BRPI0712052A2 - polipeptìdeos de fator de crescimento tipo insulina estabilizados - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEOS DE FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA ESTABILIZADOS. A invenção refere-se a polipeptídeos estabilizados tendo uma seqüência IGF-1 ou IGF-2 e uma seqüência de peptídeo E, onde a clivagem fisiológica natural dc peptídeo E a partir do IGF é impedida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- DEOS DE FATOR DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA ESTABILIZADOS"

Antecedentes da Invenção

Os fatores de crescimento tipo insulina (IGFs) são parte de um sistema completo que as células usam para se comunicarem com seu ambi- ente fisiológico. Esse sistema complexo (freqüentemente referido como o eixo de fator de crescimento tipo insulina) consiste de dois receptores de superfície de célula (IGF-1R e IGF-2R), dois Iigantes (IGF-1 e IGF-2), uma família de seis proteínas de ligação com IGF de alta afinidade (IGFBP 1-6), e enzimas de degradação de IGFBP associadas (proteases). Este sistema é importante não somente para a regulação de fisiologia normal, mas também para um número de estados patológicos (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003).

O eixo de IGF foi mostrado para executar funções na promoção de proliferação de célula e na inibição de morte celular (apoptose). O IGF-1 é principalmente secretado pelo fígado como um resultado do estímulo por hormônio de crescimento humano (hGH). Quase toda célula no corpo huma- no é afetada por IGF-1, especialmente células nos músculos, cartilagens, ossos, fígado, rim, nervos, pele e pulmões. Em adição aos efeitos tipo insuli- na, o IGF-1 pode também regular o crescimento celular. O IGF-1 e o IGF-2 são regulados por uma família de produtos de gene conhecidos como as proteínas de ligação com IGF. Essas proteínas auxiliam a modular a ação de IGF de formas complexas que envolvem ambos inibir a ação de IGF impe- dindo ligação com os receptores de IGF bem como promovendo a ação de IGF através de auxiliar a liberação aos receptores e aumentando a meia vida do IGF no fluxo sangüíneo. Há pelo menos suas proteínas de ligação carac- terizadas (IGFBP1-6).

Em sua forma madura, o IGF-1 humano (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksa; ID SEQ NO:1), também chamado somatomedina, é uma pequena proteína de 70 aminoácidos que foi mostrada para estimular o crescimento de uma ampla faixa de células em cultura. A proteína madura é inicialmente codifi- cada por três mRNAs variáveis unidos. A estrutura de leitura aberta de cada mRNA codifica uma proteína precursora contendo o IGF-1 com 70 aminoá- cidos e um peptídeo E no término C1 dependendo do mRNA de IGF-1 parti- cular. Esses peptídeos E designaram os peptídeos Ea (rsvraqrhtdmpktqkev- hlknasrgsagnknyrm; ID SEQ NO:2), Eb (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; ID SEQ NO:3), e Ec (rsvraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; ID SEQ NO:4) e a faixa de 35 a 87 aminoácidos em comprimento e abrangem uma região de seqüência co- mum no término N e uma região de seqüência variável no término C. Por exemplo, a estrutura de leitura aberta tipo selvagem para o IGF-1-Ea codifica um polipeptídeo de 105 aminoácidos

(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivde ccfrscdlrrlemycaplkpaksa rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; ID SEQ NO:5). Em expressão fisio- lógica, os peptídeos E são clivados fora do precursor por proteases endóge- nas para produzir o IGF-1 com 70 aminoácidos maduros conhecido como bioativo. Em certos contextos, um a três dos aminoácidos N-terminal de IGF- 1 são clivados sob condições fisiológicas, produzindo IGF-1 ativo tendo entre 67 - 70 aminoácidos. A expressão de gene de IGF-2 e o processamento são caracterizados por atributos similares exceto que somente um peptídeo E (rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpa hggappemasnrk; ID SEQ NO:6) para IGF-2 humano foi modificado para o precursor com 156 aminoácidos (ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlalletycatpakserdvstpptv Ipdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappem asnrk; ID SEQ NO:7). Ambos o IGF-1 e o IGF-2 parecem ser pobres candi- datos a fármacos, já que essas proteínas são rapidamente degradadas por proteases endógenas no soro de pacientes. Uma estratégia que foi observa- da é estabilizar IGF-1 como um fármaco formando um complexo com uma de suas proteínas de ligação.

Sumário da Invenção

A invenção é baseada na descoberta de que uma proteína IGF-1 ou IGF-2 precursora contendo substancialmente seu peptídeo E é bioativa e estabilizada na presença de soro, resultando em um polipeptídeo IGF-1 ou IGF-2 que é útil como um farmacêutico. Nas composições da invenção, a clivagem normal do peptídeo E de IGF-1 é evitada, por exemplo, mudando ou apagando qualquer da arginina na posição 1 ou a serina na posição 2 dos peptídeos E (correspondente às posições 71 e 72 no IGF-1 precursor do tipo selvagem). No IGF-2, a clivagem é evitada, por exemplo, mudando ou apa- gando ou a arginina na posição 1 ou o ácido aspártico na posição 2 do pep- tídeo E (correspondente às posições 68 e 69 no IGF-2 precursor tipo selva- gem). Outras modificações de uma proteína precursora com IGF podem evi- tar ou reduzir essa clivagem.

Em adição, modificações adicionais da seqüência de aminoáci- dos do precursor IGF-1 podem conferir benefícios farmacêuticos adicionais. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem exibir afinidade aumenta- da para o receptor de IGF-1 ou capacidade de ligação diminuída para uma proteína de ligação IGF-1 ou IGF-2 inibitória.

Para o propósito de esclarecimento e consistência, a numeração de resíduos de aminoácidos em precursor IGF-1 ou IGF-2 ou proteínas ma- duras por toda essa aplicação e nas reivindicações é baseada na numera- ção de seqüência de proteína precursora tipo selvagem sem peptídeo sinal.

Conseqüentemente, a invenção inclui um polipeptídeo contendo proteína precursora com IGF-1 humana, onde a clivagem do peptídeo E a partir de IGF-1 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora. O peptídeo E pode ser o peptídeo Ea, Eb ou Ec. No término N do precursor, os aminoácidos G1, P2, ou E3 da proteína precursora podem ser apagados ou mudados, como pode R36 (por exemplo, R36A) e R37 (por exemplo, R37A).

A proteína precursora pode adicionalmente incluir a seqüência consenso de glicosilação ligada em N NXS/T, por exemplo, por inserção de 93-102 aminoácidos de Ea entre os aminoácidos N95 e T96 do Eb. Em ge- ral, a proteína precursora pode incluir um oligossacarídeo covalentemente ligado a uma cadeia lateral do aminoácido da proteína precursora, tal como uma cadeia lateral da arginina da proteína precursora.

Em adição, um resíduo da proteína precursora pode ser substitu- ido por um aminoácido não natural (por exemplo, um que inclui um grupo acetileno ou azido). Tais aminoácidos não naturais podem facilitar a ligação de uma porção poli(etileno glicol) a uma cadeia lateral da proteína precurso- ra, apesar de estratégias de peguilação de proteína típicas serem bem co- nhecidas na técnica.

A proteína precursora pode adicionalmente incluir um ou mais peptídeos E adicionais ligados ao término C da proteína precursora. Por e- xemplo, um polipeptíaeo pode inciuir, ao término N ao término C, (1) uma proteína precursora com IGF-1 tendo um primeiro peptídeo Eb, onde G1, P1 e E1 são apagados, ou R36 ou R37 ou ambos são mudados, R71 e S72 são apagados, e os últimos sete aminoácidos de terminal C do primeiro peptídeo Eb são apagados; (2) um segundo peptídeo Eb1 onde R71, S72 e os últimos sete aminoácidos de terminal C do segundo peptídeo Eb são apagados; (3) um terceiro peptídeo Eb, onde R71, S72 e os últimos sete aminoácidos de terminal C do terceiro peptídeo Eb são apagados; e (4) um quarto peptídeo Eb, onde R71 e S72 são apagados.

Um meio eficaz de impedir a clivagem do peptídeo E a partir de IGF-1 é o apagamento ou mutação de R71 ou S72.

Similarmente, a invenção inclui uma proteína precursora com IGF-2 humana onde a clivagem do peptídeo E a partir de IGF-2 por uma pro- tease é reduzida por modificação da proteína precursora. Em particular, o apagamento ou mutação de R68 ou D69 pode ser um meio eficaz de evitar a digestão de protease da proteína precursora com IGF-2.

Em adição, qualquer peptídeo E de IGF-1 pode ser combinado com um IGF-2 e qualquer peptídeo E de IGF-2 pode ser combinado com IGF-1 para fornecer os benefícios descritos aqui.

A invenção adicionalmente inclui um método de tratar uma do- ença músculo-esquelética, diabetes, morte de células neuronais através da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptí- deo da invenção. Igualmente, a invenção inclui o uso de um polipeptídeo da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença músculo-esquelética, diabetes, morte de células neuronais, ou ane- mia.

Em outra modalidade, a invenção inclui um IGF-1 peguilado sem um peptídeo E1 mas tendo introduzido neste um aminoácido não natural co- mo o sítio de peguilação. Qualquer do IGF-1 peguilado modificado contendo um aminoácido não natural como descrito aqui, sem um peptídeo E, é tam- bém incluído na invenção.

A invenção também inclui métodos veterinários e usa de admi- nistrar uma quantidade efetiva do polipeptídeo da invenção para obter um efeito desejado.

Os usos veterinários incluem (i) melhorar a taxa e/ou extensão de crescimento em um animal, (ii) melhorar a eficiência de sua conversão de alimentação em tecido corporal, (iii) melhorar a produção de leite em animais lactentes, (iv) tratar sintomas prejudiciais aos animais associados com ca- quexia, trauma, ou outras doenças de consumo, e (v) tratar animais Iacten- tes para melhorar a saúde neonatal.

Todas as referências citadas ou documentos são aqui incorpo- radas por referência. Breve Descrição dos Desenhos

As Figs. 1A-1C são Western blots de polipeptídeos da invenção e precursor IGF-1 tipo selvagem depois de incubação de zero horas ou 16 horas na presença ou ausência de 10% de soro humano em 37e C. Os veto- res de expressão codificando várias construções de IGF-1 foram transfecta- dos em células Cos7, e o meio de cultura condicionado obtido. O "3mut" re- fere-se a um precursor de peptídeo hlGF-1 tendo os seguintes três conjuntos de modificações: apagamento de G1, P2 e E3; mutação de Arg 37 a Ala (R37A); e apagamento de R71 e S72. A Fig. 1A mostra os resultados de Western blot (usando anticorpo para IGF-1) para o precursor 3mut e tipo sel- vagem contendo Ea. A Fig. 1B mostra os resultados de Western blot (usan- do anticorpo para hlGF-1) para o precursor 3mut e tipo selvagem contendo Eb. A Fig. 1C mostra os resultados de Western blot (usando anticorpo para hlGF-1) para o precursor 3mut e tipo selvagem contendo Ec.

As Figs. 2A-2D são gráficos lineares que mostram a atividade biológica de vários polipeptídeos de IGF-1 ("ligantes"). A atividade biológica foi medida por estimulação de mioblastos C2C12 com polipeptídeos expres- sos com Cos7. As células C2C12 estimuladas foram então ensaiadas para as quantidades relativas de AKT total e AKT fosforilado. Long-R3-IGF-1 é um reagente comercialmente disponível (Sigma Product No. 1-1271) que consiste da seqüência de aminoácidos de IGF-1 humano maduros, com uma mutação de E3R e um peptídeo de extensão de terminal N de 13 aminoáci- dos. A Fig. 2A mostra a atividade de IGF-1 -Ea3mut. A Fig. 2B mostra a ativi- dade de IGF-1-Eb3mut. A Fig. 2C mostra a atividade de IGF-1 -Ea3mut, que é uma construção 3mut na qual os aminoácidos de Ea 93 a 102 foram inse- ridos entre os aminoácidos 95 e 96 de Eb. A Fig. 2D mostra a atividade de IGF-1-Ec3mut.

As Figs. 3A-3D e 4A-4D são gráficos lineares que mostram se polipeptídeos precursores IGF-1 da invenção mantêm seletividade para o receptor apropriado ensaiando a fosforilação de receptor em resposta à liga- ção de ligante. As Figs. 3A e 3B testam a seletividade de receptor de IGF-1- Ea3mut contra o receptor IGF-1 (Fig. 3A) e o receptor de insulina (Fig. 3B). As Figs. 3C e 3D testam a seletividade de receptor de IGF-1-Eb3mut contra o receptor de IGF-1 (Fig. 3C) e o receptor de insulina (Fig. 3D). As Figs. 4A e 4B testam a seletividade de receptor de IGF-1 -Ec3mut contra o receptor de IGF-1 (Fig. 4A) e o receptor de insulina (Fig. 4B). As Figs. 4C e 4D testam a seletividade de receptor de IGF-1-Ea3mut contra o receptor de IGF-1 (Fig. 4C) e o receptor de insulina (Fig. 4D). "IGF1-R3" refere-se ao Long-R3-IGF-1 descrito acima. O polipeptídeo listado como "IGFlEab" refere-se à constru- ção na qual aminoácidos 93 a 102 de Ea foram inseridos entre os aminoáci- dos 95 e 96 de Eb.

A Fig. 5 é um Western blot que mostra fosforilação de AKT rela- tiva mediante estímulo de miotubos C2C12 (como um resultado de 3 a 4 du- as de diferenciação de miócitos C2C12) por diferentes ligantes. O multímero IGF-1 Eb refere-se à construção esquematicamente mostrada na Fig. 6A.

As Figs. 6A e 6B são representações esquemáticas de dois dos polipeptídeos da invenção. A Fig. 6A mostra um polipeptídeo precursor IGF- 1 -Eb com quatro conjuntos de modificações: apagamento de G1, P2 e E3; mutação de R37 para A; apagamento de R71 e S72; e apagamento os últi- mos sete aminoácidos de terminal C. Em adição, o polipeptídeo é alongado pela adição de dois mais peptídeos Eb (mas sem R71 e S72 e sem os últi- mos sete aminoácidos de terminal C) e a adição de um peptídeo Eb final (mas sem R71 e S72) no término C do polipeptídeo. Essa construção é fre- qüentemente referida como o multímero IGF-1-Eb. A Fig. 6B mostra um poli- peptídeo precursor IGF-1-Eab com quatro conjuntos de modificações: apa- gamento de G1, P2, e E3; mutação de R37 para A; apagamento de R71 e S72; e inserção de aminoácidos Ea 93 a 102 entre os aminoácidos 95 e 96 e Eb.

A Fig. 7A é um alinhamento em seqüência do IGF-1 humano (ID SEQ NO:1) com IGF-1 de animal correspondente. Todas as espécies ani- mais analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes para a seqüência são dados. G1, P2, E3 é conservado em todas as espécies analisadas exceto Sterlet (onde S2 substitui P2). R36 e R37 são conserva- dos em todas as espécies analisadas.

A Fig. 7B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparadas ao IGF-1 humano (ID SEQ NO:1). A- baixo da árvore está uma escala indicando o número de "Substituições de Aminoácidos" por 100 resíduos para seqüências de proteína. A fórmula de distância Kimura é usada para calcular valores de distância, derivados do número de combinações mal sucedidas não lacunas e corrigida para substi- tuições silenciosas. Os valores computados são o número médio de diferen- ças por sítio e estão entre zero e 1. Zero representa a identidade completa e 1 representa nenhuma identidade. A escala de árvore filogenética usa esses valores multiplicados por 100.

A Fig. 8A é um alinhamento de seqüência do peptídeo Ea hu- mano (ID SEQ NO:2) com vários peptídeos Ea animais. Todas as espécies animais analisadas e seus números de acesso no GenBank corresponden- tes para a seqüência são dados. R71 e S72 são conservados em todas as espécies analisadas. A Fig. 8Β é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparadas ao peptídeo IGF-1 Ea humano (ID SEQ NO:2).

A Fig. 9A é um alinhamento de seqüência do peptídeo Eb hu- mano (ID SEQ NO:3) com vários peptídeos Eb animais. Todas as espécies analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes para a seqüência são dados. R71 e S72 são conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 9B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparado ao peptídeo Eb IGF-1 humano (ID SEQ NO:3).

A Fig. 10A é um alinhamento de seqüência do peptídeo Ec hu- mano (ID SEQ NO:4) com vários peptídeos Ec animais. Todas as espécies analisadas e seus números de acesso no GenBank correspondentes para a seqüência são dados. R71 e S72 são conservados em todas as espécies analisadas.

A Fig. 10B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparado ao peptídeo Ec IGF-1 humano (ID SEQ NO:4).

A Fig. 11A é um alinhamento de seqüência do IGF-2 humano (ID SEQ NO:7) com IGF-2 animal correspondente. Todas as espécies analisa- das e seus números de acesso no GenBank correspondentes para a se- qüência são dados. R68 é conservado em todas as espécies analisadas; D69 é conservado exceto para chipanzés, onde a histidina reside nessa po- sição.

A Fig. 11B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparado ao peptídeo IGF-2 humano (ID SEQ NO:7).

A Fig. 12A é um alinhamento de seqüência do peptídeo E de IGF-2 humano (ID SEQ NO:6) com vários peptídeos E de IGF-2 correspondentes. Todas as espécies analisadas e seus números de acesso no GenBank cor- respondentes para a seqüência são dados. R68 é conservado em todas as espécies analisadas; D69 é conservado exceto para chipanzés, onde a histi- dina reside nessa posição.

A FIG. 12B é um gráfico que mostra a filogenia das seqüências de aminoácidos analisadas comparado ao peptídeo E de IGF-2 humano (ID SEQ NO:6).

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a novos polipeptídeos precursores IGF-1 e IGF-2 contendo substancialmente um peptídeo E que foi modificado para prevenir, reduzir ou evitar a clivagem de protease típica responsável por Iibe- rar o IGF-1 ou o IGF-2 ativo de seus peptídeos Ε. A utilidade dos polipeptí- deos da invenção é baseada na descoberta surpreendente que tais polipep- tídeos precursores são biologicamente ativos, estáveis e benéficos como farmacêuticos.

Triagem para Polipeptídeos Precursores IGF Ativos

A utilidade de qualquer polipeptídeo da invenção pode ser avali- ada usando os seguintes ensaios.

Estabilidade - Um polipeptídeo da invenção deveria ter suficien- te estabilidade na presença de proteases endógenas, tal como em soro hu- mano, para ser um fármaco eficaz. Para avaliar a estabilidade, um vetor de expressão codificando o polipeptídeo pode ser transfectado em células Cos7 (ATCC) em um meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, e 100 pg/ml de estreptomicina. O meio de cultura contendo poli- peptídeos secretados pode ser aplicado para análise adicional, ou na alter- nativa, o vetor de expressão pode codificar prontamente rótulos disponíveis, tais como um rótulo hexa-histidina, no polipeptídeo para facilitar a purificação eficiente dos polipeptídeos expressos nas culturas de Cos7. Entretanto pre- parada, a amostra de polipeptídeo é incubada em soro humano normal (Sigma) ou em PBS para vários momentos (por exemplo, 0, 1, 5, 10, e 16 horas), submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida, manchado em nitrocelulose, e as proteínas relevantes visualizadas usando um anticorpo primário contra IGF-1 ou IGF-2 humano e um anticorpo secundário, por e- xemplo, conjugado para horseradish peroxidase. Qualquer número de técni- cas de blotting e detecção similares, algumas usando corantes fluorescentes ou até radionuclídeos, podem ser usados. A intensidade da faixa do precur- sor contra a intensidade da faixa de IGF-1 ou IGF-2 deveria indicar o grau no qual o polipeptídeo precursor é clivado sob várias condições. Um polipeptí- deo da invenção que é exposto a soro humano por 16 horas em 37° C pode exibir uma relação do precursor não clivado para IGF maduro clivado de a- proximadamente 1:2 a 1:0,1, por exemplo, aproximadamente 1:1 a 1:0,5, particularmente uma relação de aproximadamente 1:1 ou uma relação de aproximadamente 1:0,5. Tipicamente, o precursor deveria exibir uma relação de pelo menos 1:1.

Fosforilação de AKT - Um polipeptídeo da invenção deveria manter a capacidade de sinalizar através do receptor de IGF-1. (Ambos os sinais de IGF-1 e IGF-2 através do receptor de IGF-1). Para determinar essa capacidade de sinalização, um pode avaliar se um alvo intracelular fluxo a- baixo, AKT, é fosforilado em resposta a ligação de Iigante na superfície da célula. Para análise de fosforilação de AKT, mioblastos C2C12 são exauri- dos em meio livre de soro e então estimulados com diferentes ligantes. As células são Iisadas e clareadas por centrifugação. A fosforilação de AKT e níveis totais de AKT são analisados por ELISA usando kit ELISA de sanduí- che de AKT fosforilado PathScan (ser473) e kit ELISA de sanduíche de AKT PathScan (Sinalização Celular), respectivamente.

Especificidade de Receptor de IGF-1 - Um polipeptídeo da in- venção preferencialmente mantém a especificidade para o receptor de IGF-1 e deveria ligar ao receptor de insulina relacionada com baixa afinidade. Para avaliar a especificidade de receptor, as amostras de polipeptídeo são adicio- nadas a células NIH3T3 exauridas em soro sobrexpressando o receptor de IGF-1 ou o receptor de insulina, e o nível de fosforilação de receptor de IGF- 1 ou fosforilação de receptor de insulina é determinado através de Iise das células e submetendo os Iisatos a ELISA usando o receptor de IGF-1 fosfori- lado humano IC DuoSet e kit ELISA de receptor de insulina (R&D Systems).

Teste In Vivo de Hipertrofia em Modelos de Ratos - Para deter- minar se um polipeptídeo da invenção pode agir para aumentar a massa músculo-esquelética sob um contexto que já leva a hipertrofia muscular, um pode submeter animais tratados e não tratados a exercício e determinar se os animais que estão recebendo o polipeptídeo desenvolveram músculos maiores do que os animais não tratados.

Modelo de Exercício

Um modelo conhecido na técnica é baseado no uso de uma ro- da giratória voluntária com cargas variáveis por usuário (ver, por exemplo, Konhilas e outros, Am J Physiol Heart Circ Physiol 289:H455-H465, 2005). A roda em gaiola voluntária elimina insultos físicos e psicológicos que são co- muns em modelos de exercícios forçados, e são, portanto, mais apropriados para avaliar fármacos candidatos que são usados em indivíduos relativa- mente saudáveis nos quais o aumento da massa muscular é desejável.

Qualquer rato adequado pode ser usado. Por exemplo, ratos machos C57BI/6J podem ser aleatoriamente atribuídos a grupos experimen- tais (por exemplo, recebendo polipeptídeo precursor IGF) e grupos de con- trole. Animais são individualmente alojados em uma gaiola contendo uma roda de exercício; animais de controle sedentários são alojados em gaiolas idênticas sem uma roda. As rodas de exercício são descritas em Allen e ou- tros, J Appl Physiol 90:1900-1908, 2001. Brevemente, o sistema consiste de uma roda de diâmetro 11,5 cm com uma superfície de corrida de 5,0 cm de largura (modelo 6208, Petsmart, Phoenix, AZ) equipada com um contador magnético digital (modelo BC 600, Sigma Sport, Olney, IL) que é ativado pela rotação da roda. Em adição, cada roda é elaborada com um mecanismo de resistência permitindo ajustamento da carga. Isso é executado conectan- do linha de pesca de aço inoxidável ao topo da gaiola e enrolando o fio em torno de uma polia imóvel que é fixada à roda na gaiola no eixo de rotação, tal como para não contribuir para a carga da roda. O fio é novamente fixado ao topo da gaiola com uma mola e parafuso. Esse projeto permite ajustes finos da carga da roda, que é regularmente distribuído por toda a rotação da roda. Valores de exercício diário para corrida por tempo e distância são gra- vados para cada animal exercitado por toda a duração do período de exercí- cio. A todos os animais é dada água e comida dura padrão para roedores à vontade. A corrida voluntária (exposição à roda de gaiola) pode iniciar em uma idade média de aproximadamente 12 semanas para todos os grupos. Cada grupo continua a correr sob resistência variada, dependendo do grupo experimental, por 50 dias até que os animais estão com aproximadamente 19 semanas de idade. A carga na roda é determinada pendurando pesos conhecidos na roda até que esta seja levemente deslocada. Todos os gru- pos de exercício iniciam sem carga na roda da gaiola pela primeira semana. Entretanto, a condição "sem carga" é realmente 2 g, que é determinada co- mo a carga necessária para manter inércia na roda e carga de atrito. Consi- dera-se um período de aclimatização de roda de 1 semana, as cargas de roda podem ser alteradas em intervalos de uma semana, exceto para cargas mais altas, que podem ser alteradas depois de 2 semanas. A faixa de cargas pode ser qualquer de 2 g até 12 g. Os animais de controle exercitados e se- dentários são submetidos à eutanásia por deslocamento cervical sob anes- tesia inalada imediatamente depois do fim do período de exercício específi- co. A massa corporal é medida, e os músculos específicos são rapidamente cortados, lavados e congelados para ensaios histológicos ou bioquímicos em uma data futura.

Os modelos de hipertrofia de exercícios alternativos são tam- bém descritos ao técnico versado. Ver, por exemplo, o modelo de exercício em esteira descrito em Lerman e outros, J Appl Physiol 92:2245-2255, 2002.

Modelo de Injeção de Clembuterol

Clembuterol é um agonista β2^Γβηέ^ίοο com propriedades de promoção de crescimento que causam um aumento documentado em mas- sa muscular. O mecanismo preciso de ação de clembuterol permanece não claro, embora uma redução na degradação de proteína muscular tenha sido proposta. Na clínica, o clembuterol é usado como um fármaco anti-asma, mas ele parece ser na maior parte mal usado como um agente de constru- ção corporal para aumentar a massa muscular em ambos humanos e ani- mais.

Em cinco ratos é dada uma injeção diária de clembuterol (3 mg/kg, subcutânea (s.c.)) por 3, 7 ou 14 dias para induzir hipertrofia museu- lar. Ratos injetados com PBS servem como controle negativo. Os animais são monitorados diariamente (inspeção visual) por quaisquer reações adver- sas (isto é, revestimento revolto, letárgico) ao tratamento. O tratamento com clembuterol tem o potencial de tornar os ratos mais temerosos ou agressi- vos, então os ratos deveriam ser especialmente monitorados para luta se alojados em grupos. Os ratos são móveis, e podem comer e beber normal- mente. Os ratos são monitorados diariamente até que eles são submetidos à eutanásia no dia 3, 7 ou 14, e tecido coletado para análise posterior.

Teste In Vivo em Modelos de Atrofia Muscular - Em vários mo- delos de atrofia músculo-esquelético, um polipeptídeo precursor IGF da in- venção pode ser testado pela capacidade de manter massa muscular sob condições que geralmente reduzem a massa muscular. Com os modelos exemplificados descritos abaixo, o versado na técnica pode prontamente projetar e implementar experimentos controlados envolvendo a administra- ção e uso de polipeptídeos precursores IGF para determinar se tais polipep- tídeos podem aumentar a massa muscular.

Por exemplo, ratos machos C57BI6/2 são adquiridos a partir do The Jackson Laboratories. Os ratos são adquiridos tal que eles estão com aproximadamente 9 semanas no início de cada experimento. Geralmente, os ratos são alojados em gaiolas microisoladoras com comida de roedor nor- mal. No início de cada experimento, os ratos são pesados. No fim de cada experimento, geralmente os ratos são submetidos à eutanásia por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical, e tecidos musculares colhidos para processamento futuro. Os ratos são pesados para fornecer "peso cor- poral final". Os músculos esqueléticos que podem ser colhidos são o múscu- lo tibial anterior, o músculo extensor digitório longo, o músculo sóleo, e o músculo gastrocnêmio. Outros tecidos colhidos ocasionalmente são: cora- ção, fígado, baço, rins, testículos e cérebro. Todos os músculos e tecidos são completamente dissecados e pesados em um equilíbrio capaz de medi- ção para 0,0001 g. Os tecidos são então congelados por pressão em nitro- gênio líquido para extração de proteína e RNA futura, ou congelados por pressão embutidos em OCT em um disco de cortiça. Os músculos congela- dos em um disco de cortiça para futura criosecção são imersos em isopen- tano resíriado em uma graxa grossa por nitrogênio líquido. Todas as amos- tras são armazenadas em -80°C.

Tratamento com Dexametasona

Um método farmacológico de induzir desgaste muscular em ra- tos é injeção intraperitoneal diária com dexametasona em 20 mg/kg. A de- xametasona é um membro sintético da classe glicocorticóide de hormônios. Ela age como um aníiinílamatório e imunossupressor, com uma potência de aproximadamente 40 vezes a da hidrocortisona. A dexametasona é usada para tratar muitas condições inflamatórias e auto-imunes, por exemplo, artri- te reumatóide. É também dada a pacientes com câncer passando por quimi- oterapia, para neutralizar certos efeitos colaterais de seu tratamento anti- tumor. A dexametasona causa atrofia muscular ambos em ratos e em paci- entes humanos.

Os ratos são injetados de forma intraperitoneal (ip) com dexame- tasona por 3, 7 ou 14 dias. No dia terminal, os sujeitos são submetidos à eutanásia usando CO2, e os músculos das pernas colhidos. Os animais são monitorados diariamente (inspeção visual) por quaisquer reações adversas (isto é, revestimento revolto, letárgico) ao tratamento. Os ratos são usual- mente móveis, e podem comer e beber normalmente. Os ratos injetados com PBS são o controle negativo.

Imobilização com Gesso

O desuso físico de vários grupos de músculo resulta em atrofia desses músculos. A fixação da junção do tornozelo ("calcanhar preso" ou engessamento) tem se provado uma forma altamente útil e reproduzível de induzir imobilização física da musculatura dos membros traseiros de ratos e camundongos.

Os ratos são anestesiados com isofluorano para imobilização. As junções do tornozelo e joelho são fixas em 90 graus com um material de engessamento de peso leve (VET-LITE) em torno das junções. O material é remolhado em água morna e então enrolado em torno do membro, deixando os dedos e a junção do quadril livres. As junções são mantidas em posições de 90s até que o material de engessamento seca. A perna contralateral ser- ve como controle. Os ratos são então permitidos a se recuperarem da anes- tesia e alojados em gaiolas microisoladoras normais. O engessamento não foi observado como causando estresse excessivo, e os animais de movem livremente em torno da gaiola para se alimentarem e beberem. Os ratos são, entretanto, monitorados diariamente por quaisquer eventos adversos afetan- do-o peso corporal, atividade e irritações.

Lima vez que gesso é aplicado a um rato, o animal é monitorado diariamente para ter certeza de que o gesso permaneça no local, à medida que mastigação pode ocorrer. Os animais podem se mover, beber, e se ali- mentarem depois da recuperação da anestesia, e eles não exigem leito, en- gaiolamento ou outra assistência.

Desnervação

Geralmente, os ratos são anestesiados com gás isofluorano para desnervação. Usando procedimentos cirúrgicos assépticos (três lavagens de betadina com uma lavagem tinal de etanol), o nervo ciático direito é isolado no meio das coxas e um pedaço de 2 a 5 mm cortado. A perna contralateral serve como controle.

Mais especificamente, a incisão na pele é fechada com um grampo de sutura, e os animais injetados com uma única dose de buprenor- fina antes de serem permitidos a recuperação da anestesia. Três, sete ou 14 dias depois da cirurgia os animais são submetidos à eutanásia por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical, e os músculos (complexo gas- trocnêmio, tibial anterior, extensor digitório longo, sóleo) são removidos para análises histológica e bioquímica.

Dado que o nervo ciático é transectado, o membro afetado é fei- to imóvel para induzir atrofia músculo-esquelética dos músculos envolvidos.

O animal pode, de outra forma, se mover, beber, e se alimentar depois da recuperação da anestesia e ele não exigem leito, engaiolamento ou outra assistência especial. Todavia, os animais são monitorados imediatamente pós-cirurgia e através da recuperação (1-2 horas). Em adição, os sítios de incisão e a saúde geral do animal são monitorados por 3 dias pós-cirurgia. O grampo de sutura é removido de 7 a 10 dias depois da cirurgia.

Modelos Genéticos

Ratos transgênicos geneticamente manipulados podem também ser usados como modelos de atrofia muscular. Por exemplo, os assim cha- mados Mini Ratos (The Jackson Laboraíory, No. De Estoque 003258) con- têm uma mutação neutralizante no gene IGF-1 que resulta em crescimento pós-natal anormalmente diminuído, bem como baixo peso corporal e tama- nho. Para informação adiciona!, ver Powell-Braxton e outros, Genes Dev 7:2609-2617, 1993. Em adição, os assim chamados Midi Ratos (The Jack- son Laboratory, No. Estoque 003259) contêm uma mutação diferente no ge- ne IGF-1 que resulta em uma hipomorfia exibindo peso corporal adulto baixo e outros fenótipos cardiovasculares. Para informação adiciona, ver Lembo e outros, J Clin Invest 98:2648-2655, 1996.

Mutações ou Modificações Cruciais e Opcionais nos Precursores IGF

Mutações Cruciais - A invenção é baseada em parte na obser- vação de que um polipeptídeo precursor IGF que contém substancialmente seu peptídeo E permanece bioativo e estável na presença de soro. Para as- segurar que o peptídeo E não é clivado por proteases endógenas direciona- das ao sítio de protease dibásico, em geral qualquer um dos dois aminoáci- dos dibásicos de terminal N do peptídeo E no precursor é apagado, mudado ou de outra forma mascarado. No caso de hlGF-1, esses dois aminoácidos são R71 e S72, enquanto no caso de hlGF-2, esses primeiros dois aminoá- cidos são R68 e D69.

Uma variedade de modificações habilita esse impedimento de clivagem:

(1) Apagamento de um ou ambos os resíduos dibásicos

(2) Mutação de um ou ambos os resíduos dibásicos para um ami- noácido não básico, tal como alanina

(3) Inserção de um ou mais aminoácidos não básicos entre os resí- duos dibásicos

(4) Localizar um sítio de glicosilação próximo o suficiente aos resí- duos dibásicos para mascarar o sítio de protease

(5) Peguilação direcionada a sítio usando substituição de ou resíduo dibásico, ou inserção próxima ou entre os resíduos dibásicos, com um ami- noácido não natural, como descrito abaixo.

Em adição, os resíduos K68 e K65 parecem executar uma fun- ção na clivagem de peptídeo E/IGF-1; conseqüentemente, mutações ou a- pagamentos desses resíduos podem ser incorporados em qualquer tática direcionada aos aminoácidos dibásicos como descrito acima.

Mutações no término N de IGF Maduro - Em certas modalidades da invenção, os polipeptídeos precursores IGF têm apagamentos ou muta- ções dos primeiros poucos aminoácidos de terminal N. No caso de IGF-1, quaisquer dos primeiros três aminoácidos de terminal N podem ser apaga- dos ou mudados. Observou-se que certos aminoácidos de terminal N são naturalmente clivados in vivo, e a introdução dessas mutações ou apaga- mentos minimiza as associações in vivo dos polipeptídeos da invenção com proteínas de ligação de IGF (IGFBPs). A interação de IGF-1 e IGF-2 com o receptor de IGF-1 é regulada por IGFBPs. Todos os seis IGFBPs foram mos- trados como inibindo a ação de IGF (particularmente IGFBP5), mas em al- guns casos um efeito estimulante foi observado. Pelo menos 99% do IGF na circulação é normalmente ligado a IGFBPs. O IGFBP mais abundante na circulação depois do período neonatal é IGFBP3 que pode ligar ambos IGF- 1 e IGF-2 com afinidades similares. O IGF-1 truncado naturalmente ocorren- do (apagamento de ligação de G1, P2 e E3) se liga a IGFBP3 com a afinida- de várias vezes menor do que IGF-1 natural. Em adição, G3 é importante para ligação de IGFBP, e G6 executa uma função similar no peptídeo IGF-2.

Conseqüentemente, no caso do precursor hlGF-1, qualquer do G1, P2 ou E3 pode ser apagado ou mudado ou sozinho ou em combinação. Quando uma mutação é desejada, uma mutação para alanina pode ser in- troduzida. Em outro exemplo, no caso de precursor hlGF-2, qualquer um de P4, S5 e E6 pode ser apagado ou mudado sozinho ou em combinação. Quando uma mutação é desejada, uma mutação para alanina pode ser in- troduzida. Mutações de Resíduos 36 e 37 - IGF-1 pode ser clivado por proteases de serina presentes no soro humano. A mutação de ou R36 ou R37 para A pode impedir a clivagem de IGF-1 nesse sítio de clivagem predi- to entre R36 e R37. No caso de hlGF-2, R38 pode ser mudado ou apagado para impedir essa clivagem perigosa.

Uso de Glicosilação - A meia vida in vivo dos polipeptídeos da invenção pode ser melhorada pela adição de sítios de glicosilação ligados a N em ou o IGF ou as partes de peptídeo E do precursor quando expressos em células de mamíferos ou outras células eucarióticas capazes de glicosi- lação ligada a N. Mostrou-se in vitro que Ea IGF-1 humano é glicosilado em N92 e N100, à medida que essas partes de Ea se ajustam à seqüência de glicosilação ligada a N consenso de N-X-S/T, onde X pode ser qualquer a- minoácido e o terceiro aminoácido do tripleto é ou S ou T. Sabe-se também que o contexto de aminoácido adjacente do consenso afetará o quão forte- mente a asparagina é glicosilada. Portanto, uma estratégia para introduzir um sítio de glicosilação em Eb ou Ec é inserir aminoácidos Ea em torno da seqüência consenso em aproximadamente a mesma parte de Eb ou Ec. Uma implementação particular dessa estratégia é ilustrada nos Exemplos abaixo. Em qualquer evento, qualquer outro sítio de glicosilação ligado a N consenso, incluindo aminoácidos de contexto círcundantes, conhecidos pe- los versados na técnica pode ser inserido em um polipeptídeo precursor da invenção. Em adição, a glicosilação ligada a O de um polipeptídeo da inven- ção pode ser executada escolhendo o hospedeiro particular usado para a produção do polipeptídeo. Por exemplo, o uso de certas cepas de levedura para expressão de IGF-1 resulta na adição de oligossacarídeos em uma se- rina ou treonina. Ver, por exemplo, Patente US No. 5,273,966.

Adição de Poli(etileno glicol) - Conjugação para poli(etileno gli- col) (PEG; peguilação) têm provado ser benéficas em prolongar a meia vida de fármacos de proteínas terapêuticas. Espera-se que a peguilação dos po- lipeptídeos precursores IGF da invenção possa resultar em vantagens far- macêuticas similares. Os métodos de peguilação de IGF-1 são bem conhe- cidos na técnica. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2006/0154865, que descreve as propriedades benéficas de IGF-1 monope- guilado com lisina. Tal monopeguilação com Iisina pode ser adaptada para os polipeptídeos IGF precursores da invenção. Em adição, a peguilação po- de ser alcançada em qualquer parte de um polipeptídeo da invenção pela introdução de um aminoácido não natural. Certos aminoácidos não naturais podem ser introduzidos pela tecnologia descrita em Deiters e outros, J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang e Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang e outros, Science 292:498-500, 2001; Zhang e outros, Science 303:371-373, 2004 ou na Patente US No. 7,083,970. Brevemente, alguns desses sistemas de expressão envolvem mutagênese direcionada a sítio para introduzir um códon sem sentido, tal como um TAG âmbar, na estrutura de leitura aberta codificando um polipeptídeo da invenção. Tais vetores de expressão são então introduzidos em um hospedeiro que pode utilizar um tRNA específico para o códon sem sentido introduzido e carregado com o aminoácido não natural de escolha. Aminoácidos não naturais particulares que são benéficos para o propósito de conjugar porções dos polipeptídeos da invenção incluem aqueles com cadeias laterais de acetileno e azido. Os polipeptídeos precursores IGF contendo esses novos aminoácidos podem então ser peguilados nesses sítios escolhidos na proteína. Em adição, tais moléculas de IGF peguiladas sem o peptídeo E são também úteis como te- rapêuticos.

Multímeros de Peptídeos E - Em certos contextos farmacológi- cos, é benéfico aumentar o tamanho de um fármaco de peptídeo ou proteína para assegurar que o fármaco permaneça em uma lateral da barreira san- gue-cérebro ou a outra. Visto que as moléculas de IGF maduras são relati- vamente peptídeos curtos, mesmo se o peptídeo E permanece conectado, pode ser benéfico aumentar o tamanho dos polipeptídeos da invenção. Um meio de fazer isso é fornecer multímeros de peptídeos E no término C do polipeptídeo precursor IGF, como ilustrado em certos Exemplos descritos abaixo.

Apagamento em terminal C de Peptídeos E - Suspeita-se que a cisteína livre na posição 81 de Eb pode resultar em homodimerização ou outros efeitos que, quando presentes nos polipeptídeos da invenção, devem levar a fármacos de menor atividade. Em um exemplo particular, o apaga- mento dos últimos sete aminoácidos de Eb (isto é, aminoácidos 81-87) é benéfico.

Outras Mutações ou Modificações - Mutações ou modificações adicionais de IGF que podem ser incorporadas nos polipeptídeos precurso- res IGF da invenção são descritas na Patente US No. 5,077,276; e Patente US Publicações de Pedidos Nos. 2005/0287151, 2006/0211606, e 2006/0166328.

A invenção deveria ser construída, em adição a IGF-1 e IGF-2 humano, para incluir todas as seqüências de IGF-1 ou IGF-2 precursor de animal não humano conhecidas e desconhecidas contendo substancialmen- te seu peptídeo E onde a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou redu- zida de acordo com modificações da presente invenção.

O tipo preferencial de IGF a ser usado depende das espécies do indivíduo que está sendo tratado.

É preferencial que o IGF seja combinado com a espécie, por e- xemplo, quando uma vaca está sendo tratada, o tipo preferencial de IGF é IGF bovino.

Embora todas as formas de IGF provavelmente tenham um efei- to em diferentes indivíduos devido às altas homologias de seqüência, a combinação com a espécie evitará complicações imunológicas adversas po- tenciais originadas da indução de uma resposta imune a um IGF a partir de uma espécie diferente.

Em uma modalidade da invenção, seqüências de IGF-1 precur- sor de animal não humano modificadas são fornecidas.

Seqüências de IGF-1 precursor são preferenciais contendo substancialmente seu peptídeo E onde a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou reduzida de acordo com modificações da presente invenção a partir de um animal vertebrado.

Por exemplo, tais seqüências incluem, mas não estão limitadas a seqüências de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, ovelha, cabra, pássaro, cachorro, gato, peixe e seus similares, a partir de qualquer fonte se natural, sintética ou recombinante.

Em outra modalidade da invenção, as seqüências de IGF-2 pre- cursor de animal não humano modificadas são fornecidas.

Seqüências de IGF-2 precursor são preferenciais contendo substancialmente seu peptídeo E onde a clivagem normal do peptídeo E é evitada ou reduzida de acordo com modificações da presente invenção a partir de um animal vertebrado.

Por exemplo, tais seqüências incluem, mas não estão limitadas a seqüências de um camundongo, rato, vaca, porco, cavalo, ovelha, cabra, pássaro, cachorro, gato, peixe e seus similares, a partir de qualquer fonte se natural, sintética ou recombinante.

Uso Terapêutico de Polipeptídeos Precursor IGF

Indicações - A invenção também inclui o uso de um polipeptídeo precursor IGF da invenção na fabricação de um medicamento para o trata- mento ou prevenção de uma doença músculo-esquelética. Em adição, a in- venção inclui o uso de polipeptídeos precursores IGF para aumentar a mas- sa muscular ou óssea em um indivíduo, se ou não tal indivíduo está em risco de doença músculo-esquelética ou tem a doença.

Em particular, a doença músculo-esquelética pode ser atrofia muscular. Há muitos casos de atrofia muscular, incluindo como um resultado de tratamento com um glicocorticóide tal como cortisol, dexametasona, be- tametasona, prednisona, metilprednisolona, ou prednisolona. A atrofia mus- cular pode também ser um resultado de desnervação devido a trauma do nervo ou um resultado de neuropatia degenerativa, metabólica ou inflamató- ria (por exemplo, síndrome de Guillian-Barré, neuropatia periférica, ou expo- sição a toxinas ou drogas ambientais). Em adição, a atrofia muscular pode ser um resultado de uma doença do neurônio motor adulto, atrofia muscular espinhal infantil, atrofia muscular espinhal juvenil, neuropatia motora auto- imune com bloco condutor multifocal, paralisia devido a derrame ou lesão na corda espinhal, imobilização esquelética devido a trauma, descanso na ca- ma prolongado, inatividade voluntária, inatividade involuntária, estresse me- tabólico ou insuficiência nutricional, câncer, AIDS, jejum, rabdomiólise, uma desordem na glândula tiróide, diabetes, hipotonia congênita benigna, doença do núcleo central, miopatia nemalínica, miopatia miotubular (centronuclear), lesão do nascimento, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença do fígado, sepsia, falha renal, insuficiência cardíaca congestiva, ou envelhecimento.

A doença músculo-esquelética pode também ser uma síndrome de distrofia muscular, tai como Duchenne, Becker, miotônica, fáscioescapu- loumeral, Emery-Deifuss, óculofaringeal, escapuloumeral, do tipo cinturas, uma distrofia muscular congênita, ou miopatia distai hereditária. A doença músculo-esquelética pode também ser osteoporose, uma fratura no osso, estatura curta, ou nanismo.

O IGF-1 é sugerido como um tratamento para diabetes insensível a insulina, já que IGF-1 pode também ligar heterodímeros de receptor de IGF-1 e receptor de insulina. Conseqüentemente, os polipeptídeos da inven- ção podem ser usados para tratar diabetes.

O IGF-1 é neurotrófico e aumenta a sobrevivência dos neurônios. Sugeriu-se que IGF-1 pode ser usado para tratar casos de morte dos neurô- nios motores tal como visto em esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia cerebral, envelhecimento, e demência. Conseqüentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados para tratar condições associadas com morte neuronal, tal como ALS, atrofia cerebral, ou demência.

O IGF-1 aumenta ambas as populações de células sangüíneas brancas e vermelhas e tem um efeito aditivo à administração de eritropoieti- na. Conseqüentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados para tratar anemia.

Já que IGF-1 e IGF-2 são reguladores ubíquos e essenciais de divisão celular e crescimento vertebrado, eles podem ser vantajosamente usados em uma variedade de métodos veterinários para melhorar exogena- mente ou manter o crescimento em um animal. Alguns exemplos incluem, mas não estão limitados a:

(i) Melhorar a taxa e/ou extensão de crescimento em um animal, por exemplo, melhorar o crescimento muscular em suínos, gado, aves e pei- xes;

(ii) Melhorar a eficiência de sua conversão de alimentação em tecido corporal (relação magra para gordo), por exemplo, em suínos, ga- do, ovelhas, aves e peixes; e

(iii) Melhorar a produção de leite em animais lactantes, por exemplo, gado leiteiro, ovelhas, cabras.

Outras aplicações terapêuticas veterinárias incluem, mas não es- tão limitadas a:

(iv) Tratar sintomas prejudiciais a animais associados com caquexia, trauma ou outras doenças de consumo, por exemplo, em animais de companhia tal como cachorros, gatos, e cavalos; e

(v) Tratar animais lactantes para melhorar saúde neonatal, por exemplo, porcas lactantes para melhorar o desempenho neonatal.

Métodos de Administração - Os polipeptídeos da invenção po- dem ser liberados em uma variedade de formas, incluindo o uso de veículos de liberação de gene. Métodos conhecidos na técnica para a liberação tera- pêutica de agentes tais como proteínas ou ácidos nucléicos, podem ser usa- dos para a liberação terapêutica de um polipeptídeo da invenção, por exem- plo, transfecção celular, terapia de gene, administração direta com um veícu- lo de liberação, ou carreador farmaceuticamente aceitável, liberação indireta fornecendo células recombinantes contendo um ácido nucléico codificando o polipeptídeo.

Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usa- dos para administrar o polipeptídeo da invenção, por exemplo, encapsula- mento em lipossomos, micro-partículas, micro-cápsulas, células recombinan- tes capazes de expressar a proteína, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987), construção de um ácido nucléico como parte de um vetor retroviral, adenoviral associado, adenoviral, poxviral (por exemplo, avípoxviral, particularmente poxviral de galinhas) ou outro vetor, etc. Os métodos de introdução podem ser enterais ou parenterais e incluem, mas não estão limitados a vias intradérmica, in- tramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural e oral. Os polipeptídeos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de linhagens epiteliais ou mucocutâneas (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administradas junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistê- mica ou local. Em adição, pode ser desejável introduzir as composições far- macêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via ade- quada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; injeção intraventricuíar pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, conectado a um reservatório, tal como um reservatório Ommaya. A administração pulmo- nar pode também ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossol.

Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente à área em necessi- dade de tratamento; isso pode ser alcançado, por exemplo, e não por limita- ção, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter, ou por meio de um implante, o implante sendo de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membra- nas, tais como membranas silásticas, fibras ou substitutos de pele comerciais.

Em outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em uma vesícula, em particular, um Iipossomo (ver Langer, Science 249:1527-1533, 1990). Em ainda outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em um sistema de liberação controlado. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada. Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (ver Howard e outros, J Neurosurg 71:105, 1989). Em outra modalidade onde o agente ativo da invenção é um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover expressão de sua proteína codificada, construindo-a como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrando-o tal que ele se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (ver, por e- xemplo, Patente US No. 4,980,286), ou por injeção direta, ou pelo uso de bombardeamento com micro-partículas (por exemplo, dispositivo de biobalís- tica; Biolística, Dupont), ou revestimento com lipídeos ou receptores de su- perfície celular ou agentes transíectantes, ou administrando-o em ligação com um peptídeo tipo homeobox que é conhecido por entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliot e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868, 1991), etc. Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intrace- Iularmente e incorporado dentro do DNA celular do hospedeiro para expres- são, por recombinação homóloga.

Transfecção Celular e Terapia de Genes - A presente invenção abrange o uso de ácidos nucléicos codificando polipeptídeos da invenção para transfecção de células in vitro e in vivo. Esses ácidos nucléicos podem ser inseridos em qualquer de um número de vetores bem conhecidos para transfecção de células alvo e organismos. Os ácidos nucléicos são transfec- tados em células ex vivo e in vivo, através da interação do vetor e da célula alvo. As composições são administradas (por exemplo, por injeção em um músculo) a um indivíduo em uma quantidade suficiente para obter uma res- posta terapêutica.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar um sítio alvo, isto é, uma célula alvo ou tecido, em um humano ou outro animal incluindo transfectar uma célula com um ácido nucléico codificando um poli- peptídeo da invenção, onde o ácido nucléico inclui um promotor induzido operacionalmente ligado ao ácido nucléico codificando o polipeptídeo de fu- são direcionada. Para procedimentos de terapia de genes no tratamento ou prevenção de doenças humanas, ver, por exemplo, Van Brunt Biotechnology 6:1149-1154,1998.

Terapias de Combinação - Em numerosas modalidades, os poli- peptídeos da presente invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais compostos ou terapias adicionais. Por exemplo, múltiplos polipeptídeos podem ser co-administrados em conjunto com um ou mais compostos terapêuticos. A terapia de combinação pode abranger adminis- tração simultânea ou alternada. Em adição, a combinação pode abranger administração aguda ou crônica. Os polipeptídeos da invenção podem ser administrados em combinação com agentes anabólicos tais como testoste- rona ou moduladores específicos de receptor de androgênio (SARMs). Os agente anabólicos adicionais incluem hormônio do crescimento (GH) ou mo- léculas que incluem liberação de GH. A grelina é particularmente útil em uma terapia de combinação para caquexia, já que a grelina pode causar um au- mento no apetite. Em uma veia similar, os polipeptídeos da invenção podem ser combinados com suplementos de proteína para aumentar o anabolismo, ou combinados com terapia física ou exercício para aumentar o peso corpo- ral. Qualquer molécula que inibe miostatina é também um candidato para terapia de combinação.

Composições Farmacêuticas - A presente invenção também for- nece composições farmacêuticas compreendendo uma proteína precursora com IGF da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulató- ria do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopéia Norte- Americana ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em ani- mais ou humanos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Tais carrea- dores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tal como água e óleos, in- cluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e seus simi- lares. Os excípientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, Iac- tose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado se- co, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e seus similares. A composição, se desejada, pode também conter menores quantidades de agentes umectan- tes ou emulsificantes, ou agentes tampão de pH. Essas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsu- las, pós, formulações de liberação sustentada e seus similares. A composi- ção pode ser formulada como um supositório, com Iigantes tradicionais e carreadores tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreado- res padrão tal como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, esteara- to de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. E- xemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em "Re- mingtorVs Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

Em algumas modalidades, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Onde necessário, a com- posição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como lidocaína para aliviar a dor no sítio da injeção. Onde a composição é administrada por infusão, ela pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida tal que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.

Os polipeptídeos da invenção podem ser formulados como for- mas neutras ou em sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aque- les formados com grupos amino livres tal como aqueles derivados de ácido hidroclórico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com grupos carboxila livres tal como aqueles derivados de hidróxido de só- dio, de potássio, de amônio, de cálcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

A quantidade de um polipeptídeo da invenção que será efetiva no tratamento de uma condição ou doença pode ser determinada por técnicas clínicas padrão baseadas na presente descrição. Em adição, ensaios in vitro podem opcionalmente ser empregados para auxiliar a identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração, e a seriedade da condição, e deveria ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e cada circunstância do indivíduo. Entretanto, as faixas de dosagem adequadas para administração intravenosa são geralmente aproximadamente 20 - 5000 microgramas de composto ativo por quilograma de peso corporal. As faixas de dosagem a- dequadas para administração intranasal são geralmente aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta a dose derivadas de sistemas de teste de modelo animal ou in vitro. Em particular, um regime de dosagem possível pode ser aproximadamente 60 a 120 pg/kg de peso cor- poral, injeção subcutânea, duas vezes ao dia.

Usos Veterinários

Em adição aos métodos mencionados acima de administração em humanos, pode haver considerações adicionais para administração vete- rinária.

A dosagem pode diferir quando administrado a um animal saudá- vel versus aqueles animais sofrendo de uma doença. Uma avaliação da do- sagem apropriada pode ser facilmente feita por aqueles versados na técnica usando ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, o ensaio de prolifera- ção de mioblasto (Exemplo 79) ou o ensaio de tecido epitelial mamário (E- xemplo 80) como descrito abaixo. Ensaios gerais para medir IGF são tam- bém conhecidos na técnica, tal como aqueles no Exemplo 81.

Os versados na técnica reconhecerão que algumas espécies de animal exibem fertilidade sazonal influenciada pelo comprimento do fotoperí- odo. Qualquer modalidade de um método ou uso veterinário pode opcional- mente incluir iniciar o método de tratamento em um tempo específico dentro do ciclo reprodutivo do animal de modo a alcançar o efeito desejado. Os ver- sados na técnica saberão que o estado e ciclo reprodutivo podem facilmente ser determinado, e, se desejado, sincronizados pelo uso de um regime apro- priado.

Quando usado para indicações veterinárias, em adição a méto- dos previamente mencionados para uso humano, o peptídeo IGF-1 ou IGF-2 da presente invenção pode também ser usado como uma administração o- ral, ou um suplemento para alimentação oral ou sólida a animais.

A invenção é adicionalmente descrita, mas não limitada pelos se- guintes Exemplos.

Exemplos

Exemplo 1

O vetor de expressão de DNA codificando o polipeptídeo precur- sor de hlGF-1 Ea contendo as seguintes modificações foi construído: apa- gamento de G1, apagamento de P2, e apagamento de E3; mutação de R37 para A; e apagamento de R71 e apagamento de S72. Essas mutações são às vezes referidas como "3mut" por toda a presente descrição. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:8)

As células Cos7 (disponíveis a partir da ATCC) foram mantidas em DMEM contendo 10% de soro bovino fetal, 100U/ml de penicilina, e 100 pg/ml de estreptomicina e localizadas em uma densidade de 1 χ 106 células por placa de 10 cm. Essas culturas de células foram transfectadas com 8 pg de plasmídeo de expressão usando Fugene (Roche) de acordo com as ins- truções do fabricante. Vinte e quatro horas pós-transfecção, as células foram lavadas uma vez e cultivadas em meio livre de soro por 48 horas. Sobrena- dantes foram coletados e armazenados em -80°C.

De modo a avaliar a estabilidade do peptídeo em soro humano, sobrenadantes coletados a partir das células Cos7 transfectadas com hlGF- 1Ea tipo selvagem (wt), e hlGF-1Ea3mut foram incubados por 16 horas em 37°C ou na ausência ou na presença de 10% de soro humano (Sigma). As amostras foram separadas por 18% de SDS-PAGE, e imunoblotting foi exe- cutada usando anticorpo policlonal de cabra em IGF-1 humano. Os resulta- dos na Fig. 1A indicam que, enquanto o hlGF-1Ea wt foi substancialmente degradado depois de incubação com soro por 16 horas, o hlGF-1Ea3mut foi estabilizado. Densitometria indicou que a relação de IGF-1 não clivado para clivado foi aproximadamente 1:6,2, enquanto a relação para hlGF-1Ea3mut foi aproximadamente 1:0,68, mostrando que essas mutações resultam em um polipeptídeo estabilizado.

Para confirmar que o hlGF-1Ea3mut foi capaz de sinalizar atra- vés do IGF-1 R, a fosforilação de AKT de células em contato com o polipeptí- deo foi medida. C2C12 foram adquiridas a partir de ATCC e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alta glicose (Invitro- gen) contendo 10% de soro bovino fetal (AMIMED), 100U/ml de penicilina (Invitrogen), e 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen) e 2 mM de glutamina (Invitrogen). Para análise de fosforilação de AKT, as células C2C12 foram laminadas em uma densidade de 0,15 χ 10^6 células por cavidade de uma placa de 6 cavidades e foram cultivadas em meio de crescimento por 72 ho- ras. As células foram exauridas por quatro horas em meio livre de soro e então estimuladas com diferentes Iigantes em 379 C por 30 minutos. As célu- las foram Iisadas com tampão PhosphoSafe (sinalização celular) contendo vários inibidores de protease e clareadas por centrifugação em 14.000 χ g por 15 minutos em A- C. A fosforilação de AKT e os níveis de AKT totais fo- ram analisador por ELISA usando kit ELISA de sanduíche de fosfo-AKT Pa- thScan (Ser473) e kit ELISA de sanduíche de AKT PathScan (Sinalização Celular), respectivamente. Os resultados da fosforilação de AKT são resumi- dos na Fig. 2A, que indica que o hlGF-1Ea3mut foi capaz de ativar o cami- nho celular de IGF-1 R a uma extensão similar como o reagente de controle positivo long-R3-IGF-1 e o recombinante IGF-1. Em adição, os dados na Fig. 5 diretamente mostram que o hlGF-1Ea3mut levou à forforilação de AKT.

A seguir, para assegurar que a especificidade do receptor do hlGF-1Ea3mut permaneceu com o IGF-1R, vários ligantes foram adiciona- dos às culturas de NIH3T3 sobrexpressando ou IGF-1R ou receptor de insu- lina (InsR). Essas células foram cultivadas sob as mesmas condições como descrito acima para células Cos7. Para análise de fosforilação de IGF-1R e InsR, células NIH3T3-IGF1R e NIH3T3-lnsR foram laminadas em uma den- sidade de 0,2 χ 10^6 células por cavidade de uma placa de 6 cavidades e fo- ram cultivadas em meio de crescimento por 24 horas. As células foram exau- ridas por 18 horas em meio livre de soro e então estimuladas com diferentes ligantes em 37°C por 10 minutos. As células foram Iisadas como descrito acima para o experimento com AKT, e os níveis de fosforilação de IGF-1R e InsR foram analisados por ELISA usando kit ELISA IGF1R fosforilado e InsR fosforilado humano DuoSet IC (R&D Systems). Os resultados resumidos nas Figs. 3A e 3B indicam que esse polipeptídeo precursor com IGF-1 retém es- pecificidade para o receptor de IGF-1 e deveria ligar-se ao receptor de insu- lina relacionado com baixa afinidade. Exemplo 2

O vetor de expressão de DNA codificando o polipeptídeo precur- sor de hlGF-1 Eb contendo as seguintes mutações foi construído: apaga- mento de G1, apagamento de P2, e apagamento de E3; mutação de R37 para A; e apagamento de R71 e apagamento de S72 (isto é, o "3mut"). Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgíyínkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aecrgkkgk (ID SEQ NO:9)

O polipeptídeo foi ensaiado de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. 1B e o uso de densitometria indicaram que a relação de IGF-1 não clivado para clivado foi aproximadamente 1:9, enquanto a relação para hlGF-1Eb3mut foi aproximadamente 1:1, mostrando que essas modificações resultam em um polipeptídeo estabilizado. A Fig. 2B indica que o hlGF-1Eb3mut foi capaz de ativar o caminho celular do IGF-1R para uma extensão similar ao reagente de controle positivo long-R3-IGF-1 e o IGF-1 recombinante. Em adição, os dados na Fig. 5 diretamente mostram que o hlGF-1Eb3mut levou à fosforilação de AKT. Os resultados resumidos nas Figs. 3C e 3D indicam que esse polipeptídeo precursor com IGF-1 retém especificidade para o receptor de IGF-1 e deveria ligar-se ao receptor de insulina relacionado com baixa afinidade.

Exemplo 3

O vetor de expressão de DNA codificando o polipeptídeo precur- sor de hlGF-1-Ec contendo as seguintes mutações foi construído: apaga- mento de G1, apagamento de P2, e apagamento de E3; mutação de R37 para A; e apagamento de R71 e apagamento de S72 (isto é, o "3mut"). Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpa ksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ N0:10)

O polipeptídeo foi ensaiado de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. 1C e o uso de densitometria indicaram que a relação de IGF-1 não clivado para clivado foi aproximadamente 1:5, enquanto a relação para hlGF-1Ec3mut foi aproximadamente 1:0,96, mos- trando que essas modificações resultam em um polipeptídeo estabilizado. A Fig. 2D indica que o hlGF-1Ec3mut foi capaz de ativar o caminho celular do IGF-1R para uma extensão similar ao reagente de controle positivo long-R3- IGF-1 e o IGF-1 recombinante. Em adição, os dados na Fig. 5 diretamente mostram que o hlGF-1Ec3mut levou à fosforilação de AKT. Os resultados resumidos nas Figs. 4A e 4B indicam que esse polipeptídeo precursor com IGF-1 retém especificidade para o receptor de IGF-1 e deveria ligar-se ao receptor de insulina relacionado com baixa afinidade.

Exemplo 4

O vetor de expressão de DNA codificando o polipeptídeo precur- sor quimérico de hlGF-1-Eab contendo as seguintes modificações ao peptí- deo hlGF-1-Eb foi construído: apagamento de G1, apagamento de P2, e a- pagamento de E3; mutação de R37 para A; e apagamento de R71 e apaga- mento de S72 (isto é, o "3mut"); e inserção de aminoácidos 93 a 102 de Ea entre aminoácidos 95 e 96 de Eb. A inserção cria um suposto sinal de glico- silação ligado a N. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkp aksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkk keqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:11)

O polipeptídeo foi ensaiado de acordo com alguns dos procedi- mentos descritos no Exemplo 1 acima. A Fig. 2C indica que o hlGF- 1Eab3mut foi capaz de ativar o caminho celular do IGF-1 R para uma exten- são similar ao reagente de controle positivo long-R3-IGF-1 e o IGF-1 recom- binante. Os resultados resumidos nas Figs. 4C e 4D indicam que esse poli- peptídeo precursor com IGF-1 retém especificidade para o receptor de IGF-1 e não ativa o receptor de insulina.

Exemplo 5

O vetor de expressão de DNA codificando o polipeptídeo precur- sor multímero de hlGF-1-Eb contendo as seguintes mutações foi construído: apagamento de G1, apagamento de P2, e apagamento de E3; apagamento de R36, apagamento de R37, apagamento de R71, apagamento de S72, apagamento dos últimos sete aminoácidos de Eb de terminal C; e inserção do término C desse precursor de dois peptídeos Eb adicionais ambos sem o R71 e S72 e os últimos sete aminoácidos de terminal C e um quarto e final peptídeo Eb sem o R71 e S72. A Fig. 6A mostra um desenho esquemático dessa construção. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnae rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaer svraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaers vraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecr gkkgk (ID SEQ NO:12)

Esse peptídeo foi submetido a um ensaio de fosforilação de AKT como descrito no Exemplo 1. A Fig. 5 indica que esse multímero de hlGF-1- Eb foi capaz de sinalizar através do caminho de IGF-1R.

Exemplo 6

O polipeptídeo precursor de hlGF-1-Eb da invenção como mos- trado esquematicamente na Fig. 6B pode ser expresso. Essa construção contém as seguintes modificações: apagamento de G1, apagamento de P2, apagamento de E3, apagamento de R36, apagamento de R37, apagamento de R71, apagamento de S72; e a inserção de aminoácidos 93 a 102 de Ea entre aminoácidos 95 e 96 de Eb1 desse modo criando um sítio de glicosila- ção ligado a N na posição N92 e N100. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpak savraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkke qrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:13) Exemplo 7

O polipeptídeo precursor de hlGF-2-Ε da invenção tendo as se- guintes modificações pode ser expresso: apagamento de P4, apagamento de S5, e apagamento de E6; mutação de R38 para A; e apagamento de R68 e apagamento de D69. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secre- tada: ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletycatpaksev stpptvlpdníprypvgkfíqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahgg appemasnrk (ID SEQ N0:14)

Exemplo 8

O polipeptídeo precursor de hlGF-1-Ea da invenção tendo as se- guintes mutações pode ser expresso: apagamento de G1 e apagamento de P2; mutação de-E3 para X, onde X é um aminoácido não natural que é pe- guilado; mutação de R37 para A; e apagamento de R71 e apagamento de S72. Isso resulta na seguinte seqüência de proteína secretada:

Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplk paksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:15)

Exemplos 9 - 78 (Δ = apagamento)

9) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvegdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpaksasvraqr htdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO: 16)

10) hlGF-1-Ea: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvegdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpaksarvraqrh tdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO: 17)

10) hlGF-1-Ea: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvegdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpaksavraqrht dmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:18)

11) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpaksasvraqr htdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:19)

12) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ N0:20)

13) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrht dmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:21)

14) hlGF-1-Ea: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrht dmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:22)

15) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyínkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtd mpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:23)

16) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:24)

17) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:25)

18) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:26)

19) hlGF-1-Eb: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; àS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:27)

20) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:28)

21) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:29)

22) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NQ:30) 23) hlGF-1-Eb: ΔG1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ N0:31)

24) hlGF-1 -Ec: ΔG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:32)

25) hlGF-1-Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:33)

26) hlGF-1-Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71, Δ572 tlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:34)

27) hlGF-1-Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ2; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:35)

28) hlGF-1-Ec: Δΰ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:36)

29) hlGF-1 -Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgstteerk (ID SEQ NO:37)

30) hlGF-1-Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3, ΔΗ37, AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksasvraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:38)

31) hlGF-1-Ec: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3, àR37, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:39)

32) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71; inserção de aa 93-102 de Ea entre aa 95 e 96 de Eb (isto é, "Eab")

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (ID SEQ Ν0:40)

33) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqr htdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (ID SEQ N0:41)

34) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, AR71 tlegaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrht dmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aecrgkkgk (ID SEQ NO:42)

35) hlGF-1-Eab: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; àS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsm aecrgkkgk (ID SEQ NO:43)

36) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrh tdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aecrgkkgk (ID SEQ NO:44)

37) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3, AR37, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgíyfnkplgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrht dmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aecrgkkgk (ID SEQ NO:45)

38) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsm aecrgkkgk (ID SEQ NO:46)

39) hlGF-1-Eab: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3, àR37, AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtd mpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrna ecrgkkgk (ID SEQ NO:47)

40) hlGF-1 -Ea: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:48) 41) hlGF-1-Eb: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:49)

42) multímero de hlGF-1-Eb: (ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpkt qkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ N0:50)

43) multímero de hlGF-1-Eb: (ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:51)

44) hlGF-1-Ec: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:52)

45) hlGF-1-Ea: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:53)

46) hlGF-1-Eb: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkg k (ID SEQ NO:54)

47) multímero de hlGF-1-Eb: (AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpkt qkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:55)

48) multímero de hlGF-1-Eb: (ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC- term 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:56)

49) hlGF-1-Ec: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstíeerk (ID SEQ NO:57)

50) hlGF-1-Ea: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:58)

51) hlGF-1-Eb: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkg k (ID SEQ NO:59)

52) hlGF-1 -Ec: ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ N0:60)

53) hlGF-1-Eab: ΔΕ3; R37A; Δ R71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigs rnaecrgkkgk (ID SEQ N0:61)

54) multímero de hlGF-1-Eb: (ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, àS72, AC- term 7 aa)-Eb(AR71, AS72)

gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyínkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraq rhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:62)

55) hlGF-1-Ea: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavra qrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:63)

56) hlGF-1-Eb: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavra qrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkk gk (ID SEQ NO:64)

57) hlGF-1 -Ec: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavra qrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:65)

58) hlGF-1-Eab: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavra qrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreig srnaecrgkkgk (ID SEQ NO:66)

59) multímero de hlGF-1-Eb: (E3A; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC- term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavra qrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:67)

60) hlGF-1 -Ea: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:68) 61) hlGF-1-Eb: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccírscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:69)

62) hlGF-1 -Ec: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:181)

63) hlGF-1-Eab: ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqívcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (ID SEQ N0:70)

64) multímero de hlGF-1-Eb: (ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr

15 htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:71)

65) hlGF-1-Eb: AG1, ΔΡ2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (ID SEQ NO:72)

66) hlGF-1-Ee: AG1, ΔΡ2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:73)

67) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naecrgkkgk (ID SEQ NO:74)

68) multímero de hlGF-1-Eb: (AG1, ΔΡ2; E3X; R37A)-3xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeergkkgk (ID SEQ NO:75)

69) hlGF-1-Ea: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdlrrlemyeaplkpaksaXvraqr htdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (ID SEQ NO:76)

70) hlGF-1-Eb: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdlrrlemyeaplkpaksaXvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeergkkgk (ID SEQ NO:77)

71) hlGF-1-Ee: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlegaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeecfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (ID SEQ NO:78)

72) hlGF-1-Eab: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdlrrlemyeaplkpaksaXvraqr htdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr naeergkkgk (ID SEQ NO:79)

73) multímero de hlGF-1-Eb: (AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-Eb(AR71; S72X; AC-term 7 aa)-2xEb(AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpakXsavraqr htdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeergkkgk (ID SEQ N0:80)

74) hlGF-1-Ea: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72; N92X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdecefrscdlrrlemyeaplkpaksavraqrht dmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm (ID SEQ N0:81)

75) hlGF-1-Eb: AG1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72; C142X tlcgaelvdalqívcgdrgíyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasIqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (ID SEQ NO:82)

76) hlGF-1-Eab: ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A; AR71, AS72; C151X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrn aeXrgkkgk (ID SEQ NO:83)

78) multímero de hlGF-1-Eb (ΔΘ1, ΔΡ2, ΔΕ3; R37A)-3xEb(AR71, àS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72; C71X) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrht dmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtd mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpkt qkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasIqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (ID SEQ NO:84)

Exemplo 79: Ensaio de Proliferação de Mioblasto O ensaio de proliferação de mioblasto fornece um indicador in vitro confiável de atividade de IGF e é usado como um modelo para fatores afetando mioblastos embrionários e células satélite adultas. Os fatores ativos nesse sistema se comportam similarmente em culturas primárias de mioblas- tos. O aperfeiçoamento de proliferação de mioblasto in vitro por um peptídeo dessa invenção indica sua atividade causando proliferação de mioblasto aumentada e, portanto, um aumento no número final de miofibras no útero.

Em adição, aperfeiçoamento similar de proliferação de mioblastos indica que os peptídeos desta invenção podem ser usados para melhorar a hipertrofia muscular em adultos, por exemplo, via estimulação de proliferação de célula muscular satélite.

Exemplo 80: Ensaio com Tecido Epitelial Mamário

Em animais lactantes, a quantidade de tecido epitelial mamário é um fator Iimitante na produção de leite, à medida que essas são as células que produzem e secretam leite. Empregando em sistemas in vitro, as células epiteliais obtidas a partir de glândulas mamarias de animais podem ser esti- muladas pelo IGF-1 ou IGF-2 modificado da presente invenção para prolife- rar e produzir quantidades aumentadas de constituintes do leite. Pode ser adicionalmente demonstrado que as células epiteliais mamárias estimuladas para proliferar em um tal sistema de célula in vitro podem ser re-implantadas em pads de gordura mamária clareadas e ser estimuladas para proliferar e/ou produzir leite em animais fêmeas lactantes.

Exemplo 81: Medição de IGF-1 ou IGF-2 em Sangue e Outros Fluidos Corporais

A quantidade efetiva de peptídeo administrada parenteralmente por dose pode ser medida por uma curva de resposta a dose. Por exemplo, os peptídeos IGF modificados da invenção podem ser medidos no sangue ou fluidos corporais do indivíduo a ser tratado para determinar a dosagem. Alternativamente, um pode administrar quantidades aumentadas do peptídeo ao indivíduo e verificar os níveis de soro do indivíduo para IGF-1 e IGF-2 modificado. A quantidade de peptídeo a ser empregado pode ser calculada em uma base molar com base nesses níveis de soro de IGF-1 ou IGF-2 mo- dificado.

Um método para determinar dosagem apropriada do peptídeo confere medir um peptídeo IGF da invenção em um fluido biológico tal como um fluido corporal ou sangüíneo. Medir tais níveis pode ser feito por qual- quer meio, incluindo RIA e ELISA. Depois de medir os níveis de IGF, o fluido é contatado com o peptídeo usando doses únicas ou múltiplas. Depois des- sa etapa de contato, os níveis de IGF são re-medidos no fluido. Se os níveis de IGF no fluido caíram por uma quantidade suficiente para produzir a eficá- cia desejada para a qual a molécula é administrada, então a dose da molé- cula pode ser ajustada para produzir eficácia máxima. Esse método pode ser executado in vitro ou in vivo. Preferencialmente, esse método é executado in vivo, isto é, depois que o fluido é extraído de um indivíduo e os níveis de IGF medidos, o peptídeo aqui é administrado ao mamífero usando doses únicas ou múltiplas (ou seja, a etapa de contato é alcançada por administração a um animal), e então os níveis de IGF são re-medidos a partir do fluido extra- ído do animal. Outro método para determinar a dosagem é usar anticorpos ao peptídeo ou outro método de detecção para o peptídeo no formato LIFA. Exemplo 82: Farmacocinética In Vivo de hlGF-1-Ec3mut Ratos machos adultos (n = 3/grupo) receberam uma injeção de bolus intravenosa (i.v.) de rhlGF-1 em 1 mg/kg, e hlGF-1-Ec3mut (descrito no Exemplo 3) em 1,55 mg/kg. Os espécimes sangüíneos seriais foram cole- tados em 5, 15, 30 e 60 minutos depois de administração de material teste. As concentrações de soro de rhlGF-1 e hlGF-1-Ec3mut foram administradas por ELISA. Esse ensaio é específico para hlGF-1.

Doses equimolares de rhlGF-1 e hlGF-1-Ec3mut foram adminis- tradas i.v. em ratos. Os resultados mostram níveis significativamente mais altos da proteína hlGF-1-Ec3mut se comparado com rhlGF-1 em todos os pontos no tempo examinados, indicando que o hlGF-1-Ec3mut é metaboli- camente mais estavel do que IGF-1 longo de 70 aminoacidos.

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Claims (26)

1. Polipeptídeo compreendendo uma proteína precursora IGF-1 humana, onde a clivagem do peptídeo E a partir de IGF-1 por uma protease é reduzida por modificação da proteína precursora.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína precursora compreende o peptídeo Ea.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína precursora compreende o peptídeo Eb.

4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, onde os últimos sete aminoácidos de terminal C de Eb são apagados.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína precursora compreende o peptídeo Ec.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde G1 da proteína precursora é apagado ou mudado.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores , onde P2 da proteína precursora é apagado ou mudado.

8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde E3 da proteína precursora é apagado ou mudado.

9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde R36 da proteína precursora é apagado ou mudado.

10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, onde R36 é mudado para alanina.

11. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, onde R37 da proteína precursora é apagado ou mudado.

12. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, onde R37 é mudado para alanina.

13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, adicionalmente compreendendo a seqüência consenso de glicosilação ligada a N NXS/T.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, adicionalmen- te compreendendo aminoácidos 93-102 de Ea inseridos entre os aminoáci- dos N95 e T96 do Eb.

15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, adicionalmente compreendendo um oligossacarídeo cova- lentemente ligado a uma cadeia lateral de aminoácido da proteína precursora.

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, onde o oli- gossacarídeo é covalentemente ligado a uma cadeira lateral de arginina da proteína precursora.

17. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, onde um resíduo da proteína precursora é substituído por um aminoácido não natural.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 17, onde o ami- noácido não natural compreende um grupo acetileno ou azido.

19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, adicionalmente compreendendo uma porção poli(etileno glicol) covalentemente ligado a uma cadeia lateral da proteína precursora.

20. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, adicionalmente compreendendo um peptídeo E adicional ligado ao término C da proteína precursora.

21. Polipeptídeo compreendendo, do término N ao término C, uma proteína precursora IGF-1 compreendendo um primeiro peptídeo Eb, onde G1, P1 e E1 são apagados, R36 e R37 são apagados, R71 e S72 são apagados, e os últimos sete aminoácidos de terminal C do primeiro peptídeo Eb são apagados; um segundo peptídeo Eb, onde R71, S72, e os últimos sete ami- noácidos de terminal C do segundo peptídeo Eb são apagados; um terceiro peptídeo Eb, onde R71, S72, e os últimos sete ami- noácidos de terminal C do terceiro peptídeo Eb são apagados; e um quarto peptídeo Eb, onde R71 e S72 são apagados.

22. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, onde R71 ou S72 da proteína precursora é apagado ou muda- do.

23. Polipeptídeo compreendendo uma proteína precursora IGF-2 humana, onde a clivagem do peptídeo E de IGF-2 por uma protease é redu- zida por modificação da proteína precursora.

24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 23, onde R68 ou D69 da proteína precursora é apagado ou mudado.

25. Método para tratar uma doença músculo-esquelética, diabe- tes, morte de células neuronais, ou anemia, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de qualquer reivindicação anterior a um indivíduo.

26. Uso do polipeptídeo de qualquer das reivindicações 1 a 24 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença músculo-esquelética, diabetes, morte de células neuronais, ou anemia.