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BRPI0720476B1 - Uso de um polipeptídeo de actrii para tratar anemia em um paciente humano - Google Patents

Uso de um polipeptídeo de actrii para tratar anemia em um paciente humano Download PDF

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BRPI0720476B1
BRPI0720476B1 BRPI0720476-0A BRPI0720476A BRPI0720476B1 BR PI0720476 B1 BRPI0720476 B1 BR PI0720476B1 BR PI0720476 A BRPI0720476 A BR PI0720476A BR PI0720476 B1 BRPI0720476 B1 BR PI0720476B1
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Matthew L. Sherman
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Acceleron Pharma Inc
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Abstract

ANTAGONISTAS DE ATIVINA-ACTRI E USOS PARA AUMENTAR NÍVEIS DE CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE. Em certos aspectos, a presente invenção fornece composições e métodos para aumentar níveis de célula vermelha do sangue e/ou hemoglobina em vertebrados, incluindo roedores e primatas e, particularmente, humanos.

Description

Pedidos relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício para pedido de patente provisório U.S. 60/875.682, depositado em 18 de dezembro de 2006, cujo pedido é por meio disso incorporado pela referência na sua íntegra.
Antecedentes da invenção
[002] A célula vermelha do sangue madura, ou eritrócito, é responsável pelo transporte de oxigênio nos sistemas circulatórios de vertebrados. As células vermelhas do sangue carregam altas concentrações de hemoglobina, uma proteína que liga oxigênio nos pulmões em pressão parcial relativamente alta de oxigênio (pO2) e libera oxigênio para áreas do corpo com uma pO2 relativamente baixa.
[003] As células vermelhas do sangue maduras são produzidas a partir de células tronco hematopoiéticas pluripotentes em um processo denominado eritropoi- ese. Em indivíduos após o parto, a eritropoiese ocorre principalmente na medula óssea e na polpa vermelha do baço. A ação coordenada de vários caminhos de sinali-zação controla o equilíbrio da proliferação, diferenciação, sobrevivência e morte celular. Em condições normais, as células vermelhas do sangue são produzidas em uma taxa que mantém uma massa de células vermelhas no corpo, e a produção pode aumentar ou diminuir em resposta a vários estímulos, incluindo maior ou menor tensão de oxigênio ou demanda do tecido. O processo de eritropoiese começa com a formação de células precursoras comprometidas com linhagem e continua através de uma série de tipos de células precursoras distintas. Os estágios finais de eritropoiese ocorrem a medida que os reticulócitos são liberados na corrente sanguínea e perdem suas mitocôndrias e ribossomos, assumindo ao mesmo tempo a morfologia da célula vermelha do sangue madura. Um nível elevado de reticulócitos, ou uma razão elevada de reticulócito: eritrócito, no sangue é indicativo de maiores taxas de produção célula vermelha do sangue.
[004] Eritropoietina (Epo) é amplamente reconhecida como o regulador positivo mais significativo de eritropoiese em vertebrados após o nascimento. Epo regula a resposta eritropoiética compensatória para menor tensão de oxigênio no tecido (hi- póxia) e baixos níveis de células vermelhas do sangue ou baixos níveis de hemoglobina. Em humanos, níveis de Epo elevados promovem formação de célula vermelha do sangue estimulando a produção de progenitores eritróides na medula óssea e baço. No camundongo, Epo melhora a eritropoiese principalmente no baço.
[005] Várias formas de Epo recombinante são usadas por médicos para aumentar os níveis de células vermelhas do sangue em uma variedade de quadros clínicos e, particularmente, no tratamento de anemia. A anemia é uma condição amplamente definida caracterizada por níveis menores que normal de hemoglobina ou cé-lulas vermelhas do sangue na corrente sanguínea. Em alguns exemplos, anemia é causada por um distúrbio primário na produção ou sobrevivência das células vermelhas do sangue. Mais comumente, a anemia é secundária em doenças de outros sistemas (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1 169-1 175). A anemia pode resultar de uma menor taxa de produção ou maior taxa de destruição de células vermelhas do sangue ou da perda de células vermelhas do sangue em virtude de hemorragia. A anemia pode resultar de uma variedade de distúrbios que incluem, por exemplo, insuficiência renal crônica, síndrome mielodiblástica, artrite reumatóide e transplante de medula óssea.
[006] O tratamento com Epo causa tipicamente um aumento nas hemoglobinas em cerca de 1-3 g/dL em humanos saudáveis por um período de semanas. Quando administrado a indivíduos anêmicos, este regime de tratamento fornece frequentemente aumentos substanciais nos níveis de hemoglobina e células vermelhas do sangue e leva a melhorias na qualidade de vida e sobrevivência prolongada. Epo não é uniformemente efetiva, e muitos indivíduos são refratários mesmo a altas doses (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50). Acima de 50% de pacientes com câncer têm uma resposta inadequada à Epo, aproximadamente 10% com doença renal em estágio final são hiperresponsivos (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 12181234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425), e menos que 10% com sín- drome mielodiblástica responsdem favoravelmente (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67). Diversos fatores, incluindo inflamação, deficiência de ferro e vitamina, di- álise inadequada, toxicidade do alumínio e hiperparatiroidismo podem predizer uma resposta terapêutica deficiente e os mecanismos moleculares de resistência a Epo ainda não são claros.
[007] Assim, é um objetivo da presente revelação fornecer composições e métodos alternativos para aumentar níveis de células vermelhas do sangue em pacientes.
Sumário da invenção
[008] Em parte, a revelação demonstra que antagonistas de ativina, bem como antagonistas de ActRIIa e ActRIIb, podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina. Em particular, a revelação demonstra que uma forma solúvel de ActRIIa age como um inibidor de ativina e, quando administrada in vivo, aumenta os níveis de células vermelhas do sangue na corrente sanguínea. Um efeito mais suave foi observado com uma forma solúvel de ActRIIb, que liga ativina A com menos afinidade do que ActRIIa solúvel. Embora ActRIIa e ActRIIb solúveis possam afetar os níveis de células vermelhas do sangue através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina, entretanto, a revelação demonstra que agentes terapêuticos desejáveis podem ser selecionados com base no antagonismo de ativina ou antagonismo de ActrII ou ambos. Tais agentes são coletivamente referidos como an-tagonistas de ativina-ActrII. Portanto, em certas modalidades, a revelação fornece métodos para usar antagonistas de ativina-actrII, incluindo, por exemplo, polipeptídeos ActRIIa de ligação de ativina, polipeptídeos ActRIIb de ligação de ativina, anticorpos anti-ativina, anticorpos anti-ActRIIa, anticorpos anti-ActRIIb, moléculas e aptâmeros pequenos que alvejam ativina, ActRIIb ou ActRIIa, e ácidos nucléicos que diminuem a expressão de ativina, ActRIIb, ou ActRIIa, para aumentar níveis de célula vermelha do sangue e hemoglobina em pacientes e para tratar distúrbios associados com baixos níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina em pacientes que necessitam destes. Como descrito no pedido de patente U.S. número de série 1 1/603.485, aqui incorporado pela referência, antagonistas de ativina-ActRIIa podem ser usados para promover crescimento ósseo e aumentar a densidade óssea. Da maneira aqui descrita, os efeitos de tais antagonistas nos níveis de células vermelhas do sangue são mais rápidos e ocorrem em doses mais baixas do que os efeitos de tais antagonistas no osso. Assim, em certas modalidades, a revelação fornece métodos para usar um antagonista de ativina-ActRIIa para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina sem causar um aumento significativo na densidade óssea. Por exemplo, um método pode causar um aumento menor que 3%, 5%, 10% ou 15% na densidade óssea. Este efeito seletivo pode ser atingido usando, por exemplo, doses mais baixas de antagonista de ativina-ActRIIa, doses menos frequentes, ou usando um antagonista de ativina-ActRIIa com uma meia-vida sérica mais curta em doses e frequências calculados para fornecer uma menor concentração de soro.
[009] Em certos aspectos, a revelação fornece polipeptídeos compreendendo um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina solúvel que se liga à ativina. O polipeptídeo de ativação de ativina pode ser um polipeptídeo ActRIIa ou um polipeptídeo ActRIIb. Os polipeptídeos ActrII pode ser formulado como uma preparação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo ActrII de ligação de ativina e um carreador farmaceutica- mente aceitável. O polipeptídeo ActrII de ligação de ativina pode se ligar à ativina com uma KD menor que 1 micromolar ou menor que 100, 10 ou 1 nanomolar. Opcionalmente, o polipeptídeo ActrII de ligação de ativina liga seletivamente ativina versus GDF11 e/ou GDF8, e, opcionalmente, com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes menor com relação a ativina do que com relação a GDF11 e/ou GDF8. Embora sem querer ficar preso a um mecanismo particular de ação, espera-se que este grau de seletividade para inibição de ativina com relação a inibição de GDF11/GDF8 seja responsável pelos efeitos no osso ou eritropoiese sem um efeito consistentemente mensurável no músculo. Em muitas modalidades, um polipeptídeo ActrII será selecionado para causar menos que 15%, menos que 10% ou menos que 5% de aumento no músculo em doses que atingem efeitos desejáveis nos níveis de células vermelhas do sangue. A composição pode ser pelo menos 95% pura, com relação a outros componentes de polipeptídeo, avaliada por cromatografia por exclusão de tamanho e, opcionalmente, a composição é pelo menos 98% pura. Um polipeptídeo ActrIIa de ligação de ativina para uso em uma preparação como esta pode ser qualquer um daqueles aqui revelados, tal como um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ou 12, ou com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 ou 13. Um polipeptídeo ActrIIa de ligação de ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIa natural, tal como um que compreende pelo menos 10, 20 ou 30 ami-noácidos de uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 1-3 ou uma sequência de SEQ ID NO: 2, faltando os aminoácidos 10 a 15 do terminal C (a “cauda”). Um polipeptídeo ActrIIb de ligação de ativina para uso em uma preparação como esta pode ser qualquer um daqueles aqui revelados, tal como um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16, 17, 20, ou 21 ou com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16, 17, 20, ou 21. Um polipeptídeo ActrIIb de ligação de ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIb natural, tal como um que compreende pelo menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NOs: 15-17 ou uma sequência faltando os aminoácidos 10 a 15 do terminal C (a “cauda”) tal como SEQ ID NO: 17.
[010] Um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina solúvel pode incluir uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos (por exemplo, no domínio de ligação de elemento de ligação) com relação a um polipeptídeo ActrII de ocorrência natural. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa e ActRIIb alterados são fornecidos em WO 2006/012627, pp. 59-60 e pp. 55-58, respectivamente, que é aqui incorporado pela referência. A alteração na sequência de aminoácidos, por exemplo, pode alterar a glicosilação do polipeptídeo durante a produção em uma célula de mamífero, inseto ou outro eucarioto ou alterar a clivagem proteolítica do polipeptídeo com relação ao polipeptídeo ActrII de ocorrência natural.
[011] Um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina pode ser uma proteína de fusão que tem, como um domínio, um polipeptídeo ActrII, (por exemplo, uma porção de ligação de elemento de ligação de uma ActRIIa ou ActRIIb) e um ou mais domínios adicionais que fornecem uma propriedade desejável, tais como melhor farmacociné- tica, purificação mais fácil, alvejamento em tecidos particulares, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fusão pode melhorar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, for-mação de complexos de proteína, multimerização da proteína de fusão, e/ou purificação. Uma proteína de fusão de ActrII de ligação de ativina pode incluir um domínio Fc de imunoglobulina (tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica ou outra porção de polipeptídeo que fornece propriedades desejáveis tais como melhor farmaco- cinética, maior solubilidade ou maior estabilidade. In uma modalidade preferida, uma fusão ActrII-Fc compreende um ligante relativamente não estruturado posicionado entre o domínio Fc e o domínio ActrII extracelular. Este ligante não estruturado pode corresponder à região grosseiramente não estruturada de 15 aminoácidos na extremidade terminal C do domínio extracelular de ActrII (a “cauda”), ou pode ser uma sequência artificial de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou ter um comprimento de entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente livres de estrutura secundária, ou um mistura de ambos. Um ligante pode ser rico em resíduos de glicina e prolina e, por exemplo, pode contes uma sequência única de treonina/serina e glicinas ou sequências repetitivas de treonina/serina e glicinas (por exemplo, TG4 (SEQ ID NO: 22) ou SG4 (SEQ IN NO: 23) singletes ou de repetição). Uma proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um marcador de epítopo, um FLAG tag, uma sequência de poli-histidina, e uma fusão de GST. Opcionalmente, um polipeptídeo ActrII solúvel inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGlado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração lipídica, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatiza- ção orgânico. Uma preparação farmacêutica também pode incluir um ou mais compostos adicionais tal como um composto que é usado para tratar um distúrbio ósseo. Preferivelmente, uma preparação farmacêutica é substancialmente livre de pirogênio. Em geral, é preferível que uma proteína ActrII seja expressa em uma linhagem celular de mamífero, que faça mediação apropriada à glicosilação natural da proteína ActrII, de maneira a diminuir a probabilidade de uma resposta imune desfavorável em um paciente. Linhagens celulares humana e CHO foram usadas com sucesso e espera- se que outros sistemas de expressão de mamífero comuns sejam usados.
[012] Da maneira aqui descrita, proteínas ActRIla designadas ActRIIa-Fc (uma forma com um ligante mínimo entre a porção ActRIla e a porção Fc) têm propriedades desejáveis, incluindo ligação seletiva à ativina versus GDF8 e/ou GDF11, ligação de elemento de ligação de alta afinidade e meia-vida sérica maior que duas semanas em modelos animais. Em certas modalidades a invenção fornece polipeptídeos ActrII-Fc e preparações farmacêuticas compreendendo tais polipeptídeos e um excipiente far- maceuticamente aceitável.
[013] Em certos aspectos, a revelação fornece ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo ActrlI de ligação de ativina solúvel, tal como um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb. Um polinucleotídeo isolado pode compreender uma sequência de codificação para um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina solúvel, tal como descrito anteriormente. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode incluir uma sequência que codifica um domínio extracelular (por exemplo, domínio de ligação de elemento de ligação) de uma ActrII e uma sequência que codificaria parte ou todo o domínio trans- membrana e/ou o domínio citoplasmático de uma ActrII, mas para um códon de parada posicionado no domínio transmembrana ou no domínio citoplasmático, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio transmembrana ou domínio citoplasmático. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado pode compreender uma sequência de polinucleotídeo ActRIla de comprimento total tal como SEQ ID NO: 4 ou 5 ou uma sequência de polinucleotídeo ActRIlb de comprimento total tal como SEQ ID NO: 18, ou uma versão parcialmente truncada de ActRIla ou ActRIIb, o dito polinucleotídeo isolado compreendendo adicionalmente um códon de término de transcrição em pelo menos seiscentos nucleotídeos antes do terminal 3’ ou posicionado de outra forma, de maneira tal que a tradução do polinucleotídeo origina um domínio extracelular opcionalmente fundido a uma porção truncada de uma ActrII de comprimento total. Uma sequência de ácido nucléico preferida para ActRIla é SEQ ID NO: 14. Os ácidos nu- cléicos aqui revelados podem ser operavelmente ligados a um promotor para expressão, e a revelação fornece células transformadas com tais polinucleotídeos recombi- nantes. Preferivelmente, a célula é uma célula de mamífero tal como uma célula CHO.
[014] Em certos aspectos, a revelação fornece métodos para preparar um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina solúvel. Um método como este pode incluir expressar quaisquer dos ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5 14, 18, ou 19) aqui revelados em uma célula adequada, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Um método como este pode compreender: a) cultivar uma célula em condições adequadas para expressão do polipeptídeo ActrII solúvel, em que a dita célula é transformada com uma construção de expressão ActrII solúvel; e b) recuperar o polipeptídeo ActrII solúvel assim expresso. Polipeptídeos ActrII solúveis podem ser recuperados como frações brutas, parcialmente purificadas ou altamente purificadas. A purificação pode ser atingida por uma série de etapas de purificação, incluindo, por exemplo, um, dois, três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de troca aniônica (por exemplo, sefarose Q), cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, fenilsefarose), cromatografia por exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica.
[015] Em certos aspectos, um antagonista de ativina-ActrII aqui revelado, tal como um polipeptídeo ActrIIa de ligação de ativina solúvel ou polipeptídeo ActrIIb de ligação de ativina solúvel, pode ser usado em um método para promover a produção de célula vermelha do sangue ou aumentar os níveis de células vermelhas do sangue em um sujeito. Em certas modalidades, a revelação fornece métodos para tratar um distúrbio associado a baixas contagens de célula vermelha no sangue ou a baixos níveis de hemoglobina (por exemplo, uma anemia), ou para promover a produção de célula vermelha do sangue em pacientes que necessitam desta. Um método pode compreender administrar a um sujeito que necessita deste, uma quantidade efetiva de antagonista de ativina-ActrII. Em certos aspectos, a revelação fornece usos de antagonistas de ativina-actrII para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou condição da maneira aqui descrita.
[016] Em certos aspectos, a revelação fornece um método para identificar um agente que estimula a produção de células vermelhas do sangue. O método compreende: a) identificar um agente teste que se liga à ativina ou um domínio de ligação de elemento de ligação de um polipeptídeo ActrII; e b) avaliar o efeito do agente nos níveis de células vermelhas do sangue, hemoglobina, e/ou níveis precursores de célula vermelha do sangue (por exemplo, níveis de reticulócito).
Descrição resumida dos desenhos
[017] A figura 1 mostra a purificação de ActRIIa-hFc expressa em células CHO. A proteína purifica as um pico bem definido único, visualizado por coluna de classificação por tamanho (painel esquerdo) e SDS-PAGE corada com Coomassie (painel direito) (raia esquerda: padrões de peso molecular; raia direito: ActRIIa-hFc).
[018] A figura 2 mostra a ligação de ActRIIa-hFc à ativina e GDF-11, medida por ensaio BiaCoreTM
[019] A figura 3 mostra os efeitos de ActRIIa-hFc nas contagens de célula vermelha do sangue em primatas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos fêmeas (quatro grupos de cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIIa-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 3A mostra contagens de célula vermelha do sangue (RBC). A figura 3B mostra níveis de hemoglobina. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo de tratamento. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
[020] A figura 4 mostra os efeitos de ActRIIa-hFc nas contagens de célula vermelha do sangue em primatas não humanos machos. Macacos cinomolgos machos (quatro grupos de cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIIa-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 4A mostra contagens de célula vermelha do sangue (RBC). A figura 4B mostra níveis de hemoglobina. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo de tratamento. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
[021] Figura 5 mostra os efeitos de ActRIIa-hFc nas contagens de reticulócito em primatas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos (quatro grupos de cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de ActRIIa-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 5A mostra contagens absolutas de reticulócito. A figura 5B mostra a porcentagem de reticulócitos com relação a RBCs. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
[022] A figura 6 mostra os efeitos de ActRIla-hFc nas contagens de reticulócito em primatas não humanos fêmeas. Macacos cinomolgos (quatro grupos de cinco macacos cada) foram tratados com placebo ou 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg de Ac- tRIIa-hFc no dia 0, dia 7, dia 14 e dia 21. A figura 6A mostra contagens absolutas de reticulócito. A figura 6B mostra a porcentagem de reticulócitos com relação a RBCs. A significância estatística está relacionada a linha de base para cada grupo. No dia 57, dois macacos permaneceram em cada grupo.
[023] A figura 7 mostra resultados do experimento clínico humano descrito no exemplo 5, onde a área sob a curva (AUC) e dose administrada de ActRIIa-hFc têm uma correlação linear, indiferentemente se ActRIIa-hFc foi administrado intravenosamente (IV) ou subcutaneamente (SC).
[024] A figura 8 mostra uma comparação de níveis séricos de ActRIIa-hFc em pacientes administrados IV ou SC.
[025] A figura 9 mostra níveis de fosfatase alcalina óssea (BAP) em resposta a diferentes níveis de dose de ActRIIa-hFc. BAP é um marcador para crescimento ósseo anabólico.
[026] A figura 10 representa a mudança mediana da linha de base de níveis de hematócrito do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIIa-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
[027] A figura 11 representa a mudança mediana da linha de base de níveis de hemoglobina do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIIa-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
[028] A figura 12 representa a mudança mediana da linha de base da contagem de RBC (célula vermelha do sangue) do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIIa-hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
[029] A figura 13 representa a mudança mediana da linha de base da contagem de reticulócito do experimento clínico humano descrito no exemplo 5. ActRIIa- hFc foi administrada intravenosamente (IV) na dosagem indicada.
Descrição detalhada da invenção 1. .Aspectos gerais
[030] A superfamília de fator de crescimento transformador (TGF-beta) contém uma variedade de fatores de crescimento que compartilham elementos de sequência e motivos estruturais comuns. Sabe-se que estas proteínas mostram efeitos biológicos em uma grande variedade de tipos celulares tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Membros da superfamília realizam importantes funções durante o desenvolvimento embrionário na formação padrão e especificação de tecido e podem influenciar uma variedade de processos de diferenciação, incluindo adipogênese, mi- ogênese, condrogênese, cardiogênese, hematopoiese, neurogênese e diferenciação celular epitelial. A família é dividida em duas ramificações gerais: as ramificações BMP/GDF e TGF-beta/Ativina/BMP10, cujos membros têm efeitos complementares frequentemente diversos. Manipulando a atividade de um membro da família TGF- beta, é frequentemente possível causar mudanças fisiológicas significativas em um organismo. Por exemplo, as criações de gado Piedmontese e Belgian Blue carregam uma mutação perda-de-função no gene GDF8 (também chamado miostatina) que causa um aumento acentuado na massa muscular. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Além disso, em humanos, alelos inativos de GDF8 estão associados com maior massa muscular e, reportadamente, força excepcional. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
[031] Ativinas são fatores de crescimento de polipeptídeo dimérico que pertencem à superfamília TGF-beta. Existem três formas de ativina principais (A, B, e AB) que são homo/heterodímeros de duas subunidades β estreitamente relacionadas (βA βA, βB βB, e βA βB, respectivamente). O genoma humano também codifica uma ativina C e uma ativina E, que são principalmente expressas no fígado, e formas heterodimé- ricas contendo βc ou βE também são conhecidas. Na superfamília TGF-beta, ativinas são fatores exclusivos e multifuncionais que podem estimular a produção de hormônio em células ovarianas e placentárias, auxiliar na sobrevivência da célula neuronal, influenciar positiva ou negativamente o progresso do ciclo celular dependendo do tipo celular e induzir diferenciação mesodérmica pelo menos em embriões de anfíbios (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). Além disso, observa-se que o fator de diferenciação eritróide (EDF) isolado das células leucêmicas monocíti- cas humanas estimuladas é idêntico a ativina A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Sugere-se que ativina A promove eritropoiese na medula óssea. Em diversos tecidos, a sinalização de ativina é antagonizada por seu heterodímero relacionado, inibina. Por exemplo, durante a liberação do hormônio folículo estimulante (FSH) a partir da pituitária, ativina promove a secreção e síntese de FSH, enquanto a inibina previne a secreção e síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade de ativina e/ou se ligar à ativina incluem folistatina (FS), proteína relacionada a folistatina (FSRP) e α2-macroglobulina.
[032] Os sinais de TGF-β são mediados por complexos heterodiméricos de receptores de quinase serina/treonina tipo I e tipo II, que fosforilam e ativam proteínas Smad à jusante mediante estímulo de elemento de ligação (Massague, 2000, Nat. Rev. MoI. Cell Biol. 1 :169-178). Estes receptores tipo I e tipo II são proteínas trans- membranas compostas de um domínio extracelular de ligação de elemento de ligação com região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com especificidade serina/treonina predita. Os receptores tipo I são essenciais para sinalização; e receptores tipo II são exigidos para ligar elementos de ligação e para expressão de receptores tipo I. Os receptores de ativina tipo I e II formam um complexo estável após a ligação do elemento de ligação, resultando na fosforilação de receptores tipo I por receptores tipo II.
[033] Dois receptores tipo II relacionados (ActrII), ActRIIa e ActRIIb, foram identificados como os receptores tipo II para ativinas (Mathews e Vale, 1991 , Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, ActRIIa e ActRIIb podem interagir bioquimicamente com diversas outras proteínas da família TGF- β, incluindo BMP7, Nodal, GDF8, e GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee e McPherron, 2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-931 1 ; Yeo e Whitman, 2001 , MoI. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 é o principal receptor tipo I para ativinas, particularmente para ativina A, e ALK-7 pode servir como um receptor para ativinas igualmente, particularmente para ativina B.
[034] Da maneira aqui demonstrada, um peptídeo ActrIIa solúvel (sActRIIa), que mostra substancial preferência na ligação a ativina A, ao contrário de outros membros da família TGF-beta, tal como GDF8 ou GDF11, é efetivo para aumentar os níveis de células vermelhas do sangue in vivo. Embora sem querer ficar preso a nenhum mecanismo particular, espera-se que o efeito de sActRIIa seja causado principalmente por um efeito antagonista de ativina, dando a ligação de ativina muito forte (constante de dissociação picomolar) exibida pelo construção sActRIIa particular usados nestes estudos. Independente do mecanismo, é aparente a partir desta revelação que antagonistas de ActRIIa de ativina aumentam os níveis de células vermelhas do sangue em roedores, macacos e humanos. Deve-se notar que a hematopoiese é um processo complexo, regulado por uma variedade de fatores, incluindo eritropoietina, G-CSF e homeostase do ferro. Os termos "aumentar dos níveis de células vermelhas do sangue" e "promover a formação de célula vermelha do sangue" referem-se a métricas clinicamente observáveis, tais como hematócrito, contagens de célula vermelha do sangue e medições de hemoglobina, e pretende-se que sejam neutros ao mecanismo pelo qual tais mudanças podem ocorrer.
[035] Da maneira aqui também demonstrada, um polipeptídeo ActrIIb solúvel (sActRIIb) é efetivo em aumentar os níveis de reticulócito in vivo, um efeito que, por um período de tempo maior, espera-se que cause maiores níveis de hemotócrito.
[036] Os dados aqui relatados com relação a primatas não humanos são reproduzíveis igualmente em camundongos, ratos e humanos e, portanto, esta revelação fornece métodos para usar polipeptídeos ActrII e outros antagonistas de ativina- actrII para promover a produção de célula vermelha do sangue e aumentar os níveis de células vermelhas do sangue em mamíferos que variam de roedores a humanos. Antagonistas de ativina-actrII incluem, por exemplo, polipeptídeos ActRIIa solúveis de ligação de ativina, polipeptídeos ActRIIb solúveis de ligação de ativina, anticorpos que se ligam a ativina (particularmente as subunidades A e B de ativina, também referidos como βA ou βB) e rompem a ligação de ActRIIa e/ou ActRIIb, anticorpos que se ligam a ActRIIa e rompem a ligação de ativina, anticorpos que se ligam a ActRIIb e rompem a ligação de ativina, proteínas não anticorpo selecionadas para ligação de ativina, ActRIIb ou ActRIIa (ver, por exemplo, WO/2002/088171, WO/2006/055689, e WO/2002/032925 para exemplos de tais proteínas e métodos para projetar e seleção das mesmas), peptídeos randomizados selecionados para ligação de ativina, ActRIIb, ou ActRIIa, frequentemente fixados em um domínio Fc. Duas proteínas diferentes (ou outras frações) com atividade de ligação de ativina, ActRIIb, ou ActRIIa, especialmente ligadores de ativina que bloqueiam os sítios de ligação tipo 1 (por exemplo, um receptor de ativina tipo I solúvel) e tipo II (por exemplo, um receptor de ativina tipo II solúvel), respectivamente, podem ser ligadas uma na outra para criar uma molécula de ligação bifuncional. Aptâmeros de ácido nucléico, moléculas pequenas e outros agentes que inibem o eixo de sinalização ativina-ActrII são incluídos como antagonistas de ativina-actrII. Várias proteínas têm atividade antagonista de ativina-ActrII, incluindo inibina (isto é, subunidade alfa inibina), embora inibina não antagonize universalmente ativina em todos os tecidos, folistatina (por exemplo, folistatina-288 e folistatina- 315), FSRP, ativina C, alfa(2)-macroglobulina e uma ativina A mutante M108A (mudança de metionina para alanina na posição 108). Em geral, formas alternativas de ativina, particularmente aquelas com alterações no domínio de ligação do receptor tipo I, podem se ligar a receptores tipo II e não conseguem formar um complexo ternário ativo, agindo assim como antagonistas. Adicionalmente, ácidos nucléicos, tais como moléculas antissentido, RNAsis ou ribozimas que inibem ativina A, B, C ou E, ou, particularmente, a expressão de ActRIIa ou ActRIIb, podem ser usados como antagonistas de ativina-actrII. Os antagonistas de ativina-ActrII a serem usados podem exibir a seletividade para inibir a sinalização mediada por ativina versus outros membros da família TGF-beta e, particularmente, com relação a GDF8 e GDF11.
[037] Em geral, os termos usados nesta especificação têm seus significados usuais na técnica, no contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos são discutidos a seguir ou em outra parte na especificação, para fornecer orientação adicional ao profissional em descrever as composições e métodos da invenção e como preparar e usá-las. O escopo ou significado de qualquer uso de um termo será aparente a partir do contexto específico no qual o termo é usado.
[038] "Cerca de" e "aproximadamente", em geral, devem significar um grau de erro aceitável para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus de erro exemplares estão em 20 porcento (%), preferivelmente em 10%, e mais preferivelmente em 5% de um valor dado ou faixa de valores.
[039] Alternativamente e particularmente, em sistemas biológicos, os termos "cerca de" e "aproximadamente" podem significar valores que estão em uma ordem de magnitude, preferivelmente em 5 vezes e, mais preferivelmente, em 2 vezes de um valor dado. Quantidades numéricas aqui fornecidas são próximas, a menos que de outra forma declarada, significando que o termo "cerca de" ou "aproximadamente" podem ser inferidos quando não expressamente declarados.
[040] Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar sequências umas com as outras, incluindo sequência tipo selvagem para um ou mais mutantes (variantes de sequência). Tais comparações compreendem tipicamente alinhamentos de sequências de polímero, por exemplo, usando programas e/ou algoritmos de alinhamento de sequência que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar alguns). Os versados na técnica percebem facilmente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o alinhamento de sequência introduzirá uma "folga" (tipicamente representada um hífen, ou "A") na sequência de polímero que não contém o resíduo inserto ou deletado.
[041] "Homólogo", em todas as suas formas gramaticais e variações de ortografia, refere-se ao relacionamento entre duas proteínas que possuem uma "origem evolucionária comum," incluindo proteínas das superfamílias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas de espécie diferente de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucléicos que codificam) têm homologia de sequência refletida por sua similaridade de sequência, quer em termos de identidade percentual ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas.
[042] O termo "similaridade de sequência", em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre as sequências de ácido nucléico ou aminoácidos que podem ou não compartilhar uma origem evolucionária comum.
[043] Entretanto, no uso comum e na aplicação imediata, o termo "homólogo", quando modificado com um advérbio tal como "altamente", pode referir-se a similaridade de sequência e pode ou não estar relacionado a uma origem evolucionária comum.
2. Polipeptídeos ActrII
[044] Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos ActrII. Da maneira aqui usada, a palavra "ActrII" refere-se à família de receptores de ativina tipo II. Esta família inclui tanto o receptor de ativina tipo IIa quanto o receptor de ativina tipo IIb.
[045] Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos ActRIIa. Da maneira aqui usada, a palavra "ActRIIa" refere-se a uma família de proteínas do receptor de ativina tipo IIa (ActRIIa) de quaisquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIa por mutagênese ou outra modificação. Entende-se aqui que a referência ActRIIa é uma referência a qualquer uma das formas identificadas atualmente. Membros da família ActRIIa são em geral proteínas transmembranas, compostas de um domínio extracelular de ligação de elemento de ligação com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com atividade quinase serina/treonina predita.
[046] O termo "polipeptídeo ActRIIa" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família ActrIIa, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que mantêm uma atividade útil. Ver, por exemplo, WO/2006/012627. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIa incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer ActRIIa conhecida com uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo ActRIIa e, opcionalmente, pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo ActrIIa da invenção pode se ligar e inibir a função de uma proteína ActrIIa e/ou ativina. Um polipeptídeo ActRIIa pode ser selecionado pela atividade em promover formação de célula vermelha do sangue in vivo. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa incluem polipeptídeo precursor de ActRIIa humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeos ActRIIa humanos solúveis (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 12).
[047] A sequência de proteína precursora de ActRIIa humana é da maneira a seguir: MGAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEP CYGDKDKRRHCFATWKgISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSP EVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPL MLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLE VKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHEN ILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAE TMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGL ALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGL VLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVL RDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIIT TEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL (SEQ ID NO: 1)
[048] O peptídeo de sinal está sublinhado em linha única; o domínio extracelular está em negrito e os sítios de glicosilação potenciais ligados a N estão sublinhados em linha dupla.
[049] A sequência de polipeptídeo processado solúvel ActRIIa humano (extracelular) é da maneira a seguir: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
[050] O terminal C "cauda" do domínio extracelular está sublinhado. A sequência com a "cauda" deletada (uma sequência Δ15) é da maneira a seguir: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EM (SEQ ID NO:3)
[051] A sequência de ácido nucléico que codifica proteína precursora de ActRIIa humana é da maneira a seguir (nucleotídeos 164-1705 de acesso ao Genbak NM_001616): ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTT CTTCAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTT TAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCG TGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGA ATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGA TATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCT GAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTT CTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTAC ACCTAAGCCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTT ATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGGCATC ACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGACCCAGGACC ACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAGTTATTAGAA GTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAAGCCCAGTTGCTTA ACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACAAACAGTCATG GCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCATGAGAAC ATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGATGTGG ATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACTT TCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAA ACCATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAA AAGATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAA TGTGCTGTTGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTG GCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGG TTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAA CTTCCAAAGGGATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTA GTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAG ATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCT TGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTA AGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCA TTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATG TGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTATTACC ACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTC CTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO: 4)
[052] A sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo solúvel ActRIIa (extracelular) é da maneira a seguir: ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATT GGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGA CAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGT TCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCT ATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTT TTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCA GAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCAC CC (SEQ ID NO: 5)
[053] Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos ActRIIb. Da maneira aqui usada, a palavra "ActRIIb" refere-se a uma família de proteínas do receptor de ativina tipo IIb (ActRIIb) de quaisquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIb por mutagênese ou outra modificação. Entende-se aqui que a referência a ActRIIb é uma referência a qualquer uma das formas identificadas atualmente. Em geral, membros da família ActRIIb são proteínas transmembranas, compostas de um domínio extracelular de ligação de elemento de ligação com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático com atividade quinase serina/treonina predita.O termo "polipeptídeo ActRIIb" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo de ocorrência natural de um membro da família ActrIIb, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que mantêm uma atividade útil. Ver, por exemplo, WO/2006/012627. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIb incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer ActRIIb conhecida com uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo ActRIIb e, opcionalmente, pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo ActrIIb da invenção pode se ligar e inibir a função de uma proteína ActrIIb e/ou ativina. Um polipeptídeo ActRIIb pode ser selecionado pela atividade em promover a formação de célula vermelha do sangue in vivo. Exemplos de polipeptídeos ActRIIb incluem precursor de polipeptídeo ActRIIb humano (SEQ ID NO: 15) e polipeptídeos ActRIIb solúveis humanos (por exemplo, SEQ ID NO: 16, 17, 20, e 21).
[054 A sequência de proteína precursora ActRIIb humana é da maneira a se- MTAPWVALALLWGSLWPGSGRGEAETRECIYYNANWELERT|N|QSGLERC EGEQDKRLHCYASWAgsSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQ VYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAY S LL PIG GLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIK ARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLL QFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETM SRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLA VRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLV LWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIK DHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTS . DCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO: 15) guir:
[055] O peptídeo de sinal está sublinhado por uma única linha; o domínio extracelular está em negrito e os sítios de glicosilação potenciais ligados a N estão em caixas.
[056] A sequência de polipeptídeo processado (extracelular) solúvel ActRIIb humana é da maneira a seguir: SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSS GTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHL PEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID NO: 16)
[057] O terminal C "cauda" do domínio extracelular está sublinhado. A sequência com a “cauda” deletada (uma sequência Δ15) é da maneira a seguir: SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSS GTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHL PEA (SEQ ID NO: 17)
[058] A sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína precursora ActRIIb humana é da maneira a seguir: (nucleotídeos 5-1543 de acesso ao Genbak NM_001 106) ATGACGGCGCCCTGGGTGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGGC CCGGCTCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAA CGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGC GAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACA GCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTT CAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAG GTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTC ATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGG7XAGTCACGTACGAGCCACCCCCGAC AGCCCCCACCCTGCTCACGGTGCTGGCCTACTCACTGCTGCCCATCGGG GGCCTTTCCCTCATCGTCCTGCTGGCCTTTTGGATGTACCGGCATCGCA AGCCCCCCTACGGTCATGTGGACATCCATGAGGACCCTGGGCCTCCACC ACCATCCCCTCTGGTGGGCCTGAAGCCACTGCAGCTGCTGGAGATCAAG GCTCGGGGGCGCTTTGGCTGTGTCTGGAAGGCCCAGCTCATGAATGACT TTGTAGCTGTCAAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAG TGAACGGGAGATCTTCAGCACACCTGGCATGAAGCACGAGAACCTGCTA CAGTTCATTGCTGCCGAGAAGCGAGGCTCCAACCTCGAAGTAGAGCTGT GGCTCATCACGGCCTTCCATGACAAGGGCTCCCTCACGGATTACCTCAA GGGGAACATCATCACATGGAACGAACTGTGTCATGTAGCAGAGACGATG TCACGAGGCCTCTCATACCTGCATGAGGATGTGCCCTGGTGCCGTGGCG AGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACTTTAAAAGTAAGAATGT ATTGCTGAAGAGCGACCTCACAGCCGTGCTGGCTGACTTTGGCTTGGCT GTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGACACCCACGGACAGGTAG GCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACTT CCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTG CTGTGGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATG AGTACATGCTGCCCTTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGA GGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCACAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAA GATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTTTGTGTGACCATCG AGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGCTGTGT GGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCG GACTGTCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCC CTAAAGAGTCAAGCATCTAA (SEQ ID NO: 18)
[059] A sequência de ácido nucléico que codifica um peptídeo (extracelular) ActRIIa solúvel é da maneira a sejuir: TCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCA ACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGG ICGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACAGCTCT GGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTTCAACT GCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAGGTGTA CTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTCATTTG CCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCC CCACC (SEQ ID NO: 19)
[060] Em uma modalidade específica, a invenção diz respeito a polipeptídeos ActrII solúveis. Da maneira aqui descrita, o termo "polipeptídeo ActrII solúvel" refere- se em geral a polipeptídeos compreendendo um domínio extracelular de uma proteína ActrIIa ou ActRIIb. O termo "polipeptídeo ActrII solúvel", da maneira aqui usada, inclui qualquer domínio extracelular de ocorrência natural de uma proteína ActrIIa ou ActRIIb, bem como quaisquer variantes deste (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas). Um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina é um que mantém a capacidades de se ligar a ativina, incluindo, por exemplo, ativina AA, AB, BB, ou formas que incluem uma subunidade C ou E. Opcionalmente, um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina se ligará a ativina AA com uma constante de dissociação de 1 nM ou menos. Em geral, o domínio extracelular de uma proteína ActrII que se liga a ativina é solúvel e, pode assim, ser denominado um polipeptídeo ActrII de ligação de ativina solúvel. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa de ligação de ativina solúveis incluem os polipeptídeos solúveis ilustrados em SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. SEQ ID NO:7 é referida como ActRIIa-hFc e é descrita adicionalmente nos exemplos. Outros exemplos de polipeptídeos ActRIIa de ligação de ativina solúveis compreendem um sequência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActRlIa, por exemplo, a sequência líder melitina de mel de abelha (SEQ ID NO: 8), a líder ativador de plasmi- nogênio tecidual (TPA) (SEQ ID NO: 9) ou a líder ActRIIa nativa (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActRIIa-hFc ilustrado em SEQ ID NO: 13 usa um líder TPA. Exemplos de polipeptídeos ActRIIb de ligação de ativina solúveis incluem os polipeptídeos solúveis ilustrados em SEQ ID NOs: 16, 17, 20. Os polipeptídeos ActRIIb de ligação de ativina podem t. compreender uma sequência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActrIIb, por exemplo, a sequência líder melitina de mel de abelha (SEQ ID NO: 8) ou líder ativador de plasminogênio tecidual (TPA) (SEQ ID NO: 9).
[061] Fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos ActrII podem ser obtidos triando polipeptídeos produzidos recombinantemente a partir do fragmento correspondente do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ActrII. Além do mais, os fragmentos podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas conhecidas na tecnologia tal como química f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Os fragmentos podem ser produzidos (recombinantemente ou por síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos de peptidila que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActrII ou sinalização mediada por ativina.
[062] Variantes funcionalmente ativos de polipeptídeos ActrII podem ser obtidos triando bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidos recombinantemente a partir de ácidos nucléicos mutagenizados correspondentes que codificam um polipeptídeo ActrII. As variantes podem ser produzidos e testados para identificar aqueles que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActrII ou sinalização mediada por ativina. Em certas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIIa compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certos casos, a variante funcional tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIIb compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 17. Em certos casos, a variante funcional tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 17 ou 18. Variantes funcionais podem ser produzidas modificando a estrutura de um polipeptídeo ActrII com tais propósitos como melhorar a eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vida em prateleira ex vivo e resistência a degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos ActrII modificados, quando selecionados para manter a ligação de ativina, são considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos ActrII de ocorrência natural. Polipeptídeos ActrII modificados também podem ser produzidos, por exemplo, por substituição, de- leção ou adição de aminoácido. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um gluta- mato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservati- vas) não terão um efeito importante na atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem em uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Pode-se determinar facilmente se uma mudança na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ActrII resulta em um homólogo funcional avaliando a capacidade da variante de polipeptídeo ActrII produzir uma resposta em células de uma maneira similar ao polipeptídeo ActrII tipo selvagem.
[063] Em certas modalidades, a presente invenção contempla mutações específicas dos polipeptídeos ActrII de maneira a alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem ser selecionadas de maneira a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tais como sítios de glicosilação ligados a O ou ligados a N. Os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina compreendem em geral uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina ou asparagina-X-se- rina (onde "X" é qualquer aminoácido) que é reconhecida especificamente por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração também pode ser realizada pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do polipeptídeo ActrII tipo selvagem (para sítios de glicosilação ligados a O). Uma variedade de substituições de aminoácidos ou deleções de uma ou ambas da primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção de aminoácido na segunda posição) resulta em não glicosilação na sequência de tripeptídeo modificada. Um outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato em um polipeptídeo ActrII é por acoplamento químico ou enzimático de glico- sídeos no polipeptídeo ActrII. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açú- car(s) pode(m) ser anexado a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfidrila livres tal como aquele de cisteína; (d) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. A remoção de uma ou mais frações de carboidrato presente em um polipeptídeo ActrII pode ser realizada química e/ou enzimaticamente. A deglicosilação química pode envolver, por exemplo, exposição do polipeptídeo ActrII ao composto ácido trifluormetanossulfô- nico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, com exceção do açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando ao mesmo tempo a sequência de aminoácidos intacta. A clivagem enzimática de frações de carboidrato em polipeptídeos ActrII pode ser atingida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases descritas por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A sequência de um polipeptídeo Ac- trll pode ser ajustada, da maneira apropriada, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, visto que as células de mamífero, de levedura, de inseto e de planta podem todas introduzir padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela sequência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, proteínas ActrII para uso em humanos pode ser expressa em uma linhagem celular de mamífero que fornece glicosilação própria, tal como linhagens celulares HEK293 ou CHO, embora espera-se que outras linhagens celulares de expressão de mamíferos sejam igualmente usadas.
[064] Esta revelação contempla adicionalmente um método de produzir mu- tantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatórios de um polipeptídeo ActrII, bem como mutantes truncados; reuniões de mutantes combinatórios são especialmente usadas para identificar sequências de variante funcional. O propósito de triar tais bibliotecas combinatórias pode ser para produzir, por exemplo, variantes de polipeptídeo ActrII que se ligam a ativina ou outros elementos de ligação. Uma variedade de ensaios de triagem é fornecida a seguir, e tais ensaios podem ser usados para avaliar variantes. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo ActrII pode ser triado pela capacidade de se ligar a um elemento de ligação de ActrII, prevenir a ligação de um elemento de ligação ActrII a um polipeptídeo ActrII ou interferir na sinalização causada por um elemento de ligação ActrII.
[065] A atividade de um polipeptídeo ActrII ou suas variantes também pode ser testada em um ensaio com base em células ou in vivo. Por exemplo, o efeito de uma variante de polipeptídeo ActrII na expressão de genes envolvidos na hematopoi- ese pode ser avaliado. Da maneira necessária, isto pode ser realizado na presença de uma ou mais proteínas de elemento de ligação de ActrII recombinante (por exemplo, ativina), e as células podem ser transfectadas de maneira a produzir um polipeptídeo ActrII e/ou variantes deste e, opcionalmente, um elemento de ligação ActrII. Similarmente, um polipeptídeo ActrII pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais medições sanguíneas, tais como uma contagem de RBC, hemoglobina, ou contagem de reticulócito podem ser avaliadas.
[066] Podem ser produzidas variantes combinatoriamente derivadas que têm uma potência seletiva ou em geral maior com relação a um polipeptídeo ActrII de ocorrência natural. Similarmente, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm meias-vidas intracelulares muito diferentes daquelas que correspondem a um polipeptídeo ActrII tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode tornar-se tanto mais estável quanto menos estável a degradação proteolítica ou outros processos celulares que resultam na destruição ou, de outra forma, na inativação de um polipeptídeo ActrII nativo. Tais variantes, e os genes que os codificam, podem ser utilizados para alterar níveis de polipeptídeo ActrII modulando a meia-vida dos polipeptídeos ActrII. Por exemplo, uma meia-vida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transientes e, quando parte de um sistema de expressão indutível, pode permitir controle mais rigoroso dos níveis de polipeptídeo ActrII na célula. Em uma proteína de fusão Fc, as mutações podem ser realizadas no ligante (se houver) e/ou na porção Fc para alterar a meia-vida da proteína.
[067] Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca degenerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos, em que cada qual inclui pelo menos uma porção de sequências de polipeptídeo ActrII potenciais. Por exemplo, uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos pode ser enzimatica- mente ligada nas sequências de genes, de maneira tal que o conjunto degenerado de sequências de nucleotídeo de polipeptídeo ActrII potenciais sejam expressos como polipeptídeos individuais ou, alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fago).
[068] Existem muitas maneiras pelas quais a biblioteca de homólogos potenciais pode ser produzida a partir de uma sequência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma sequência de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA automático, e os genes sintéticos podem a seguir ser ligados em um vetor apropriado para expressão. A síntese de oligonucleotídeos degenerados é bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic acid Res. 1 1 All). Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outras proteínas (ver, por exemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al.,(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; bem como patente U.S. 5.223.409, 5.198.346 e 5.096.815).
[069] Alternativamente, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para produzir uma biblioteca combinatória. Por exemplo, variantes de polipeptídeo ActrII podem ser produzidos e isolados de uma biblioteca triando pelo uso, por exemplo, mutagênese de varredura de alanina e similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-1 18; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597- 601; Na- gashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; e Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mu-tagênese de varredura de ligante (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) MoI. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagênese de saturação (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagênese por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell MoI Biol 1 : 1 1-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; e Greener et al., (1994) Strategies in MoI Biol 7:32-34). A mutagênese de varredura de ligante, particularmente em um ajuste combinatório, é um método atrativo para identificar formas truncadas (bioativa) de polipeptídeos ActrII.
[070] Uma ampla faixa de técnicas é conhecida na técnica para triar produtos genéticos de bibliotecas combinatórias feitas por mutações pontuais e truncações e, no que diz respeito ao assunto, para triar bibliotecas de DNAc para produtos de gene com uma certa propriedade. Tais técnicas serão em geral adaptáveis para triagem rápida das bibliotecas genéticas produzidas pela mutagênese combinatória de polipeptídeos ActrII. As técnicas mais amplamente usadas para triar grandes bibliotecas genéticas compreendem tipicamente clonar a biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, transformar células apropriadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressar os genes combinatórios em condições nas quais a detecção de uma atividade desejada favorece o isolamento relativamente fácil do vetor que codifica o gene cujo produto foi deletado. Ensaios preferidos incluem ensaios de ligação de ativina e ensaios de sinalização celular mediados por ativina.
[071] Em certas modalidades, os polipeptídeos ActrII da invenção podem compreender adicionalmente modificações pós-translacionais além de quaisquer que estejam naturalmente presente nos polipeptídeos ActrII. Tais modificações incluem, mas sem limitações, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Em função disso, os polipeptídeos ActrII modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipídeos, poli- ou mono- sacarídeo e fosfatos. Efeitos de tais elementos não aminoácidos na funcionalidade de um polipeptídeo ActrII podem ser testados da maneira aqui descrita para outras variantes de polipeptídeo ActrII. Quando um polipeptídeo ActrII é produzido nas células clivando uma forma nascente do polipeptídeo ActrII, o processamento pós-translacional também pode ser importante para dobramento e/ou função corretos da proteína. Diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ou HEK293) têm ma- quinário celular e mecanismos característicos específicos para tais atividades pós- translacionais e podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos dos polipeptídeos ActrII.
[072] Em certos aspectos, variantes funcionais ou formas modificadas dos polipeptídeos ActrII incluem proteínas de fusão com pelo menos uma porção dos polipeptídeos ActrII e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas sem limitações, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação da maltose (MBP) ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente usados para isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Com o propósito de purificação da afinidade, matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas com glutationa, amilase, e níquel ou cobalto são usadas. Muitas das tais matrizes estão disponíveis na forma de "estojo", tais como o sistema de purificação de GST da Pharmacia e o sistema QIAexpress™ (Qiagen) usado com sócios de fusão (HIS6). Como um outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a facilitar a detecção dos polipeptídeos ActrII. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) bem como "marcadores de epítopos," que são usualmente sequências pequenas de peptídeo sequências para as quais um anticorpo específico está disponível. Marcadores de epítopos bem conhecidos, para os quais anticorpos monoclonais específicos estão facilmente disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e marcadores c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem de protease, tal como para Fator Xa ou Trombina, que permite a protease relevante digerir parcialmente as proteínas de fusão e liberar por meio disto as proteínas recombinantes daí. As proteínas liberadas podem ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em certas modalidades preferidas, um polipeptídeo ActrII é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActrII in vivo (um domínio “estabilizador”). “Estabilizando" significa qualquer coisa que aumente a meia-vida sérica, independendo se isto é em decorrência da menor destruição, menor desobstrução pelo rim, ou outro efeito farmacocinético. Sabe-se que fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina conferem propriedades farmacocinéti- cas desejáveis em uma ampla faixa de proteínas. Similarmente, fusões a albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetramerização) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tal como estímulo adicional de crescimento muscular).
[073] Como um exemplo específico, a presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIIa fundido a um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 6. THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG PFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
[074] Como um exemplo específico adicional, a presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIIb fundido a um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 21). SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLD IDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[075] Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações em resíduos tais como Asp-265, lisina 322 e Asn-434. Em certos casos, o domínio Fc mutante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asp-265) reduziu a capacidade de se ligar ao receptor FCY com relação a um domínio Fc tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante com uma ou mais destas mutações (por exemplo, mutação Asn-434) aumentou a capacidade de se ligar ao receptor Fc relacionado a MHC classe I (FcRN) com relação ao domínio Fc tipo selvagem.
[076] Entende-se que diferentes elementos das proteínas de fusão podem estar arranjados de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo ActrII pode ser colocado no terminal C de um domínio heterólogo, ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C de um polipeptídeo ActrII. O domínio de polipeptídeo ActrII e o domínio heterólogo não precisam ser adjacentes em uma proteína de fusão, e domínios adicionais ou sequências de aminoácidos podem estar incluídos nos terminais C ou N tanto no domínio quanto entre os domínios.
[077] Em certas modalidades, os polipeptídeos ActrII da presente invenção contém uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActrII. Por exemplo, tais modificações melhoram a meia-vida in vitro dos polipeptídeos ActrII, melhoram a meia-vida circulatória dos polipeptídeos ActrII ou diminuem a degradação proteolítica dos polipeptídeos ActrII. Tais modificações de estabilização incluem, mas sem limitações, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo ActrII e um domínio estabilizador), modificações de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glico- silação a um polipeptídeo ActrII), e modificações de fração de carboidrato (incluindo, por exemplo, remoção de frações de carboidrato de um polipeptídeo ActrII). Da maneira aqui usada, o termo "domínio estabilizador" não se refere apenas a um domínio de fusão (por exemplo, Fc) como no caso de proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceas tal como uma fração de carboidrato, ou fração não proteinácea, tal como polietileno glicol.
[078] Em certas modalidades, a presente invenção disponibiliza formas isoladas e/ou purificadas dos polipeptídeos ActrII, que são isoladas ou, de outra forma, substancialmente isentas de outras proteínas. Os polipeptídeos ActrII serão em geral produzidos por expressão de ácidos nucléicos recombinantes.
3. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos ActRII
[079] Em certos aspectos, a invenção diz respeito a ácidos nucléicos isolados e/ou recombinantes que codificam quaisquer dos polipeptídeos ActRII (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa solúveis e polipeptídeos ActRIIb solúveis), incluindo fragmentos, variantes e proteínas de fusão funcionais aqui revelados. Por exemplo, SEQ ID NO: 4 codifica os polipeptídeos precursores de ActRIIa humano de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular de ActRIIa processado. Por exemplo, SEQ ID NO: 18 codifica os polipeptídeos precursores de ActRIIb humano de ocorrência natural, enquanto SEQ ID NO: 19 codifica o domínio extracelular de ActRIIb processado. Os ácidos nucléicos em questão podem ser de fita única ou de fita dupla. Tais ácidos nucléicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para preparar polipeptídeos ActRII ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, na abordagem de terapia genética).
[080] Em certos aspectos, entende-se adicionalmente que os ácidos nucléicos em questão que codificam polipeptídeos ActRIIa incluem ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. Em certos aspectos, entende-se adicionalmente que os ácidos nucléicos em questão que codificam polipeptídeos ActRIIb incluem ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 18 ou 19. Sequências de nucleotídeo variantes incluem sequências que diferem por uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções, tais como variantes alélicas.
[081] Em certas modalidades, a invenção diz respeito a sequências de ácido nucléico isoladas ou recombinantes que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênticas a SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19. Versados na tecnologia perceberão que as sequências de ácido nucléico complementares para SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, e as variantes de SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19 estão também no escopo desta invenção. Em modalidades adicionais, as sequências de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas, recombinante, e/ou fundidas com uma sequência de nucleotídeo heteróloga, ou em uma biblioteca de DNA.
[082] Em outras modalidades, ácidos nucléicos da invenção também incluem sequências de nucleotídeo que hibridizam em condições de alto rigor para a sequência de nucleotídeo designada em SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, sequência de complemento de SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19, ou fragmentos destas. Da maneira discutida anteriormente, versados na tecnologia entenderão facilmente que condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA podem ser variadas. Versados na tecnologia entenderão facilmente que as condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA podem ser variadas. Por exemplo, poderia ser realizada a hibridização a 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 0C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50 °C até um alto rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50 0C. Além do mais, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de baixas condições rigorosas à temperatura ambiente, cerca de 22 °C, para altas condições rigorosas em cerca de 65 0C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou temperatura ou concentração de sal podem ser mantidos constantes enquanto a outra variável é mudada. Em uma modalidade, a invenção diz respeito a ácidos nucléicos que hibridizam em baixas condições rigorosas de 6 x SSC à temperatura ambiente seguido por uma lavagem a 2 x SSC à temperatura ambiente.
[083] Ácidos nucléicos isolados que diferem dos ácidos nucléicos da maneira apresentada em SEQ ID NOs: 4, 5, 18, ou 19 em virtude da degeneração no código genético estão também no escopo da invenção. Por exemplo, inúmeros aminoácidos são projetados por mais que um triplete. Códons que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) pode resultar em mutações "silenciosa" que não afetam a sequência de aminoácidos da proteína. Entretanto, espera-se que polimorfismos de sequência de DNA que leva a mudanças na sequência de aminoácidos das proteínas em questão possam existir entre as células de mamífero. Versados na tecnologia perceberão que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5 % dos nucleotídeos) dos nucléicos que codificam uma proteína particular podem existir entre indivíduos de uma dada espécie em virtude de variação alélica natural. Todas e quaisquer variações de nucleotídeo como essas e polimorfismos de aminoácido resultantes estão no escopo desta invenção.
[084] Em certas modalidades, os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser operacionalmente ligados a uma ou mais sequências de nucleotídeo regu- latórias em uma construção de expressão. Sequências de nucleotídeo regulatórias serão geralmente apropriadas para a célula hospedeira usada para expressão. Inúmeros tipos de vetores de expressão apropriados e sequências regulatórias adequadas são conhecidos na tecnologia por uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a dita uma ou mais sequências de nucleotídeo regulatórias podem incluir, mas sem limitações, sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, sítios de ligação ribossômica, sequências de início e término transcricionais, sequências de início e término translacionais, e sequências melhoradoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou indutíveis como conhecido na tecnologia são contemplados pela invenção. Os promotores podem ser tanto promotores de ocorrência natural quanto promotores híbridos que combinam elementos de mais que um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente em uma célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na tecnologia e variarão com a célula hospedeira usada.
[085] Em certos aspectos da invenção, o ácido nucléico em questão é fornecido em um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo ActRII e operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência regulatória. As sequências regulatórias são reconhecidas na tecnologia e são se-lecionadas para direcionar expressão do polipeptídeo ActRII. Consequentemente, o termo sequência regulatória inclui promotores, melhoradores, e outros elementos de controle de expressão. Sequências regulatórias exemplares são descritas em Goe- ddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA quando operacionalmente ligada a ela pode ser usada nestes vetores para expressar sequências de DNA que codificam um polipeptídeo ActRII. Tais sequências de controle de expressão usadas incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor tet, promotor precoce imediato de adenovírus ou citomegalovírus, promotores de RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor de T7 cuja expressão é dirigida por T7 RNA polimerase, as regiões operadora e promotora principais de fago lambda, as regiões de controle para proteína revestida de fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de ácido fosfatase, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores de α-conjugação levedura, o promotor poliedro do sistema de baculovírus e outras sequências conhecidas por controlar a expressão de genes de células procarióticas e eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações destes. Deve-se entender que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejada a ser expressa. Além do mais, o número de cópia do vetor, a capacidade de controlar qual número de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como marcadores de antibiótico, podem também ser considerados.
[086] Um ácido nucléico recombinante da invenção pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma porção deste, em um vetor adequado para expressão tanto em células procarióticas, células eucarióticas (levedura, ave, inseto ou mamífero), quanto em ambas. Veículos de expressão para produção de um polipeptídeo ActRII recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tal como E. coli.
[087] Alguns vetores de expressão de mamífero contêm tanto sequências procarióticas par facilitar a propagação do vetor na bactéria, quanto uma ou mais unidades de transcrição eucariótica que são expressas nas células eucarióticas. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequados para transfecção de células eucarióticas. Alguns desses vetores são modificados com sequências dos plasmídeos bacterianos, tal como pBR322, para facilitar seleção de replicação e resistência a medicamento tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Alternativamente, derivados de vírus tais como o papiloma vírus bovino (BPV-I), ou vírus Epstein- Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para expressão transiente de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluindo retroviral) podem ser encontrados a seguir na descrição de sistemas de distribuição de terapia genética. Os vários métodos empregados na preparação dos plasmídeos e na transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na tecnologia. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto eucarióticas, bem como procedimentos recombinantes em geral, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns exemplos, pode-se desejar expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tal como pAcUWl), e vetores derivados de pBlueBac (tal como o β-gal contendo pBlueBac III).
[088] Em uma modalidade preferida, um vetor seria projetado para produção dos polipeptídeos ActRII em questão em células CHO, tal como um vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Conforme ficaria aparente, as construções genéticas em questão podem ser usadas para causar expressão dos polipeptídeos ActRII em questão em células propagadas na cultura, por exemplo, para produzir proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.
[089] Esta revelação também diz respeito a uma célula hospedeira transfec- tada com um gene recombinante incluindo uma sequência e codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4, 5, 18, ou 19) para um ou mais dos polipeptídeos ActRII em questão. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActRII da invenção pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, usando um sistema de expressão de baculovírus), levedura, ou células de mamífero. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos versados na tecnologia.
[090] Consequentemente, a presente invenção diz respeito adicionalmente a métodos de produzir os polipeptídeos ActRII em questão. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo Ac- tRlIa ou ActRIIb pode ser cultivado em condições apropriadas para permitir que ocorra expressão do polipeptídeo ActRII. O polipeptídeo ActRII pode ser secretado e isolado de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActRII. Alternativamente, o polipeptídeo ActRII pode ser retido citoplasmicamente ou em uma fração de membrana e as células colhidas, lisadas e as proteína isoladas. Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Os meios adequados para cultura celular são bem conhecidos na tecnologia.
[091] Os Polipeptídeos ActRII em questão podem ser isolados a partir do meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, usando técnicas conhecidas na tecnologia para purificar proteínas, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração de gel, ultafiltração, eletroforese, purificação de imunoafinidade com anticorpos específicos para epítopos particulares dos polipeptídeos ActRII e purificação de afinidade com um agente que liga a um domínio fundido ao polipeptídeo ActRII (por exemplo, uma coluna A de proteína pode ser usada para purificar uma fusão de ActRIIa-Fc ou ActRIIb-Fc). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ActRII é uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita sua purificação. Em uma modalidade preferida, a purificação é obtida por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia A de proteína, cromatografia de sefarose Q, fenilcromatografia de sefa- rose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca catiônica. A purificação pode ser completa com filtração viral e troca de tampão. Da maneira aqui demonstrada, proteína ActRIIa-hFc foi purificada a uma pureza de >98 % da forma determinada por cromatografia de exclusão por tamanho e >95 % da maneira deter-minada por SDS PAGE. Este nível de pureza foi suficiente para obter resultados desejáveis em camundongos, ratos e primatas não humanos.
[092] Em uma outra modalidade, um gene de fusão que codifica uma sequência líder de purificação, tal como uma sequência de sítio de clivagem poli-(His)/ente- roquinase no N-terminal da porção desejada do polipeptídeo ActRII recombinante, pode permitir a purificação da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidade usando uma resina metálica Ni2+ A sequência líder de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enteroquinase para fornecer o polipeptídeo ActRII purificado (por exemplo, ver Hochuli et al., (1987) J. Cromatografia 41 1: 177; e Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
[093] Técnicas para preparar genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA que codificam diferentes sequências de polipeptídeos é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais de ponta romba ou ponta escalonada para ligação, digestão de enzima de res-trição para fornecer terminais apropriadas, enchimento de terminais coesivos da maneira apropriada, tratamento de fosfatase alcalina para evitar junções indesejáveis, e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, amplificação de PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem subsequentemente ser anelados para gerar uma sequência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Bio-logy, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Antagonistas Alternativos de Ativina e ActRII
[094] Os dados aqui apresentados demonstram que antagonistas de sinalização de ativina-ActRII podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina. Embora polipeptídeos ActRIIa e ActRIIb solúveis, e particularmente ActRIIa-Fc e ActRIIb-Fc, sejam antagonistas preferidos, e embora tais antagonistas possam afetar os níveis de célula vermelha do sangue através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina (por exemplo, inibição de ativina pode ser um indicador da tendência de um agente para inibir as atividades de um espectro de moléculas, incluindo, talvez, outros membros da superfamília TGF-beta, e tal inibição coletiva pode levar ao efeito desejado em hematopoiese), espera-se que outros tipos de antagonistas de ativina-ActRII sejam usados, incluindo anticorpos anti-ativina (por exemplo, ativina βA, βB, βc e βE), anticorpos anti-ActRIIa, anticorpos anti-ActRIIb, an- tissentido, RNAi ou ácidos nucléicos ribozima que inibem a produção de ActRIIa e/ou ActRIIb, e outros inibidores de ativina, ActRIIb ou ActRIIa, particularmente aqueles que interrompem ligação de ativina-ActRIIa e/ou ativina-ActRIIb.
[095] Um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo ActRII (por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb solúvel) e que tanto liga competitivamente ao ligante com o polipeptídeo ActRII quanto de outra forma inibe sinalização mediada por ActRII pode ser usado como um antagonista de atividades de polipeptídeo ActRII. Similarmente, um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptídeo de ativina βA, βB, βC ou βE, ou qualquer heterodímero deste, e que interrompe a ligação de ActRIIa e/ou ActRIIb pode ser usado como um antagonista.
[096] Usando imunógenos derivado de um polipeptídeo ActRIIa, polipeptídeo ActRIIb ou um polipeptídeo ativina, antissoro anti-proteína/anti-peptídeo ou anticorpos monoclonais podem ser feitos por protocolos padrões (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tais como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com uma forma imunogênica do ativina, polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb, um fragmento antigênico que é capaz de elicitar uma resposta do anticorpo, ou uma proteína de fusão. Técnicas para conferir imunogenicidade em uma proteína ou peptídeo incluem conjugação a carreadores ou outras técnicas bem conhecidas na tecnologia. Uma porção imunogênica de um ActRII ou polipeptídeo ativina pode ser administrada na presença de adjuvante. O progresso de imunização pode ser monitorado por detecção de tituladores de anticorpo em plasma ou soro. ELISA ou outros imunoensaios padrões podem ser usados com o imunógeno como antígeno para avaliar os níveis de anticorpos.
[097] Após a imunização de um animal com uma preparação antigênica de um ativina, polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb, antissoro pode ser obtido e, se desejado, anticorpos policlonais podem ser isoladas do soro. Para produzir anticorpos monoclo- nais, células que produzem anticorpo (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas por procedimentos de fusão de célula somática padrões com células imortalizantes, tal como células de mieloma para produzir células de hibri- doma. Tais técnicas são bem conhecidas na tecnologia, e incluem, por exemplo, a técnica de hibridoma (originalmente desenvolvidas por Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), a técnica de hibridoma célula B humana (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Células de hibridoma podem ser selecionadas imu- noquimicamente para produção de anticorpos especificamente reativos com um ativina, polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb e anticorpos monoclonais isolados de uma cultura compreendendo tais células de hibridoma.
[098] O termo "anticorpo" da maneira aqui usada deve incluir anticorpos totais, por exemplo, de qualquer isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc), e inclui fragmentos ou domínios de imunoglobulinas que são reativos com um antígeno selecionado. Anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e os fragmentos selecionados para utilidade e/ou interação com um epítopo específico de interesse. Assim, o termo inclui segmentos de porções preparadas recombinantemente ou proteolitica- mente clivadas de uma molécula do anticorpo que são capazes de reagir seletivamente com uma certa proteína. Exemplos não limitantes de tais fragmentos proteolíti- cos e/ou recombinante incluem Fab, F(ab')2, Fab' , Fv, e anticorpos de cadeia única (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] unido por um ligante peptídeo. Os scFv's podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados para formar anticorpos tendo dois ou mais sítios de ligação. O termo anticorpo também inclui policlonal, monoclonal, ou outras preparações purificadas de anticorpos e anticorpos recombinan- tes. O termo "anticorpo recombinante", significa um anticorpo, ou domínio de ligação de antígeno de uma imunoglobulina, expresso de um ácido nucléico que foi construído usando as técnicas de biologia molecular, tais como um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano desenvolvido a partir de um anticorpo de cadeia única. Domínio único e anticorpos de cadeia única estão também incluídos no termo "anticorpo recombinante".
[099] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal e, em certas modalidades, a invenção produz métodos disponíveis para gerar anticorpos inéditos. Por exemplo, um método para gerar um anticorpo monoclonal que liga especificamente a um polipeptídeo ActRlIa, polipeptídeo ActRIIb, ou polipeptídeo ativina pode compreender administrar a um camundongo uma quantidade de uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo do antígeno efetivo para estimular uma resposta imune detectável, obtendo células que produzem anticorpo (por exemplo, células do baço) do camundongo e fundindo as células que produzem anticorpo com células mieloma para obter hibridomas de produção de anticorpo, e testar os hibridomas de produção de anticorpo para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao antígeno. Uma vez obtido, um hibridoma pode ser propagado em uma cultura celular, opcionalmente nas condições de cultura onde as células derivadas de hibridoma produzem o anticorpo monoclonal que liga especificamente ao antígeno. O anticorpo monoclonal pode ser purificado da cultura celular.
[0100] O adjetivo "especificamente reativo com" da maneira usada na referência a um anticorpo deve significar, como é geralmente entendido na tecnologia, que o anticorpo é suficientemente seletivo entre o antígeno de interesse (por exemplo, um ativina, polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb) e outros antígenos que não são de interesse que o anticorpo seja usado, para no mínimo, detectar a presença do antígeno de interesse em um tipo particular de amostra biológica. Em certos métodos que empregam o anticorpo, tal como aplicações terapêuticas, pode ser desejável um grau mais alto de especificidade na ligação. Anticorpos monoclonais geralmente têm uma maior tendência (comparado aos anticorpos policlonais) de discriminar efetivamente entre os antígenos desejados e polipeptídeos de reação cruzada. Uma característica que influencia a especificidade de uma interação anticorpo:antígeno é a afinidade do anticorpo com o antígeno. Embora a especificidade desejada possa ser atingida com uma faixa de diferentes afinidades, geralmente anticorpos preferidos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de cerca de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 M ou menos.
[0101] Além do mais, as técnicas usadas para selecionar anticorpos a fim de identificar um anticorpo desejável podem influenciar nas propriedades do anticorpo obtido. Por exemplo, se um anticorpo deve ser usado para ligar um antígeno em solução, pode-se desejar testar a ligação da solução. Uma variedade de diferentes técnicas é disponível para testar interação entre anticorpos e antígenos para identificar anticorpos particularmente desejáveis. Tais técnicas incluem ensaios de ligação de ressonância de plasma superficiais ELISAs, (por exemplo, o ensaio de ligação Bia- core™, Biacore AB, Uppsala, Suécia), ensaios sanduíche (por exemplo, o sistema de conta paramagnético de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), western blots, ensaios de imunoprecipitação, e imunoistoquímica.
[0102] Exemplos de categorias de compostos de ácido nucléico que são antagonistas ativina ou ActRII incluem ácidos nucléicos antissentido, construções RNAi e construções de ácido nucléico catalítico. Um composto do ácido nucléico pode ser de fita única ou dupla. Um composto de fita dupla pode também incluir regiões de saliências ou não complementariedade, onde uma ou outra das fitas é fita única. Um composto de fita única pode incluir regiões de auto-complementariedade, significando que o composto forma uma assim chamada estrutura "grampo" ou “semicircular”, com uma região de estrutura helicoidal dupla. Um composto do ácido nucléico pode com-preender uma sequência de nucleotídeo que é complementar com uma região consistindo em não mais que 1.000, não mais que 500, não mais que 250, não mais que 100, ou não mais que 50, 35, 25, 22, 20, 18 ou 15 nucleotídeos da sequência de ácido nucléico de ActRII de comprimento total ou sequência de ácido nucléico de ativina PA, ββ, βc, ou βε. A região de complementariedade seria preferivelmente pelo menos 8 nucleotídeos, e opcionalmente cerca de 18 a 35 nucleotídeos. Uma região de complementariedade faltaria em um íntron, uma sequência de codificação ou uma sequência de não codificação do alvo transcrito, tal como a porção da sequência de codificação. Geralmente, um composto do ácido nucléico teria um comprimento de cerca de 8 a cerca de 500 nucleotídeos ou pares de base em comprimento, e opcionalmente o comprimento seria cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos. Um ácido nucléico pode ser um DNA (particularmente para usar como um antissentido), RNA ou RNA:DNA híbrido. Qualquer uma fita pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem facilmente ser classificadas tanto como DNA quanto RNA. Similarmente, um composto de fita dupla pode ser DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA, e qualquer uma fita pode também incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facilmente classificado tanto como DNA quanto RNA. Um composto do ácido nucléico pode incluir qualquer de uma variedade de modificações, incluindo uma modificação ou modificações na espinha dorsal (a porção açúcar-fosfato em um ácido nucléico natural, incluindo ligações internucleotí- deo) ou a porção base (a porção de purina ou pirimidina de um ácido nucléico natural). Um composto antissentido do ácido nucléico teria preferivelmente um comprimento de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos e conteria frequentemente uma ou mais modificações para melhorar características, tal como estabilidade no soro, em uma célula ou em um local onde o composto deve provavelmente ser distribuído, tais como o estômago no caso de compostos oralmente distribuídos e o pulmão para compostos inalados. No caso de uma construção RNAi, a fita complementar para o alvo transcrito será geralmente RNA ou modificações deste. A outra fita pode ser RNA, DNA ou qualquer outra variação. A porção duplex de fita dupla ou fita única "grampo" construção RNAi terá geralmente um comprimento de 18 a 40 nucleotídeos em comprimento e opcionalmente cerca de 21 a 23 nucleotídeos em comprimento, desde que ela sirva como um substrato Dicer. Ácidos nucléicos catalíticos ou enzimáticos podem ser ri- bossomas ou enzimas de DNA e podem também conter formas modificadas. Compostos de ácido nucléico podem inibir expressão do alvo por cerca de 50 %, 75 %, 90 % ou mais quando em contato com células em condições fisiológicas e a uma concentração onde um controle não sentido ou sentido tem pouco ou nenhum efeito. Concentrações preferidas para testar o efeito de compostos de ácido nucléico são 1, 5 e 10 micromolar. Compostos de ácido nucléico podem também ser testados para efeitos, por exemplo, em níveis de célula vermelha do sangue.
5. Ensaios de Triagem
[0103] Em certos aspectos, a presente invenção diz respeito ao uso de Polipeptídeos ActRII (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa ou ActRIIb solúveis) e polipeptídeo ativina para identificar compostos (agentes) que são agonista ou caminho de sinalização dos antagonistas de ativina ActRIIa e/ou ativina ActRIIb. Compostos identificados através desta seleção podem ser testados para avaliar sua capacidade de modular níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina e/ou reticulócito in vivo ou in vitro. Estes compostos podem ser testados, por exemplo, em modelos animais.
[0104] Existem inúmeras abordagens para seleciona agentes terapêuticos para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina alvejando sinalização de ativina e ActRII. Em certas modalidades, seleção de alta produção de compostos pode ser realizada para identificar agentes que perturbam efeitos mediados por ativina ou ActRII em uma linhagem celular selecionada. Em certas modalidades, o ensaio é realizado para selecionar e identificar os compostos que inibem especificamente ou reduzem a ligação de um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb em ativina. Alternativamente, o ensaio pode ser usado para identificar compostos que melhoram a ligação de um polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb em ativina. Em uma modalidade adicional, os compostos podem ser identificados pela sua capacidade de interagir com um ativina, polipeptídeo ActRIIb, ou polipeptídeo ActRIIa.
[0105] Uma variedade de formatos de ensaio será suficiente e, sob a luz da presente revelação, aqueles não expressamente aqui descrito, no entanto, serão compreendidos pelos versados na tecnologia. Da maneira aqui descrita, os compostos de teste (agentes) da invenção podem ser criados por qualquer método químico combinatorial. Alternativamente, os compostos em questão podem ser de biomoléculas de ocorrência natural sintetizadas in vivo ou in vitro. Compostos (agentes) a ser testados com relação à sua capacidade de agir como moduladores de crescimento do tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactéria, levedura, plantas ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimicamente (por exemplo, pequenas moléculas, incluindo peptidomiméticas), ou produzidos recombinantemente. Compostos teste contemplados pela presente invenção incluem moléculas orgânicas não peptidil, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios, e moléculas de ácido nucléico. Em uma modalidade específica, o agente teste é uma pequena molécula orgânica tendo um peso molecular de menos que cerca de 2,000 Daltons.
[0106] Os compostos de teste da invenção podem ser fornecidos como entidades únicas, discretas, ou fornecidos em bibliotecas de maior complexidade, tal como feito por substâncias químicas combinatoriais. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, álcoois, haletos de alquila, aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos orgânicos. A apresentação de compostos teste no sistema teste podem ser tanto em uma forma isoladas quanto como misturas de compostos, especialmente nas etapas de seleção iniciais. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivatizados com outros compostos e têm grupos de derivatização que facilitam a isolação dos compostos. Exemplos não limitantes de grupos de derivatização incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, poliistidina, gotas magnéticas, glutationa S transferase (GST), reticuladores fotoativáveis ou quaisquer combinações destes.
[0107] Em muitos medicamentos para selecionar programas que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, ensaios de alta produção são desejáveis a fim de maximizar o número de compostos que sobreviveram em um dado período de tempo. Ensaios que são realizados em sistemas sem célula como esses, podem ser derivados com proteínas purificadas ou semipurificadas, são frequentemente preferidos como seleções "primárias" no qual eles podem ser gerados para permitir desenvolvimento rápido e detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto teste. Além do mais, os efeitos de toxicidade celular ou biodisponibilidade do composto teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, o ensaio em vez disso sendo focado basicamente no efeito do medicamento no alvo molecular como pode ser manifestado em uma alteração de afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActRIIa e ativina e/ou entre um polipeptídeo ActRIIb e ativina.
[0108] Meramente para ilustra, em um ensaio de seleção exemplar da presente invenção, o composto de interesse é colocado em contato com um polipeptídeo ActRIIa isolado e purificado que é ordinariamente capaz de se ligar a ativina. À mistura do composto e polipeptídeo ActRIIa é então adicionada uma composição contendo um agente de ligação ActRIIa. A detecção e quantificação de complexos ActRIIa/ati- vina fornece um meio para determinar a eficácia do composto na inibição (ou potenci- alização) de formação de complexo entre o polipeptídeo ActRIIa e ativina. A eficácia do composto pode ser avaliada gerando curvas de resposta de dose a partir dos dados obtidos usando várias concentrações do composto teste.
[0109] Além do mais, um ensaio controle pode também ser realizado para fornecer uma linha de base para comparação. Por exemplo, em um ensaio controle, ativina isolada e purificada é adicionada a uma composição contendo o polipeptídeo ActRIIa, e a formação do complexo ActRIIa/ativina é quantificado na ausência do composto teste. Deve-se entender que, em geral, a ordem na qual os reagentes podem ser misturados pode ser variada, e pode ser misturado simultaneamente. Além do mais, no lugar de proteínas purificadas, extratos celulares e lisatos podem ser usados para tornar um sistema de ensaio sem célula adequado. Compostos que afetam a sinalização de ActRIIb podem ser identificados de uma maneira similar usando um polipeptídeo ActRIIb e um agente de ligação ActRIIb.
[0110] Formação do complexo entre o polipeptídeo ActRII e ativina pode ser detectada por uma variedade de técnicas. Por exemplo, modulação da formação de complexos pode ser quantificada usando, por exemplo, proteínas marcadas detectá- veis tais como polipeptídeo ActRIIa ou ActRIIb ou ativina radiomarcados (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcados fluorescentemente (por exemplo, FITC), ou marcados enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica.
[0111] Em certas modalidades, a presente invenção contempla o uso de ensaios polarização de fluorescência e ensaios na medição de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), tanto direta quanto indiretamente, do grau de interação entre um polipeptídeo ActRII e sua proteína de ligação. Adicionalmente, outros modos de detecção, tal como aqueles com base em guias de onda óticas (Publicação PCT WO 96/26432 e patente U.S. 5.677.196), ressonância de plasma de superfície (SPR), sensores de carga de superfície, e sensores de força de superfície, são compatíveis com muitas modalidades da invenção.
[0112] Além do mais, a presente invenção contempla o uso de uma interação de ensaio trap, também conhecido como o "dois ensaios híbridos", para identificar agentes que interrompem ou potencializam a interação entre um polipeptídeo ActRIl e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, patente U.S. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 2046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a presente invenção contempla o uso de sistemas de dois híbridos reverso para identificar compostos (por exemplo, pequenas moléculas ou peptídeos) que dissociam interações entre um polipeptídeo ActRIl e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, Vidal e Legrain, (1999) acids nucleics Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; e patentes U.S. 5.525.490, 5.955.280 e 5.965.368.
[0113] Em certas modalidades, os compostos em questão são identificados por suar capacidade de interagir com um polipeptídeo ActRIl ou ativina da invenção. A interação entre o composto e o polipeptídeo ActRIIa, ActRIIb, ou ativina pode ser covalente ou não covalente. Por exemplo, tal interação pode ser identificada no nível de proteína usando métodos bioquímicos in vitro, incluindo fotoreticulação, ligação de agente de ligação radiomarcados, e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Em certos casos, os compostos podem ser se-lecionados em um mecanismo baseado no ensaio, tal como um ensaio para detectar compostos que se ligam a um ativina ou polipeptídeo ActRIl. Isto pode incluir um evento de ligação de fase sólida ou fase de fluido. Alternativamente, o gene que codifica um ativina ou polipeptídeo ActRIl podem ser transfectado com um sistema repor- tador (por exemplo, β-galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde) em uma célula e selecionada contra a biblioteca opcionalmente por uma seleção de alta produção ou com membros individuais da biblioteca. Outro mecanismo baseado em ensaios de ligação pode ser usado, por exemplo, ensaios de ligação que detectam mudanças em energia livre. Ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixado em um poço, gota ou chip ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados usando normalmente ressonância de plasma colorimétrica ou de fluorescência ou de superfície. 6. Usos terapêuticos Exemplares
[0114] Em certas modalidades, antagonistas de ativina-ActRII (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa ou ActRIIb) da presente invenção podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue em mamíferos, tal como roedores e primatas, e particularmente pacientes humanos. Em certas modalidades, a presente invenção diz respeito a métodos de tratar ou impedir anemia em um indivíduo que necessita destes para administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina-ActRIIa, tal como um polipeptídeo ActRIIa, ou uma quanti-dade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina-ActRIIb, tal como um polipeptídeo ActRIIb. Em certas modalidades, a presente invenção diz respeito a métodos de promover a formação de célula vermelha do sangue em um indivíduo administrando ao individual uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina-ActRII, particularmente um polipeptídeo ActRII. Estes métodos podem ser usados para tratamentos terapêuticos e profiláticos de mamíferos, e particularmente humanos.
[0115] Da maneira aqui usada, um produto terapêutico que "preveni" um distúrbio ou condição refere-se a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do distúrbio ou condição na amostra tratada a relação a uma amostra controle não tratada, ou atrasa o início de ação ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condição em relação a amostra controle não tratada. O termo "tratar" da maneira aqui usada inclui profilaxia de condição denominada ou atenuação ou eliminação da condição uma vez que ela foi estabelecida. De qualquer maneira, prevenção ou tratamento pode ser discernido no diagnóstico fornecido por um médico ou outro provedor de cuidado com a saúde e o resultado visado de administração do agente terapêutico. Da maneira aqui mostrada, antagonistas ativina-ActRIIa e antagonistas ativina-ActRIIb podem ser usados para aumentar níveis de célula vermelha do sangue, hemoglobina ou reticulócito em indivíduos saudáveis, e tais antagonistas podem ser usados em populações de paciente selecionadas. Exemplos de populações de paciente apropriadas incluem aqueles com baixos níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina indesejáveis, tais como pacientes tendo uma anemia, e aqueles que correm o risco de desenvolver baixos níveis de célula vermelha do sangue ou hemoglobina indesejáveis, tais como aqueles pacientes que estão próximos de passar por cirurgia principal ou outros procedimentos que podem resultar em perda de sangue substancial. Em uma modalidade, um paciente com níveis adequados de célula vermelha do sangue é tratado com um antagonista ativina-ActRIIa para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue, e então o sangue é retirado e armazenado para uso posterior em transfusões. Em uma modalidade, um paciente com níveis adequados de célula vermelha do sangue é tratado com um antagonista ativina- ActRIIb para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue, e então o sangue é retirado e ar-mazenado para uso posterior em transfusões.
[0116] Antagonistas Ativina-ActRII aqui revelados, e particularmente proteínas ActRIIa-Fc e ActRIIb, podem ser usados para aumentar os níveis de célula vermelha do sangue em pacientes tendo uma anemia. Observando ao mesmo tempo os níveis de hemoglobina em humanos, um nível menor que normal para a categoria de idade e sexo apropriada pode ser indicativo de anemia, embora variações de indivíduos sejam levados em conta. Por exemplo, um nível de hemoglobina de 12 g/dl é geralmente considerado o limite inferior ao normal na população adulta em geral. Causas potencial incluem perda sanguínea, déficits nutricionais, reação a medicação, vários problemas com a medula óssea e muitas doenças. Mais particularmente, anemia foi associada com uma variedade de distúrbios que incluem, por exemplo, deficiência renal crônica, síndrome mielodisplástica, artrite reumatóide, transplante de medula óssea. Anemia pode também ser associada com as seguintes condições: tumores sólidos (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer do cólon); tumores do sistema linfático (por exemplo, leucemia linfócita crônica, linfomas não de Hodgkins e de Hodgkins); tumores sistema do hematopoiético (por exemplo, síndrome de leucemia, mielodisplástica, mieloma múltiplo); terapia de radiação; quimioterapia (por exemplo regimes contendo platina); doenças inflamatórias e autoimunes, incluindo, mas sem limitações, artrite reumatóide, outras artrites inflamatórias, lupus sistêmico eritematoso (SLE), doenças pele agudas ou crônicas (por exemplo psoríase), doença do intestino inflamatório (por exemplo doença de Crohn's e colite ulcerativa); doença ou insuficiência renal aguda ou crônica incluindo condições idiopáticas ou congênitas; doença do fígado aguda ou crônica; hemorragia aguda ou crônica; situações onde a transfusão de célula vermelha do sangue não é possível em virtude de aloanticorpos ou autoanticorpos do paciente e/ou por motivos religiosos (por exemplo alguns Jehovah's Witnesses); infecções (por exemplo malária, osteomielite); hemoglobinopa- tias, incluindo, por exemplo, doença falciforme, talassemia; medicamento uso ou abuso, por exemplo abuso de álcool; pacientes pediátrico com anemia de qualquer causa para evitar transfusão; e pacientes idosos ou pacientes passando por doença cardiopulmonar com anemia que não pode receber transfusões em virtude de preocupações com sobrecarga circulatória.
[0117] Os pacientes podem ser tratados com um regime de dosagem visado para restabelecer o paciente a um nível alvejado de hemoglobina, normalmente entre cerca de 10 g/dl e cerca de 12,5 g/dl, e tipicamente cerca de 11,0 g/dl (ver também Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19), embora níveis mais baixos alvejados possam causar pouco efeitos colaterais cardiovasculares. Alternativamente, níveis hematócritos (porcentagem do volume de uma amostra sanguínea ocupada pelas células) podem ser usados como uma medida para a condição de células vermelhas do sangue. Níveis de hematócrito para indivíduos saudáveis variam de 41 a 51 % para machos adultos e de 35 a 45 % para fêmeas adultas. Os níveis de hematócrito alvejados são normalmente em torno de 30-33 %. Além do mais, níveis de hemoglo- bina/hematócrito variam de pessoa para pessoa. Assim, idealmente, o nível hemoglo- bina/hematócrito visado pode ser individualizado para cada paciente.
[0118] O efeito rápido nos níveis de célula vermelha do sangue dos antagonistas ativina-ActRIIa aqui revelados indica que estes agentes agem por um mecanismo diferente que Epo. Consequentemente, estes antagonistas podem ser usados para aumentar os níveis célula vermelha do sangue e de hemoglobina em pacientes que não respondem bem ao Epo. Por exemplo, um antagonista ativina-ActRIIa pode ser benéfico para um paciente no qual a administração de uma dose normal para maior (>300 IU/kg/semana) de Epo não resulta no aumento de nível de hemoglobina até o nível alvejado. Pacientes com uma resposta a Epo inadequada são encontrados para todos os tipos de anemia, mas, números maiores de não respondedores foram observados particularmente de modo frequente em pacientes com cânceres e pacientes com doença renal em estágio final. Uma resposta inadequada a Epo pode ser tanto constitutiva (isto é, observada no primeiro tratamento com Epo) ou adquirida (por exemplo, observada no tratamento repetido com Epo). Os antagonistas de ativina- ActRII podem também ser usados para tratar pacientes que são suscetíveis a efeitos adversos de Epo. Os efeitos adversos primários de Epo são um aumento excessivo nos níveis de hematócrito ou de hemoglobina e policitemia. Elevados níveis de hema- tócrito podem levar a hipertensão (mais particularmente agravamento de hipertensão) e trombose vascular. Outros efeitos adversos de Epo que foram reportados, alguns dos quais relacionados a hipertensão, são dor de cabeça, síndrome similar a influenza, obstrução dos desvio, infartos do miocárdio e convulsões cerebrais em virtude de trombose, encefalopatia hipertensiva, e aplasia de célula vermelha no sangue (Sin- gibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523). 7. Composições farmacêuticas
[0119] Em certas modalidades, antagonistas de ativina-ActRII (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa e ActRIlb) da presente invenção são formulados com um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIl pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os compostos em questão podem ser formulados para administração de qualquer maneira conveniente para o uso em remédio humano ou veterinário.
[0120] Em certas modalidades, o método terapêutico da invenção inclui administrar a composição sistematicamente, ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administrada a composição terapêutica para uso nesta invenção, é claro, em uma forma isenta de pirogênio fisiologicamente aceitável. Agentes terapeutica- mente usados sem ser os antagonistas ativina- ActRII que podem também opcionalmente ser incluídos na composição da maneira descrita anteriormente, podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente com os compostos em questão (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa e ActRIIb) nos métodos da invenção. Tipicamente, antagonistas de ativina-ActRII seriam administrados parenteralmente.
[0121] Composições farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem compreender um ou mais Polipeptídeos ActRII em combinação com um ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser recons-tituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente visado ou agentes de suspensão ou de espessamento. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, eta- nol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigida no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.
[0122] Adicionalmente, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma para distribuição a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, medula óssea). Em certas modalidades, as composições da presente invenção podem incluir uma matriz capaz de distribuir um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, po-lipeptídeos ActRIIa ou ActRIIb ) a um sítio do tecido alvejado (por exemplo, medula óssea), fornecendo uma estrutura para o desenvolvimento do tecido e idealmente capaz de ser reabsorvida no corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer lenta liberação dos polipeptídeos ActRII. Tais matrizes podem ser formadas de materiais atualmente no uso para outras aplicações médicas implantadas.
[0123] A escolha de material da matriz é baseada em biocompatibilidade, bio- degradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e interface propriedades. A aplicação particular das composições em questão definirá a formulação apro-priada. As matrizes potenciais para as composições podem ser biodegradáveis e sulfato de cálcio quimicamente definido, tricálciofosfato, hidroxiapatite, ácido polilático e polianidretos. Outros materiais potenciais são biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tal como colágeno ósseo ou dérmico. Matrizes adicionais são compreendidas de componentes de proteínas puras ou matriz extracelular. Outras matrizes potenciais não são biodegradáveis e quimicamente definidas, tal como hidroxiapatite sin- terizado, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. As matrizes podem ser compreendidas de combinações de qualquer dos tipos de material mencionados anteriormente, tal como ácido polilático e hidroxiapatite ou colágeno e tricálciofosfato. As bio- cerâmicas podem ser alteradas na composição, tal como em cálcio-aluminato-fosfato e processadas para alterar o tamanho do poro, tamanho de partícula, forma de partícula, e biodegradabilidade.
[0124] Em certas modalidades, métodos da invenção podem ser administrados oralmente, por exemplo, na forma de cápsulas, sachês, pílulas, comprimidos, pílulas em forma de losango (usando uma base flavorizada, normalmente sacase e acácia ou tragacanto), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguante bucal e similares, cada qual contendo uma quantidade predeterminada de um agente como um ingrediente ativo. Um agente pode também ser administrado como um bolo, eletuário ou pasta.
[0125] Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos, e similares), um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquer dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) gentes aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose, e/ou acácia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes de desintegração, tais como ágar- ágar, carbonato de cálcio, batata ou amido de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tal como parafina; (6) acelaradoresde absorção, tal como compostos amônio quaternário; (7) agentes edul- corantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caolim e argila de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, cálcio estearato, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, sulfato lauril de sódio, e misturas destes; e (10) agentes de coloração. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas gelatina cheias macias e duras usando tais exci- pientes como lactose ou açúcares de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares.
[0126] Formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na tecnologia, tal como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropí- lico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propi- leno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, de amendoim, de milho, de germe, de oliva, rícino, e sésamo), glicerol, álcool tetraidrofu- rílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas destes. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tal como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes, fla- vorizantes, corantes, perfumantes e conservantes.
[0127] Suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, tal como álcoois isostearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto, e misturas destes.
[0128] As composições da invenção podem também conter adjuvantes, tal como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção da ação de microrganismos pode ser garantida pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e similares. Pode-se também ser desejável incluir agentes isotô- nicos, tal como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além do mais, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
[0129] Entende-se que o regime de dosagem seria determinado pelo médico atendente considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos em questão da invenção (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa e ActRIIb). Os vários fatores incluem, mas sem limitações, a contagem de célula vermelha do sangue do paciente, nível de hemoglobina ou outras avaliações de diagnóstico, a contagem de célula vermelha do sangue alvejada desejada, a idade, sexo, e dieta, do paciente a gravidade de qualquer doença que possa contribuir com um nível de célula vermelha do sangue reduzido, tempo de administração, e outros fatores clínicos. A adição de outros fatores de crescimento conhecidos na composição final pode também afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica de níveis de célula vermelha do sangue e de hemoglobina, bem como avaliação de níveis de reticulócitos e outros indicadores do processo hematopoiético.
[0130] Experimentos com primatas e humanos têm demonstrado que efeitos de ActRIIa-Fc nos níveis de célula vermelha do sangue são detectáveis quando o composto é dosado em intervalos e quantidades suficientes para obter as concentrações de soro de cerca de 100 ng/mL ou mais, por um período de pelo menos cerca de 20 a 30 dias. Dosagem para obter níveis de soro de 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1.000 ng/mL ou mais por um período de pelo menos 20 a 30 dias pode também ser usada. Efeitos nos ossos podem ser observados nos níveis de soro de cerca de 200 ng/mL, com efeitos substanciais começando em cerca de 1.000 ng/mL ou mais, por um período de pelo menos cerca de 20 a 30 dias. Assim, se for desejável obter efeitos em células vermelha do sangue tendo pouco efeito no osso, um esquema de dosagem pode ser projetado para distribuir uma concentração de soro entre cerca de 100 e 1.000 ng/mL por um período de cerca de 20 a 30 dias. Em humanos, os níveis de soro de 200 ng/mL podem ser obtidos com uma dose única de 0,1 mg/kg ou mais e níveis de soro de 1.000 ng/mL podem ser obtidos com uma dose única de 0,3 mg/kg ou mais. A meia vida do soro observada da molécula é entre cerca de 20 e 30 dias, substancialmente maior do que a maioria das proteínas de fusão Fc, e assim um nível de soro efetivo sustentado pode ser obtido, por exemplo, por dosagem com cerca de 0,05 a 0.5 mg/kg em uma base semanal ou bissemanal, ou doses mais altas podem ser usadas com intervalos mais longos entre as dosagens. Por exemplo, doses de 0,1 a 1 mg/kg devem ser usadas em uma base mensal ou bimensal.
[0131] Em certas modalidades, a presente invenção também fornece terapia genética para a produção in vivo de polipeptídeo ActRIl. Tal terapia alcançaria seu efeito terapêutico por introdução da sequência de polinucleotídeos ActRIIa ou ActRIlb nas células ou tecidos tendo os distúrbios listados anteriormente. A distribuição de sequência de polinucleotídeos ActRIl pode ser obtida usando um vetor de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Preferido para distribuição de sequência de polinucleotídeos ActRII é o uso de lipossomas alvejadas.
[0132] Vários vetores virais que podem ser utilizados para terapia genética, conforme preceituado aqui, incluem adenovírus, herpes vírus, vaccínia, ou um vírus de RNA, tal como um retrovírus. O vetor retroviral pode ser um derivado de um retro- vírus de murino ou ave. Exemplos de vetores retrovirais em que um único gene estranho pode ser inserido incluem, mas sem limitações: vírus de leucemia de murino Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma de murino Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário de murino (MuMTV), e vírus de sarcoma de Rous (RSV). Inúmeros vetores retrovirais adicionais podem incorporar múltiplos genes. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável, de maneira tal que células tranduzidas podem ser identificadas e geradas. Vetores retrovirais podem ser preparados específicos para o alvo anexando, por exemplo, um açúcar, um glicolipí- deo, ou uma proteína. O alvejamento preferido é realizado usando um anticorpo. Versados na tecnologia perceberão que sequência de polinucleotídeos específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou anexadas a um envelope viral para permitir distribuição específica ao alvo do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo ActRII.
[0133] Alternativamente, células celulares de tecido podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por transfecção com fosfato de cálcio convencional. Estas células são então transfectadas com o plasmídeo do vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura. Um outro sistema de distribuição alvejado para polinucleotídeos ActRII é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidais incluem complexos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, gotas, e sistemas a base de lipídeo incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas misturadas e lipossomas. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Lipossomas são vesículas de membrana artificial que são usadas como veículos de distribuição in vitro e in vivo. RNA, DNA e vírions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuídos às células em uma forma biologicamente ativa (ver, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Métodos para transfectar gene eficientes usando um veículo de lipossoma são conhecidos na tecnologia, ver por exemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolipídeos, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolipídeos ou outros lipídeos também podem ser usados. As características físicas de lipossomas dependem do pH, intensidade iônica e da presença de cátions divalentes.
[0134] Exemplos de lipídeos usado em produção de lipossoma incluem compostos de fosfatidil, tal como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidi- letanolamina, esfignolipídeos, cerebrosódeos e gangliosídeos. Fosfolipídeos ilustrativos incluem fosfatidilcolina de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e distearoilfosfatidilcolina. O alvejamento de lipossomas também é possível com base, por exemplo, na especificidade so órgão, especificidade da célula, e especificidade da organela e é conhecido na tecnologia.
Exemplos
[0135] A invenção, sendo agora descrita no geral, será mais prontamente entendida pela referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente com propósitos de ilustração de certas modalidades e modalidades da presente invenção, e não pretende-se que limitem a invenção.
Exemplo 1 : Proteínas de Fusão ActRIIa-Fc
[0136] Os requerentes construíram uma proteína de fusão ActRIIa solúvel que tem o domínio extracelular de ActRIIa humano fundido em um domínio Fc humano ou de camundongo, com um mínimo ligante entre eles. As construções são referidas como ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc, respectivamente.
[0137] ActRIIa-hFc é mostrada a seguir da forma purificada a partir de linhagens celulares de CHO (SEQ ID NO: 7): ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQ GCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVT PKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYT OKSLSLSPGK
[0138] As proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram expressadas em linhagens celulares de CHO. Três diferentes sequências líderes foram consideradas: (i)Melitina de abelha de mel (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii)Ativador de Tecido plasminogênico (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGA VFVSP (SEQ ID NO: 9) (iii)Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10).
[0139] A forma selecionada emprega o líder de TPA e tem a seguinte sequência não processada de aminoácido: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPC YGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE GNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)
[0140] Este polipeptídeo é codificado pela seguinte sequência de ácido nu- cléico: ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCT TTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGT GTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTC TGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATG ACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTG TGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACA CAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG TACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGT CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)
[0141] Tanto ActRIIa-hFc quanto ActRIIa-mFc foram consideravelmente receptivas à expressão recombinante. Da forma mostrada na figura 1, a proteína foi purificada como um único pico de proteína bem definido. Sequenciamento N-terminal revelou uma única sequência de -ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11). A purificação pode ser alcançada por uma série de etapas da cromatografia de coluna, incluindo, for exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, croma- tografia em sefarose Q, cromatografia em fenilsefarose, cromatografia por exclusão de tamanhos e cromatografia de troca catiônica. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. A proteína ActRIIa-hFc foi purificada até uma pureza > 98 %, da forma determinada pela cromatografia por exclusão de tamanhos e > 95 %, da forma determinada por SDS PAGE.
[0142] ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc mostraram uma alta afinidade em relação aos elementos de ligação, particularmente, ativina A. GDF-11 ou Ativina A ("ActA") foram imobilizados em um chip Biacore CM5 usando procedimento de acoplamento de amina padrão. Proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram carregadas sobre o sistema, e a aglutinação foi medida. ActRIIa-hFc aglutinou em ativina com uma constante de dissociação (KD) de 5 x 1012, e a proteína aglutinou em GDF11 com uma KD de 9,96 x 10-9. Veja figura 2. ActRIIa-mFc se comportou de forma similar. A ActRIIa-hFc foi muito estável em estudos farmacocinéticos. Ratos foram dosados com 1 mg / kg, 3 mg / kg ou 10 mg / kg da proteína ActRIIa-hFc, e níveis de plasma da proteína foram medidos em 24, 48, 72, 144 e 168 horas. Em um estudo separado, ratos foram dosados com 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg. Em ratos, ActRIIa-hFc teve uma meia- vida sérica de 11 - 14 dias, e níveis de circulação do medicamento foram bastante altos depois de duas semanas (11 μg / mL, 110 μg / mL ou 304 μg / mL para administrações iniciais de 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg, respectivamente.) Em macacos cinomolgo, a meia-vida plasmática foi substancialmente maior que 14 dias, e níveis de circulação do medicamento foram 25 μg / mL, 304 μg / mL ou 1.440 μg / mL para administrações iniciais de 1 mg / kg, 10 mg / kg ou 30 mg / kg, respectivamente.
Exemplo 2: ActRIIa-hFc Aumenta Níveis de Célula Vermelha do Sangue em Primatas Não Humanos
[0143] O estudo empregou quatro grupos de cinco machos e cinco fêmeas de macacos cinomolgo cada, com três por sexo por grupo agendados para término no dia 29, e dois por sexo por grupo agendados para término no dia 57. Em cada animal foi administrado o veículo (Grupo I) ou ActRIIa-Fc em doses de 1, 10, ou 30 mg / kg (Grupos 2, 3 e 4, respectivamente) por meio de injeção intravenosa (IV) nos dias 1, 8, 15 e 22. O volume da dose foi mantido em 3 mL / kg. Várias medições dos níveis de célula vermelha do sangue foram avaliadas dois dias antes da primeira administração e nos dias 15, 29 e 57 (para os dois animais restantes) depois da primeira administração.
[0144] A ActRIIa-hFc ocasiona aumentos estatisticamente significativos em parâmetros médios de célula vermelha do sangue (contagem de célula vermelha do sangue [RBC], hemoglobina [HGB] e hematócrito [HCT]) para machos e fêmeas, em todos os níveis de dose e pontos no tempo por todo o estudo, com elevações associadas nas contagens de reticulócito absoluta e relativa (ARTC; RTC). Veja figuras 3 - 6.
[0145] A significância estatística foi calculada para cada grupo de tratamento em relação à média para o grupo de tratamento no valor de referência.
[0146] Notavelmente, os aumentos nas contagens de célula vermelha do sangue e nos níveis de hemoglobina são grosseiramente equivalentes, em magnitude, aos efeitos relatados com eritropoietina. O início destes efeitos é mais rápido com ActRIIa-Fc do que com eritropoietina. Resultados similares foram observados com ratos e camundongos.
Exemplo 3: ActRIIa-hFc Aumenta Níveis de Célula Vermelha do Sangue em Pacientes Humanos
[0147] A proteína de fusão ActRIIa-hFc descrita no Exemplo 1 foi administrada em pacientes humanos em um estudo aleatorizado, duplo cego, controlado em relação ao placebo, que foi conduzido para avaliar, primariamente, a segurança da proteína em mulheres saudáveis pós-menopausais. Quarenta e oito sujeitos foram aleato- rizados em coortes de 6 para receber tanto uma única dose de ActRIIa-hFc quanto placebo (5 ativos: 1 placebo). Os níveis de dose variaram de 0,01 até 3,0 mg / kg intravenosamente (IV) e de 0,03 até 0,1 mg / kg subcutaneamente (SC). Todos os sujeitos foram seguidos por 120 dias. Além da análise farmacocinética (PK), a atividade biológica de ActRIIa-hFc também foi avaliada pela medição de marcadores bioquímicos de formação e reabsorção óssea, e de níveis de FSH.
[0148] Para procurar mudanças em potencial, números de hemoglobina e RBC foram examinados com detalhes para todos os sujeitos durante o curso do estudo, e comparados com os níveis de valor de referência. Contagens de plaqueta foram comparadas durante o mesmo tempo, como o controle. Não houve mudanças clinicamente significativas dos valores de referência durante o tempo para as contagens de plaqueta.
[0149] Análise de PK da ActRIIa-hFc exibiu um perfil linear com dose, e a meia-vida média de aproximadamente 25 - 32 dias. A área debaixo da curva (AUC) para ActRIIa-hFc foi linearmente relacionada à dose, e a absorção depois da dosagem SC foi essencialmente completa (veja figuras 7 e 8). Estes dados indicam que SC é uma abordagem desejável para dosagem em virtude de ela fornecer equivalente bio- disponibilidade e meia-vida sérica ao medicamento, ainda evitando o aumento em concentrações séricas de medicamento associadas com os primeiros poucos dias de dosagem IV (veja figura 8). ActRIIa-hFc ocasionou um rápido e sustentado aumento dependente de dose nos níveis séricos de fosfatase alcalina específica óssea (BAP), que é um marcador para crescimento ósseo anabólico, e uma diminuição dependente de dose em telopeptídeo colágeno tipo 1 C-terminal e nos níveis de ácido fosfatase 5b resistente ao tartrato, que são marcadores para reabsorção óssea. Outros marcadores, tal como P1NP, mostraram resultados inconclusivos. Níveis de BAP mostraram efeitos quase saturantes na dosagem de medicamento mais alta, indicando que efei-tos meio-máximo neste biomarcador ósseo anabólico podem ser alcançados em uma dosagem de 0,3 mg / kg, com aumentos que variam até 3 mg / kg. Calculado como um relacionamento de efeito farmacodinâmico na AUC para o medicamento, o EC50 é 51,465 (dia * ng / mL). Veja figura 9. Estas mudanças no biomarcador ósseo foram sustentadas por aproximadamente 120 dias nos níveis mais altos da dose testada. Também houve uma diminuição dependente de dose nos níveis de FSH sérico consistente com a inibição de ativina.
[0150] No total, houve uma redução muito pequena não relacionada a medicamento na hemoglobina durante a primeira semana do estudo, provavelmente, relacionada à flebotomia do estudo nos grupos de 0,01 e 0,03 mg / kg, sejam dados IV ou SC. Os resultados de hemoglobina SC e IV de 0,1 mg / kg foram estáveis ou mostraram modestos aumentos pelo dia 8 - 15. No nível de dose IV de 0,3 mg / kg houve um claro aumento nos níveis de HGB vistos, já no dia 2 e, frequentemente, com pico nos dias 15 - 29, que não foi visto nos sujeitos com placebo. Neste ponto do estudo, esta mudança não alcançou significância estatística.
[0151] No total, ActRIIa-hFc mostrou um efeito dependente de dose em contagens de célula vermelha do sangue e contagens de reticulócito. Para um resumo das mudanças hematológicas, veja figuras 10 - 13.
Exemplo 4: Proteínas ActRIIa-Fc Alternativas
[0152] Uma variedade de variantes de ActRIIa, que pode ser usada de acordo com os métodos aqui descritos, é descrita no Pedido de Patente Internacional, publicado como WO2006/012627 (veja, por exemplo, pp. 55 - 58), aqui incorporado pela referência em sua íntegra. Uma construção alternativa pode ter uma deleção da cauda do C-terminal (os 15 aminoácidos finais) do domínio extracelular de ActRIIa. A sequência para uma construção como esta é apresentada a seguir (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 12): ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQ GCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAK GOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
Exemplo 5: Proteínas de Fusão ActRIIb-Fc
[0153] Os requerentes construíram uma proteína de fusão ActRIIb solúvel que tem o domínio extracelular de ActRIIb humano fundido em um domínio Fc humano. Uma estrutura de co-cristal de Ativina e ActRIIb extracelular não mostrou nenhum papel para os 15 aminoácidos finais (C-terminal) (aqui referido como a "cauda") do domínio extracelular na aglutinação do elemento de ligação. Esta sequência deixou de resolver na estrutura de cristal, sugerindo que estes resíduos estão presentes em um laço flexível que não embala uniformemente no cristal. Thompson et al. EMBO J. 2003 Apr 1; 22(7):1555-66. Esta sequência também é fracamente conservada entre ActRIIb e ActRIIa. Dessa maneira, estes resíduos foram omitidos na construção de fusão Ac- tRIIb-Fc básica ou fundamental. Adicionalmente, a posição 64 na forma fundamental é ocupada por uma alanina que, no geral, é considerada a forma "tipo selvagem", embora um alelo A64R ocorra naturalmente. Assim, a fusão ActRIIb-Fc fundamental tem a sequência (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 20): SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELV KKGCWLDDFNCYDROECVATEENPOVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGGTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAK GOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
[0154] Surpreendentemente, descobriu-se que a cauda do C-terminal melhora ativina e a aglutinação de GDF-11, assim, uma versão preferida de ActRIIb-Fc tem uma sequência (parte Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 21): SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELV KKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYE P PPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKV SNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHN HYTOKSLSLSPGK
[0155] Uma variedade das variantes de ActRIIb a que pode ser usada de acordo com os métodos aqui descritos é descrita no Pedido de Patente Internacional, publicado como WO2006/012627 (veja, por exemplo, pp. 59 - 60), aqui incorporado pela referência na sua íntegra.
Exemplo 6: ActRIIb-hFc Estimula Eritropoiese em Primatas Não Humanos
[0156] ActRIIb-hFc (IgG1) foi administrada uma vez por semana por 1 mês em macacos cinomolgo macho e fêmea por injeção subcutânea. Quarenta e oito macacos cinomolgo (24 / sexo) foram atribuídos a um dos quatro grupos de tratamento (6 animais / sexo / grupo) e foram administradas injeções subcutâneas de veículo ou de ActRIIb-hFc em 3, 10, ou 30 mg / kg uma vez por semana por 4 semanas (total de 5 doses). Parâmetros avaliados incluíram patologia clínica geral (hematologia, química clínica, coagulação e urinálise). ActRIIb-hFc ocasionou significativos valores médios absolutos estatisticamente elevados de reticulócito pelo dia 15 em animais tratados. Pelo dia 36, ActRIIb-hFc ocasionou diversas mudanças hematológicas, incluindo elevados valores médios absolutos de amplitude de distribuição de reticulócito e de célula vermelha do sangue e concentração de hemoglobina corpuscular média mais baixa. Todos os grupos tratados e ambos os sexos foram afetados.
[0157] Estes efeitos são consistentes com um efeito positivo de ActRIIb-hFc na liberação de reticulócitos imaturos da medula óssea. Este efeito foi invertido depois que medicamento foi eliminado por lavagem dos animais tratados (pelo dia de estudo 56). Dessa maneira, conclui-se que ActRIIb-hFc estimula a eritropoiese.
Incorporação pela Referência
[0158] Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são por meio dessa incorporadas pela referência em suas íntegras, como se cada publicação ou patente individuais fosse indicada, de forma específica e individual, como incorporada pela referência.
[0159] Embora modalidades específicas do assunto em questão tenham sido discutidas, a especificação exposta é ilustrativa, e não restritiva. Muitas variações ficarão aparentes aos versados na técnica mediante revisão desta especificação e das seguintes reivindicações. O completo escopo da invenção deve ser determinado pela referência às reivindicações, juntamente com seu completo escopo de equivalentes, e à especificação, juntamente com tais variações.

Claims (11)

1. Uso de um polipeptídeo de ActRII CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar anemia em um paciente humano, em que o polipeptídeo de ActRII é selecionado de um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12, 16, 17, 20 ou 21, e em que o polipeptídeo se liga à ativina.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de ActRII tem uma ou mais das seguintes características: i) se liga a um ligante de ActRII com um KD de pelo menos 10-7 M; e ii) inibe sinalização de ActRII em uma célula.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo é uma proteína de fusão de ActRII-Fc tendo um domínio Fc de imunoglobulina.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a anemia está associada com doença renal crônica.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a anemia está associada com um tumor ou câncer.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a anemia está associada com mieloma múltiplo.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a anemia está associada com câncer de pulmão.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente humano possui doença renal crônica.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente humano tem um tumor ou câncer.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente humano tem mieloma múltiplo.
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