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BRPI0816458A2 - terapia combinada com anticorpos anti-cd20 tipo i e tipo ii - Google Patents

terapia combinada com anticorpos anti-cd20 tipo i e tipo ii Download PDF

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BRPI0816458A2
BRPI0816458A2 BRPI0816458-4A BRPI0816458A BRPI0816458A2 BR PI0816458 A2 BRPI0816458 A2 BR PI0816458A2 BR PI0816458 A BRPI0816458 A BR PI0816458A BR PI0816458 A2 BRPI0816458 A2 BR PI0816458A2
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BR
Brazil
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antibody
type
antibodies
rituximab
cells
Prior art date
Application number
BRPI0816458-4A
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English (en)
Inventor
Thomas Friess
Christian Klein
Pablo Umana
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Hoffmann La Roche, Roche Glycart Ag filed Critical Hoffmann La Roche
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Abstract

TERAPIA COMBINADA COM ANTICORPOS ANTI-CD2O TIPO 1 E TIPO II. A presente invenção refere-se à terapia combinada de um anti-corpo anti-CD2O tipo 1 e tipo II para o tratamento de câncer, especialmente de câncer que expressa CD2O.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA COMBINADA COM ANTICORPOS ANTI-CD20 TIPO I E TIPO II".
A presente invenção refere-se ao uso de dois anticorpos diferen- tes anti-CD20 para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de câncer, especialmente de cânceres que expressam CD20. Antecedentes da invenção
A molécula de CD20 (também denominada antígeno de diferen- ciação restrito aos linfócitos B humanos ou Bp35) é uma proteína transmem- brana hidrofóbica com peso molecular de aproximadamente 35 kD, presente em pré-linfócitos B e em linfócitos B maduros (Valentine, M.A., et ai J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287; e Einfield1 D.A., et ai EMBO J. 7(3) (1988) 711-717). A proteína CD20 é encontrada sobre a superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou de órgãos linfoides, cuja ex- pressão ocorre nas fases iniciais do desenvolvimento de células pré-B e que permanece até a diferenciação celular no plasma. A proteína CD20 está pre- sente tanto em células B normais como em células B malignas. Especifica- mente, a proteína CD20 é expressa em mais de 90% das células B de Iinfo- mas não-Hodgkin (NHL) (Anderson, K.C., et al., Blood 63(6) (1984) 1424- 1433), porém esta não é encontrada em células-tronco hematopoiéticas, pró- células B, células normais no plasma ou em outros tecidos normais (Tedder, T.F., et ai, J, Immunoi 135 (2) (1985) 973- 979).
A região terminal carboxila da proteína CD20, composta por 85 aminoácidos, está localizada dentro do citoplasma. O comprimento desta região contrasta com aquele de outras estruturas superficiais específicas da célula B, tais como cadeias pesadas de IgM, IgD e de IgG ou cadeias α ou β de antígenos de histocompatibilidade da classe 11, as quais possuem regi- ões intracitoplasmáticas relativamente curtas, formadas por 3, 3, 28, 15 e 16 aminoácidos, respectivamente (Komaromy, M., et al., NAR 11 (1983) 6775- 6785). Dentre os últimos 61 aminoácidos da carboxila terminal, 21 são resí- duos ácidos, enquanto que apenas 2 são básicos, indicando que esta região exibe uma forte carga negativa final. Seu N0 de Acesso do GenBank é NP- 690605. Acredita-se que a CD20 possa estar envolvida na regulação de uma ou mais etapas iniciais no processo de ativação e diferenciação de células B (Tedder et al., Eur. J. Immunol. 25 Vol. 16 (1986) 881-887) e que poderia funcionar como canal do íon cálcio (Tedder, T.F., et al., J. CeH. Biochem. 14D (1990) 195).
Existem dois tipos diferentes de anticorpos anti-CD20 que diferem
significativamente no modo como se ligam a CD20 e em suas atividades bio- lógicas (Cragg, M.S., et al, Blood, 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al, Blood, 101 (2003) 1045-1052). Anticorpos tipo I, como o Rituximab1 são po- tentes na citotoxicidade mediada por complemento, enquanto que anticorpos tipo II, como Tositumomab (B1), 11B8 e AT80, ou anticorpos humanizados B- Lyl1 dão início efetivamente à morte de células-alvo por meio de apoptose independente de caspases com exposição simultânea de fosfatidilserina.
As características compartilhadas comuns de anticorpos anti- CD20 tipo I e tipo Il são resumidas na Tabela 1. Tabela 1: Propriedades de anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo Il
Anticorpos anti-CD20 tipo I Anticorpos anti-CD20 tipo Il Epitopo de CD20 tipo I Epitopo de CD20 tipo Il Localizam CD20 para grande quantidade (rafts) lipídica Não localizam CD20 para grande quantidade (rafts) lipídica Maior CDC (se do isotipo IgGI) Menor CDC (se do isotipo IgG 1) Atividade (se do isotipo IgGI) Atividade ADCC (se do isotipo IgGI) Plena capacidade de ligação Capacidade reduzida de ligação Agregação homotípica Agregação homotípica mais forte Indução de apoptose mediante reticulação Forte indução de morte celular sem reticulação
O documento W02004035607 refere-se a anticorpos monoclo-
nais humanos contra CD20 e a seu uso para o tratamento de doenças asso- ciadas a células que expressam CD20. Sumário da invenção A invenção compreende o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de câncer com expressão de CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
A invenção compreende ainda o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I, como primeiro anticorpo anti-CD20 para a produção de um medica- mento destinado ao tratamento de câncer com expressão de CD20, caracte- rizado pelo fato de que:
a) o referido primeiro anticorpo anti-CD20 tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do
referido primeiro anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,8 a 1,2,
b) o referido primeiro anticorpo anti-CD20 é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II, como um segundo anticorpo anti-CD20,
c) o referido segundo anticorpo anti-CD20 tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do
referido segundo anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,3 a 0,6.
A invenção ainda compreende o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento para o tratamento de um pacien- te que sofre de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD tipo I é coadministrado com um anticorpo anti- CD20 tipo II.
A invenção compreende ainda o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I como primeiro anticorpo anti-CD20 para a produção de um medica- mento destinado ao tratamento de um paciente que sofre de câncer que ex- pressa CD20, caracterizado pelo fato de que: a) o referido primeiro anticorpo anti-CD20 tem uma razão das
capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido primeiro anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,8 a 1,2,
b) o referido primeiro anticorpo anti-CD20 é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II, como segundo anticorpo anti-CD20, c) o referido segundo anticorpo anti-CD20 tem uma razão das
capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido segundo anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,3 a 0,6. A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 tipo I pa- ra o tratamento de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 tipo I pa-
ra o tratamento de um paciente que sofre de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coad- ministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
De preferência, o câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não- Hodgkin (NHL) de células B.
De preferência, os referidos primeiro e segundo anticorpos anti- CD20 (tipo I e tipo II) são anticorpos monoclonais.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anti- corpo B-Lyl humanizado.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem citoto- xicidade celular dependente de anticorpos aumentada (ADCC).
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo I possui como razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido primeiro anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,9 a 1,1.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il possui uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido segundo anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,35 a 0,55, mais preferivelmente, de 0,4 a 0,5.
Em uma concretização preferida da invenção, o referido anticor- po anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfo- ma de não-Hodgkin (NHL) de células B. A invenção compreende ainda um kit contendo um anticorpo an-
ti-CD20 tipo Il e um anticorpo anti-CD20 tipo I para o tratamento combinado de um paciente com câncer que expressa CD20. De preferência, o kit é caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
Descrição detalhada da invenção
O termo "anticorpo" abrange as várias formas de anticorpos, in- cluindo, entre outras, anticorpos inteiros, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos construídos geneticamente, como anticorpos mo- noclonais, anticorpos quiméricos ou anticorpos recombinantes, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que as propriedades características de acordo com a invenção sejam retidas.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpos monoclonais", como utilizados neste relatório, se referem à preparação de moléculas de um anticorpo com uma única composição de aminoácidos. Dessa forma, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos exibindo uma única especificidade de ligação com regiões variáveis e cons- tantes derivadas de seqüências na linhagem germinativa de imunoglobulinas humanas. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por hibridoma incluindo uma célula B obtida de um animal trans- gênico não-humano, por exemplo, um camundongo transgênico, com geno- ma compreendendo o transgene de uma cadeia pesada humana e o trans- gene de uma cadeia leve humana, fundidas para formação de uma célula imortalizada.
De preferência, os referidos primeiro e segundo anticorpos anti- CD20 (tipo I e tipo II) são anticorpos monoclonais.
O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo mono- clonal compreendendo uma região variável, isto é, região de ligação, prove- niente de uma única origem ou espécie, e pelo menos uma parte de uma região constante derivada de uma origem ou espécie diferente, preparada geralmente por técnicas de DNA recombinante. Anticorpos quiméricos, com- preendendo uma região variável murina e uma região constante humana, são especialmente preferidos. Estes anticorpos quiméricos muri- nos/humanos são produto da expressão de genes de imunoglobulinas com- preendendo segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imuno- globulinas murinas e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulinas humanas. Outras formas de "anticorpos quiméricos" a- brangidos pela presente invenção são aquelas nas quais a classe ou a sub- classe foi modificada ou alterada daquela do anticorpo original. Estes anti- corpos "quiméricos" são referidos também como "anticorpos com mudança de classe". Métodos para produção de anticorpos quiméricos envolvem téc- nicas convencionais de DNA recombinante e de transfecção gênica, atual- mente bem conhecidas na arte. Vide, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855 e os documentos US 5 202 238 e US 5 204 244.
O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais a estrutura ou as "regiões determinantes de complementaridade" (Ο- Ι 5 DR) foram modificadas de modo a compreenderem a CDR de uma imuno- globulina de especificidade diferente, quando comparada àquela da imuno- globulina original. Em uma concretização preferida, uma CDR murina é en- xertada na região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "an- ticorpo humanizado". Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. CDRs especialmente preferidas correspondem àquelas que representam seqüên- cias capazes de reconhecer os antígenos notados acima para anticorpos quiméricos e bifuncionais.
O termo "anticorpo humano", como utilizado neste relatório, pre- tende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de se- qüências na linhagem germinativa de imunoglobulinas humanas. Anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology. 5 (2001) 368-374). Com base nessa tecnologia, é possível produzir anticorpos humanos contra uma gran- de variedade de alvos. Exemplos de anticorpos humanos são descritos, por exemplo, em Kellermann, S. A., et al., CurrOpin Biotechnol. 13 (2002) 593- 597. O termo "anticorpo humano recombinante", como utilizado neste relatório, pretende incluir todos os anticorpos humanos preparados, expres- sos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos iso- lados de uma célula hospedeira como, por exemplo, célula NSO ou CHO, ou de um animal (por exemplo, camundongo), que é transgênico para genes de imunoglobulinas humanas, ou anticorpos expressos usando um vetor de ex- pressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Estes anti- corpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências na linhagem germinativa de imunoglobulinas hu- manas em forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos à hipermutação somática in vivo. Consequentemente, as seqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas e re- lacionadas com seqüências na linhagem germinativa de VH e VL humanas, podem não existir naturalmente dentro do repertório na linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.
Como utilizados neste relatório, "especificamente ligado" ou "li- ga-se especificamente a" referem-se a um anticorpo especificamente ligado ao antígeno CD20. De preferência, a afinidade de ligação é de valor KD igual a 10"8 mol/l ou mais baixo, de preferência, 10"9 mol/l ou mais baixo (por e- xemplo, 10"10 mol/l), mais preferivelmente com valor KD de 10"10 mol/l ou mais baixo (por exemplo, 10"12 mol/l). A afinidade de ligação é determinada com ensaio-padrão de ligação, como pela técnica de ressonância plasmôni- ca de superfície (por exemplo, Biacore®) em células que expressam CD20. O termo "molécula de ácido nucleico", como utilizado neste rela-
tório, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla, porém, é de preferência, DNA de fita dupla.
Os "domínios constantes" não estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno, porém estão envolvidos nas funções efeto- ras (ADCC, ligação a complemento e CDC).
A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), re- gião variável de uma cadeia pesada (VH)), como utilizado neste relatório, indica cada par de cadeia leve e pesada envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas humanas possuem a mesma estrutura geral, e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR) cujas seqüências são amplamente conser- vadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinan- tes de complementaridade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação em folha beta, e as CDRs podem formar alças conectando a estrutura em folha beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua es- trutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam, junto com as CDRs da outra cadeia, o sítio de ligação a antígeno. As regiões CDR3 da cadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel especialmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, por conseguinte, provêem um objeto adicional da inven- ção.
Os termos "região hipervariável" ou "porção de ligação a antíge- no de um anticorpo", quando utilizados neste relatório, referem-se aos resí- duos de aminoácidos de um anticorpo, responsáveis pela ligação ao antíge- no. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos das "regi- ões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". Regiões de "estrutu- ra" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variável, diferentes dos resíduos da região hipervariável conforme definidas neste relatório. Portanto, as ca- deias leves e pesadas de um anticorpo compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 do N ao C-terminal. Especialmente, a CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao an- tígeno. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, E.A., et ai, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, 5a edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethes- da, MD. (1991), e/ou aqueles resíduos de uma alça "hipervariável". Os termos "CD20" e "antígeno CD20" são empregados aliena-
damente neste relatório, e incluem quaisquer variantes, isoformas e homólo- gos de CD20 humano de outras espécies, os quais são expressos natural- mente por células ou são expressos em células transfectadas com o gene do CD20. A ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno CD20 medeia a eliminação de células que expressam CD20 (por exemplo, uma célula tumo- ral) por inativação do CD20. A eliminação das células que expressam CD20 pode ocorrer por um ou mais dos seguintes mecanismos: morte celu- lar/indução de apoptose, ADCC e/ou CDC.
Sinônimos de CD20, reconhecidos na técnica, incluem antígeno CD20 de linfócitos B, antígeno de superfície B1 de linfócitos B, Leu-16, Bp35, BM5 e LF5.
O termo "anticorpo anti-CD20", de acordo com a invenção, é um
anticorpo que se liga especificamente ao antígeno CD20. Dependendo das propriedades de ligação e atividades biológicas de anticorpos anti-CD20 pa- ra o antígeno CD20, dois tipos de anticorpos anti-CD20 (anticorpos anti- CD20 tipo I e tipo II) podem ser distinguidos de acordo com Cragg, M.S., et al , Blood 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al, Blood 101 (2003) 1045-1052, vide a Tabela 2.
Tabela 2: Propriedades de anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo Il
Anticorpos anti-CD20 tipo I Anticorpos anti-CD20 tipo Il Epitopo de CD20 tipo I Epitopo de CD20 tipo Il Localizam CD20 para grande quan- tidade lipídica Não localizam CD20 para grande quantidade lipídica Maior CDC (se isotipo do IgGI) Menor CDC (se isotipo do IgGI) Atividade de ADCC (se isotipo do lgG1) Atividade de ADCC (se isotipo do lgG1) Plena capacidade de ligação Capacidade reduzida de ligação Agregação homotípica Agregação homotípica mais forte Indução de apoptose mediante reti- culação Forte indução de morte celular sem reticulação
Uma propriedade essencial do anticorpo anti-CD20 tipo I e tipo Il é o seu modo de ligação. Portanto, o anticorpo anti-CD20 tipo I e tipo Il pode ser classificado pela razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti-CD20, comparado ao rituximab.
Os anticorpos anti-CD20 tipo I exibem como razão das capaci- dades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referi- do anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,8 a 1,2, de preferência, de 0,9 a 1,1. Exemplos destes anticorpos anti-CD20 tipo I incluem, por e- xemplo, rituximab, lgG2a 1F5 (ECACC, hibridoma; Press, O.W., et ai, Blood 69/2 (1987) 584-591), lgG3 HI47 (ECACC, hibridoma), IgGI 2C6 (como des- crito em WO 2005/103081), IgGI 2F2 (como descrito em WO 2004/035607 e WO 2005/103081) e IgGI 2H7 (como descrito em WO 2004/056312). De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epitopo conforme o rituximab.
Os anticorpos anti-CD20 tipo Il tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anti- corpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,3 a 0,6, de preferência, de 0,35 a 0,55, mais preferivelmente, de 0,4 a 0,5. Exemplos destes anticorpos anti-CD20 tipo Il incluem, por exemplo, tositumomab (B1 lgG2a), o anticorpo IgGI B-Lyl humanizado (um anticorpo IgGI quimérico humanizado como exposto em WO 2005/044859), IgGI 11B8 (como descrito em WO 2004/035607) e IgGI AT80. De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epitopo conforme o anticorpo B-Lyl humanizado (como exposto em WO 2005/044859).
A "razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86) de anticorpos anti-CD20 comparados a rituximab" é determinada por medição direta de imunofluorescência (a intensidade média da fluorescência (MFI) é medida), usando o referido anticorpo anti-CD20 conjugado com Cy5 e rituximab conjugado com Cy5 em FACSArray (Becton Dickinson) com células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), como descrito no Exem- plo No. 2, e calculada da forma como segue:
Razão das capacidades de ligação a CD20 em células Raji (N° de ATCC: CCL-86) = MFI (Cy5 - anticorpo anti - CD20) razão de Cy5 marcado (Cy5 - rituximab)
MFI (Cy5 - rituximab) razão de Cy5 - marcado (Cy5 - anticorpo anti - CD20)
MFI é a intensidade média de fluorescência. A "razão de Cy5- marcado", como utilizada neste relatório, significa o número de moléculas de Cy5-marcadas por molécula de anticorpo.
Tipicamente, o referido anticorpo anti-CD20 tipo I tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido primeiro anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,8 a 1,2, de preferência, de 0,9 a 1,1.
Tipicamente, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem uma ra- zão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL- 86), do referido segundo anticorpo anti-CD20 comparado ao rituximab de 0,3 a 0,6, de preferência, de 0,35 a 0,55, mais preferivelmente, de 0,4 a 0,5.
Em uma concretização preferida, o referido anticorpo anti-CD20 tipo II, de preferência, um anticorpo B-Lyl humanizado, possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentada. Por "anticorpo possuindo citotoxicidade celular dependente de
anticorpos (ADCC) aumentada", pretende-se significar um anticorpo, como esse termo é definido neste relatório, com ADCC aumentada conforme de- terminada por qualquer método adequado, conhecido de qualquer técnico versado na técnica. Um ensaio aceito de ADCC in vitro é da forma como se- gue:
1) o ensaio faz uso de células-alvo conhecidas por expressarem o antígeno-alvo, reconhecido pela região de ligação a antígeno do anticorpo;
2) o ensaio faz uso de células mononucleares do sangue perifé- rico (PBMCs), isoladas do sangue de um doador saudável escolhido aleato-
riamente, como células efetoras;
3) o ensaio é conduzido de acordo com o seguinte protocolo:
i) as PBMCs são isoladas empregando procedimentos-padrão de centrifugação por gradiente de densidade e suspensas em 5 X 106 célu- las/ml em meio de cultura celular RPMI; ii) as células-alvo são cultivadas por métodos-padrão de cultura em tecidos, colhidas na fase de crescimento exponencial com variabilidade acima de 90%, lavadas em meio de cultura celular RPMI, marcadas com 100 micro-Curies of Cl-, lavadas duas vezes com meio de cultura celular e res- supendidas em meio de cultura em densidade de 1 0' células/ml;
iii) 100 microlitros da suspensão final das células-alvo acima são
transferidos para cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavi- dades;
iv) o anticorpo é diluído em série de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml em meio de cultura celular, e 50 microlitros das soluções resultantes de anticor-
pos são adicionados às células-alvo na microplaca de titulação de 96 cavi- dades, sendo testadas em três vezes várias concentrações do anticorpo, cobrindo todo o intervalo de concentração acima;
v) para controles de liberação máxima (MR)1 3 cavidades adicio- nais na placa, contendo as células-alvo marcadas, recebem 50 microlitros de
uma solução aquosa a 2% (VN) de detergente não-iônico (Nonidet, Sigma, St. Louis), em vez de a solução de anticorpos (item iv acima);
vi) para os controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidades adicionais na placa, contendo as células-alvo marcadas, recebem 50 microli- tros de meio de cultura celular RPMI, em vez de a solução de anticorpos (i-
tem iv acima);
vii) a placa de microtitulação de 96 cavidades é, então, centrifu- gada, em 50 χ g por 1 minuto e incubada por 1 hora a 4 0C;
viii) 50 microlitros da suspensão de PBMC (item i acima) são adicionados a cada cavidade de modo a resultar em razão de célula-
efetora:célula-alvo de 25: 1, e as placas são colocadas em incubadora sob atmosfera de CO2 a 5% a 37 0C por 4 horas;
ix) O sobrenadante sem células de cada cavidade é recolhido e a radioatividade experimentalmente liberada (ER) é quantificada empregan- do um contador gama;
χ) O percentual da Iise específica é calculado para cada concen-
tração de anticorpo, de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) χ 100, onde ER é a radioatividade quantificada em média (vide o item ix acima) para a- quela concentração, MR é a radioatividade quantificada em média (vide o item ix acima) para os controles de MR (vide o item ν acima) e SR é a radio- atividade quantificada em média (vide o item ix acima) para os controles de SR (vide o item vi acima);
4) "ADCC aumentada" é definida como aumento no percentual
máximo da Iise específica, observada dentro do intervalo de concentração de anticorpo testado acima e/ou redução na concentração de anticorpo exi- gida para atingir a metade do percentual máxima da Iise específica, obser- vado dentro do intervalo de concentração de anticorpo testado acima. O au- mento em ADCC é relativo a ADCC medida com o ensaio acima, mediada pelo mesmo anticorpo, produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos-padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento, os quais são conhecidos daqueles versados na técnica, porém que não foi produzida pelas células hospedeiras construídas para superexpressar GnTI 11.
A referida "ADCC aumentada" pode ser obtida por glico- engenharia dos referidos anticorpos, significando aperfeiçoamento das refe- ridas funções efetoras de mediação celular de anticorpos monoclonais por engenharia dos seus componentes do tipo oligossacarídeo conforme descri- to em Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e no docu- mento US 6 602 684.
O termo "citotoxicidade dependente de complemento (CDC)" refere-se à Iise de células-alvo de tumor humano pelo anticorpo, de acordo com a invenção, na presença de complemento. A CDC é medida, de prefe- rência, pelo tratamento de um preparado de células que expressam CD20 com um anticorpo anti-CD20 de acordo com a invenção, na presença de complemento. A CDC é constatada se o anticorpo induzir, em concentração de 100 nM, a Iise (morte celular) de 20% ou mais das células tumorais após 4 horas. O ensaio é realizado de preferência com células tumorais marcadas com 51Cr ou Eu, e medição do 51Cr ou Eu liberado. Os controles incluem a incubação das células tumorais-alvo com complemento, porém sem o anti- corpo. Tipicamente, anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo Il do isotipo IgGI exibem propriedades características de CDC. Os anticorpos anti-CD20 tipo I apresentam maior CDC (se do isotipo IgGI) e os anticorpos anti-CD20 tipo Il apresentam menor CDC (se do isotipo IgGI), comparados entre si. De prefe- rência, ambos os anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo Il são anticorpos do isoti- po IgGI.
O anticorpo "rituximab" é um anticorpo monoclonal quimérico murino construído geneticamente, contendo domínio constante humano ga- ma 1, direcionado contra o antígeno CD20 humano. Este anticorpo quiméri- co contém domínios constantes humanos gama 1 e é identificado pelo nome "C2B8" na patente US 5 736 137 (Andersen, et. ai), emitida em 17 de abril de 1998 e concedida para IDEC Pharmaceuticals Corporation. Rituximab é aprovado para o tratamento de pacientes com Iinfoma de não-Hodgkin de células B, CD20 positivas, recidivante ou refratário de baixo grau ou folicular. Estudos do mecanismo de ação in vitro demonstraram que rituximab exibe citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em humanos (Reiff, M.E., et. al, Blood 83(2) 435-445 (1994)). Adicionalmente, exibe atividade significa- tiva em ensaios que medem citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
O termo "anticorpo B-Lyl humanizado" refere-se ao anticorpo B- Ly1 humanizado exposto nos documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875, obtido a partir do anticorpo monoclonal murino B-Lyl anti- CD20 (região variável da cadeia pesada murina (VH): SEQ ID NO: 1; região variável da cadeia leve murina (VL): SEQ ID NO: 2- vide Poppema, S. e Vis- ser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139;) por quimerização de uma região constante humana de IgGI e seguida por humanização (vide os documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Estes "anticorpos B-Lyl humaniza- dos" são descritos em detalhes nos documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875.
De preferência, o "anticorpo B-Lyl humanizado" possui região variável da cadeia pesada (VH) selecionada a partir do grupo de SEQ ID No.3 a SEQ ID No.20 (B-HH2 a B-HH9 e B-HL8 a B-HL17 dos documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Especialmente preferidas são as Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 e 15 (B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B- HL11 e B-HL13 do documento WO 2005/044859). De preferência, o "anti- corpo B-Lyl humanizado" possui região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID No. 20 (B-KV1 do documento WO 2005/044859. Ademais, o anticorpo B- Ly1 humanizado é, de preferência, um anticorpo IgGI. De preferência, estes anticorpos B-Lyl humanizados são resultantes de glico-engenharia (GE) na região Fc de acordo com os procedimentos descritos em WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e WO 99/154342. Estes anticorpos B-Lyl humanizados resultantes de glico-engenharia possuem padrão alterado de glicosilação na região Fc1 de preferência, com nível menor de resíduos fucose. De preferên- cia, pelo menos 40% ou mais (em uma concretização entre 40% e 60%, em outra concretização, pelo menos 50% e ainda em outra concretização pelo menos 70% ou mais) dos oligossacarídeos da região Fc são não- fucosilados. Ademais, os oligossacarídeos da região Fc são, de preferência, bissectados.
A invenção compreende o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de um câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti- CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
A invenção compreende o uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de um paci- ente com câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o refe- rido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
De preferência, o uso é caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer com expressão de CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
O componente oligossacarídeo pode afetar significativamente propriedades pertinentes à eficácia de uma glicoproteína terapêutica, inclu- indo estabilidade física, resistência a ataque por proteases, interações com o sistema imune, farmacocinética e atividade biológica específica. Estas pro- priedades podem depender não só da presença ou ausência, porém também das estruturas específicas dos oligossacarídeos. Algumas generalizações entre estrutura de oligossacarídeo e função de glicoproteína podem ser fei- tas. Por exemplo, certas estruturas de oligossacarídeo medeiam a depura- ção rápida da glicoproteína da circulação sangüínea através de interações com proteínas específicas de ligação a carboidratos, enquanto outras podem ser ligadas por anticorpos e desencadearem reações imunes não desejadas (Jenkins, N., et ai, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81).
Células de mamíferos são as hospedeiras preferidas para pro- dução de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade em glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana (Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., et ai, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81). Bactérias muito raramente glicosilam proteínas, e outros ti- pos semelhantes de hospedeiros comuns, tais como leveduras, fungos fila- mentosos, células de insetos e de plantas, rendem padrões de glicosilação associados à depuração rápida da circulação sangüínea, interações imunes não desejadas e, em alguns casos específicos, atividade biológica reduzida. Entre as células de mamíferos, as células de ovário de hamster chinês (CHO) têm sido as mais comumente utilizadas durante as últimas duas dé- cadas. Além de propiciar padrões adequados de glicosilação, estas células permitem a geração uniforme de linhagens celulares clonais geneticamente estáveis e altamente produtivas. Podem ser cultivadas até altas densidades em biorreatores simples usando meios livres de soro, e permite o desenvol- vimento de bioprocessos seguros e reprodutíveis. Outras células comumente utilizadas de animais incluem células de rim de hamster recém-nascidos (BHK), células de mieloma de camundongos NSO e SP2/0. Mais recente- mente, a produção a partir de animais transgênicos foi também testada. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81.
Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidrato em posi- ções conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, com cada iso- tipo possuindo um arranjo distinto de estruturas de carboidratos unidos ao N, as quais afetam de modo variável a montagem, secreção ou atividade fun- cional proteica. (Wright, A., e Morrison1 S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26- 32). A estrutura do carboidrato unido ao N varia consideravelmente, depen- dendo do grau de processamento, e pode incluir uma estrutura com alta pre- sença de manose (high mannose), multirramificada, bem como oligossacarí- deos com ramificações biantenárias complexas. (Wright, A., e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Tipicamente, há processamento hete- rogêneo das estruturas centrais dos oligossacarídeos, unidos em um sítio especial de glicosilação, de modo que anticorpos monoclonais existem em múltiplas glicoformas. Da mesma forma, foi demonstrado que diferenças im- portantes na glicosilação de anticorpos ocorrem entre linhagens celulares, e mesmo diferenças secundárias são observadas para uma determinada li- nhagem celular cultivada sob condições diferentes de cultura (Lifely, M. R .et al., Glycobiology 5(8) (1995) 813-22).
Uma maneira de obter aumentos grandes em potência, ao mes- mo tempo em que se mantendo o processo de produção simples e potenci- almente evitando efeitos colaterais não desejados significativos, é intensifi- car as funções efetoras naturais de mediação celular de anticorpos mono- clonais pela engenharia do seu componente oligossacarídeo como descrito em Umana, P., et ai, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e na patente US 6 602 684. Anticorpos tipo IgGI, os anticorpos mais comumente utilizados em imunoterapia contra câncer, são glicoproteínas tendo um sítio de glicosi- lação N-Iigado conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oli- gossacarídeos de ramificação biantenária complexa unidos a Asn297 são entranhados entre os domínios CH2, formando extensos contatos com a ca- deia central polipeptídica, e a sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções efetoras, tais como citotoxicidade celular dependente de an- ticorpos (ADCC) (Lifely, M. R., et ai, Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jeffe- ris, R., et ai, Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).
Foi previamente demonstrado que a superexpressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de β(1,4)-N-acetilglicosaminil transferase 111 ("GnTI117y), uma glicosil transferase que catalisa a formação de oligos- sacarídeos bissectados, aumenta significativamente a atividade ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7), produzido pelas células CHO engenheiradas (vide ümana, P., et ai, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; e WO 99/154342, cujos conteúdos, em sua totalidade, são aqui incorporados por referência neste pedido de patente). O anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de anticorpos monoclonais não-conjugados com alta afinidade e especificidade a tumor, porém potência baixa demais para ser clinicamente útil quando produzidos em linhagens celulares industriais padrão, desprovidas da enzima GnTIII (Umana, P., et ai, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180. Esse estudo foi o primeiro a de- monstrar que grandes aumentos da atividade de ADCC poderiam ser obtidos pela engenharia das células produtoras de anticorpos para que expressem GnTIII1 o que levou também a aumento na proporção de oligossacarídeos bissectados associados à região constante (Fc), incluindo oligossacarídeos bissectados, não-fucosilados, acima dos níveis encontrados em anticorpos naturais.
O termo "expressão do antígeno CD20" pretende indicar um ní- vel significativo de expressão do antígeno CD20 em uma célula, de prefe- rência, sobre a superfície celular de célula T ou B, mais preferivelmente de célula B de um tumor ou câncer, respectivamente, preferivelmente de tumor não-sólido. Pacientes com "câncer que expressam CD20" podem ser deter- minados por ensaios-padrão, conhecidos na técnica. Por exemplo, a expres- são do antígeno CD20 é medida por detecção imuno-histoquímica (IHC), FACS ou por intermédio de detecção com base em PCR do mRNA corres- pondente.
O termo "câncer que expressa CD20", como utilizado neste rela- tório, refere-se de preferência a Iinfomas (preferivelmente Iinfomas de não- Hodgkin (NHL) de células B) e Ieucemias linfocíticas. Estes Iinfomas e Ieu- cemias linfocíticas incluem, por exemplo, a) Iinfomas foliculares, b) Iinfomas de pequenas células não-clivadas/ Iinfoma de Burkitt (incluindo Iinfoma de Burkitt endêmico, Iinfoma de Burkitt esporádico e Iinfoma de não-Burkitt) c) Iinfoma de zona marginal (incluindo Iinfoma de células B de zona marginal extranodal (linfoma de tecido linfático associado à mucosa, MALT), Iinfoma de células B de zona marginal nodal e linfoma de zona marginal esplênica), d) linfoma de células do manto (MCL), e) linfoma de grandes células (inclu- indo linfoma difuso de grandes células B (DLCL)1 linfoma difuso de células mistas, linfoma imunoblástico, linfoma primário de células B mediastinal, lin- foma angiocêntrico-linfoma pulmonar de célula B) f) leucemia de células pi- losas, g) linfoma linfocítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, h) leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL)/ linfoma linfocítico de pequenas células (SLL), leucemia prolinfocítica de células B, i) neoplasias de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, mieloma múltiplo, plasmaeitoma e j) doença de Hodgkin.
De preferência, o câncer que expressa CD20 é linfoma de não- Hodgkin (NHL) de células B. Especialmente, o câncer que expressa CD20 é linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfocítica aguda (ALL)1 leuce- mia linfocítica crônica (CLL)1 linfoma difuso de grandes células B (DLCL)1 linfoma de Burkitt, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiplo, linfoma de zona marginal, distúrbio Iinfoproliferativo pós-transplante (PTLD)1 linfoma associado ao HIV1 macroglobulinemia de Waldenstrom ou linfoma primário do SNC.
O termo "método de tratamento" ou seu equivalente, quando aplicado a, por exemplo, câncer refere-se a um procedimento ou curso de ação destinado a reduzir ou eliminar o número de células cancerosas em um paciente, ou a aliviar os sintomas de câncer. "Método de tratamento" de câncer ou de outro distúrbio proliferativo não significa necessariamente que as células do câncer ou do outro distúrbio serão, de fato, eliminadas, que o número de células ou o distúrbio será, de fato, reduzido ou que os sintomas de câncer ou de outro distúrbio serão, de fato, aliviados. Freqüentemente, um método de tratamento de câncer será realizado mesmo com baixa pro- babilidade de sucesso, porém que, em vista do histórico médico e da expec- tativa estimada de sobrevida de um paciente, considera-se que, não obstan- te, induza um curso de ação benéfico em termos globais.
Os termos "coadministração" ou "coadministrado" referem-se à administração dos referidos primeiro e segundo anticorpos anti-CD20 em uma única formulação ou em duas formulações separadas. A coadministra- ção pode ser simultânea ou sequenciada em qualquer ordem, em que, de preferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas. Se uma única formulação for utilizada, ambos os anticorpos anti-CD20 são coadministra- dos simultaneamente. Se duas formulações separadas (uma para o primeiro anticorpo anti-CD20 e outra para o segundo anticorpo anti-CD20) forem utili- zadas, os referidos primeiro e segundo anticorpos anti-CD20 são coadminis- trados simultaneamente (por exemplo, através de uma única infusão contí- nua ou através de duas infusões contínuas separadas ao mesmo tempo) ou em seqüência. Quando ambos os anticorpos são administrados em sequên- cia, a dose é administrada no mesmo dia em duas administrações separa- das, por exemplo, duas infusões contínuas separadas em tempos diferentes, ou um dos anticorpos é administrado no dia 1 e o segundo anticorpo é co- administrado no dia 2 ao dia 7, de preferência no dia 2 ao dia 4. Portanto, o termo "em seqüência" significa dentro de 7 dias após a dose do primeiro an- ticorpo, de preferência dentro de 4 dias após a dose do primeiro anticorpo; e o termo "simultaneamente" significa ao mesmo tempo. Os termos "coadmi- nistração", com relação às doses de manutenção dos anticorpos anti-CD20, significa que as doses de manutenção podem ser coadministradas simulta- neamente, por exemplo, durante uma única infusão contínua, se o ciclo de tratamento for apropriado para ambos os anticorpos, por exemplo, a cada semana. Ou as doses de manutenção são coadministradas em seqüência, quer dentro de um ou dentro de vários dias, por exemplo, a dose de manu- tenção de um dos anticorpos é administrada a cada semana, e a dose de manutenção do segundo anticorpos é coadministrada também a cada duas semanas. Ademais, outros ciclos de tratamento, geralmente, por exemplo, de 3 dias até várias semanas, podem ser utilizados para ambos os anticor- pos. É evidente por si só que os anticorpos são administrados ao pa- ciente em quantidade terapeuticamente efetiva, ou seja, a quantidade do composto em questão, ou combinação, que incitará a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou ser humano que está sendo bus- cada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.
A quantidade coadministrada do primeiro e do segundo anticor- pos anti-CD20 e o momento para a coadministração dependerão do tipo (espécie, sexo, idade, peso, etc.) e condição do paciente a ser tratado e a gravidade da doença ou condição a ser tratada. Os referidos primeiro e se- gundo anticorpos anti-CD20 são adequadamente coadministrados ao paci- ente em tratamento único ou uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, em torno de 1 pg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1 - mg/kg) do referido primeiro ou segundo anticorpo anti-CD20 é uma dose inicial candidata para coadministração para o paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Em uma concretização, o tempo da infusão inicial para o referido primeiro ou o segundo anticorpo anti-CD20 pode ser mais longo do que os tempos subse- quentes de infusão, por exemplo, aproximadamente 90 minutos para infusão inicial e aproximadamente 30 minutos para infusões subsequentes (se a in- fusão inicial for bem tolerada).
A dose preferida do referido primeiro ou do segundo anticorpo anti-CD20 variará de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. Por conseguinte, uma ou mais doses de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg (ou qualquer combina- ção destas) poderá ser administrada ao paciente. Dependendo do tipo (es- pécie, sexo, idade, peso, etc.) e da condição do paciente e do tipo de anti- corpo anti-CD20, a dose do referido primeiro pode diferir da dose do segun- do anticorpo anti-CD20. Estas doses podem ser coadministradas diariamen- te ou intermitentemente, por exemplo, a cada três ou seis dias ou mesmo a cada uma a três semanas. Uma dose inicial mais alta de ataque, seguida por uma ou mais doses mais baixas podem ser administradas.
Em uma concretização preferida, o medicamento é útil para pre- venção ou redução de metástases ou ainda a disseminação neste paciente com câncer que expressa CD20. O medicamento é útil para aumentar a du- ração da sobrevida deste paciente, aumentar a sobrevida livre de progres- são deste paciente, aumentar a duração de resposta, resultando em uma melhora estatística e clinicamente significativa do paciente tratado, conforme medida pela duração da sobrevida, sobrevida livre de progressão, taxa de resposta ou duração de resposta. Em uma concretização preferida, o medi- camento é útil para aumentar a taxa de resposta em um grupo de pacientes.
No contexto desta invenção, outros agentes adicionais citotóxi- cos, quimioterápicos ou anticâncer, ou compostos que intensificam os efeitos destes agentes, podem ser utilizados no tratamento combinado de anticor- pos anti-CD20 de câncer que expressa CD20. De preferência, o tratamento combinado dos anticorpos anti-CD20 é utilizado sem estes agentes adicio- nais citotóxicos, quimioterápicos ou anticâncer, ou compostos que intensifi- cam os efeitos destes agentes.
Estes agentes incluem, por exemplo: agentes alquilantes ou a- gentes com ação de alquilação, como ciclosfosfamida (CTX; por exemplo, cytoxan®), clorambucila (CHL; por exemplo, leukeran®), cisplatina (CisP; por exemplo, platinol®) bussulfano (por exemplo, myleran®), melfalano, carmustina (BCNU)1 estreptozotocina, trietilenemelamina (TEM), mitomicina C e assemelhados; antimetabólitos, como metotrexato (MTX)1 etoposídeo (VP16; por exemplo, vepesid®), 6-mercaptopurina (6MP), 6-tioguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluoruracil (5-FU), capecitabina (por exemplo, Xeloda®), dacarbazina (DTIC) e similares; antibióticos, como actinomicina D, doxorrubicina (DXR; por exemplo, adriamycin®), daunorrubicina (daunomici- na), bleomicina, mitramicina e similares; alcalóides, tais como alcalóides da vinca, como vincristina (VCR), vimblastina e similares; e outros agentes anti- tumorais, como paclitaxel (por exemplo, taxol®) e derivados de paclitaxel, os agentes citostáticos, glicocorticoides como dexametasona (DEX; por exem- pio, decadron®) e corticosteroides como prednisona, inibidores de enzimas de nucleosídeos como hidroxiureia, enzimas com ação de depleção de ami- noácidos, como asparaginase, Ieucovorina e outros derivados do ácido fóli- co, e igualmente diversos agentes antitumorais. Os agentes a seguir podem ser também utilizados como agentes adicionais: arnifostina (por exemplo, ethyol®), dactinomicina, mecloretamina (mostarda nitrogenada), estreptozo- cina, ciclofosfamida, Iomustina (CCNU), doxorrubicina Iipo (por exemplo, do- xil®), gencitabina (por exemplo, gemzar®), daunorrubicina Iipo (por exemplo, daunoxome®), procarbazina, mitomicina, docetaxel (por exemplo, taxote- re®), aldesleucina, carboplatina, oxaliplatina, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecano), 10-hidróxi 7-etil-camptotecina (SN38), floxuridina, fludarabi- na, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferon beta, interferon alfa, mitoxan- trona, topotecano, leuprolide, megestrol, melfalano, mercaptopurina, plicami- cina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobromano, plicamicina, ta- moxifeno, teniposide, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorrelbina, clorambucila. De preferência, o tratamento combinado dos anti- corpos anti-CD20 é utilizado sem estes agentes adicionais. O uso de agentes citotóxicos e anticâncer descritos acima, bem
como fármaco anticâncer antiproliferativo de alvo específico, como inibidores de proteínas quinase, em regime quimioterápico está, em geral, bem carac- terizado nas técnicas da terapia contra câncer, e o seu uso, neste relatório, se enquadra sob as mesmas considerações para o monitoramento da tole- rância e da eficácia e para o controle de vias de administração e doses, com alguns ajustes. Por exemplo, as doses reais dos agentes citotóxicos podem variar dependendo da resposta de células cultivadas do paciente, determi- nadas por métodos de histocultura. De modo geral, a dose será menor em comparação à quantidade utilizada na ausência de outros agentes adicio- nais.
As doses típicas de um agente citotóxico eficaz podem ser nos intervalos recomendados pelo fabricante e, quando indicado, por respostas in vitro ou respostas em modelos animais, podem ser reduzidas para con- centração ou quantidade de até aproximadamente uma ordem de magnitu- de. Por conseguinte, a dose real dependerá do juízo do médico, da condição do paciente e da eficácia do método terapêutico com base na capacidade de resposta in vitro das células malignas primárias cultivadas ou de amostra de tecido histocultivada, ou das respostas observadas nos modelos apropriados com animais.
No contexto desta invenção, a radiação ionizante em uma quan- tidade efetiva pode ser conduzida e/ou um produto radiofarmacêutico pode ser utilizado além do tratamento combinado dos anticorpos anti-CD20 de câncer que expressa CD20. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente a ser tratado. Quando a fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como radioterapia de feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamento é denominado braquiterapia (BT). Átomos radioativos para uso no contexto desta invenção podem ser selecionados a partir do grupo incluindo, entre outros, rádio, césio-137, Irf- dio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnétio-99, iodo-123, iodo-131 e índio-111. É também possível marcar o anticorpo com estes isó- topos radioativos. De preferência, o tratamento combinado dos anticorpos anti-CD20 é utilizado sem esta radiação ionizante.
A radioterapia é um tratamento-padrão para o controle de tumo- res irressecáveis ou inoperáveis e/ou de metástases tumorais. Resultados melhores foram observados quando a radioterapia foi combinada com qui- mioterapia. A radioterapia tem como base o princípio de que radiação em alta dose liberada a uma área intencionada resultará na morte de células reprodutivas tanto em tecido tumoral como no normal. O regime das doses de radiação é geralmente definido em termos de dose absorvida (Gy)1 tempo e fracionamento da radiação, e deve ser cuidadosamente definido pelo onco- logista. A quantidade de radiação que um paciente recebe dependerá de várias considerações, porém as duas mais importantes são a localização do tumor em relação a outras estruturas críticas ou órgãos do corpo e a exten- são à qual o tumor se disseminou. Um ciclo típico de tratamento para um paciente submetido à radioterapia será um esquema de tratamento sobre um período de uma a seis semanas, com dose total entre 10 e 80 Gy, adminis- trada ao paciente em uma única fração diária de aproximadamente 1,8 a 2,0 Gy, 5 dias por semana. Em uma concretização desta invenção, há sinergia quando tumores em pacientes são tratados com o tratamento combinado da invenção e a radiação. Em outras palavras, a inibição de crescimento tumo- ral por meio dos agentes compreendendo a combinação da invenção é in- tensificada quando combinada com radiação, opcionalmente com quimiote- rápicos ou agentes anticâncer adicionais. Parâmetros de radioterapias adju- vantes estão contidos, por exemplo, no documento WO 99/60023.
Os anticorpos são administrados a um paciente de acordo com métodos conhecidos, por administração intravenosa como em bolo ou por infusão contínua sobre um período de tempo, por via intramuscular, intraperi- toneal, intracérebro-espinhal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial ou intratecal. A administração intravenosa ou subcutânea dos anticorpos é pre- ferida.
A invenção compreende ainda um kit caracterizado por compre- ender um recipiente, uma composição dentro do recipiente compreendendo os referidos anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo II, quer na forma de uma única formulação ou em duas formulações separadas, e uma bula do medicamen- to com instruções para o usuário da composição sobre a administração dos referidos anticorpos anti-CD tipo I e tipo Il para um paciente com câncer que expressa CD20.
De preferência, o kit é caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
O termo "bula do medicamento" refere-se a instruções habitual- mente inseridas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, a qual pode incluir informação sobre as indicações, uso, posologia, administração, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso destes produtos tera- pêuticos.
Em uma concretização preferida, o item de recipientes fabrica- dos pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. O item de fabrica- ção pode incluir um diluente estéril, o qual está preferivelmente acondiciona- do em recipiente adicional separado.
Como utilizado neste relatório, "veículo farmaceuticamente acei- tável" pretende incluir todos e quaisquer materiais compatíveis com a admi- nistração farmacêutica, incluindo solventes, meios de dispersão, revestimen- tos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e outros materiais e compostos compatíveis com a administra- ção farmacêutica. Exceto na medida em que quaisquer meios ou agentes convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições. Formulações farmacêuticas Formulações terapêuticas dos anticorpos, utilizados em confor-
midade com a presente invenção, são preparadas para armazenamento pela mistura de um anticorpo com o grau desejado de pureza com veículos op- cionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Re- mington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou de soluções aquosas. Veículos, excipi- entes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para receptores nas do- ses e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metioni- na; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; cate- col; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidi- na, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidra- tos, incluindo glicose, manose ou dextrina; agentes de quelação, como ED- TA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons for- madores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, como TWEEN®, PLURO- NICS® ou polietilenoglicol (PEG).
As formulações de acordo com a invenção podem ser duas for- mulações separadas para cada anticorpo anti-CD20. Alternativamente, a presente formulação pode conter ambos os anticorpos em uma única formu- lação.
Adicionalmente, a composição pode compreender ainda um a- gente quimioterápico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor de cresci- mento ou agente antiangiogênico. Essas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades eficazes para a finalidade pre- tendida.
Os princípios ativos podem estar inseridos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização inter-racial, por exemplo, microcápsulas de hidrometilcelulose ou de gelatina, microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas colo- dais de liberação de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroe- mulsões. Estas técnicas são expostas em Remington1S Pharmaceutical Sci- ences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticor- po, cujas matrizes estão na forma de itens moldados, por exemplo, em fil- mes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada inclu- em poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou ál- cool poli(vinílico)), polilactídeos (US 3 773 919), copolímeros de ácido L- glutâmico e gama-etil-L-glutamato, acetato de etilenovinila não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico, como o LUPRON DEPOT® (mi- croesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicó- lico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. A esterilização é rapidamente realizada por filtração a- través de membranas estéreis de filtração.
A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 tipo I pa- ra o tratamento de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 tipo I pa- ra o tratamento de um paciente com câncer que expressa CD20, caracteri- zado pelo fato que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
Em uma concretização preferida da invenção, o referido anticor- po anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfo- ma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 tipo I pa- ra o tratamento de câncer que expressa CD20 ou de um paciente com cân- cer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que
a) o referido anticorpo anti-CD20 tipo I tem uma razão das capa- cidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do refe- rido anticorpo anti-CD20 tipo I comparado a rituximab de 0,8 a 1,2,
b) o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II, e
c) o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem uma razão das ca- pacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do
referido anticorpo anti-CD20 tipo Il comparado a rituximab de 0,3 a 0,6.
De preferência, o câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não- Hodgkin (NHL) de células B.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab. De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anti-
corpo B-Lyl humanizado.
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il possui cito- toxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentada.
Os exemplos e as figuras a seguir são fornecidos para ajudar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações anexadas. É entendido que modificações podem ser fei- tas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção. Listagem de seqüências
SEQ ID NO: 1 seqüência de aminoácidos de região variável da cadeia
pesada (VH) de anticorpo monoclonal B-Lyl murino an- ti-CD20.
SEQ ID NO: 2 seqüência de aminoácidos de região variável da cadeia
leve (VL) de anticorpo monoclonal B-Lyl murino anti- CD20.
SEQ ID NO: 3-19 seqüência de aminoácidos de região variável da cadeia
pesada (VH) de anticorpos B-Lyl humanizados (B-HH2 a B-HH9, B-HL8 e B-HL10 a B-HL17)
SEQ ID NO: 20 seqüência de aminoácidos de região variável da cadeia
leve (VL) do anticorpo B-Lyl B-KV1 humanizado Descrição das figuras
Figura 1 - Atividade antitumoral do tratamento combinado de um anticorpo anti-CD20 tipo I (rituximab) com razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti- CD20 tipo I comparado a rituximab de 1,0, com um anticorpo anti-CD20 tipo Il (B-HH6-B-KV1 GE) com razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti-CD20 tipo Il comparado a rituximab de 0,44, em células OCI-LyI 8 de Iinfoma de não- Hodgkin (NHL) humano. Valores médios de volume de tumor [mm3] inseridos no eixo y; número de dias após injeção de células tumorais, inserido no eixo x. Legenda: A)Veículo (círculos), B) rituximab 30 mg/kg, por via i.v., uma vez por semana (triângulos). C) B-Iyl humanizado (B-HH6-B-KV1 GE) 30 mg/kg, uma vez por semana (quadrados) e D) rituximab coadministrado com B-HH6-B-KV1 GE (cada um, 30 mg/kg uma vez por semana) (cruzes)
Figura 2 - Intensidade Média de Fluorescência (MFI, eixo y à esquerda) do anticorpo anti-CD20 tipo I (Cy5-rituximab = barra branca) e do anticorpo anti-CD20 tipo Il (Cy5- B-Lyl B-HH6-B-KV1 GE humanizado = bar- ra preta) em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86); Razão das capacidades de ligação a CD20 do anticorpo anti-CD20 tipo I (rituximab) e do anticorpo anti- CD20 tipo Il (B-HH6-B-KV1 GE) comparados a rituximab (em escala sobre o eixo y)
Figura 3 - Atividade antitumoral do tratamento com dois anticor- pos anti-CD20 sobre células Z138 de Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) huma- no. Ambos os anticorpos são anticorpos B-Lyl humanizados anti-CD20; 1) B-HH6-B-KV1 glico-engenheirado (GE) e 2) B-HH6-B-KV1 do tipo selvagem (wt, não glico-engenheirado). Valores médios de volume de tumor [mm3] in- seridos no eixo y; número de dias após injeção de células tumorais, inserido no eixo x. Legenda: A)Veículo (círculos ), B) B-Iyl GE humanizado (B-HH6- B-KV1 GE) 30 mg/kg, uma vez por semana (triângulos) e C) B-Iyl wt hu- manizado (B-HH6-B-KV1 wt), 30 mg/kg, uma vez por semana (cruzes). Procedimentos experimentais Exemplo 1
Atividade antitumoral do tratamento combinado de um anticorpo anti-CD20 tipo I (rituximab) com um anticorpo anti-CD20 tipo Il (B-HH6-B-KV1 GE) Agentes de teste
Anticorpo anti-CD20 tipo I, rituximab, foi provido em forma de solução de estoque (c = 10 mg/ml) pela Hoffmann La Roche, Basiléia, Suíça. O tampão contém polissorbato 80, cloreto de sódio e citrato de sódio.
Anticorpo anti-CD20 tipo II, B-HH6-B-KV1 GE (=B-LyI humani- zado, B-HH6-B-KV1 glico-engenheirado, vide os documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875)) foi provido em forma de solução-estoque (c = 9,4 mg/kg) pela GIycArt, Schlieren, Suíça. O tampão do anticorpo con- tém histidina, trealose e polissorbato 20.
Ambas as soluções são diluídas apropriadamente em PBS de estoque antes das injeções.
Linhagens celulares e condições da cultura
Células OCI-LyI 8 de Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) humano (Chang, H., et al, Leuk Lymphoma. 1992 Sep;8(1-2): 129-36) (linfoma difuso de grandes células - LDGC) foram utilizadas. A linhagem celular tumoral foi cultivada de modo de rotina em meio INDM (PAA, Laboratories, Áustria), suplementado com soro bovino fetal a 20% (PAA Laboratories, Áustria) e L- glutamina a 2 mM, HEPES a 25 nM e mercaptoetanol a 0,05 mM a 37 0C em atmosfera saturada com água em CO2 a 5%. Duas passagens foram utiliza- das para o transplante. Animais
Camundongos fêmeas SCID bege, idade de 4-5 semanas ao chegarem (adquiridos da Bomholtgard, Ry, Dinamarca), foram mantidos sob condições livres de agentes patogênicos com ciclos diários de 12 h de luz/ 12 h no escuro de acordo com diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de qua- rentena das instalações reservada para animais, por uma semana até que se acostumassem ao novo ambiente e para observação. O monitoramento da saúde contínuo foi conduzido regularmente. Ração de dieta (Provimi Kli- ba 3337) e água (acidificada, pH 2,5 - 3) foram fornecidas ad Iibitum. Monitoramento
Os animais foram controlados diariamente quanto a sintomas
clínicos e detecção de efeitos adversos. Para monitoramento por todo o ex- perimento, o peso corporal foi documentado duas vezes semanalmente, e o volume tumoral foi medido com calibrador após estadiamento. Tratamento de animais O tratamento dos animais iniciou no dia da randomização, 24
dias após o transplante celular. Os grupos que receberam o anticorpo anti- CD20 tipo II, B-HH6-B-KV1 GE, e o grupo do veículo correspondente, foram tratados por via i.v., uma vez a cada dia, nos dias 24, 31, 38, 45 e 52 do es- tudo, na dose indicada de 30 mg/kg. O tratamento com o anticorpo anti- CD20 tipo I, rituximab, como agente único e combinado ao anticorpo anti- CD20 tipo II, B-HH6-B-KV1 GE, foi realizado nos dias 26, 33, 40, 47 e 54 Estudo de inibicão de crescimento tumoral in vivo
Animais com tumor recebendo controle de veículo tiveram que ser excluídos 10 dias após a introdução do tratamento devido à carga tumo- ral. O tratamento de animais com Rituximab semanalmente, em dose de 30 mg/kg, como agente único inibiu o crescimento do xenoenxerto por 10 dias (TGI: 68%). Posteriormente, os xenoenxertos tumorais progrediram continu- amente, apesar de injeções semanais de Rituximab como agente único. Por outro lado, a monoterapia com B-HH6-B-KV1 GE (30 mg/kg), uma vez por semana, controlou o crescimento do tumor de células OCI-LyI8 (TGI: 100%). Não obstante, finalmente, os xenoenxertos tumorais começaram a progredir sob administração do agente isolado B-HH6-B-KV1 GE. No entan- to, a combinação de Rituximab e B-HH6-B-KV1 GE1 ambos em dose de 30 mg/kg, foi obviamente de eficácia superior. Os tumores xenoenxertados fo- ram controlados e ao contrário do tumor de cada braço do anticorpo como agente isolado, a estase manteve-se ao longo do tempo. Exemplo 2
Determinação da razão das capacidades de ligação a CD20. em células Raii (N0 de ATCC: CCL-86). do anticorpo anti-CD20 tipo Il comparado a rituximab Células Raji (N0 de ATCC: CCL-86) foram mantidas em cultura em meio RPMI-1640 (PanBiotech GmbH, N0 de cat.: P04-18500), contendo 10% de FCS (Gibco, N0 de cat.: 10500-064). O anticorpo anti-CD20 tipo II, B-HH6-B-KV1 (anticorpo B-Lyl humanizado), e rituximab foram marcados com Cy5 monoéster de NHS (Amersham GE Healthcare, N0 de catálogo: PA15101) de acordo com as instruções do fabricante. A marcação de Ritu- ximab conjugado a Cy5 teve como razão 2,0 moléculas de Cy-5 por anticor- po. A marcação de B-HH6-B-KV1 conjugado a Cy5 teve como razão 2,2 mo- léculas de Cy5 por anticorpo. A fim de determinar e comparar as capacida- des e modo de ligação de ambos os anticorpos, foram geradas curvas de ligação (por titulação de Rituximab conjugado a Cy5 e B-HH6-B-KV1 conju- gado a Cy5) por imunofluorescência, usando uma linhagem de células Raji de Iinfoma de Burkitt (N0 de ATCC: CCL-86). Intensidades médias de flo- rescência (MFI) foram analisadas em função de EC50 (50% da intensidade máxima) para o Rituximab conjugado a Cy5 e B-HH6-B-KV1 conjugado a Cy5, respectivamente. 5*105 células por amostra foram coradas por 30 min. a 4 °C. Posteriormente, as células foram lavadas em meio de cultura. A colo- ração com iodeto de propídio (PI) foi utilizada par excluir células mortas. As medições foram realizadas utilizando o FACSArray (Becton Dickinson), Iode- to de propídio (PI) foi medido em Vermelho Distante A e Cy5, em Vermelho- Α. A figura 2 exibe a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) para ligação em EC50 (50% da intensidade máxima) de B-HH6-B-KV1 marcado com Cy5 (barra preta) e de rituximab marcado com Cy5 (barra branca).
Em seguida, a razão das capacidades de ligação a CD20 em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86) é calculada de acordo com a seguinte fórmula:
Razão das capacidades de ligação a CD20 em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86) =
MFI (anticorpo anti - CD20 - Cy5) razão de Cy5 - marcado (Cy5 - rituximab)
MFI (Cy5 - rituximab) razão de Cy5 - marcado (anticorpo anti - CD20 - Cy5)
MFI (Β - HH6 - B - KV1) c razão de Cy5 - marcado (Cy5 - rituximab) MFI (Cy5 - rituximab) razão de Cy5 - marcado (Β - HH6 - B - KV1)
207 2,2 ...
-χ-= 0,44
433 2,0 '
Portanto, B-HH6-B-KV1, como um típico anticorpo anti-CD20 tipo II, exibe menor capacidade de ligação, comparado a rituximab. Exemplo 3
Atividades antitumorais semelhantes do anticorpo anti-CD20 qlico- enqenheirado (GE) e não qlico-enaenheirado (tipo de selvagem, wt) (B-HH6- B-KV1 GE e wt) contra xenoenxertos de MCL Z138 em camundonqos beaes SCID
Agentes de teste
Anticorpo anti-CD20 tipo II, B-HH6-B-KV1 (glico-engenheirado (GE) e do tipo selvagem (wt)) foi fornecido em forma de solução de estoque (c = 9,4 mg/ml e 12,5 mg/ml) pela GIycArt, Schlieren, Suíça. O tampão do anticorpo incluiu histidina, trealose e polissorbato 20.
Ambas as soluções foram diluídas apropriadamente em PBS de estoque antes das injeções. Linhagens celulares e condições da cultura
Células Z138 de Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B foram original- mente obtidas da Glycart (Linfoma de células do manto - LCM). A linhagem de células tumorais foi cultivada de modo de rotina em meio DMEM (PAA, Laboratories, Áustria), suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA Laboratories, Áustria) e L-glutamina a 2 mM a 37 0C em atmosfera saturada com água em 5% de CO2. Foram utilizadas 2 passagens para o transplante.
Animais
Camundongos fêmeas bege SCID, com idade de 4-5 semanas ao chegarem (adquiridos da Bomholtgard, Ry1 Dinamarca) foram mantidos sob condições livres de agentes patogênicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h no escuro de acordo com diretrizes comprometidas (GV-Solas; Fe- lasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de quarentena das instalações reservadas para animais, por uma semana até que se acostumassem ao novo ambiente e para observação. O monitora- mento da saúde contínuo foi conduzido regularmente. Ração de dieta (Pro- vimi Kliba 3337) e água (acidificada, pH 2,5 - 3) foram fornecidas ad libitum. Monitoramento
Os animais foram controlados diariamente quanto a sintomas clínicos e detecção de efeitos adversos. Para monitoramento por todo o ex- perimento, o peso corporal foi documentado duas vezes semanalmente, e o volume tumoral foi medido com calibrador após estadiamento. Tratamento de animais
O tratamento dos animais iniciou no dia da randomização, 14 dias após o transporte s.c. das células. Grupos recebendo o anticorpo hu- manizado anti-CD20 (B-HH6-B-KV1 GE e wt) e o grupo correspondente do veículo foram tratados por via i.v. a cada 7 dias, nos dias 14, 20, 27 e 34 do estudo na dose indicada de 10 mg/kg. Estudo de inibição de crescimento tumoral in vivo
Animais com tumor recebendo controle de veículo tiveram que ser excluídos 19 dias após a introdução do tratamento devido à carga tumo- ral. O tratamento semanal com B-HH6-B-KV1, em forma de wt ou glico- engenheirada (B-HH6-B-KV1 GE e wt), na dose de 10 mg/kg, inibiu o cres- cimento do xenoenxerto pouco após o início do tratamento. Ao término do controle de todos os anticorpos, os tumores regrediram e, mais tarde, a mai- oria dos xenoenxertos tumorais de células Z138 exibiu remissão completa. Não foram observadas diferenças significativas entre as versões wt e glico- engenheirada do anticorpo anti-CD20 B-HH6-B-KV1 neste modelo de xeno- enxertos. O achado não foi improvável uma vez que camundongos não ex- pressam o receptor correto de Fc em suas células NK e, além disso, camun- dongos beges SCID são supostamente incompetentes para ADCC mediada por NK devido à imunodeficiência tripla grave. Por conseguinte, modelos de xenoenxertos s.c. em camundongos beges SCID não são apropriados para mimetizar o efeito humano de ADCC mediado com anticorpos glico- engenheirados modificados.

Claims (16)

1. Uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de câncer que expressa CD20, carac- terizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadminis- trado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
2. Uso de um anticorpo anti-CD20 tipo I para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de um paciente que sofre de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti- CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
3. Anticorpo anti-CD20 tipo I para o tratamento de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti- CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti-CD20 tipo II.
4. Anticorpo anti-CD20 tipo I para o tratamento de um paciente que sofre de câncer que expressa CD20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é coadministrado com um anticorpo anti- CD20 tipo II.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a) o referido anticorpo anti-CD20 tipo I exibe como razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti-CD20 tipo I comparado a rituximab de 0,8 a 1,2, e b) o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem uma razão das ca- pacidades de ligação a CD20, em células Raji (N° de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti-CD20 tipo Il comparado a rituximab de 0,3 a 0,6.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os referidos anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo Il são anticorpos monoclonais.
8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ca- racterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado.
10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituxi- mab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem citotoxi- cidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentada.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que, pelo menos 40% ou mais dos oltgossacarí- deos da região Fc do referido anticorpo anti-CD20 tipo Il são não- fucosilados.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL- 86), do referido anticorpo anti-CD20 tipo I comparado a rituximab de 0,9 a 1,1.
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il tem uma razão das capacidades de ligação a CD20, em células Raji (N0 de ATCC: CCL-86), do referido anticorpo anti-CD20 tipo Il comparado a rituximab de 0,35 a 0.55, de preferência, de 0,4 a 0,5.
15. Kit compreendendo um anticorpo anti-CD20 tipo Il e um anti- corpo anti-CD20 tipo I para o tratamento combinado de um paciente que so- fre de câncer que expressa CD20.
16. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é rituximab, o referido anticorpo anti-CD20 tipo Il é um anticorpo B-Lyl humanizado e o referido câncer que expressa CD20 é Iinfoma de não-Hodgkin (NHL) de células B.
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