MX2008015657A - Polipeptidos de factor de crecimiento similares a insulina estabilizados. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con polipéptidos estabilizados que tienen una secuencia IGF-1 o IGF-2 y una secuencia de péptido E, en donde se evita la división fisiológica natural del péptido E del IGF.

Description

POLIPÉPTIDOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILARES A INSULINA ESTABILIZADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con polipéptidos estabilizados que tienen una secuencia IGF-1 o IGF-2 y una secuencia de péptido E. En las composiciones de la invención, se evita la división normal del péptido E a partir del IGF-1 mediante la mutación o eliminación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los factores de crecimiento similares a insulina (IGF) son parte de un sistema complejo que las células utilizan para comunicarse con su ambiente fisiológico. Este sistema complejo (a menudo referido como los ejes de factor de crecimiento similares a insulina) consiste de dos receptores de superficie celular (IGF-1R y IGF-2R) , dos ligandos (IGF-1 y IGF-2) , una familia de seis proteínas de unión IGF de alta afinidad (IGFBP 1-6) , y enzimas que degradan IGFBP asociadas (proteasas) . Este sistema no es sólo importante para la regulación de la fisiología normal sino que también para un cierto número de estados patológicos (Glass, Nat Cell Biol 5:87-90, 2003) . Los ejes IGF se han mostrado por jugar un papel en la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la muerte celular (apoptosis) . El IGF-1 se secreta principalmente por el hígado como un resultado de la estimulación mediante la hormona de crecimiento humana (hGH) . Casi cada célula en el cuerpo humano se afecta por el IGF-1, especialmente las células en los músculos, cartílagos, huesos, hígado, riñon, nervios, piel y pulmones. Además a los efectos similares a insulina, en IGF-1 también puede regular el crecimiento celular. El IGF-1 y IGF-2 se regulan por una familia de productos de gen conocidos como las proteínas de unión IGF. Estas proteínas ayudan a modular la acción del IGF en formas complejas que involucran inhibir la acción IGF al evitar la unión de los receptores IGF así como también promover la acción IGF a través de suministro de ayuda a los receptores e incrementar la vida media del IGF en el torrente sanguíneo. Existen por lo menos seis proteínas de unión caracterizadas (IGFBP1-6) . En su forma madura, el IGF-1 humano (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptg ygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksa; SEQ ID NO:l), también llamado somatomedina, es una proteína pequeña de 70 aminoácidos que ha demostrado estimular el crecimiento de un amplio rango de las células en el cultivo. La proteína madura se codifica inicialmente mediante tres ARNm variantes de empalme conocidos. El cuadro de lectura abierto de cada ARNm codifica una proteína precursora que contiene el IGF-1 de 70 aminoácidos y un péptido E particular en el terminal C, que depende del IGF-1 ARNm particular. Estos péptidos E se han llamado los péptidos Ea (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO: 2) , Eb ( rsvraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; SEQ ID NO: 3), y Ec (rsvraqrhtdm pktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; SEQ ID NO: 4) y varían de 35 a 87 aminoácidos de longitud y abarcan una región de secuencia común en el terminal N y una región de secuencia variable en el terminal C. Por ejemplo, el cuadro de lectura abierto para el IGF-l-Ea codifica un polipéptido de 105 aminoácidos (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivde ccfrscdlrrlemycaplkpaksa rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO: 5). En la expresión fisiológica, los péptidos E se dividen del precursor mediante proteasas endógenas para proporcionar el IGF-1 de 70 aminoácidos maduro conocido por ser bioactivo. En ciertos contextos, se conocen uno a tres de los aminoácidos de terminal N de IGF-1 por estar divididos bajo condiciones fisiológicas, produciendo IGF-1 activo entre 67-70 aminoácidos. La expresión del gen IGF-2 y el procesamiento se caracterizan por atributos similares excepto que sólo un péptido E (rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakele afreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEQ ID NO: 6) para IGF-2 humano se ha identificado para el precursor de 156 aminoácidos (ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlall etycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrar rghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEQ ID NO: 7) . El IGF-1 y IGF-2 aparecen por ser candidatos de fármaco pobres, debido a que estas proteínas se degradan rápidamente por proteasas endógenas en el suero de los pacientes. Una estrategia que se ha contemplado es estabilizar el IGF-1 como un fármaco para formar un complejo con una de sus proteínas de unión.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el hecho de que un precursor de la proteína IGF-1 o IGF-2 que contiene sustancialmente su péptido E se bioactiva y se estabiliza en la presencia de suero, que resulta en un polipéptido IGF-1 o IGF-2 que es útil como un farmacéutico. En las composiciones de la invención, se evita la división normal del péptido E a partir del IGF-1, por ejemplo, mediante la mutación o eliminación de la arginina en la posición 1 o la serina en la posición 2 de los péptidos E (que corresponde a las posiciones 71 y 72 en el IGF-1 precursor intacto) . En el IGF-2, se evita la división, por ejemplo, mediante la mutación o eliminación de la arginina en la posición 1 o el ácido aspártico en la posición 2 del péptido E (que corresponde a las posiciones 68 y 69 en el IGF-2 precursor intacto) . Otras modificaciones de una proteína precursora IGF pueden evitar o reducir esta división.

Además, modificaciones adicionales de la secuencia de aminoácidos precursora IGF-1 puede conferir beneficios farmacéuticos adicionales. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden exhibir afinidad incrementada para el receptor IGF-1 o disminución de la capacidad de unión a una proteína de unión IGF-1 o IGF-2 inhibidora.

Para motivo de claridad y consistencia, la numeración de los residuos de aminoácido en los precursores IGF-1 o IGF-2 o proteínas maduras a través de esta solicitud y en las reivindicaciones se basa en la numeración de secuencia de proteína precursora intacta sin péptido de señal .

De acuerdo con lo anterior, la invención incluye un polipéptido que contiene una proteína precursora IGF-1, en donde el péptido E de división de IGF-1 mediante una proteasa se reduce por la modificación de la proteína precursora. El péptido E puede ser el péptido Ea, Eb, o Ec . En el terminal N del precursor, aminoácidos Gl, P2 , o E3 de la proteína precursora se pueden eliminar o mutar, como lo puede hacer el R36 (por ejemplo, R36A) y R37 (por ejemplo, R37A) .

La proteína precursora puede incluir adicionalmente la secuencia NXS/T consenso de glicosilación ligada a N, por ejemplo mediante inserción de 93-102 aminoácidos de Ea entre los aminoácidos N95 y T96 del Eb. En general, la proteína precursora puede incluir un oligosacárido ligado covalentemente a una cadena lateral de aminoácido de la proteína precursora, tal como una cadena lateral arginina de la proteína precursora.

Además, un residuo de la proteína precursora se puede reemplazar por un aminoácido no natural (por ejemplo, uno que incluye un grupo acetileno o azido) . Tales aminoácidos no naturales pueden facilitar el ligado de un grupo funcional poli (etilenglicol) a una cadena lateral de la proteína precursora, a través de estrategias de pegilación de proteína típicas que son bien conocidas en la técnica.

La proteína precursora puede incluir adicionalraente uno o más péptidos E adicionales ligados al terminal C de la proteína precursora. Por ejemplo, un polipéptido puede incluir, del terminal N al terminal C, (1) una proteína precursora IGF-1 que tiene un primer péptido Eb, en donde se eliminan Gl, Pl, y El, R36 o R37 o ambos se mutan, se eliminan R71 y S72, y se eliminan los últimos siete aminoácidos de terminal C del primer péptido Eb; (2) un segundo péptido Eb, en donde se eliminan R71, S72, y los últimos siete aminoácidos de terminal C del segundo péptido Eb; (3) un tercer péptido Eb, en donde se eliminan R71, S72, y los últimos siete aminoácidos de terminal C del tercer péptido Eb; y (4) un cuarto péptido Eb, en donde se elimina R71 y S72.

Unos medios efectivos para evitar división del péptido E del IGF-1 es la eliminación o mutación de R71 o S72.

De forma similar, la invención incluye una proteína precursora IGF-2 en donde la división del péptido E del IGF-2 por una proteasa se reduce mediante modificación de la proteína precursora. En particular, la eliminación o mutación de R68 o D69 puede ser un medio efectivo de evitar digestión de proteasa de la proteína precursora IGF-2.

Además, cualquier péptido E de IGF-1 se puede combinar con un IGF-2 y cualquier péptido E de IGF-2 se puede combinar con IGF-1 para proporcionar los beneficios descritos aquí.

La invención incluye adicionalmente un método para tratar una enfermedad musculoesquelética, diabetes, muerte de células neuronales al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención. En forma similar, la invención incluye el uso de un polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad musculoesquelética, diabetes, muerte de células neuronales, o anemia.

En otra modalidad, la invención incluye un IGF-1 pegilado sin un péptido E pero que tiene introducido allí un aminoácido no natural como el sitio de pegilación. Cualquiera del IGF-1 pegilado, modificado que contiene un aminoácido no natural como se describe aquí, sin un péptido E, se incluye también en la invención.

La invención también incluye métodos veterinarios y usos para administrar una cantidad efectiva del polipéptido de la invención para obtener un efecto deseado.

Los usos veterinarios incluyen (i) mejorar la proporción y/o grado de crecimiento en un animal, (ii) mejorar la eficiencia de su conversión de alimento en tejido corporal, (iii) mejorar la producción de leche en animales lactantes, (iv) tratar síntomas de deterioro en animales asociados con caquexia, trauma, u otras enfermedades de consumo, y (v) tratar animales lactantes para mejorar en la salud neonatal.

Todas las referencias o documentos citados se incorporan por lo tanto como referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1C son inmunotransferencias de polipéptidos de la invención y precursor IGF-1 intacto después de cero o 16-horas de incubación en la presencia O ausencia de 10 % de suero humano a 37° C. Los vectores de expresión que codifican varias construcciones IGF-1 se transfectan en células Cos7, y el medio de cultivo condicionado obtenido. El "3mut" se refiere a un precursor de péptido hIGF-l-E que tiene los siguientes tres conjuntos de modificaciones: eliminación de Gl, P2 , y E3 ; mutación de Arg 37 a Ala (R37A) ; y eliminación de R71 y S72. La figura 1A muestra los resultados de inmunotransferencia (utilizando anticuerpo para IGF-1) para el precursor 3mut e intacto que contiene Ea. La figura IB muestra los resultados de inmunotransferencia (utilizando anticuerpo para hIGF-1) para el precursor 3mut e intacto que contiene Efc>. La figura 1C muestra los resultados de inmunotransferencia (utilizando anticuerpo para hIGF-1) para el precursor 3mut e intacto que contiene Ec.

Las figuras 2A-2D son gráficas de línea que muestran la actividad biológica de varios polipéptidos IGF-1 ( "ligandos" ) . La actividad biológica se mide mediante estimulación de mioblastos C2C12 con polipéptidos que expresan Cos7. Las células C2C12 estimuladas luego se ensayan para las cantidades relativas de AKT total y AKT fosforilado. El -R3-IGF-1 largo es un reactivo comercialmente disponible (Sigma Product No. 1-1271) que consiste de la secuencia de aminoácido humana IGF-1 madura, con una mutación E3R y un péptido de extensión de 13 aminoácido de terminal N. La figura 2A muestra la actividad de IGF-1-Ea3mut . La figura 2B muestra la actividad de IGF- 1-Eb3mut . La figura 2C muestra la actividad de IGF-1-Eab3mut , que es una construcción 3mut en la que los aminoácidos Ea 93 a 102 se insertan entre aminoácidos 95 y 96 de Eb. La figura 2D muestra la actividad de IGF-1-Ec3mut .

Las figuras 3A-3D y 4A-4D son gráficas de línea que muestran si los polipéptidos de precursor IGF-1 de la invención mantienen selectividad al receptor apropiado al ensayar la fosforilación para el receptor en respuesta a la unión del ligando. Las Figuras 3A y 3B prueban la selectividad del receptor de IGF-1-Ea3mut contra el receptor IGF-1 (Fig. 3A) y el receptor de insulina (Fig. 3B) . Las figuras 3C y 3D prueban la selectividad del receptor de IGF-1-Eb3mut contra el receptor IGF-1 (Fig. 3C) y el receptor de insulina (Fig. 3D) . Las figuras 4A y 4B prueban la selectividad del receptor de IGF-1-Ec3mut contra el receptor IGF-1 (Fig. 4A) y el receptor de insulina (Fig. 4B) . Las figuras 4C y 4D prueban la selectividad del receptor de IGF-1-Eab3mut contra el receptor IGF-1 (Fig. 4C) y el receptor de insulina (Fig. 4D) . "IGF1-R3" se refiere a R3- IGF-1 largo descrito anteriormente. El polipéptido listado como "IGFlEab" se refiere una construcción en la que los aminoácidos Ea 93 a 102 se insertan entre aminoácidos 95 y 96 de Eb.

La Figura 5 es un Western blot que muestra la fosforilación AKT relativa luego de estimulación de miotubos C2C12 (como un resultado de 3 a 4 días de diferenciación de miocitos C2C12) mediante diferentes ligandos. El multímero IGF-lEb se refiere a la construcción esquemática que se muestra en la Figura 6A.

Las figuras 6A y 6B son representaciones esquemáticas de dos de los polipéptidos de la invención. La figura 6A muestra un polipéptido precursor IGF-l-Eb con cuatro conjuntos de modificaciones: eliminación de Gl, P2, y E3 ; mutación de R37 a A; eliminación de R71 y S72; y eliminación de los últimos siete aminoácidos de terminal C. Además, el polipéptido se alarga mediante la adición de dos péptidos Eb más (pero son R71 y S72 y sin los últimos siete aminoácidos de terminal C) y la adición de un péptido b final (pero sin R71 y S72) en el terminal C del polipéptido. Esta construcción es referida a menudo como el multímero IGF-l-Eb. La figura 6B muestra un polipéptido precursor IGF-l-Eab con cuatro conjuntos de modificaciones: eliminación de Gl, P2, y E3 ; mutación de R37 a A; eliminación de R71 y S72; y inserción de aminoácidos Ea 93 a 102 entre aminoácidos 95 y 96 de Eb.

La Figura 7A es una alineación de secuencia del IGF-1 humano (SEQ ID NO: 1) con el correspondiente IGF-1 animal. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. Gl, P2, E3 se conservan en todas las especies analizadas excepto Sterlet (en donde S2 reemplaza P2) . R36 y R37 se conservan en todas las especies analizadas.

La Figura 7B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparadas con el IGF-1 humano (SEQ ID NO: 1) . Abajo del árbol hay una escala que indica el número de "Sustituciones de Aminoácido" por 100 residuos para las secuencias de proteína. La fórmula de distancia Kimura se utiliza para calcular los valores de distancia, derivados del número de incompatibilidades sin espacio y corregidas para sustituciones silentes. Los valores computados son el número que significa diferencias por sitio y caen entre cero y 1. El cero representa la identidad completa y 1 representa no identidad. La escala del árbol filogenético utiliza estos valores multiplicados por 100.

La Figura 8A es una alineación de secuencia del péptido Ea humano (SEQ ID NO: 2) con varios péptidos Ea animales. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas.

La Figura 8B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparadas con IGF-1 humano del péptido Ea (SEQ ID NO: 2) .

La Figura 9A es una alineación de secuencia del péptido Eb humano (SEQ ID NO: 3) con varios péptidos animales Eb. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas .

La Figura 9B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas del IGF-1 humano de péptido Eb (SEQ ID NO: 3) .

La Figura 1QA es una alineación de secuencia del péptido Ec humano (SEQ ID NO: 4) con varios péptidos Ec animales. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. R71 y S72 se conservan en todas las especies analizadas .

La Figura 10B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de amonoácido analizadas comparadas con IGF-1 humano de péptido Ec (SEQ ID NO: 4) .

La Figura 11A es una alineación de secuencia del IGF-2 humano (SEQ ID NO: 7) con el IGF-2 animal correspondiente. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. El R68 se conserva en todas las especies analizadas; el D69 se conserva excepto para el chimpancé, en donde hay un residuo de histidina en la posición.

La Fig. 11B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparadas con IGF-2 humano (SEQ ID NO: 7) .

La Figura 12A es una alineación de secuencia del IGF-2 humano de péptido E (SEQ ID NO: 6) con varios IGF-2 animales de péptidos E. Se dan todas las especies animales analizadas y sus números de acceso GenBank correspondientes para la secuencia. El R68 se conserva en todas las especies analizadas; el D69 se conserva excepto para el Chimpancé, en donde hay un residuo histidina en esta posición.

La Fig. 12B es una gráfica que muestra la filogenia de las secuencias de aminoácido analizadas comparadas con IGF-2 humano de péptido E (SEQ ID NO: 6) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con polipéptidos de precursor IGF-1 y IGF-2 nuevos que contienen sustancialmente un péptido E que se ha modificado para prevenir, reducir, o ayudar a la división de proteasa típica responsable para la liberación de los IGF-1 o IGF-2 activos de sus péptidos E. La utilidad de los polipéptidos de la invención se basan en el descubrimiento sorprendente que tales polipéptidos precursores son biológicamente activos, estables y benéficos como farmacéuticos.

Detección para polipéptidos precursores IGF activos La utilidad de cualquier polipéptido de la invención se puede ensayar utilizando las siguientes pruebas.

Estabilidad. Un polipéptido de la invención debe tener suficiente estabilidad en la presencia de proteasas endógenas, tal como en suero humano, para ser un fármaco efectivo. Para evaluar la estabilidad, un vector de expresión que codifica el polipéptido se puede transferir en las células Cos7 (ATCC) en un medio DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, y 100 g/ml de estreptomicina. El medio de cultivo que contiene polipéptidos secretados se puede aplicar al análisis adicional, o en la alternativa, el vector de expresión puede codificar fácilmente etiquetas disponibles, tal como una etiqueta hexa-histidina, en el polipéptido para facilitar la purificación eficiente de los polipéptidos expresados en los cultivos Cos7. Sin embargo al preparar, la muestra de polipéptido se incuba en suero humano normal (Sigma) o en PBS durante varios tiempos (por ejemplo, 0, 1, 5, 10, y 16 horas), se somete a electrofóresis de gel poliacrilamida, se mancha en nitrocelulosa, y las proteínas relevantes se visualizan utilizando un anticuerpo primario contra IGF-1 humano o IGF-2 y un segundo anticuerpo, por ejemplo, conjugado con peroxidasa de rábano. Cualquier número de manchas similares y técnicas de detección, algunas utilizando tintes fluorescentes o aún radionúclidos , se pueden utilizar. La intensidad de la banda precursora versus la intensidad de la banda IGF-1 o IGF-2 deben indicar el grado en el que el polipéptido precursor se divide bajo varias condiciones. Un polipéptido de la invención que se expone a suero humano durante 16 horas a 37° C puede exhibir una proporción del precursor no dividido para dividir el IGF maduro de aproximadamente 1:2 a 1:0.1, por ejemplo, aproximadamente 1:1 a 1:0.5, particularmente una proporción de aproximadamente 1:1 o una proporción de aproximadamente 1:0.5. Típicamente, el precursor debe exhibir una proporción de por lo menos 1:1.

Fosforilación AKT. Un polipéptido de la invención deberá mantener la capacidad de señalizar a través del receptor IGF-1. (Tanto señal IGF-1 e IGF- 2 a través del receptor IGF-1) . Para determinar esta capacidad de señalización, uno puede evaluar si un objetivo intracelular de corriente baja, AKT, se fosforila en respuesta a la unión de ligando en la superficie celular. Para análisis de la fosforilación AKT, los mioblastos C2C12 se cosechan en medio libre de suero y luego se estimulan con diferentes ligandos. Las células se lisan y se aclaran mediante centrifugación. La fosforilación AKT y los niveles AKT totales se analizan mediante ELISA utilizando kit de emparedado ELISA (Ser473) fosfo AKT PathScan y kit de emparedado ELISA AKT PathScan (Cell Signaling) , respectivamente.

Especificidad del receptor IGF-1. Un polipéptido de la invención preferiblemente mantiene la especificidad para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad. Para evaluar la especificidad del receptor, el polipéptido se agregan las muestras para cosechar suero NIH3T3 las células que sobreexpresan el receptor IGF-1 o el receptor de insulina, y el nivel de fosforilación del receptor IGF-1 o fosforilación del receptor de insulina se determina mediante lisar las células y somete los lisatos a ELISA utilizando el receptor IGF fósforo humano DuoSet IC y el kit de receptor de insulina ELISA (R&D Systems) .

Ensayo In Vivo en Modelos de ratón de hipertrofia. Para determinar si un polipéptido de la invención puede actuar para incrementar la masa músculo esquelético bajo un contexto que conduce fácilmente a la hipertrofia muscular, uno puede tratar el sujeto y no tratar animales para ejercer y determinar si los animales que reciben el polipéptido han desarrollado músculos más grandes que los animales no tratados.

Modelos de ejercicio Un modelo conocido en la técnica se basa en el uso de una rueda para correr voluntaria con cargas variables de usuario (ver, por ejemplo, Konhilas et al . , Am J Physiol Heart Circ Physiol 289 : H455-H465 , 2005). La rueda de jaula voluntaria elimina los traumatismos físicos y sicológicos que son comunes en modelos de ejercicio forzoso, y por lo tanto son más apropiados para evaluar los fármacos candidatos que se utilizan en individuos relativamente saludables para quienes es deseable el incremento de la masa muscular.

Se puede utilizar cualquier cepa de ratón adecuada. Por ejemplo, ratones machos C57B1/6J que se pueden asignar aleatoriamente a grupos experimentales (por ejemplo, que reciben polipéptido precursor IGF) y de control. Los animales se alojan individualmente en una jaula que contiene una rueda de ejercicio; los animales de control sedentarios se alojan en jaulas idénticas sin una rueda. Las ruedas de ejercicio se describen en Alien et al., J Appl Physiol 90:1900-1908, 2001. En resumen, el sistema consiste de una rueda de 11.5 cm de diámetro con una superficie para carrera de ancho de 5.0 cm (modelo 6208, Petsmart, Phoenix, AZ) equipado con un contador magnético digital (modelo BC 600, Sigma Sport, Olney, IL) que se activa por rotación de la rueda. Adicionalmente, cada rueda se construye con ingeniería con un mecanismo de resistencia que permite el ajuste de la carga. Esto se logra al adherir una línea de pesca de acero inoxidable a la parte superior de la jaula y envolver el cable alrededor de una polea inmóvil que se asegura a la rueda de la jaula en el eje de rotación con el fin de no contribuir a la carga de la rueda. El cable se asegura de nuevo a la parte superior de la jaula con un resorte y tornillo. Este diseño permite el ajuste fino de la carga de la rueda, que se distribuye uniformemente a través de la rotación de la rueda. Los valores diarios de ejercicio para distancia y tiempo se registran para cada animal ejercitado a través de la duración del periodo de ejercicio. A los animales se les suministra agua y concentrado para roedores duro estándar ad libitum. La carrera voluntaria (exposición de rueda de jaula) puede ser a una edad promedio de aproximadamente 12 semanas para todos los grupos. Cada grupo continúa corriendo bajo resistencia variante, dependiendo del grupo experimental, durante 50 días hasta que los animales son de aproximadamente 19 semanas de edad. La carga en la rueda se determina al colgar los pesos conocidos sobre la rueda hasta que la rueda se desplaza ligeramente. Todos los grupos de ejercicio no tienen carga en la rueda de la jaula durante la primera semana. Sin embargo, la condición "sin carga" es actualmente 2g, que se determina como la carga necesaria para mantener la inercia de la rueda y la carga de fricción. Considerando un periodo de aclimatación de la rueda de una semana, las cargas de rueda se pueden cambiar en intervalos de una semana, excepto para cargas mayores, que se pueden cambiar después de dos semanas. El rango de cargas puede ser de cualquier forma de 2 g hasta 12 g. Los animales de control sedentarios y ejercitados se les practica la eutanasia mediante dislocación cervical bajo anestesia inhalada inmediatamente después del final del periodo de ejercicio específico. Se mide la masa corporal, y los músculos específicos se retiran rápidamente, se lavan, y se congelan para ensayos bioquímicos o histológicos en un periodo futuro.

Los modelos de hipertrofia de ejercicio alternativos también están disponibles por el experto. Ver, por ejemplo, el modelo de ejercicio de cinta rodante descrito en Lerman et al., J Appl Physiol 92:2245-2255, 2002.

Modelo de inyección de Clenbuterol El Clenbuterol es un agonista adrenérgico ß2 con propiedades promotoras del crecimiento que originan un incremento documentado en la masa muscular. El mecanismo pregiso de la acción de clenbuterol permanece no claro, aunque una reducción en la degradación de la proteína del músculo se ha propuesto. En las clínicas, el clenbuterol se utiliza como un fármaco anti-asma, pero este aparece para ser mal empleado en su mayoría como un agente formador de cuerpo para incrementar la masa muscular en humano y animales mostrados .

A cinco ratones se les da una inyección diaria de clenbuterol (3 mg/kg, subcutáneamente (s.c.)) durante 3, 7, o 14 días para inducir hipertrofia muscular. Los ratones se inyectan con PBS que sirve como control negativo. Los animales se monitorean diariamente (inspección visual) para cualesquier reacciones adversas (es decir recubrimiento desaliñado, letárgico) al tratamiento. El tratamiento de clenbuterol tiene el potencial para hacer ratones más temerosos o agresivos, así los ratones se deben monitorear especialmente para pelea si se alojan en grupos. Los ratones se mueven, y pueden comer y beber normalmente . Los ratones se monitorean diariamente hasta que se les practica la eutanasia en el día 3, 7, o 14, y el tejido se recolecta para análisis adicional.

Modelos de atrofia muscular en ensayo In Vivo. En varios modelos de atrofia músculo esquelética, un polipéptido precursor IGF de la invención se puede ensayar para la capacidad de mantener la masa muscular bajo condiciones que reducen generalmente la masa muscular. Con los modelos de ejemplo descritos adelante, el experto puede fácilmente diseñar e implementar experimentos controlados que involucran la administración y el uso del polipéptido precursor IGF para determinar si tales polipéptidos pueden incrementar la masa muscular.

Por ejemplo, ratones macho C57B16/2 se compran de The Jackson Laboratories. Los ratones así comprados son de aproximadamente 9 semanas en el inicio de cada experimento. Los ratones generalmente se alojan en jaulas microaisladoras con concentrado para roedor normal. Al inicio de cada experimento los ratones se pesan. Al final de cada experimento, a los ratones generalmente se les practica la eutanasia mediante inhalación de C02 seguido por dislocación cervical, y los tejidos musculares se cosechan para procesamiento adicional. Los ratones se pesan para proporcionar el "peso corporal final" . Los músculos esqueléticos que se pueden cosechar son los músculos anteriores de la tibia, músculo extensor de los dedos, soleus, y músculos gemelos. Otros tejidos cosechados ocasionalmente son corazón, hígado, bazo, ríñones, testículos y cerebro. Todos los músculos y tejidos se disecan completamente y se pesan en un balance capaz de medir hasta O.OOOlg. Los tejidos luego se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido para el ARN posterior y la extracción de proteína, o se congelan instantáneamente embebidos en OCT en un disco de corcho.

Los músculos congelados en un disco de corcho para crioseccionamiento posterior se sumergen en isopentano frío en una colada espesa mediante nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan a -80° C.

Tratamiento de Dexametasona Un método farmacológico de deterioro muscular inducido en los ratones es inyección intraperitoneal diaria con dexametasona a 20mg/kg. La dexametasona es un miembro sintético de la clase glucocorticoide de las hormonas. Este actúa como un anti- inflamatorio e inmunosupresor, con una potencia de aproximadamente 40 veces que de hidrocortisona . La dexametasona se utiliza para tratar muchas infecciones inflamatorias y autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide. También se da a pacientes con cáncer que experimentan quimioterapia, para contrarrestar ciertos efectos colaterales de su tratamiento antineoplásico . La dexametasona origina atrofia muscular en ratones y en pacientes humanos.

Los ratones se inyectan intraperitonealmente (ip) con dexametasona durante 3, 7, o 14 días. En el día terminal a los sujetos se les practica la eutanasia utilizando C02, y se cosechan los músculos de las patas. Los animales se monitorean diariamente (inspección visual) para cualesquier reacciones adversas (es decir recubrimiento desaliñado, letárgico) al tratamiento. Los ratones se mueven usualmente, y pueden comer y beber normalmente. Los ratones inyectados con PBS son el control negativo.

Inmovilización por Molde El desuso físico de varios grupos de músculos resulta en la atrofia de aquellos músculos. Fijación de articulación del tobillo ("talón con pasador" o fijación por molde) ha probado ser una forma reproducible y altamente útil para inducir inmovilización física de patas traseras de ratas y ratones.

Los ratones se anestesian con isofluorano para inmovilización. Las articulaciones de tobillo y talón se fijan a 90 grados con un material de para molde de peso liviano (VET-LITE) alrededor de las articulaciones. El material se enjuaga con agua caliente y luego se envuelve alrededor del miembro, dejando los dedos y la articulación de la cadera libres. Las articulaciones se mantienen en las posiciones 90° hasta que se ha secado el material de molde. La pata contralateral sirve como control. A los ratones luego se les permite recuperarse de la anestesia y se alojan en jaulas microaisladoras normales. No se ha observado que el molde origine tensión excesiva, y los animales se mueven libremente alrededor de la jaula para alimentarse y beber. Sin embargo Los ratones se monitorean diariamente para cualesquier eventos adversos que afecten el peso corporal, la actividad, y las irritaciones.

Una vez se aplica un molde a un ratón, el animal se monitorea diariamente para hacer Asegurarse de que el molde permanece en el lugar, ya que puede ocurrir masticación. Los animales se pueden mover, beber, y alimentarse después de recuperarse de la anestesia, y no requieren descanso especial, ni dispositivos de bloqueo u otra asistencia.

Desnervación Generalmente, los ratones se anestesian con gas se isofluorano para desnervación. Utilizando procedimientos quirúrgicos asépticos (tres lavados de betadina con un lavado final de etanol) , el nervio ciático derecho se aisla en la parte media del muslo y de 2 a 5 mm se corta la pieza. La parte contralateral de la pata sirve como control .

Más específicamente, la incisión en la piel se cierra con un clip de sutura, y los animales se inyectan con una dosis única de buprenorfina antes de permitirles recuperarse de la anestesia. Tres, siete, o 14 días después de la cirugía a los animales se les practica la eutanasia mediante la inhalación de C02 seguida por dislocación cervical, y los músculos (gemelos, de la tibia anterior, extensor de los dedos, soleus) se remueven para análisis histológico y bioquímico.

Dado que el nervio ciático se corta en sección transversal, el miembro afectado se inmoviliza para inducir atrofia músculo esquelética de los músculos involucrados. El animal se puede de otra forma mover, beber, y alimentarse después recuperarse de la anestesia y no requiere descanso especial, ni dispositivo de bloqueo u otra asistencia. No obstante, los animales se monitorean inmediatamente después de la cirugía y a lo largo de la recuperación (1-2 hrs) . Además, los sitios de incisión y la salud general del animal se monitorean durante 3 días después de la cirugía. El clip de sutura se remueve 7 a 10 días después de la cirugía.

Modelos Genéticos Los ratones transgénicos manipulados genéticamente también se pueden utilizar como modelos de atrofia muscular. Por ejemplo, los llamados Mini Ratones (The Jackson Laboratory, Stock No. 003258) contienen una mutación transgénica en el gen IGF-1 que resulta en la reducción anormal del crecimiento postnatal, así como también el bajo peso corporal y la talla. Para información adicional, ver Powell-Braxton et al., Genes Dev 7:2609-2617, 1993. Además, los llamados Mini Ratones (The Jackson Laboratory, Stock No. 003259) contienen una mutación diferente en el gen IGF-1 que resulta en un bajo peso corporal en el adulto que exhibe hipomorfismo y otros fenotipos cardiovasculares. Para información adicional, ver Lembo et al., J Clin Invest 98:2648-2655, 1996.

Mutaciones Críticas y Opcionales o Modificaciones en los precursores IGF Mutaciones críticas . La invención se basa en parte en la observación que un polipéptido precursor IGF que contiene sustancialmente su péptido E permanece bioactivo y estable en la presencia de suero. Para asegurar que el péptido E no se divide mediante proteasas endógenas objetivo al sitio de proteasa dibásica, en general de los dos aminoácidos del péptido E dib sicos de terminal N en el precursor se elimina, muta, o de otra forma enmascarado. En un ejemplo de IGF-1, estos dos aminoácidos son R71 y S72, mientras que en el otro ejemplo de IGF-2, estos dos primeros aminoácidos son R68 y ?69.

Una variedad de modificaciones permiten esta prevención de división: (1) Eliminación de uno o más residuos dibásicos (2) Muta uno o más residuos dibásicos a un aminoácido no básico, tal como alanina (3) Inserta uno o más aminoácidos no básicos entre los residuos dibásicos (4) Coloca un sitio de glicosilación cerca de los residuos dibásicos suficiente para enmascarar el sitio proteasa (5) Pegilación dirigida al sitio utilizando el reemplazo del residuo dibásico, o inserción cerca o entre los residuos dibásicos, con un aminoácido no natural, como se describe adelante.

Además, los residuos K68 y K65 parecen jugar un papel en la división de IGF-l/péptido E; de acuerdo con lo anterior, las mutaciones o eliminaciones de estos residuos se pueden incorporan en cualquier táctica dirigida a los aminoácidos dibásicos como se describió anteriormente .

Mutaciones en el terminal N de IGF maduro. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos precursores IGF tienen eliminaciones o mutaciones de los pocos primeros aminoácidos N-terminales . En el caso de IGF-1, cualquiera de los primeros tres aminoácidos N-terminales se pueden eliminar o mutar, sea el caso de IGF-2, cualquiera de los primeros seis aminoácidos N-terminal se pueden eliminar o mutar. Se ha observado que ciertos aminoácidos N-terminales se dividen naturalmente in vivo, y la introducción de estas mutaciones o eliminaciones minimiza las asociaciones in vivo de los polipéptidos de la invención con proteínas de unión IGF (IGFBP) . La interacción de IGF-1 y IGF-2 con el receptor IGF-1 se regula por IGFBP. Todos los seis IGFBP se han mostrado por inhibir la acción IGF (particularmente IGFBP5) , pero en algunas instancias un efecto estimulador se ha observado. Por lo menos 99% del IGF en la circulación se une normalmente a los IGFBP. El IGFBP más abundante en la circulación después del periodo neonatal es IGFBP3 que se puede unir a IGF-1 y IGF-2 con afinidades similares. La ocurrencia natural trunca el IGF-1 (siendo la eliminación de Gl, P2 , y E3) que se une a IGFBP3 con varias veces de afinidad inferior que el IGF-1 natural. Además, G3 es importante para la unión IGFBP, y G6 juega un papel similar en el péptido IGF-2.

De acuerdo con lo anterior, en un ejemplo del precursor IGF-1, cualquiera Gl, P2 , o E3 Se puede eliminar o mutar solo o en combinación. Cuando una mutación se desea, se puede introducir una mutación a alanina. En otro ejemplo, en otro ejemplo del precursor IGF-2, cualquiera de P4 , S5, y E6 se puede eliminar o mutar solo o en combinación. Cuando se desea una mutación, se puede introducir una mutación a alanina.

Mutaciones en los Residuos 36 y 37. El IGF-1 se puede dividir mediante proteasas serina. La mutación de R36 o R37 a A puede prevenir la división de IGF-1 en su sitio de división predicho entre R36 y R37. En un ejemplo de IGF-2, R38 se puede mutar o eliminar para prevenir su división deletérea.

Uso de la Glicosilación. La vida media in vivo de los polipéptidos de la invención se puede mejorar mediante la adición de los sitios de glicosilación ligados a N en el IGF o las porciones de péptido E del precursor cuando se expresan en los mamíferos otras células eucarióticas capaces de glicosilación ligada a N. Se ha mostrado in vitro que el IGF-1 Ea se glicosila en N92 y N100, como estas porciones de Ea ajusta el consenso de la secuencia de glicosilación ligada a N de N-X-S/T, en donde X puede ser cualquier aminoácido y el tercer aminoácido de la tripleta es S o T. Es también conocido que el contexto de aminoácido adyacente de los consensos que afectará fuertemente la asparagina se glicosila. Por lo tanto, una estrategia para introducir un sitio de glicosilación en Eb o Ec es insertar aminoácidos Ea alrededor de la secuencia consenso en la misma parte de Eb o Ec . Una implementación particular de esta estrategia se implementa en los Ejemplos adelante. En cualquier caso, cualquier otro sitio de glicosilación consenso ligado a N, incluye los aminoácidos de contexto circundantes, conocidos por el experto que se pueden insertar en un polipéptido precursor de la invención. Además, la glicosilación de ligado O de un polipéptido de la invención se puede llevar a cabo al seleccionar el anfitrión particular utilizado para la producción del polipéptido. Por ejemplo, el uso de ciertas cepas de levadura para la expresión IGF-1 resulta en la adición de oligosacáridos en unas serinas o treoninas . Ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5,273,966.

Adición de Poli (etilenglicol) . Conjugación a vitro que el IGF-1 Ea se glicosila en N92 y N100, como estas porciones de Ea ajusta el consenso de la secuencia de glicosilacion ligada a N de N-X-S/T, en donde X puede ser cualquier aminoácido y el tercer aminoácido de la tripleta es S o T. Es también conocido que el contexto de aminoácido adyacente de los consensos que afectará fuertemente la asparagina se glicosila. Por lo tanto, una estrategia para introducir un sitio de glicosilacion en Eb o Ec es insertar aminoácidos Ea alrededor de la secuencia consenso en la misma parte de Eb o Ec . Una implementación particular de esta estrategia se implementa en los Ejemplos adelante. En cualquier caso, cualquier otro sitio de glicosilacion consenso ligado a N, incluye los aminoácidos de contexto circundantes, conocidos por el experto que se pueden insertar en un polipéptido precursor de la invención. Además, la glicosilacion de ligado O de un polipéptido de la invención se puede llevar a cabo al seleccionar el anfitrión particular utilizado para la producción del polipéptido. Por ejemplo, el uso de ciertas cepas de levadura para la expresión IGF-1 resulta en la adición de oligosacáridos en unas serinas o treoninas. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5,273,966.

Adición de Poli (etilenglicol) . Conjugación a poli (etilenglicol) (PEG; pegilación) han probado ser de benéfico al prolongar la vida media de los fármacos de proteínas terapéuticas. Se espera que la pegilación de los polipéptidos precursores IGF de la invención puede resultar en ventajas farmacéuticas similares. Métodos de pegilación de IGF-1 son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Población de Solicitud de Patente US 2006/0154865, que describe las propiedades benéficas de lisina-monopegilado IGF-1. Tal lisina-monopegilación se puede adaptar para los polipéptidos de precursor IGF de la invención. Además, la pegilación se puede lograr en cualquier parte de un polipéptido de la invención mediante la introducción de un aminoácido no natural. Ciertos aminoácidos no naturales se pueden introducir mediante la tecnología descrita en Deiters et al . , J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang y Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 o en la Patente US No. 7,083,970. En resumen, algunos de estos sistemas de expresión involucran mutagenia dirigida a sitio para introducir un codón no sensor, tal como un TAG ámbar, en el cuadro de lectura abierto que codifica un polipéptido de la invención. Tales vectores de expresión luego se introducen en un anfitrión que puede utilizar un ARNt específico para la introducción de un codón no sensor y cargar con el aminoácido no natural de selección. Aminoácidos no naturales Particulares que son benéficos para el propósito de conjugar grupos funcionales a los polipéptidos de la invención incluye aquellos con cadenas laterales acetileno y azido. Los polipéptidos precursores IGF que contienen estos aminoácidos novedosos se pueden lego pegilar en estos sitios de elección en la proteína. Además, tales moléculas IGF pegiladas sin el péptido E son útiles como terapéuticos.

Multímeros de péptidos E. En ciertos contextos farmacológicos, es benéfico incrementar el tamaño de un fármaco péptido o proteína para asegurar que el fármaco permanezca en un lado de la barrera hematoencefálica o la otra. Ya que las moléculas IGF maduras son péptidos relativamente cortos, aún si el péptido E permanece unido, puede ser benéfico incrementar el tamaño de los polipéptidos de la invención. Un medio para hacer esto es proporcionar multímeros de péptidos E en el terminal C del polipéptido precursor IGF, como se ilustra en ciertos ejemplos descritos adelante.

Eliminación de terminal C de péptidos E. Se sospecha que la cisteína libre en la posición 81 de Eb puede resultar en homodimerización u otros efectos que, cuando están presentes en los polipéptidos de la invención, pueden conducir a fármacos de actividad más baja. Así, la eliminación o mutación de C81 en Eb puede optimizar la actividad del fármaco. En un ejemplo particular, la eliminación de los últimos siete aminoácidos de Eb (es decir, aminoácidos 81-87) es benéfica.

Otras Mutaciones o Modificaciones . Mutaciones o modificaciones adicionales de IGF que se pueden incorporar los polipéptidos precursores IGF de la invención se describen en la Patente U.S. No. 5,077,276; y la Publicación de Solicitud de Patente U.S. Nos. 2005/0287151, 2006/0211606, y 2006/0166328.

La invención se debe construir para incluir todas las secuencias de precursor conocidas y no conocidas de animal no humano IGF-1 o IGF-2 que ccpntienen sustancialmente su péptido E en donde la división normal del péptido E se evita o reduce de acuerdo con modificaciones de la presente invención.

El tipo preferido de IGF se puede utilizar dependiendo de las especies objeto a ser tratadas.

Se prefiere que el IGF sea una especie compatible, por ejemplo, cuando una vaca se trata, el tipo preferido de IGF es IGF bovino.

Aunque todas las formas de IGF son similares por tener un efecto en sujetos diferentes debido a la alta homología de secuencia, las especies compatibles evitarán complicaciones inmunológicas adversas potenciales provenientes de la inducción de una respuesta inmune a un IGF de una especie diferente.

En una modalidad de la invención, se proporcionan las secuencias de precursor IGF-1 animal no humano modificado .

La secuencias de precursor IGF-1 preferidas que contiene sustancialmente su péptido E en donde la división normal del péptido E se evita o reduce de acuerdo con modificaciones de la presente invención de un animal vertebrado.

Por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, pájaro, perro, gato, pez y similar, de cualquier fuente si es natural, sintético, o recombinante .

En otra modalidad de la invención, se proporcionan las secuencias de precursor IGF- 2 de animal no humano modificadas.

Las secuencias preferidas de precursor IGF-2 que contienen sustancialmente su péptido E en donde la división normal del péptido E se evita o reduce de acuerdo con modificaciones de la presente invención de un animal vertebrado .

Por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, pájaro, perro, gato, pez y similar, de cualquier fuente si es natural, sintética, o recombinante .

Uso terapéutico de polipéptidos de precursor IGF Indicaciones . La invención también incluye el uso de un polipéptido precursor IGF de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad musculoesquelética . Además, la invención incluye el uso de polipéptidos precursores IGF para incrementar de masa ósea o músculo en un individuo, si o no tal un individuo está en riesgo de o tiene una enfermedad musculoesquelética .

En particular, la enfermedad musculoesquelética puede ser atrofia muscular. Existen muchas causas de atrofia muscular, que incluyen como un resultado el tratamiento con un glucocorticoide tal como cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona, o prednisolona . La atrofia muscular también puede ser un resultado de la desnervación debido a trauma nervioso o un resultado de neuropatía degenerativa, metabólica o inflamatoria (por ejemplo, síndrome Guillian-Barré , neuropatía periférica, o exposición a fármacos o toxinas ambientales) . Además la atrofia muscular puede ser un resultado de una enfermedad neuromotriz de adulto, atrofia muscular de médula espinal infantil, atrofia muscular de espina dorsal juvenil, neuropatía motriz autoinmune con bloqueo conductor multifocal, parálisis debido a apoplejía o lesión de médula espinal, inmovilización esquelética debido a trauma, reposo de cama prolongado, inactividad voluntaria, inactividad involuntaria, tensión metabólica o insuficiencia nutricional, cáncer, SIDA, ayuno, rabdomiolisis , un trastorno de glándula tiroides, diabetes, hipotonía congénita benigna, enfermedad de núcleo central, miopatia nemalena, miopatía miotubular (centro nuclear) , lesión por quemadura, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad del hígado, sepsis, falla renal, falla cardiaca congestiva, o envejecimiento.

La enfermedad musculoesquelética puede también ser un síndrome de distrofia muscula, tal como Duchenne, Becker, miotónico, fascioescapulohumeral , Emery-Deifuss , oculofaríngeo, escapulohumeral , aro del miembro, una distrofia muscular congénita, o miopatía distal hereditaria. La enfermedad musculoesquelética puede también ser osteoporosis , una fractura ósea, estatura corta, o enanismo.

El IGF-1 se sugiere como un tratamiento para diabetes sensible a insulina, dado que el IGF-1 también puede unir heterodímeros del receptor IGF-1 y receptor de insulina. De acuerdo con lo anterior, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para tratar la diabetes.

El IGF-1 es neurotrófico e incrementa la supervivencia de las neuronas. Se ha sugerido que el IGF-1 se puede utilizar para tratar instancias de muerte de neurona motora tal como se ve en esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , atrofia de cerebro, envejecimiento, y demencia. De acuerdo con lo anterior, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para tratar afecciones asociadas con muerte neuronal, tal como ALS, atrofia de cerebro, o demencia .

El IGF-1 incrementa las poblaciones de células sanguíneas rojas y blancas y tiene un efecto aditivo para la administración de eritropoyetina. De acuerdo con lo anterior, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para tratar la anemia.

EN razón a que los IGF-1 e IGF-2 son reguladores esenciales y ubicuos de la división celular y crecimiento de vertebrados, ellos se pueden utilizar ventajosamente en una variedad de métodos veterinarios para mejorar exógenamente o mantener el crecimiento en un animal. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a: (i) mejorar la tasa y/o grado de crecimiento en un animal, por ejemplo, mejorar el crecimiento muscular en cerdos, ganado, aves y peces; (ii) mejorar la eficiencia de su conversión de alimento en tejido corporal (proporción de carne a grasa), por ejemplo, en cerdos, ganado, ovejas, aves, y peces; y (iii) mejorar la producción de leche en animales lactantes, por ejemplo, ganado lechero, ovejas, cabras. Otras aplicaciones terapéuticas veterinarias incluyen, pero no se limitan a: (iv) tratar síntomas de desperdicio animal asociados con caquexia, trauma u otras enfermedades de consumo, por ejemplo, en animales de compañía tal como perros, gatos, y caballos; y (v) tratar animales lactantes para mejoramiento en la salud neonatal, por ejemplo, cerdas lactantes para mejora en el desempeño neonatal.

Métodos de administración. Los polipéptidos de la invención se pueden liberar en una variedad de vías, que incluyen el uso de vehículos de liberación de genes. Métodos conocidos en la técnica para la liberación terapéutica de agentes tales como proteínas o ácidos nucleicos se pueden utilizar para la liberación terapéutica den polipéptido de la invención, por ejemplo, transfección celular, terapia de genes, administración directa con un vehículo de liberación, o portador farmacéuticamente aceptable, liberación indirecta al proporcionar células recombinantes que contiene un ácido nucleico que codifica el polipéptido.

Varios sistemas de liberación se muestran y se pueden utilizar para administrar el polipéptido de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropart culas , microcápsulas , células recombinantes capaces de expresar la proteína, endocitosis mediada por (ver, por ejemplo, Wu y Wu, J Biol Chem 262:4429-4432, 1987), la construcción de un ácido nucleico como parte de un retrovirus, virus adeno asociado, adenovirus, poxvirus (por ejemplo, virus de pústula aviar, particularmente virus de pústula de gallináceas) u otro vector, etc. Métodos de introducción pueden ser entéricos o parentéricos e incluyen pero no se limitan a rutas intradérmicas , intramusculares, intraperitoneales , intravenosas, subcutáneas, pulmonares, intranasales , intraoculares , epidurales, y orales. Los polipéptidos se pueden administrar mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de la piel o recubrimiento mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y intestinal mucosa, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes activos biológicamente. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de. la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier ruta adecuada, que incluye inyección intraventricular y intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio, tal como un reservorio Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de pulverización.

En una modalidad especifica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área en necesidad del tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no por vía de limitación, mediante infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, el implante será de un material poroso o no poroso, o gelatinoso, que incluye membranas, tal como membranas sialásticas, fibras, o sustitutos para la piel comerciales .

En otra modalidad, el agente activo se puede liberar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533, 1990). En todavía otra modalidad, el agente activo se puede liberar en un sistema de liberación controlado. En una modalidad, se puede utilizar una bomba. En otra modalidad, los materiales poliméricos se pueden utilizar (ver Howard et al., J Neurosurg 71:105, 1989). En otra modalidad en donde el agente activo de la invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, al construirla como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo así que este llegue a ser intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retrovírico (ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,980,286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o cubrir con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transíección, o al administrarlo en el ligado a un péptido similar a homeosecuencia que es conocida por entrar al núcleo (ver, por ejemplo, Joliot et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 88:1864-1868, 1991), etc. Alternativamente, un ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de célula anfitriona para expresión, mediante recombinación homologa.

Transfección Celular terapia de genes. La presente invención abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención para la transfección de las células in vitro e in vivo. Estos ácidos nucleicos se pueden insertar en cualquiera de un número de vectores bien conocidos para transfección de células objetivo y organismos. Los ácidos nucleicos se transfieren en las células ex vivo e in vivo, a través de la interacción del vector y la célula objetivo. Se administran las composiciones (por ejemplo, mediante inyección en un músculo) a un sujeto en una cantidad suficiente para elicitar una respuesta terapéutica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sitio objetivo, es decir, una célula objetivo o tejido, un animal que incluye transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, en donde el ácido nucleico incluye un promotor inducible operablemente unido al ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión objetivo.

Terapias de Combinación En numerosas modalidades, los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos adicionales o terapias. Por ejemplo, polipéptidos múltiples se pueden coadministrar en conjunto con uno o más compuestos terapéuticos. La terapia de combinación puede abarcar la administración simultánea alterna. Además, la combinación puede abarcar administración aguda o crónica. Los polipéptidos de la invención se pueden administrar en conjunto con agentes anabólicos tales como testosterona o moduladores de receptor andrógeno específicos (SAR ) . Los agentes anabólicos adicionales incluyen hormona de crecimiento (GH) o moléculas que inducen liberación GH. El Ghrelin es particularmente útil en una terapia de combinación para caquexia, dado que el Ghrelin puede originar un incremento en el apetito. En una vena similar, los polipéptidos de la invención se pueden combinar con complementos de proteína para incrementar el anabolismo, o combinar con terapia física o ejercicio para incrementar el peso corporal. Cualquier molécula que inhibe miostatina también es un candidato para la terapia de combinación.

Composiciones farmacéuticas La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína precursora IGF de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa mejorado por un agente regulador del Gobierno Estatal o Federal en la Pharmacopeia U.S. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales o humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual el terapéutico se administra. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Excipientes farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener cantidades menores de agentes humectantes y emulsificantes , o agentes que amortiguan el pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con ligadores y portadores tradicionales tal como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándar tal como grados f rmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticamente adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

En algunas modalidades, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa. En donde sea necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína en caso de dolor en el sitio de la inyección. En donde la composición es para ser administra por infusión, esta se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o solución salina. En donde la composición se administra mediante inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina se puede proporcionar dado que los ingredientes se pueden mezclar antes de administración.

Los polipéptidos de la invención se pueden formular como formas de sal o neutras . Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados de ácidos clorhídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., y aquellos formados con grupos carboxilo libres tal como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, etanol 2-etilamino, histidina, procaína, etc .

La cantidad de un polipéptido de la invención que será efectivo en el tratamiento de una afección o enfermedad se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar con base en la presente descripción. Adem s, los ensayos in vitro se pueden emplear opcionalmente para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se puede emplear en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y seriedad de la afección, y se debe decidir de acuerdo con el juicio del practicante y las circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, los rangos de dosificación adecuados para administración intravenosa son generalmente aproximadamente 20-5000 microgramos del composición activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de dosificación adecuados para administración intranasal son generalmente aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta cerrada derivadas de sistemas de ensayo de modelo in vitro o animal. En particular, un régimen de dosificación posible puede ser aproximadamente 60 a 120 ug/kg de peso corporal, inyección subcutánea, dos veces diariamente.

Usos Veterinarios La dosificación puede diferir cuando se administra a un animal saludable animal versus aquellos animales que sufren de una enfermedad. Una evaluación de la dosificación apropiada se puede hacer fácilmente por aquellos expertos en la técnica utilizando ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo, el ensayo de proliferación de mioblasto (Ejemplo 79) o el ensayo de tejido epitelial mamario (Ejemplo 80) como se describe adelante. Los ensayos generales para medir el IGF también se conocen en la técnica, tal como aquellos en el Ejemplo 81.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que algunas especies de animal exhibe la fertilidad estacional influenciada por la longitud del fotoperiodo. Cualquier modalidad de un método veterinario o uso se puede incluir opcionalmente partiendo del método de tratamiento en un tiempo específico con el ciclo reproductor de los animales con el fin de alcanzar el efecto deseado.

Aquellos expertos en la técnica conocerán que el estado reproductivo y el ciclo se pueden determinar fácilmente, y, si se desea, sincronizar mediante el uso de un régimen apropiado .

Cuando se utiliza para indicaciones veterinarias el péptido IGF-1 o IGF-2 de la presente invención se puede utilizar como un dosificador oral, o un complemento para alimentación oral o sólida para los animales.

La invención se describe adicionalmente pero no se limita por los siguientes Ejemplos.

Ejemplos Ej emplo Se construye un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido precursor hIGF-l-Ea que contiene las siguientes modificaciones: eliminación de Gl, eliminación de P2, y eliminación de E3 ; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72. Estas mutaciones se refieren algunas veces como "3mut" a través de la presente descripción. Esto resulta en la secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID N0:8) Las células Cos7 (disponibles de ATCC) se mantienen en DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal, 100U/ml de penicilina, y 100 g/ml de estreptomicina y se colocan en placas en una densidad de 1 x 106 células por placa de 10-cm. Estos cultivos celulares se transfectan con 8 yg de plásmido de expresión utilizando Fugene (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas post-transíección, las células se lavan una vez y se cultivan en medio libre de suero durante 48 horas. Los sobrenadantes se recolectan y se almacenan a -80° C.

Con el fin de evaluar la estabilidad del polipéptido en suero humano, los sobrenadantes recolectados a partir de las células Cos7 transfectadas con (wt) hIGF-lEa intacto (wt) , y hIGF-lEa3mut se incuban durante 16 horas a 37° C en la ausencia o presencia de 10% de suero humano (Sigma) . Las muestras se separan mediante 18% de SDS-PAGE, y se desarrolla inmunotransferencia utilizando anticuerpo policlonal de cabra a IGF-1 humano. Los resultados en la Figura 1A indican que, mientras que el wt hIGF-lEa se degrada sustancialmente después de incubación con suero durante 16 horas, se estabiliza el hIGF-lEa3mut . La densitometría indica que la proporción de IGF-1 no dividido a dividido es aproximadamente 1:6.2, mientras que la proporción para hIGF-lEa3mut es aproximadamente 1:0.68, lo que muestra que estas mutaciones resultan en un polipéptido estabilizado.

Para confirmar que el hIGF-lEa3mut es capaz de señalizar a través del IGF-1R, se mide la fosforilación AKT de las células en contacto con el polipéptido. Los C2C12 se compran de ATCC y se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa (Invitrogen) que contiene 10% de suero bovino fetal (A IMED) , 100U/ml de penicilina (Invitrogen), 100 ug/ml de estreptomicina (Invitrogen) y 2 mM de glutamina (Invitrogen) . Para análisis de fosforilación AKT, las células C2C12 se colocan en placas en una densidad de 0.15 x 106 células por pozo de una placa de 6-pozos y se cultivan en medio de crecimiento durante 72 horas. Se provoca la muerte de las células durante cuatro horas en medio libre de suero y luego se estimulan con diferentes ligandos a 37° C durante 30 minutos. Las células se lisan con amortiguador PhosphoSafe (Cell Signaling) que contienen varios inhibidores de proteasa y se aclaran mediante centrifugación a 14,000 x g durante 15 minutos a 4o C. La fosforilación AKT y niveles AKT totales se analizan mediante ELISA utilizando kit de ELISA emparedado (Ser473) AKT fosfo PathScan y kit de ELISA emparedado AKT PathScan (Cell Signaling) , respectivamente. Los resultados de la fosforilación AKT se resumen en la Figura 2A, que indican que el hIGF-lEa3mut es capaz de activar la ruta celular IGF-IR a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 largo y el IGF-1 recom inante . Además, los datos en la Figura 5 muestran directamente que el hIGF-lEa3mut lleva a la fosforilación AKT.

Luego, para asegurar que la especificidad del receptor del hIGF-lEa3mut restante con el IGF- IR, varios ligandos se agregan a los cultivos de NIH3T3 que sobreexpresan IGF-1R o receptor de insulina (InsR) . Estas células se cultivan bajo las mismas condiciones como se describió anteriormente para las células Cos7. Para análisis de IGF-1R y fosforilación InsR, las células NIH3T3-IGF1R y NIH3T3 -InsR se colocan en placas en una densidad de 0.2 x 106 células por pozo de una placa de 6 -pozos y se cultivan en medio de crecimiento durante 24 horas. Se provoca la muerte a las células durante 18 horas en medio libre de suero y luego se estimulan con diferentes ligandos a 37° C durante 10 minutos. Las células se lisan como se describió anteriormente para el experimento AKT, y los niveles de fosforilación IGF- IR y InsR se analizan mediante ELISA utilizando kit ELISA -InsR e IGFIR-fosfor humano DuoSet IC (R&D Systems) . Los resultados resumidos en las figuras 3A y 3B indican que este polipéptido precursor IGF-1 retiene especificidad para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad.

Ejemplo 2 Se construye un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido precursor hIGF-l-Eb que contiene las siguientes mutaciones: eliminación de Gl, eliminación de P2, y eliminación de E3 ; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut"). Esto resulta en la secuencia de proteína secretada : tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 9) El polipéptido se evalúa de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La figura IB y el uso de la densitometría indica que la proporción de IGF-1 no dividido a dividido es aproximadamente 1:9, mientras que la proporción para hIGF-lEb3mut es aproximadamente 1:1, lo que muestra que estas modificaciones resultan en un polipéptido estabilizado. La figura 2B indica que el hIGF-lEb3mut es capaz de activar la ruta celular IGF- IR a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 largo y el IGF-1 recombinante . Además, los datos en la Figura 5 muestran directamente que el hIGF-lEb3mut lleva a la fosforilación AKT. Los resultados resumidos en las figuras 3C y 3D indican que este polipéptido precursor IGF-1 retiene especificidad para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad.

E emplo 3 Se construye Un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido precursor hIGF-l-Ec que contiene las siguientes mutaciones: eliminación de Gl, eliminación de P2, y eliminación de E3 ; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut") . Esto resulta en la secuencia de proteina secretada : tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 10) El polipéptido se evalúa de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La figura 1C y el uso de la densitometría indica que la proporción de IGF-1 no dividido a dividido es aproximadamente 1:5, mientras que la proporción para hIGF-lEc3mut es aproximadamente 1:0.96, lo que muestra que estas modificaciones resultan en un polipéptido estabilizado. La figura 2D indica que el hIGF-lEc3mut es capaz de activar la ruta celular IGF-1R a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 largo y el IGF-1 recombinante . Además, los datos en la Figura 5 muestran directamente que el hIGF-lEc3mut lleva a la fosforilación AKT. Los resultados resumidos en las figuras 4A y 4B indican que este polipéptido precursor IGF-1 retiene especificidad para el receptor IGF-1 y se debe unir al receptor de insulina relacionado con baja afinidad .

Ejemplo 4 Se construye un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido precursor quimérico hIGF-l-Eab que contiene las siguientes modificaciones al péptido hIGF-1-Eb: eliminación de Gl, eliminación de P2 , y eliminación de E3 ; mutación de R37 a A; eliminación de R71 y eliminación de S72 (es decir, el "3mut"); e inserción de aminoácidos Ea 93 a 102 entre aminoácidos 95 y 96 de Eb. La inserción crea una señal de glicosilación ligada a N putativa en N92. Esto resulta en la secuencia de proteína secretada : tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthp ggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 11) El polipéptido se evalúa de acuerdo con algunos de los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. La figura 2C indica que el hIGF-lEab3mut es capaz de activar la ruta celular IGF-IR a un grado similar como el reactivo de control positivo R3-IGF-1 largo y el IGF-1 recombinante . Los resultados resumidos en las figuras 4C y 4D indican que este polipéptido precursor IGF-1 retiene especificidad para el receptor IGF-1 y no activa el receptor de insulina.

Ejemplo 5 Se construye un vector de expresión de ADN que codifica el polipéptido precursor multímero hIGF-l-Eb que contiene las siguientes mutaciones: eliminación de Gl, eliminación de P2, eliminación de E3 , eliminación de R36, eliminación de R37, eliminación de R71, eliminación de S72, eliminación de los últimos siete aminoácidos de terminal C de Eb; y la inserción a el terminal C de este precursor de dos péptidos Eb adicionales ambos sin el R71 y S72 y los últimos siete aminoácidos de terminal C y un cuarto y final péptido Eb sin el R71 y S72. La figura 6A muestra un dibujo esquemático de esta construcción. Esto resulta en la secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemyca plkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteasl qirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkn tksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmp ktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrna ecrgkkgk (SEQ ID NO: 12) Este polipéptido se somete a un ensayo de fosforilación AKT como se describe en el Ejemplo 1. La figura 5 indica que este multímero hIGF-l-Eb es capaz de señalizar a través de la ruta IGF-IR.

Ejemplo 6 Se puede expresar un polipéptido precursor hIGF-l-Eb de la invención como se muestra esquemáticamente en la Figura 6B. Esta construcción contiene las siguientes modificaciones: eliminación de Gl, eliminación de P2, eliminación de E3 , eliminación de R36, eliminación de R37, eliminación de R71, eliminación de S72; y la inserción de aminoácidos Ea 93-102 entre aminoácidos 95 y 96 de Eb, creando por lo tanto un sitio de glicosilación ligado a N en la posición N92 y N100. Esto resulta en la secuencia de proteína secretada: tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemyca plkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpgg eqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 13) Ejemplo 7 Se puede expresar un polipéptido precursor hIGF-2-? de la invención que tiene las siguientes modificaciones: eliminación de P4 , eliminación de S5, y eliminación de E6; mutación de R38 a A; y eliminación de R68 y eliminación de D69. Esto resulta en la secuencia de proteína secretada: ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletyc atpaksevstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvla keleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk (SEQ ID NO: 14) Ejemplo 8 Se puede expresar un polipéptido precursor hIGF-l-Ea de la invención que tiene las siguientes mutaciones: eliminación de Gl y eliminación de P2 ; mutación de E3 a X en donde X es un aminoácido no natural que se pegila; mutación de R37 a A; y eliminación de R71 y eliminación de S72. Esto resulta en la secuencia de proteína secretad : Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 15) Ejemplos 9-78 (? = eliminación) 9) hIGF-l-Ea: AGI, ??2 , ??3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 16) 10) hIGF-l-Ea : AGI, ??2 , ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 17) 10) hIGF-l-Ea : AGI, ??2 , ??3; R36A; AR71, ??72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 18) 11) hIGF-l-Ea : AGI , ??2 , ??3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 19) 12) hIGF-l-Ea: AGI, ??2, ??3; R37A; ??72 tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO : 2 O ) 13) hIGF-l-Ea: AGI, ??2, ??3 , AR37; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 21) 14) hIGF-l-Ea: AGI, ??2, ??3 , AR37; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 22) 15) hIGF-l-Ea: AGI, ??2, ??3; AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyf kptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 23) hIGF-l-Eb: AGI , ??2 , ??3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:24) 17) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 25) 18) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 26) 19) hIGF-l-Eb : AGI, ??2, ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 27) 20) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 28) 21) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3 , AR37; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 29) 22) hIGF-l-Eb: AGI, ??2 , ??3 , AR37; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 30) 23) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3 , AR37; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteas lqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 31) 24) hIGF-l-Ec: AGI, ??2 , ??3; R36A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 32) 25) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 33 ) 26) hIGF-l-Ec: AGI, ??2 , ??3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 34) 27) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??2; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 35 ) 28) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 36 ) 29) hIGF-l-Ec: AGI , ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 37 ) 30) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??3 , AR37, AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 38 ) 31) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??3, AR37, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO : 39 ) 32) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3; R36A; AR71 inserción de Ea aa 93-102 entre aa 95 y 96 de Eb (es decir, "Eab") tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:40) 33) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkg kth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID N0:41) 34) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3, AR37, AR71 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthp ggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 42) 35) hIGF-l-Eab: AGI, ??2 , ??3; R36A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 3) 36) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3; R37A; AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkg kth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 44) 37) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3 , AR37, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemyc aplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthp ggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 45) 38) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3; R36A; AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthp ggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 46) 39) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3, AR37, AR71, AS72 tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlerayc aplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpg geqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 7) 40) hIGF-l-Ea: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO : 48 ) 41) hIGF-l-Eb: ??2, ??3; R37A; AR71, ??72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 9) 42) multímero hIGF-l-Eb: (AGI, ??2, ??3; R37A) -3xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntk sqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqk yqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrg kkgk (SEQ ID NO: 50) 43) multímero hIGF-l-Eb: (??2 , ??3; R37A) -3xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkt hpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktq kyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecr gkkgk (SEQ ID NO: 51) 44) hIGF-1-Ec: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 52) 45) hIGF-1-Ea: ??3 ; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccf scdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 53) 46) hIGF-1-Eb : ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegt easlqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ??) NO: 54) 47) multímero hIGF-l-Eb: (AGI, ??2 , ??3; R37A) -3xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntk sqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqk yqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrg kkgk (SEQ ID NO:55) 48) multimero hIGF-1-Eb: (??3; R37A) -3xEb (AR71, AS72, ?? term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegt easlqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdrapktqkyqppstnkntksqrrkgwpk thpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkn tksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpkt qkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaec rgkkgk (SEQ ID NO: 56) 49) hIGF-l-Ec: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 57) 50) hIGF-l-Ea: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 58) 51) hIGF-1-Eb: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegt easlqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:59) 52) hIGF-1-Ec: ??3; R37A; AR71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk ( SEQ ID NO:60) 53) hIGF-1-Eab: ??3; R37A; ? R71, AS72 gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkt hpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 61) 54) multímero hIGF-l-Eb : (??3; R37A) -3xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrle mycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegt easlqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdrapktqkyqppstnkntksqrrkgv k thpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkn tksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpkt qkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaec rgkkgk (SEQ ID NO:62) 55) hIGF-l-Ea: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgf fnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrl emycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 63) 56) hIGF-l-Eb: E3A; R37A AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrl emycaplk aksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgv kt pggeqkeg teaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 64) 57) hIGF-l-Ec: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrl emycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk ( SEQ ID NO: 65) 58) hIGF-l-Eab: E3A; R37A; AR71, AS72 gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrl emycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpk thpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:66) 59) multímero hIGF-l-Eb: (E3A; R37A) -3xEb (AR71, AS72, ?? term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrl emycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkeg teaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwp kthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnk ntksqrrkg^kthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpk tqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnae crgkkgk (SEQ ID NO: 67) 60) hIGF-l-Ea: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 68) 61) hIGF-l-Eb: ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 69) 62) hIGF-l-Ec: ??2, ??3; R37A; AR71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 181) 63) hIGF-l-Eab: ??2 , ??3; R37A; A 71, AS72 gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 70) 64) multímero hIGF-l-Eb: (??2, ??3; R37A) -3xE (AR71, AS72, ??-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkt hpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktq kyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecr gkkgk (SEQ ID NO: 71) 65) hIGF-l-Eb: AGI, ??2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO:72) 66) hIGF-l-Ec: AGI , ??2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 73) 67) hIGF-l-Eab: AGI, ??2; E3X; R37A; AR71, AS72 Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 74) 68) multímero hIGF-l-Eb: (AGI, ??2; E3X; R37A) -3xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72) Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlem ycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte a lqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkt hpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktq kyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecr gkkgk (SEQ ID NO:75) 69) hIGF-l-Ea: AGI , ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksaXvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm (SEQ ID NO: 76) 70) hIGF-l-Eb: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 77) 71) hIGF-l-Ec: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk (SEQ ID NO: 78) 72) hIGF-l-Eab: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71; S72X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk (SEQ ID NO: 79) 73) multímero hIGF-l-Eb: (AGI, ??2, ??3; R37A) -Eb (AR71; S72X; AC-term 7 aa) -2xEb (AR71, AS72, AC-term 7 aa) - E (AR71 , AS72) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpakXsavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegte aslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkt hpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnknt ksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktq kyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecr gkkgk (SEQ ID NO: 80) 74) hIGF-l-Ea: AGI, ??2, ??3; R37A; AR71, AS72; N92X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm (SEQ ID NO : 81 ) 75) hIGF-l-Eb : AGI, ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72; C142X tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (SEQ ID NO: 82) 76) hIGF-l-Eab: AGI, ??2 , ??3; R37A; AR71, AS72; C151X tlcgaelvdalqf cgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthp ggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk (SEQ ID NO: 83) 78) multímero hIGF-l-Eb (AGI, ??2 , ??3; R37A) -3xE (AR71, AS72, AC-term 7 aa)-Eb(AR71, AS72; C71X) tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemy caplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegtea slqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkth pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntk sqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqk yqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrg kkgk (SEQ ID NO: 84) Ejemplo 79: Ensayo De Proliferación De Mioblasto El ensayo de proliferación de mioblasto proporciona un indicador in vitro confiable de la actividad IGF y se utiliza como un modelo para factores que afectan mioblastos embriónicos y células satélite. Los factores activos en este sistema de ensayo se comportan de forma similar en cultivos de mioblastos primarios. La mejora de la proliferación in vitro de mioblastos mediante un péptido de esta invención indica su actividad en la que se origina el incremento de la proliferación de mioblastos y, por lo tanto, un incremento en el número miofibras finales en el útero. Además, la mejora similar de proliferación de mioblastos indica que los péptidos de esta invención se pueden utilizar para mejorar la hipertrofia muscular de adulto, por ejemplo, por vía de estimulación de proliferación de célula de músculo satélite .

Ejemplo 80: Ensayo De Tejido Epitelial Mamario En animales lactantes, la cantidad de tejido epitelial mamario es un factor limitante en la producción de leche, ya que estas son las células que producen y secretan leche. El empleo de sistemas in vitro, las células epiteliales obtenidas de glándulas mamarias de animales se puede estimular mediante el IGF-1 o IGF-2 o modificado de la presente invención para proliferar y producir cantidades incrementadas de constituyentes de leche. Se puede demostrar adicionalmente que las células epiteliales mamarias estimuladas para proliferar en un tal sistema de célula in vitro se puede reimplantar en almohadillas de grasas mamarias clarificadas y se puede estimular para proliferar y/o producir lecha en animales hembra lactantes.

Ejemplo 81: Medida de IGF-1 o IGF-2 en Sangre u Otros Fluidos Corporales La cantidad efectiva del péptido administrada parenteralmente por dosis se puede medir mediante una curva de respuesta de dosis. Por ejemplo, los péptidos IGF modificados de la invención se pueden medir en la sangre u otros fluidos corporales del sujeto a ser tratado para determinar la dosificación.

Alternativamente, uno puede administrar cantidades incrementadas del péptido al sujeto y revisar los niveles de suero del sujeto para IGF-1 y IGF-2 modificados. La cantidad de péptido a ser empleado se puede calcular sobre una base molar basada en estos niveles de suero de IGF-1 o IGF-2 modificados.

Un método para determinar la dosificación apropiada del péptido que vincula la medición de un péptido IGF de la invención en un fluido biológico tal como un fluido corporal o sanguíneo. La medición de tales niveles se puede hacer mediante cualesquier medios, que incluyen RIA y ELISA. Después de medir los niveles, el fluido se pone en contacto con el péptido utilizando dosis únicas o múltiples. Después de esta etapa de contacto, los niveles IGF se re-miden en el fluido. Si los niveles IGF del fluido han caído por una cantidad suficiente para producir la eficacia deseada para la que la molécula se ha administrado, entonces la dosis de molécula se puede ajustar para producir la máxima eficacia. Este método se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Preferiblemente, este método se lleva a cabo in vivo, es decir, después de que el fluido se extrae de un sujeto y se miden los niveles de IGF, el péptido aquí se administra al mamífero utilizando dosis única o múltiple (esto es, se logra la etapa de contacto mediante la administración a un animal) , y luego se re-miden los niveles del fluido extraído del animal. Otro método para determinar la dosificación es el uso de anticuerpos con el péptido u otro método de detección para el péptido en el formato LIFA.

Ejemplo 82: Farmacocinéticos In Vivo de hIGF-l-Ec 3mut Ratones machos adultos (n = 3/grupo) reciben una inyección de bolo intravenosa (i.v.) de rhIGF-1 a 1 mg/kg, y hIGF-1-Ec 3mut (descrito en el Ejemplo 3) a 1.55 mg/kg. se recolectan los especímenes de sangre en series a 5, 15, 30 y 60 minutos después de administración del material de prueba. Las concentraciones de suero de rhIGF-1 y hIGF-l-Ec 3mut se determinan mediante ELISA. Este ensayo es específico para hIGF-1. Las dosis equimolares de rhIGF-1 y hIGF-l-Ec 3mut se administran i.v. en ratones. Los resultados muestran niveles significativamente altos de la proteína hIGF-l-Ec 3mut según se compara con rhIGF-1 en todos los puntos de tiempo examinados, que indican que el hIGF-l-Ec 3mut es metabólicamente más estable que los IGF1 de 70 aminoácidos de longitud.

IGF-l-Ec 3mut tiempo (min) (nM) IGF-1 (nM) 5 201.4 54.7 15 65.3 14.3 30 12 2.4 60 0.76 0.2

Claims (44)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido caracterizado porque comprende una proteína precursora IGF-1 animal no humana, en donde la división del péptido E del IGF-1 mediante una proteasa se reduce por la modificación de la proteína precursora.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la proteína precursora IGF-1 animal no humana se origina de una especie vertebrada no humana .

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque la especie vertebrada no humana se selecciona de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, ave, perro, gato o pez.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína precursora comprende el péptido Ea.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque el péptido Ea se selecciona de una secuencia animal no humana de la Figura 8A.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína precursora comprende el péptido Eb.

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque el péptido Eb se selecciona de una secuencia animal no humana de la Figura 9A.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, caracterizado porque se eliminan los últimos siete aminoácidos de terminal C de Eb.

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proteína precursora comprende el péptido Ec .

10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 9 caracterizado porque el Ec se selecciona de una secuencia animal no humana de la Figura 10A.

11. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se elimina o muta el Gl de la proteína precursora.

12. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se elimina o muta el P2 de la proteína precursora.

13. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se elimina o muta el E3 de la proteína precursora.

14. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se elimina o muta el R36 de la proteína precursora.

15. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el R36 se muta a alanina.

16. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se elimina o muta el R37 de la proteína precursora.

17. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el R37 se muta a alanina.

18. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende adicionalmente la secuencia NXS/T de consenso de glicosilación ligada a N.

19. El polipéptido Eb de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende adicionalmente 93-102 aminoácidos de Ea insertados entre aminoácidos N95 y T96 del Eb.

20. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende adicionalmente un oligosacárido ligado covalentemente a una cadena lateral de aminoácido de la proteína precursora .

21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el oligosacárido se liga covalentemente a una cadena lateral arginina de la proteína precursora.

22. El polipéptido de conformidad con cualqu reivindicación precedente, caracterizado porque residuo de la proteína precursora se reemplaza por un aminoácido no natural.

23. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el aminoácido no natural comprende un grupo acetileno o azido.

24. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende adicionalmente un grupo funcional poli (etilenglicol) adherido covalentemente a una cadena lateral de la proteína precursora.

25. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende adicionalmente un péptido E adicional ligado al terminal C de la proteína precursora.

26. Un polipéptido caracterizado porque comprende, de terminal N a terminal C, una proteína precursora IGF-1 que comprende un primer péptido Eb, en donde se eliminan Gl, Pl, y El, se eliminan R36 y R37, se eliminan R71 y S72, y se eliminan los últimos siete aminoácidos de terminal C del primer péptido Eb; un segundo péptido Eb, en donde se eliminan R71, S72, y los últimos siete aminoácidos de terminal C del segundo péptido Eb; un tercer péptido Eb, en donde se eliminan R71, S72, y los últimos siete aminoácidos de terminal C del tercer péptido Eb; y un cuarto péptido Eb, en donde se eliminan R71 y S72.

27. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque se elimina o muta R71 o S72 de la proteína precursora.

28. Un polipéptido caracterizado porque comprende una proteína precursora IGF-2 animal no humana, en donde la división del péptido E de IGF-2 mediante una proteasa se reduce por la modificación de la proteína precursora.

29. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 28 caracterizado porque la especie vertebrada no humana se selecciona de un ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, ave, perro, gato o pez.

30. El polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 28-39, caracterizado porque la proteína precursora comprende el péptido E de IGF-2.

31. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30 caracterizado porque el péptido E se selecciona de una secuencia de la Figura 12A.

32. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 -32, caracterizado porque se elimina o muta R68 o D69 de la proteína precursora.

33. Un método para mejorar la proporción y/o grado de crecimiento en un animal no humano que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

34. Un método de conformidad con la reivindicación 33 caracterizado porque el animal no humano es un animal que produce carne que comprende cerdo, ganado, ovejas, aves de corral y peces .

35. Un método para mejorar la eficiencia de conversión de alimento en el tejido corporal en un animal no humano que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

36. Un método de conformidad con la reivindicación 35 caracterizado porque el animal no humano es uno de los animales que produce carne que comprende cerdos, ganado, ovejas, aves de corral y peces.

37. Un método para mejorar la producción de leche en animales no humanos lactantes que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

38. Un método de conformidad con la reivindicación 37 caracterizado porque el animal no humano es uno de los animales lactantes que comprende ganado lechero, cerdos, ovejas y cabras.

39. Un método para tratar un animal no humano por síntomas de deterioro asociados con caquexia, trauma u otras enfermedades de consumo que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

40. Un método de conformidad con la reivindicación 39 caracterizado porque el no humano es un animal de compañía que comprende perros, gatos y caballos.

41. Un método para tratar animales no humanos lactantes para mejorar en salud neonatal que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

42. Un método de conformidad con la reivindicación 41 caracterizado porque el animal no humano es un animal lactante que comprende ganado lechero, cerdos, ovejas y cabras .

43. Uso del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 para la fabricación de una composición veterinaria para uso en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-42.

44. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 43 en donde dicha composición veterinaria es una dosificación oral, complemento para alimento oral o complemento para alimento sólido.