BRPI0817482B1

BRPI0817482B1 - uso de um anticorpo do receptor da interleucina-6 (il-6) no tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd)

Info

Publication number: BRPI0817482B1
Application number: BRPI0817482A
Authority: BR
Inventors: Mihara Masahiko; Moriya Yoichiro
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-10-02
Filing date: 2008-10-01
Publication date: 2020-01-14
Also published as: JP5264752B2; HK1145288A1; RU2010117171A; RU2490025C2; CN101815532B; TWI468173B; BR122019021238B8; US8529895B2; AU2008308163B2; BRPI0817482B8; EP2196220A1; TW200932262A; BR122019021238B1; US20100255007A1; KR20100075591A; AU2008308163A1; KR101601986B1; BRPI0817482A2; CA2701155A1; JPWO2009044774A1

Abstract

uso de um anticorpo do receptor da interleucina-6 (il-6) no tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd) a presente invenção refere-se a um novo agente terapêutico para a doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd). um agente terapêutico para a doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd), que compreende um inibidor do receptor da interleucina-6 (il-6) como um ingrediente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE UM ANTICORPO DO RECEPTOR DA INTERLEUCINA-6 (IL-6) NO TRATAMENTO DA DOENÇA DO ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO (GVHD).

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a agentes terapêuticos para a doença do enxerto versus hospedeiro. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a agentes terapêuticos para a doença do enxerto versus hospedeiro, que compreendem um inibidor do receptor da interleucina-6 (IL-

6) como um ingrediente ativo.

Técnica Antecedente

Embora tumores hematopoiéticos tais como leucemia sejam primeiramente tratados por quimioterapia com agentes anticâncer, os pacientes difíceis de curar ou com menor probabilidade de cura com a quimioterapia tradicional requerem ainda transplante de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, células-tronco de sangue periférico, células de medula óssea). No entanto, já foi mostrado que o transplante de células-tronco hematopoiéticas vai causar a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).

GVHD é um nome genérico para as doenças que são causadas pela reação imunológica de células imunocompetentes transferidas ou transplantadas contra tecidos do hospedeiro. Isto se dá principalmente porque as células imunocompetentes (por exemplo, células T maduras) contidas no sangue periférico a ser transferido ou transplantado vão provocar respostas imunológicas contra os tecidos do receptor. GVHD inclui tanto os tipos agudos quanto os tipos crônicos de doenças com sintomas tais como sintomas de pele, diarreia e icterícia, que podem desenvolver um efeito severo levando à morte em alguns casos.

As técnicas convencionalmente usadas para suprimir GVHD incluem aquelas baseadas no uso de agentes imunossupressores tais como metotrexato ou ciclosporina A, assim como aquelas baseadas na remoção de células T maduras de um grupo de células transplantadas (enxerto). No caso de ser usado o metotrexato ou a ciclosporina A, surge o problema dos

Petição 870190099363, de 04/10/2019, pág. 13/15

2/30 seus efeitos colaterais no corpo. Sabe-se que a ciclosporina A apresenta uma forte nefrotoxicidade como um efeito colateral, ao passo que o metotrexato causa supressão da medula óssea como um efeito colateral.

Por outro lado, a remoção de células T maduras de um grupo de células transplantadas possibilita a supressão de GVHD, mas apresenta a desvantagem de que o efeito antitumoral fica atenuado levando, por exemplo, à reincidência da leucemia (Documento não-Patente 1).

Interleucina 6 (IL-6) é uma citocina chamada fator estimulante de células B 2 (BSF2) ou interferon β2. A IL-6 foi descoberta como um fator de diferenciação envolvido na ativação de linfócitos B (Documento não-Patente 2), e mais tarde revelou-se uma citocina multifuncional que influencia o funcionamento de várias células (Documento não-Patente 3). Já foi relatado que a IL-6 induz a maturação de linfócitos T (Documento não-Patente 4).

A IL-6 transmite sua atividade biológica por meio de dois tipos de proteínas na célula. O primeiro tipo de proteína é o receptor de IL-6, que é uma proteína fixadora de ligante à qual a IL-6 se liga; ela tem um peso molecular de cerca de 80 kDa (Documentos não-Patentes 5 e 6). O receptor de IL-6 está presente em uma forma ligada à membrana que penetra e é expressa na membrana celular, e também como um receptor de IL-6 solúvel, que consiste principalmente na região extracelular da forma ligada à membrana.

O outro tipo de proteína é a proteína membranosa gp130, que tem um peso molecular de cerca de 130 kDa e está envolvida na transdução de sinais não fixadores de ligante. A atividade biológica da IL-6 é transmitida para dentro da célula através da formação de um complexo IL-6/receptor de IL-6 a partir de IL-6 e receptor de IL-6 seguida da ligação do complexo com a gp130 (Documento não-Patente 7).

Inibidores de IL-6 são substâncias que inibem a transmissão da atividade biológica da IL-6. Atualmente, os inibidores de IL-6 conhecidos incluem anticorpos contra (anticorpos anti-IL-6), anticorpos contra o receptor de IL-6 (anticorpos antirreceptor de IL-6), anticorpos contra gp130 (anticorpos anti-gp130), variantes de IL-6, peptídios parciais da IL-6 ou do receptor

3/30 de IL-6, entre outros.

Existem vários trabalhos sobre anticorpos antirreceptor de IL-6 (Documentos não-Patentes 8 e 9, Documentos de Patente 1 a 3). Um desses trabalhos relata um anticorpo PM-1 humanizado, que é obtido por enxerto da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo PM-1 de camundongo (Documento não-Patente 10), que é um anticorpo contra o receptor da IL-6, dentro de um anticorpo humano (Documento de Patente 4).

Anticorpos contra o receptor de IL-6 são usados para tratamento de doenças inflamatórias tais como reumatismo. No entanto, as citocinas inflamatórias incluindo IL-6 formam uma rede complexa, e por conseguinte ainda não está claro se inibidores do receptor de IL-6 são eficazes para tratamento de outras doenças tais como doença do enxerto versus hospedeiro.

Na verdade, já foi reportado que nenhum efeito terapêutico foi obtido em modelos de camundongos com GVHD expressando IL-6 mesmo quando medicados com um anticorpo anti-IL-6 (Documento não-Patente 11).

Documentos da técnica anterior relevantes para a presente invenção estão mostrados abaixo.

Documento não-Patente 1: Marmont, AM. Et al., Blood (1991) 78,2120-2123

Documento não-Patente 2: Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76

Documento não-Patente 3: Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78

Documento não-Patente 4: Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258

Documento não-Patente 5: Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981

Documento não-Patente 6: Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241,825-828

Documento não-Patente 7: Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573581

Documento não-Patente 8: Novick, D. et al., Hybridoma (1991)

4/30

10, 137-146

Documento não-Patente 9: Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630

Documento não-Patente 10: Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906

Documento não-Patente 11: Knulst A. C. et al., Mediators of Inflammation (1994) 3, 33-40

Documento de Patente 1: Publicação de Patente Internacional N° WO 95/09873

Documento de Patente 2: Publicação de Patente Francesa N° FR 2694767

Documento de Patente 3: Patente US N° US 5216128

Documento de Patente 4: Publicação de Patente Internacional N° WO 92/19759

Descrição da Invenção

Problemas a serem resolvidos pela invenção

Funções detalhadas do receptor de IL-6 em GVHD ainda continuam desconhecidas. Também, ainda não foi esclarecido qual efeito é produzido na GVHD pela administração de inibidores do receptor de IL-6.

A presente invenção foi realizada nas circunstâncias descritas acima. O objetivo da presente invenção é oferecer novos agentes terapêuticos para GVHD.

Meios para resolver os problemas

Como resultado de longos e imensos esforços feitos para atingir o objetivo acima, os inventores da presente invenção descobriram que o anticorpo contra o receptor de IL-6 produz um efeito terapêutico notável em modelos de camundongos com GVHD. Esta descoberta levou à conclusão da presente invenção.

A saber, a presente invenção fornece mais especificamente os itens 1 a 5 mostrados abaixo.

1- Um agente terapêutico para a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), que compreende um inibidor do receptor da interleucina-6

5/30 (IL-6) como ingrediente ativo.

2- O agente terapêutico para GVHD de acordo com o item 1 acima, onde o inibidor do receptor de IL-6 é um inibidor do receptor de IL-6 humana.

3- O agente terapêutico para GVHD de acordo com o item 1 acima, onde o inibidor do receptor de IL-6 é um anticorpo contra o receptor da IL-6.

4- O agente terapêutico para GVHD de acordo com o item 3 acima, onde o anticorpo contra o receptor de IL-6 é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.

5- O agente terapêutico para GVHD de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4 acima, destinado ao tratamento de GVHD subsequente a transplante de células-tronco do sangue periférico.

6- Um método para tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor do receptor da interleucina-6 (IL-6).

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um gráfico mostrando o tempo das alterações no peso corporal de camundongos com GVHD induzida no grupo com o anticorpo contra o receptor de IL-6 e no grupo de controle.

Melhor modo de realizar a invenção

Neste relatório, um inibidor do receptor de IL-6 é uma substância que bloqueia a transdução de sinais mediada pelo receptor de IL-6 e inibe a atividade biológica do receptor de IL-6. Tal inibidor do receptor de IL-6 pode ser uma substância que inibe diretamente a atividade biológica do receptor de IL-6 embora se ligue ao receptor de IL-6 ou pode ser uma substância que inibe indiretamente a atividade biológica do receptor de IL-6 através de ligação a uma outra substância tal como gp130, mas é de preferência uma substância que se liga ao receptor de IL-6 e tem atividade inibitória contra a ligação entre a IL-6 e o receptor de IL-6.

Os inibidores do receptor de IL-6 da presente invenção incluem, porém sem limitação, anticorpos contra o receptor de IL-6, variantes solúveis

6/30 do receptor de IL-6, peptídios parciais receptor de IL-6 e compostos de baixo peso molecular que mostram atividades similares. Exemplos preferidos dos inibidores do receptor de IL-6 da presente invenção incluem anticorpos que reconhecem o receptor de IL-6.

A fonte dos anticorpos contra o receptor de IL-6 usados na presente invenção não é particularmente limitada; no entanto, os anticorpos são de preferência derivados de mamíferos.

Os anticorpos contra o receptor de IL-6 usados na presente invenção podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando-se métodos conhecidos. Em particular, os anticorpos contra o receptor de IL-6 usados na presente invenção são de preferência anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Os anticorpos monoclonais derivados de mamíferos incluem aqueles produzidos a partir de hibridomas e aqueles produzidos pelo uso de métodos de engenharia genética a partir de hospedeiros transformados com um vetor de expressão que compreende o gene de um anticorpo. Por meio de sua ligação ao receptor de IL-6, o anticorpo inibe a ligação da IL-6 ao receptor de IL-6, e dessa forma bloqueia a transmissão da atividade biológica de IL-6 para a célula.

Exemplos de tais anticorpos incluem o anticorpo MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 11924-11928); o anticorpo PM-1 (Hirata, Y. et ai., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); o anticorpo AUK12-20, o anticorpo AUK64-7 e o anticorpo AUK146-15 (WO 92/19759); tocilizumab; e assim por diante. Destes, o anticorpo PM-1 pode ser exemplificado como um anticorpo monoclonal preferido contra o receptor de IL-6 humana, e o anticorpo MR16-1 como um anticorpo monoclonal preferido contra o receptor de IL-6 de camundongo.

Basicamente, hibridomas que produzem anticorpo monoclonal contra o receptor de IL-6 podem ser preparados usando-se técnicas conhecidas, como a seguir: especificamente, tais hibridomas podem ser preparados usando-se o receptor de IL-6 como um antígeno sensibilizante para realizar imunização por um método de imunização convencional, fundindo-se as células imunes obtidas com uma célula parental conhecida usando-se um

7/30 método de fusão de células convencional, e rastreando-se células produtoras de anticorpos monoclonais usando-se um método de rastreamento convencional.

Mais especificamente, os anticorpos contra o receptor de IL-6 podem ser produzidos da seguinte maneira: por exemplo, o receptor de IL-6 humana ou o receptor de IL-6 de camundongo para uso como um antígeno sensibilizante para obtenção de anticorpos pode ser obtido usando-se os genes do receptor de IL-6 e/ou as sequências de aminoácidos descritas na Publicação de Patente Européia N° EP 325474 e JP 3-155795 A, respectivamente.

Existem dois tipos de proteínas receptoras de IL-6: uma expressa na membrana celular e a outra separada da membrana celular (receptor de IL-6 solúvel) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). O receptor de IL-6 solúvel consiste essencialmente na região extracelular do receptor de IL-6 ligado à membrana celular, e difere do receptor de IL-6 ligado à membrana por não ter a região transmembranosa ou as regiões transmembranosa e intracelular. Qualquer receptor de IL-6 pode ser empregado como proteína receptora de IL-6, contanto que possa ser usado como antígeno sensibilizante para produzir o anticorpo contra o receptor de IL-6 usado na presente invenção.

Depois de transformar uma célula hospedeira apropriada com um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma sequência de genes do receptor de IL-6, a proteína receptora de IL-6 desejada é purificada do interior da célula hospedeira ou do sobrenadante de cultura usandose um método conhecido. Esta proteína receptora de IL-6 purificada pode ser usada como antígeno sensibilizante. Alternativamente, uma célula expressando o receptor de IL-6 ou uma proteína de fusão entre a proteína receptora de IL-6 e uma outra proteína pode ser usada como antígeno sensibilizante.

Os mamíferos a serem imunizados com um antígeno sensibilizante não são particularmente limitados, mas são de preferência selecionados levando-se em consideração sua compatibilidade com a célula parental

8/30 usada para a fusão de células. Em geral, são usados roedores tais como camundongos, ratos, e hamsters.

Os animais são imunizados com um antígeno sensibilizante de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, como um método geral, os animais são imunizados por injeção intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno sensibilizante. Especificamente, o antígeno sensibilizante é de preferência diluído ou suspendido em uma quantidade apropriada de solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina fisiológica, entre outras, e, se desejado, ele é ainda misturado e emulsificado com uma quantidade apropriada de um adjuvante comumente usado (por exemplo, adjuvante completo de Freund), e em seguida administrado a um mamífero várias vezes, a intervalos de quatro a 21 dias. Além disso, um veículo apropriado pode ser usado para imunização com um antígeno sensibilizante.

Subsequente a tal imunização, um nível aumentado de um anticorpo desejado no soro é confirmado e então as células imunes são retiradas do mamífero para a fusão de células. As células imunes preferidas para a fusão de células incluem, em particular, células do baço.

Células de mieloma de mamíferos usadas como células parentais, isto é, como células participantes a serem fundidas com as células imunes acima, incluem várias linhagens celulares conhecidas, por exemplo, P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-

7), NS-1 (Kohler, G. & Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S„ J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), entre outras.

Basicamente, a fusão de células das células imunes e células de mieloma acima mencionadas pode ser efetuada usando-se métodos conhecidos, por exemplo, o método de Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), entre outros.

Mais especificamente, a fusão de células acima mencionada é

9/30 obtida em um meio de cultura de nutrientes padrão na presença de um agente intensificador de fusão de células. Por exemplo, polietileno glicol (PEG), vírus Sendai (HVJ), entre outros, são usados com agentes intensificadores de fusão. Além disso, para aumentar a eficiência de fusão, agentes auxiliares tais como sulfóxido de dimetila podem ser adicionados, conforme a necessidade.

A proporção de células imunes para células de mieloma usadas é de preferência, por exemplo, 1 a 10 células imunes para cada célula de mieloma. O meio de cultura para a fusão de células acima mencionada é, por exemplo, o meio de cultura RPMI1640 ou MEM, que é adequado para proliferação das células de mieloma acima mencionadas. Um meio de cultura padrão usado para a cultura desse tipo de célula também pode ser usado. Além disso, suplementos séricos tais como soro de bezerro fetal (FCS) podem ser usados de forma combinada.

Para a fusão de células, as células de fusão (hibridomas) de interesse são formadas por misturação de quantidades predeterminadas de uma célula imune e uma célula de mieloma acima mencionadas em um meio de cultura mencionado acima, e em seguida adição de uma solução de PEG (por exemplo, uma solução de PEG com um peso molecular médio de cerca de 1.000 a 6.000) preaquecido até cerca de 37°C a uma concentração de 30% a 60% (p/v). Em seguida, os agentes de fusão de células, entre outros, que não são adequados para o crescimento de hibridomas podem ser removidos por adição repetida de um meio de cultura apropriado e em seguida remoção do sobrenadante por centrifugação.

Os hibridomas acima são selecionados por meio de seu cultivo em um meio de cultura de seleção padrão, por exemplo, o meio de cultura HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). A cultura no meio de cultura HAT continua por um período de tempo suficiente, geralmente vários dias a várias semanas, para eliminar as células que não sejam os hibridomas de interesse (células não fundidas). Em seguida, um método de diluição limitada tradicional é realizado para rastreamento e clonagem dos hibridomas que produzem um anticorpo de interesse.

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Além dos métodos para imunização de animais não-humanos com antígenos para obtenção dos hibridomas mencionados acima, anticorpos humanos desejados com a atividade de ligação a um antígeno desejado ou a uma célula expressando o antígeno desejado podem ser obtidos por sensibilização de um linfócito humano uma proteína do antígeno desejado ou com uma célula expressando o antígeno desejado in vitro, e fusão do linfócito B sensibilizado com uma célula de mieloma humano (por exemplo, U266) (vide JP 1-59878 B). Além disso, um anticorpo humano desejado pode ser obtido por administração de um antígeno ou de uma célula expressando o antígeno a um animal transgênico que tem um repertório de genes de anticorpos humanos, empregando-se em seguida do método mencionado acima (vide Publicação de Patente Internacional N^oSW0 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, e WO 96/33735).

Os hibridomas assim preparados que produzem anticorpos monoclonais podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional e armazenados em nitrogênio líquido por um longo período.

Para se obter anticorpos monoclonais dos hibridomas mencionados acima, os seguintes métodos podem ser empregados: um método no qual os hibridomas são cultivados de acordo com métodos convencionais e os anticorpos são obtidos como sobrenadante de cultura; um método no qual os hibridomas são administrados a um mamífero compatível e proliferados no mesmo e os anticorpos são obtidos como ascites; entre outros. O primeiro método é o método preferido para obtenção de anticorpos com alta pureza, e o segundo é o método preferido para produção de anticorpos em grande escala.

Por exemplo, hibridomas produtores de anticorpos contra o receptor de IL-6 podem ser preparados pelo método apresentado no documento JP 3-139293 A. Tais hibridomas podem ser preparados por injeção de um hibridoma produtor do anticorpo PM-1 na cavidade abdominal de um camundongo BALB/c, obtenção de ascites, e em seguida purificação ao anticorpo PM-1 dos ascites; ou por cultura do hibridoma em um meio apropriado (por exemplo, meio RPMI1640 contendo 10% de soro bovino fetal e 5% de

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BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); meio hibridoma SFM (GIBCOBRL); meio PFHM-II (GIBCO-BRL), etc.) e em seguida obtenção do anticorpo PM-1 do sobrenadante da cultura.

Anticorpos recombinantes podem ser usados como os anticorpos monoclonais da presente invenção, onde os anticorpos são produzidos usando-se técnicas de recombinação genética por clonagem do gene de um anticorpo de um hibridoma, inserção do gene em um vetor apropriado, e então introdução do vetor em um hospedeiro (vide, por exemplo, Borrebaeck, C. A. K. & Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino Unido por Macmillan Publishers Ltd, 1990).

Mais especificamente, mRNAs codificando regiões variáveis (V) do anticorpo são isolados de células que produzem anticorpos de interesse, tais como hibridomas. mRNAs podem ser isolados através da preparação de RNAs totais de acordo com métodos conhecidos, tais como o método de ultracentrigufação de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) e o método de AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), e preparação de mRNAs usando um kit de purificação de mRNA (Pharmacia) entre outros. Alternativamente, mRNAs podem ser preparados diretamente usando um kit de purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia).

cDNAs das regiões V do anticorpo são sintetizados a partir dos mRNAs obtidos usando-se transcriptase reversa. Os cDNAs podem ser sintetizados usando-se um kit de síntese de cDNA de primeira fita de transcriptase reversa AMV AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit entre outros. Além disso, para sintetizar e amplificar os cDNAs, o método 5-RACE (Frohman, Μ. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) usando um Kit 5’-Ampli FINDER RACE (Clontech) e PCR pode ser usado. Um fragmento de DNA de interesse é purificado dos produtos de PCR obtidos e em seguida ligado com o DNA de um vetor. Em seguida, um vetor recombinante é preparado usando-se o DNA acima e introduzido em Escherichia coli ou similar, e então suas colônias são selecionadas para preparar

12/30 um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeos do DNA de interesse é confirmada por um método conhecido, por exemplo, o método de didesóxi.

Depois que o DNA codificando a região V de um anticorpo de interesse é obtido, o DNA é ligado ao DNA que codifica uma região constante (região C) do anticorpo desejado, e inserido em um vetor de expressão. Alternativamente, o DNA codificando a região V de um anticorpo pode ser inserido em um vetor de expressão compreendendo o DNA de uma região C do anticorpo.

Para produzir um anticorpo a ser usado na presente invenção, descrito abaixo, um gene de anticorpo é inserido em um vetor de expressão para que ele seja expresso sob o controle de uma região reguladora de expressão, por exemplo, um intensificador e um promotor. Em seguida, o anticorpo pode ser expresso transformando-se uma célula hospedeira com esse vetor de expressão.

Na presente invenção, para reduzir a heteroantigenicidade contra seres humanos, entre outros, anticorpos recombinantes genéticos artificialmente modificados, por exemplo, anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados, podem ser usados. Esses anticorpos modificados podem ser preparados usando-se métodos conhecidos.

Um anticorpo quimérico pode ser obtido por ligação do DNA codificando a região V de um anticorpo, obtido acima, com um DNA codificando a região C de um anticorpo humano, e em seguida inserção do DNA em um vetor de expressão e introdução do mesmo em uma célula para produção (vide Publicação de Patente Européia N° EP 125023; Publicação de Patente Internacional N° WO 92/19759). Este método conhecido pode ser usado para obtenção de anticorpos quiméricos úteis na presente invenção.

Anticorpos humanizados também são chamados anticorpos humanos remodelados, e são anticorpos nos quais as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero não humano (por exemplo, um anticorpo de camundongo) são enxertadas nas CDRs de anticorpos humanos. Métodos genéricos para esta recombinação genéti

13/30 ca também são conhecidos (vide Publicação de Patente Européia N° EP 125023, Publicação de Patente Internacional N° WO 92/19759).

Mais especificamente, as sequências de DNA criadas para que as CDRs de um anticorpo de camundongo sejam ligadas às regiões de esqueleto (FRs) de um anticorpo humano são sintetizadas por PCR a partir de diversos oligonucleotídeos produzidos para conter porções sobrejacentes em seus terminais. O DNA obtido é ligado ao DNA codificando a região C do anticorpo humano e em seguida inserido em um vetor de expressão. O vetor de expressão é introduzido em um hospedeiro para produzir o anticorpo humanizado (vide Publicação de Patente Européia N° EP 239400, Publicação de Patente Internacional N° WO 92/19759).

As FRs de anticorpo humano a serem ligadas via as CDRs são selecionadas de modo que as CDRs formem sítios fixadores de antígeno adequados. Os aminoácidos dentro das FRs das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos se necessário de modo que as CDRs do anticorpo humano remodelado formem sítios fixadores de antígeno apropriados (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

As regiões C de anticorpo humano geralmente são usados para anticorpos quiméricos e humanizados. Exemplos de regiões C da cadeia pesada de anticorpos humanos incluem Cy, Ca, C μ, Cô e Ce, e por exemplo, Cy1, Cy2, Cy3 ou Cy4 podem ser usadas. Exemplos de regiões C da cadeia leve de anticorpos humanos incluem κ ou λ. Além disso, para aumentar a estabilidade dos anticorpos ou sua produção, as regiões C de anticorpos humanos podem ser modificadas.

Anticorpos quiméricos consistem nas regiões variáveis de um anticorpo derivado de um mamífero não-humano e nas regiões constantes de um anticorpo derivado de um ser humano; anticorpos humanizados consistem nas CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não-humano e nas regiões de esqueleto e regiões constantes derivadas de um anticorpo humano. Estes possuem antigenicidade reduzida no corpo humano, e são portanto úteis como anticorpos para uso na presente invenção.

Exemplos específicos preferidos de anticorpos humanizados

14/30 para uso na presente invenção incluem o anticorpo PM-1 humanizado (tocilizumab; vide Publicação de Patente Internacional N° WO 92/19759). Alternativamente, também são possíveis formas modificadas do anticorpo PM-1 humanizado, que são criadas de modo a compreender substituições, deleções, adições ou outras modificações na sequência de aminoácidos do anticorpo PM-1 humanizado.

Além disso, além dos métodos mencionados acima para obtenção de anticorpos humanos, técnicas para obter anticorpos humanos por panning usando uma biblioteca de anticorpos humanos também são conhecidas. Por exemplo, as regiões variáveis de anticorpos humanos podem ser expressas nas superfícies de fagos como anticorpos de cadeia simples (scFv) usando-se o método de exposição em fagos para dessa forma selecionar fagos fixadores de antígeno. Através da análise dos genes dos fagos selecionados, as sequências de DNA codificando as regiões variáveis do anticorpo humano que se ligam ao antígeno podem ser determinadas. Depois que a sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é revelada, um vetor de expressão apropriado compreendendo a sequência pode ser construída para obter um anticorpo humano. Estes métodos já são conhecidos, e as publicações das patentes WO 92/01047, WO 92/20791, WO93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388 podem ser usadas como referência.

Os genes de anticorpos construídos acima podem ser expressos de acordo com métodos convencionais. Quando uma célula de mamífero é usada, o gene de anticorpo pode ser expresso usando-se um DNA no qual o gene de anticorpo a ser expresso é operacionalmente ligado a um promotor útil comumente usado e um sinal poli A a jusante do gene de anticorpo, ou usando-se um vetor compreendendo o DNA. Exemplos de um promotor/intensificador incluem o promotor/intensificador prematuro imediato do citomegalovírus.

Além disso, outros promotores/intensificadores que podem ser usados para expressar os anticorpos para uso na presente invenção incluem promotores/intensificadores de retrovirus, vírus do polioma, adenovirus, ví

15/30 rus símio 40 (SV40), entre outros; e também incluem promotores/intensificadores derivados de células de mamíferos tais como o fator de alongamento humano 1a (HEF1a).

Por exemplo, quando se usa o promotor/intensificador de SV40, a expressão pode ser facilmente realizada de acordo com o método de Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114). Alternativamente, no caso de se usar o promotor/intensificador HEF1a, o método de Mizushima et al. (Mizushima, S. & Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) pode ser usado.

Sistemas de produção usando células hospedeiras procarióticas incluem aqueles que usam células bacterianas. Células bacterianas conhecidas incluem E. coli e Bacillus subtilis.

Quando E. coli é usado, um gene de anticorpo pode ser expresso ligando-se operacionalmente um promotor convencional útil, uma sequência de sinais para secreção do anticorpo, e o gene de anticorpo a ser expresso. Exemplos de tal promotor incluem o promotor lacZ, o promotor araB entre outros. Quando o promotor lacZ é usado, os genes podem ser expressos de acordo com o método de Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); e promotor araB pode ser usado de acordo com o método de Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).

Quando um anticorpo é produzido no periplasma de E. coli, a sequência de sinais pel B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 43794383) pode ser usada como uma sequência de sinais para secreção do anticorpo. Os anticorpos produzidos no periplasma são isolados e novamente dobrados apropriadamente antes do uso (vide por exemplo, WO 96/30394).

Quanto à origem da replicação, aqueles derivados do SV40, do vírus do polioma, do adenovirus, do vírus do papiloma bovino (BPV), entre outros, podem ser usados. Além disso, para aumentar o número de cópias do gene em um sistema de células hospedeiras, o vetor de expressão pode compreender o gene da aminoglicosídeo fosfotransferase (ΑΡΗ), o gene da timidina quinase (TK), o gene da xantina-guanina fosforibosiltransferase de

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E. coli (Ecogpt), o gene da desidrofolato redutase (dhfr), entre outros, como um marcador de seleção.

Qualquer sistema de produção pode ser usado para preparar os anticorpos para uso na presente invenção. Os sistemas de produção para a preparação de anticorpos incluem sistemas de produção in vitro e in vivo. Os sistemas de produção in vitro incluem aqueles que usam células eucarióticas ou células procarióticas.

Os sistemas de produção que usam células eucarióticas incluem aqueles que usam células animais, células vegetais, ou células fúngicas. Tais células animais incluem (1) células de mamíferos, por exemplo, CHO, COS, mieloma, rim de filhote de hamster (BHK), HeLa, Vero, entre outras; (2) células de anfíbios, por exemplo, oócito de Xenopus' e (3) células de insetos, por exemplo, sf9, sf21, Tn5, entre outras. As células vegetais conhecidas incluem aquelas derivadas de Nicotiana tabacum, que podem ser cultivadas como um calo. As células fúngicas conhecidas incluem leveduras tais como Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae), fungos do tipo mofo tais como Aspergillus (por exemplo, A. niger), entre outras.

Os anticorpos podem ser obtidos usando-se transformação para introduzir um gene do anticorpo de interesse dentro dessas células, e em seguida cultura das células transformadas in vitro. As culturas são conduzidas de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM podem ser usados como o meio de cultura, e suplementos séricos tais como FCS podem ser usados de forma combinada. Além disso, as células introduzidas com o gene de anticorpo podem ser transferidas para a cavidade abdominal, entre outras, de um animal para produzir os anticorpos in vivo.

Por outro lado, os sistemas de produção in vivo incluem aqueles que usam animais ou plantas. Os sistemas de produção que usam animais incluem aqueles que usam mamíferos ou insetos.

Mamíferos que podem ser usados incluem cabras, porcos, carneiros, camundongos, bovinos, entre outros (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Além disso, insetos que podem ser usados

17/30 incluem o bicho-da-seda. Quando se usa plantas, pode-se usar tabaco, por exemplo.

Um gene de anticorpo é introduzido nesses ou plantas, e o anticorpo é produzido no corpo dos animais ou plantas e em seguida recuperados. Por exemplo, um gene de anticorpo pode ser preparado como um gene de fusão sendo inserido no meio de um gene codificando uma proteína tal como β caseína de cabra, que só é produzida no leite. Fragmentos de DNA compreendendo o gene de fusão, que inclui o gene de anticorpo, são injetados em embriões de cabra, e os embriões são introduzidos em cabras. O anticorpo desejado é obtido do leite produzido pelos animais transgênicos nascidos das cabras que receberam os embriões, ou produzidos por descendentes desses animais. As cabras transgênicas podem receber hormônios para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado que elas produzem (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Quando bichos-da-seda são usados, os bichos-da-seda são infectados com baculovírus que teve inserido um gene do anticorpo desejado, e o anticorpo desejado é obtido dos fluidos corporais desses bichos-da-seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Ademais, quando tabaco é usado, um gene do anticorpo desejado é inserido em um vetor de expressão de uma planta (por exemplo, pMON530) e o vetor é introduzido em células bacterianas tais como Agrobacterium tumefaciens. Essas células bacterianas são usadas para infectar o tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacum) de modo que os anticorpos desejados podem ser obtidos das folhas desse tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Quando anticorpos são produzidos usando sistemas de produção in vitro ou in vivo, como descrito acima, DNAs codificando uma cadeia pesada (cadeia H) e uma cadeia leve (cadeia L) do anticorpo podem ser inseridos em vetores de expressão separados e cotransformados em um hospedeiro. Alternativamente, DNAs codificando as cadeias H e L podem ser inseridos em um único vetor de expressão para serem transformados em um hospedeiro (vide Publicação de Patente Internacional N° WO 94/11523).

Os anticorpos usados na presente invenção podem ser fragmen

18/30 tos de anticorpos ou produtos modificados dos mesmos, contanto que possam ser usados de forma adequada na presente invenção. Por exemplo, fragmentos de anticorpos incluem Fab, F(ab’)2, Fv, e a cadeia simples Fv (scFv), onde as Fvs das cadeias H e L são ligadas por meio de um ligador apropriado.

Especificamente, os fragmentos de anticorpos são produzidos por tratamento dos anticorpos com enzimas, por exemplo, papaína ou pepsina, ou, alternativamente, genes codificando esses fragmentos são construídos, introduzidos em vetores de expressão, e em seguida expressos em células hospedeiras apropriadas (vide por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, Μ. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663666; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv podem ser obtidas por ligação da região V da cadeia H e da região V da cadeia L de um anticorpo. Nas scFv, a região V da cadeia H e a região V da cadeia L são ligadas por meio de um ligador peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 5879-5883). As regiões V das cadeias H e L nas scFv podem ser derivadas de qualquer dos anticorpos descritos acima. Ligadores peptídicos para ligar as regiões V incluem, por exemplo, peptídios de cadeia simples arbitrários consistindo em 12 a 19 resíduos de aminoácidos.

DNA codificando scFv pode ser obtido usando-se um DNA codificando a cadeia H ou a região V da cadeia H do anticorpo acima e um DNA codificando a cadeia L ou a região V da cadeia L do anticorpo acima como gabaritos em PCR para amplificar a porção do DNA que codifica uma sequência de aminoácidos desejada na sequência do gabarito com iniciadores que definem os terminais da porção, e em seguida amplificando-se ainda mais a porção de DNA amplificada com um DNA que codifica um ligador peptídico e pares de iniciadores que ligam ambas as extremidades do ligador às cadeias H e L, respectivamente.

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Depois de ser obtido um DNA codificando scFv, um vetor de expressão compreendendo o DNA e uma célula transformada com o vetor pode ser obtido de acordo com métodos convencionais. Além disso, a scFv pode ser obtida de acordo com métodos convencionais usando o hospedeiro.

Esses fragmentos de anticorpos podem ser produzidos a partir dos hospedeiros através da obtenção e expressão de seus genes, como descrito acima. Neste relatório, o termo anticorpo abrange tais fragmentos de anticorpos.

Anticorpos ligados a várias moléculas, tais como polietileno glicol (PEG), também podem ser usados como anticorpos modificados. Neste relatório, o termo anticorpo abrange tais anticorpos modificados. Esses anticorpos modificados através de modificação química dos anticorpos obtidos. Tais métodos já estão estabelecidos na literatura.

Os anticorpos produzidos e expressos da maneira descrita acima podem ser isolados de dentro ou de fora das células ou dos hospedeiros, e em seguida purificados até a homogeneidade. Os anticorpos para uso na presente invenção podem ser isolados e/ou purificados através do uso de cromatografia por afinidade. As colunas a serem usadas para a cromatografia por afinidade incluem, por exemplo, colunas de proteína A e colunas de proteína G. Os veículos usados para as colunas de proteína A incluem, por exemplo, HyperD, POROS, Sepharose FF, entre outros. Além dos mencionados acima, outros métodos comumente usados para isolamento e/ou purificação de proteínas podem ser usados, e não são de forma alguma limitados.

Por exemplo, os anticorpos usados na presente invenção podem ser isolados e/ou purificados pela escolha e combinação apropriadas de cromatografias além de cromatografia por afinidade, filtros, ultrafiltração, dessalinização, diálise, entre outras. Cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrófoba, filtração em gel, entre outras. Essas cromatografias podem ser aplicadas à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Alternativamente, HPLC de fase reversa pode ser

20/30 usada.

A concentração dos anticorpos obtidos acima pode ser determinada por medição da absorvência, por ELISA, entre outros. Especificamente, a absorvência é determinada diluindo-se apropriadamente a solução de anticorpo com PBS(-), medindo-se a absorvência a 280 nm, e calculando-se a concentração (1,35 OD = 1 mg/ml). Alternativamente, quando se usa ELISA, a medição pode ser feita da seguinte maneira: especificamente, IgG antihumana de cabra (TAG) diluída até 1 pg/ml com tampão bicarbonato 0,1 M (pH 9,6) é adicionada a 100 μΙ por poço em uma placa de 96 poços (Nunc) e incubada por uma noite a 4°C para imobilizar o anticorpo. Depois do bloqueio, um anticorpo da presente invenção apropriadamente diluído ou uma amostra apropriadamente diluída compreendendo o anticorpo, ou IgG humana (CAPPEL) como padrão é adicionado em volumes de 100 μΙ e a mistura é incubada por uma hora à temperatura ambiente.

Depois da lavagem, IgG anti-humana marcada com fosfatase alcalina diluída 5.000x (BIO SOURCE) é adicionada em volumes de 100 μΙ e incubada por uma hora à temperatura ambiente. Depois de mais uma lavagem, uma solução de substrato é adicionada e incubada, e a absorvência a 405 nm é medida usando uma leitora de microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad) para calcular a concentração do anticorpo de interesse.

Peptídios parciais do receptor de IL-6 são peptídios que compreendem parte ou toda a sequência de aminoácidos da região da sequência de aminoácidos do receptor de IL-6 que está envolvida na ligação entre a IL-6 e o receptor de IL-6. Tais peptídios geralmente compreendem 10 a 80, de preferência 20 a 50, mais preferivelmente 20 a 40 resíduos de aminoácidos.

Peptídios parciais do receptor de IL-6 podem ser produzidos de acordo com métodos geralmente conhecidos, por exemplo, técnicas de engenharia genética ou métodos de síntese de peptídios, especificando qual a região da sequência de aminoácidos do receptor de IL-6 que está envolvida na ligação entre a IL-6 e o receptor de IL-6, e usando uma porção ou a totalidade da sequência de aminoácidos da região especificada.

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Quando se prepara um peptídio parcial do receptor de IL-6 usando métodos de engenharia genética, uma sequência de DNA codificando o peptídio desejado é inserida em um vetor de expressão, e em seguida o peptídio pode ser obtido aplicando-se os métodos acima mencionados para expressar, produzir e purificar anticorpos recombinantes.

Quando se produz de um peptídio parcial do receptor de IL-6 usando métodos de síntese de peptídios, é possível usar os métodos de síntese de peptídios geralmente empregados, por exemplo, métodos de síntese em fase sólida ou métodos de síntese em fase líquida.

Especificamente, os peptídios podem ser sintetizados de acordo com o método descrito em Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis (em japonês) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten). Como um método de síntese em fase sólida, por exemplo, pode-se empregar o seguinte método: o aminoácido correspondente ao terminal C do peptídio a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos, em seguida o cordão do peptídio é alongado repetindo-se alternadamente (1) a reação de aminoácidos condensantes, cujos grupos α-amino e grupos funcionais da cadeia ramificada são protegidos com grupos protetores apropriados, um de cada vez na direção do terminal C para o terminal N; e (2) a reação de remoção dos grupos protetores dos grupos α-amino dos aminoácidos ou peptídios ligados à resina. A síntese de peptídios em fase sólida é classificada como o método de Boc e o método de Fmoc, dependendo do tipo de grupos protetores usados.

Depois de sintetizar um peptídio de interesse da maneira descrita acima, as reações de desproteção são realizadas, e em seguida o cordão de peptídio é clivado de seu suporte. Para a reação de divagem do cordão de peptídio, fluoreto de hidrogênio ou ácido trifluormetano sulfônico geralmente é usado no método de Boc, e TFA geralmente é usado no método de Fmoc. No método de Boc, por exemplo, a resina peptídica protegida mencionada acima é tratada com fluoreto de hidrogênio na presença de anisol. Em seguida, o peptídio é recuperado por remoção dos grupos protetores e divagem do peptídio de seu suporte. Por secagem por congelamento do

22/30 peptídio recuperado, é possível obter um peptídio bruto. No método de Fmoc, por outro lado, a reação de desproteção e a reação para clivar o cordão de peptídio do seu suporte podem ser efetuadas em TFA usando um método semelhante àqueles descritos acima, por exemplo.

Os peptídios brutos obtidos podem ser separados e/ou preparados através do uso de HPLC. A eluição pode ser realizada em condições ideais usando-se água-acetonitrila como o sistema solvente, que é geralmente usado para purificação de proteínas. As frações correspondentes aos picos do perfil cromatográfico obtido são recolhidas e secadas por congelamento. As frações de peptídio assim purificadas são identificadas por análise do peso molecular via espectrometria de massas, análise da composição de aminoácidos, análise da sequência de aminoácidos, entre outros.

Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção podem ser usados no tratamento e/ou na prevenção de GVHD. Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção também incluem agentes profiláticos para GVHD que suprimem o desenvolvimento de GVHD. Portanto, a expressão agente terapêutico para GVHD conforme usada neste relatório significa que ele suprime a GVHD, reduz a % de ocorrência de GVHD, trata a GVHD, melhora os sintomas de GVHD etc.

Qualquer tipo de GVHD pode ser tratado pelos agentes terapêuticos da presente invenção. GVHD que pode ser tratada pelos agentes terapêuticos da presente invenção inclui GVHD aguda e GVHD crônica. Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção são particularmente eficazes contra GVHD subsequente ao transplante de células-tronco hematopoiéticas, tais como GVHD subsequente ao transplante de células-tronco do sangue periférico (por exemplo, transplante de células-tronco do sangue periférico alogênico) ou GVHD subsequente ao transplante de medula óssea (por exemplo, transplante de medula óssea alogênica).

Os inibidores do receptor de IL-6 usados na presente invenção podem ser avaliados quanto ao seu efeito como agentes terapêuticos para GVHD, por exemplo, porém sem limitação, pelo uso de sua atividade inibitória contra a transdução de sinais como um índice. A atividade inibitória dos

23/30 inibidores do receptor de IL-6 contra a transdução de sinais pode ser avaliada por métodos convencionais. Especificamente, IL-6 é adicionada a culturas de linhagens celulares de mieloma humano IL-6-dependente (S6B45 e KPMM2), da linhagem celular de linfoma de células T humano de Lennert KT3, ou da linhagem celular IL-6-dependente MH60.BSF2; e a absorção de ³H-timidina pelas células IL-6-dependentes é medida na presença de um inibidor do receptor de IL-6. Alternativamente, células U266 expressando o receptor de IL-6 são cultivadas, e IL-6 marcada com ¹²⁵l e um inibidor do receptor de IL-6 são adicionados à cultura ao mesmo tempo; e então a IL-6 marcada com ¹²⁵l ligada às células expressando o receptor de IL-6 é quantificada. Além do grupo de inibidor do receptor da IL-6, um grupo de controle negativo que não contém inibidor do receptor de IL-6 é incluído no sistema de ensaio descrito acima. A atividade inibidora do receptor de IL-6 para inibir o receptor de IL-6 pode ser avaliada por comparação dos resultados de ambos os grupos.

Os indivíduos a serem medicados com os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção são mamíferos. Os mamíferos são de preferência seres humanos.

Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção podem ser administrados como fármacos, e podem ser administrados de forma sistêmica ou local por administração oral ou parenteral. Por exemplo, injeções intravenosas tais como infusões por gotejamento, injeções intramusculares, injeções intraperitoneais, injeções subcutâneas, supositórios, enemas, comprimidos entéricos orais, entre outros, podem ser selecionadas. Os métodos de administração apropriados podem ser selecionados dependendo da idade e dos sintomas do paciente. A dose eficaz por administração não é de forma alguma limitada, mas é selecionada na faixa de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. Alternativamente, a dose pode ser selecionada na faixa de 1 a 1000 mg/paciente, de preferência na faixa de 5 a 50 mg/paciente. A título de exemplo específico, uma dose e um método de administração preferido são os seguintes: por exemplo, quando um anticorpo contra o receptor de IL6 é usado, uma dose de 0,5 a 40 mg/kg de peso corporal/mês (quatro sema

24/30 nas), de preferência de 1 a 20 mg/kg de peso corporal/mês é administrada por uma injeção intravenosa tal como uma infusão por gotejamento, injeção subcutânea, injeção intramuscular entre outras, uma a várias vezes ao mês, por exemplo, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, ou uma vez a cada quatro semanas. O programa de administração pode ser ajustado, por exemplo, aumentando-se o intervalo de administração de duas vezes por semana ou uma vez por semana para uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas, e ao mesmo tempo monitorando-se a condição do paciente e as alterações nos valores dos exames de sangue.

Como descrito abaixo na seção de Exemplos, os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção foram capazes de suprimir acentuadamente o desenvolvimento de GVHD quando administrados aos receptores antes e depois do transplante de células-tronco hematopoiéticas. Portanto, os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção são de preferência administrados antes do transplante de células-tronco hematopoiéticas e são ainda administrados depois do transplante dependendo da condição de GVHD.

Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção podem ser administrados em combinação com pelo menos um agente terapêutico ou método conhecido para GVHD. Por exemplo, os agentes terapêuticos da presente invenção podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente com agentes imunossupressores (por exemplo, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato) usados para a prevenção de GVHD. Além disso, os agentes terapêuticos da presente invenção podem ser combinados com remoção de células T maduras de um grupo de células transplantadas (enxerto).

Os agentes terapêuticos para GVHD da presente invenção podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como conservantes e estabilizantes. Veículos farmaceuticamente aceitáveis referem-se a materiais que podem ser coadministrados com os agentes acima. Tais materiais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, água estéril, solução

25/30 salina fisiológica, estabilizantes, excipientes, tampões, conservantes, detergentes, agentes quelantes (por exemplo, EDTA), e aglutinantes.

Na presente invenção, detergentes incluem detergentes nãoiônicos, exemplos típicos dos mesmos incluindo ésteres de ácidos graxos de sorbitano tais como monocaprilato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, e monopalmitato de sorbitano; ésteres de ácidos graxos de glicerina tais como monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina e monoestearato de glicerina; ésteres de ácidos graxos de poliglicerina tais como monoestearato de decaglicerila, diestearato de decaglicerila, e monolinoleato de decaglicerila; ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano tais como monolaurato de polioxietileno sorbitano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano, monoestearato de polioxietileno sorbitano, monopalmitato de polioxietileno sorbitano, trioleato de polioxietileno sorbitano, e triestearato de polioxietileno sorbitano; ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol tais como tetraestearato de polioxietileno sorbitol e tetraoleato de polioxietileno sorbitol; ésteres de ácidos graxos de polioxietileno glicerina tais como monoestearato de polioxietileno glicerila; ésteres de ácidos graxos de polietileno glicol tais como diestearato de polietileno glicol; polioxietileno alquil éteres tais como polioxietileno lauril éter; polioxietileno polioxipropileno alquil éteres tais como polioxietileno polioxipropileno glicol, polioxietileno polioxipropileno propil éter, e polioxietileno polioxipropileno cetil éter; polioxietileno alquil fenil éteres tais como polioxietileno nonilfenil éter; óleos de rícino polioxietileno endurecidos tais como óleo de rícino polioxietileno e óleo de rícino polioxietileno endurecido (óleo de rícino polioxietileno hidrogenado); derivados de cera de abelha polioxietileno tais como cera de abelha polioxietileno sorbitol; derivados de lanolina polioxietileno tais como lanolina polioxietileno; e amidas de ácidos graxos de polioxietileno e aquelas com um HLB de 6 a 18, tais como amida de ácido esteárico de polioxietileno.

Detergentes também incluem detergentes aniônicos, e exemplos típicos dos mesmos incluem, por exemplo, sulfatos de alquila com um grupo alquila com 10 a 18 átomos de carbono, tais como cetil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, e oleil sulfato de sódio; sulfatos de polioxietileno alquil

26/30 éter nos quais o grupo alquila tem 10 a 18 átomos de carbono e o número molar médio de óxido de etileno adicionado varia de 2 a 4, tais como polioxietileno lauril sulfato de sódio; sais de éster de alquil sulfossuccinato com um grupo alquila com 8 a 18 átomos de carbono, tais como éster de lauril sulfossuccinato de sódio; detergentes naturais, por exemplo, lecitina; glicerofosfolipídios; esfingolipídios tais como esfingomielina; e ésteres de ácido graxo de sacarose nos quais os ácidos graxos têm 12 a 18 átomos de carbono.

Um ou mais dos detergentes descritos acima podem ser combinados e adicionados aos agentes da presente invenção. Detergentes que são de preferência usados nas preparações da presente invenção incluem ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, tais como polissorbatos 20, 40, 60 e 80. Os Polissorbatos 20 e 80 são particularmente preferidos. Polioxietileno polioxipropileno glicóis, tais como poloxâmero (por exemplo, Pluronic F-68®), também são preferidos.

A quantidade de detergente adicionada varia dependendo do tipo de detergente usado. Quando o polissorbato 20 ou 80 é usado, a quantidade em geral varia na faixa de 0,001 a 100 mg/ml, de preferência na faixa de 0,003 a 50 mg/ml, mais preferivelmente na faixa de 0,a 2 mg/ml.

Na presente invenção, tampões incluem tampões fosfato ou citrato, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido láctico, fosfato de potássio, ácido glicônico, ácido cáprico, ácido desoxicólico, ácido salicílico, trietanolamina, ácido fumárico, e outros ácidos orgânicos; assim como tampão carbonato, tampão Tris, tampão histidina, e tampão imidazol.

As preparações líquidas podem ser formuladas por dissolução dos agentes em tampões aquosos conhecidos no campo de preparações líquidas. A concentração de tampão em geral varia na faixa de 1 a 500 mM, de preferência na faixa de 5 a 100 mM, mais preferivelmente na faixa de 10 a 20 mM.

Os agentes terapêuticos da presente invenção também podem compreender outros polipeptídios de baixo peso molecular; proteínas tais como albumina sérica, gelatina, e imunoglobulina; aminoácidos; açúcares e

27/30 carboidratos tais como polissacarídeos e monossacarídeos, alcoóis de açúcar, entre outros.

Neste relatório, aminoácidos incluem aminoácidos básicos, por exemplo, arginina, lisina, histidina, e ornitina, e sais inorgânicos desses aminoácidos (de preferência sais de cloridrato, e sais de fosfato, a saber fosfatos de aminoácidos). Quando os aminoácidos livres são usados, o pH é ajustado em um valor preferido por adição de substâncias tamponantes fisiologicamente aceitáveis apropriadas, por exemplo, ácidos inorgânicos, em particular ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético, e ácido fórmico, e sais dos mesmos. Neste caso, o uso de fosfato é particularmente benéfico porque ele dá produtos liofilizados bastante estáveis. O fosfato é particularmente vantajoso quando as preparações não contêm quantidades significativas de ácidos orgânicos, tais como ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, e ácido fumárico, ou não contêm ânions correspondentes (por exemplo, ion de malato, ion de tartarato, ion de citrato, íon de succinato, íon de fumarato). Os aminoácidos preferidos são arginina, lisina, histidina, e ornitina. Também é possível usar aminoácidos ácidos tais como ácido glutâmico e ácido aspártico, e sais dos mesmos (de preferência sais sódicos); aminoácidos neutros tais como isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cisteína, e alanina; ou aminoácidos aromáticos tais como fenilalanina, tirosina, triptofano, e seu derivado, N-acetil triptofano.

Neste relatório, açúcares e carboidratos tais como polissacarídeos e monossacarídeos incluem, por exemplo, dextrana, glicose, frutose, lactose, xilose, manose, maltose, sacarose, trealose, e rafinose.

Neste relatório, alcoóis de açúcar incluem, por exemplo, manitol, sorbitol, e inositol.

Quando os agentes da presente invenção são preparados como soluções aquosas para injeção, os agentes podem ser misturados com, por exemplo, solução salina fisiológica, e/ou solução isotônica contendo glicose ou outros agentes auxiliares (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol, cloreto de sódio). As soluções aquosas podem ser usadas em combinação

28/30 com solubilizantes apropriados tais como alcoóis (por exemplo, etanol), polialcoóis (por exemplo, propileno glicol, PEG), ou detergentes não-iônicos (por exemplo, polissorbato 80, HCO-50).

Os agentes podem compreender ainda, se necessário, diluentes, solubilizantes, ajustadores de pH, agentes suavizantes, agentes redutores contendo enxofre, antioxidantes, entre outros

Neste relatório, os agentes redutores contendo enxofre incluem, por exemplo, compostos compreendendo grupos sulfidrila, tais como Nacetilcisteína, N-acetilhomocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiossorbitol, ácido tioglicólico e sais do mesmo, tiossulfato de sódio, glutationa, e ácidos tioalcanoicos com 1 a 7 átomos de carbono.

Além disso, os antioxidantes na presente invenção incluem, por exemplo, ácido eritórbico, dibutil hidróxi tolueno, butil hidróxido anisol, atocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico e sais do mesmo, palmitato de ácido L-ascórbico, estearato de ácido L-ascórbico, sulfito ácido de sódio, sulfito de sódio gaiato de triamila, gaiato de propila, e agentes quelantes tais como etilenodiamina tetra-acetato de sódio (EDTA), pirofosfato de sódio, e metafosfato de sódio.

Se necessário, os agentes podem ser encapsulados em microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina, poli[ácido metilmetacrílico] etc.) ou preparados como sistemas coloidais de distribuição de fármaco (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsão, nanopartículas, nanocápsulas) (vide Remington’s Pharmaceutical Science 16^th edition, Oslo Ed., 1980, entre outros). Além disso, métodos para a preparação de agentes como agentes de liberação sistemática também são conhecidos, e se aplicam à presente invenção (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; Patente US N° 3.773.919; Publicação de Patente Européia N° (EP) 58.481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; e EP 133.988).

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis usados são apropriadamente selecionados daqueles descritos acima ou combinados dependendo do tipo da forma de dosagem, porém não se limitam aos mesmos.

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A presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir a GVHD em um indivíduo, que compreende a etapa de administrar um inibidor do receptor de IL-6 a um indivíduo que esteja desenvolvendo a GVHD ou que corra o risco de desenvolver a GVHD.

Neste relatório, indivíduo refere-se a um organismo ou a uma parte do corpo do organismo a ser medicada com os agentes terapêuticos para a GVHD da presente invenção. Tal organismo inclui animais (por exemplo, o homem, espécies de animais domésticos, e animais selvagens), porém não se limita a estes.

Neste relatório, administração inclui administração oral e parenteral. Administração oral inclui, por exemplo, a administração de agentes orais. Tais agentes orais incluem, por exemplo, grânulos, pós, comprimidos, cápsulas, soluções, emulsões, e suspensões.

Administração parenteral inclui, por exemplo, a administração de injeções. Tais injeções incluem, por exemplo, injeções subcutâneas, injeções intramusculares, injeções intravenosas e injeções intraperitoneais. Entretanto, os efeitos do método da presente invenção podem ser obtidos por introdução de genes compreendendo oligonucleotídeos a serem administrados a seres vivos usando técnicas de terapia genética. Alternativamente, os agentes da presente invenção podem ser administrados por via local às áreas de tratamento desejadas. Por exemplo, os agentes podem ser administrados por injeção local durante uma cirurgia, pelo uso de cateteres, ou por distribuição genética vetorizada de DNAs codificando os peptídios da presente invenção.

Todos os documentos da técnica anterior citados neste relatório estão aqui incorporados a título de referência.

A presente invenção será ainda descrita mais detalhadamente por meio do exemplo a seguir, que não pretende limitar a invenção. Várias alterações e modificações podem ser feitas pelos versados na técnica, e essas alterações e modificações também se enquadram na presente invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1: Efeito do anticorpo para o receptor de IL-6 em GVHD

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Método de teste

Células do baço (6 χ 10⁷ células/camundongo) obtidas de camundongos doadores fêmeas C57BL/6J de 8 semanas de idade (Charles River Japan, Inc.) foram transferidas para camundongos receptores fêmeas B6D2F1/Crlj de 8 semanas de idade (Charles River Japan, Inc.) pela veia caudal para induzir GVHD.

Os camundongos receptores foram divididos em dois grupos, um deles sendo medicado com o anticorpo contra o receptor de IL-6 de camundongo MR16-1 (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Japão) a uma dose de 4 mg/camundongo pela veia caudal 1 dia antes da transferência das células do baço e em seguida a uma dose de 0,5 mg/camundongo por via intraperitoneal quatro vezes ao dia durante 7 dias. O grupo de controle foi medicado com solução salina tamponada com fosfato (PBS; SIGMA-ALDRICH Inc.) (10 animais para cada grupo). Depois da transferência das células do baço, os camundongos tiveram seu peso corporal medido três vezes por semana para avaliar o desenvolvimento de GVHD com base no peso corporal. Resultados

Os resultados obtidos estão mostrados na figura 1. O grupo de controle apresentou uma redução bifásica no peso corporal. Isto é, o peso corporal diminuiu nos 9^o a 14° dias depois do transplante de células do baço e em seguida foi recuperado no 16° dia, mas diminuiu novamente nos 19° e 21° dias e em seguida foi significativamente recuperado no 33° dia. Em contraste, o grupo que recebeu o MR16-1 não apresentou redução no peso corporal nos 9^o a 14° dias. Isto é, estes resultados sugerem que o anticorpo contra o receptor de IL-6 suprime o desenvolvimento de GVHD.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um anticorpo do receptor da interleucina-6 (IL-6), caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).

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2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo do receptor da interleucina-6 (IL-6) é o anticorpo PM-1.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo do receptor da interleucina-6 (IL-6) é o anticorpo PM-1 humanizado.