後、ＥｃｏＲＩメチラーゼおよびＥｃ ｏメチレント（ｍｅｔｈｙｌｅｎｔ）緩衝液を用いてそれをイー・コリメチル化 し、かくしてＣＭＶ−Ｃｄ　ｓ　−ｃ　ＤＮＡ分子のすべての内部ＥｃｏＲ１部 位を保護した。Ｅｃｏメチル化の後、ＣＭＶ−Ｃｄ　ｓ−ｃ　ＤＮＡ分子をイー ・コリポリモース（ｐｏｌｙｍｏｒｓｅ）　Ｉ　（クレノー断片）で再度処理し て、すべての末端（５°および３゛）が平滑となることを確実とし、次いで、Ｔ ４−リガーゼを用いてこれらの分子をＥｃｏＲＩリンカ−に結んだ。結んだ後、 ＧＹＯＧカラム（ｌａｍＸ　３０ｃｍ）上のサイズ分別によって、ＣＭＶ−Ｃｄ 　ｓ　−ｃ　ＤＮＡ分子を不純物リンカ−から分離した。ＣＭＶ−Ｃｄ　ｓ　− ｃ　ＤＮＡ分子の大部分を含有する画分をエタノール沈殿させ、続いてＲ２０の ｌＯμｇに再懸濁した。これらのＥｃｏＲＩ連結ＣＭＶ−Ｃｄ　ｓ　−ｃ　ＤＮ Ａ分子の約１００μｇを取り出し、λｇＴ１１アーム（商業的に入手可能）の１ Ｈｇと混合し、Ｔ４リガーゼを用いて一緒に結んだ。

イー・コリＵｐ５０ｓｕｐＦを宿主として用いて組換体ＧＴＩＩ−ＣＭＶ−Ｃを 平板培養し、Ｐ−標識ＣＭＶ−ホワイト・リーフ（ｗｈｉｔｅ　１ｅａｆ）Ｓ　 Ｓ　−ｃ　ＤＮＡをプローブとして用い、これらのプレート（１０−’クローン ）を、ＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子コーディング領域を含有するクローンについて スクリーニングした。このスクリーニングからクローン、λ　ＧＴｌ　１−ＣＭ Ｖ９．９を単離した。それは、完全なＣＭＶ外皮蛋白をコード付けするのに充分 な１４００白遺伝子は、植物活性プロモーターおよびポリ（Ａ）シグナルをその ５゛および３°領域に各々連結させると、植物組織で発現され得る。

これを達成する図式はチャート３に示す。

まず、ラムダＧＴＩ　ｌ−ＣＭＶ９．９からのＥｃｏＲＩインサー）をＥｃｏＲ Ｉ切断のｐｕｃ１９（商業的に入手可能）にクローン化することによって得たク ローンｐＣＭＶ９．９の部分的なＡｃｃＩ消化および完全なＥｃｏＲＩ消化を行 うことによって、構成的カリフラワーモザイクウィルス（Ｃａ　ＭＶ）３５Ｓプ ロモーターの連結を行った。１１００ｂ　ｐ　ＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子断片を 取り出し、両端を平滑とし、この断片を、エイ・ティ・モーノ（Ａ、Ｔ、Ｍｏｈ ｎ）、フリートリック・ミージエン・インスティテユート（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｋ Ｍｉｅｓｃｈｅｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ベイセル（Ｂａｓｅｔ）、スイス国 から入手可能なｐ　ＤＨ５１のＳｍａＩ部位（ビエトルズクら（Ｐｉｅｔｒｚａ ｋ　ｅｔ　ａｌ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、）、１４：５８５７）にクローン化してクローンｐ　ＤＨ５１／ｃ　 ｐ　１９を得た。

これにより、ＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子をＣａＭＶ　３５Ｓ７’ロモーター下流 であってＣａＭＶポリ（Ａ）シグナル配列の上流に位置させた。高レベルの発現 を確実とするために、（Ｃａ、ＭＶ　３５Ｓポリ（Ａ）シグナルよりも良好に機 能し得る）種子貯蔵蛋白遺伝子ｐｈａｓｅｏｌｉｎからのポリ（Ａ）シグナル（ スライトムら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、ｅｔ　ａｌ）、（１９８３）　、プロシーデ ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）８０　：１９８７）のごとき他のポリ（Ａ） シグナル配列を連結させることができる。構築を容易とするために、ＥｃｏＲＩ 消化によって、この植物発現可能ＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子をクローンｐＤＨ５ １／ＣＰ１９から取り出し、１８００ｂｐ断片を（より多くの制限酵素部位を含 有し、アール・カイ（Ｒ，Ｋａｙ）博士、ワシントン州立大学、プルマン（ｐＨ １ｍａｎ）、ワシントン州から入手可能な）ｐＵｃ１８１３にクローン化した。

次いで、得られたクローン、ｐＵＣ８１３／ＣＰ１９をＨｉｎｄＩＩＩで部分的 に消化し、１８００ｂｐ断片をバイナリベクターｐＧＡ４８２にクローン化して 新しいクローン、りＧＡ４８２／ＣＰ　１９Ｈ（チャート３参照）を得た。この バイナリプラスミド、またはその誘導体はアグロバクテリウム株、Ａ２０Ｂ、Ｃ ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ５，Ａ４ＲＳ（ｐＲｉＢ２８ｂ ）およびその他に移入することができる。本発明の形質転換法を用い、この植物 発現可能ＣＭＶ−Ｃ外皮蛋白遺伝子（またはいずれかの他の植物ウィルス外皮蛋 白遺伝子）をキュウリ、カポチャ、メロン、ズッキーニ、コシヨウ等のごとき双 子葉植物種に移入することができる。これらの新しい栽培品種の育成は、特異的 ウィルスまたは（ｌを越えるウィルス外皮蛋白遺伝子構築体を単一の植物に移入 する場合は）ウィルス類による感染に対する耐性のために有用である。

実施例５　除草剤耐性の移入 本実施例の目的は、植物を特定の種類の除草剤に対して耐性とできる植物発現可 能遺伝子のつくり方を説明することにある。かかる植物は多くの理由；　（ｉ） 通常は致死的である除草剤を使用できる、および（ｉｉ）通常は第二の収穫に対 して致死的である従前に用いた除草剤の残量を含有するおそれがある土壌で異な る作物を間隔が狭い輪作で用いることができる；で有用である。注目する２種の 遺伝子は、クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）およびスルホメト ウロンメチル（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ　ｍｅｔｈｙｌ）除草剤に対して感受 性でないアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（ファルコら（Ｆａｌｃ ｏ　ｅｔａｌ）、（１９８５）バイオチク・プラント・サイエンス（Ｂｉｏｔｅ ｃｈ。

Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、）、アカデミツク・プレス・インコーホレイテッド（Ａｃ ａ−ｄｅＩＩｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）　、３１３頁）の（植物または細菌 源に由来する）突然変異誘導体ならび除草剤グリフォセ−１’　（ｇｌ）ｐｈｏ ｓａｔｅ）に対して感受性でないエノールビルビルレキメート−３−ボスフェー トシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコード付けする突然変異体（ストールカーら（Ｓ ｔａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２６０　：　４７２４）で ある。

特定の除草剤に対して耐性であるかまたはそれを解毒するかのいずれかである重 要な酵素をコード付けする遺伝子を、ＣａＭＶ３５Ｓ１リブロース−１，５−ビ ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子のごとき植物活性プロモ ーター、または他の強力なプロモーターから下流であって植物遺伝子ポリ（Ａ） シグナル配列の上流にクローン化した。チャート４参照。

次いで、この遺伝子をアグロバクテリウム由来ベクター（バイナリまたはｃｉｓ いずれか）にクローン化し、前記植物形質転換法を用いてかかる遺伝子を大豆、 インゲンマメ、コシヨウ、メロン等のごとき多（の双子葉植物種に移入する。

実施例６　昆虫耐性遺伝子 天然においては、害虫に対して毒性である多くのポリペプチドが存在する。最良 の公知蛋白毒物は種々の株のバチラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）　；例えば、双翅目（蚊およびブユ）に対し て活性なビイ・イスラレニス（Ｂ、１ｓｒａｅｌｅｎｉｓ）、鱗翅目に対して活 性なビイ・チューリンギエンシス（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｇｉｓ）、およ び鞘翅目に対して活性なビイ・サン・ジエゴ（Ｂ、　ｓａｎ　ｄｉｅｇｏ）に関 するものである。これらの各細菌で見い出される毒素蛋白は害虫な対して高度に 特異的であり；それらは他の生物に対しては毒性でない。かくして、植物におけ るかかる毒素蛋白をコード付けする遺伝子の移入および発現は化学殺虫剤を用い ることなく昆虫害を減少させるのに有用であり、それにより他の生物の危険を回 避する。これらの多くの毒素蛋白をコード付けする遺伝子が単離され、配列が決 定されている（シュネフら（Ｓｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａｌ）、（１９８５）ジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋ ＋、）２６０：６２６４；ワールライニックら（Ｗａａｌｗｉｊｋ　ｅｔ　ａｌ ）、（１９８５）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、）、１３：８２０７　；セカーら（Ｓｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌ）　（１ ９８７）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）８４　：　７０３６）　、ビイ・チューリ ンギエンシス毒素遺伝子のタバコへの移入および植物を昆虫害から保護するにお けるその有用性が報告されている（パニックら（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ）、（ １９８７）ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２８　：　３３）　、か（して、本明 細書中に記載する植物形質転換システムおよび植物発現可能バチラス毒素遺伝子 （チャート５参照）の使用の組み合わせにより、組織培養ベースの形質転換シス テムが不十分であるかまたは開発されていないインゲンマメ、大豆、メロン、キ ュウリ、カポチャ、ズッキーニ、コシヨウ等のいずれの双子葉植物種への有用な 特性移入も可能となる。

チャート！ ミニ遺伝子 チャート２ Ｂ９＋　植物　ｐｂａｓ　ＢＬ　１Ｌ ＨＳＳＰ−遺伝子 チャード３ ３５５　植物ウィルスからの外皮蛋白 チャート４ Σ−ｊ’ チャート５ 皿　植物　バチルスまたは　植物騒 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年６月８日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０４４６４ ２、発明の名称 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国ミシガン州４９００１．カラマズー、ヘンリエッタ・スト リート３０１番 名称　ジ・アップジョン・カンパニー　（ほか１名）４、代理人 住所　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号請求の範囲 １、（ａ）植物の種子を発芽させ； （ｂ）該種子の分化に先立って、発芽中に産生された分裂細胞または中胚軸細胞 を、アグロバクテリウム由来ベクター中の移入可能な遺伝子を含有するビルレン トまたは非ビルレント・アグロバクテリウム株で接種し；次いで （Ｃ）該細胞を成体植物に分化させることよりなり、ただし、該植物はアラビド プシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）科からのもの ではないことを特徴とする遺伝子導入植物生産用非組織培養方法。

２゜該ベクターがトランス−またはシス−立体配置での移入いずれかに適合した プラスミドである請求の範囲第１項記載の方法。

３、該ベクターがトランス立体配置での移入に適合したノくイナリプラスミドで ある請求の範囲第２項記載の方法。

４、該植物が双子葉植物である請求の範囲前記いずれかの項に記載の方法。

５．子葉の１つを接種に先立って除去することよりなる請求の範囲第４項記載の 方法。

６、該植物がマメ科（ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ）の成員である請求の範囲第４ 項または第５項記載の方法。

７、該植物が大豆である請求の範囲第６項記載の方法。

８、該植物がインゲンマメである請求の範囲第６項記載の方法。

９、該植物遺伝子がファゼオリンについての遺伝子である請求の範囲第８項記載 の方法。

１０、請求の範囲前記いずれかの項に記載の方法によって調製された天然に生じ ない遺伝子を含有する植物。

国際調査報告 １＋＋１＋＋ｆｆｎ１ｌ。ＭＩＡ工１１１□、ｓ、ＩＮＬＰＣＴ／ＵＳ　８８１ ０４を仄ｌ＋１１１６１Ｒａ１１ｍｌｌＡｌ＾ｅ１１−一口ｗ＋−・−ｘ＊−Ｐ ＣＴ／υｓ８Ｂ１０４４６４国際調査報告 ＵＳ　８８０４４６４ ＳＡ　２５９５０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）植物の種子を発芽させ： （ｂ）その分化に先立って、発芽中に産生された分裂細胞または中胚軸細胞を、 アグロバクテリウム由来ベクター中の移入可能な遺伝子を含有するピルレントま たは非ビルレソト・アグロバクテリウム株で接種し：次いで （ｃ）該細胞を成体植物に分化させることよりなり、ただし、該植物はアラビド プシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）科からのもの ではないことを特徴とする遺伝子導入植物の生産方法。
2. ２．該ベクターがトランス−またはシス−立体配置での移入いずれかに適合した プラスミドである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該ベクターがトランス立体配置での移入に適合するバイナリプラスミドであ る請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．該植物が双子葉植物である請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．子葉の１つを接種に先立って除去する請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．請求の範囲第１項記載の方法によって生産された遺伝子導入植物。
7. ７．請求の範囲第６項記載の遺伝子導入双子葉植物。
8. ８．該植物がマメ科（１ｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ）の成員である請求の範囲第７ 項記載の植物。
9. ９．該植物が大豆である請求の範囲第８項記載の植物。
10. １０．該植物がインゲンマメである請求の範囲第９項記載の植物。
11. １１．該植物遺伝子がファゼオリンについての遺伝子である請求の範囲第１０項 記載の植物。