BRPI0715869A2

BRPI0715869A2 - mÉtodos e composiÇÕes para o tratamento de neuropatias mediadas por anticorpos

Info

Publication number: BRPI0715869A2
Application number: BRPI0715869-6A2A
Authority: BR
Inventors: Susan Halstead; Hugh Willison; Russell P Rother
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2007-09-05
Publication date: 2013-07-30
Also published as: JP5695317B2; AU2007293013A1; KR20090051063A; JP2014240438A; WO2008030505A8; WO2008030505A2; EP2380907B1; EP2380907A1; WO2008030505A3; NZ575018A; EP2913342A1; KR101503540B1; DK2061810T3; CA2662480C; JP2010502708A; MX2009002426A; IL197148A; EP2061810B1; CA2662480A1; SI2061810T1

Abstract

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE NEUROPATIAS MEDIADAS POR ANTICORPOS". Trata-se do uso de um terapêutico capaz de inibir o complemento, por exemplo, um anticorpo anti-C5 para tratar neuropatias mediadas por anticorpo.

Description

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE NEUROPATIAS MEDIADAS POR ANTICORPOS"

Referência Remissiva aos Pedidos de Depósito Correlatos

Esse pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório No. de Série U.S. 60/842.296, depositado em 5 de setembro de 2006, que está incorporado aqui em sua totalidade a título de referência.

Campo da Invenção

Esse pedido proporciona métodos e composições para o tratamento de neuropatias mediadas por anticorpos que ativam o complemento para induzir lesão de nervo. Em modalidades específicas, o pedido se refere ao uso de inibidores de cascata de complemento como agentes terapêuticos para tratar neuropatias mediadas por anticorpos.

Antecedentes da Invenção

A neuropatia é um termo genérico usado para descrever doenças do sistema nervoso periférico. Há cerca de 200 causas diferentes conhecidas de neuropatias periféricas. Embora a maioria das neuropatias afetem as três classes principais de fibras nervosas a níveis variados, algumas doenças envolvem apenas uma ou duas, e são consideradas neuropatias pura ou predominantemente motoras, sensoriais, ou autonômicas.

A síndrome de Guillain-Barré (GBS) é uma doença aguda que envolve o sistema nervoso periférico que geralmente ocorre duas a três semanas após uma doença tipo gripe ou outra infecção, inclusive enterite por Campylobacter. Trata-se, na maioria das vezes, de uma neuropatia motora, o que significa que seus sintomas estão amplamente relacionados com a complicação dos nervos motores. Apesar da natureza principalmente motora da doença, os primeiros sintomas podem ser entorpecimento e formigamento nas extremidades inferiores imediatamente acompanhados por fraqueza dos músculos distais das extremidades inferiores. O risco ocorre quando a fraqueza envolve os músculos da respiração. A GBS está associada em uma proporção de casos com auto-anticorpos anti- gangliosídeo (AGAs) a uma ampla gama de estruturas especificas de glicolipídeo, e também com anticorpos a outros componentes nervosos que incluem proteínas da mielina e glicosaminoglicanas em alguns casos, e em outros casos de GBS1 presume-se que os anticorpos estejam presentes, porém ainda devem ser formalmente identificados.

A síndrome de Miller Fisher (MFS) é uma variante da síndrome de Guillain-Barré, estimando-se 5 a 10% de casos. Em uma análise, a incidência anual foi estimada em 0,09 por 100.000 habitantes. A MFS é caracterizada pelo início agudo de oftalmoplegia, ataxia e areflexia. Os anticorpos gangliosídeo anti-GQ1b são a característica serológica de MFS. Os anticorpos podem aparecer em alguns casos através da simulação molecular com lipopolissacarídeos de Campylobacter. Hoje, é amplamente aceito que mais de 90% dos pacientes com MFS possuem anticorpos IgG anti-GQ1b durante a fase aguda da doença. A ausência completa de anticorpos IgG anti-GQ1b de grupos de controle normais e outros grupos de controle da doença é igualmente significativa, indicativa de um alto nível de especificidade para essa associação de doença. O pico de títulos de anticorpo em apresentação clínica decai rapidamente durante a recuperação clínica. Os títulos de anticorpo IgG Anti-GQIb também são elevados no soro em fase aguda de alguns pacientes com síndrome de Guillain-Barré com oftalmoplegia. O marcador de anticorpo IgG anti-GQ1b também identifica um agrupamento de síndromes estreitamente relacionadas, geralmente consideradas formes frustes de MFS1 que têm em comum a presença de oftalmoplegia externa ou ataxia tipo cerebelar.

O tratamento atual de GBS1 inclusive casos mediados por AGA1 é imunoglobulina intravenosa (IVIg), plsamaférese, ou uma combinação de ambas. Embora algumas neuropatias tipo GBS sejam geralmente doenças autolimitadoras, muitas vezes a intervenção terapêutica intensiva é necessária. Alguns indivíduos ficam com déficits residuais. Outras neuropatias são crônicas e apenas sintomas como dor são tratados. Há uma grande necessidade de tratamentos adicionais para melhorar os sintomas e reduzir o tempo de recuperação de neuropatias mediadas por anticorpos.

Sumário da Invenção

São apresentados os métodos e composições para tratar pacientes que sofrem de neuropatias mediadas por anticorpos. Em algumas modalidades, um método para tratar uma neuropatia mediada por anticorpos em um mamífero compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento.

Em inúmeras neuropatias foram identificados anticorpos de componentes específicos de nervos. Algumas dessas doenças são mediadas por auto-anticorpos anti- gangliosideo e anti-glicolipídeo, tal como, a variante de Miller Fisher da síndrome de Guillain-Barré. Os anticorpos a uma ampla gama de glicolipídeos inclusive GM1, GMI(NeuGc), GMIb1 GaINAc-GMIb, GDIa1 GaINAc-GDIa1 GD1b, 9-0-acetil GD1b, GD3, GT1a, GT1b, GQ1b, GQ1ba, LM1 , galactocerebrosídeo e SGPG foram descritos em documentos sobre neuropatias inflamatórias, como relatos de casos e em seqüências maiores. Em uma modalidade exemplificativa, um método para tratar uma neuropatia mediada por AGA em um mamífero compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento, tal como, um anticorpo antí-C5.

Os anticorpos para outros componentes de nervos, inclusive proteínas e glicoproteínas também foram descritos como causadores em neuropatias. Por exemplo, o IgM monoclonal contra glicoproteína associada à mielina causa neuropatia paraproteinêmica IgM anti-MAG (Willison and Yuki, Brain, 2002, 125, 2591-2625). Em uma proporção de casos de neuropatia, presume-se que os anticorpos estejam presentes devido aos padrões patológicos similares e respostas ao tratamento, como observado em casos associados a anticorpo, porém a especificidade do anticorpo presumido ainda deve ser formalmente identificada. Em algumas modalidades, a neuropatia mediada por anticorpos pode ser uma ou mais entre as seguintes: neuropatia axonal motora aguda, polineuropatia desmielinizante inflamatória aguda, encefalite do tronco encefálico de Bickerstaff, oftalmoparese aguda, síndrome de Guillain-Barré atáxica, fraqueza faríngeo-cervical-braquial, síndromes de neuropatia crônica com anticorpos anti-glicolipídeo, neuropatia paraproteinêmica IgM anti- MAG, neuropatia atáxica sensorial crônica com anticorpos anti-disialosil, IgM, IgG e neuropatia paraproteinêmica IgA, neuropatia motora com anticorpos anti-GM1 e anti-GM2, neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), neuropatia motora multifocal (MMN), e neuropatia sensorial e motora desmielinizante adquirida multifocal (MADSAM).

Em algumas neuropatias, a ativação de complemento pode ser independente de anticorpo, por exemplo, em neuropatia amilóide hereditária. Nessa doença, os marcadores de ativação de via clássicos antigos, C1q e C4, foram detectados em depósitos de amilóide na ausência de anticorpo detectável (Hafer-Macko et al., J Peripher Nerv Syst. 2000 Sep;5(3): 131-9; incorporado aqui a título de referência). Isso sugere que a ativação independente de anticorpo da via clássica pode ocorrer e que os inibidores de cascata de complemento podem ser eficazes no tratamento de neuropatias mediadas por complemento independentes de anticorpo. Em uma modalidade exemplificativa, um método para tratar uma neuropatia mediada por complemento independente de anticorpo em um mamífero compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento. Em algumas modalidades, um anticorpo do pedido inibe a ativação da via clássica, da via alternativa ou da via de complemento de lectina. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um anticorpo contra qualquer elemento do grupo que compreende os componentes de complemento C5, C5b, C6, C7, C8, e C9. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um anticorpo contra C5. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um inibidor de clívagem C5. Em algumas modalidades, um inibidor de cascata de complemento do pedido é selecionado entre: um polipeptídeo, um análogo de polipeptídeo, um peptidomimético, um anticorpo, um ácido nucléico, uma construção de RNAi, um análogo de ácido nucléico, e uma molécula pequena.

Em algumas modalidades, um anticorpo do pedido é um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o dito anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, um anticorpo bivalente, um anticorpo quimerizado ou quimérico ou fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo, um anticorpo humano desimunizado ou fragmento de anticorpo, um anticorpo completamente humano ou fragmento de anticorpo, um anticorpo de cadeia simples, um Fv1 um Fab1 um Fab', ou um F(ab')2.

Em algumas modalidades, um anticorpo do pedido inibe a ativação da via clássica, da via alternativa ou da via de complemento de lectina. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um anticorpo contra qualquer elemento do grupo que compreende os componentes de complemento C5, C5b, C6, C7, C8, e C9. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um anticorpo contra C5. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é um inibidor de clivagem C5.

Em algumas modalidades, um anticorpo do pedido é eculizumab. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é pexelizumab. Em algumas modalidades, o dito tratamento com eculizumab é crônico. Em algumas modalidades, o dito tratamento com pexelizumab compreende tratar um episódio agudo.

Em algumas modalidades, um mamífero do pedido é tratado ao administrar o dito anticorpo de forma intravenosa. Em algumas modalidades, o dito anticorpo é administrado de forma sistêmica ao dito mamífero. Em algumas modalidades, o dito agente é administrado localmente ao dito mamífero.

Em algumas modalidades, os tratamentos do pedido resultam em lesão neural reduzida em um mamífero do pedido.

Em algumas modalidades, um mamífero do pedido é tratado para inibir ou reduzir o grau e/ou nível de uma condição fisiológica indesejada que resulta de excesso de lesão do nervo devido à neuropatia dependente de anticorpo. Em algumas modalidades, a dita condição fisiológica indesejada é selecionada a partir do grupo que consiste em oftalmoplegia, ataxia, areflexia, coordenação muscular anormal, paralisia dos músculos oculares, dores musculares, ausência dos reflexos do tendão, entorpecimento e formigamento nas extremidades inferiores, fraqueza dos músculos distais das extremidades inferiores, pé caído, fraqueza que envolve toda a extremidade inferior, fraqueza que envolve as extremidades superiores, fraqueza nos músculos da respiração, e morte.

Em algumas modalidades, os métodos do pedido resultam em formação de complexo de ataque à membrana reduzida (MAC) em axônios motores pré-sinápticos.

Em algumas modalidades, os métodos do pedido resultam em restauração de uma freqüência normal de potenciais de placa terminal em miniatura.

Em algumas modalidades, os métodos do pedido resultam em restauração de transmissão sináptica nas junções neuromusculares.

Em algumas modalidades, os métodos do pedido resultam em perda reduzida de integridade terminal nas junções neuromusculares. Em outra modalidade, um método para tratar síndrome de Guillain-Barré em um

mamífero compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento, tal como, um anticorpo anti-C5. Em outra modalidade, um método para tratar a variante de Miller Fisher da síndrome de Guillain-Barré em um mamífero compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento, tal como, um anticorpo anti-C5.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As FIGURAS 1A-1F apresentam uma demonstração imunoistológica do efeito

protetor de eculizumab contra o depósito de MAC e axonopatia motora terminal em NMJs no modelo de MFS in vitro. As preparações de hemidiafragma de camundongo foram pré- incubadas com gangliosídeo CGM3 mAb anti-GQ1b (50/vg/ml) e subseqüentemente tratadas com 40% de soro humano normal (NHS) com eculizumab adicionado (mAb anti-humano C5 neutralizante; 100 //g/ml) ou mAb de controle combinado com isotipo não-específico (100 //g/ml), e comparado com tecido não-tratado. A Figura 1A mostra que os tecidos tratados com NHS/eculizumab apresentaram coloração C3c intensa em junções neuromusculares (NMJs), similar àquela de tecidos tratados com NHS/mAb de controle (p=0,12). A Figura 1B mostra que a coloração do complexo de ataque à membrana (MAC) não foi observada na presença de eculizumab (intensidade comparável à linha de base , p=0,92), indicando inibição completa de complemento terminal. A Figura 1C mostra que a integridade axonal foi preservada na presença de eculizumab, como avaliado pela presença de sinal de neurofilamento (NF), comparável com a linha de base em controles não-tratados (p=0,80). As Figuras 4D, 4E e 4F são imagens imunofluorescentes ilustrativas de NMJs em músculo de membrana que demonstram o efeito protetor de eculizumab contra o depósito de MAC (Figura 4D), dano à célula de Schwann pré-sináptica (pSC) (Figura 4E) e dano axonal motor terminal (Figura 4F), como comparado com tratamento com NHS/mAb de controle. A coloração do receptor de acetilcolina nicotínico pós-sináptico (nAChR; púrpura) foi usada para delinear a NMJ. A proteína de complemento intermediária C3c (Figura 4D) permanece abundantemente depositada em NMJs. *p<0,01, diferente da não-tratada; #p<0,01, diferente da tratada com mAb de controle; barra de escala = 20 //m.

As Figuras 2a a 2G mostram que eculizumab protege contra defeitos eletrofisiológicos e funcionais induzidos em NMJs no modelo de MFS in vitro. As preparações de hemidiafragma de camundongos foram pré-incubadas com gangliosídeo CGM3 mAb anti-GQ1b (50 /yg/ml) e subseqüentemente tratadas com 40% de soro humano normal (NHS) com 100 //g/ml de eculizumab adicionados (mAb anti-humano C5 neutralizante) ou mAb de controle combinado com isotipo não-específico. A Figura 2A mostra a liberação espontânea de acetilcolina uniquantal, medida como freqüência de MEPP, na NMJ. Eculizumab preveniu a indução de uma alta freqüência de MEPP (p< 0,001, n=5 músculos). A Figura 2B mostra traços representativos de duração 1 s obtidos durante a incubação com NHS, tanto com eculizumab adicionado (traço superior) como mAb de controle (traço inferior). A Figura 2C mostra que a contração assíncrona das fibras musculares induzida por NHS foi amplamente impedida por eculizumab (p<0,01, n= 5 músculos). A Figura 2D mostra que eculizumab impediu completamente a ocorrência de NMJs silenciosas (ou seja, sem sinais eletrofisiológicos sinápticos detectáveis). Nas Figuras 2E, 2F e 2G as preparações músculo-nervo de hemidiafragma foram pré-incubadas com 200 /yg/ml de CGM3 e o efeito protetor de diversas concentrações de eculizumab (0 a 100 /yg/ml, n=2-5 músculos por concentração) adicionadas ao NHS foi observado em experimentos de registro de força de contração muscular. A Figura 2E mostra exemplos dos perfis de contração observados 0, 30, 60 e 90 min após o início da incubação de NHS sem eculizumab adicionado ou 6 ou 100 //g/ml de eculizumab adicionados. Cada contração foi obtida por estimulação elétrica supra-máxima do nervo frênico durante 3 s a 40 Hz. A Figura 2F mostra o desenvolvimento da perda de contração durante a incubação de NHS com as diversas concentrações de eculizumab adicionadas. A Figura 2G mostra a relação concentração-efeito de eculizumab e a proteção contra a perda de contração após 90 min depois do início da incubação de NHS. Uma curva sigmóide de Boltzmann é ajustada pelos pontos de dados, que produzem um EC50 de 7,1 /vg/ml. As barras de erro nas Figuras 2A, 2D, 2F e 2G representam S. Ε. M.

As FIGURAS 3 a 3B mostram a curva dose-resposta de eculizumab in vivo. A Figura 3A mostra que uma dose crescente de eculizumab resulta em uma redução dose- dependente no depósito de MAC na NMJ. A Figura 3B mostra o sinal de neurofilamento e demonstra a preservação da integridade axonal em todas as doses de eculizumab investigadas quando comparadas com controle de linha de base tratado com PBS.

As Figuras 4 a 4H mostram que a paralisia respiratória no modelo de MFS in vivo é impedida por eculizumab devido à inibição de bloco pré-sináptico de transmissão neuromuscular no diafragma. Os camundongos (n=6) foram injetados de forma intraperitoneal com 1,5 mg de gangliosideo mAb CGM3 anti- GQ1b e, 16 h depois, com 0,5 ml soro humano 100% normal (NHS) como fonte de complemento. Uma dose de 200 /vg de eculizumab ou mAb de controle foi injetada na veia da cauda pouco antes da injeção de NHS. A Figura 4A mostra a análise de dinamometria 2h após a injeção de NHS. Eculizumab impediu a perda de força de tração observada no grupo mAb de controle (p<0,01). A Figura 4B mostra o volume tidal médio e a Figura 4C mostra a freqüência respiratória medida com pletismografia de corpo inteiro antes da injeção de NHS e durante a 2a, 4a e 6a hora após a injeção de NHS. O desenvolvimento da dificuldade respiratória foi impedido por eculizumab. A Figura 4D mostra exemplos de traços de 1 s de sinais de pletismografia obtidos em camundongos tratados com eculizumab e mAb de controle. A Figura 4E mostra a força de contração e a Figura 4F mostra a força tetânica produzida no músculo do diafragma dissecado por uma estimulação nervosa elétrica simples e de 40 Hz, respectivamente. Eculizumab preveniu completamente a paralisia severa observada em músculos dos camundongos tratados com mAb de controle (p<0,01). A Figura 4G mostra que eculizumab preveniu quase completamente a ocorrência de NMJs silenciosas (ou seja, sem sinais eletrofisiológicos sinápticos detectáveis) nesses camundongos (p< 0,001). A Figura 4H mostra trinta traços representativos sobrepostos com 1 s de duração obtidos em NMJs do músculo de camundongos tratados com eculizumab (traços superiores) ou tratados com mAb de controle (traços inferiores). As barras de erro nos gráficos de barra dessas figuras representam S.E.M.

As Figuras 5A a 5F mostram uma análise morfológica de NMJs de tecido do diafragma de camundongos MFS in vivo. Os camundongos foram passivamente imunizados com 1,5 mg de gangliosideo mAb anti-GQ1b, CGM3, 16 h depois com injeções concomitantes de 0,5 ml de soro humano 100% normal (intraperitoneal) e eculizumab ou mAb de controle (intravenosa; 200/vg). As Figuras 5A e 5B mostram C3c e o depósito de complexo de ataque à membrana (MAC) é reduzido em junções neuromusculares (NMJs) tanto de camundongos tratados com eculizumab como tratados com mAb de controle (p< 0,01). A Figura 5C mostra que o sinal de neurofilamento (NF) foi significativamente maior em NMJs de músculos de camundongos tratados com eculizumab, comparado com o controle (p<0,01). As Figura 5D e 5E mostram imagens imunofluorescentes ilustrativas de NMJs em músculos de membrana.

A coloração dos receptores de acetilcolina nicotínicos pós-sinápticos (nAChR; púrpura) foi usada para delinear a NMJ. A Figura 5D mostra adicionalmente C3c e o depósito de MAC. A Figura 5E mostra ainda a integridade de NF e o depósito de MAC. A Figura 5F é uma micrografia eletrônica de terminais nervosos protegidos com eculizumab com a vesícula sináptica bem compactada e a mitocôndria elétron-densa com cristas paralelas. Em NMJs de camundongos tratados com mAb de controle, os terminais nervosos são eletroluminescentes com vesículas sinápticas dispersas e mitocôndria dilatada. #p<0,01, diferente daqueles tratados com mAb de controle. As barras de escala nas Figuras 5D e 5E = 20 //m; e na Figura 5F = 1 μιτι.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Visão Geral

Sugere-se aqui que o tratamento de um paciente com neuropatia mediada por

anticorpo com um inibidor de complemento irá atenuar a lesão neural. Por exemplo, a neuropatia mediada por anticorpo pode ser uma neuropatia mediada por AGA. Os inibidores de elementos da cascata de complemento incluem, por exemplo, anticorpos para componentes, tais como, C5, C5b, C6, C7, C8, e C9. Em modalidades particulares, esse pedido contempla o uso do anticorpo anti-C5 eculizumab (um anticorpo total) que é conhecido por inibir a clivagem de C5 em C5a e C5b. O tratamento de pacientes com tais inibidores reduzem, assim, a lesão neural mediada por complemento. Eculizumab foi usado em estudos clínicos considerados bem tolerados com efeitos colaterais mínimos. Veja, Patente U.S. 6.355.245 e Hillmen et al„ New Engl. J. Med. 350:552-559 (2004), cujos conteúdos estão especificamente incorporados aqui em sua totalidade a título de referência.

O Sistema de Complemento

O sistema de complemento atua em conjunto com outros sistemas imunológicos do corpo para se defender contra a intrusão de patógenos celulares e virais. Há pelo menos 25 proteínas de complemento, que são encontradas como uma coleção complexa de proteínas plasmáticas e co-fatores de membrana. As proteínas plasmáticas (que também são encontradas na maioria dos outros fluidos corporais, tais como, linfa, medula óssea, fluido sinovial, e fluido cérebro-espinhal) constituem cerca de 10% das globulinas no soro de vertebrados. Os componentes do complemento realizam suas funções imuno-defensivas ao interagir em uma série de eventos de ligação à membrana e clivagem enzimática intricados, porém precisos. A cascata de complemento resultante resulta na produto de produtos com funções opsônicas, imunorreguladoras, e líticas.

A cascata de complemento progride através da via clássica ou da via alternativa. Essas vias partilham muitos componentes e, embora se difiram em suas primeiras etapas, as mesmas se convergem e partilham os mesmos componentes do complemento terminal responsáveis pela destruição de células alvo e vírus.

A via de complemento clássica é tipicamente iniciada pela identificação de anticorpo de uma ligação a um sítio antigênico sobre uma célula alvo. Esse anticorpo ligado à superfície reage subseqüentemente com o primeiro componente do complemento, C1. O C1 ligado desse modo se submete a um conjunto de reações autocataliticas que resultam, inter alia, na indução de atividade proteolítica de C1 que atua sobre os componentes do complemento C2 e C4.

Esse C1 ativado cliva C2 e C4 em C2a, C2b, C4a, e C4b. A função de C2b é insatisfatoriamente compreendida. C2a e C4b se combinam para formar o complexo C4b,2a, que é uma protease ativa conhecida como convertase C3 da via clássica. C4b,2a atua para clivar C3 em C3a e C3b. C3a e C4a são anafilatoxinas relativamente fracas que podem induzir a degranulação de mastócitos, que resultam na liberação de histamina e outros mediadores de inflamação.

C3b possui múltiplas funções. Como a opsonina, esse se liga às bactérias, vírus e outras células e partículas e se unem para a remoção a partir da circulação. C3b também pode formar um complexo com C4b,C2a para produzir C4b,2a,3b, ou convertase C5 da via clássica, esse cliva C5 em C5a (outra anafilatoxina) e C5b. A convertase C5 alternativa é C3b,Bb,C3b e realiza a mesma função. C5b se combina com C6 para produzir C5b,6, e esse complexo se combina com C7 para formar o complexo ternário C5b,6,7. O complexo C5b,6,7 se liga a C8 na superfície de uma membrana celular. Mediante a ligação de C9, o complexo de ataque à membrana completo (MAC) é formado (C5b-9), esse media a Iise de células estranhas, microorganismos, e vírus. Discussões adicionais de via de complemento clássica, bem como uma descrição detalhada da via alternativa de ativação de complemento, podem ser encontradas em inúmeras publicações que incluem, por exemplo, Muller-Eberhard, Annu Rev Biochem. 1988;57:321-47.

Inibidores da Cascata de Complemento

Em algumas modalidades, um inibidor de complemento pode ser uma pequena molécula (até 6.000 Da em peso molecular), um ácido nucléico ou análogo de ácido nucléico, um peptidomimético, ou uma macromolécula que não seja um ácido nucléico ou uma proteína. Esses agentes incluem, porém sem caráter limítativo, pequenas moléculas orgânicas, aptâmeros de RNA, aptâmeros de L-RNA, Spiegelmers, compostos anti-senso, RNA de cadeia dupla, pequeno RNA interferente, inibidores de ácido nucléico travados, e inibidores de ácido nucléico peptídicos.

Em algumas modalidades, um inibidor de complemento pode ser uma proteína ou fragmento de proteína. As proteínas que são conhecidas por inibir a cascata de complemento incluem CD59, CD55, CD46 e outros inibidores de C8 e C9 (veja, por exemplo, Patente U.S. 6.100.443). As proteínas conhecidas como receptores de complemento que ligam o complemento também são conhecidas (veja, Pedido de Patente PCT Publicado WO 92/10205 e Patente U.S. 6.057.131). O uso de formas solúveis de receptores de complemento, por exemplo, CR1 solúvel, podem inibir as conseqüências de ativação de complemento, tais como, burst oxidativo de neutrófilos, lesão neural mediada por complemento, e produção de C3a e C5a. Os versados na técnica reconhecem o que precede como alguns, porém não, todos, os métodos para inibir o complemento e sua ativação.

Em algumas modalidades, um inibidor de complemento pode ser um anticorpo

capaz de inibir o complemento, tal como, um anticorpo que pode bloquear a formação de MAC. Por exemplo, um inibidor de complemento de anticorpo pode incluir um anticorpo anti- C5. Tais anticorpos anti-C5 podem interagir diretamente com C5 e/ou C5b, para inibir a formação e/ou função fisiológica de C5b. Os anticorpos anti-C5 adequados são conhecidos pelos versados na técnica. Os

anticorpos podem ser feitos para componentes individuais de complemento ativado, por exemplo, anticorpos para C7, C9, etc. (veja, por exemplo, Patente U.S. 6.534.058; pedido de patente publicado U.S. US 2003/0129187; e Patente U.S. 5.660.825). A Patente U.S. 6.355.245 apresenta um anticorpo que se liga a C5 e inibe a clivagem em C5a e C5b reduzindo assim a formação não só de C5a, como também dos componentes de complemento a jusante.

A concentração e/ou atividade fisiológica de C5a e C5b em um fluido corporal pode ser medida por métodos bem conhecidos na técnica. Para C5a tais métodos incluem ensaios de quimiotaxia, RIAs1 ou ELISAs (veja, por exemplo, Ward and Zvaifler, J Clin Invest. 1971 Mar;50(3):606-16; Wurzner, et al„ Complemento Inflamm. 8:328-340, 1991). Para C5b, os ensaios hemolíticos ou ensaios de C5b-9 solúvel, como discutido aqui, podem ser usados. Outros ensaios conhecidos na técnica também podem ser usados. Utilizando-se ensaios desses e outros tipos adequados, os anticorpos candidatos capazes de inibir o complemento, tais como, anticorpos anti-C5, conhecidos agora ou subseqüentemente identificados, podem ser verificados para 1) identificar os compostos que são úteis na prática do pedido e 2) determinar os níveis de dosagem apropriados de tais compostos. Um anticorpo capaz de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5 que

afeta C5b é, de preferência, usado em concentrações que proporcionam redução substancial (ou seja, redução em pelo menos cerca de 25% comparado com aquela na ausência do anticorpo anti-C5) nos níveis de C5b presentes em pelo menos um fluido derivado de sangue do paciente apos a ativação do complemento dentro do fluido. Tais concentrações podem ser convenientemente determinadas ao medir a capacidade de Iise celular (por exemplo, atividade hemolítica) de complemento presente no fluido ou os níveis de C5b-9 solúvel presentes no fluido. Consequentemente, uma concentração específica de um anticorpo que afeta C5b é uma que resulta em uma redução substancial (ou seja, uma redução de pelo menos cerca de 25%) na capacidade de Iise celular do complemento presente em pelo menos um dos fluidos derivados do sangue do paciente. As reduções da capacidade de Iise celular do complemento presente nos fluidos corporais do paciente podem ser medidas por métodos bem conhecidos na técnica tais como, por exemplo, por um ensaio hemolítico convencional, tal como, ensaio hemolítico descrito por Kabat and Mayer (eds.), "Experimental Immunochemistry, 2d Edition", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, ou uma variação convencional daquele ensaio como o método de hemólise de eritrócito de galinha descrito abaixo.

Os anticorpos específicos capazes de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5, são relativamente específicos e não bloqueiam as funções dos primeiros componentes do complemento. Em particular, tais agentes específicos não prejudicam substancialmente as funções de opsonização associadas com o componente C3b do complemento, tais funções proporcionam um meio para depuração de partículas e substâncias estranhas do corpo.

C3b é gerado pela clivagem de C3, que é realizada pelas C3 convertases de via clássica e/ou alternativa e resulta na geração tanto de C3a como de C3b. Portanto, para não prejudicar as funções de opsonização associadas com C3b, os anticorpos específicos capazes de inibir ρ complemento a jusante de C3, tal como, um anticorpo anti-C5, não interferem substancialmente na clivagem do componente C3 do complemento no fluido corporal do paciente (por exemplo, soro) em C3a e C3b. Tal interferência na clivagem de C3 pode ser detectada ao medir os níveis de fluido corporal de C3a e/ou C3b, que são produzidos em razoes equimolares pelas ações das C3 convertases. Tais medidas são informativas, pois os níveis de C3a e C3b serão reduzidos (comparados com uma amostra combinada sem o anticorpo capaz de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5) se a clivagem for interferida por um anticorpo capaz de inibir o complemento.

Na prática, a medida quantitativa de tal clivagem é geralmente mais precisa quando realizada pela medida dos níveis de C3a no fluido corporal em vez de os níveis de C3b no fluido corporal, desde que C3a permaneça na fase fluida considerando que C3b é rapidamente depurado. Os níveis de C3a no fluido corporal podem ser medidos por métodos bem conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, utilizando um kit EIA C3a comercialmente disponível, por exemplo, aquele vendido por Quidel Corporation, San Diego, Calif, de acordo com as especificações do fabricante. Os anticorpos particularmente específicos capazes de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5, não produzem essencialmente nenhuma redução nos níveis de C3a do fluido corporal apos a ativação do complemento quando testado em tais ensaios.

Alguns anticorpos da descrição irão impedir a clivagem de C5 para formar C5a e C5b, impedindo assim a geração da atividade anafilatóxica associada com C5a e impedindo a montagem do complexo de ataque à membrana associada com C5b. Como discutido acima, em uma modalidade particular, esses anticorpos anti-C5 não irão prejudicar a função de opsonização associada com a ação de C3b.

Um método preferido para inibir a atividade do complemento é utilizar um anticorpo monoclonal que se liga ao complemento C5 e inibe a clivagem. Isso reduz a formação tanto de C5a como de C5b, ao mesmo tempo em que permite a formação de C3a e C3b que são benéficas ao receptor. Tais anticorpos que são específicos para o complemento humano são conhecidos (Patente U.S. 6.355.245). Esses anticorpos descritos na Patente U.S. 6.355.245 incluem um anticorpo total preferido (agora chamado de eculizumab). Um anticorpo similar contra C5 de camundongo é chamado de BB5.1 (Frei et al., Mol. Cell. Probes. 1 :141-149 (1987)). Os anticorpos para inibir a atividade do complemento não precisam ser anticorpos monoclonais. Esses podem ser, por exemplo, anticorpos policlonais. Esses podem ser adicionalmente fragmentos de anticorpo. Um fragmento de anticorpo inclui, porém sem caráter limitativo, um Fab, F(ab'), F(ab')2, anticorpo de cadeia simples, e Fv. Ademais, é bem conhecido pelos versados na técnica que os anticorpos podem ser humanizados (Jones et al., Nature 321 :522-5 (1986)), quimerizados, ou desimunizados. Os anticorpos que serão usados na presente descrição podem ser qualquer um desses. É preferível utilizar anticorpos humanizados. Em modalidades específicas, um agente terapêutico da descrição compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os anticorpos e fragmentos desses podem ser feitos por qualquer método convencional, tais como aqueles métodos descritos aqui. Os anticorpos são encontrados em múltiplas formas, por exemplo, IgA1 IgG, IgM, etc. Adicionalmente, os anticorpos podem ser elaborados de inúmeras maneiras. Esses podem ser feitos como anticorpos de cadeia simples (inclusive small modular immunopharmaceuticals ou SMIPs™), Fab e fragmentos de F(ab')2, etc. Os anticorpos podem ser humanizados, quimerizados, desimunizados, ou completamente humanos. Inúmeras publicações apresentadas os diversos tipos de anticorpos e os métodos de elaboração de tais anticorpos. Por exemplo, veja a Patente Nos. U.S. 6.355.245; 6.180.370; 5.693.762; 6.407.213; 6.548.640; 5.565.332; 5.225.539; 6.103.889; e 5.260.203. Essa invenção proporciona fragmentos de anticorpos anti-C5, que podem

compreender uma parte de um anticorpo intacto, de preferência, a região de ligação ao antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; anticorpos bivalentes; anticorpos lineares (Zapata et ai., Protein Eng. 8:1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.

A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticas, chamados de fragmentos de "Fab", cada um com um único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento de "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de se cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um fragmento de F(ab')2 que possui dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.

"Fv" se refere ao mínimo fragmento de anticorpo que contém um sítio de identificação e ligação ao antígeno completo. Essa região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e leve em estreita associação não-covalente. É nessa configuração que os três CDRs de cada domínio variável interajam para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. De forma coletiva, os seis CDRs conferem especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicos para um antígeno) possui a capacidade de identificar e se ligar ao antígeno, embora provavelmente em uma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' se diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada que incluem uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab-SH é a designação para Fab' onde o(s) resíduo(s) de cisteina dos domínios constantes sustenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de dobradiça entre esses. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos. Os fragmentos de anticorpo de "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. De preferência, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigante entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma análise de scFv veja Pluckthun em The Pharmacoloqy of Monoclonal Antibodies. vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer- Verlag: New York, 1994), pp. 269-315.

SMIPs são uma classe de peptídeo de cadeia simples elaborada para incluir uma região de ligação alvo, domínio efetor (domínios CH2 e CH3). Veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente No. U.S. 20050238646. A região de ligação alvo pode ser derivada da região variável ou CDRs de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-C5 do pedido. Alternativamente, a região de ligação alvo é derivada de uma proteína que se liga a C5.

O termo "anticorpos bivalentes" se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, tais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Ao utilizar um Iigante que também é curto para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a se emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação ao antígeno. Os anticorpos bivalentes são mais completamente descritos, por exemplo, em EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

É bem conhecido que a ligação a uma molécula (ou um patógeno) de anticorpos com uma região Fc ajuda no processamento e depuração da molécula (ou patógeno). As partes Fc de anticorpos são identificadas por receptores especializados expressos por células efetoras imunes. As partes Fc de anticorpos IgGI e lgG3 são identificadas por receptores Fc presentes sobre a superfície de células fagocíticas, tais como, macrófagos e neutrófilos, que podem desse modo se ligar e submergir as moléculas ou patógenos cobertos com anticorpos desses isotipos (C. A. Janeway et al., Immunobioloqy 5th edition, página 147, Garland Publishing (New York, 2001)).

Essa descrição também proporciona anticorpos anti-C5 monoclonais. Um anticorpo monoclonal pode ser obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possível mutações naturalmente ocorrentes que podem estar presentes em menores proporções. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo que são direcionados contra um único sítio antigênico. Ademais, ao contrário de preparações de anticorpo convencional (policlonal) que incluem tipicamente anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), sendo que cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos, pois esses são geralmente sintetizados pela cultura de hibridoma, não-contaminada por outras imunoglobulinas. Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos em células transfectadas, tais como, células CHO e células NSO. O "monoclonal" modificador indica a natureza do anticorpo como obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não requer a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que serão usados de acordo com a presente descrição podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente Nos. U.S. 4.816.567 e 6.331.415). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo com fago que utilizam as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.

Uma descrição da preparação de um anticorpo monoclonal anti-humano-C5 de camundongo com características de ligação específicas é apresentada na Publicação de Pedido de Patente No. U.S. 20050226870. Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340 (1991), descreve a preparação de outros anticorpos monoclonais anti-humanos-C5 de camundongo referidos como N 19-8 e N20-9.

Outros anticorpos especificamente contemplados são anticorpos "oligoclonais". Como usado aqui, o termo "anticorpos oligoclonais" se refere a uma mistura predeterminada de anticorpos monoclonais distintos. Veja, por exemplo, publicação PCT WO 95/20401; Patente Nos. U.S. 5.789.208 e 6.335.163. Em uma modalidade, os anticorpos oligoclonais que consistem em uma mistura predeterminada de anticorpos contra um ou mais epítopos são gerados em uma única célula. Em outras modalidades, os anticorpos oligoclonais compreendem uma pluralidade de cadeias pesadas capazes de pareamento com uma cadeia leve comum para gerar anticorpos com múltiplas especificidades (por exemplo, publicação PCT WO 04/009618). Os anticorpos oligoclonais são particularmente úteis quando se deseja marcar múltiplos epítopos sobre uma única molécula alvo (por exemplo, C5). Devido aos ensaios e epítopos descritos aqui, os versados na técnica podem gerar ou selecionar anticorpos ou misturas de anticorpos que são aplicáveis para um propósito pretendido necessidade desejada.

Em algumas modalidades que incluem um anticorpo humanizado e/ou quimérico, um ou mais dos CDRs são derivados de um anticorpo anti-humano C5. Em uma modalidade específica, todos os CDRs são derivados de um anticorpo anti-humano C5. Em outra modalidade específica, os CDRs de mais de um anticorpo anti-humano C5 são misturados e combinados em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico podem compreender um CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-humano C5 combinado com CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti-humano C5, e os CDRs da cadeia pesada podem ser derivados de um terceiro anticorpo anti-humano C5.

Ademais, as regiões de estrutura podem ser derivadas de um ou mais anticorpos anti- humanos C5 similares, de um ou mais anticorpos diferentes, tal como, um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanos ou humanizados são específicos para a administração aos pacientes humanos.

Em algumas modalidades, os anticorpos de cadeia simples, e anticorpos quiméricos, humanizados ou primatizados (enxertados com CDR), bem como anticorpos quiméricos ou de cadeia simples enxertados com CDR, que compreendem partes derivadas de espécies diferentes, também são abrangidos pela presente descrição como fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo. As várias partes desses anticorpos podem ser quimicamente unidas umas às outras por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua que utiliza técnicas de engenharia genética. Por exemplo, os ácidos nucléicos que codificam uma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressos para produzir uma proteína contígua. Veja, por exemplo, Patente Nos. U.S. 4.816.567 e 6.331.415; Patente No. U.S. 4.816.397; Patente européia No. 0.120.694; WO 86/01533; Patente européia No. 0.194.276 B1; Patente No. U.S. 5.225.539; e Patente européia No. 0.239.400 B1. Veja também, Newman et al„ BioTechnoIogy 10:1455- 1460 (1992), relativo a anticorpo primatizado. Veja, por exemplo, Ladner et a!., Patente No. U.S. 4.946.778; e Bird et al., Science 242:423-426 (1988), relativo a anticorpos de cadeia simples.

Ademais, os fragmentos funcionais de anticorpos, que incluem fragmentos de anticorpos quiméricos, humanizados, primatizados ou de cadeia simples, também podem ser produzidos. Os fragmentos funcionais dos anticorpos em questão mantêm pelo menos uma função de ligação e/ou função de modulação do anticorpo de comprimento total a partir do qual esses são derivados. Os fragmentos funcionais preferidos mantêm uma função de ligação ao antígeno de um anticorpo de comprimento total correspondente (tal como, por exemplo, a capacidade de um anticorpo anti-C5 se ligar a C5). Os métodos gerais para a imunização de animais (nesse caso com C5 e/ou C5b,

etc.), isolamento de células produtoras de anticorpo, fusão de tais células com células imortais (por exemplo, células de mieloma) para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonaís, classificação de sobranadantes de hibridoma para reatividade de anticorpos monoclonais secretados com um antígeno desejado (nesse caso o imunógeno ou uma molécula que contém o imunógeno), a preparação de quantidades de tais anticorpos em sobrenadantes de hibridoma ou fluidos ascíticos, e para a purificação e armazenamento de tais anticorpos monoclonais, podem ser encontrados em inúmeras publicações. Essas incluem: Coligan, et al., eds. Current Protocols In Immunoloqy. John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell and Cryer, A Practical Guide To Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991 ; Montz et al., Cellular Immunol. 127:337-351 (1990); Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328- 340 (1991); e Mollnes et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312 (1988).

Formulações Farmacêuticas e Usos

Os métodos de administração de pequenas moléculas, proteínas, e ácidos nucléicos são bem conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos de administração de anticorpos são bem conhecidos pelos versados na técnica. Para obter a inibição desejada, os anticorpos podem ser administrados em uma variedade de formas de dosagem unitária. A dose irá variar de acordo com o anticorpo particular. Por exemplo, diferentes anticorpos podem possuir diferentes massas e/ou afinidades, e assim, requerem níveis de dosagem diferentes. Os anticorpos preparados como fragmentos Fab também irão requerer dosagens diferentes daquelas de imunoglobulinas intactas equivalentes, visto que esses possuem massa consideravelmente menor que as imunoglobulinas intactas, e assim, requerem dosagens inferiores para atingir os mesmos níveis molares no sangue do paciente. A dose também irá variar dependendo da forma de administração, os sintomas particulares do paciente que está sendo tratado, a saúde geral, condição, tamanho, e idade do paciente, e opinião do médico. Os níveis de dosagem dos anticorpos para indivíduos humanos são geralmente entre cerca de 1 mg por kg e cerca de 100 mg por kg por paciente por tratamento, e, de preferência, entre cerca de 5 mg por kg e cerca de 50 mg por kg por paciente por tratamento. Em termos de concentrações plasmáticas, as concentrações de anticorpo são, de preferência, na faixa de cerca de 25 //g/mL a cerca de 500 yug/mL. Entretanto, quantidades maiores podem ser requeridas para casos extremos e quantidades menores podem ser suficientes para casos mais brandos.

A administração dos anticorpos anti-C5 será geralmente realizada por uma via intravascular, por exemplo, via infusão intravenosa por injeção. Outras vias de administração podem ser usadas, se desejado, porém uma via intravenosa será a mais preferível. As formulações adequadas para injeção são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Tais formulações devem ser estéreis e não-pirogênicas, e geralmente irão incluir um veículo farmaceuticamente eficaz, tais como, solução salina, solução salina tamponada (por exemplo, tamponada com fosfato), solução de Hank, solução de Ringer, dextrose/solução salina, soluções de glicose, e similares. As formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme requerido, tais como, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes, e similares.

A administração dos anticorpos capazes de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5 será geralmente realizada por uma via parenteral, tipicamente via injeção, tal como, injeção intra-articular ou intravascular (por exemplo, infusão intravenosa) ou injeção intramuscular. Outras vias de administração, por exemplo, oral (p.o.), podem ser usados, se desejado, e praticáveis pelo anticorpo particular capaz de inibir o complemento que será administrado. Os anticorpos capazes de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5, também podem ser administrados em uma variedade deformas de dosagem unitária e suas dosagens também irão variar com o tamanho, potência, e em meia- vida in vivo do anticorpo particular capaz de inibir o complemento que será administrado. As doses de anticorpos capazes de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5 também irá variar dependendo da forma de administração, dos sintomas particulares do paciente que será tratado, a saúde geral, condição, tamanho, e idade do paciente, e a opinião do médico.

Em algumas modalidades, um tratamento terapêutico típico inclui uma série de

doses, que serão geralmente administradas com o acompanhamento de desfechos clínicos com os níveis de dosagem ajustados conforme necessário para atingir o resultado clínico desejado. Em algumas modalidades, o tratamento é administrado em múltiplas dosagens durante pelo menos uma semana. Em algumas modalidades, o tratamento é administrados em múltiplas dosagens durante pelo menos um mês. Em algumas modalidades, o tratamento é administrado em múltiplas dosagens durante pelo menos um ano. Em algumas modalidades, o tratamento é administrado em múltiplas dosagens até o resto da vida do paciente.

A freqüência de administração também pode ser ajustada de acordo com vários parâmetros. Esses incluem a resposta clínica, a meia-vida plasmática do terapêutico da descrição, e os níveis do anticorpo no fluido corporal, tais como, sangue, plasma, soro, ou fluido sinovial. Para guiar o ajuste da freqüência de administração, os níveis do terapêutico da descrição do fluido corporal podem ser monitorados durante o processo de tratamento.

Em algumas modalidades, a freqüência de administração pode ser ajustada de acordo com um ensaio que mede a capacidade de Iise celular do complemento presente em um ou mais fluidos corporais do paciente. A capacidade de Iise celular pode ser medida como porcentagem de hemólise em ensaios hemolíticos dos tipos descritos aqui. Uma redução de 10% ou 25% ou 50% na capacidade de Iise celular do complemento presente em um fluido corporal após o tratamento com o anticorpo capaz de inibir o complemento usado na prática do pedido significa que a porcentagem de hemólise após o tratamento é de 90, 75, ou 50 porcento, respectivamente, da porcentagem de hemólise antes do tratamento.

Para o tratamento de neuropatias mediadas por anticorpos por administração sistêmica de um anticorpo capaz de inibir o complemento, tal como, um anticorpo anti-C5 (oposta à administração local), a administração de uma dose inicial grande é específica, ou seja, uma única dose inicial suficiente para produzir uma redução substancial, e com mais preferência, uma redução de pelo menos 50%, na atividade hemolítica do soro do paciente.

Tal dose inicial grande é, de preferência, seguida por administração regularmente repetida de doses diminuídas conforme necessário para manter as reduções substanciais de título hemolítico de soro. Em outra modalidade, a dose inicial é administrada tanto por vias locais como sistêmicas, seguida por administração sistêmica repetida de doses diminuídas, como descrito acima. Para administração de um anticorpo anti-C5 a humanos, veja, por exemplo, Hillmen et al, N. Engl. J. Med. 350:552-559 (2004). Os níveis de anticorpos administrados em Hillmen et al. estão baseados na meia-vida do anticorpo e são relativos à administração de um anticorpo anti-C5 para outras indicações, tal como, para tratar neuropatias.

As formulações particularmente úteis para agentes terapêuticos baseados em anticorpo também são descritas na Publicação de Pedido de Patente Nos. U.S. 20030202972, 20040091490 e 20050158316. Em algumas modalidades, as formulações líquidas do pedido são substancialmente isentas de tensoativo e/ou sais inorgânicos. Em outra modalidade específica, as formulações líquidas possuem um pH que varia de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Ainda em outra modalidade específica, as formulações líquidas compreendem histidina em uma concentração que varia de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM. É contemplado que as formulações líquidas podem compreender ainda um ou mais excipientes, tais como, sacarídeo, um aminoácido (por exemplo, arginina, lisina, e metionina) e um poliol. As descrições e métodos adicionais de preparação e análise de formulações líquidas podem ser encontrados, por exemplo, em publicações PCT WO 03/106644, WO 04/066957, e WO 04/091658. Os agentes umectantes, emulsificantes e lubrificantes, tais como, Iauril sulfato de

sódio e estearato de magnésio, bem como, agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, flavorizantes e de perfume, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes nas composições farmacêuticas do pedido.

Em algumas modalidades, as formulações dos anticorpos em questão são formulações isentas de pirogênio que são substancialmente isentas de endotoxinas e/ou substâncias pirogênicas relacionadas. As endotoxinas incluem toxinas que são confinadas dentro de microorganismos e são liberadas quando os microorganismos são decompostos ou morrem. As substâncias pirogênicas também incluem substâncias termoestáveis indutoras de febre (glicoproteínas) da membrana externa de bactérias e outros microorganismos. Ambas as substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administradas a humanos. Devido aos efeitos prejudiciais potenciais, é vantajoso remover mesmo pequenas quantidades de endotoxinas de soluções medicamentosas farmacêuticas administradas de forma intravenosa. O Food & Drug Administration ("FDA") estabeleceu um limite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dose por quilograma de peso corporal em um único período de uma hora para aplicações medicamentosas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention1 Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Quando as proteínas terapêuticas foram administradas em quantidades de centenas ou milhares de miligramas por quilograma de peso corporal, como pode ser o caso com anticorpos monoclonais, é vantajoso remover mesmo quantidades-traço de endotoxina.

As formulações dos anticorpos em questão incluem aquelas adequadas para administração oral, alimentar, tópica, parenteral (por exemplo, injeção intravenosa, intra- arterial, intramuscular, subcutânea), oftalmológica (por exemplo, tópica ou intra-ocular), inalação (por exemplo, intrabronquial, intranasal ou inalação oral, gotas intranasais), retal, e/ou intravaginal. Outros métodos adequados de administração também podem incluir dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis e dispositivos poliméricos de liberação controlada. Os stents, em particular, podem ser revestidos com um polímero de liberação controlada misturado com um agente do pedido. As composições farmacêuticas dessa descrição também podem ser administradas como parte de uma terapia combinatória com outros agentes (tanto na mesma formulação como em uma formulação separada).

A quantidade da formulação que será terapeuticamente eficaz pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Ademais, ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa que será empregada na formulação também irá depender da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser julgada de acordo com a opinião do médico e as condições de cada paciente. As doses eficazes podem ser inferidas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste de modelo in vitro ou animais. A dosagem das composições que serão administradas pode ser determinada pelo versado na técnica sem experimentação indevida em conjunto com estudos de dose-resposta padrão. As circunstâncias relevantes que serão consideradas ao fazer tais determinações incluem a condição ou condições que serão tratadas, da seleção da composição que será administrada, a idade, peso, e resposta do paciente individual, e a gravidade dos sintomas do paciente. Por exemplo, o peso corporal real do paciente pode ser usado para calcular a dose das formulações em mililitros (mL) que será administrada. Pode não haver ajuste para estimativa até o peso "ideal". Em tal situação, uma dose apropriada pode ser calculada pela seguinte fórmula: Dose (mL) = [peso do paciente (kg) χ nível de dose (mg/kg)/ concentração de fármaco (mg/mL)]

Para atingir os resultados de tratamento desejados, os anticorpos anti-C5 podem ser administrados em uma variedade de formas de dosagem unitária. A dose irão variar de acordo com o anticorpo particular. Por exemplo, anticorpos diferentes podem possuir massas e/ou afinidades diferentes, e, desse modo, requerem níveis de dosagem diferentes. Os anticorpos preparados como fragmentos Fab' ou anticorpos de cadeia simples irão requerer dosagens diferentes daquelas das imunoglobulinas nativas equivalentes, visto que esses possuem massa consideravelmente menor do que as imunoglobulinas nativas, e, desse modo, requerem dosagens mais baixas para atingir os mesmos níveis molares no sangue do paciente.

Outros terapêuticos da descrição também podem ser administrados em uma variedade de formas de dosagem unitária e suas dosagens também irão variar com o tamanho, potência, e meia-vida in vivo do terapêutico particular que está sendo administrado.

As doses de terapêuticos da descrição também irão variar dependendo da forma de administração, dos sintomas particulares do paciente que será tratado, da saúde geral, condição, tamanho, e idade do paciente, e da opinião do médico.

As formulações do pedido podem ser distribuídas como artigos de fabricação que compreendem material para embalagem e um agente farmacêutico que compreende o anticorpo capaz de inibir o complemento e um veículo farmaceuticamente aceitável como adequado ao modo de administração. O material para embalagem pode incluir um rótulo que indica que a formulação serve para uso no tratamento de neuropatias mediadas por anticorpos. Embora os anticorpos sejam preferidos, especialmente os anticorpos anti-C5 que já se mostraram seguros e eficazes na redução do acúmulo de componentes de complemento a jusante em indivíduos, o uso de outros inibidores de complemento também é contemplado por essa descrição. As formulações farmacêuticas e usos da descrição podem ser combinadas com qualquer inibidor de complemento ou tratamentos de neuropatia mediada por anticorpo conhecidos na técnica (supra).

Métodos de Tratamento

Os métodos do pedido podem ser usados para tratar sintomas associados com neuropatia mediada por anticorpo. Por exemplo, os métodos do pedido podem ser usados para tratar sintomas de neuropatia mediada por AGA. Os métodos do pedido podem ser usados para tratar sintomas associados à síndrome de Guillain-Barré. O tratamento de neuropatias mediadas por anticorpos pode ser administrado por meios padrão. Os tratamentos do pedido podem ser usados em combinação com outros tratamentos do pedido ou tratamentos conhecidos para neuropatias mediadas por anticorpos. Os tratamentos do pedido podem ser co-administrados com outros tratamentos que tratam sintomas de neuropatias mediadas por anticorpos. A administração dos terapêuticos da descrição serão geralmente realizados por uma via parenteral, tipicamente via injeção, tal como, injeção intra-articular ou intravascular (por exemplo, infusão intravenosa) ou injeção intramuscular. Outras vias de administração, por exemplo, oral (p.o.), podem ser usadas, se desejado, e praticáveis pelo anticorpo particular capaz de inibir o complemento que será administrado.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

Todas as publicações e patentes mencionadas nesse estão aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência. No caso de conflito, o presente pedido, inclusive quaisquer definições aqui, irá controlar.

Os presentes métodos são descritos com referência aos seguintes Exemplos, que são oferecidos a título de ilustração e não pretendem limitar de modo algum a descrição. As técnicas padrão bem conhecidas ou as técnicas especificamente descritas abaixo são utilizadas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. ECULIZUMAB PREVINE LESÕES FUNCIONAIS E ESTRUTURAIS MEDIADAS POR COMPLEMENTO NO MODELO DE MFS IN VITRO No modelo de MFS in vitro, o tratamento de preparações nervo-músculo de

diafragma com mAb anti-GQ1b CGM3 e soro humano normal (NHS), na presença de um mAb combinado com isotipo irrelevante (100 //g/ml), que serviu como um controle negativo para eculizumab, induziu a ativação de complemento em NMJs. Isso foi morfologicamente evidenciado por C3c e depósito de MAC (Figura 1A, 1B, 1D, 1E e 1F), bem como células de Schwann pré-sinápticas danificadas (pSCs) e terminais nervosos motores mostrados por coloração de etídio homodímero-1 (EthD-1) e perda de coloração de neurofilamento (NF), respectivamente (Figuras 1C, 1E e 1F). Essas características são idênticas àquelas descritas antes (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999); Halstead et al. Brain 127:2109-2123 (2004); 0'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). A adição de 100 //g/ml de eculizumab ao NHS como fonte de complemento preveniu completamente o depósito de MAC (Figuras 1B, 1D, 1E e 1F; p<0,001) e perda de NF axonal terminal (Figuras 1C e 1F; p<0,001), ao mesmo tempo em que o depósito do componente de complemento C3c anterior não foi afetado (Figuras 1A e 1D; p= 0,2). Ademais, o dano aos pSCs foi eliminado como se apenas 2% das 1439 NMJs investigadas possuíssem um ou mais núcleos positivos EthD-1, comparadas com 33% de 1529 NMJs investigadas em tecido tratado com mAb de controle (Figura 1E; p<0,001).

Essas observações imunoistológicas foram comparadas com as observações eletrofisiológicas e funcionais. Em NMJs pré-incubadas de CGM3, o NHS (40%) na presença do mAb de controle induziu um grande aumento na freqüência de potenciais de placa terminal em miniatura (MEPPs, os eventos pós-sinápticos que surgem de liberação espontânea de quantidade específica de acetilcolina a partir do terminal nervoso motor pré- sináptico), como anteriormente observado (Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999)). Esse efeito foi quase completamente impedido por 100 /vg/ml de eculizumab. A freqüência de MEPP foi cerca de 0.7 s"1 antes e após a incubação de 50 /vg/ml de CGM3 e elevada 34,0 ± 4,6 s"1 na presença de NHS com 100 /vg/ml de mAb de controle adicionados. Ao contrário, a freqüência de MEPP foi apenas 3,1 ± 1,3 s"1 na presença de NHS com 100 /vg/ml de eculizumab adicionados (Figuras 2A e 2B; n=5 músculos; p< 0,001).

Eculizumab não alterou o potencial de membrana de apoio de fibra muscular ou a amplitude de MEPP, tempos de aumento e diminuição (dados não mostrados). Como descrito acima (Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999); Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999)), a contração assíncrona de fibras musculares individuais ocorre durante a incubação de NHS (escores visuais medianos 4; n= 5 músculos). Eculizumab impediu tal alto grau de contração com apenas um escore mediano de observado (Figura 2C; n=5 músculos, p<0,01, teste de Mann-Whitney), que se igual aos baixos níveis basais observados nos períodos de observação antes e após a incubação de CGM3.

O resultado final de dano pré-sináptico mediado por anti-CGM3/complemento é o bloqueio da transmissão sináptica na NMJ devido à incapacidade de liberar acetilcolina (Goodyear et al. J. CHn. Invest 104:697-708 (1999)). Eculizumab impediu completamente esse efeito. Nenhuma das NMJs "silenciosas" (ou seja, ausência de MEPPs e potenciais de ação muscular evocados por estímulo nervoso) foi encontrada, enquanto que na condição de mAb de controle 19 ± 2,6 % do número total de NMJs experimentadas foram observeados como silenciados (Figura 2D; n=5 músculos). Ademais, o efeito protetor de eculizumab sobre a paralisia muscular foi quantificado no modelo de MFS in vitro. Eculizumab inibiu a perda de força de contração induzida por estímulo nervos de preparações de hemidiafragma em uma forma dependente de concentração após o tratamento com 200 //g/ml de CGM3 e 33% de NHS (Figuras 2E e 2F). nos experimentos de controle sem eculizumab, o NHS induziu a perda quase completa de força de contração dentro de 90 min. A adição de 3 ou 6 //g/ml de eculizumab ao NHS reduziu consideravelmente a taxa de perda de força de contração (50% de perda foram observados em 39 e 60 min, respectivamente, comparada com 27 min na condição de controle; Figura 2F). Concentrações maiores de eculizumab de 9 e 12 //g/ml eram quase completamente protetoras (>90% da contração inicial após 90 min) enquanto 25, 50 e 100 /vg/ml impediram completamente qualquer perda de contração induzida por CGM3/NHS. Uma curva sigmóide de Boltzmann ajustada através dos pontos de dados de concentração-efeito obtidos produz um EC50 de 7,1 /vg/ml de eculizumab sob essas condições (Figura 2G).

Essas análises imunoistológicas e funcionais mostram que o eculizumab previne eficientemente os efeitos patofisiológicos mediados por complemento no modelo de MFS in vitro.

EXEMPLO 2. CURVA DOSE-RESPOSTA IN VIVO DE ECULIZUMAB. Depois, foram examinados os benefícios in vivo de eculizumab nesse modelo murino de síndrome de Guillain-Barré. Os camundongos foram passivamente imunizados com anticorpo anti-gangliosideo ou PBS (como um controle negativo) seguido por injeções concomitantes de NHS (intraperitoneais) e eculizumab (intravenosas) em O, 50, 100, 200, e 400 /yg/camundongo em PBS. O complemento C3 foi abundantemente depositado na NMJ de todos os camundongos que receberam o anticorpo anti-gangliosideo. Uma dose crescente de eculizumab resulta em uma redução dose-dependente no depósito de MAC na NMJ (Figura 3A). A análise do sinal de neurofilamento demonstra a preservação da integridade axonal em todas as doses de eculizumab investigadas quando comparadas com o controle de linha de base tratado com PBS. {n = 3 para cada dose) (Figura 3B).

EXEMPLO 3. ECULIZUMAB PROTEGE CONTRA NEUROPATIA E PARALISIA RESPIRATÓRIA EM UM MODELO DE MFS IN VIVO

Para determinar a eficácia in vivo de eculizumab, criou-se um modelo de MFS in vivo através da injeção intraperitoneal de anticorpo anti-GQ1b de CGM3 e NHS como fonte de complemento. 16 h após a injeção de CGM3, uma dose de 200 /vg de eculizumab ou mAb de controle foi sistemicamente administrada, através da veia da cauda, seguida por injeção intraperitoneal de 0,5 ml de NHS). O protocolo de vias de injeção diferentes de eculizumab e NHS foi aplicado para evitar a inibição de C5 no NHS por eculizumab no confinamento da cavidade peritoneal. Os camundongos tratados com CGM3, NHS e mAb de controle (n=10) desenvolveram uma aparência geral fraca, em alguns casos uma alteração postural, flancos abdominais invaginados e dificuldades respiratórias (ofegantes) 2 h após a injeção de NHS. A injeção intravenosa de eculizumab impediu completamente o desenvolvimento desses sintomas (n=11). A fraqueza foi quantificada com a medida de dinamometria em camundongos pré-tratados com CGM3, antes e 2h após a injeção de mAb de controle ou eculizumab e NHS (Figura 4A). Os camundongos de grupo de controle (n-5) puxaram 56,0 ± 5,7 g pouco antes da injeção de mAb de controle e NHS, enquanto os camundongos do grupo eculizumab (n=5) puxaram 54,3 ± 8,4 g (p= 0,87) nessa fase. A força de puxamento 2h após a injeção de mAb de controle/NHS foi 22% inferior (43,7 ± 4,5 g; p<0,005). Eculizumab melhorou tal efeito (8% de redução p=0,07). O distúrbio respiratório foi avaliado com pletismografia de corpo inteiro continuamente após a injeção de mAb/NHS durante um período de 6h (Figuras 4B e 4C; n=5 camundongos por grupo). O volume tidal antes da injeção de CGM3 foi similar em ambos os grupos (0,21 ± 0,01 e 0,22 ± 0,03 ml no grupo de mAb de controle e eculizumab, respectivamente). Uma redução de aproximadamente 50% (p<0,001) foi observada no grupo de mAb de controle 4 e 6 h após a injeção de NHS. Tal redução foi amplamente impedida por eculizumab (apenas 17% de redução nesses pontos de tempo, Figura 4B). Similarmente, a freqüência respiratória caiu no grupo de mAb de controle aproximadamente 30% (p<0,01) 4 e 6 h após a injeção de NHS. No grupo eculizumab, essa redução foi de apenas 7% (Figura 4C). Ambos os grupos de tratamento mostraram uma redução inicial igual de cerca de 40% da freqüência respiratória medida 2 h após mAb/NHS, comparada com a freqüência antes da injeção de CGM3, que se deve aparentemente ao regime de injeção intraperitoneal. Exemplos de traços dos sinais respiratórios obtidos são mostrados na Figura 4D.

As preparações nervosas frênicas de hemidiafragma foram dissecadas a partir de camundongos tratados com CGM3/NHS in vivo 4 h após a injeção de NHS e as medidas eletrofisiológicas realizadas em NMJs1 experimentos de contração muscular, e análises imunoistológicas detalhadas. A inspeção visual indicou que apenas uma parte muito pequena dos músculos dos camundongos tratados com mAb de controle se contraiu mediante a estimulação elétrica supra-máxima do nervo frênico, comparada com uma contração completa de músculos obtidos de camundongos tratados com eculizumab. Em experimentos de contração in vitro em tecidos colhidos de imunizações passivas, esse efeito foi quantificado (Figuras 4E e 4F). A contração e tensão tetânica (40Hz) são 0,07 ± 0,06 e 0,92 ± 0,61 g, respectivamente, no grupo de mAb de controle (n=4), enquanto no grupo eculizumab (n=4) essas são 1,36 ± 0,29 e 9,26 ± 0,65 g, respectivamente, igualando os valores de músculos de camundongos pareados quanto à idade não-tratados com NHS (dados não mostrados). Com a análise eletrofisiológica foi testado se a paralisa foi causada por disfunção da NMJ. Em músculos dissecados do grupo mAb de controle, 66 ± 7% das NMJs experimentadas foram "silenciados", ou seja, não ocorreram MEPPs detectáveis e nenhum potencial de ação muscular mediante estímulos nervosos. No grupo eculizumab apenas 3 ± 2% foram "silenciados" (Figuras 4G e 4H; p<0,001). As análises imunoistológicas mostraram que CGM3 foi depositado igualmente em NMJs dos dois grupos de tratamento (dados não mostrados). Os depósitos de C3c foram identificados em NMJs de ambos os grupos, embora com uma intensidade um tanto menor no grupo eculizumab (Figuras 5 A e 5D; p<0,001). O MAC foi claramente depositado em NMJs de músculos de camundongos tratados com mAb de controle, porém virtualmente ausente no grupo tratado com eculizumab (Figuras 5B, 5D e 5E). Eculizumab impediu a perda de integridade terminal em NMJs de camundongos tratados com mAb de controle, como evidenciado pela intensidade de sinal de NF e modelo que sobrepõe a região de placa terminal, ou seja, a ramificação axonal terminal que permanece intacta (Figuras 5C e 5E). Ademais, a microscopia eletrônica mostrou a presença de uma ultra-estrutura pré-sináptica bem conservada na NMJ de camundongos tratados com eculizumab em comparação com aquela de camundongos tratados com mAb de controle que mostraram dilatação terminal característica, depleção vesicular sináptica e mitocôndria dilatada (Figura 5F) (O1HanIon et al. Brain 124:893-906 (2001)). Esses dados eletrofisiológicos, funcionais e imunoistológicos mostram que a neuropatia motora terminal mediada por complemento ocorre no modelo de MFS in vivo e que a paralisia de diafragma contribui para os déficits respiratórios observados. Importantemente, o tratamento in vivo com eculizumab preveniu de forma eficaz esses defeitos neuropatológicos in vivo.

EXEMPLO 4. MÉTODOS

Camundongos

Camundongos machos Balb/c (3 a 6 semanas de idade, 10 a 25 g) foram obtidos de Harlan (UK ou NL). Em alguns experimentos de contração muscular (veja abaixo) os camundongos mutantes nulos da sintase-GM2/GD2 machos e fêmeas (Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002)) foram usados com 12 a 22 semanas de idade (19 a 37 g). Todos os experimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes de UK Home Office (UK PPL60/3096), lei da Holanda e Glasgow e diretrizes de Leiden University.

Anticorpos monoclonais e soro humano normal

O gangliosídeo mAb anti-GQ1b IgM1 CGM3 foi derivado de camundongos inoculados com um lipooligossacarídeo Campylobacterjejuni contendo GT1a (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). CGM3 reage com GQ1b gangliosídeos, GD3 e GT1a que partilham a estrutura de disialilgalactose terminal. Estudos anteriores mostraram que CGM3 possui especificidade de gangliosídeo similar e efeitos patogênicos de complemento- dependentes induzidos idênticos como soro de MFS humano (Goodyear et al. J. Clin. Invest 104:697-708 (1999)). A concentração de CGM3 foi medida utilizando ELISA quantitativo (Bethyl Laboratories, Texas, USA). O soro humano normal (NHS) foi obtido de um único estoque doador que foi recentemente congelado e armazenado em múltiplas alíquotas a - 70°C para conservar a atividade do complemento. Antes do uso experimental, CGM3 e NHS foram dialisados durante 24 h a 4°C contra a solução de Ringer (116 mM de NaCI, 4,5 mM de KCI, 1 mM de MgCI2, 2 mM de CaCI2, 1 mM de NaH2PO4, 23 mM de NaHCO3, 11 mM de glicose, pH 7,4), pré-gaseificados com 95% de O2 /5% de CO2. O eculizumab mAb anti- humano C5 humanizado e um mAb de controle ALXN3300 combinado com isotipo não- específico foram obtidos junto à Alexion Pharmaceuticals (Cheshire, USA) e armazenados a 40°C

Modelo de MFS in vitro

O modelo in vitro de MFS que utiliza CGM3 e NHS foi descrito antes (Goodyear et al. J Clin. Invest 104:697-708 (1999); 0'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). Em suma, os hemidiafragmas de camundongos com nervo frênico ligado (ou músculos triangularis sterni em alguns casos para imunoistologia de NMJ ilustrativa) foram dissecados e colocados em meio de Ringer em temperatura ambiente (20 a 22°C). As pequenas seções de controle não-tratadas foram removidas de cada preparação muscular antes de qualquer incubação e congeladas em gelo seco para análise imunoistológica de linha de base subseqüente. Os músculos foram incubados com CGM3 (50 /vg/ml) durante 2 a 2,5 h a 32°C, então durante 30 min a 4°C e, então, equilibrados durante 10 minutos em temperatura ambiente, enxaguados em meio de Ringer e subseqüentemente expostos a 33 ou 40% de NHS em meio de Ringer durante 1 h em temperatura ambiente. Eculizumab (100 /yg/ml) ou o mAb de controle (100 yug/ml) foi misturado com NHS 10 min antes da incubação da preparação muscular. As medidas eletrofisiológicas in vitro na NMJ (veja abaixo) e contagem as contrações de fibras musculares, uma característica de liberação de transmissor não-controlada em NMJs nesse modelo (Jacobs et al. Muscle Nerve 25:549-558 (2002); 0'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)), foram realizadas antes e após a incubação de CGM3, e durante 1h de incubação com NHS. As faixas musculares foram congeladas em gelo seco e armazenadas a -20°C, tanto antes como após a incubação com NHS. As NMJs e axônios motores terminais foram avaliados por níveis de IgM1 C3c, MAC, NF e viabilidade de pSC (veja abaixo).

Modelo de MFS in vivo

Os camundongos Balb/c (3 a 4 semanas de idade, 10 a 15 g) foram injetados de forma intraperitoneal com 1,5 mg de CGM3, seguidos por 16 h depois por uma injeção intraperitoneal de 0,5 ml de 100% NHS. Os camundongos foram observados por mais 4 a 6 h e analisados com pletismografia de corpo inteiro (veja abaixo) e teste de dinamometria, como descrito antes (Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007)). Os camundongos então morreram por asfixia com CO2 e o tecido muscular de hemidiafragma foi dissecado e analisado em experimentos eletrofisiológicos e contração muscular (veja abaixo) ou adicionalmente processado para análise imunoistológica (veja abaixo). O efeito de eculizumab sobre os sintomas in vivo e as lesões eletrofisiológicas, funcionais e histológicas subseqüentemente analisadas foi testado nesse modelo ao injetar 200 μg de eculizumab ou mAb de controle na veia da cauda, pouco antes da injeção intraperitoneal de NHS. Os experimentos de descoberta de variação de dose iniciais (dados não mostrados) indicaram que eculizumab em doses de >50 /yg/camundongo protegido contra neuropatia.

Pletismografia

A pletismografia de corpo inteiro não-invasiva (EMMS, Hants, UK) foi empregado para demonstrar alterações nos parâmetros respiratórios em experimentos in vivo. Os dados de linha de base foram coletados antes do início do experimento. Os camundongos foram injetados com CGM3 seguidos por NHS com eculizumab ou mAb de controle 16 h depois (protocolo como acima) e continuamente monitorados durante 6 h. Os parâmetros derivados de fluxo de freqüência respiratória e volume tidal são coletados de 25 respirações aceitas e calculados durante períodos de 1h.

Análise eletrofisiológica in vitro de NMJs e escore visual de contratilidade muscular

Os hemidiafragmas esquerdo e direito com seu nervo frênico associado foram dissecados e achatados em uma placa revestida com borracha de silicone em 1,5 ml de meio de Ringer em temperatura ambiente. Os registros intracelulares de potenciais de placa terminal em miniatura (MEPPs, os eventos pós-sinápticos que surgem de liberação espontânea de única porção de acetilcolina do terminal nervoso motor pré-sináptico) foram feitos em NMJs a 20 a 22°C. As fibras musculares foram imobilizadas próximas à NMJ com um microeletrodo de vidro de 10 a 20 ΜΩ preenchido com 3 M de KCI1 conectadas a um amplificador GeneCIamp 500B (Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, CA1 USA) para amplificar e filtrar (10 kHz passa baixo) do sinal. Os sinais foram digitalizados, armazenados e analisados (desligados) utilizando uma interface Digidata 1322A, Clampex 9.2 e programas Clampfit 9.2 (todas de Axon Instruments/Molecular Devices), Mini Analysis 6.0 (Synaptosoft, Fort Lee, USA) e rotinas programadas em Matlab (The Math Works Inc., Natick, MA, USA).

A ocorrência de contrações fibrosas assíncronas espontâneas que são induzidas por uma alta freqüência de MEPP resultante de CGM3/dano pré-sináptico mediado por complemento (Plomp et al. Ann. Neurol. 45:189-199 (1999)) foi visualmente observada a cada 5 min (0'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). O tecido pontuou 0 para nenhuma atividade, 1 para a contração de <10 fibras, 2 para uma pequena quantidade de contração ao longo do tecido, 3 para uma quantidade moderada e 4 para uma grande quantidade. O escore médio durante cada período de medição foi calculado. O resultado final de CGM3/dano pré-sináptico mediado por complemento é um silenciamento de transmissão sináptica na NMJ. O número de NMJs "silenciosas" (ou seja, sem MEPPs detectáveis e ocorrência de potenciais de ação muscular evocados por estímulo de nervo frênico) foi expresso como a porcentagem do número total de NMJs experimentadas (8-41) em um músculo sob cada condição experimental.

Experimentos de contração muscular A eficácia protetora de eculizumab sobre a perda induzida por CGM3/NHS in vitro

de força de contração evocada por estímulo nervoso da preparação de hemidiafragma foi testada. Foi usado o diafragma de camundongos mutantes nulos da sintase-GM2/GD2, pois estudos anteriores mostraram uma sensibilidade um tanto maior de músculo dessa cepa à perda induzida por CGM3/NHS de contração (Bullens et al. J. Neurosci. 22:6876-6884 (2002)). As preparações de nervo frênico/hemidiafragma esquerdo e direito que foram pré- incubadas com 200 //g/ml de CGM3 durante 3 h a 32°C foram colocadas em uma placa revestida de borracha de silicone que contém 2,25 ml de meio de Ringer em temperatura ambiente (20 a 22°C), continuamente borbulhadas com 95% de 02/5% de CO2. O lado das costelas do músculo foi perfeitamente fixado à parte inferior da placa por múltiplos pinos pequenos e o tendão central foi conectado por meio de um gancho de metal e um cordão a um transdutor de força que foi conectado a um amplificador e equipamento de digitalização, como descrito antes (Kaja et al. Eur J. Neurosci 25:2009-2020 (2007)). Os estímulos supra- máximos (geralmente -10 V) de 100 //s de duração foram distribuídos a cada 5 min durante 3 s em 40 Hz de um estimulador programável Master-8 (AMPI, Jerusalem, Israel). A tensão básica foi ajustada com um controle de vernier para obter a força de contração tetânica estimulada máxima (geralmente cerca de 10 g). A estabilidade da contração obtida foi monitorada durante 30 a 50 min. Subseqüentemente, o meio foi substituído por NHS (33%) ao qual eculizumab (3, 6, 9, 12, 25, 50 ou 100 /vg/ml) foi adicionado e misturado durante -10 min antes da adição e o efeito durante 100 a 200 min, sob borbulhamento suave contínuo com 95% de 02/5% de CO2. Nos experimentos de controle sem eculizumab adicionado, 100 /vg/ml de mAb de controle foram adicionados ao NHS. A amplitude de contrações foi medida por cursor off-line no programa Clampfit 9.0 (Axon Instruments/Molecular Devices, Union City, USA), 2 s após o início de cada série de estímulo nervoso.

As forças de contração tetânica também foram medidas mediante o estímulo nervoso in vitro de músculos do hemidiafragma esquerdo que foram dissecados de camundongos que foram submetidos ao protocolo de MFS in vivo.

Análises imunoistológicas

As seções de hemidiafragma não-fixadas foram colocadas em meio de montagem M-I de Lipshaw (Pittsburgh, PA, USA), e as seções de criostato longitudinais (8 a 20 /vm) foram cortadas em lâminas revestidas com 3-aminopropiltrietoxisilano, secas ao ar, então armazenadas a -20°C. Para localizar as NMJs, TRITC e σ-bungarotoxina marcada por bodipy (σ-ΒΤχ, diluído em 1/750 a 1,3 /vg/ml; Molecular Probes, Eugene1 Oregon) foram usados. O componente de complemento C3c intermediário foi detectado por incubação com anti-C3c de coelho marcado por FITC (1/300; Dako, Ely, UK) durante 1 h a 4°C. o MAC foi detectado utilizando C5b-9 anti-humano de camundongo (1/50; Dako) seguido por IgG de cabra anti-camundongo conjugado por FITC (1/300), ambos durante 1 h a 4°C.

Para coloração de NF1 as seções de tecido não-fixado foram pré-incubadas durante 1h a 4°C com σ-ΒΤχ conjugado por TRITC, enxaguadas, imersas em etanol a -20°C durante min, então, incubadas durante a noite em temperatura ambiente com o soro policlonal de coelho 1211 (1/750; reativo com NF fosforilado; Affiniti Research Products Ltd. Exeter, UK) seguidas por IgG de cabra anti-coelho conjugado por FITC (1/300; Southern Biotechnology Associates) durante 3 h a 4°C. Todos os anticorpos de detecção foram diluídos em salina tamponada com fosfato (PBS). A viabilidade de pSC foi avaliada utilizando EthD-1, um corante impermeável de membrana que marca com fluorescência vermelha os ácidos nucléicos de células permeabilizadas por membrana (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Em suma, as preparações nervo-músculo foram expostas ao meio de Ringer que contém 2 /vM de EthD-1. O tecido foi incubado no escuro em temperatura ambiente durante 1 h, enxaguado em solução de Ringer e congelado para imunoistologia. As NMJs foram identificadas em 15 /vm de seções de criostato mediante coloração com σ-ΒΤχ conjugado por bodipy (1,3 /vg/ml), e a porcentagem de NMJs com núcleos positivos de EthD-1 em NMJs foi calculada.

Para ilustrações, os músculos triangularis sterni de membrana foram incubados com CGM3 (50 /yg/ml) e σ-ΒΤχ conjugado por fluorocromo (TRITC/FITC/CYS) (2 /ug/ml;

1:500), seguido por NHS mais eculizumab ou mAb de controle. As preparações foram incubadas com a-BTx fluorescentemente conjugado e várias combinações dos seguintes: anti-C5b-9 de camundongo (1 :40; Dako), anti-C3c-FITC (1:200; Dako), ou EthD-1 (2 μΜ) em meio de Ringer durante 1 h em temperatura ambiente, enxaguado em meio de Ringer, seguido por fixação durante 20 min em 4% de formaldeído em PBS. Os grupos aldeído não- reativos foram extinguidos, mediante incubação com 0,1 M de glicina durante 10 min. Os anticorpos foram então reaplicados em PBS e agitadas durante a noite em temperatura ambiente. Para coloração de antígenos intracelulares, o músculo foi fixado em 4% de formaldeído durante 20 min seguido por 10 min em 0,1 M de glicina e então incubado em uma solução permeabilizante de 0,5% de Triton-XIOO em PBS durante 30 min em RT, e tanto anti-S100 de coelho (1:150; Dako) ou anti-NF de coelho (1: 150; Chemicon, Hampshire, UK) diluído em solução permeabilizante aplicada durante a noite em temperatura ambiente. O tecido foi enxaguado em PBS e se necessário incubado nos seguintes anticorpos fluorescentemente conjugados 1:300; IgG-FITC anti-coelho, IgG-FITC anti-camundongo ou TRITC e agitado durante 7 h em RT no escuro. O tecido foi enxaguado em PBS e colocado em meio de montagem de Citifluor (Citifluor Products, Canterbury, UK).

Aquisição de imagens, quantificação e análise estatística

As imagens digitais foram capturadas utilizando tanto microscopia confocal de varredura a laser Zeiss Pascal e Zeiss Axio Imager Zl com ApoTome. As medidas de imagem-análise foram feitas utilizando o software de análise de imagem Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA). Para análise quantitativa de IgM, C3c, MAC e NF, 3 séries de coloração de cada marcador foram realizadas no tecido de pelo menos 3 hemidiafragmas individuais, e quantificadas como anteriormente descrito (0'Hanlon et al. Brain 124:893-906 (2001)). Todos os estudos eram "observer blinded". Para análise imunoistológica de dados não-paramétricos, foram feitas comparações estatísticas utilizando Mann- Whitney Test que emprega um nível de 1% de significância. Para comparação de pSC positivo de EthD-1 na NMJ1 o teste qui-quadrado foi usado em nível de 1% de significância. Referências

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Claims

1. Método para tratar um mamífero que possui uma neuropatia mediada por anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que sendo que o dito método compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero possui uma neuropatia mediada por anticorpo anti-gangliosideo ou anti- glicolipídeo (AGA).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita neuropatia mediada por anticorpo é selecionada a partir do grupo que consiste em neuropatia axonal motora aguda, polineuropatia desmielinizante inflamatória aguda, encefalite do tronco encefálico de Bickerstaff, oftalmoparese aguda, síndrome de Guillain-Barré atáxica, fraqueza faríngeo-cervical-braquial, síndromes de neuropatia crônica com anticorpos anti-glicolipídeo, neuropatia paraproteinêmica IgM anti-MAG, neuropatia atáxica sensorial crônica com anticorpos anti-disialosil, neuropatia paraproteinêmica de IgM, IgG e IgA, neuropatia motora com anticorpos anti-GM1 e anti- GM2, neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), neuropatia motora multifocal (MMN), e neuropatia sensorial e motora desmielinizante adquirida multifocal (MADSAM).

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero é um humano.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito inibidor de cascata de complemento é selecionado entre: um polipeptídeo, um análogo de polipeptídeo, um peptidomimético, um anticorpo, um ácido nucléico, uma construção de RNAi1 um análogo de ácido nucléico, e uma pequena molécula.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito inibidor de cascata de complemento é um anticorpo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo total ou um fragmento de anticorpo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo total ou fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, um a anticorpo bivalente, um anticorpo quimerizado ou quimérico ou fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo, um anticorpo humano desimunizado ou fragmento de anticorpo, um anticorpo completamente humano ou fragmento de anticorpo, um anticorpo de cadeia simples, um Fv, um Fab, an Fab', ou um F(ab')2.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo inibe a ativação da via clássica de complemento, a via alternativa de complemento ou a via de Iectina de complemento.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo contra qualquer elemento do grupo que consiste nos componentes de complemento C5, C5b, C6, C7, C8, e C9.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo contra C5.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um inibidor de clivagem de C5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é eculizumab.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é pexelizumab.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento é crônico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento compreende tratar um episódio agudo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero é tratado ao administrar o dito anticorpo de forma intravenosa.

18. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é administrados de forma sistêmica ao dito mamífero.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito inibidor de cascata de complemento é localmente administrado ao dito mamífero.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento resulta em lesão neural reduzida no dito mamífero.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito inibidor de cascata de complemento inibe ou reduz o grau e/ou nível de uma condição fisiológica indesejada que resulta de excesso de lesão do nervo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita condição fisiológica indesejada é selecionada a partir do grupo que consiste em 30 oftalmoplegia, ataxia, areflexia, coordenação muscular anormal, paralisia dos músculos oculares, dores musculares, ausência dos reflexos do tendão, entorpecimento e formigamento nas extremidades inferiores, fraqueza dos músculos distais das extremidades inferiores, pé caído, fraqueza que envolve toda a extremidade inferior, fraqueza que envolve as extremidades superiores, fraqueza nos músculos da respiração, e morte.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento resulta em formação de complexo de ataque à membrana (MAC) reduzida em junções neuromusculares pré-sinápticas.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento restaura a freqüência normal de potenciais de placa terminal em miniatura.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento restaura a transmissão sináptica nas junções neuromusculares.

26. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tratamento inibe a perda de integridade terminal nas junções neuromusculares.

27. Método para tratar um mamífero que possui síndrome de Guillain-Barré, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de cascata de complemento.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero possui a variante de Miller Fisher da síndrome de Guillain-Barré.