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BRPI0708832A2 - construÇço proteinÁcea - Google Patents

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BRPI0708832A2
BRPI0708832A2 BRPI0708832-9A BRPI0708832A BRPI0708832A2 BR PI0708832 A2 BRPI0708832 A2 BR PI0708832A2 BR PI0708832 A BRPI0708832 A BR PI0708832A BR PI0708832 A2 BRPI0708832 A2 BR PI0708832A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
fviii
factor viii
polyethylene glycol
molecule
rfviii
Prior art date
Application number
BRPI0708832-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Juergen Siekamann
Katalin Varadi
Herbert Gritsch
Peter Turecek
Original Assignee
Baxter Int
Baxter Healthcare Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Int, Baxter Healthcare Sa filed Critical Baxter Int
Publication of BRPI0708832A2 publication Critical patent/BRPI0708832A2/pt

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Abstract

CONSTRUÇçO PROTEINÁCEA. A invenção é uma construção proteinácea compreendendo uma molécula do Fator VIII tendo pelo menos uma porção do domínio B intacta, o qual é conjugado a um polímero solúvel em água, tal como o polietileno glicol com um peso molecular de mais do que 10.000 Daltons. A construção tem uma atividade biológica de pelo menos 80 % da atividade biológica do Fator VIII nativo, e a meia-vida in vivo da construção é aumentada em pelo menos 1,5 vez, em comparação com a meia-vida in vivo do fator FVIII nativo.

Description

"CONSTRUÇÃO PROTEINÁuüaCAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a uma construção proteináceacompreendendo o fator VIII de coagulação (FVIII) sendo ligado a pelo menos5 um polímero solúvel, tal como um poli(óxido de alquileno), tal como opolietileno glicol. Além disso a presente invenção diz respeito a métodos paraprolongar a meia-vida in vivo do FVIII no sangue de um mamífero que tenhaum distúrbio de sangramento associado com imperfeições funcionais oudeficiências do FVIII.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O fator VIII (FVIII) de coagulação circula no plasma em umaconcentração muito baixa, e é ligado não covalentemente ao fator de vonWillebrand (VWF). Durante a hemostasia, o FVIII é separado do VWF e atuacomo um cofator para a ativação do fator X (FX) mediada pelo fator IXativado (FIXa) mediante intensificação da relação de ativação na presença decálcio e de fosfolipídeos ou de membranas celulares.
O FVIII é sintetizado como um precursor de cadeia única deaproximadamente 270 a 330 kD com a estrutura de domínio A1-A2-B-A3-C1-C2. Quando purificado do plasma, o FVIII é composto de uma cadeiapesada (A1-A2-B) e uma cadeia leve (A3-C1-C2). A massa molecular dacadeia leve é de 80 kD, enquanto, por causa da proteólise dentro do domínioB, a cadeia pesada situa-se na faixa de 90 a 220 kD.
O FVIII é também sintetizado como uma proteínarecombinante para uso terapêutico em distúrbios de sangramento. Váriosensaios in vitro foram delineados para determinar a eficácia potencial doFVIII recombinante (rFVIII) como um tratamento terapêutico. Estes ensaiosimitam os efeitos in vivo do FVIII endógeno. O tratamento in vitro datrombina do FVIII resulta em um rápido aumento e subseqüente redução emsua atividade pró-coagulante, conforme medido pelo ensaio in vitro. Estaativação e inativação coincide com a proteólise específica limitada, tanto nascadeias pesadas quanto nas leves, o que altera a disponibilidade de diferentesepisódios de ligação no FVIII, por exemplo possibilitando que o FVIII sedissocie do VWF e se ligue a uma superfície fosfolipídica, ou alterando acapacidade de ligação a certos anticorpos monoclonais.
A ausência ou disfiinção do FVIII acha-se associada com odistúrbio de sangramento mais freqüente, a hemofilia A. O tratamento deescolha para o controle da hemofilia A é a terapia de substituição com plasmaderivado ou com concentrados de rFVIII. Os pacientes com hemofilia Asevera com níveis de FVIII abaixo de 1 %, acham-se geralmente na terapiaprofilática com o objetivo de manter o FVIII acima de 1 % entre as doses,Levando-se em conta as meias-vidas médias dos vários produtos de FVIII nacirculação, isto pode usualmente ser alcançado dando-se FVIII duas a trêsvezes por semana.
Existem muitos concentrados no mercado para o tratamento dahemofilia A. Um destes concentrados é o produto recombinante Advate®, queé produzido nas células de CHO e fabricado pela Baxter HealthcareCorporation. Nenhuma proteína ou albumina plasmática humana ou animal éadicionada no processo de cultura celular, purificação ou formulação finaldeste produto.
O objetivo de muitos fabricantes dos concentrados de FVIII edos medicamentos terapêuticos de polipeptídeos, é desenvolver um produtopara a próxima geração com propriedades farmacodinâmicas efarmacocinéticas intensificadas, ao mesmo tempo em que mantenha todas asoutras características do produto.
Os medicamentos polipeptídicos terapêuticos são rapidamentedegradados pelas enzimas proteolíticas e neutralizados pelos anticorpos. Istoreduz sua meia-vida e o tempo de circulação, dessa forma limitando suaeficácia terapêutica. A adição de um polímero ou carboidrato solúveis a umpolipeptídeo foi observada impedir a degradação e aumentar a meia-vida dospolipeptídeos. Por exemplo, a PEGuilação dos medicamentos depolipeptídeos protegé-os e melhora seus perfis farmacodinâmicos efarmacocinéticos (Harris, J. M. e Chess, R. B., Nat. Rev. Drug Discov. 2003;
2: 214-221). O processo de PEGuilação liga unidades de repetição dopolietileno glicol (PEG) a um medicamento polipeptídico. A PEGuilação dasmoléculas pode levar a uma resistência aumentada dos medicamentos àdegradação enzimática, à meia-vida in vivo aumentada, à freqüência dedosagem reduzida, à imunogenicidade decrescida, à estabilidade física etérmica aumentada, à solubilidade aumentada, à estabilidade líquidaaumentada, e à agregação reduzida.
Assim sendo, a adição de um polímero solúvel, tal comoatravés da PEGuilação, é uma abordagem para melhorar as propriedades deum produto de FVIII. O estado da técnica é documentado por diferentespatentes e pedidos de patentes:
A U.S. 6037452 descreve um conjugado de poli(óxido dealquileno-FVIII ou FIX, em que a proteína seja covalentemente ligada a umpoli(óxido de alquileno) através de grupos carbonila do referido FVIII.
A EP 1258497 Bl descreve um método para prepararconjugados de FVIII e um polímero biocompatível. Esta patente foisuplementada por uma publicação de Rõstin et al. (Bioconj. Chem. 2000; 11:387-396). Os conjugados compreendem um FVIII recombinante deletado dedomínio B, modificado com o polietileno glicol monometóxi. O conjugadotinha função de FVIII reduzida e a atividade coagulante rapidamente reduzidacom o grau de modificação.
A WO 04075923A3 descreve o conjugado molecular depolímero-FVIII compreendendo uma pluralidade de conjugados em que cadaconjugado tem um a três polímeros solúveis em água covalentemente ligadosa uma molécula de FVIII. A molécula de FVIII é deletada de domínio B.A U.S. 4970300 descreve um FVIII modificado, em que umconjugado infusível contendo uma proteína tendo atividade de FVIII, foicovalentemente ligado a um ligando não antigênico.
A U.S. 6048720 descreve conjugados de um polipeptídeo e umpolímero biocompatível.
A WO 94/15625 descreve o FVIII ligado a polietileno glicoltendo um peso molecular preferido de não mais do que 5.000 Daltons.
Permanece uma necessidade de um FVIII tendo um polímerosolúvel ligado para prolongar a meia-vida do FVIII in vivo, por exemplo umFVIII PEGuilado, tal como o FVIII de comprimento completo tendo PEGmaior do que 10.000 Daltons a ele conjugado, o qual retenha a atividadefuncional enquanto proporciona uma meia-vida in vivo prolongada, emcomparação com o FVIII não PEGuilado.
FIGURAS
A Figura 1 mostra a ampliação e o aumento de massa dorFVIII após a conjugação com PEG medido por SDS-PAGE com osubseqüente imunomanchamento.
A Figura 2 mostra as farmacocinéticas do conjugado de PEG-rFVIII em comparação com o FVIII não conjugado em camundongoshemofílicos. Quadrados abertos: PEGrFVIII, dose 200 IU de FVIII/kg.Losangos fechados: rFVIII nativo, dose 200 IU de FVIII/kg.
A Figura 3 mostra a análise detalhada dos sítios dePEGuilação por SDS-PAGE, com o uso de vários anticorpos anti-FVIII.
A Figura 4 mostra a ativação e a inativação induzidas pelatrombina, do rFVIII nativo e PEGuilado.
A Figura 5 mostra as faixas demonstrando os domínios dorFVIII nativo e PEGuilado.
A Figura 6 mostra a extensão da PEGuilação de váriosdomínios do rFVIII nativo e PEGuilado.A Figura 7 mostra a relação de inativação da trombina dorFVIII nativo e PEGuilado.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção é uma construção proteinácea compreendendo umamolécula de FVIII tendo pelo menos uma porção do domínio B intacta, ligadaa um polímero solúvel em água, o qual é um óxido de polialquileno, umapolivinil pirrolidona, um álcool polivinílico, polioxazolina, uma poli-acriloilmorfolina ou um carboidrato, tal como um ácido polissiálico (PSA).Em uma forma de realização da invenção, o polímero solúvel em água é umamolécula de polietileno glicol tendo um peso molecular de mais do que10.000 Daltons. A construção retém a atividade funcional completa dosprodutos de FVIII terapêuticos padrão, e proporciona uma meia-vida in vivoprolongada, em comparação com os produtos de FVIII terapêuticos padrão.
O material de partida da presente invenção é o FVIII, o qualpode ser originado do plasma humano, ou produzido por técnicas deengenharia recombinante, como descrito nas patentes U.S. 4.757.006; U.S.5.733.873; U.S. 5.198.349; U.S. 5.250.421; U.S. 5.919.766; EP 306 968.
No presente, os termos "Fator VIII" ou "FVIII" referem-se aqualquer molécula de FVIII que tenha pelo menos uma porção do domínio Bintacto, e que apresente atividade biológica que esteja associada com o FVIIInativo. Em uma forma de realização da invenção, a molécula de FVIII é oFator VIII de comprimento completo. A molécula de FVIII é uma proteínaque é codificada pelas seqüências de DNA capazes de hibridizar ao DNAcodificando o Fator VIII:C. Uma tal proteína pode conter deleções deaminoácidos em vários sítios entre ou dentro dos domínios A1-A2-B-A3-C1-C2 (U.S. 4.868.112). A molécula do FVIII pode também ser análoga do FVIIInativo, em que um ou mais resíduos de aminoácidos tenham sido substituídosmediante a mutagênese dirigida ao sítio.
Por exemplo, uma molécula de FVIII pode ser PEGuilada poruma variedade de métodos químicos (Roberts, J. M. et al., Advan. DrugDelivery Rev. 2002; 54: 459-476). Por exemplo, o FVIII pode ser PEGuiladopela combinação do PEG com grupos SH livres usando-se a química damaleimida ou o acoplamento das hidrazidas de PEG ou das aminas de PEGaos componentes de carboidrato do FVIII após a oxidação anterior.
Em uma forma de realização da invenção, o FVIII foimodificado através de resíduos de lisina mediante o uso de derivados depolietileno glicol contendo um éster ativo de N-hidroxissuccinimida (NHS),tal como o succinato de succinimidila, o glutarato de succinimidila ou opropionato de succinimidila. Estes derivados reagem com os resíduos delisina do FVIII sob condições brandas mediante a formação de uma ligaçãoamida estável. Em uma forma de realização da invenção, o comprimento dacadeia do derivado de PEG é de 5.000 Da. Outros derivados de PEG comcomprimentos de cadeia de 500 a 2.000 Da, 2.000 a 5.000 Da, maiores do que5.000 até 10.000 Da ou maiores do que 10.000 até 20.000 Da, ou maiores doque 20.000 até 150.000 Da, podem ser usados, incluindo as estruturas linearese ramificadas.
Métodos alternativos para a PEGuilação dos grupos amino sãoa combinação química com carbonatos de PEG, mediante a formação deligações de uretano, ou a reação com aldeídos ou cetonas mediante aaminação redutiva formando ligações de amida secundárias.
Na presente invenção, uma molécula de FVIII é quimicamentemodificada com o uso de derivados de PEG que são comercialmentedisponíveis. Estes derivados de PEG podem ter uma estrutura linear ouramificada. Exemplos de derivados de PEG contendo grupos de NHS sãolistados abaixo.
Os seguintes derivados de PEG são exemplos daquelescomercialmente disponíveis da Nektar Therapeutics (Huntsville, Al; verwww.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced PEGylation, lista depreços de 2005-2006):
Propionato de mPEG-succinimidila (mPEG-SPA)
<formula>formula see original document page 8</formula>
a-metilbutanoato de mPEG-succinimidila (mPEG-SMB)mPEG-CM-HBA-NHS (CM = carboximetila; HBA = ÁcidoHidróxi butírico)
<formula>formula see original document page 8</formula>
Estrutura de um derivado de PEG ramificado (NektarTherapeutics):
N-hidroxissuccinimida de PEG ramificado (mPEG2-NHS)
<formula>formula see original document page 8</formula>
Este reagente com estrutura ramificada é descrito em maisdetalhes por Kozlowski et al. (BioDrugs 2001; 5: 419-429).
Outros exemplos de derivados de PEG acham-secomercialmente disponíveis da NOF Corporation (Tóquio, Japão; verwww.nof.co.jp/english: Catálogo 2005)
Estrutura Geral dos derivados de PEG linear (NOF Corp.):<formula>formula see original document page 9</formula>
X = carboximetila
<formula>formula see original document page 9</formula>
<formula>formula see original document page 9</formula>
X = carboxipentila
<formula>formula see original document page 9</formula>
X = succinato
<formula>formula see original document page 9</formula>
succinato de succinimidila de mPEGX = glutarato
<formula>formula see original document page 9</formula>
glutarato de succinimidila de mPEGEstruturas de derivados de PEG ramificado (NOF Corp.):2,3 -bis(metilpolioxietileno-óxi)-1 -(1,5 -dioxo-5 -succinimidilóxi-pentilóxi)-propano<formula>formula see original document page 10</formula>
2,3-bis(metilpolioxietileno-óxi)-1 -(succinimidilcarboxipentilóxi)propano
<formula>formula see original document page 10</formula>
Estes derivados de propano mostram uma estrutura de glicerolcom um padrão de substituição de 1,2. Na presente invenção, os derivados dePEG ramificados com base nas estruturas de glicerol com substituição de 1,3ou outras estruturas ramificadas descritas na U.S. 2003/0143596A1, tambémpodem ser usados.
hidrolisáveis) como descrito por Tsubery et al. (J. Biol. Chem. 2004; 279:38118-38124) e Shechter et al. (WO 04089280 A3) podem também serusados na presente invenção.
apresenta atividade funcional completa, combinada com uma meia-vida invivo do FVIII prolongada. Além disso, o rFVIII PEGuilado parece ser maisresistente contra a inativação da trombina. Isto foi mostrado por umavariedade de métodos in vitro e in vivo, e é ilustrado pelos seguintesexemplos.
EXEMPLOSEXEMPLO 1
PEGUILACÂO DOS RESÍDUOS DE LISINA NO rFVIII COM
Os derivados de PEG com degradável (por exemplo, ligadores
Surpreendentemente, o FVIII PEGuilado desta invenção
SUCCINATO DE SUCCINIMIDILA DE mPEG
Uma solução de uma massa de rFVIII derivada do processo defabricação Advate (3.400 U/ml) foi filtrada em gel mediante o uso de colunasEcono-Pac IODG (Bio-Rad) com o uso de tampão de Hepes 20 mM, NaCl150 mM, pH 7,4, contendo 0,5 % de sacarose e 0,1 % de Polissorbato 80.Depois, succinato de succinimidila de mPEG (Abuchowski et al. CâncerBiochim. Biophys. 1984; 7: 175-186) com um comprimento de cadeia de5.000 Da (PEG-SS 5000) foi adicionado a esta solução sob agitação suave (5mg de PEG-SS / mg de proteína) e o valor do pH foi ajustado em 7,4 pelaadição em gotas de NaOH 0,5 M. Depois a PEGuilação foi realizada sobagitação suave por 1 hora na temperatura ambiente.
Subseqüentemente, a mistura de reação foi aplicada sobre umaresina de cromatografia de troca de íons equilibrada (Fractogel EMD TMAE650M / coluna XK-10 da Pharmacia, altura do leito: 15,0 cm) em tampão deHepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, contendo 0,5 % de sacarose e 0,1 % dePolissorbato 80. Depois, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio de 20CV para remover o reagente em excesso, e o rFVIII PEGuilado foi eluídocom tampão de eluição (Hepes 20 mM, NaCl 1,0 M, 0,5 % de sacarose, 0,1 %de Polissorbato 80 pH 7,4). O eluído foi concentrado medianteultrafiltração/diafiltração com uma membrana consistindo em celuloseregenerada e com um corte de peso molecular de 30 kD, usando um sistemade tampão consistindo em Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, 0,5 % de sacarose,pH 7,4.
EXEMPLO 2
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO rFVIII PEGUILADO IN VITROO RFVIII derivado do processo de fabricação Advate foiPEGuilado de acordo com o Exemplo Ieo produto de FVIII PEGuilado foibioquimicamente caracterizado. A atividade funcional do PEG-rFVIII foideterminada pelo uso do ensaio cromogênico de FVIII [Rosen, S., Scand, J.Haematol. 1984; 33 (Supl. 40): 139-145). O método baseia-se no Assay ofBlood Coagulation Factor VIII 5â edição da Farmacopéia Européia (5.05)Uma amostra contendo o fator VIII (FVIILC) é misturada comtrombina, fator IX ativado (FIXa), fosfolipídeos e fator X (FX) em um tampãocontendo cálcio. O FVIII é ativado pela trombina e subseqüentemente formaum complexo com os fosfolipídeos, FIXa e íons de cálcio. Este complexoativa o fator X no fator Xa5 o qual por sua vez cliva o substrato cromogênicoFXa-I (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA). O decurso de tempo dapara-nitroanilina (pNA) liberada é medido com uma leitora de microplacasem 405 nm. O declive da reação é proporcional à concentração do fator VIIIna amostra. O valor do antígeno de FVIII foi medido pelo uso de um sistemade ELISA comercialmente disponível (Cedarlane, Hornby, Ontário, Canadá)com modificações de menor importância. Destes valores, as relações decromogênio de FVIII/antígeno de FVIII foram calculadas. O conteúdo deproteínas nas preparações foi determinado pela medição da densidade ópticaem 280 nm. Destes dados, o conteúdo de proteína foi calculado (Hoyer, L. W.em: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley VCH,Weinheim, Alemanha, 1998) e expresso em mg/ml.
TABELA 1
<formula>formula see original document page 12</formula>
Os dados da Tabela 1 mostram que, na preparação do rFVIIIPEGuilado, a atividade biológica (expressa pela relação da atividadecromogênica do FVIII para o antígeno de FVIII) é recuperada em mais do que90 % em comparação com a atividade biológica do rFVIII nativo (100 %).
EXEMPLO 3
CARACTERIZAÇÃO DO rFVIII PEGUILADO MEDIANTE SDS-PAGE ETÉCNICAS DE IMUNOMANCHAMENTOO rFVIII nativo foi caracterizado por SDS-PAGE sobcondições de redução pelo uso de um gel de gradiente de 4 a 12 % depoliacrilamida obtido da Invitrogen (Carlsbad, Califórnia, USA) de acordocom as instruções do fabricante. Como marcadores de peso molecular (MW)5os marcadores Precision Plus (10 kD a 250 kD) obtidos da Bio-Rad(Hercules, CA, USA) foram usados. Depois, as proteínas foram transferidaspara uma membrana de PCDF obtida da Bio-Rad (Hercules, CA, USA)mediante eletromanchamento e, subseqüentemente, incubadas com umanticorpo de FVIII: C policlonal anti-humano de carneiro obtido da Cedarlane(Hornby, Ontário, Canadá). As últimas etapas do procedimento deimunomanchamento foram a incubação com um anticorpo anticarneiroconjugado à fosfatase alcalina (ALP) obtido da Accurate (Westbury, NY,USA), seguida pela visualização final mediante o uso de um kit de substratode ALP (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Os resultados acham-se resumidos naFigura 1. A mancha demonstra a estrutura do domínio do rFVIII nativo e
PEGuilado. E mostrado que o rFVIII PEGuilado tem faixas mais amplas emassas moleculares elevadas do que a proteína recombinante nativa.EXEMPLO 4
FARMACOCINÉTICA DO rFVIII PEGUILADO EM UM MODELO DECAMUNDONGO SILENCIADO DEFICIENTE DE FVIII
Camundongos deficientes de FVIII descritos em detalhes porBi et al. (Nat. Genet. 1995; 10: 119-121) foram usados como um modelo dehemofilia A humana severa. Grupos de 5 camundongos receberam umainjeção de bolo (10 ml/kg) através da veia da cauda, ou com PEG-rFVIII(PEG-SS, 5K) preparado de acordo com o Exemplo 1, ou com rFVIII nativoem uma dose de 200 IU de FVIII/kg de peso corporal. Plasma citratado,mediante punção do coração após anestesia, foi preparado dos gruposrespectivos, em 5 minutos, 3, 6, 9 e 24 horas após a injeção. Os níveis deatividade do FVIII foram medidos nas amostras de plasma. Os resultadosdesta experiência são resumidos na Figura 2. A meia-vida média aumentou de1,9 hora (para o rFVIII nativo) para 4,9 horas (para o rFVIII PEGuilado), aárea sob a curva (AUC) aumentou de 13,0 para 25,2 horas*IU/ml. O cálculoda meia-vida foi realizado com MicroMath Scientist, modelo 1, da bibliotecade farmacocinética (MicroMath, Saint Louis, MO, USA).EXEMPLO 5
ANÁLISE DETALHADA DA PEGUILACÂO DO rFVIII PELASTÉCNICAS DE SDS-PAGE E IMUNOMANCHAMENTO
rFVIII nativo e PEGuilado foram digeridos com trombina 1nM por 60 minutos em 60 °C, o que resultou na clivagem específica damolécula de FVIII com produtos de degradação bem definidos. Estesfragmentos de cadeia pesada e leve foram separados por SDS-PAGE, seguidopor eletromanchamento, como descrito no Exemplo 3. Para visualizar osfragmentos clivados, um anticorpo policlonal e anticorpos monoclonais contraos domínios Al e A2 de cadeia pesada, o domínio Beo domínio A3 N-terminal de cadeia leve foram aplicados.
Como observado na Figura 3, todos os domínios foramPEGuilados, não obstante em uma extensão diferente. O domínio B foiintensamente PEGuilado. Ambos os domínios, Al e A2, da cadeia pesada,foram parcialmente PEGuilados. Vários graus de PEGuilação (mono-, di-, tri-...) puderam ser observados no domínio A3 de cadeia leve. De acordo com oExemplo 6, o FVIII PEGuilado pareceu ser mais resistente à trombina.
EXEMPLO 6
RESISTÊNCIA À TROMBINA DO rFVIII PEGUILADO
O tratamento da trombina in vitro do FVIII resulta em umrápido aumento e subseqüente redução na sua atividade pró-coagulante. Arelação de ativação e de inativação, que depende da concentração da trombinae da integridade do FVIII, foi monitorado por um ensaio do cofator de FIXa,como segue:O FVIII foi incubado em 37 0C com trombina a 0,5 ou 1 nM.Sub-amostras foram retiradas em intervalos de tempo entre 0,5 a 40 minutos eadicionadas a uma mistura de FIXa, FX, vesículas de PL e CaCl2 tambémcontendo um inibidor de trombina específico para interromper as outrasreações mediadas pela trombina, e incubadas por 3 minutos. Uma sub-amostrafoi adicionada a um substrato cromogênico, o qual foi seletivamente clivadopor Fxa e continha EDTA para interromper outra ativação Xa; Após umaincubação de 15 minutos, a reação foi encerrada por ácido acético. Os valoresda absorbância (A405), que são proporcionais às concentrações de Fxa, forammedidos em uma leitora de ELISA e transformados nas concentrações de Fxacom o uso de uma curva de referência de Fxa purificado. As concentrações deFxa geradas foram traçadas em gráfico em relação ao tempo de incubaçãocom trombina.
A relação de inativação de pseudoprimeira ordem do FVIII foideterminada pelo ajuste da parte de declínio das curvas com um único ajusteexponencial.
TABELA 2
<table>table see original document page 15</column></row><table>
Como mostrado na Figura 4 e na Tabela 2, o rFVIIIPEGuilado apresentou uma menor relação de inativação em ambas asconcentrações de trombina aplicadas.
EXEMPLO 7
PEGUILACÂO DOS RESÍDUOS DE LISINA EM rFViii COM 2.3-BIS-(METIL-POLIOXOETILENO-ÓXI)-1 -(1,5-DIOXO-5-SUCCINIMIDILÓXI.PENTILÓXnPROPANO
Uma solução de rFVIII em tampão de Hepes 20 mM, pH 7,4,contendo NaCl 150 mM, 0,5 % de sacarose e 0,1 % de Polissorbato 80, foipreparada de material em massa derivado do processo de fabricação Advatecontendo 489 IU de FVIII/ml. Um reagente de glutarato de succinimidila dePEG (PEG-SG) ramificado [2,3-bis(metilpolioxietileno-óxi)-l-(l,5-dioxo-5-succinimidilóxi, pentilóxi)propano] obtido da NOF Corporation (Tóquio,Japão), com um peso molecular de 20 kD, foi adicionado a 153 ml destasolução sob agitação suave (5 mg de reagente/mg de proteína), e o valor dopH foi ajustado em 7,4 pela adição em gotas de NaOH 0,5 M após 10minutos. Depois, a PEGuilação do rFVIII foi realizada sob agitação suave por1 hora na temperatura ambiente.
Subseqüentemente, a mistura de reação foi aplicada sobre umaresina de cromatografia de troca de íons equilibrada (coluna de FractogelEMD TMAE 65OM / Pharmacia XK-50, altura do leito: 14,5 cm) em tampãoHepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, contendo 0,5 % de sacarose e 0,1 % dePolissorbato 80, com o uso de uma vazão linear de 1 cm/minuto. A coluna foilavada com tampão de equilíbrio de 25 CV para remover o reagente excedente(vazão linear: 2 cm/minuto) e o rFVIII peguilado foi eluído com tampão deeluição (Hepes 20 mM, NaCl 1,0 M, 0,5 % de sacarose, 0,1 % de Polissorbato80, pH 7,4) em uma vazão linear de 0,5 cm/minuto. Depois o eluído foiconcentrado por ultrafiltração/diafiltração com uma membrana consistindoem celulose regenerada e com um corte de peso molecular de 30 kD com ouso de um sistema de tampão consistindo em Hepes 20 mM, NaCl 150 mM,0,5 % de sacarose, pH 7,4.
EXEMPLO 8
CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DO rFVIII PEGUILADO COM 20 kD DEPEG-SG RAMIFICADO
O RFVIII derivado do processo de fabricação Advate foiPEGuilado através de resíduos de lisina com o uso de um reagente de PEG-SG ramificado de acordo com o Exemplo 7, e o produto de rFVIII PEGuiladofoi bioquimicamente caracterizado como descrito no Exemplo 2.TABELA 3
<formula>formula see original document page 17</formula>
Os dados da Tabela 3 mostram que, na preparação do rFVIII
PEGuilado, a atividade biológica (expressa pela relação da atividadecromogênica do FVIII para o antígeno de FVIII) recuperou-se completamenteem comparação com a atividade biológica do rFVIII nativo (100 %).
O rFVIII PEGuilado foi caracterizado por SDS-PAGE etécnicas de imunomanchamento sob condições de redução pelo uso de um gelde gradiente de 4 a 12 % de poliacrilamida como descrito no Exemplo 3. Osresultados acham-se resumidos na Figura 5. A mancha demonstra a estruturado domínio do rFVIII nativo e PEGuilado. E mostrado que o rFVIIIPEGuilado tem faixas mais amplas e massas moleculares elevadas do que aproteína recombinante nativa.
Para uma análise mais detalhada da PEGuilação da preparaçãode rFVIII por SDS-PAGE e técnicas de imunomanchamento, os rFVIII nativoe PEGuilado foram digeridos com trombina 1 nM por 60 minutos em 60 °C, oque resultou na clivagem específica da molécula de FVIII com produtos dedegradação bem definidos, como descrito no Exemplo 5. Os fragmentosforam separados por SDS-PAGE, seguido por eletromanchamento, evisualizados por diferentes anticorpos anti-FVIII. Como observado na Figura6, todos os domínios foram PEGuilados, embora em uma extensão diferente.O domínio B foi intensamente PEGuilado. Vários graus de PEGuilação(mono-, di-, tri-PEGuilação) puderam ser observados no domínio A3 decadeia leve. Os resultados indicam que o rFVIII PEGuilado pareceu ser maisresistente à trombina.
A relação de ativação e de inativação pela trombina foimonitorado por um ensaio do cofator FIXa como descrito no Exemplo 6. Arelação de inativação de pseudoprimeira ordem do FVIII foi determinado peloajuste da parte de declínio das curvas com um ajuste exponencial único.
TABELA 4
<formula>formula see original document page 18</formula>
Como mostrado na Figura 7 e na Tabela 4, o rFVIIIPEGuilado apresentou uma menor relação de inativação em ambas asconcentrações de trombina aplicadas.

Claims (10)

1. Construção proteinácea, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) uma molécula do Fator VIII tendo pelo menos uma porçãodo domínio B intacta; e(b) pelo menos uma molécula de polietileno glicol ligada àreferida molécula de Fator VIII, referida molécula de polietileno glicol tendoum peso molecular mais elevado do que 10.000 Daltons;referida construção tendo uma atividade biológica de pelomenos 80 % da atividade biológica do Fator VIII nativo, em que as atividadesbiológicas da construção e do Fator VIII nativo são determinadas pelasrelações da atividade cromogênica para o valor do antígeno do FVIII(FVIII :Chr/FVIII:Ag), e em que a meia-vida in vivo da referida construção éaumentada em pelo menos 1,5 vez, em comparação com a meia-vida in vivodo Fator VIII nativo.
2. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que tem uma atividade biológica de pelo menos 90% da atividade biológica do Fator VIII nativo.
3. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula do Fator VIII é um FatorVIII recombinante.
4. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula do Fator VIII é o Fator VIIIde comprimento completo.
5. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temum peso molecular de mais do que 10.000 Da até cerca de 125.000 Da.
6. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temum peso molecular de cerca de 15.000 a cerca de 20.000 Da.
7. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temum peso molecular de cerca de 18.000 a cerca de 25.000 Da.
8. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temum peso molecular de cerca de 20.000 Da.
9. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temum peso molecular de cerca de 20.000 a cerca de 150.000 Da.
10. Construção proteinácea de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a referida molécula de polietileno glicol temuma estrutura linear ou ramificada.
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