BRPI0620859A2 - vacina de combinação multivalente contra pcv2 - Google Patents

Abstract

VACINA DE COMBINAçãO MULTIVALENTE CONTRA PCV2. é proporcionado um método aprimorado para recuperar a proteína expressada pela estrutura de leitura aberta 2 de circovírus porcino tipo 2. Também é proporcionada proteína de ORF2 de PCV2 recombinante, e composições imunogênicas compreendendo proteína de ORF2 de PCV2. Além disso, são proporcionadas vacinas de combinação multivalentes as quais incluem um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por PCV2, preferencialmente proteína de ORF2 de PCV2, ou uma composição imunogênica compreendendo proteína de ORF2 de PCV2, e no mínimo um componente ativo imunogênico de outro organismo causador de doença em suíno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA DE COMBINAÇÃO MULTIVALENTE CONTRA PCV2".

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Este requerimento contém uma listagem de seqüência em for- mato de papel e em formato legível por computador, cujos ensinamentos e conteúdo são por este incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

Um aspecto da presente invenção refere-se à recuperação de uma proteína expressada por estrutura de leitura aberta 2 (ORF2) de circoví- rus porcino tipo 2 (PÇV2). Mais particularmente, a proteína é uma proteína recombinante expressada por um vírus transfectado contendo seqüências codificantes recombinantes para circovírus porcino tipo 2, estrutura de leitura aberta 2. Ainda mais particularmente, deixa-se o vírus transfectado infectar células em meio de crescimento e a proteína expressada por estrutura de leitura aberta 2 é recuperada no sobrenadante, ao invés de do interior das células. Ainda mais particularmente, o método envolve as etapas de amplifi- car o gene da estrutura de leitura aberta 2 de circovírus porcino tipo 2, clo- nar esta porção amplificada em um primeiro vetor, excisar a porção da es- trutura de leitura aberta 2 deste primeiro vetor e clonar esta em um vetor de transferência, cotransfectar o vetor de transferência com um vetor viral em células em meio de crescimento, fazer com que as células se tornem infec- tadas pelo vetor viral e deste modo expressar estrutura de leitura aberta 2, e recuperar a proteína recombinante expressada codificada por estrutura de leitura aberta 2 no sobrenadante.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma compo- sição imunogênica eficaz para induzir uma reação imune contra PCV2, e métodos para produzir estas composições imunogênicas. Mais particular- mente, a presente invenção refere-se a uma composição imunológica eficaz para proporcionar uma reação imune quer protege um animal recebendo a composição e reduz, ou minora a gravidade, dos sintomas clínicos as- sociados com infecção por PCV2. Ainda mais particularmente, a presente in- venção refere-se a uma composição imunológica à base de proteína que confe- re proteção eficaz contra infecção por PCV2. Ainda mais particularmente, a pre- sente invenção' refere-se a uma composição imunológica compreendendo ORF2 de PCV2, em que a administração de PCV2-ORF2 resulta em proteção contra infecção por PCV2. O mais particularmente, a presente invenção refere- se a uma composição imunológica eficaz para conferir imunidade eficaz a um suíno recebendo a composição imunológica, e em que a composição compre- ende a proteína expressada por ORF2 de PCV2.

Em outro aspecto da presente invenção, são proporcionadas vacinas de combinação ou vacinas multivalentes. Mais particularmente, a presente invenção proporciona composições imunogênicas eficazes na in- dução de uma reação imune contra infecção por PCV2 e no mínimo um ou- tro organismo causador de doença para suínos.

Descrição da Técnica Anterior

Circovírus porcino tipo 2 (PCV2) é um pequeno vírus de DNA não-envelopado (17 a22 nm de diâmetro), icosaédrico, o qual contém um genoma circular de filamento único. PCV2 partilha aproximadamente 80% de identidade de seqüência com circovírus porcino tipo 1 (PCV1). No entan- to, em contraste com PCV1, o qual é geralmente não-virulento, suínos infec- tados com PCV2 apresentam uma síndrome comumente referida como sín- drome debilitante multisistêmica pós-desmame (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS). PMWS é clinicamente caracterizada por debili- tação, palidez da pele, desgaste, insuficiência respiratória, diarréia, icterícia, e Icterícia. Em alguns suínos afetados, uma combinação de todos os sinto- mas será evidente ao passo que outros suínos terão somente um ou dois destes sintomas. Durante a necropsia, também aparecerão lesões micros- cópicas e macroscópicas sobre múltiplos tecidos e órgãos, com órgãos Iin- fóides sendo o sítio mais comum para lesões. Foi observada uma forte cor- relação entre a quantidade de antígeno ou ácido nucléico PCV2 e a gravi- dade de lesões linfóides microscópicas. Os índices de mortalidade para suí- nos infectados com PCV2 podem ser próximos de 80%. Além de PMWS, PCV2 tem sido associado com várias infecções diferentes incluindo pseudo- raiva, síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS), doença de Glas- ser, meningite estreptocóccica, salmonelose, colibacilose pós-desmame, hepatose dietética, e broncopneumonia supurativa.

Proteína de PCV2 de estrutura leitura aberta 2 (ORF2), tendo um peso molecular aproximado de 30 kDa quando deslisa SDS-PAGE em gel, tem sido utilizado no passado como um antigenic componente in vaci- nas for PCV2. Métodos típicos para obter ORF2 para uso em semelhantes vacinas geralmente consistem de amplificar o PCV2 DNA codificando para ORF2, transfectár um vetor viral com o DNA de ORF2, infectar células com o vetor viral contendo o DNA de ORF2, permitir que o vírus expresse proteí- na ORF2 dentro da célula, e extrair a proteína ORF2 da célula através de lise celular. Estes procedimentos geralmente duram até cerca de quatro dias depois de infecção das células pelo vetor viral. No entanto, estes procedi- mentos têm uma desvantagem em que os procedimentos de extração são tanto caros quanto consomem tempo. Adicionalmente, a quantidade de ORF2 recuperada das células não é muito elevada; conseqüentemente, precisa ser infectado um grande número de células por um grande número de vetores virais de modo a obter quantidades suficientes da proteína ex- pressada recombinante para uso em vacinas e semelhantes.

As abordagens correntes para imunização contra PCV2 incluem vacinas à base de DNA, tais como as descritas na Patente dos Estados U- nidos N°. 6.703.023. No entanto, as vacinas referidas têm sido ineficazes para conferir imunidade protetora contra infecção por PCV2 e os sinais clíni- cos associados com a mesma.

Síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS) é causada por um vírus o qual foi primeiro isolado e classificado como um arterivírus tão recentemente quanto 1991. A síndrome da doença foi primeiro reconhecida nos Estados Unidos em meados dos anos 80 e foi denominada "doença suína misteriosa". Também foi denominada doença da orelha azul. O nome arteriví- rus porcino foi proposto recentemente. O vírus da síndrome reprodutiva e res- piratória porcina tem uma afinidade particular para os macrófagos particular- mente os encontrados nos pulmões. Macrófagos são parte das defesas do corpo. Os presentes nos pulmões são denominados macrófagos alveolares. Eles ingerem e removem bactérias e vírus invasores, mas não no caso do vírus PRRS. Aó invés, o vírus se multiplica dentro dos mesmos produzindo mais vírus e mata os macrófagos. Uma vez que tenha ingressado em um re- banho tende a permanecer presente e ativo indefinidamente. Até 40% dos macrófagos são destruídos, o que remove uma parte importante do mecanis- mo de defesa dos corpos e possibilita que bactérias e outros vírus proliferem e causem dano. Um exemplo comum disto é o notável aumento na gravidade da pneumonia enzoótica em unidades de produtores/acabadores quando se tornam infectadas com vírus PRRS. Pode tomar até um ano para todo o esto- que de reprodução, particularmente em grandes rebanhos, se tornar infectado pela primeira vez e embora o vírus parece se disseminar rapidamente em um rebanho, talvez alguns 4 a 5 meses antes de no mínimo 90% das porcas se tornarem soro-positivas. Algumas porcas permanecem naive. Além disso, não é incomum para rebanhos de porcas 1 a 2 anos depois da infecção conterem menos de 20% de animais soro-positivos. No entanto, isto não significa ne- cessariamente que eles ainda não estão imunees nem significa que pararam de transferir imunidade para sua prole. Animais adultos espalham vírus por períodos de tempo muito mais curtos (14 dias) comparados com porcos em crescimento os quais podem excretar vírus por 1 a 2 meses. O quadro clínico pode variar tremendamente de um rebanho para outro. Via de regra, para ca- da três rebanhos que são expostos a PRRS pela primeira vez, um não apre- sentará doença reconhecível, o segundo apresentará doença branda, e o ter- ceiro apresentará doença moderada a grave. As razões para isto não são en- tendidas claramente. No entanto, quanto melhor o estado de saúde do reba- nho, menos graves os efeitos da doença. Pode ser que o vírus esteja mudan- do, enquanto se multiplica, abandonando algumas cepas que são altamente virulentas e algumas que não são. PRRS infecta todos os tipos de rebanhos, incluindo com estado de saúde ótimo ou regular e tanto unidades internas quanto externas, independente do tamanho.

Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) é uma pequena bactéria (400 a 1200 nm) classificada na família mycoplasmataceae. M hyo está associada com Pneumonia Enzoótica, uma doença respiratória suína vista comumente em porcos em crescimento e acabamento. M hyo ataca os cílios de células epiteli- ais da traquéia e dos pulmões, fazendo com que os cílios parem de bater (cilios- tase) e eventualmente provocando o colapso de áreas dos pulmões. Depen- dendo da extensão da doença, o ganho de peso readiário do suíno infectado pode ser reduzido por até 17%. A Pneumonia Enzoótica é disseminada em po- pulações suínas e está presente em quase todo rebanho suíno. M hyo é consi- derado um patógeno primário que facilita o ingresso de PRRSV e outros pató- genos respiratórios nos pulmões. Três cepas isoladas, 232, J e 7448, tiveram seus genomas seqüenciados (Minion et al., J. Bacteriol. 186: 7123-33, 2004; Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187: 5568-77, 2005).

Enterite proliferativa porcina é uma doença diarréica comum de porcos em crescimento-acabamento e reprodução jovens caracterizada por hiperplasia e inflamação do íleo e cólon. Freqüentemente é branda e autoli- mitante, mas algumas vezes causa diarréia persistente, grave enterite ne- crótica, ou enterite hemorrágica com alta mortalidade. A etiólogia é a bacté- ria intracelular classificada recentemente Lawsonia intracellularis. O orga- nismo foi cultivado somente em culturas celulares, e falharam as tentativas de propagação em meio livre de células. Os postulados de Koch foram satis- feitos por inoculação de culturas puras de L intracellularis em porcos criados convencionalmente; foram produzidas lesões típicas da doença, e L intracel- lularis foi reisolado das lesões. A forma não hemorrágica mais comum da doença freqüentemente afeta porcos de 18 a 36 kg e é caracterizada por início súbito da diarréia. As fezes são aquosas a pastosas, amarronzadas, ou tenuamente tingidas de sangue. Depois de ~2 dias, os porcos podem passar cálculos fibrinonecróticos amarelos que se formaram no íleo. A maio- ria dos porcos afetados se recupera espontaneamente, mas um número significativo desenvolve enterite necrótica crônica com emaciação progressi- va. A forma hemorrágica é caracterizada por palidez cutânea, fraqueza, e passagem de fezes hemorrágicas ou pretas, alcatroadas. Porcas grávidas podem abortar. Podem ocorrer lesões em qualquer lugar na metade inferior do intestino delgado, ceco, ou cólon mas são mais freqüentes e óbvias no íleo. A parede do intestino é espessada, e o mesentério pode ser edemato- so. Os Iinfonodos mesentéricos são dilatados. A mucosa intestinal aparece espessada e rúgosa, mas pode ser coberta com uma membrana fibrinone- crótica amarronzada ou amarela, e algumas vezes tem hemorragias pete- quiais. Cálculos necróticos amarelos podem ser encontrados no íleo ou pas- sando através do cólon, Necrose mucosa difusa e completa em casos crôni- cos faz com que o intestino seja rígido, se assemelhando a uma mangueira de jardim. As lesões mucosas proliferativas são freqüentemente no cólon, mas são detectadas somente por cuidadosa inspeção na necropsia. Na for- ma profusamente hemorrágica, são fezes alcatroadas vermelhas ou pretas, no cólon e sangue coagulado no íleo.

Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVD) e Doença de Border são dois vírus, os quais são do mesmo grupo de pestivírus que o vírus da febre suína (peste suína), mas os quais infectam essencialmente gado vacum e carneiros respectivamente. Podem penetrar em rebanhos de reprodução de porcos e provocar problemas reprodutivos. A doença não é uma causa co- mum de infertilidade na porca e seria considerada baixa na lista de possibili- dades de um ponto de vista de diagnóstico.

Leptospirose é uma doença contagiosa de animais, incluindo homem, causada por vários serovars Ieptospirais imunologicamente distin- tos, a maior parte dos quais são considerados subgrupos do Leptospira in- terrogans. Há cinco serovars e grupos os quais são importantes em suíno: pomona, australis, tarassovi, canicola, icterohaemorrhagicae, e grippotypho- sa. As infecções podem ser assintomáticas ou causar vários sinais, incluin- do anorexia, pirexia, apatia, icterícia, abortamentos, partos de natimortos e outros problemas reprodutivos indefinidos, e morte. Depois da infecção agu- da, os leptospiras freqüentemente se localizam nos rins ou nos órgãos re- produtivos consistindo em focos cinzentos pequenos disseminados de uma nefrite intersticial focai, e são disseminados na urina, algumas vezes em grandes números por meses ou anos. Como os organismos sobrevivem em águas de superfície por períodos prolongados, a doença pe freqüentemente transportada pela água. Nos Estados Unidos, a doença é essencialmente devido aos serovars Leptospira hardjo, Leptospira pomona, e Leptospira grippotyphosa. O diagnóstico pode ser difícil por que os títulos de anticorpos podem ser transitórios, durando menos de um mês. Além disso, também podem ser encontrados Leptospiras em animais saudáveis. L. australis se- rovar bratislava é mais comumente associado com problemas reprodutivos. Rebanhos cronicamente infectados apresentam abortamentos, partos de natimortos e leitões fracos.

Brucelose é causada por bactérias do gênero Brucella e é carac- terizada por abortamento, retenção placentária, infertilidade, orquite em por- co não-castrado, e grave metrite em porcas. Em leitões, a doença é caracte- rizada por paralisia posterior e coxeadura. A doença em porcos é causada quase exclusivamente por Brucella suis biovars 1, 2, e 3. Uma série de ou- tros mamíferos pode carregar e transmitir Brucella suis aos porcos. A infec- ção se espalha rapidamente e causa muitos abortamentos em rebanhos não vacinados. A transmissão ocorre essencialmente por contato com outro por- co, embora seja possível transmissão venérea. O diagnóstico sorológico po- de ser difícil devido a um organismo relativamente comum, Yersinia entero· colitica 0:9 o qual partilha um antígeno comum com Bruceila e freqüente- mente causa resultados falso positivos. Lesões pós-morte geralmente inclu- em metrite e orquite, e podem incluir abscesso, algumas vezes com focos de necrose no fígado.

Clostridium é uma bactéria Gram-positiva ubíquo, da família clos- tridiaceae, geralmente encontrada no solo, mas também ocorre naturalmente no intestino da maioria dos animais. Infecções por C. difficile em suíno são caracterizadas por grave edema mesocolônico, diarréia e edema em outros tecidos tais como o hidrotórax. Enterite por Clostridium em suíno é causada por C. perfringens, e é caracterizada por enterite crônica, a qual é acompa- nhada por diarréia, perda de peso e febre. Infecção com C perfringens tipos A, B e C causa grave enterite, desinteria, toxemia, e alta mortalidade em be- zerros jovens. Ambos os tipos BeC produzem a toxina β altamente necroti- zante e letal que é responsável pelo grave dano intestinal. Esta toxina é sen- sível a enzimas proteolíticas, e a doença é associada com inibição de proteó- lise no intestino. O colostro da porca, o qual contém um inibidor de tripsina, foi sugerido como um fator na suscetibilidade de leitões jovens. A doença pode causar morte súbita em leitões de menos de uma semana de idade, e é mais comum dentro de 3 dias do nascimento. Em leitões mais velhos, enterite por Clostridium causa um espessamento do intestino delgado tornando difícil a absorção de alimentos e nutrientes. Os leitões geralmente morrem em conse- qüência de uma combinação da infecção e falta de nutrientes. Pode ocorrer morte em umas poucas horas, porém casos menos graves sobrevivem por uns poucos dias, e é possível recuperação durante um período de poucos dias. Enterite hemorrágica com ulceração da mucosa é a principal lesão em todas as espécies. A grosso modo, a porção afetada do intestino é púrpura azulada profunda e parece à primeira vista ser um enfarte associado com tor- são mesentérica. Esfregaços dos conteúdos intestinais podem ser examina- dos para grandes números de bactérias Gram-positivas, em forma de bastão, e preparados filtrados para detecção de toxina e subseqüente identificação por neutralização com anti-soro específico.

Clostridium novyi tem sido suspeitado, mas ainda não confirma- do como uma causa de morte súbita em gado vacum e porcos alimentados com dietas de alto nível de grãos, e nos quais não foram detectáveis lesões preexistentes do fígado. As toxinas letais e necrotizantes (essencialmente α toxina) danificam o parênquima hepático, deste modo permitindo que as bactérias multipliquem e produzam uma quantidade letal de toxina. Geral- mente, a morte é súbita sem sinais bem definidos. Os animais afetados ten- dem a andar devagar atrás do rebanho, assumem posição deitada esternal, e morrem dentro de umas poucas horas. A maioria dos casos ocorre no ve- rão e no início do outono quando a infecção por fascíola hepática está em seu máximo. A doença é mais prevalente em carneiros de 1 a 4 anos de idade e é limitada a animais infectados com fascíolas hepáticas. A diferenci- ação de fasciolíase aguda pode ser difícil, mas mortes peragudas de ani- mais que apresentam lesões típicas na necropsia deve provocar suspeita de hepatite necrótica infecciosa. As lesões mais características são os focos necróticos amarelo acinzentados no fígado que freqüentemente seguem os cursos migratórios das fascíolas jovens. Outros achados comuns são um saco pericardial dilatado preenchido com fluido cor de palha, e excesso de fluido dentro das cavidades peritoneal e torácica. Geralmente, há extensiva ruptura dos capilares no tecido subcutâneo, o que faz com que a pele adja- cente fique preta (portanto o nome comum, doença preta).

Clostridium septicum é encontrado no solo e no conteúdo intes- tinal de animais (inclusive homem) em todo o mundo. A infecção geralmente ocorre através de contaminação de ferimentos contendo tecido desvitaliza- do, solo, ou algum outro debilitante de tecido. Ferimentos causados por aci- dente, castração, amputação de cauda, vacinação insalubre, e parto podem se tornar infectado. Desenvolvem-se sinais gerais, tais como anorexia, into- xicação, e febre alta, bem como lesões locais, dentro de umas poucas horas até uns poucos dias depois da lesão predisponente. As lesões locais são tumefações moles que descem sob pressão e se estendem rapidamente devido à formação de grandes quantidades de exsudato que infiltra o tecido conjuntivo subcutâneo e intramuscular das áreas afetadas. São incomuns acúmulos de gás. Edema maligno associado com lacerações é caracteriza- do por acentuado edema, grave toxemia, e morte em 24 a 48 horas.

Toxemia tetânica é causada por uma neurotoxina específica produzida por Clostridium tetani em tecido necrótico. Quase todos os mamí- feros, incluindo suíno, são suscetíveis a esta doença. Embora o tétano seja de distribuição mundial, há algumas áreas, tais como a seção setentrional das Montanhas Rochosas dos Estados Unidos, onde o organismo é rara- mente encontrado no solo e onde o tétano é quase desconhecido. Em geral, a ocorrência de C tetani no solo e a incidência de tétano no homem é maior nas partes mais quantes dos vários continentes. Clostridium tetani, um ana- eróbio com esporos esféricos terminais, é encontrado no solo e nos tratos intestinais. Na maioria dos casos, é introduzido nos tecidos através de feri- mentos, particularmente ferimentos de perfuração profunda, que proporcio- nam um ambiente anaeróbico adequado.

Infecção com Salmonella spp pode produzir diarréia em animais de todas as idades, especialmente aqueles que estão estressados, armaze- nados estreitamente, ou expostos a um suprimento de água ou alimento for- temente contaminado. A Salmonelose é causada por muitas espécies de sal- monelas e se caracteriza clinicamente por uma ou mais de três síndromes principais — septicemia, enterite aguda, e enterite crônica. A incidência tem aumentado com a intensificação da produção de criação. Embora vários tipos de Salmonella possam causar infecções em porcos as salmonelas clássicas encontradas em suíno são S. choleraesuis e S. typhimurium. Seus padrões clínicos resultantes da maioria das salmonelas não são espécies de salmone- Ias distintas e diferentes tendem a diferir em sua epidemiologia. O perfil de plasmídeo e padrões de resistência a fármacos são algumas vezes marcado- res úteis para estudos epidemiológicos. A salmonelose septicêmica freqüen- temente está associada com S choleraesuis. Leitões infectados demonstram uma relutância para mover, anorexia, uma febre alta de 40,5C a 41,6C, e po- dem ter uma tosse superficial. Os leitões também podem ser encontardos mortos com extremidades cianóticas. S choleraesuis é uma das raras doen- ças que podem causar tanto pneumonia quanto diarréia e a mortalidade de leitões infectado é freqüentemente elevada. Enterocolite é geralmente associ- ada com a S typhimurium mais comum. Infecções são caracterizadas por diar- réia amarela ou aquosa que pode conter sangue ou muco à medida que a infecção progride. A mortalidade é baixa e freqüentemente associada com desidratação e deficiência de potássio devidas à diarréia. As fezes de animais infectados podem contaminar o alimento e a água, carnes frescas e proces- sadas de abatedouros, produtos vegetais e animais usados como fertilizantes ou gêneros alimentícios, a pastagem e a extensão de terra, e muitos materiais inertes. Embora raramente seja encontrada S choleraesuis em alimento. Também pode ser passada diretamente através de contato com um animal infectado. A Salmonella pode sobreviver por meses em áreas úmidas e quen- tes tais como em alimentador de currais de porcos ou em águas subterrâ- neas. Roedores e aves selvagens também são fontes de infecção. A preva- lência de infecção varia entre as espécies e países e é muito maior do que a incidência de doença clínica, a qual é comumente precipitada por situações estressantes tais como súbita privação de alimento, transporte, estiagem, a- glomeração, parto, e a administração de alguns fármacos.

Escherichia coli é uma bactéria da família enterbacteriaceae e é um dos principais tipos de bactérias que ocorrem naturalmente nos intesti- nos delgados de todos os mamíferos. Embora geralmente inofensivas, al- gumas cepas de E coli podem produzir uma série de exo- e endotoxinas que causam infecção e doença. Exotoxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST) são ativamente produzidas por algumas cepas e são responsáveis por causar diarréia. A doença de edema por verotoxina e toxina semelhante a Shigela tipo II variante (SLT-IIe), Stx2e agem sobre a parede das pequenas artérias resultando em edema. Endotoxinas, tais como Lipídeo A, desempe- nham um papel em mastite e em infecções do trato urinário. A infecção por E. coli se caracteriza por uma série de diferentes sintomas dependendo da cepa em particular envolvida, incluindo diarréia, olhos encovados, desgaste, perda de peso visível, crescimento interrompido, depressão, edema intesti- nal, mastite, cistite, pielonefrite e morte. E. coli pode ser classificada e codi- ficada por sua parede celular (antígenos O) e fímbrias (antígenos F). Por exemplo, diarréia é freqüentemente associada com E. coli Abbotstown: 0147, F4, F5, ao passo que edema intestinal é associado com fímbrias F18. Identificar corretamente o código é essencial para a seleção da vacina cor- reta. Infecções por E. coli comprometem o sistema imune de um porco e freqüentemente o resultado de infecções secundárias e doença é a morte.

Pox Suína é uma doença a qual provoca lesões da pele, paules, pústulas e sarnas.

Eperitrozoonose é uma doença Rickettsial (hemotrófica) causada por Eperythrozoon suis, um organismo bacteriano extracelular que adere às membranas dos eritrócitos dos porcos, induzindo sua deformação e lesão. A doença é caracterizada por anemia e icterícia (descoloração amarela de mem- branas mucosas, esclerótica e ouvidos internos). Pode levar a baixas taxas de concepção, outros problemas indefinidos de reprodução, e mesmo morte.

Peste suína também conhecida como Febre Suína Clássica (CSF) ou Febre Suína Africana (ASF) é uma doença causada por um vírus Flaviviridae, o qual é um vírus de RNA envelopado, ou no caso da Febre Suína Africana, um vírus de DNA envelopado que é relacionado com os Pox vírus. Clinicamente, a Febre Suína Clássica e a Febre Suína Africana são indistinguíveis. Os primeiros sintomas são uma redução na atividade e sono- lência com alguma anorexia e o suíno pode parecer resfriado. Dentro de dias, os porcos apresentam uma febre acentuada (41 a 42 graus Celsius), a qual algumas vezes é acompanhada por um avermelhamento da pele. Em seguida, os porcos desenvolvem uma conjuntivite e constipação levando a diarréia amarelada. Em rebanhos, os porcos parecerão resfriados e freqüen- temente se ajuntarão confusamente. Uns poucos porcos podem ter convul- sões antes de morrer. Os porcos começam a morrer com uma descoloração púrpura da pele se espalhando e freqüentemente a morte ocorre dentro de 10 a 20 dias pós-infecção. Os porcos sobreviventes algumas vezes serão afetados por um grave retardo de seu crescimento e dorsos arqueados. Em rebanhos estabelecidos, leitões infectados por suas mães durante a gravi- dez podem resultar em abortamento, mumificação, malformações, partos de natimortos e leitões nascidos fracos. Leitões nascidos de mães infectadas com Febre Suína Clássica podem permanecer saudáveis mas continuamen- te espalham a doença por toda a sua vida.

Pasteurelose pneumônica e Estreptococos são causados por Pasteurella multocida e várias espécies de estreptococos, tipicamente S. suis. Infecção pelo agente causai geralmente representa o estágio final da síndrome respiratória. pós-desmame. Os sinais clínicos aparecem em três formas, a forma aguda é mais comumente associada com P. multocida so- rotipo B. Os animais se apresentam com dispnéia, respiração penosa, palpi- tação, febre alta (42,2°C), prostração, e finalmente morte. Em alguns casos o abdômen se torna púrpura com descoloração. Uma segunda forma é uma forma subaguda caracterizada por pleurite, tosse, e dificuldade para respi- rar. Os porcos podem perder quantidades significativas de peso e podem ter pouco ou nenhum crescimento com sérias conseqüências sobre a circula- ção do porco. A forma crônica se apresenta com a tosse ocasional, palpita- ção, e pouca ou nenhuma febre. Esta forma geralmente afeta porcos de 10 a 16 semanas de idade.

Meningite Estreptocóccica causa inflamação das meninges as quais são as membranas que recobrindo o cérebro. No leitão não desma- mado geralmente é causada por Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, ou algumas vezes bactérias tais como E. coii e outros estreptococos. S. suis tem muitos sorotipos. Na maioria dos países S. suis tipo 1 é o principal soro- tipo em leitões não desmamado, mas isto pode não ser verdade em outros países. Por exemplo, na Dinamarca é tipo 7. S. suis também provoca pro- blemas articulares, particularmente tipos 1 e 14. S. suisé carregado por Ion- gos períodos nas amídalas e pode ser transmitido para o leitão não desma- mado pela porca ou a partir de outros leitões. A porca também proporciona um nível de imunidade variável no colostro. A meningite estreptocóccica em leitões não desmamado é esporádica em leitões individuais. A meningite estreptocóccica pode ser pior em porcos não desmamados quando o orga- nismo foi introduzido no rebanho pela primeira vez, ou onde é secundária a infecção com PRRS.

Pseudorabies, também conhecido como vírus da raiva porcina, Suid herpes vírus no qual o agente causai é um vírus de DNA da herpes enve- lopado. Em rebanhos naíve, porcos neonatais se apresentam com uma série de sinais nervosos centrais graves desde espasmos a grave em coordenação. Pode resultar paralisia posterior em leitões sentando em uma maneira que se assemelha aos cachorros. Adicionalmente, a mortalidade é elevada. Em por- cos desmamados, os sinais nervosos centrais podem ser reduzidos, mas po- dem ser acompanhados por um aumento nos sinais respiratórios. Freqüente- mente, as doenças respiratórias são associadas com infecções secundárias. Porcos desmamados podem definhar e sofrer doença de desenvolvimento e freqüentemente têm o desenvolvimento interrompido. Em porcos em cresci- mento, os sinais nervosos centrais continuam a reduzir, enquanto os sinais respiratórios aumentam. O grau da doença respiratória depende da presença e da gravidade de infecções secundárias. Em adultos, predominam os sinais reprodutivos. As porcas podem abortar e animais infectados próximos do ter- mo têm a probabilidade de parir natimortos ou leitões fracos. Em rebanhos estabelecidos, podem haver poucos sinais clínicos.

O Vírus da Influenza Suína causa gripe suína e pertence ao grupo do vírus da influenza Tipo A. Em rebanhos naíve, os sinais clínicos podem se apresentar em surtos explosivos com todos ou muitos animais adoecendo ao mesmo tempo. Os animais podem se apresentar com inatividade, depressão, amontoados/empilhados e com anorexia. Os animais freqüentemente estão respirando pela boca e a respiração é laboriosa. Pode resultar tosse com o movimento. Outros sinais clínicos incluem uma secreção nasal e olhos incha- dos com temperaturas retais entre 40,5 a 41,59C. As temperaturas elevadas em um estoque de reprodução podem resultar em abortamentos, infertilidade, produção de ninhadas fracas e pequenas, e aumento de partos de natimortos. Em rebanhos estabelecidos, aparece reinfecção anual.

Colite por espiroqueta é causada pelas bactérias Brachyspira pilosicoli. Esta infecção geralmente afeta produtores/acabadores de 10 a 20 semanas de idade. Caracteriza-se por uma diarréia debilitante não fatal de porcos em crescimento que resulta em um número aumentado de dias ne- cessários para acabar. A diarréia também resulta em redução na eficiência alimentar e produz diarréia aquosa a fezes moles. Cerca da metade dos porcos podem apresentar diarréia transitória a persistente a aquosa a verde mucóide a amarronzada sem sangue. Os sinais clínicos são mais comuns 10 a 14 dias depois de misturação e troca da ração.

A desinteria suína é causada pelas bactérias Brachyspira hyodysentheriae. Há doze sorotipos conhecidos atualmente. Os sinais clíni- cos em rebanho estabelecido incluem diarréia, uma rápida perda da condi- ção em alguns porcos, um aspecto peludo, desidratação, abdômen doloro- so, e a morte de um ou dois porcos antes de outros porcos apresentarem quaisquer sinais. Em um surto chave em rebanhos naíve, todos os grupos etários desde leitões em aleitamento a porcas adultas podem ser afetados.

Gastroenterite transmissível é uma doença dos intestinos cau- sada por um coronavírus. É da mesma família que o coronavírus respiratório porcino, o vírus da diarréia epidêmica, e o vírus da encefalomielite hemaglu- tinante. Sinais clínicos iniciais são diarréia aquosa, vômito, e anorexia. Lei- tões de menos de 21 dias de idade geralmente morrem, leitões desmama- dos se tornam inúteis, ao passo que produtores, acabadores, e adultos ge- ralmente são afetados moderadamente e sobreviverão caso lhes seja pro- porcionada água adequada.

Parvovirus é uma doença caracterizada por problemas reprodu- tivos em porcos. O agente causai é um pequeno vírus de DNA não-envelo- pado. Os fetos são o único grupo afetado e o efeito sobre o feto depende da idade na qual se torna infectado. Aos 10 a 30 dias de idade, a infecção re- sulta e morte e reabsorção do feto. Entre 30 a 70 dias de idade, a infecção resulta em morte e mumificação. E a partir de 70 dias até o termo, as infec- ções resultam no nascimento de leitões fracos e mumificação. A doença tem a capacidade de cruzar a placenta e em seguida mover para cada feto ao longo do útero. Na porca, os sinais clínicos são partos de natimortos, leitões mumificados, mortes embrionárias, infertilidade, e a produção de um núme- ro significativamente reduzido de filhotes nascidos vivos. O abortamento não é um aspecto característico da infecção por parvòvírus.

Actinobacillus pleuropneumonia, também conhecida como APP e pleuropneumonia por Haemophilus, é causada pelas bactérias Actinobacillus pleuopneumonia. Há 15 sorovírus correntemente descritos e a gravidade dos sinais clínicos difere entre os diferentes sorovírus e a presença de outros fato- res. Os sorovírus 1, 5, 9, 10, e 11 são considerados os mais virulentos. Adi- cionalmente, os sorovírus 1, 9, e 11; 2, 6, e 8; e 4 e 7 podem ter reação cru- zada. Porcos de todas as idades são suscetíveis. Os sinais clínicos são uma doença súbita que resulta nos animais deitando muito e apresentando uma temperatura retal elevada de 41,5Q Celsius. Geralmente, os animais são ano- réxicos e não bebem, suas extremidades se tornam cianóticas e frias ao to- que. A cianose pode se espalhar para todo o corpo e graves dificuldades de respiração, freqüentemente com respiração pela boca, se desenvolvem antes da morte. Espuma cor de sangue pode ser vista na boca e narinas e geral- mente ocorre a morte dentro de 24 a 48 horas. Sinais clínicos agudos incluem uma alta percentagem de animais em um grupo sendo deprimido e deitando, temperaturas retais elevadas de 40,5 a 41- Celsius, anorexia, sem beber, com angústia respiratória severa, tosse, respiração pela boca, cianose, vômito, e abortamento. Sinais clínicos subagudos incluem tosse intermitente em um grupo de porcos, uma falta geral de apetite, e uma redução no crescimento. Cyrovar tipo 3 se apresenta com artrite, endocardite, e abscessos. Em reba- nhos cronicamente afetados, o ganho de peso diário pode não ser afetado, mas pode ser ouvida uma tosse intermitente.

Doença de Glássers é causada pela bactéria Haemophilus pa- rasuis (Hps), das quais há no mínimo quinze tipos diferentes. É encontrada em todo o mundo e os organismos estão presentes mesmo em rebanhos com boa saúde. Se semelhantes rebanhos são estabelecidos usando técni- cas de SPF ou MEW e são livres de Hps, podem ser devastadores quando se tornam contaminados pela primeira vez, produzindo uma doença seme- lhante a antrax com alta mortalidade em porcas. Na maioria dos rebanhos nos quais a bactéria é endêmica, as porcas produzem uma forte imunidade materna a qual normalmente persiste em sua prole até 8 a 12 semanas de idade. Em conseqüência, os efeitos da infecção em leitões desmamados são geralmente nulos ou mínimos. No entanto a doença pode ser vista em porcos em aleitamento. Geralmente, os porcos se tornam infectados subcli- nicamente quando ainda protegidos por anticorpo materno e em seguida estimulam sua própria reação imune. Se1 no entanto, a imunidade materna desaparece antes deles se tornarem infectados, eles podem desenvolver doença grave. Isto geralmente é um pouco depois do desmame. Também pode agir como um patógeno secundário a outras doenças importantes par- ticularmente pneumonia enzoótica (EP) (Mycoplasma hyopneumoniaé). Sur- tos de doença são às vezes experimentados em porcos não desmamados, particularmente em rebanhos de porcas. Hps ataca as superfícies lisas das articulações, revestimentos dos intestinos, pulmões, coração e cérebro cau- sando pneumonia, infecção da bolsa cardíaca, peritonite e pleurisia. É dis- seminada por via respiratória. Doença provocada por Hps é rara em porcas a menos que a porca a seco seja naíve. Coxeadura ou enrijecimento, ligei- ras tumefações sobre as articulações e tendões, e raramente meningite, são vistos ocasionalmente em porcas. Em leitões, a doença aguda se apresenta com porcos rapidamente deprimidos com temperatura elevada, inapetência, e uma relutância para levantar. Um aspecto característico é uma tosse curta de 2 a 3 episódios. Não é incomum morte súbita em leitões que mamam bem. Também se sabe que Hps causa casos individuais de artrite e coxea- dura com febre e inapetência. A doença crônica se caracteriza por porcos pálidos e com crescimento sinsuficiente. Também pode ocorrer morte súbi- ta. Para leitões desmamados e produtores, porcos com doença de Glássers se tornam rapidamente deprimidos ou podem ser encontrados mortos. Ou- tros sintomas incluem temperatura elevada, anorexia, uma relutância para levantar, sinais nervosos tais como espasmos e convulsões incluindo me- ningite, e freqüentemente resultam porcos abatidos, que se encontram en- fraquecidos e peludos. Em porcos jovens em crescimento, os seguintes sin- tomas são os mais comuns: febre, meningite moderada, artrite, coxeadura, pneumonia, infecção da bolsa cardíaca, peritonite e pleurisia. Novamente, um aspecto característico é uma tosse curta de somente 2 a 3 episódios.

Epidermite exudativa é causada pela bactéria Staphylococcus hyicus a qual vive normalmente sobre a pele sem causar doença. Não se sabe porque algumas vezes subitamente inflama-se e causa uma dermatite a qual exsuda fluido graxo. Produz toxinas as quais são absorvidas no sis- tema e danificam o fígado e os rins. No leitão não desmamado a doença geralmente é confinada a animais individuais, mas pode ser um problema importante em novos rebanhos de porcas e porcos desmamados. Durante os dias imediatamente precedentes à parição, a bactéria se multiplica profu- samente dentro da vagina da porca de modo que os leitões são infectados durante o processo do parto ou logo depois disso. Sintomas em porcas in- cluem lesões incomuns, porém localizadas podem ser vistas particularmente atrás da face e dos olhos. Leitões gravemente afetados morrerão. Em lei- tões, os sintomas incluem lesões localizadas sobre os flancos e atrás das orelhas. As lesões geralmente começam com pequenas áreas de infecção escuras e localizadas em torno da face ou sobre as pernas. E pele ao longo dos flancos, o abdômen e entre as pernas muda para uma cor marrom, en- volvendo gradualmente todo o corpo. A pele se torna enrugada com desça- mação de grandes áreas e tem uma sensação graxa. Em casos graves, a pele se torna preta devido à necrose e os leitões morrem. Um quadro mais localizado é visto se a porca tiver passado alguma imunidade para o leitão, com pquenas Tesões circunscritas de aproximadamente 5 a 10 mm de diâ- metro que não se espalham. Para leitões desmamados e produtores, os sin- tomas geralmente começam cerca de 3 dias depois do desmame com áreas marrons localizadas de infecção ou dermatite em torno da face ou sobre as pernas, onde a pele tenha sido danificada. Pode ulcerar. A pele ao longo dos flancos, o abdômen e entre as pernas muda para uma cor marrom en- volvendo gradualmente todo o corpo. A pele se torna enrugada com desca- mação de grandes áreas e progride para uma textura graxa escura e em casos graves se torna preta. Estes casos geralmente morrem devido às to- xinas produzidas pelos organismos estafilococos. Em criadouros até 15% da população pode estar envolvida e a desidratação é comum.

A erisipela suína é provocada por uma bactéria, Erysipelothrix rhusiopathiae que é encontrada na maioria das fazendas de porcos, se não em todas. Até 50% dos animais podem ser portadores da erisipela suína em suas amídalas. Está sempre presente ou no porco ou noambiente porque é excretada através da saliva, das fezes ou da urina. Também é encontrada em muitas outras espécies, incluindo aves e carneiros, e pode sobreviver fora do porco por umas poucas semanas e por mais tempo em solos ilumi- nados. Portanto é impossível eliminá-la de um rebanho. Fezes infectadas são provavelmente a.principal fonte de infecção, particularmente em pocil- gas de crescimento e acabamento. A bactéria sozinha pode causar a doen- ça, mas infecções virais simultâneas, tais como PRRS ou influenza, podem disparar surtos. A doença é relativamente incomum em porcos abaixo de 8 a 12 semanas de idade devido à proteção proporcionada por anticorpos ma- ternos a partir da porca através do colostro. Os animais mais suscetíveis são porcos em crescimento, porcas não vacinadas, e porcas até a 4a. paridade. O organismo se multiplica no corpo, e invade a corrente sangüínea para produzir uma septicemia. A rapidez da multiplicação e o nível de imunidade no porco então determina os sintomas clínicos. Eperitrozoonose (Epe) é uma doença causada por uma bactéria denominada Eperythrozoonosis suis a qual ataca a superfície das hemácias e algumas vezes as destrói. O porco pode então ficar anêmico e os produtos deixados depois da destruição das células podem causar icterícia. A doença clínica é vista mais comumente em porcos jovens em crescimento. No en- tanto, também pode causar problemas reprodutivos no rebanho de reprodu- ção. Uma porca pode carregar Epe e ainda permanecer bastante saudável, no entanto, esta pode cruzar a placenta resultando em porcos pálidos e fra- cos ao nascer. Epe está presente na maioria se não em todos os rebanhos, mas são desconhecidos os mecanismos que permitem que se torne patogê- nica e produza doença em algumas populações e não em outras. À incidên- cia da doença é baixa.

Encefalomiocardite, ou EMC, infecta e causa doença em uma am- pla gama de animais vertebrados mais os porcos parecem ser as mais suscetí- veis das espécies de animais de criação. O vírus é mundial, mas difere em pa- togenicidade e virulência em diferentes países e regiões. Na maioria dos países da Europa, particularmente os na União Européia, tende a ser relativamente brando ou não patogênico e a doença em porcos raramente é diagnosticada. Na Austrália as cepas parecem ser muito mais virulentas para os porcos do que as na Nova Zelândia. Cepas virulentas na Flórida, no Caribe e provavelmente na América Central danificam o coração e causam a morte ao passo que as cepas no Meio Oeste dos Estados Unidos tendem a causar problemas reprodu- tivos. A doença clínica em porcos tende a ocorrer quando os números de ratos aumentam para níveis de praga. Os porcos podem ser infectados por ratos ou por ração ou água contaminada por rato. Não parece se disseminar muito pron- tamente entre porcos. Em rebanhos afectados geralmente não há sinais clíni- cos em porcos desmamados e em crescimento.

Doença de Aujeszky, ou AD, é uma importante doença de porcos causada por um herpes vírus. O vírus pode permanecer oculto nos nervos do porco em um estado de portador por longos períodos de tempo e em seguida ser reativado. Uma vez introduzido em um rebanho, o vírus geralmente aí per- manece e pode afetar continuamente a performance reprodutiva em níveis vari- áveis. O vírus pode sobreviver por até três semanas fora do porco. Surtos agu- dos de doença ocorrem quando cepas virulentas do vírus infectam primeiro um rebanho suscetível não vacinado. O vírus cruza o útero e a placenta e infecta os fetos. O porco é o principal hospedeiro. No entanto, cães e gado vacuum tam- bém podem ser tornar infectados, apresentar sinais nervosos, e morrer.

Infecção por Cytomegalovirus Porcino (PCMV) é causada por um herpes vírus encontrados nos tecidos em todo o corpo incluindo o nariz de leitões recém-nascidos onde causa inflamação (rinite). PCMV está pre- sente em todo o mundo e existe na maioria se não em todas as populações de porcos, mas a maioria das infecções são subclínicas e é rara a doença clínica. Sorologia realizada no Reino Unido, por exemplo, indica que mais de 90% dos rebanhos foram expostos a infecção. A rinite produzida por este vírus é incomum e ocorre essencialmente em porcos recém-nascidos e não tem relação com rinite atrófica causada pelas bactérias produtoras de toxina Pasteurella multocidia. Na maioria dos rebanhos, portanto a infecção é in- significante e além de às vezes provocar um espirro moderado não tem efei- to importante sobre a saúde do porco.

A Doença dos Olhos Azuis é uma doença viral que causa sinto- mas nervosos, falência reprodutiva e opacidade ou azulamento da córnea. É vista essencialmente no México mas também foi reportada em outros países. Não é vista na Europa. Os sintomas incluem inapetência, opacidade corneal - conjuntivite, sinais nervosos tais como espasmos e convulsões, uma tendên- cia a sentar como um cachorro, febre, aumento de recaídas, aumento de desmame a intervalos de acasalamento, partos de natimortos, leitões mumifi- cados, alta mortalidade em leitões, testículos inchados, e perda da libido.

Vírus da B Encefalite Japonesa (JE) é um vírus disseminado por mosquitos e somente é importante em países onde os insetos são prevalen- tes. A maioria dos animais domésticos é afetada. Provoca uma encefalite no homem. O porco é uma importante fonte de infecção. Os sintomas incluem leitões mumificados ou natimortos, sinais nervosos em leitões tais como es- pasmos e convulsões, e fluido de edema em leitões. Também pode causar infertilidade e testículos inchados em porcos não-castrados. Diarréia Epidêmica Porcina (PED) é causada por um coronaví- rus um tanto similar ao que causa TGE. Este vírus está disseminado na Eu- ropa. O vírus danifica os vilos nos intestinos deste modo reduzindo a super- fície absortiva, com perda de fluido e desidratação. Depois da introdução do vírus em um rebanho de reprodução suscetível, desenvolve-se uma forte imunidade durante duas a três semanas. A imunidade colostral então prote- ge os leitões. O vírus geralmente desaparece espontanemente de rebanhos de reprodução particularmente pequenos (< 300 porcas). Ocorrem surtos agudos de diarréia quando o vírus é introduzido pela primeira vez em uma população suscetível. Em tais casos até 100% das porcas podem ser afeta- dos, apresentando uma diarréia branda a muito aquosa. São reconhecidos dois quadros clínicos: PED Tipo I somente afeta porcos em crescimento ao passo que PED Tipo Il afeta todas as idades incluindo porcos não desma- mados e porcas maduras. O período de incubação é de aproximadamente 2 dias e a diarréia dura por 7 a 14 dias. Em porcos não desmamados, a doen- ça pode ser branda ou grave com mortalidades de até 40%. Em grandes rebanhos de reprodução, particularmente se mantidas extensivamente, nem todas as fêmeas podem se tornar infectadas em torno da primeira vez e po- de haver recrudescência. Isto somente ocorre em leitões em aleitamento de porcas sem anticorpos maternos e portanto é esporádico.

A Infecção por Corona Vírus Respiratório Porcino (PRCV) apa- receu primeiro em porcos na Europa há uns dez anos atrás ou mais. Está relacionada com mas é distinta do vírus TGE, o qual é outro corona vírus. Imagina-se que se dissemine entre as fazendas no vento e portanto é ex- tremamente difícil de manter os rebanhos livres da mesma. Freqüentemente ocorre infecção no porco não desmamado com 2 a 3 semanas de idade, mas não é importante. Pode ter um efeito sobre o tecido pulmonar quando outros patógenos respiratórios estão presentes em complexos de doenças respiratórias crônicas. As porcas geralmente não apresentam sintomas, mas pode ocorrer tosse na presença de outros agentes respiratórios em que a tosse possa ser associada. Em leitões, pode estar presente uma tosse tran- sitória. Em leitões desmamados e produtores, rebanhos expostos pela pri- meira vez têm nenhum ou poucos sinais de doença. O sintoma mais comum é uma tosse transitória durando somente umas poucas horas.

Infecção por Rotavírus é uma infecção viral que é muito difundi- da em populações de porcos. Está presente na maioria se não em todos os rebanhos de porcos com virtualmente uma soro-conversão de 100% no es- toque adulto. Uma característica epidemiológica adicional é sua persistência fora do porco onde é resistente a alterações ambientais e muitos desinfetan- tes. Os anticorpos maternos persistem por 3 a 6 semanas depois das quais os porcos se tornam suscetíveis a infecção, mas a exposição não resulta necessariamente em doença. Estima-se que somente 10 a 15% das diarréi- as em porcos sejam iniciadas por uma infecção por rotavírus primária. Em um rebanho maduro, a doença aparece depois dos leitões terem 7 a 10 dias de idade. Torna-se progressivamente menos importante com a idade. No entanto se estiverem presentes cepas patogênicas de E. coli, pode ocorrer doença grave com alta mortalidade.

Raiva é causada por um vírus e é considerada uma doença rara em porcos. Invariavelmente é fatal em todas as espécies incluindo o homem - portanto sua importância. A raiva está ausente do Reino Unido, porém pre- sente em muitos outros países em todo o mundo. A infecção em leitões e porcas é rara. Em porcas, leitões desmamados, e produtores, o início da doença é súbito com sintomas que incluem uma contração nervosa dos músculos da face, espasmos e convulsões, rápida mastigação, salivação, músculos que podem .chegar ao espasmo, e pode ocorrer paralisia posterior. Geralmente a morte ocorre dentro de 3 dias.

Doença Vesicular Suína (SVD) é um vírus diferente do vírus que causa doença de pés e boca (FMD). No entanto, produz uma doença em porcos que é clinicamente indistinguível da FMD. Esta doença deve ser sempre considerada se aparecer coxeadura súibita disseminada com vesí- culas ou bolhas sobre o focinho, a língua e parte de cima das patas.

Tuberculose afeta mamíferos, incluindo pessoas, aves, e suínos. O organismo causai, Mycobacterium tuberculosis, é subclassificado em ti- pos, humano, bovino e avícola. O tipo avícola é referido como M. avium ou mais freqüentemente o complexo avium/intracellulare porque não é uma es- pécie uniforme. O próprio M. avium infecta essencialmente aves mas tam- bém é encontrado no ambiente junto com M. intracellulare o qual é predomi- nantemente saprofítico ou de vida livre. Os porcos são raramente infectados pelos tipos humano ou bovino, mas são comumente infectados pelo com- plexo avian/intracellulare. O complexo avian/intracellulare também causa infecção subclínica não-progressiva em pessoas saudáveis. A principal pre- ocupação é que pode causar doença mais grave em pessoas imunossupri- midas e pessoas com AIDS. Na maioria dos países, se são encontradas Ie- sões no pescoço durante o abate, toda a cabeça é condenada e se são en- contradas nos Iinfonodos mesentéricos os quais drenam os intestinos, as vísceras são condenadas. Se estiverem mais disseminados no corpo, o que é raro, toda a carcassa pode ser condenada ou cozida. Caso pequenas le- sões não forem vistas pelo inspetor de carne o cozimento na cozinha normal destrói o organismo. Em todos os porcos, infecção causa pequenos nódulos nos Iinfonodos do pescoço e os que drenam o intestino delgado. Na grande maioria de casos as lesões são não-progressivas, não se espalham pelo corpo, não tornam o porco doente e não são excretadas. Não há sintomas clínicos e não há diferença na performance entre porcos infectados e não- infectados.

O vírus deo exantema vesicular do suíno (VES) é diferente dos que causam a doença dos pés e da boca (FMD) e a doença vesicular suína (SVD), mas produz uma doença em porcos que é clinicamente indistinguível de FMD e SVD. Diferentemente de FMD, somente afeta porcos. Os sinto- mas incluem baixa mortalidade, mas pode haver algumas mortes em leitões em aleitamento. Outros sintomas incluem salivação, inapetência, e vesículas em torno da boca, nariz, língua e pés.

Estomatite Vesicular (VS) causa uma doença que ocorre essenci- almente na América do Sul e Central, ocasionalmente nos Estados Unidos e raramente como epidemias se estendendo tão ao Norte quanto o Canadá e tão ao Sul quanto a Argentina. O vírus da estomatite vesicular produz uma doença em porcos que é clinicamente indistinguível FMD, SVD e VES. O mais freqüentemente, no entanto, a infecção de porcos é subclínica. Em todos os porcos, a infecção se caracteriza por babar saliva, lesões das patas e coxea- dura, uma redução na taxa de crescimento, um aumento na temperatura cor- poral para 40 á 41°C (106 a 107°F), o aparecimento de vesículas (bolhas) até 30 mm de diâmetro no nariz, lábios, e tetas e em torno das coroas das patas que pode fazer os porcos mancar. A mortalidade geralmente é baixa e a maio- ria dos porcos se recupera em uma a duas semanas.

Rinite Atrófica, Doença Progressiva e Não progressiva a qual causa inflamação do nariz e pode ser causada por uma variedade de bacté- rias e substâncias irritantes. Durante o processo de infecção, as delicadas estruturas ou ossos turbinados no nariz se tornam danificadas e atrofiam ou desaparecem. Rinite atrófica progressiva descreve uma doença específica onde os tecidos do nariz atrofiam permanentemente. É causada por cepas de Pasteurella multocidia (PMt) produtoras de toxina específicas. Há dois tipos A e D. Em porcos não desmamados, espirro, defluxo e uma secreção nasal são os primeiros sintomas, mas em surtos agudos onde há pouco anticorpo ma- terno, a rinite pode ser tão grave até a extensão de que haja hemorragia do nariz. Por volta de três a quatro semanas de idade e do desmame em diante, há evidência de manchamento da lágrima e malformação do nariz associada com deformação e encurtamento. Porcos gravemente afetados podem ter problemas para comer. Há ganho de peso diário consideravelmente reduzido. Em vários surtos os porcos podem não crescer até o peso do mercado.

Vírus da Encefalomielite Eqüina Oriental (EEEV) são membros do gênero Alphavirus, família Togaviridae. EEEV pode ser transmitido para eqüinos e seres humanos durante a mordida de um mosquito infectado. A- lém de cavalos e seres humanos, EEEV pode produzir doença grave em espécies de criação comum tais como suíno e gado vacuum. EEEV, ou anti- corpos vírus-específicos, têm sido recuperados de aves tais como o peru, faisão, codorna, avestruz, e casuar, entre outros.

Artrite por Mycoplasma é provocada por infecção por Mycoplas- ma hyosynoviae. Esta artrite, é caracterizada por inflamação de uma ou mais articulações e é comum em todos os porcos não desmamados e em crescimento e porcas. No entanto, é rara em leitões.

Infecção em suíno também é provocada por adenovírus e vírus da encefalomielite hemaglutinante.

Por conseguinte, o que é necessário na técnica é um método pa- ra obter proteína ORF2, o qual não requer extração da proteína 0RF2 de den- tro das células infectadas. O que é adicionalmente necessário são métodos para obter proteína 0RF2 recombinante em quantidades suficientes para pre- parar de modo eficaz composições de vacina. O que é ainda adicionalmente necessário são métodos para obter proteína 0RF2 os quais não requerem os métodos complicados e de trabalho intensivo necessários para os protocolos correntes de extração de proteína 0RF2. Finalmente, com respeito a compo- sições, o que é necessário na técnica é uma composição imunogênica a qual confere imunidade protetora contra infecção por PCV2 e reduz a gravidade de ou previne os sinais clínicos associados com a mesma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção supera os problemas inerentes na técnica anterior e proporciona um distinto avanço no estado da técnica. Especifica- mente, um aspecto da presente invenção proporciona métodos aprimorados para produzir e/ou recuperar proteína recombinante de 0RF2 de PCV2, i) permitindo infecção de células suscetíveis em cultura com um vetor viral re- combinante contendo seqüências codificantes de DNA de 0RF2 de PCV2, em que proteína 0RF2 é expressada pelo vetor viral recombinante, e ii) de- pois disso recuperar a ORF2 no sobrenadante. Foi inesperadamente desco- berto que 0RF2 é liberado no sobrenadante em grandes quantidades se a infecção e incubação subseqüente das células infectadas é deixada para progredir além do último processo de recuperação de 0RF2 de PCV2 ante- rior típico, o qual extrai o 0RF2 de PCV2 de dentro das células. Além disso foi visto surpreendentemente que proteína 0RF2 de PCV é forte contra de- gradação prototípica fora das células de produção. Ambos os achados jun- tos permitem uma recuperação de altas quantidadeds de proteína de ORF2 de PCV2 do sobrenadante de culturas celulares infectadas com vetores vi- rais recombinantes contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e expressando a proteína de ORF2 de PCV2. Altas quantidades de proteína de ORF2 de PCV2 significa mais de cerca de 20 pg/mL de sobrenadante, preferencial- mente mais de cerca de 25 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 30 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 40 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 50 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 60 pg/mL, ainda mais preferenci- almente mais de cerca !de 80 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 100 pg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 150 pg/mL, o mais preferencialmente mais de cerca de 190 pg/mL. Estes índices de expressão também podem ser obtidos, por exemplo, pelos métodos con- forme descrito nos Exemplos 1 a 3.

Culturas celulares preferenciais têm uma contagem celular entre cerca de 0,3 a 2,0 χ 106 células/mL, mais preferencialmente de cerca de 0,35 a 1,9 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,4 a 1,8 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,45 a 1,7 χ 106 célu- las/mL, e o mais preferencialmente de cerca de 0,5 a 1,5 χ 106 células/mL Cé- lulas preferenciais são determináveis pelos versados na técnica. Células prefe- renciais são os suscetíveis para infecção com um vetor viral recombinante a- propriado, contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e expressando a proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente as células são células de inseto, e mais pre- ferencialmente, incluem as células de inseto vendidas sob a marca registrada células de inseto Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT).

Meio de crescimento apropriado também será determinável pelos versados na técnica com um meio de crescimento preferencial sendo meio de células de inseto livre de soro tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Le- nexa, KS) e semelhantes. Vetores virais preferenciais incluem baculovírus tais como BacuIoGoId (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), em particu- lar se as células de produção forem células de inseto. Embora o sistema de expressão de baculovírus seja preferencial, é entendido pelos versados na técnica que outros sistemas de expressão funcionarão para os fins da presen- te invenção, a saber a expressão de ORF2 de PCV2 no sobrenadante de uma cultura celular. Os sistemas de expressão diferentes referidos requerem o uso de uma seqüência de sinal de modo a provocar expressão de ORF2 no meio. Foi descoberto surpreendentemente que quando ORF2 é produzido por um sistema de expressão de baculovírus, não requer qualquer seqüência de sinal ou modificação adicional para causar expressão de 0RF2 no meio. Acredita- se que esta proteína pode formar independentemente partículas semelhantes a vírus (Journal of General Virology Vol. 81, pp. 2281-2287 (2000) e ser secre- tada no sobrenadante da cultura. O vetor viral recombinante contendo as se- qüências de DNA de ORF2 de PCV2 tem uma multiplicidade preferencial de infecção (MOI) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencialmente de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,09 a 1,1, e o mais preferencialmente de cerca de 0,1 a 1,0, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferencialmente as MOIs mencionadas acima refere- sem a um ml_ de fluido de cultura celular. Preferencialmente, o método descri- to aqui, neste requerimento de patente, compreende a infecção de 0,35 a 1,9 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,4 a 1,8 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,45 a 1,7 χ 106 célu- las/mL, e o mais preferencialmente de cerca de 0,5 a 1,5 χ 106 células/mL com um vetor viral recombinante contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e ex- pressando a proteína PCV2 ORF tendo uma MOI (multiplicidade de infecção) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencialmente de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,09 a 1,1, e o mais preferencial- mente de cerca de 0,1 a 1,0.

As células infectadas são em seguida incubadas por um período de até dez dias, mais preferencialmente de cerca de dois dias a cerca de dez dias, ainda mais preferencialmente de cerca de quatro dias a cerca de nove dias, e o mais preferencialmente de cerca de cinco dias a cerca de oito dias. Condições de incubação preferenciais incluem uma temperatura entre cerca de 22 a 32°C, mais preferencialmente de cerca de 24 a 30°C, ainda mais preferencialmente de cerca de 25 a 29°C, ainda mais preferencialmen- te de cerca de 26 a 28°C, e o mais preferencialmente cerca de 27°C. Prefe- rencialmente, as células Sf+ são observadas depois de inoculação para alte- rações induzidas por baculovírus características. A observação referida po- de incluir monitoramento das tendências da densidade celular e a redução na viabilidade durante o período de pós-infecção. Foi visto que o pico do título viral é observado 3 a 5 dias depois de infecção e pico de liberação de ORF2 das céliilas no sobrenadante é obtido entre os dias 5 e 8, e/ou quan- do a viabilidade celular diminui para menos de 10%.

Portanto, um aspecto da presente invenção proporciona um mé- todo aprimorado para produzir e/ou recuperar proteína recombinante de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descritas acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressar proteína de ORF2 de PCV2 pelo vetor viral recombinante, e iii) depois disso recuperar o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%. Preferencialmente, o vetor viral recombinante é um baculovírus recom- binante contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 de PCV2 e as células são células Sf+. Adicionalmente, é preferencial que a cultura seja peri- odicamente examinada para evidência macroscópica e microscópica de con- taminação ou para alterações atípicas na morfologia celular durante o período pós-infecção. Qualquer cultura apresentando qualquer contaminação deve ser descartada. Preferencialmente, a proteína recombinante ORF2 expressada é secretada pelas células no meio de crescimento vizinho que mantém a viabili- dade celular. O ORF2 é em seguida recuperado no sobrenadante vizinho às células ao invés das próprias células.

O processo de recuperação preferencialmente se inicia com a separação de debris celulares do ORF2 expressado no meio através de uma etapa de separação. Etapas de separação preferenciais incluem métodos de filtração, centrifugação em velocidades até cerca de 20.000 xg, centrifugação de fluxo contínuo, separação cromatográfica usando troca tônica ou filtração por gel, e imunoafinidade convencional. Estes métodos são de conhecimento de pessoas versadas na técnica, por exemplo, por (Harris and Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995). Os métodos de separação mais preferenciais incluem centrifugação em velo- cidades até cerca de 20.000 xg e filtração. Métodos de filtração preferenciais incluem microfiltração de ponta morta e filtração de fluxo tangencial (ou fluxo cruzado) incluindo microfiltração de ponta morta de filtração de fibra oca. Des- tes, é preferencial microfiltração de ponta morta. Tamanhos de poro preferen- ciais para microfiltração de ponta morta são entre cerca de 0,30 a 1,35 μιη, mais preferencialmente entre cerca de 0,35 a 1,25 μm, ainda mais preferenci- almente entre cerca de 0,40 a 1,10 μm, and o mais preferencialmente entre cerca de 0,45 a 1,0 μm. Acredita-se que qualquer membrana de filtração con- vencional funcionará para os fins da presente invenção e são preferenciais membranas de polietersulfona. Quaisquer espécies de ácido nucléico de bai- xo peso são removidas durante a etapa de filtração.

Portanto, um aspecto adicional da presente invenção proporcio- na um método aprimorado para produzir e/ou recuperar proteína recombi- nante de ORF2 de PGV2, preferencialmente em quantidades descritas aci- ma, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme defini- do acima, ii) expressando proteína ORF2 de PCV pelo vetor viral recombi- nante, iii) recuperando o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, e, iv) separando debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma etapa de separação. Preferencialmente, o vetor viral recombinante é um baculovírus contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 e as células são células SF+. Etapas de separação preferen- ciais são as descritas acima. A mais preferencial é uma microfiltração de ponta morta usando uma membrana tendo um tamanho de poro entre cerca de 0,30 a 1,35 μm, mais preferencialmente entre cerca de 0,35 a 1,25 μm, ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,40 a 1,10 μm, e o mais prefe- rencialmente entre cerca de 0,45 a 1,0 μm.

Para recuperação de ORF2 de PCV2 que será usado em uma composição imunogênica ou imunológica tal como uma vacina, a inclusão de uma etapa de inativação é preferencial de modo a inativar o vetor viral. Uma "composição imunogênica ou imunológica" refere-se a uma composi- ção de substância que compreende no mínimo um antígeno o qual provoca uma reação imunológica no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou mediada por anticorpos para a composição ou vacina de interesse. Geral- mente, uma "réação imunológica" inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, célu- las T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou célu- las yd T, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferencialmente, o hospedeiro apre- sentará ou uma reação imunológica terapêutica ou protetora tal que a resis- tência a nova infecção será reforçada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. A proteção referida será demonstrada ou por uma redução ou falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título viral reduzido no hos- pedeiro infectado. Portanto, a presente invenção também referè-se a méto- do para produzir e/ou recuperar proteína recombinante de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descrito acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressando prote- ína ORF2 de PCV pelo vetor viral recombinante, iii) recuperando o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de in- fecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, iv) separa- ção de debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma eta- pa de separação, e v).inativando o vetor viral recombinante.

Preferencialmente, esta inativação é feita ou logo antes ou logo depois da etapa de filtração, com depois da etapa de filtração sendo o mo- mento preferencial para inativação. Qualquer método de inativação conven- cional pode ser usado para os fins da presente invenção. Portanto, pode ser realizada inativação por tratamentos químicos e/ou físicos. Em formas prefe- renciais, o volume dos fluidos colhidos é determinado e a temperatura é tra- zida para entre cerca de 32 a 42°C, mais preferencialmente entre cerca de 34 a 40°C, e o mais preferencialmente entre cerca de 35 a 39°C. Métodos de inativação preferenciais incluem a adição de etilenimina binária ciclizada (BEI), preferencialmente em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 20 mM, mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferencial- mente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, e o mais preferencialmente de cerca de 5 mM. Por exemplo, a inativação inclui a adição de uma solução de bro- midrato de 2-bromoetilenoamina, preferencialmente de cerca de 0,4 M, a qual foi ciclizada para 0,2 M de etilenimina binária (BEI) em 0,3 N de NaOH, aos fluidos para dar uma concentração final de cerca de 5 mM de BEI. Pre- ferencialmente, os fluidos são em seguida agitados continuamente por 72 a 96 horas e os fluidos colhidos inativados podem ser armazenados congela- dos a -40°C ou abaixo ou entre cerca de 1 a 1°C. Depois da inativação ser completada, uma solução de tiossulfato de sódio tiossulfato de sódio, prefe- rencialmente a 1,0 M é adicionada para neutralizar qualquer BEI residual.

Preferencialmente, o tiossulfato de sódio é adicionado em quantidade equi- valente comparado com a BEI adicionada antes para inativação. Por exem- plo, no caso de BEI ser adicionada para uma concentração final de 5 mM, uma solução a 1,0 M de tiossulfato de sódio é adicionada para dar uma concentração mínima final de 5 mM para neutralizar qualquer BEI residual.

Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método para produzir proteína recombinante de ORF2 de PCV2, prefe- rencialmente em quantidades descrito acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral re- combinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressar proteína de ORF2 de PCV pelo vetor viral recombinante, iii) recuperar o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de in- fecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, iv) separar debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma etapa de separação, e v) inativar o vetor viral recombinante. Preferencialmente, o ve- tor viral recombinante é um baculovírus contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 e as células são células SF+. Etapas de separação prefe- renciais são as descritas acima, a mais preferencial é a etapa de filtração. Etapas de inativação preferenciais são as descritas acima. Preferencialmen- te, é realizada inativação entre cerca de 35 a 39°C e na presença de 2 a 8 mM de BEI, e ainda mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI. Foi visto surpreendentemente que maiores concentrações de BEI afetam negativamente a proteína de ORF2 de PCV2.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o método descrito acima também inclui uma etapa de neutralização depois da etapa v). Esta etapa vi) compreende a adição de uma quantidade equivalen- te de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução. Preferencialmente, se o agente de inativação for BEI, é preferencial a adição de tiossulfato de sódio a uma quantidade equivalente. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, a etapa vi) compreende adicionar uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferencial- mente de cerca de 3 a cerca de 7 mM o mais preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

Em formas preferenciais e especialmente em formas que usarão a proteína recombinante de ORF2 de PCV2 em uma composição imunogê- nica tal como uma vacina, cada lote de ORF2 colhido será testado para ina- tivação por passagem nas células Sf+ suscetíveis a baculovírus, dependen- tes de ancoragem. Em uma forma preferencial deste experimento, 150 cm2 de monocámada de cultura celular apropriada é inoculada com 1,0 mL de fluidos de PCV2 inativado e mantido em 25 a 29°C por 14 dias com no mí- nimo duas passagens. Ao final do período de manutenção, as monocama- das celulares são examinadsa para efeito citopatogênico (CPE) típico de baculovírus de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, também são usados controles virais positivos. Os controles referidos podem consistir em uma cultura de células Sf+ inoculada com um baculovírus de ORF2 de PCV2 de referência não-inativado e um frasco de células Sf+ que permanecem não inoculadas. Depois de incubação e passagem, a ausência de células infec- tadas com vírus nos fluidos virais tratados com BEI constituiriam um teste de inativação satisfatório. As células controle inoculadas com o vírus de refe- rência devem apresentar CPE típica de baculovírus de ORF2 de PCV2 e o frasco não inoculado não apresentraria qualquer evidência de CPE de bacu- lovírus de ORF2 de PCV2. Alternativamente, ao final do período de manu- tenção, as amostras de sobrenadante podem ser coletadas e inoculadas sobre uma placa de 96 cavidades de Sf+, a qual foi carregada com células Sf+, e em seguida mantida em 25 a 29°C por 5 a 6 dias. A placa é em se- guida fixada e corada com anticorpo anti-ORF2 de PCV2 conjugado a FITC. A ausência de expressão de CPE e ORF2, conforme detectado por micos- copia IFA, nos fluidos virais tratados com BEI constitui um teste de inativa- ção satisfatório. As células controle inoculadas com o vírus de referência devem apresentar atividade de CPE e IFA e o frasco não inoculado não de- ve apresentar qualquer evidência de CPE de baculovírus de ORF2 dé PCV2 e não deve conter atividade de IFA.

Portanto um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um teste de inativação para determinar a eficácia da inativação do vetor viral de recombinação, compreendendo as etapas de: i) contactar no mínimo uma porção do fluido de cultura contendo o vetor viral recombinante com um agente inativante, preferencialmente conforme descrito acima, ii) adicionar um agente de neutralização para neutralizar o agente de inativação, prefe- rencialmente conforme descrito acima, e iii) determinar a infectividade resi- dual pelos testes conforme descrito acima.

Um adicional aspecto da invenção refere-se a um método para construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e ex- pressando proteína de ORF2 de PCV2 em altas quantidades, quando infecta- do em células suscetíveis. Foi visto surpreendentemente que o vetor viral re- combinante conforme proporcionado deste modo expressa altas quantidades, conforme definido acima, de ORF2 de PCV2 depois de infectar células susce- tíveis. Portanto, a presente invenção também refere-se a um método aprimo- rado para produção e/ou recuperação de proteína de ORF2 de PCV2, prefe- rencialmente compreendendo as etapas de: construir um vetor viral recombi- nante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, o vetor viral é um baculorvírus recombinante. Deta- lhes do método para construir vetores virais recombinantes contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2, conforme propor- cionado deste modo, são descritos para os seguintes: Em formas preferenci- ais o vetor viral'recombinante contendo PCV2 ORF 2 DNA e expressando pro- teína de 0RF2 de PCV2 usado para infectar as células é gerado transfectan- do um vetor de transferência que teve um gene 0RF2 clonado no mesmo em um vetor viral. Preferencialmente, somente a porção do vetor de transferência, que contém o DNA de ORF2 é transfectado no vetor viral. O termo "transfec- tado em um vetor viral" significa, e é usado como um sinônimo para "introdu- zir" ou "clonar" um DNA heterólogo em um vetor viral, tal como, por exemplo, em um vetor de baculovírus. O vetor viral é preferencialmente mas não ne- cessariamente um baculovírus.

Portanto, de acordo com um aspecto adicional da presente in- venção, o vetor viral recombinante é gerado por recombinação entre um ve- tor de transferência contendo o DNA heterólogo de 0RF2 de PCV2 e um vetor viral, preferencialmente um baculovírus, ainda mais preferencialmente um baculovírus de replicação-deficiente Iinearizado (tal como Baculo Gold DNA). Um "vetor de transferência" significa uma molécula de DNA1 que in- clui no mínimo uma origem de replicação, o gene heterólogo, no presente caso ORF2 de PCV2, e seqüências de DNA as quais permitem a clonagem do gene heterólogo referido no vetor viral. Preferencialmente as seqüências as quais permitem a clonagem do gene heterólogo no vetor viral estão flan- queando o gene heterólogo. Ainda mais preferencialmente, as seqüências fIanqueantes são no mínimo homólogcas em partes com seqüências do ve- tor viral. A homologia de seqüência em seguida possibilita recombinação de ambas as moléculas, o vetor viral, e o vetor de transferência para gerar um vetor viral recombinante contendo o gene heterólogo. Um vetor de transfe- rência preferencial é o vetor pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen), o qual é designado para co-transfecção com o BacuIoGoId DNA na linhagem celu- lar Sf+ preferencial. Preferencialmente, o referido vetor de transferência compreende um DNA de 0RF2 de PCV2. O constructo co-transfectado tem aproximadamente 10.387 pares de bases de extensão. Em formas mais preferenciais, os métodos da presente inven- ção se iniciarão com o isolamento de DNA de ORF2 de PCV2. Geralmente, este pode ser de uma cepa conhecida ou desconhecida uma vez que o DNA de ORF2 parece ser altamente conservado com no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüência entre diferentes isolados. Qualquer gene de ORF2 de PCV2 conhecido na técnica pode ser usado para os fins da presente in- venção uma vez que cada seria expresso no sobrenadante. O DNA de ORF2 de PCV preferencialmente é amplificado usando métodos de PCR, ainda mais preferencialmente junto com a introdução de uma seqüência de consenso de Kózak flanqueante 5' (CCGCCAUG) (SEQ ID NO 1) e/ou um sítio EcoRI flanqueante 3' (GAATTC) (SEQ ID NO 2). A referida introdução de uma seqüência de consenso de Kozak 5' preferencialmente remove o códon de partida que ocorre naturalmente AUG de 0RF2 de PCV2. O sítio EcoR1 3' preferencialmente é introduzido a jusante do códon de parada do 0RF2 de PCV2. Mais preferencialmente é introduzido a jusante de uma se- qüência de terminação de transcrição poly A, que é a própria localizada a jusante do códon de parada 0RF2 de PCV2. Foi visto que o uso de uma seqüência de consenso de Kozak, em particular conforme descrito acima, aumenta o nível de expressão da proteína de 0RF2 de PCV2 subseqüente. O DNA de 0RF2 de PCV2 amplificado, com estas seqüências adicionais, é clonado em um vetor. Um vetor preferencial para esta etapa de clonagem inicial é o vetor pGEM-T-Easy Vector (Promega, Madison, Wl). O DNA de ORF2 de PCV2 incluindo algumas seqüências de vetor pGEM (SEQ ID NO: 7) é preferencialmente excisado do vetor no sítio de restrição Notl. O DNA resultante é em seguida clonado no vetor de transferência.

Portanto, em um aspecto da presente invenção, um método pa- ra construir um vetor viral recombinante contendo DNA de 0RF2 de PCV2 é proporcionado. Este método compreende as etapas de: i) clonar um 0RF2 de PCV2 recombinante em um vetor de transferência; e ii) transfectar a por- ção do vetor de transferência contendo o 0RF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral, para gerar o vetor viral recombinante. Preferencialmente, o vetor de transferência é o descrito acima ou é construído conforme descrito acima ou conforme mostrado exemplarmente na figura 1. Portanto de acor- do com um aspecto adicional, o vetor de transferência, usado para a cons- trução do vetor viral recombinante conforme descrito aqui, neste requeri- mento de patente, contém a seqüência de SEQ ID NO: 7.

De acordo com um aspecto adicional, este método adicional compreende antes da etapa i) a seguinte etapa: amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas conforme descrito acima. Métodos in vitro parfa am- plificar o DNA de ORF2 de PCV2 e modificar as seqüências flanqueantes, clonar in vitro DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transfe- rência e vetores de transferência adequados são descritos acima, mostra- dos exemplarmente na figura 1, ou de conhecimento de uma pessoa versa- da na técnica. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2 compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante. Preferencialmente, a modi- ficação das seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 é realizada conforme descrito acima, por exemplo, introduzindo uma seqüência de Ko- zak 5' e/ou um sítio EcoRI, preferencialmente conforme descrito acima.

De acordo com um aspecto adicional, um método para produzir e/ou recuperar proteína recombinante expressada por estrutura de leitura aberta 2 de PCV2 é proporcionado. O método geralmente compreende as etapas de: i) clonar um ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor de trans- ferência; ii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o ORF2 de PCV2 recombinante em um vírus; iii) infectar células em meios com o vírus transfectado; iv) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteí- na recombinante de ORF2 de PCV2; v) separar células do sobrenadante; e vi) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante.

Métodos de como clonar um DNA de ORF2 de PCV2 recombi- nante em um vetor de transferência são descritos acima. Preferencialmente, o vetor de transferência contém a seqüência de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 7. No entanto, o vetor de transferência pode conter qual- quer DNA de 0RF2 de PCV2, não modificado ou modificado, contanto que o DNA de ORF2 de PCV2, quando transfectado em um vetor viral recombi- nante, seja expressado em cultura celular. Preferencialmente, o vetor viral recombinante compreende a seqüência de SEQ ID NO: 8. Além disso, mé- todos de como infectar células, preferencialmente como infectar células de inseto com um número definido de baculovírus recombinante contendo DNA de 0RF2 de PCV2 e expressando proteína de 0RF2 de PCV2, são descri- tos acima em detalhes. Além disso, etapas para separar células do sobre- nadante bem como etapas para recuperar a proteína de 0RF2 de PCV2 expressada também são descritas acima em detalhes. Qualquer uma destas etapas do processo específicas, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, são parte do método para produzir e/ou recuperar proteína re- combinante expressada por estrutura de leitura aberta 2 de PCV2 conforme descrito acima. Preferencialmente, as células são células SF+. Ainda mais preferencialmente, as culturas celulares têm uma contagem celular entre cerca de 0,3 a 2,0 χ 106 células/mL, mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a 1,9 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente a partir de cer- ca de 0,4 a 1,8 χ 106 células/mL, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a 1,7 χ 106 células/mL, e o mais preferencialmente a partir de cerca de 0,5 a 1,5 χ 106 células/mL Preferencialmente, o vetor viral recom- binante contendo o DNA de ORF2 de PCV2 tem uma multiplicidade de in- fecção preferencial (MOI) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencial- mente a partir de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,09 a 1,1, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,1 a 1,0, e o mais preferencialmente até cerca de 0,5, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferencialmente, a recuperação da pro- teína de ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%. Preferencialmente, para produzir proteína de ORF2 de PCV2, as célu- las são cultivadas em 25 a 29°C. Preferencialmente, a etapa de separação é uma etapa de centrifugação ou uma etapa de filtração.

Opcionalmente, este método pode incluir a etapa de amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 de uma cepa de PCV2 antes de clonar o DNA de ORF2 de PCV2 no vetor de transferência. Em formas preferenciais, uma se- qüência de Kozak 5', um sítio 3' EcoRI, e combinações dos mesmos também podem ser adicionados à seqüência amplificada, preferencialmente antes ou durante a amplificação. Uma seqüência de Kozak 5' preferencial compreende a SEQ ID NO: 1. Um sítio 3" EcoRI preferencial compreende a SEQ ID NO: 2. DNA de 0RF2 de PCV2 preferencial compreende a seqüência de nucleotí- deos do Genbank Acesso N°. AF086834 (SEQ ID NO: 3) e SEQ ID NO: 4. Proteína reçombinante de 0RF2 de PCV2 preferencial compreende a se- qüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, a qual é a proteína codificada por SEQ ID NO: 3 (Genbank Acesso N°. AF086834) e SEQ ID No: 6, a qual é a proteína codificada por SEQ ID NO: 4. Um meio preferencial compreende meio de células de inseto livre de soro, ainda mais preferencialmente meio Excell 420. Quando a etapa de amplificação opcional é realizada, é preferen- cial primeiro clonar a estrutura de leitura aberta 2 amplificado em um primeiro vetor, excisar a estrutura de leitura aberta 2 do primeiro vetor, e usar a estrutu- ra de leitura aberta excisado para clonagem no vetor de transferência. Uma linhagem celular preferencial para cotransfecção é a linhagem celular SF+. Um vírus preferencial para cotransfecção é baculovírus. Em formas preferen- ciais deste método, a porção transfectada do vetor de transferência compre- ende a SEQ ID NO: 8. Finalmente, para este método, é preferencial recuperar a proteína da estrutura de leitura aberta 2 (ORF2) de PCV2 no sobrenadante da cultura celular no mínimo 5 dias depois de infectar as células com o vírus.

Portanto, um aspecto adicional da invenção refere-se a um méto- do para produzir e/ou recuperar a estrutura de leitura aberta de PCV2 2, com- preende as etapas de: i) amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, prefe- rencialmente adicionando uma seqüência de Kozak 5' e/ou adicionando um sítio de restrição 3' EcoRI, ii) clonar o 0RF2 de PCV2 amplificado em um ve- tor de transferência; iii) transfectar a porção do vetor de transferência conten- do o 0RF2 de PCV2 recombinante em um vírus; iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de 0RF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadan- te; e vii) recuperar a proteína de 0RF2 de PCV2 expressada do sobrenadante.

Um adicional aspecto da presente invenção refere-se a um méto- do para preparar uma composição compreendendo proteína de 0RF2 de PCV2, e vetor viral inativado. Este método compreende as etapas de: i) clonar o ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; ii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o 0RF2 de PCV2 recombinante em um vírus; iii) infectar células em meios com o vetor viral transfectado; iv) fazer com que o vetor viral transfectado expresse a proteína recombinante de 0RF2 de PCV2; v) separar células do sobrenadante; vi) recuperar a proteína de 0RF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; e vii) inativar o vetor viral recombinante. Preferencialmente, o vetor viral recombinante é um baculovírus contendo seqüências codificantes de DNA de 0RF2 e as células são células SF+. Etapas de separação preferenciais são as descritas acima, a mais prefe- rencial é a etapa de filtração. Etapas de inativação preferenciais são as descri- tas acima. Preferencialmente, é realizada inativação entre cerca de 35 a 39°C e na presença de 2 a 8 mM de BEI, ainda mais preferencialmente na presen- ça de cerca de 5 mM de BEI. Toi visto surpreendentemente que maiores con- centrações de BEI afetam negativamente a proteína de 0RF2 de PCV2, e menores concentrações não são eficazes para inativar o vetor viral dentro de 24 a 72 horas de inativação. Preferencialmente, inativação é realizada por no mínimo 24 horas, ainda mais preferencialmente por 24 a 72 horas.

De acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição compreendendo proteína de 0RF2 de PCV2, e vetor viral inativado, conforme descrito acima, também inclui uma etapa de neutraliza- ção depois da etapa vii). Esta etapa viii) compreende adicionar uma quanti- dade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução. Preferencialmente, se o agente de inativação for BEI1 é prefe- rencial a adição de tiossulfato de sódio a uma quantidade equivalente. Por- tanto, de acordo com um aspecto adicional, a etapa viii) compreende adicio- nar uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, o mais preferenci- almente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

De acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição compreendendo proteína de ORF2 de PCV2, e vetor viral inativado, conforme descrito acima, compreende antes da etapa i) a seguinte etapa: amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas conforme descrito acima. Métodos in vitro para amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 e modificar as seqüências flanqueantes, clonar in vitro DNA de ORF2 de PCV2 amplifica- do em um vetor de transferência e vetores de transferência adequados são descritos acima, mostrados exemplarmente na figura 1, ou de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Portanto, de acordo com um aspecto adi- cional, este método compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadan- te; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente, na presença de cer- ca de 1 a cerca de 20 mM de BEI, o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; e ix) adicionar uma quantidade equivalente de um a- gente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferencial- mente, adição de uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um mé- todo para preparar uma composição, preferencialmente uma composição anti- gênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2. Geralmente, este método inclui as etapas de transfectar um cons- tructo em um vírus, em que o constructo compreende i) DNA recombinante de ORF2 de PCV2, ii) infectar células em meio de crescimento com o vírus trans- fectado, iii) fazer com que o vírus expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2, iv) recuperar a proteína de ORF2 expressada do sobrenadante, v) e preparar a composição combinando a proteína recuperada com um adjuvante adequado e/ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.

"Adjuvantes" conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, pode incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas por exemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão de água-em- óleo, emulsão de óleo-em-água, emulsão de água-em-óleo-em-água. A e- mulsão pode ser à base de, em particular, óleo de parafina líquida leve (tipo da Farmacopéia Européia); óleo isoprenóide tal como óleo esqualano ou esqualeno resultante da teoligomerização de alquenos, em particular de iso- buteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquil linear, mais particularmente óleos vegetais, etil oleato, di-(caprilato/caprato) de propileno glicol, gliceril tri-(caprilato/caprato) ou dioleato de propileno gli- col; ésteres de álcoois ou de ácidos graxos ramificados, em particular éste- res de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsifican- tes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferencialmente tensoa- tivos não-iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manide (por exem- plo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, os quais são opcionalmente etoxilados, e blocos de copolímeros de polioxipropileno- polioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart- Tull, D. Ε. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) e Todd et al., Vac- Cine 15:564-570 (1997).

Por exemplo, é possível usar a emulsão de SPT descrita à pági- na 147 de uVaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59 des- crita à página 183 deste mesmo livro.

Um caso adicional de um adjuvante é um composto escolhido entre os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidri- do maléico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes benéficos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico os quais são reticulados, especial- mente com éteres de polialquenila de açúcares ou poliálcoois. Estes compos- tos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, N°. 2, June 1996). As pessoas versadas na técnica também podem consultar a Patente dos Estados Unidos N°. 2.909.462 a qual descreve os polímeros acrílicos re- feridos reticulados com um composto poliidroxilado tendo no mínimo 3 grupos oxidrila, preferencialmente não mais de 8, os átomos de hidrogênio de no mí- nimo três oxidrilas sendo substituídas por radicais alifáticos insaturados tendo no mínimo 2 átomos de carbono. Os radicais preferenciais são aqueles con- tendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem os próprios conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Car- bopol; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. São reticu- lados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre estes, podem ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. É mais preferencial o uso de Ca- bopol 971P. Entre os copolímeros de anidrido maléico e derivado de alqueni- la, os copolímeros EMA (Monsanto) os quais são copolímeros de anidrido ma- léico e etileno. A dissolução destes polímeros em água leva a uma solução ácida que será neutralizada, preferencialmente até pH fisiológico, de modo a dar a solução adjuvante na qual será incorporada a própria composição imu- nogênica, imunológica ou de vacina.

Adjuvantes adequados adicionais incluem, mas não estão limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero em bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lipídeo A, adjuvante de lipí- deo-amina Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante ou diver- sa), toxina do cólera, IMS 1314 ou dipeptídeo muramil entre muitos outros.

Preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantida- de de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencial- mente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adi- cionado em uma quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. O mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.

Portanto, de acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2 compreende i) preparar e recuperar proteína de ORF2 de PCV2, e ii) misturar esta com um adjuvante adequado. Preferencialmente, o adjuvante é Carbopol 971P. Ainda mais preferencialmente, Carbopol 971P é adicionado em uma quantidade de cer- ca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose. Prefe- rencialmente, a etapa do processo i) inclui as etapas do processo conforme descrito para a preparação e recuperação de ORF2 de PCV2. Por exemplo, em formas preferenciais deste método, o constructo compreendendo DNA de ORF2 de PCV2 é obtido em um vetor de transferência. Vetores de trans- ferência adequados e métodos para preparar os mesmos são descritos aci- ma. Opcionalmente, o método pode incluir a etapa de amplificar o ORF2 de uma cepa de PCV2 através de PCR antes de clonar o ORF2 no vetor de transferência. Seqüências de estrutura de leitura aberta preferenciais, se- qüências de Kozak, seqüências de sítio 3' EcoRI, seqüências de proteínas recombinantes, seqüências de constructos transfectados, meios, células, e vírus são conforme descrito nos métodos anteriores. Outra etapa opcional para este método inclui clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um primeiro vetor, excisando o DNA de ORF2 deste primeiro vetor, e usando este DNA de ORF2 de PCV2 excisado para clonagem no vetor de transfe- rência. Como com os outros métodos, é preferencial esperar por no mínimo 5 dias depois de infecção das células pelo baculovírus transfectado antes de recuperação de proteína de ORF2 recombinante do sobrenadante. Prefe- rencialmente, a etapa de recuperação deste método também inclui a etapa de separar os meios das células e debris celulares. Isto pode ser feito em uma variedade de modos, mas para facilidade e conveniência, é preferencial filtrar as células, debris celulares, e meio de crescimento através de um filtro tendo poros variando de tamanho de cerca de 0,45 μΜ a cerca de 1,0 μΜ. Finalmente, por este método, é preferencial incluir uma etapa de inativação viral antes de combinar a proteína recombinante de ORF2 de PCV2 recupe- rada em uma composição. Isto pode ser feito em uma variedae de modos, mas é preferencial na prática da presente invenção usar BEI.

Portanto, de acordo com um aspecto adicional, este método compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente, na presença de cerca de 1 a cerca de 20 mM de BEI, o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; ix) adicionar uma quantidade equivalente de um a- gente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferenci- almente, adicionar uma solução de tiossulfato de sódio a uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI, e x) adicionar uma quantidade ade- quada de um adjuvante, preferencialmente adicionar Carbopol, mais prefe- rencialmente Carbopol 971P, ainda mais preferencialmente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose).

Adicionalmente, a composição pode incluir um ou mais veículos farmacêuticos aceitáveis. Conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, "um veículo farmacêutico aceitável" inclui qualquer um e todos os sol- ventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes, diluen- tes, conservantès, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotôni- cos, agentes retardantes da adsorção, e semelhantes. O mais preferencial- mente, a composição proporcionada deste modo, contém proteína de ORF2 de PCV2 recuperada do sobrenadante de células cultivadas in vitro, em que as células referidas foram infectadas com um vetor viral recombinante con- tendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2, e em que a referida cultura celular foi tratada com cerca de 2 a cerca de 8 mM de BEI, preferencialmente com cerca de 5 mM de BEI para inativr o vetor viral, e uma concentração equivalente de um agente de neutralização, prefe- rencialmente solução de tiossulfato de sódio, para uma concentração final de cerca de 2 a cerca de 8 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, de Carbopol, mais preferencialmente Carbopol 971P, preferencialmente em quantidades de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais pre- ferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose, e salina fisiológica, preferencialmente em uma quantidade de cer- ca de 50 a cerca de 90% (v/v), mais preferencialmente a cerca de 60 a 80% (v/v), ainda mais preferencialmente de cerca de 70% (v/v).

Portanto, um aspecto adicional refere-se a um método para pre- parar uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2 compreendendo as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanquean- tes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinan- te, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, prefe- rencialmente, na presença de cerca de 2 a cerca de 20 mM de BEI1 o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; ix) adicionar uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferencialmente, adicionar uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 0,5 a cerca de 20 mM, prefe- rencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI, x) adi- cionar uma quantidade adequada de um adjuvante, preferencialmente adicio- nar Carbopol, mais preferencialmente Carbopol 971P, ainda mais preferenci- almente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferen- cialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose); e xi) adicionar sa- lina fisiológica, preferencialmente em uma quantidade de cerca de 50 a cerca de 90% (v/v), mais preferencialmente a cerca de 60 a 80% (v/v), ainda mais preferencialmente de cerca de 70% (v/v). Opcionalmente, este método tam- bém pode incluir a adição de um protetor. Um protetor conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a um agente ativo antimicrobiológi- co, tal como, por exemplo, Gentamicina, Merthiolate, e semelhantes. Em par- ticular adicionar um protetor é mais preferencial para a preparação de uma composição multidose. Os agentes ativos antimicrobiológicos são adicionados em concentrações eficazes para prevenir a composição de interesse para qualquer contaminação microbiológica ou para inibição de qualquer cresci- mento microbiológico dentro da composição de interesse.

Além disso, este método também pode compreender a adição de qualquer agente estabilizante, tal como, por exemplo, sacarídeos, trealo- se, manitol, sacarose e semelhantes, para aumentar e/ou manter a vida útil do produto. No entanto, foi visto surpreendentemente, que a formulação re- sultante é imunologicamente eficaz por um período de no mínimo 24 meses, sem adicionar qualquer agente estabilizante adicional.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se aos produ- tos resultantes dos métodos conforme descrito acima. Em particular, a pre- sente invenção refere-se a uma composição de substância compreendendo proteína de 0RF2 de PCV2 expressada de modo recombinante. Além disso, a presente invenção também refere-se a uma composição de substância que compreende proteína de 0RF2 de PCV2 expressada de modo recombi- nante, recuperada do sobrenadante de uma cultura de células de inseto. Além disso, a presente invenção também refere-se a uma composição de substância compreendendo proteína de 0RF2 de PCV2 expressada de mo- do recombinante, recuperada do sobrenadante de uma cultura de células de inseto. Preferencialmente, esta composição de substância também compre- ende um agente adequado para a inativação de vetores virais. Preferenci- almente, o referido agente de inativação é BEI. Além disso, a presente in- venção também refere-se a uma composição de substância que compreen- de proteína de ORF2 de PCV2 expressada de modo recombinante, recupe- rada do sobrenadante de uma cultura de células de inseto, e compreende um agente, adequado para a inativação de vetores virais, preferencialmente BEI e um agente de neutralização para neutralização do agente de inativa- ção. Preferencialmente, o agente de neutralização é tiossulfato de sódio, quando se usa BEI como um agente de inativação.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogênica que induz uma reação imune e, mais prefe- rencialmente, confere imunidade protetora contra os sinais clínicos de infec- ção por PCV2. A composição geralmente compreende o polipeptídeo, ou um fragmento do mesmo, expressado por Estrutura de Leitura Aberta 2 (ORF2) de PCV2, como o componente antigênico da composição.

DNA e proteína de ORF2 de PCV2, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, para a preparação das composições e também conforme usado dentro dos processos proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, é um domínio altamente conservado dentro de isolados de PCV2 e deste modo, qualquer ORF2 de PCV2 seria eficaz como a fonte do DNA e/ou polipeptídeo de ORF2 de PCV conforme usado aqui, neste requerimento de patente. Uma proteína de ORF2 de PCV2 preferencial é a de SEQ ID N°. 11. Um polipeptídeo de ORF2 de PCV preferencial é propor- cionado aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID N°. 5, mas é entendido pelos versados na técnica que esta seqüência pode variar por tanto quanto 6 a 10% em homologia de seqüência e ainda conservar as ca- racterísticas antigênicas que a tornam útil em composições imunogênicas. As características antigênicas de uma composição imunológica pode ser, por exemplo, estimada pelo experimento de ataque conforme proporcionado pelo Exemplo 4. Além disso, a característica antigênica de um antígeno mo- dificado ainda é conservada, quando o antígeno modificado confere no mí- nimo 70%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90% da imuni- dade protetora comparado com a proteína ORF2 de PCV2, codificada pela seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Uma "composição imunogênica" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa uma proteína de ORF2 de PCV2 a qual provoca uma "rea- ção imunológica" no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou mediada por anticorpos para a proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, esta composição imunogênica tem a capacidade de conferir imunidade protetora contra infecção por PCV2 e os sinais clínicos associados com a mesma. Em algumas formas, porções imunogênicas de proteína de ORF2 de PCV2 são usados como o componente antigênico na composição. O termo "porção imunogênica" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere- se a formas truncadas e/ou substituídas, ou fragmentos de proteína e/ou polinucleotídeo de ORF2 de PCV2, respectivamente. Preferencialmente, as formas truncadas e/ou substituídas referidas, ou fragmentos compreenderão no mínimo 6 aminoácidos contíguos do polipeptídeo ORF2 de extensão to- tal. Mais preferencialmente, as formas truncadas ou substituídas, ou frag- mentos terão no mínimo 10, mais preferencialmente no mínimo 15, e ainda mais preferencialmente no mínimo 19 aminoácidos contíguos do polipeptí- deo ORF2 de extensão total. Duas seqüências preferenciais a este respeito são proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NOs. 9 e 10. É entendido adicionalmente que as seqüências referidas po- dem ser uma parte de fragmentos ou formas truncadas maiores. Um poli- peptídeo de ORF2 de PCV2 preferencial adicional proporcionado aqui, neste requerimento de patente, é codificada pelas seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Mas é entendido pelos versados na técnica que esta seqüência pode variar por tanto quanto 6 a 20% em homo- logia de seqüência e ainda conservar as características antigênicas que a tornam útil em composições imunogênicas. Em algumas formas, uma forma truncada ou substituída, ou fragmento de ORF2 é usada como o componen- te antigênico na composição. Preferencialmente, as formas truncadas ou substituídas referidas, ou fragmentos compreenderão no mínimo 18 nucleo- tídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos de ORF2 de extensão total, por exemplo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Mais preferencialmente, as formas truncadas ou substituídas, ou fragmentos terão no mínimo 30, mais preferencialmente no mínimo 45, e ainda mais preferencialmente no mínimo 57 nucleotídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos de ORF2 de extensão total, por exemplo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4.

"Identidade de Seqüência" como é conhecido na técnica refere-se a uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeo, a saber uma seqüência de referência e uma dada seqüência a ser comparada com a seqüência de referência. A iden- tidade de seqüência é determinada comparando a seqüência dada com a se- qüência de referência depois das seqüências terem sido alinhadas otimamen- te para produzir o maior grau de similaridade de seqüência, conforme deter- minada pela combinação entre filamentos das seqüências referidas. Em se- melhante alinhamento, a identidade de seqüência é determinada em uma ba- se de posição a posição, por exemplo, as seqüências são "idênticas" em uma posição em particular e nesta posição, os nucleotídeos ou resíduos aminoáci- dos são idênticos. O número total de semelhantes identidades de posição é em seguida dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos na se- qüência de referência para dar a% de identidade de seqüência. A identidade de seqüência pode ser prontamente calculada por meio de métodos conheci- dos, incluindo mas não limitados, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocom- puting: Informatics and Genome Projectsl Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, NewJersey (1994); Sequence Analy- sis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Inieiador, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cujos ensinamentos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Os métodos preferenciais para determinar a identidade de seqüência são designados para dar a maior combinação entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade de se- qüência são codificados em programas de computador disponíveis publica- mente os quais determinam a identidade de seqüência entre seqüências da- das. Exemplos de semelhantes programas incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1 ):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está disponível publicamente na NCBI e em outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Estes programas alinham otimamente se- qüências usando pesos de gap default de modo a produzir o maior nível de identidade de seqüência entre as seqüências dadas e de referência. Como uma ilustração, por meio de um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nu- cleotídeos tendo no mínimo, por exemplo, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de "identidade de seqüência" com uma seqüên- cia de nucleotídeos de referência, pretende-se que a seqüência de nucleotí- deos do polinucleotídeo dado seja idêntica à seqüência de referência exceto que a seqüência de polinucleotídeos dada pode incluir até 15, preferencial- mente até 10, ainda mais preferencialmente até 5 mutações ponto por cada 100 nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de referência. Em outras pa- lavras, em um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos tendo no mínimo 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de identidade com relação à seqüência de nucleotídeos de referência, até 15%, preferencialmente 10%, ainda mais preferencialmente 5% dos nucleotídeos na seqüência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos até 15%, preferencialmente 10%, ainda mais preferencialmente 5% do total de nucleotídeos na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Estas mutações da seqüência de referência podem ocorrer nas posições do terminal 5' ou 3' da seqüência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da se- qüência de referência. De modo análogo, por meio de um polipeptídeo tendo uma dada seqüência de aminoácidos tendo no mínimo, por exemplo, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de referência, pretende-se que a seqüência de aminoácidos dada do polipeptídeo seja idêntica à se- qüência de referência exceto que a dada seqüência de polipeptídeos pode incluir até 15, preferencialmente até 10, ainda mais preferencialmente até 5 aminoácidos alterações por cada 100 aminoácidos da seqüência de aminoá- cidos de referência. Em outras palavras, para obter uma dada seqüência de polipeptídeo tendo no mínimo 85%, preferencialmente 90%, ainda mais prefe- rencialmente 95% de identidade de seqüência com uma seqüência de amino- ácidos de referência, até 15%, preferencialmente até 10%, ainda mais prefe- rencialmente até 5% dos resíduos aminoácidos na seqüência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro aminoácido, ou uma série de aminoácidos até 15%, preferencialmente até 10%, ainda mais preferencial- mente até 5% do número total de resíduos aminoácidos na seqüência de refe- rência pode ser inserido na seqüência de referência. Estas alterações da se- qüência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou car- bóxi da seqüência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre as posições terminais, intercaladas quer individualmente entre resíduos na seqüência de referência ou no um ou mais grupos contíguos dentro da se- qüência de referência. Preferencialmente, posições de resíduos as quais não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. No en- tanto, substituições conservativas não são incluídas como uma combinação ao determinar a identidade de seqüência.

"Homologia de seqüência", conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, refere-se a um método para determina a relação de duas seqüências. Para determinar a homologia de seqüência, duas ou mais se- qüências são alinhadas otimamente, e caso necessário são introduzidos gaps. No entanto, em contraste com "identidade de seqüência", substituições de aminoácidos conservativas são contadas como uma combinação ao determi- nar a homologia de seqüência. Em outras palavras, para obter um polipeptí- deo ou polinucleotídeo tendo 95% de homologia de seqüência com uma se- qüência de referência, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencial- mente 95% dos resíduos aminoácidos ou nucleotídeos na seqüência de refe- rência devem combinar ou compreender uma substituição conservativa com outro aminoácido ou nucleotídeo, ou uma série de aminoácidos ou nucleotí- deos até 15%, preferencialmente até 10%, ainda mais preferencialmente até 5% do total de resíduos aminoácidos ou nucleotídeos, não incluindo substitui- ções conservativas, na seqüência de referência pode ser inserido na seqüên- cia de referência. Preferencialmente a seqüência homóloga compreende no mínimo um trecho de 50, ainda mais preferencialmente 100, ainda mais prefe- rencialmente 250, ainda mais preferencialmente 500 nucleotídeos.

Uma "substituição conservativa" refere-se à substituição de um resíduo aminoácido ou nucleotídeo com outro resíduo aminoácido ou nucle- otídeo tendo características ou propriedades similares incluindo tamanho, hidrofobicidade, e etc., de tal modo que a funcionalidade global não se alte- ra significativamente.

"Isolado" significa alterado "pela mão do homem" a partir de seu estado natural, isto é, se ocorre na natureza, foi alterado ou removido de sem ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou poli- peptídeo naturalmente presente em um organismo vivo não é "isolado," mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexisten- tes de seu estado natural é "isolado", conforme o termo é empregado aqui, neste requerimento de patente.

Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição imunogênica eficaz para reduzir a gravidade de sintomas clínicos associados com infecção por PCV2 compreendendo proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, a proteína de ORF2 de PCV2 é qual- quer uma destas, descritas acima. Preferencialmente, a referida proteína de ORF2 de PCV2 é

i) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11;

ii) qualquer polipeptídeo que é no mínimo 80% homólogo ao po- lipeptídeo de i),

iii) qualquer porção imunogênica dos polipeptídeos de i) e/ou ii)

iv) a porção imunogênica de iii), compreendendo no mínimo 10 aminoácidos contíguos incluídos nas seqüências de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11,

v) um polipeptídeo que é codificado por um DNA compreenden- do a seqüência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

vi) qualquer polipeptídeo que é codificado por um polinucleotí- deo que é no mínimo 80% homólogo ao polinucleotídeo de v),

vi) qualquer porção imunogênica dos polipeptídeos codificados pelo polinucleotídeo de v) e/ou vi)

viii) a porção imunogênica de vii), em que o polinucleotídeo codifi- cando para a referida porção imunogênica compreende no mínimo 30 nucleotí- deos contíguos incluídos nas seqüências de SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4.

Preferencialmente qualquer uma das porções imunogênicas terá as características imunogênica da proteína de ORF2 de PCV2 que é codifi- cada pela seqüência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. De acordo com um aspecto adicional, proteína de ORF2 de PCV2 é proporcionada na composição imunológica em um nível de inclusão de antígeno eficaz para induzir a reação imune desejada, a saber reduzindo a incidência dè ou reduzindo a gravidade de sinais clínicos resultantes de infecção por PCV2. Preferencialmente, o nível de inclusão da proteína de ORF2 de PCV2 é no mínimo 0,2 pg de antígeno/ml da composição imuno- gênica final (pg/ml), mais preferencialmente a partir de cerca de 0,2 a cerca de 400 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,3 a cerca de 200 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a cer- ca de 100 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,4 a cerca de 50 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a cerca de 30 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,6 a cerca de 15 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,75 a cerca de 8 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,0 a cerca de 6 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,3 a cerca de 3,0 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,4 a cerca de 2,5 ug/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,0 ug/ml, e o mais preferencialmente cerca de 1,6 pg/ml.

De acordo com um aspecto adicional, o nível de inclusão de an- tígeno de ORF2 é no mínimo 0,2 ug de proteína de ORF2 de PCV2, confor- me descrito acima, por dose da composição antigênica final (ug/dose), mais preferencialmente a partir de cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,3 a cerca de 200 ug/dose, a- inda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,4 a cerca de 50 ug/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,6 a cer- ca de 15 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,75 a cerca de 8 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,0 a cerca de 6 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,3 a cerca de 3,0 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,4 a cerca de 2,5 pg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,0 µg/dose, e o mais preferencialmente cerca de 1,6 µg/dose.

O polipeptídeo ORF2 de PCV2 usado em uma composição imu- nogênica de acordo com a presente invenção pode ser derivado de qualquer modo incluindo isolamento e purificação de ORF2 de PCV2, síntese de pro- teína de rotina, e metodologia recombinante. Métodos preferenciais para obter polipeptídeo ORF2 de PCV2 são descritos acima e também são pro- porcionados no Requerimento Serial de Patente dos Estados Unidos N°. 11/034.797, cujos ensinamentos e conteúdo são por este incorporados por meio de referência. Em resumo, células suscetíveis são infectadas com um vetor viral recombinante contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 de PCV2, polipeptídeo ORF2 de PCV2 é expressado pelo vírus recombinan- te, e o polipeptídeo ORF2 de PCV2 expressado é recuperado do sobrena- dante por filtração e inativado por qualquer método convencional, preferen- cialmente usando etilenimina binária, a qual é em seguida neutralizado para parar o processo de inativação.

Portanto, de acordo com um aspecto adicional a composição i- munogênica compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, e ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um baculovírus recombinante. Além disso, de acordo com um aspecto adicional, a composição imunogênica compreende i) qual- quer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descrito acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expres- sando a referida proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um bacu- lovírus recombinante, e iii) uma porção do sobrenadante da cultura celular.

De acordo com uma modalidade específica do processo de pro- dução e recuperação para proteína de ORF2 de PCV2, o sobrenadante da cultura celular é filtrado através de uma membrana tendo um tamanho de poro, preferencialmente entre cerca de 0,45 a 1 µm. Portanto, um aspecto adicional refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um baculovírus recombinante, e iii) uma porção da cultura celular; em que cerca de 90% dos componentes têm um tamanho menor do que 1 pm.

De'acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações des- critas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) e agente inativante para inativar o vetor viral recombinante preferencialmente BEI1 em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que 1 pm. Preferencialmente, BEI está presente em concentrações eficazes para inativar o baculovírus. Concentrações eficazes são descritas acima.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refe- re-se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da prote- ína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a refe- rida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativante para inativar o vetor viral recombinante preferencialmente BEI, e v) um agente de neutralização para parar a inativação mediada pleo agente inativante, em que cerca de 90% dos componentes i) to iii) têm um ' tamanho menor do que 1 pm. Preferencialmente, se o agente inativante for BEI, a referida composição compreende tiossulfato de sódio em quantida- des equivalentes a BEI.

O polipeptídeo é incorporado em uma composição que pode ser administrada a um animal suscetível a infecção por PCV2. Em formas prefe- renciais, a composição também pode incluir componentes adicionais de co- nhecimento dos versados na técnica (vide também Remington1S Pharmaceu- tical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). Adicionalmente, a com- posição pode incluir um ou mais veículos aceitáveis para uso veterinário. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "um veículo aceitável para uso veterinário" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dis- persão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, con- servantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agen- tes retardadores de adsorção, e semelhantes.

Em uma modalidade preferencial, a composição imunogênica compreende proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, preferencialmente em concentrações descritas acima como um com- ponente antigênico, o qual é misturado com um adjuvante, preferencialmen- te Carbopol, e salina fisiológica.

Os versados na técnica entenderão que a composição aqui, neste requerimento de patente, pode incorporar soluções estéreis injetáveis, fisiolo- gicamente aceitáveis conhecidas. Para preparar uma solução pronta-para-uso para injeção ou infusão parenteral, soluções isotônicas aquosas, tais como, por exemplo salina ou soluções de proteínas plasmáticas correspondentes estão prontamente disponíveis. Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da presente invenção podem incluir diluentes, agentes isotônicos, estabilizantes, ou adjuvantes. Diluentes podem incluir água, salina, dextrose, etanol, glicerol, e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes inclu- em albumina e sais de áldali de ácido tetracético de diamina de etileno, entre outros. Adjuvantes adequados são os descritos acima. O mais preferencial é o uso de Carbopol, em particular o uso de Carbopol 971P1 preferencialmente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose).

Portanto, a presente invenção também refere-se a uma composi- ção imunogênica que compreende i) quaquer uma das proteínas ORF2 de PCV2 descritas acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativante para inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente BEI, e v) um agen- te de neutralização para parar a inativação mediada pelo agente inativante, preferencialmente tiossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI; e vi) um adjuvante adequado, preferencialmente Carbopol 971, em quantidades descritas acima; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um ta- manho menor do que 1 μm. De acordo com um aspecto adicional, esta com- posição imunogênica adicional compreende um sal farmacêutico aceitável, preferencialmente um sal de fosfato em concentrações fisiologicamente acei- táveis. Preferencialmente, o pH da referida composição imunogênica é ajus- tada para um pH fisiológico, significando entre cerca de 6.5 e 7.5.

Portanto, a presente invenção também refere-se a uma compo- sição imunogênica compreende por um ml i) no mínimo 1,6 pg de proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, ii) no mínimo uma porção de baculovírus expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2 iii) uma porção da cultu- ra celular, iv) cerca de 2 a 8 mM de BEI, v) tiossulfato de sódio em quanti- dades equivalentes a BEI; e vi) cerca de 1 mg de Carbopol 971, e vii) sal de fosfato em uma concentração fisiologicamente aceitável; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que Ipmeo pH da referida composição imunogênica é ajustado para cerca de 6.5 a 7.5.

As composições imunogênicas podem incluir adicionalmente um ou mais agentes imunomoduladores adicionais tais como, por exemplo, in- terleucinas, interferons, ou outras citocinas. As composições imunogênicas também podem incluir Gentamicina e Merthiolate. Enquanto as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente in- venção podem ser prontamente determinadas pelo técnico versado, a pre- sente invenção contempla composições compreendendo a partir de cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante e preferencialmente cerca de 250 Mg/ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade preferencial, a presente invenção contempla composições de vacina compreendendo a partir de cerca de 1 ug/ml a cerca de 60 pg/ml de antibióticos, e mais prefe- rencialmente menos de cerca de 30 Mg/ml de antibióticos.

Portanto, a presente invenção também refere-se a uma compo- sição imunogênica que compreende i) quaquer uma das proteínas ORF2 de PCV2 descritas acima, preferencialmente em concentrações descritas aci- ma, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de 0RF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativan- te para inativar o vetor viral recombinante preferencialmente BEIj e v) um agente de neutralização para parar a inativação mediada pelo agente inati- vante, preferencialmente tiossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI; vi) um adjuvante adequado, preferencialmente Carbopol 971 em quan- tidades descritas acima; vii) uma concentração farmacêutica aceitável de um tampão de salina, preferencialmente de um sal de fosfato, e viii) um agente ativo antimicrobiológico; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que 1 μm.

Foi visto surpreendentemente que a composição imunogênica proporcionada deste modo compreende foi altamente estável por um período de 24 meses. Também foi visto que as composições imunogênicas proporcio- nadas deste modo, compreendendo proteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombinante, conforme proporcionado deste modo são muito eficazes para reduzir os sintomas clínicos associados com infecções por PCV2. Foi visto surpreendentemente que as composições imunogênicas compreendendo a proteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombinante conforme proporcionado deste modo, são mais eficazes do que uma composição imunogênica compreendendo o vírus de PCV2 inteiro em uma forma inativada, ou antígeno de ORF2 de PCV2 viral isolado. Em particu- lar, foi visto surpreendentemente, que a proteína de ORF2 de PCV2 expres- sada por baculovírus recombinante é eficaz em concentrações muito baixas, o que significa em concentrações até 0,25 pg/dose. Este potencial imunogênico elevado inesperado da proteína de ORF2 de PCV2 pode ser adicionalmente aumentado pela adição de Carbopol.

Um adicional aspecto refere-se a um recipiente compreendendo no mínimo uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, em que uma dose compreende no mínimo 2 pg de proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente 2 a 16 pg de proteína de ORF2 de PCV2. O recipiente referido pode compreender a partir de 1 até 250 doses da composição imunogênica, preferencialmente con- tém 1,10, 25, 50, 100, 150, 200, ou 250 doses da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, cada um dos recipientes compreendendo mais de uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 adicional compreende um agente ativo antimicrobiológico. Os agentes sãó, por exemplo, antibióticos incluindo Gentamicina e Merthiolate e semelhantes. Portanto, um aspecto da presente invenção refere-se a um recipiente que compreende de 1 a 250 doses da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2, em que uma dose compreende no mínimo 2 pg de proteína de ORF2 de PCV2, e Gentamicina e/ou Merthiolate, preferencial- mente a partir de cerca de 1 μg/ml a cerca de 60 μg/ml de antibióticos, e mais preferencialmente menos de cerca de 30 μg/ml.

Um adicional aspecto refere-se a um kit, compreendendo qual- quer um dos recipientes, descrito acima, e um manual de instruções, inclu- indo a informação para a aplicação intramuscular de no mínimo uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 em leitões para reduzir a gravidade dos sintomas clínicos associados com infecção por PCV2. Além disso, de acordo com um aspecto adicional, o manual de ins- truções referido compreende a informação de uma segunda ou adicional administração(s) de no mínimo uma dose da composição imunogênica de ORF2 de PCV2, em que a segunda administração ou qualquer administra- ção adicional é no mínimo 14 dias além da administração inicial ou qualquer administração anterior. Preferencialmente, o manual de instruções referido também inclui a informação, para administrar um estimulante imune. Prefe- rencialmente, o estimulante imune referida será administrado no mínimo duas vezes. Preferencialmente, no mínimo 3, mais preferencialmente no mínimo 5, e ainda mais preferencialmente no mínimo 7 dias estão entre a primeira e a segunda ou qualquer administração adicional do estimulante imune. Preferencialmente, o estimulante imune é administrado no mínimo 10 dias, preferencialmente 15, ainda mais preferencialmente 20, e ainda mais preferencialmente no mínimo 22 dias além da administração inicial da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2. Um estimulante imune preferencial é, por exemplo, hemocianina de keyhole Iimpet (KLH), preferencialmente emulsificada com adjuvante de Freund incompleto (K- LH/ICFA). No entanto, é entendido deste modo que também pode ser usado qualquer outro estimulante imune de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. "Estimulante imune" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa qualquer agente ou composição que pode díspar uma reação imune geral, preferencialmente sem iniciar ou aumentar uma reação imune específica, por exemplo, a reação imune contra um patógeno especí- fico. É adicionalmente instruído para administrar o estimulante imune em uma dose adequada. Além disso, o kit também pode compreender um reci- piente, incluindo no mínimo uma dose do estimulante imune, preferencial- mente uma dose de KLH, ou KLH/ICFA.

Além disso, também foi visto surpreendentemente que o potencial imunogênico das composições imunogênicas compreendendo proteína de ORF2 de PGV2 expressada por baculovírus récombinante, preferencialmente em combinação com Carbopol, pode ser adicionalmente reforçado pela admi- nistração da vacina IngeIVac PRRS MLV (vide o Exemplo 5). Os sinais clíni- cos de PCV2 e as manifestações da doença são bastante amplificados quan- do está presente infecção por PRRS. No entanto, as composições imunogêni- cas e as estratégias de vacinação conforme proporcionado deste modo redu- ziram muito este efeito, e mais do que o esperado. Em outras palavras, foi observado um efeito sinérgico inesperado quando animais, preferencialmente porcos, são tratados com qualquer uma das composições imunogênicas de ORF2 de PCV2, conforme proporcionado deste modo, e a vacina Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao kit conforme descrito acima, compreendendo a composição imunogênica de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo e o manual de ins- truções, em que o manual de instruções adicional inclui a informação para administrar a composição imunogênica de ORF2 de PCV2 junto, ou em tor- no da mesma hora, com uma composição imunogênica que compreende antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, preferencialmente antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina adjuvantado. Prefe- rencialmente, o antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Um adicional aspecto da presente invenção também refere-se a um kit compreendendo i) um recipiente contendo no mínimo uma dose de uma composição imunogênica de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, e ii) um recipiente contendo uma composição imunogênica com- preendendo antígeno de PRRS1 preferencialmente antígeno de PRRS adju- vantado. Preferencialmente o antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Mais preferencial- mente, o kit adicional compreende um manual de instruções, incluindo a in- formação para administrar ambas as composições farmacêuticas. Preferenci- almente, contém a informação que a composição contendo ORF2 de PCV2 é administrada temporalmente antes da composição contendo PRRS.

Um adicional aspecto, refere-se ao uso de qualquer uma das composições proporcionadas deste modo como um medicamento, preferen- cialmente como um medicamento veterinário, ainda mais preferencialmente como uma vacina. Além disso, a presente invenção também refere-se ao uso de qualquer uma das composições descritas aqui, neste requerimento de patente, para a preparação de um medicamento para reduzir a gravidade dos sintomas clínicos associados com infecção por PCV2. Preferencialmen- te, o medicamento é para a prevenção de uma infecção por PÇV2, ainda mais preferencialmente em leitões.

Um adicional aspecto refere-se a um método para (i) a preven- ção de uma infecção,. ou reinfecção com PCV2 ou (ii) a redução ou elimina- ção de sintomas clínicos causada por PCV2 em um sujeito, compreendendo administrar quaisquer das composições imunogênicas proporcionadas deste modo a um sujeito que necessite das mesmas. Preferencialmente, o sujeito é um porco. Preferencialmente, a composição imunogênica é administrada por via intramuscular. Preferencialmente, uma dose ou duas doses da com- posição imunogênica é/são administradas, em que uma dose preferencial- mente compreende no mínimo cerca de 2 pg de proteína de ORF2 de PCV2, ainda mais preferencialmente cerca de 2 a cerca de 16 pg, e no mí- nimo cerca de 0,1 a cerca de 5 mg de Carbopol, preferencialmente cerca de 1 mg de Carbopol. Um aspecto adicional refere-se ao método de tratamento conforme descrito acima, em que uma segunda aplicação da composição imunogênica é administrada. Preferencialmente, a segunda administração é feita com a mesma composição imunogênica, preferencialmente tendo a mesma quantidade de proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente a se- gunda administração também é feita por via intramuscular. Preferencialmen- te, a segunda administração é feita no mínimo 14 dias além da administra- ção inicial, ainda mais preferencialmente no mínimo 4 semanas além da administração inicial.

De acordo com um aspecto adicional, o método de tratamento também compreende a administração de um estimulante imune. Preferencial- mente, o referido estimulante imune é administrado no mínimo duas vezes. Pre- ferencialmente, no mínimo 3, mais preferencialmente no mínimo 5 dias, ainda mais preferencialmente no mínimo 7 dias são entre a primeira e a segunda ad- ministração do estimulante imune. Preferencialmente, o estimulante imune é administrado no mínimo 10 dias, preferencialmente 15, ainda mais preferenci- almente 20, ainda mais preferencialmente no mínimo 22 dias além da adminis- tração inicial da composição imunogênica de ORF2 de PCV2. Um estimulante imune preferencial é, por exemplo, é hemocianina de keyhole Iimpet(KLH), ain- da preferencialmente emulsificado com adjuvante de Freund incompleto (K- LH/ICFA). No entanto, é entendido deste modo que qualquer outro estimulante imune de conhecimento de uma pessoa versada na técnica também pode ser usado. Está dentro do conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica como administrar o estimulante imune em uma dose adequada.

De acordo com um aspecto adicional, o método de tratamentos descrito acima também compreende a administração de antígeno PRRS. Preferencialmente, o antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porci- na é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Preferencialmente, o referido antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é adminis- trado temporalmente além da administração da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção pro- porciona uma vacina de combinação multivalente a qual inclui um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou diminuir a gravidade da infecção por PCV2, e no mínimo um componente ativo imunogênico contra outro organismo causador de doença em suíno.

Em particular, o agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por PCV2 é um antígeno de PCV2. Prefe- rencialmente, o antígeno de PCV2 referido é uma proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, ou qualquer composição imunogênica conforme descrito acima, que compreende proteína de ORF2 de PCV2.

No entanto, é entendido deste modo que um antígeno de PCV2 também refere-se a qualquer composição de substância que compreende no mínimo um antígeno que pode induzir, estimular ou reforçar a reação i- mune contra infecção por PCV2, quando administrado a um porco. Prefe- rencialmente, o referido antígeno de PCV2 é o vírus de PCV2 inteiro, prefe- rencialmente em uma forma inativada, um vírus de PCV2 vivo modificado ou atenuado, um vírus quimérico que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imunogênica de PCV2, qualquer outro polipeptídeo ou com- ponente que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imu- nogênica de PCV2. Os termos "proteína imunogênica", "polipeptídeo imuno- gênico" ou "seqüência de aminoácidos imunogênica" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a qualquer seqüência de aminoá- cidos a qual provoca uma reação imune em um hospedeiro contra um pató- geno compreendendo a referida proteína imunogênica, polipeptídeo imuno- gênico ou seqüência de aminoácidos imunogênica. Uma "proteína imunogê- nica", "polipeptídeo imunogênico" ou "seqüência de aminoácidos imunogê- nica" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui a seqüên- cia de extensão total de quaisquer proteínas, análogos das mesmas, ou fragmentos imunogênicos das mesmas. Por "fragmento imunogênico" se indica um fragmento de uma proteína a qual inclui um ou mais epítopos e deste modo provoca a reação imunológica contra o patógeno relevante. Os fragmentos referidos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos de conhecimento geral na técnica. Vid por exemplo, Epitope Mapping Protocole in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sinteti- zando simultaneamente grandes números de peptídeos sobre suportes sóli- dos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, e rea- gir os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão fixados aos suportes. As técnicas referidas são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nº. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immu- nol. 23:709-715. Similarmente, epítopos conformacionais são prontamente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos tais co- mo, por exemplo, por cristalografia de raios-x e ressonância magnética nucle- ar bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Anti- genos sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, poliepíto- pos, epítopos flanqueantes, e outros antígenos recombinantes ou derivados sinteticamente. Vide, por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Genebra, Suíça, 28 de junho a 3 de julho de 1998.

De acordo com adicional modalidade, qualquer antígeno de PCV-2 é Ingelvac® CircoFLEX®, (Boehringer Ingelheim Vetmedica lnc, St Joseph, MO, EUA), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, France), CircoVent (Inter- vet Inc., Millsboro, DE, EUA), ou Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, EUA).

Uma "reação imunológica ou imune" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou media- da por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "re- ação imune" inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células T yd, dirigidas especifica- mente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de in- teresse. Preferencialmente, o hospedeiro apresentará ou uma reação imuno- lógica terapêutica ou protetora tal que a resistência a nova infecção será re- forçada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. Semelhante prote- ção será demonstratada ou por uma redução olu falta dos sintomas associa- dos com infecções do hospedeiro conforme descrito acima.

Preferencialmente, o outro organismo causador de doença em suíno é selecionado entre o grupo consistindo em: Actinobacillus pleurop- neumonia (1); Adenovírus (2); Alphavírus tais como o Vírus da Encefalomie- lite Eqüina Oriental (3); Bordetella bronchiseptica (4); Brachyspira spp. (5), preferencialmente B. hyodyentheriae (6); B. piosicoli (7), Brucella suis, prefe- rencialmente biovars 1, 2, e 3 (8); vírus da febre suína clássica (9); Clostridi- um spp. (10), preferencialmente Cl. difficile (11), Cl. perfringens tipos A, B, e C (12), Cl. novyi (13), Cl.septicum (14), Cl. tetani (15); Coronavirus (16), pre- ferencialmente Corona vírus Respiratório Porcino (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20); Haemophilus parasuis, preferencialmente subtipos 1, 7 e 14 (21) vírus da encefalomielite hemaglutinante (22); Vírus da Encefalite Japonesa (23); Lawsonia intracellu- laris(24) Leptospira spp. (25), preferencialmente Leptospira australis (26); Leptospira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icteroha- emorrhagicae (29); e Leptospira interrogans (30); Leptospira pomona (31); Leptospira tarassovi (32); Mycobacterium spp. (33) preferencialmente M. avium (34), M. intracellulare (35) e M.bovis (36); Mycoplasma hyopneumoni- ae (M hyo) (37) Pasteurella multocida (38); Porcine cytomegalovirus (39); Porcine Parvovirus (40); Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Por- cina (PRRS) (41) Pseudorabies vírus (42); Rotavírus (43); Salmonella spp. (44), preferencialmente S. thyhimurium (45) e S. choleraesuis (46); Staph. hyicus (47); Staphylococcus spp. (48) preferencialmente Streptococcus spp. (49), preferencialmente Strep. suis (50); herpes vírus suíno (51); Vírus da Influenza suína (52); pox vírus suíno (53); pox vírus suíno (54); Vírus da es- tomatite Vesicular (55); Vírus do exantema vesicular de suíno (56); Leptospi- ra Hardjo (57); e/ou Mycoplasma hyosynoviae (58).

Qualquer referência feita em conexão com um patógeno suíno a seguir pode ser feita nomeando o patógeno, por exemplo, M. hyo, ou fazendo referência ao número entre parênteses após o patógeno, que é encontrado a- cima. Por exemplo, pode ser feita referência a M. hyo por M. hyo ou por (37).

Portanto, a presente invenção refere-se a uma vacina de combina- ção para o tratamento e/ou a profilaxia de suíno, que inclui um agente imunoló- gico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por PCV2, preferencialmente um antígeno de PCV2, e adicionalmente um compo- nente ativo imunológico eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas por qualquer um dos patógenos suínos (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) e/ou (58), ou é um componente ativo imunológico do referi- do um ou mais patógenos suínos, [combo 1].

Um "componente ativo imunológico" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa um componente que induz ou estimula a reação imune em um animal ao qual o componente referido é administrado. De acordo com uma modalidade preferencial, a reação imune referida é diri- gida para o componente referido ou para um microorganismo compreen- dendo o componente referido. De acordo com uma modalidade preferencial adicional, o componente ativo imunológico é um microorganismo atenuado, incluindo vírus vivo modificado (MLV), um microorganismo morto ou no mí- nimo uma parte ativa imunológica de um microorganismo.

"Parte ativa imunológica de um microorganismo" conforme usa- do aqui, neste requerimento de patente, significa uma fração de um micro- organismo contendo proteína, açúcar, e ou glicoproteína que compreende no mínimo um antígeno que induz ou estimula a reação imune em um ani- mal ao qual o componente referido é administrado. De acordo com uma modalidade preferencial, a reação imune referida é dirigida para a parte ati- va imunológica referida de um microorganismo ou para um microorganismo compreendendo a parte ativa imunológica referida.

Preferencialmente o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causa- das pelo patógeno suíno (41) ou é um componente ativo imunológico do pa- tógeno suíno (41).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [cómbo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (37) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (37).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (1) ou é um componente ativo imunoló- gico do patógeno suíno (1).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (7) ou é um componente ativo imunoló- gico do patógeno suíno (7).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (24) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (24).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (38) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (38).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (21) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (40) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (40).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (2) ou é um componente ativo imunoló- gico do patógeno suíno (2).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (44) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (44).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (50) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (50).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (19), preferencialmente (20) e/ou (21) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (19), preferenci- almente (20) e/ou (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelo patógeno suíno (22) ou é um componente ativo imuno- lógico do patógeno suíno (22).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (41) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (41) e (37).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1 ] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (1) e (41), ou é um componente ati- vo imunológico dos patógenos suínos (1) e (41).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1 ] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (1) e (37), ou é um componente ati- vo imunológico dos patógenos suínos (1) e (37).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos, (1) (41) e (37), ou é um componen- te ativo imunológico dos patógenos suínos), (1), (41) e (37). Em uma forma preferencial, esta combinação é adjuvantada com Carbopol.

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (1) e (21), ou é um componente ati- vo imunológico dos patógenos suínos (1) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (21) e (41), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (41).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (21) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (37).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (21) e (38), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (38).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos .patógenos suínos (7) e (19), ou é um componente ati- vo imunológico dos patógenos suínos (7) e (19).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (38) e (33), preferencialmente (34), (35) e/ou (36), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (38) e (33) preferencialmente (34), (35) e/ou (36).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) preferen- cialmente (50), e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) pre- ferencialmente (50), (20) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) pre- ferencialmente (50), (20) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20), (33) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) (33) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) (33) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suí- nos (49), preferencialmente (50), (20), (38), (33) e (21).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (41), (40), e (19), ou é um compo- nente ativo imunológico dos patógenos suínos (41), (40), e (19).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (38), (4), e (19), ou é um componen- te ativo imunológico dos patógenos suínos (38), (4), e (19).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (38), (4), (21), e (19), ou é um com- ponente ativo imunológico dos patógenos suínos (38), (4), (21) e (19).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (20), preferencialmente, (20), (31) e (38), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (20), (31), (38).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (5), preferencialmente, (5) e (24), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (5), e (24).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (1), preferencialmente, (1), e (5), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1), e (5).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (41), preferencialmente, (40), (27), (28), (29), (31), (19) e (59), ou é um componente ativo imunológico dos pa- tógenos suínos (41), (40), (27), (28), (29), (31), (19) e (57).

De acordo com outro aspecto, o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infec- ções causadas pelos patógenos suínos (6), preferencialmente, (6), (19), (38) e (58) ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1), e (5).

De acordo com aspecto adicional, o componente ativo imunoló- gico adicional da vacina de combinação é selecionado entre o grupo consis- tindo em Enterisol® lleitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC1 Ingelvac® AR4, Ingel- vac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, In- gelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE1 Reprocyc® PLE, Tetguard®, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parsius, (todas da Boehrin- ger Ingelheim, St. Joseph, MO, EUA); Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Poreilis Glasser, Poreilis Parvo, Poreilis Poreoli DF, Por- cilis APP, Poreilis AR-T, Poreilis AR-T DF, Poreilis Porcoli, Poreilis Poreoli Dilu- vac forte, Poreilis PRRS, Poreilis Poreol 5, Poreilis Aujeszky, Poreilis Begonia Diluvac, Poreilis Begonia I.D.A.L., Poreilis Begonia Unisole, Poreilis M. hyo, Poreilis Atrinord, Myeo Silencer® BPM, Myeo Silencer® BPME, Myeo Silen- cer® ME, Myeo Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® ΒΡΕ, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® Ell, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® com Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG- Emune® Rota com Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG- Emune® com Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, Ma- GESTic® com Spur®, MaGESTic® 7 com Spur®, MaGESTic® 8 com Spur®, End-FLUence® com Imugen® II, End-FLUence® 2, PRRomiSE®, PRV- Begonia com Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® com I- mugen® II,-Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (to- das da Intervet Inc., Millsboro, DE, EUA); Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Par- voruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- (todas da Merial LTD, Duluth, GA); ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®' ER BAC® Leptoferm-5®, Farrowsure®, Farrowsure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE®, FLUSURE® RTU, FLUSURE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE®/ER BAC PLus®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLU- SURE®/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSURED/RespiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSU- RE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE®/RESPISURE 1 ONE®, FLUSU- RE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stel- lamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure®, Respisure 1 ONE®, Respisure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (formerly known como Baypamune), Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm-5DDParvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®- Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plus® (todas da Pfizer Inc., New York, NY, EUA); Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha + Diluent, Suvaxyn Aujeszky Bartha + o/w, Suvaxyn Au- jeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Suvaxyn® EC-4, Su- vaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® Ε-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot (todas da Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, EUA (Wyeth); SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMU- NE®-CR, AR-PAC®-PD+ER, AR-PARAPAC®fER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Excell®3, MaxiVac® H1N1, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, Maxi- Vac®^+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen®, Gletvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax plus, M-ParapacDSS PAC® (todas da Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, EUA); AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLÀSSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC- PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (todas da Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Espanha); Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 (todas da IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau1 Alemanha); Mypra- vac Suis, (Albrecht GmbH, Alemanha); Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P1 Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield® TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD1 Clostratox® C1 Clostra- tox® Ultra C 1300, Porcine EcolizeKÊ) 3 + C, Porcine Pili Shield ®+C, Porcine Pili Shield DPoreine Ecolizer® 3, Ery SerumpEry Shield®Ery Vae Oral, Ery Shield® +L5, PanSTAR® Ery, Erycell®Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, Pneu- moSTAR® Myeo, Lepto Shield® 5, Myeo Shield®Salmo Shield® 2, Salmo Shi- eld® Live, Amitox Tet®C. Perfingens Type A Toxoid (todas da Novartis Animal Health, Basel, Suíça); Nitro-Sal (Akro); ou qualquer antígeno o qual é incluído nas composições descritas acima. Alternativamente, quando antígeno PCV2 já está presente em qualquer uma destas vacinas, (i) antígeno PCV2, confor- me descrito aqui, neste requerimento de patente, é adicionado a qualquer um destas composições/antígenos, ou (ii) o antígeno PCV2 presente em qualquer uma destas vacinas é substituído pelo antígeno PCV2, conforme descrito a- qui, neste requerimento de patente.

Formulações

Um importante apecto da presente invenção é a preparação da uma ou mais vacinas de combinação. A pessoa versada na técnica conhece componentes adicionais os quais podem ser compreendidos na composição referida (vide também Remington1S Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). O especialista pode usar soluções estéreis injetáveis, fisiologicamente aceitáveis, conhecidas. Para preparar uma solução pronta para uso para injeção ou infusão parenteral, soluções isotônicas aquosas, tais como, por exemplo salina ou soluções de proteínas plasmáticas correspon- dentes, estão prontamente disponíveis. As composições farmacêuticas po- dem estar presentes como Iiofilisados ou preparações a seco, as quais podem ser reconstituídas com uma solução injetável conhecida diretamente antes do uso sob condições estéreis, por exemplo como um kit de partes.

Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da pre- sente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "um veículo veteriná- rio aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retar- dantes da adsorção, e semelhantes.

Dilúentes podem incluir água, salina, dextrose, etanol, glicerol, e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina e sais de álcali de ácido de tetracético de diamina de etileno, entre outros.

Adjuvantes preferenciais são aqueles conforme descrito acima. As composições imunogênicas podem incluir adicionalmente um ou mais a- gentes imunomoduladores diversos tais como, por exemplo, interleucinas, interferons, ou outras citocinas. As composições imunogênicas também po- dem incluir Gentamicina e Merthiolate. Enquanto as quantidades e concentra- ções de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelo técnico versado, a presente invenção con- templa composições compreendendo a partir de cerca de 50 ug a cerca de 2000 ug de adjuvante e preferencialmente cerca de 250 ug/ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade preferencial, a presente inven- ção contempla composições de vacina compreendendo a partir de cerca de 1 ug/ml a cerca de 60 ug/ml de antibióticos, e mais preferencialmente menos de cerca de 30 ug/ml de antibióticos.

De acordo com uma adicional modalidade a vacina de combina- ção é primeiro desidratada. Se a composição for primeiro liofilizada ou desi- dratada por outros métodos, então, antes da vacinação, a composição refe- rida é reidratada em soluções aquosas (por exemplo, salina, PBS (salina tamponada com fosfato)) ou não aquosas (por exemplo, emulsão em óleo (óleo mineral, ou à base de óleo vegetal/metabolizável/à base de emulsão única ou dupla), à base de alumínio, adjuvante à base de carbômero). Dosagem e administração

De acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de uma vacina de combinação administrada a porcos proporciona imunidade eficaz contra infecções microbiológicas causadas por PCV2 e no mínimo um patógeno adicional conforme listado acima. Combinações preferenciais de antígenos para o tratamento e a profilaxia de doenças microbiológicas em porcos são listadas acima.

De acordo com uma modalidade adicional, a vacina de combina- ção é administrada a porcos em uma ou duas doses em um intervalo de cerca de 2 a 4 semanas. Por exemplo, a primeira administração é realizada quando o animal é cerca de 2 a 3 semanas a cerca de 8 semanas de idade. A segun- da administração é realizada cerca de 1 a cerca de 4 semanas depois da pri- meira administração da primeira vacinação. De acordo com uma adicional modalidade, revacinação é realizada em um intervalo de 3 a 12 meses depois da administração da segunda dose. A administração de doses de vacina sub- seqüentes é feita preferencialmente em uma base de 6 meses a anual. Em outra modalidade preferencial, animais vacinados antes da idade de cerca de 2 a 3 semanas devem ser revacinados. A administração de doses de vacina subseqüentes é feita preferencialmente em uma base anual.

A quantidade de vacina de combinação que é eficaz depende dos ingredientes da vacina e do esquema de administração. Tipicamente, quando um vírus inativadõ ou uma preparação de vírus vivo modificado é usada na vacina de combinação, uma quantidade da vacina contendo cerca de 102 a cerca de 109 TCID50 por dose, preferencialmente cerca de 103 a cerca de 108 TCID50 por dose, mais preferencialmente, cerca de 104 a cerca de 108 TCID50 por dose. Em geral, antígeno inativadõ é normalmente usado em quantidades maiores do que vírus modificados vivos. Tipicamente, quan- do se usa antígeno bacteriano na vacina de combinação, a vacina contendo uma quantidade de cerca de 103 a cerca de 109 unidades formadores de colônia (CFU) por dose, preferencialmente, cerca de 104 a cerca de 108 (CFU) por dose, mais preferencialmente cerca de 105 a cerca de 106 (CFU) por dose. Vacinas em subunidade são normalmente administradas com um nível de inclusão de antígeno de no mínimo 0,2 pg antígeno por dose, prefe- rencialmente com cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/dose, ainda mais prefe- rencialmente com cerca de 0,3 a cerca de 200 pg/dose, ainda mais prefe- rencialmente com cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, ainda mais prefe- rencialmente com cerca de 0,4 a cerca de 50 pg/dose, ainda mais preferen- cialmente com cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/dose, ainda mais preferenci- almente com cerca de 0,6 a cerca de 15 pg/dose, ainda mais preferencial- mente com cerca de 0,75 a cerca de 8 pg/dose, ainda mais preferencial- mente com cerca de 1,0 a cerca de 6 pg/dose, e ainda mais preferencial- mente com cerca de 1,3 a cerca de 3,0 pg/dose. Por exemplo, o nível de inclusão de antígeno do antígeno de ORF2 de PCV, preferencialmente da proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, contém cerca de 2 pg a cerca de 150 pg, preferencialmente cerca de 2 pg a cerca de 60 pg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 pg a cerca de 50 pg, a - inda mais preferencialmente cerca de 2 pg a cerca de 40 pg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 pg a cerca de 30 pg, ainda mais preferencial- mente cerca de 2 pg a cerca de 25 pg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 pg a cerca de 20 pg, ainda mais preferencialmente cerca de 4 pg a cerca de 20 pg, e ainda mais preferencialmente cerca de 4 pg á cerca de 16 pg. No caso de vacinas de combinação que incluem (37), é preferencial u- sar no mínimo 1 a 10 logs, mais preferencialmente, 5 a 10 logs, e o mais preferencialmente, 6 a 8 logs. No caso de vacinas de combinação que inclu- em (41), é preferencial usar no mínimo 1 a 10 logs, mais preferencialmente, 3 a 1Ó logs, e o mais preferencialmente, 5 a 6 logs.

A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada por via intradérmica, por via intratraqueal, ou por via intravaginal. a composição preferencialmente pode ser aplicada por via intramuscular ou por via intra- nasal. Em um corpo animal, pode-se comprovar vantajoso aplicar as com- posições farmacêuticas conforme descrito acima através de uma injeção intravenosa ou por injeção direta em tecidos alvo. Para aplicação sistêmica, são preferenciais as vias intravenosa, intravascular, intramuscular, intrana- sal, intra-arterial, intraperitoneal, oral, ou intratecal. Uma aplicação mais lo- cal pode ser realizada por via subcutânea, por via intradérmica, por via intra- cutânea, intracardialmente, intralobalmente, intramedularmente, por via in- trapulmonar ou diretamente dentro ou próximo do tecido a ser tratado (teci- do conjuntivo, ósseo, muscular, nervoso, epitelial). Dependendo da duração desejada e da eficácia do tratamento, as composições de acordo com a in- venção podem ser administradas uma vez ou várias vezes, também de mo- do intermitente, por exemplo, em uma base diária por vários dias, semanas ou meses, e em diferentes dosagens.

Métodos para tratamento

Ainda outra modalidade importante da invenção é um método para a profilaxia ou o tratamento de doenças causadas por PCV2, e um ou mais microorganismos patogênicos suínos, em que um antígeno de PCV2, preferencialmente uma proteína de 0RF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, e componentes ativos imunológicos adicionais eficazes para o tratamento e/oü a profilaxia da infecção causada pelo referido microorga- nismo patogênico suíno adicional são administrados a um animal que ne- cessite dos mesmos em uma dosagem adequada. De acordo com um as- pecto adicional, a referida proteína de ORF2 de PCV2, é parte de uma com- posição antigênica, conforme descrito acima. Portanto, ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a uma vacina de combinação que compre- ende qualquer uma das composições antigênicas proporcionadas deste mo- do e que compreende proteína de ORF2 de PCV2, e outro componente ati- vo imunológico eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de uma infecção causada pelo outro microorganismo patogênico suíno referido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um fluxograma esquemático de uma construção pre- ferencial de ORF2 de PCV2 baculovírus recombinante; e

As figuras 2a e 2b são cada uma um fluxograma esquemático de como produzir uma composição de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

Os exemplos seguintes estabelecem materiais e procedimentos preferenciais de acordo com a presente invenção. Deve ser entendido, no entanto, que estes exemplos são proporcionados a título de ilustração so- mente, e nada nos mesmos deve ser considerado umà limitação no âmbito geral da invenção.

EXEMPLO 1

Este exemplo compara as produções relativas de ORF2 usando métodos da presente invenção com métodos que são conhecidos na técnica anterior. Quatro frascos de spinner de 1000 mL foram cada um semeados com aproximadamente 1,0x106 células Sf+/ml em 300 mL de meio livre de soro de inseto', Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS). A cultura celular principal é identificada como estoque celular principal Master Cell Stock SF+ (Spodoptera frugiperda) Master Cell Stock, passagem 19, Lote N°. N112-095W. As células usadas para gerar o Master Cell Stock SF+ fo- ram obtidas da Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT. A linhagem celular SF+ para este exemplo foi confinada entre as passagens 19 e 59. Outras passagens funcionarão para os fins da presente invenção, mas de modo a escalar o processo até produção em larga escala, provavelmente no mínimo 19 passagens serão necessárias e passagens além de 59 podem ter um efeito sobre a expressão, embora isto não tenha sido investigado. Em mais detalhes, as culturas celulares SF+ iniciais de armazenamento de ni- trogênio líquido foram cultivadas em meio Excell 420 em suspensão dentro de frascos de spinner estéreis com constante agitação. As culturas foram cultivadas dentor de frascos de spinner de 100 mL a 250 mL com 25 a 150 mL de meio sem soro Excell 420. Quando as células tinham sido multiplica- das para uma densidade celular de 1,0 a 8,0 χ 106 células/mL, foram dividi- das para novos recipientes com uma densidade de plantio de 0,5 a 1,5 χ 106 células/mL. Culturas de expansão subseqüentes foram cultivadas dentro de frascos de spinner até 36 litros de tamanho ou em biorreatores de aço inoxi- dável de até 300 litros por um período de 2 a 7 dias em 25 a 29°C.

Depois da semeadura, os frascos foram incubados em 27°C por quatro horas. Subseqüentemente, cada frasco foi semeado com um baculo- vírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 (SEQ ID NO: 4). O ba- culovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 foi gerado como se segue: o gene ORF2 de PCV2 de uma cepa Norte Americana de PCV2 foi amplificado por PCR para conter uma seqüência de Kozak 5' (SEQ ID NO: 1) e um sítio 3' EcoRI (SEQ ID NO: 2), clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, Madison, Wl). Em seguida, foi em seguida excisado subclonado no vetor de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Die- go, CA). A porção subclonada é representada aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NO: 7. O plasmídeo pVL1392 contendo o gene ORF2 de PCV2 foi designado N47-064Y e em seguida co-transfectado com DNA de baculovírus BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) em células de inseto Sf+ (Protein Sciences, Meriden1 CT) para gerar o baculovírus recom- binante contendo o gene 0RF2 de PCV2. O novo constructo é proporciona- do aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NO: 8. O baculovírus recombinante contendo o gene 0RF2 de PCV2 foi purificado por placa e vírus de semente principal Master Seed Virus (MSV) foi propagado sobre a linhagem celular SF+, dividido em alíquotas, e armazenado em -70°C. O MSV foi identificado positivamente como baculovírus de ORF2 de PCV2 por PCR-RFLP usando iniciadores específicos para baculovírus. Células de in- setos infectadas com baculovírus de ORF2 de PCV2 para gerar MSV ou vírus de semente de trabalho (WSV, Working Seed Virus) expressam antí- geno de 0RF2 de PCV2 conforme detectado por soro policlonal ou anticor- pos monoclonais em um teste de anticorpos fluorescentes indiretos. Adicio- nalmente, a identidade do baculovírus de 0RF2 de PCV2 foi confirmada por seqüenciamento de aminoácidos de N-terminal. O baculovírus de 0RF2 de PCV2 MSV também foi testado para pureza de acordo com 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28, e 113.55. Cada baculovírus recombinante semeado dentro dos frascos de spinner tiveram multiplicidades de infecção (MOIs) variáveis. O frasco 1 foi semeado com 7,52 mL de semente de 0,088 MOI; o frasco 2 foi semeado com 3,01 mL de semente de 0,36 MOI; o frasco 3 foi semeado com 1,5 mL de semente de 0,18 MOI; e o frasco 4 foi semeado com 0,75 mL de semente de 0,09 MOI. Um fluxograma esquemático ilustrando as e- tapas básicas usadas para construir um baculovírus recombinante de ORF2 de PCV2 é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, na figura 1.

Depois de serem semeados com o baculovírus, os frascos foram em seguida incubados em 27 ± 2°C por 7 dias e também foram agitados em 100 rpm durante este tempo. Os frascos usaram tampas ventiladas para permi- tir o fluxo de ar. Amostras de cada frasco foram tomadas a cada 24 horas pelos 7 dias seguintes. Depois da extração, cada amostra foi centrifugada, e tnato o pélete quanto o sobrenadante foram separados e em seguida microfiltrados através de uma membrana de 0,45 a 1,0 μm de tamanho de poro.

As amostras resultantes em seguida tiveram a quantidade de ORF2 presenté dentro destas quantificadas através de um ensaio ELISA. O ensaio ELISA foi conduzido com anticorpo de capturo suíno anti-PCV2 Pab IgG Prot. G purificado (diluído a 1:250 em PBS) diluído para 1:6000 e, 0,05 M de tampão de Carbonato (pH 9.6). 100 pL do anticorpo foram em seguida colocados nas cavidades da placa de microtitulação, selado, e incubado de um dia para o outro em 37°C. A placa foi em seguida lavada três vezes com uma solução de lavagem a qual consistiu de 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL de 10X D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) e 899,5 mL de água destilada. Subseqüentemente, 250 pL de uma solução de bloqueio (5 g de leite em pó sem gordura Carnation Non-fat (Nestle, Glenda- le, CA) em 10 mL de D-PBS QS para 100 mL com água destilada) foi adi- cionado a cada uma das cavidades. A etapa seguinte foi lavar a placa de teste e em seguida adicionar antígeno pré-diluído. O antígeno pré-diluído foi produzido adicionando 200 pL de solução de diluente (0,5 mL de Tween 20 em 999,5 mL de D-PBS) a cada uma das cavidades sobre uma placa de diluição. A amostra foi em seguida diluída em uma proporção a 1:240 e uma proporção a 1:480, e 100 pL de cada uma destas amostras de diluídas foi em seguida adicionado a uma das cavidades superiores sobre a placa de diluição (isto é, uma cavidade superior recebeu 100 pL da diluição a 1:240 e a outra recebeu 100 pL da diluição a 1:480). Em seguida foram feitas dilui- ções seriais para o restante da placa removendo 100 pL de cada cavidade sucessiva e transferindo isto para a cavidade seguinte sobre a placa. Cada cavidade foi misturada antes de fazer a transferência seguinte. A lavagem da placa de teste incluiu lavar a placa três vezes com o tampão de lavagem. A placa foi em seguida selada e incubada por uma hora em 37°C antes de ser lavada três vezes mais com o tampão de lavagem. O anticorpo de de- tecção usado foi anticorpo monoclonal para ORF2 de PCV. Foi diluído para 1:300 em solução de diluente, e 100 pL do anticorpo de detecção diluído foi em seguida adicionado às cavidades. A placa foi em seguida selada e incu- bada por uma hora em 37°C antes de ser lavada três vezes com o tampão de lavagem. Conjugado de diluente foi em seguida preparado adicionando soro de coelho normal (Jackson lmmunoresearch, West Grove, PA) à solu- ção de diluente até concentração de 1%. Conjugado de anticorpo de cabra anticamundongo (H+I)-HRP (Jackson lmmunoresearch) foi diluído no conju- gado de diluente para 1:10.000. 100 μL do conjugado de anticorpo diluído foram em seguida adicionados a cada uma das cavidades. A placa foi em seguida selada e incubada por 45 minutos em 37°C antes de ser lavada três vezes com o tampão de lavagem. 100 μL de substrato (TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD), mis- turados com um volume igual de Substrato de Peroxidase B (KPL) foram adicionados a cada uma das cavidades. A placa foi incubada em temperatu- ra ambiente por 15 minutos. 100 pL de solução a 1 N de HCL foi em seguida adicionado a todas as cavidades para parar a reação. A placa foi em segui- da passada através de uma leitora ELISA. Os resultados deste teste são proporcionados na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1

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Estes resultados indicam que quando o tempo de incubação é prolongado, a expressão de ORF2 no sobrenadante das células centrifuga- das e meio é maior do que a expressão no pélete das células centrifugadas e meio. Por conseguinte, deixar a expressão de ORF2 prosseguir por no mínimo 5 dias e recuperar a mesma no sobrenadante ao invés de deixar a expressão prosseguir por menos de 5 dias e recuperar ORF2 das células, proporciona um grande aumento nas produções de ORF2, e uma melhora significativa em relação aos métodos anteriores.

EXEMPLO 2

Este exemplo proporciona dados quanto à eficácia da invenção

reivindicada aqui, neste requerimento de patente. Um frasco de spinner de 1000 mL foi semeado com aproximadamente 1,0x106 células Sf+/ml em 300 mL de meio Excell 420. O frasco foi em seguida incubado em 27°C e agita- do a 100 rpm. Subseqüentemente, o frasco foi semeado com 10 mL de se- mente de vírus ORF2 de PCV2/Bac p+6 (o baculovírus recombinante con- tendo o gene ORF2 de PCV2 passado 6 vezes adicionais nas células de inseto Sf9) com uma MOI de 0,1 depois de 24 horas de incubação.

O frasco foi em seguida incubado em 27°C por um total de 6 dias. Depois da incubação, o frasco foi em seguida centrifugado e três a- mostras do sobrenadante resultante foram colhidas e inativadas. O sobre- nadante foi inativado trazendo sua temperatura para 37 ± 2°C. À primeira amostra, uma solução a 0,4 M de bromidreto de 2-bromoetilenoamina o qual tinha sido ciclizado para 0,2 M de etilenimina binária (BEI) em 0,3 N de Na- OH é adicionado ao sobrenadante para dar uma concentração final de BEI de 5 mM. À segunda amostra, 10 mM de BEI foi adicionado ao sobrenadan- te. À terceira amostra, não foi adicionada BEI ao sobrenadante. As amostras foram em seguida agitadas continuamente por 48 horas. Uma solução a 1,0 M de tiossulfato de sódio para dar uma concentração mínima final de 5 mM foi adicionada para neutralizar qualquer BEI residual. A quantidade de ORF2 em cada amostra foi em seguida quantificada usando o mesmo procedimen- to do ensaio ELISA conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados deste podem ser vistos na Tabela 2 abaixo:

Tabela 2

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Este exemplo demonstra que a neutralização com BEI não re- move ou degrada quantidades significativas do produto de proteína recom- binante de ORF2 de PCV2. Isto é evidenciado pelo fato de que não há grande perda de ORF2 no sobrenadante a partir da BEI ou temperaturas elevadas. Os versados na técnica reconhecerão que o 0RF2 recuperado é um produto protéico estável.

EXEMPLO 3

Este exemplo demonstra que a presente invenção é escalável a partir de produção em pequena escala de 0RF2 de PCV2 recombinante até produção em larga escala de ORF2 de PCV2 recombinant. 5,0 χ 105 célu- las/ml de células SF+/ml em 7000 mL de meio ExCeII 420 foi plantado em um biorreator Applikon Bioreactor de 20000 mL. O meio e as células foram em seguida incubados em 27°C e agitados a 100 RPM pelas próximas 68 horas. Na 68a hora, 41,3 mL de Baculovírus de ORF2 de PCV2 MSV+3 foi adicionado a 7000 mL de meio ExCeII 420. A mistura resultante foi em se- guida adicionada ao biorreator. Pelos próximos sete dias, a mistura foi incu- bada em 27°C e agitada a 100 RPM. Amostras do biorreator foram extraídas a cada 24 horas iniciando no dia 4, pós-infecção, e cada amostra foi centri- fugada. O sobrenadante das amostras foram preservados e a quantidade de ORF2 foi em seguida quantificada usando densitometria SDS-PAGE. Os resultados disto podem ser visto na Tabela 3 abaixo:

Tabela 3

<table>table see original document page 86</column></row><table> EXEMPLO 4

Este exemplo testa a eficácia de sete vacinas candidatas de PCV2 e adicionalmente define os parâmetros de eficácia depois de exposi- ção a uma cepa virulenta de PCV2. Cento e oito (108) leitões privados de colostro paridos por cesárea (CDCD), de 9 a 14 dias de idade, foram dividi- dos aleatoriamente em 9 grupos de tamanho igual. A Tabela 4 estabelece o Design do Estudo Geral para este Exemplo.

Tabela 4. Desian do Estudo Geral

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada.

Sete dos grupos (Grupos 1 a 7) receberam doses de polipeptí- deo ORF2 de PCV2, um dos grupos agiu como um controle de ataque e não recebeu ORF2 de PCV2, e outro grupo agiu como o grupo controle negativo estrito e também não recebeu ORF2 de PCV2. No Dia 0, os Grupos 1 a 7 foram tratados com as vacinas atribuídas. Aos leitões no Grupo 7 foi admi- nistrado um tratamento de reforço no Dia 14. Os leitões foram observados para eventos adversos e reações no sítio de injeção depois da vacinação e no Dia 19, os leitões foram movidos para o segundo sítio de estudo. No se- gundo sítio de estudo, os Grupos 1 a 8 foram alojados em grupo em uma construção enquanto o Grupo 9 foi alojado em uma construção separada. Todos os porcos receberam hemocianina de keyhole Iimpet (KLH)/adjuvante de Freund incompleto (ICFA) nos Dias 21 e 27 e no Dia 24, os Grupos 1 a 8 foram testados com um PCV2 virulento.

Pré- e pós-ataque, foram coletadas amostras de sangue para sorologia de PCV2. Pós-ataque, foram coletados dados do peso corporal para determinação do ganho de peso diário médio (ADWG), e sintomas clí- nicos, bem como amostras de esfregaço nasal para determinar eliminação nasal de PCV2. No Dia 49, todos oo porcos sobreviventes foram necropsia- dos, os pulmões foram classificados para lesões, e tecidos selecionados foram preservados em formalina para experimentação por Imuno- histoquímica (IHC) em uma data posterior.

Materiais e Métodos

Este foi um estudo-cego parcialmente da viabilidade do ataque de vacinação conduzido em porcos CDCD1 9 a 14 dias de idade no Dia 0. Para serem incluídas no estudo, os títulos de PCV2 IFA das porcas foram < 1:1000. Adicionalmente, o estado sorológico das porcas foram de um rebanho PRRS- negativo conhecido. Vinte e oito (28) porcas foram testadas para estado soro- lógico de PCV2. Quatorze (14) porcas tiveram um título de PCV2 de < 1000 e foram transferidas para o primeiro sítio de estudo. Cento e dez (110) leitões foram paridos por cirurgias por corte cesareana e estavam disponíveis para este estudo no Dia -4. No Dia -3, 108 porcos CDCD no primeiro sítio de estu- do foram pesados, identificados com etiquetas de orelha, bloqueados por pe- so e atribuídos aleatoriamente a 1 de 9 groups, conforme determinado acima na tabela 4. Se qualquer animal de teste satisfazendo os critérios de inclusão foi registrado no estudo e foi posteriormente excluído por qualquer razão, o Investigador e o Monitor consultado de modo a determinar o uso de dados coletados do animal na análise final. A data de quais leitões registrados foram estudados e a razão para a exclusão foi documentada. Inicialmente, nenhuma das porcas foi excluídas. Um total de 108 de 110 porcos disponíveis foi atribu- ído aleatoriamente a um de 9 grupos no Dia -3. Os dois menores porcos (No. 17 e 19) não foram atribuídos a um grupo e estavam disponíveis como extras, caso necessário. Durante o curso do estudo, foram removidos vários animais. O Porco 82 (Grupo 9) no Dia -1, o Porco N°. 56 (Grupo 6) no Dia 3, o Porco N°. 53 (Grupo 9) no Dia 4, o Porco N°. 28 (Grupo 8) no Dia 8, o Porco N°. 69 (Grupo 8) no Dia 7, e o Porco N°. 93 (Grupo 4) no Dia 9, foram cada um en- contrados mortos antes do ataque. Estes seis porcos não foram incluídos nos resultados do estudo final. O Porco no 17 (um dos porcos extras) foi atribuído ao Grupo 9. O porco extra restante, N°. 19, foi excluído do estudo.

As formulações administrada a cada um dos grupos foram como se segue: o Grupo 1 foi designado para administrar 1 ml de ORF2 viral (vORF2) contendo 16 pg de ORF2/ml. Isto foi feito misturando 10,24 ml de 15 ORF2 viral (256 pg/25 Mg/ml = 10,24 ml de vORF2) com 3,2 ml de Carbopol a 0,5% e 2,56 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto pro- duziu 16 ml de formulação para o grupo 1. O Grupo 2 foi designado para ad- ministrar 1 ml de vORF2 contendo 8 pg de vORF2/ml. Isto foi feito misturando 5,12 ml de vORF2 (128 Mg/25 pg/ml = 5,12 ml de vORF2) com 3,2 ml de Car- bopol a 0,5% e 7,68 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 16 ml de formulação para o grupo 2. O Grupo 3 foi designado para administrar 1 ml de vORF2 contendo 4 pg de vORF2/ml. Isto foi feito mis- turando 2.56 ml de vQRF2 (64 μς/25 pg/ml = 2,56 ml de vORF2) com 3,2 ml de Carbopol a 0,5% e 10,24 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 16 ml de formulação para o grupo 3. O Grupo 4 foi de- signado para administrar 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) contendo 16 Mg de rORF2/ml. Isto foi feito misturando 2,23 ml de rORF2 (512 μς/230 pg/ml = 2,23 ml de rORF2) com 6,4 ml de Carbopol a 0,5% e 23,37 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação 30 para o grupo 4. O Grupo 5 foi designado para administrar 1 ml de rORF2 con- tendo 8 Mg de rORF2/ml. Isto foi feito misturando 1,11 ml de rORF2 (256 Mg/230 Mg/ml = 1,11 ml de rORF2) com 6,4 ml de Carbopol a 0,5% e 24,49 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação para o grupo 5. O Grupo 6 foi designado para administrar 1 ml de rORF2 contendo 8 pg de rORF2/ml. Isto foi feito misturando 0,56 ml de rORF2 (128 μg/230 pg/ml = 0,56 ml de rORF2) com 6,4 ml de 0,5% de Carbopol e 25,04 ml de salina tamponada com fosfato a um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação para o grupo 6. O Grupo 7 foi designado para administrar 2 ml de vacina de célula morta inteira de PCV2 (PCV2 KV) contendo a MAX PCV2 KV. Isto foi feito misturando 56 ml de PCV2 KV com 14 ml de Carbopol a 0,5%. Isto produziu 70 ml de formulação para o grupo 7. Finalmente, o gru- po 8 foi designado para administrar KLH a 0,5 pg/ml ou 1,0 Mg/ml por dose de 2ml. Isto foi feito misturando 40,71 ml de KLH (7,0 pg de proteína/ml a 0,5 μ g/ml = 570 ml (7,0 pg/ml) (x) = (0,5) (570 ml)), 244,29 ml de salina tampona- da com fosfato a um pH de 7.4, e 285 ml de adjuvante de Freund. A Tabela 5 descreve as janelas de tempo para as atividades chave deste Exemplo.

Tabela 5. Atividades do Estudo

<table>table see original document page 90</column></row><table> Coletadas amostras de sangue e de esfregaço nasal de todos os porcos; Pesados todos os porcos; Necropsia de todos os porcos; Lesões ma- croscópicas observadas com ênfase posta em icterícia e úlceras gástri- cas; Pulmões avaliados para lesões; Amostras de tecido fresco e fixado em formalina preservadas; Fase in-life do estudo completada

Depois do completamento da fase in-life do estudo, tecidos fixa- dos em formalina foram examinados por Imuno-histoquímica (IHC) para de- tecção de antígeno de PCV2 por um patologista, as amostras de sangue foram avaliadas para sorologia por PCV2, amostras de esfregaço nasal fo- ram avaliadas para eliminação de PCV2, e foi determinado o ganho de peso diário médio (ADWG) do Dia 24 ao Dia 49.

Os animais foram alojados no primeiro sítio de estudo dentro de gaiolas individuais em cinco ambientes a partir do nascimento até aproxima- damente 11 dias de idade (aproximadamente Dia O do estudo). Cada ambi- ente foi idêntico ém disposição e consistiu de gaiolas de aço inoxidável indi- viduais empilhadas com ar aquecido e filtrado suprido separadamente a ca- da unidade de isolamento. Cada ambiente tinha calor e ventilação separa- dos, deste modo evitando a contaminação cruzada do ar entre os ambien- tes. Os animais foram alojados em duas construções diferentes no segundo sítio de estudo. O Grupo 9 (O grupo controle Estrito negativo) foi alojados separadamente em uma construção de acabamento convertida e os Grupos 1 a 8 foram alojados em construção de criadouro convertido. Cada grupo foi alojado em uma pocilga separada (11 a 12 porcos por pocilga) e cada pocil- ga proporcionou aproximadamente 0,28 m2 (3,0 pés quadrados) por porco. Cada pocilga estava sobre um piso elevado com pisos feito de ripas de plás- tico. Um buraco abaixo das pocilgas serviu como um tanque de contenção para excremento e resíduos. Cada construção tinha seus próprios sistemas de aquecimento e ventilação separados, com pouca probabilidade de con- taminação cruzada de ar entre as construções.

No primeiro sítio de estudo, os leitões foram alimentados com uma ração de leite especialmente formulada a partir do nascimento até a - proximadamente 3 semanas de idade. Todos os leitões estavam consumin- do ração sólida, misturada especial pelo Dia 19 (aproximadamente 4 Vz se- manas de idade). No segundo sítio de estudo, todos os leitões foram alimen- tados com uma ração de mistura comercial não-medicada customizada a- propriada para sua idade e peso, à vontade. Água em ambos os sítios de estudo também estava disponível à vontade.

Todos os porcos de teste foram tratados com Vitamina E no Dia -2, com injeções de ferro no Dia -1 e com NAXCEL® (1,0 ml_, IM, em pernas alter- nadas) nos Dias 16, 17, 18 e 19. Além disso, o Porco N°. 52 (Grupo 9) foi trata- do com uma injeção de ferro no Dia 3, o Porco 45 (Grupo 6) foi tratado com uma injeção de ferro no Dia 11, o Porco N0. 69 (Grupo 8) foi tratado com NAX- CEL® no Dia 6, o Porco N°. 74 (Grupo 3) foi tratado com dexametazona e peni- cilina no Dia 14, e o Porco N°. 51 (Grupo 1) foi tratado com dexametazona e penicilina no Dia 13 e com NAXCEL® no Dia 14 por várias razões de saúde.

Enquanto em ambos os sítios de estudo, os porcos estavam sob cuidados veterinários. Foram conduzidos exames de saúde dos animal no Dia 0 e foram registrados no Formulário do Registro do Exame de Saúde (Health E- xamination Record Form). Todos os animais estavam em bom estado de saúde e nutricional antes da vacinação conforme determinado por observação no Dia 0. Foi observado que todos os animais de teste estavam em bom estado de saúde e nutricional antes do ataque. As carcaças e os tecidos foram descarta- dos derretendo. A disposição final dos animais do estudo foi registrada no Re- gistro de Disposição Animal (Animal Disposition Record).

No Dia 0, os porcos atribuídos aos Grupos 1 a 6 receberam 1,0 mL de PCV2 Vacinas 1-6, respectivamente, IM na região esquerda do pes- coço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ Vz". Porcos atribuídos ao Grupo 7 receberam 2,0 mL de PCV2 Va- cina N°. 7 IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ Vz". No Dia 14, os porcos atribuídos ao Grupo 7 receberam 2,0 mL de PCV2 Vacina N°. 7 IM na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ Vz".

No Dia 21 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de K- LH/ICFA IM na região da perna direita usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g x1". No Dia 27 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA na região da perna esquerda usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ 1".

No Dia 24, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 8 receberam 1,0 mL de material de ataque de PCV2 ISUVDL (5,11 Iog10 TCID50/mL) IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ 1". Um adicional de 1,0 mL do mesmo mate- rial foi administrado IN a cada porco (0,5 mL por narina) usando uma serin- ga estéril de 3,0 mL Luer-Iock e cânula nasal.

Os porcos de teste foram observados diariamente para saúde global e eventos adversos no Dia -4 e do Dia 0 ao Dia 19. As observações foram registradas no Registro de Observações Clínicas. Todos os porcos de teste foram observados do Dia 0 ao Dia 7, e o Grupo 7 foi observado adicio- nalmente do Dia 14 ao 21, para reações no sítio de injeção. Foi determinado o ganho de peso diário médio pesando cada porco em uma balança calibra- da nos Dias -3, 24 e 49, ou no dia que um porco foi encontrado morto de- pois do ataque. Os pesos corporais foram registrados no Formulário de Pe- so Corporal (Body Weight Form). Os pesos corporais do Dia -3 foram utili- zados para bloquear os porcos antes da randomização. Os dados de peso do Dia 24 e do Dia 49 foram utilizados para determinar o ganho de peso diá- rio médio (ADWG) para cada porco durante testes pontos do tempo. Para porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 49, o ADWG foi ajus- tado para representar o ADWG do Dia 24 até o dia da morte.

De modo a determinar a sorologia de PCV2, sangue total veno- so foi colhido de cada leitão do seio venoso orbital nos Dias -3 e 14. Para cada leitão, foi colhido sandue do seio venoso orbital inserindo um tubo ca- pilar estéril dentro do canto mediai de um dos olhos e drenando aproxima- damente 3,0 mL de sangue total para um tubo separador de soro (Serum Separator Tube, SST) de 4,0 mL. Nos Dias 24, 31, e 49, sangue total veno- so de cada porco foi coletado da cava vena anterior usando uma agulha es- téril de 18 g χ 1 Yztt Vacutainer (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), um suporte de agulha Vacutainer e um tubo separador de soro SST de 13 mL. As coletas de sangue em cada ponto de tempo fo- ram registradas sobre o Relatório de Coleta de Amostra (Sample Collection Record). O sangue em cada tubo separador de soro foi deixado para coagu- lar, cada tubo separador de soro foi em seguida centrifugado e o soro colhi- do. O soro colhido foi transferido para um tubo de encaixe de pressão estéril e armazenado a -70 ± 10°C até ser testado em uma data posterior. As a- mostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos de PCV2 pela equipe de BIVI-R&D.

Os porcos foram observados uma vez ao dia do Dia 20 ao Dia 49 para sintomas clínicos e as observações clínicas foram registradas no Registro de Observações Clínicas.

Para testar a eliminação nasal de PCV2, nos Dias 24, 25, e em seguida a cada segundo dia ímpar do estudo até e incluindo o Dia 49, um es- fregaço de dácron estéril foi inserido por via intra nasal quer dentro da narina esquerda quer da direita de cada porco (um esfregaço por porco) tão assetica- mente quanto possível, girado rapidamente por uns poucos segundos e em se- guida removido. Cada esfregaço foi em seguida colocado dentro de um único tubo de tampa de encaixe de pressão estéril contendo 1,0 mL de meio EMEM com 2% de IFBS, 500 unidades/mL de Penicilina, 500 pg/mL de Estreptomicina e 2,5 pg/mL de Fungizone. O esfregaço foi cortado dentro do tubo, e o tubo de encaixe de pressão foi selado e etiquetado apropriadamente com número do animal, número do estudo, data de coleta, dia do estudo e "esfregaço nasal." Os tubos de encaixe de pressão selados foram armazenados a -40 ± 10°C até serem transportados de um dia para o outro sobre gelo para BIVI-St. Joseph. As coletas de esfregaço nasal foram registradas no Formulário de Coleta de Amostra de Esfregaço Nasal (Nasal Swab Sample Collection Form). BIVI-R&D conduziu teste de isolamento viral quantitativo (VI) para PCV2 sobre amostras de esfregaço nasal. Os resultados foram expressados em valores de log10. Um valor de 1,3 log ou menos foi considerado negativo e qualquer valor maior do que 1,3 logs foi considerado positivo.

Porcos que morreram (Nos. 28, 52, 56, 69, 82, e 93) no primeiro sítio de estudo foram necropsiados ao nível necessário para determinar um diagnóstico. Lesões macroscópicas foram registradas e não foram conser- vados tecidos destes porcos. No segundo sítio de estudo, os porcos que morreram antes do Dia 49 (Nos. 45, 23, 58, 35), os porcos encontrados mor- tos no Dia 49 antes da eutanásia (Nos. 2, 43) e os porcos eutanizados no Dia 49 foram necrópsiados. Foram observadas quaisquer lesões macroscópicas e as percentagens de lobos pulmonares com lesões foram registradas no

Formulário do Relatório de Necropsia.

De cada um dos 103 porcos necropsiados no segundo local de estudo, uma amostra de tecido da amídala, pulmonar, de coração, do fíga- do, linfonodós mesentéricos, rins e linfonodos inguinais foi colocada dentro de um único recipiente com 10% de formalina tamponada; enquanto outra amostra de tecido dos mesmos órgãos supracitados foi colocado em um Whirl-pak (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) e cada Whirl-pak foi colocado sobre gelo. Cada recipiente foi adequadamente rotulado. As coletas de amostras foram registradas no Formulário do Relatório de Ne- cropsia (Necropsy Report Form). Depois disso, amostras de tecido fixadas com formalina e um Formulário de Solicitação de Diagnóstico (Diagnostic Request Form) foram submetidas à experimentação por IHC. A experimen- tação por IHC foi conduzida de acordo com procedimentos laboratoriais ISU de rotina para técnicas de recebimento de amostras, preparação de amostra e placa, e de tingimento. Tecidos frescos em Whirl-paks foram despachados com sacos de gelo para o Monitor do Estudo para armazenamento (-70° ± 10°C) e possível uso futuro. Tecidos fixados com formalina foram examina- dos por um patologista para detecção de PCV2 por IHC e classificados u- sando o seguinte sistema de classificação: 0 = Nenhuma; 1 = Tingimento positivo insuficiente, poucos sítios; 2 = Tingimento positivo moderado, múlti- plos sítios; e 3 = Abundante tingimento positivo, difuso por todo o tecido. Devido ao fato de que o patologista não pode diferenciar positivamente Iin- fonodo inguinal de Iinfonodo mesentérico, os resultados para estes tecidos foram simpesmente etiquetados como Linfonodo e o escore dado ao maior escore para cada um dos dois tecidos por animal.

Resultados

Os resultados para este exemplo são dados abaixo. Observa-se que um porco do Grupo 9 morreu antes do Dia 0, e 5 porcos mais morreram depois da vacinação (1 porco do Grupo 4; 1 porco do Grupo 6; 2 porcos do Grupo 8; e 1 porco do Grupo 9). Exame pós-morte indicou que todos os seis morreram devido a infecções subjacentes que não foram associadas com vacinação ou PMWS. Adicionalmente, não foram observados eventos ad- versos ou reações no sítio de injeção com quaisquer grupos.

Os resultados do ganho de peso diário médio (ADWG) são a- presentados abaixo na Tabela 6. O Grupo 9, o grupo controle estrito negati- vo, teve o maior ADWG [0,48 ± 0,08 Kg/dia (1,06 ±0,17 Ib/dia), seguido pelo Grupo 5 [0,43 ±0,10 Kg/dia (0,94 ± 0,22 Ib/dia)], o qual recebeu uma dose de 8 pg de rORF2. O Grupo 3, o qual recebeu uma dose de 4 pg de vORF2, teve o menor ADWG [0,22 + 0,09 Kg/dia (0,49 ± 0,21 Ib/dia)], seguido pelo Grupo 7 [0,23 + 0,07 Kg/dia (0,50 ±0,15 Ib/dia)], o qual recebeu 2 doses de vacina de vírus morto.

Tabela 6. Sumário do Ganho de Peso Diário Médio por Grupo (ADWG)

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada.

Os resultados da sorologia de PCV2 são apresentados abaixo na Tabela 7. Todos os nove grupos foram soronegativos para PCV2 no Dia - 3. No Dia 14, Grupos recebendo vacinas de vORF2 tiveram os maiores títu- los, os quais variaram de 187,5 a 529,2. Porcos recebendo vacina de vírus morto tiveram os maiores títulos seguintes, seguidos pelos grupos receben- do vacinas de rORF2. Os Grupos 8 e 9 permaneceram soronegativos neste momento. No Dia 24 e Dia 31, porcos recebendo vacinas de vORF2 conti- nuaram a demonstrar uma forte resposta sorológica, seguidos de perto pelo grupo que recébeu duas doses de uma vacina de vírus morto. Porcos rece- bendo vacinas de rORF2 foram mais lentos para responder sorologicamente e os Grupos 8 e 9 continuaram a permanecer soronegativos. No Dia 49, porcos recebendo vacina de vORF2, 2 doses da vacina de vírus morto e a menor dose de rORF2 demonstrarm as respostas sorológicas mais fortes. Porcos recebendo 16 pg e 8 pg de vacinas de rORF2 tiveram títulos de IFA ligeiramente maiores do que os controles de ataque. O Grupo 9 no Dia 49 demonstrou uma forte resposta sorológica.

Tabela 7. Sumário dos Títulos de PCV2 IFA por Grupo TÍTULO IFA MÉDIO

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vORF2 = 0RF2 viral isolado; rORF2 = 0RF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

*Para fins de cálculo, um título IFA £100 foi designado como um título de "50"; um título IFA >6400 foi designado como um título de "12.800" **Dia de Ataque ***Dia de Necropsia

Os resultados das observações clínicas pós-ataque são apresenta- dos abaixo na Tabela 8. Este sumário de resultados inclui observações para Compormentao Anormal, Respiração Anormal, Tosse e Diarréia. A Tabela 9 inclui os resultados do Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos por Grupo e a Tabela 10 inclui resultados do Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-ataque por Grupo. O sintoma clínico mais comum observado neste estudo foi comportamento anormal, o qual foi classificado como letargia branda a gra- ve. Porcos recebendo as 2 menores doses de vORF2, porcos recebendo 16 Mg de rORF2 e porcos recebendo 2 doses de vacina KV tiveram taxas de incidên- cia de £ 27,3%. Porcos recebendo 8 pg de rORF2 e o grupo controle estrito ne- gativo não teve comportamento anormal. Nenhum dos porcos neste estudo demonstrou qualquer respiração anormal. Não foi observada tosse freqüente- mente em todos os grupos (0 a 25%), assim como diarréia (0 a 20%). Nenhum dos sintomas clínicos mencionados foram patognômicos para PMWS.

A incidência global de sintomas clínicos variou entre os grupos. Grupos recebendo quaisquer das vacinas de vORF2, o grupo recebendo 16 Mg de rORF2, o grupo recebendo 2 doses de vacina KV e o grupo controle de ataque teve a maior incidência de sintomas clínicos globais (£36,4%). O grupo controle estrito negativo, o grupo recebendo 8 pg de rORF2 e o grupo recebendo 4 pg de rORF2 teve taxas de incidência global de sintomas clíni- cos de 0%, 8,3% e 9,1%, respectivamente.

As taxas de mortalidade globais entre os grupos variou da mes- ma forma. O grupo recebendo 2 doses de vacina KV teve a maior taxa de mortalidade (16,7%); enquanto grupos que receberam 4 pg de vORF2, 16 pg de rORF2, ou 8 pg de rORF2 e o grupo controle estrito negativo todo te- ve taxas de mortalidade de 0%.

Tabela 8. Sumário das Observações para Comportamento Anormal, Respi- ração Anormal. Tosse, e Diarréia por Grupo

<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table>

vORF2 = 0RF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus

recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

1 Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer compor- tamento anormal por no mínimo um dia

2Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer respira- ção anormal por no mínimo um dia

3Número total de porcos em cada grupo que demonstrou uma tosse por no mínimo um dia

4Número total de porcos em cada grupo que demonstrou diarréia por no mí- nimo um dia

Tabela 9. Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos por Grupo

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

1Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer sintoma clínico por no mínimo um dia

Tabela 10. Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-ataque por Grupo

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Os resultados da eliminação nasal de PCV2 são apresentados a- baixo na Tabela 11. Depois do ataque no Dia 24, 1 porco no Grupo 7 começa a eliminação de PCV2 no Dia 27. Nenhum dos outros grupos experimentou elimi- nação até o Dia 33. O volume de eliminação nasal foi observado do Dia 35 ao Dia 45. Grupos recebendo qualquer uma das três vacinas de vORF2 e os gru- pos recebendo ou 4 ou 8 pg de rORF2 tiveram a menor incidência de elimina- ção nasal de PCV2 (< 9,1%). O grupo controle de ataque (Grupo 8) teve a mai- or taxa de eliminação (80%), seguido prlo grupo controle estrito negativo (Grupo 9), o qual teve uma taxa de incidência de 63,6%.

Tabela 11. Sumário da Incidência de Eliminação Nasal de PCV2 por Grupo

<table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

O Sumário da Incidência de Icterícia por Grupo, da Incidência de Úlceras Gástricas por Grupo, os Escores de Lesões Pulmonares Médias por Grupo, e da Incidência de Lesões Pulmonares por Grupo são mostrados abaixo na Tabela 12. Seis porcos morreram no primeiro sítio de teste duran- te a fase de pós-vacinação do estudo (Grupo 4, N=1; o Grupo 6, N=1; o Grupo 8, N=2; o Grupo 9, N=2). Quatro de seis porcos tiveram lesões fibri- nosas em uma ou mais cavidades corporais, um porco (Grupo 6) teve le- sões consistentes com doença clostridial, e um porco (Grupo 9) não teve lesões macroscópicas. Nenhum dos porcos que morreu durante a fase pós- vacinação do estudo teve lesões consistentes com PMWS.

Porcos que morreram pós-ataque e porcos eutanizados no Dia 49 foram necropsiados. Na necropsia, icterícia e úlceras gástricas não esta- vam presentes em qualquer grupo. Com respeito a % média de lesões pul- monares, o Grupo 9 teve a menor% média de lesões pulmonares (0%), se- guido pelo Grupo 1 com 0,40 ± 0,50% e o Grupo 5 com 0,68 ±1,15%. Os Grupos 2, 3, 7 e 8 tiveram a maior% média de lesões pulmonares (≥7,27%). Cada um destes quatro grupos continha um porco com% de lesões pulmo- nares ≥71,5%, os quais desviaram os resultados maiores para estes quatro grupos. Com a exceção do Grupo 9 com 0% de lesões pulmonares obser- vadas, os 8 grupos restantes tiveram ≤36% de lesões pulmonares. Quase todas as lesões pulmonares observadas foram descritas como verme- lhas/púrpura e consolidadas.

Tabela 12. Sumário da Incidência de Icterícia por Grupo, da Incidência de Úlceras Gástricas por Grupo,% Média de Escores de Lesões Pulmonares por Grupo, e da Incidência de Lesões Pulmonares Mencionadas por Grupo <table>table see original document page 102</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

O Sumário dos Resultados da Incidência IHC Positiva por Grupo são mostrados na Tabela 13. O Grupo 1 (vORF2 -16 μg) e o Grupo 5 (rORF2 - 8 ug) tiveram a menor taxa de resultados IHC positivos (16,7%). O Grupo 8 (Controles de Ataque) e o Grupo 9 (Controles Estritos Negativos) tiveram a mai- or taxa de resultados IHC positivos, 90% e 90,9%, respectivamente.

Tabela 13. Sumário da Taxa de Incidência IHC Positiva por Grupo

<table>table see original document page 102</column></row><table> vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Pós-ataque, o Grupo 5, o qual recebeu uma dose de 8 μς de antígeno rORF2, teve melhor performance do que os outros 6 grupos de vacina. O Grupo 5 teve o maior ADWG [0,43 ±0,10 kg/dia (0,94 ± 0,22 lb/dia)], a menor incidência de comportamento anormal (0%), a segunda menor incidência de tosse (8,3%), a menor incidência de sintomas clínicos globais (8,3%), a menor taxa de mortalidade (0%), a menor taxa de elimina- ção nasal de PCV2 (8,3%), a segunda menor taxa para% média de lesões pulmonares (0,68 ± 1,15%) e a menor taxa de incidência para tecidos positi- vos (16,7%). Os grupos recebendo vários níveis de antígeno rORF2 global tiveram melhor performance do que os grupos recebendo vários níveis de vORF2 e o grupo recebendo 2 doses de vacina de PCV2 de célula inteira morta tiveram o pior desempenho. As Tabelas 14 e 15 contém sumários dos dados pós-ataque por grupo.

Tabela 14. Sumário dos Dados Pós-Ataque por Grupo - Parte 1

<table>table see original document page 103</column></row><table> <table>table see original document page 104</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Tabela 15. Sumário dos Dados Pós-Ataque por Grupo - Parte 2

<table>table see original document page 104</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Os resultados deste estudo indicam que todos os esforços de vacina adicionais devem se focalizar em uma vacina de rORF2. Além de tudo, eliminação nasal de PCV2 foi detectado pós-ataque e vacinação com uma vacina de PCV2 resultou em uma redução da eliminação. Imuno- histoquímica de tecidos linfóides selecionados também serviu como um bom parâmetro para eficácia da vacina, ao passo que grandes diferenças no ADWG, sintomas clínicos, e lesões macroscópicas não foram detectadas entre os grupos. Este estudo foi complicado pelo fato de que PCV2 extrín- seco foi introduzido em algum ponto durante o estudo, conforme evidencia- do por eliminação nasal de PCV2, soroconversão de PCV2 e tecidos IHC positivos no Grupo 9, o grupo controle estrito negativo.

Discussão

Sete vacinas de PCV2 foram avaliadas neste estudo, as quais incluíram três níveis de doses diferentes de antígeno vORF2 administrado uma vez no Dia 0, três níveis de doses diferentes de antígeno rORF2 admi- nistrado uma vez no Dia 0 e um nível de dose de vacina PCV2 de célula in- teira morta administrado uma vez Dia 0 e Dia 14. Além de tudo, o Grupo 5, o qual recebeu 1 dose de vacina contendo 8 pg de antígeno rORF2, teve os melhores resultados. O Grupo 5 teve o maior ADWG, a menor incidência de comportamento anormal, a menor incidência de respiração anormal, a se- gunda menor incidência de tosse, a menor incidência de sintomas clínicos globais, a menor taxa de mortalidade, a menor taxa de eliminação nasal de PCV2, a segunda menor taxa para% média de lesões pulmonares e a me- nor taxa de incidência para tecidos IHC positivos.

Interessantemente, o Grupo 4, o qual recebeu uma maior dose de antígeno rORF2 do que o Grupo 5, não teve desempenho tão bom ou melhor do que o Grupo 5. O Grupo 4 teve um ADWG ligeiramente menor, uma maior incidência de comportamento anormal, uma maior incidência de sintomas clí- nicos globais, uma maior taxa de eliminação nasal de PCV2, uma maior% média de lesões pulmonares, e uma maior taxa para tecidos IHC positivos do que o Grupo 5. Análise estatística, a qual pode ter indicado que as diferenças entre estes dois grupos não foram estatisticamente significantes, não foi con- duzida sobre estes dados, mas houve uma tendência observada de que o Grupo 4 não teve desempenho tão bom quanto o Grupo 5.

Depois da vacinação, 6 porcos morreram no primeiro sítio de estudo. Quatro dos seis porcos eram do Grupo 8 ou do Grupo 9, que não receberam vacina. Nenhum dos seis porcos demonstraram lesões consis- tentes com PMWS, não foram reportados eventos adversos e no total, todas as sete vacinas pareceram ser seguras quando administradas a porcos de aproximadamente 11 dias de idade. Durante a fase pós-vacinação do estu- do, porcos recebendo qualquer um dos três níveis de dose de vacina de vORF2 ou vacina de célula inteira morta tiveram os maiores níveis de IFAT, enquanto o Grupo 5 teve os menores níveis de IFAT logo antes do ataque, dos grupos de vacina.

Embora não comprovado formalmente, acredita-se que a via de transmissão de PCV2 predominante para suíno jovem logo depois do des- mame seja por contato direto oronasal e uma vacina eficaz que reduz a eli- minação nasal de PCV2 em uma situação de produção ajudaria a controlar a disseminação da infecção. Grupos recebendo um de três níveis de antíge- no vORF2 e o grupo recebendo 8 pg de rORF2 tiveram a menor taxa de in- cidência de eliminação nasal de PCV2 (8,3%). Supostamente, o grupo con- trole de ataque teve a maior taxa de incidência de eliminação nasal (80%).

Lesões macroscópicas em porcos com PMWS secundária a in- fecção por PCV2 consistem tipicamente de Iinfadenopatia generalizada em combinação com um ou um múltiplo dos seguintes: (1) pneumonia interstici- al com edema interlobular, (2) palidez cutânea ou icterícia, (3) fígados atrófi- cos mosqueados, (4) úlceras gástricas e (5) nefrite. Na necropsia, icterícia, hepatite, nefrite, e úlceras gástricas não foram observadas em quaisquer grupos e não foi especificamente examinada linfadenopatia. Os escores da% média de lesão pulmonar variaram entre os grupos. O grupo recebendo 16 μg de antígeno vORF2 teve o menor escore da% média de lesão pulmo- nar (0,40 ± 0,50%), seguido pelo grupo que receber 8 pg de rORF2 (0,68 ± 1,15%). Conforme esperado, o grupo controle de ataque teve o maior esco- re da% média de lesão pulmonar (9,88 ± 29,2%). Em todos os quatro gru- pos, os escores da% média de lesão pulmonar foram elevados devido a um porco em cada um destes grupos que teve escores de lesão pulmonar muito elevados. A maioria das lesões pulmonares foram descritas como verme- lhas/púrpura e consolidadas. Tipicamente, lesões pulmonares associadas com PMWS são descritas como de cor castanha amarelada e não-flexíveis com edema interlobular. As lesões pulmonares observadas neste estudo foram ou não associadas com infecção por PCV2 ou um segundo agente pulmonar infeccioso pode ter estado presente. Dentro do contexto deste es- tudo, os escores da% de lesão pulmonar provavelmente não refletem uma medida verdadeira da quantidade de infecção pulmonar devido a PCV2.

Outros pesquisadores demonstraram uma direta correlação en- tre a presença de antígeno de PCV2 por IHC e histopatologia. Não foi con- duzida histopatologia em tecidos selecionados com este estudo. O Grupo 1 (16 μg de vORF2) e o Grupo 5 (8 pg de rORF2) teve a menor taxa de inci- dência de porcos positiva para antígeno de PCV2 (8,3%), enquanto o Grupo 9 (o grupo controle estrito negativo - 90,9%) e o Grupo 8 (o grupo controle de ataque - 90,0%) teve as maiores taxas de incidência para porcos positi- vos para antígeno de PCV2. Devido à natureza não-subjetiva deste teste, os resultados da IHC são provavelmente um dos melhores parâmetros para julgar a eficácia da vacina. Portanto, em um aspecto da presente invenção, foi determinada a Dosagem Protetora Mínima (Minimum Portective Dosage, MPD) de um 1 ml/l dose de produto recombinante com antígeno de ORF2 de PCV2 (rORF2) extraído no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Dos três grupos que receberam níveis variáveis de antígeno rORF2, o Grupo 5 (8 pg de antígeno rORF2) teve claramente o maior nível de proteção. O Grupo 5 ou teve os melhores resultados ou foi vinculado aos resultados mais favoráveis com respeito a todos os parâmetros examinados. Quando o Grupo 5 foi comparado com os outros seis grupos de vacina pós- ataque, o Grupo 5 teve o maior ADWG (0,94 ± 0,22 Ib/dia), a menor incidên- cia de comportamento anormal (0%), a segunda menor incidência de tosse (8,3%), a menor incidência de sintomas clínicos globais (8,3%), a menor ta- xa de mortalidade (0%), a menor taxa de eliminação nasal de PCV2 (8,3%), a segunda menor taxa para % média de lesões pulmonares (0,68 ± 1,15%) e a menor taxa de incidência para tecidos IHC positivos (16,7%).

Em outro aspecto da presente invenção, foi determinada a MPD de um 1 ml/l dose de produto convencional que é antígeno de ORF2 de PCV2 (vORF2) parcialmente purificado no modelo de porco CDCD na face de um ata- que de PCV2. Dos três grupos que receberam níveis variáveis de antígeno vORF2, o Grupo 1 (16 pg de vORF2) teve o maior nível de proteção. O Grupo 1 superou os Grupos 2 e 3 com respeito a ADWG,% média de lesões pulmona- res, e IHC. Os Grupos 1 e 2 (8 pg de antígeno vORF2) tiveram performance igual com respeito à incidência global de sintomas clínicos, o Grupo 3 (4 pg de antígeno vORF2) teve a menor taxa de mortalidade, e todos os três grupos tive- ram performance igual com respeito à eliminação nasal. Além de tudo, vacinas de vORF não tiveram performance igual às vacinas de rORF.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a eficácia de uma dose máxima de 2 ml/2 dose de vacina de PCV2 Morto Con- vencional no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Das sete vacinas avaliadas neste estudo, a vacina de PCV2 de célula inteira morta teve o pior desempenho. Leitões recebendo duas doses de vacina de PCV2 celular inteira morta teve o menor ADWG, a segunda maior taxa de compor- tamento anormal (58,3%), a segunda maior incidência global de sintomas clí- nicos (58,3%), a maior taxa de mortalidade (16,7%), a segunda maior incidên- cia de eliminação nasal (41,7%), maior% média de lesões pulmonares (9,88 ± 29,2%), uma alta incidência de lesões pulmonares observadas (75%) e uma taxa de incidência por Imuno-histoquímica moderada nos tecidos (41,7%). No entanto, ainda foi eficaz para provocar uma reação imune.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, a eliminação na- sal de PCV2 foi avaliada como um parâmetro de eficácia e os parâmetros de eficácia de PCV2 prévios de estudos anteriores foram reconfirimados. Os resultados deste estudo indicam que ocorrer eliminação nasal de PCV2 de- pois de ataque intra nasal e que vacinas de PCV2 reduzem a eliminação nasal de PCV2 pós-ataque. Além disso, os resultados deste estudo e relató- rios na literatura indicam que a Imuno-histoquímica também deve continuar a ser avaliada em provas futuras de vacinas de PCV2.

Algumas conclusões adicionais originárias deste estudo são que linfadenopatia é um dos sinais patognomônicos da PMWS. Outro dos sinais patognomônicos da PMWS é depleção linfóide e histiócitos multinuclea- dos/gigantes. Adicionalmente, não foram observados eventos adversos ou reações no sítio de injeção para qualquer uma das 7 vacinas de PCV2 e to- das as 7 vacinas de PCV2 pareceram ser seguras quando administradas a porcos jovens. EXEMPLO 5

Este exemplo testa a eficácia de oito vacinas candidatas de PCV2 e reconfirma os parâmetros de ataque de PCV2 de estudos de ataque anteriores depois de exposição a uma cepa virulenta de PCV2. Cento e cin- qüenta (150) leitões privados de colostro paridos por cesárea (CDCD)1 de 6 a 16 dias de idade, foram bloqueados por peso e divididos aleatoriamente em 10 grupos de tamanho igual. A Tabela 16 determina o Design do Estudo

Geral para este Exemplo.

Tabela 16. Design do Estudo Geral

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

A formulação de vacina administrada a cada grúpo foi como se se- gue. PCV2 Vacina N°. 1, administrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 1, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inativado adju- vantado com IMS 1314 (16 ug de rORF2 - IMS 1314). PCV2 Vacina N°. 2, ad- ministrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 2, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de um antígeno ORF2 de PCV2 gerado por VIDO R-1 parcialmente purifi- cado adjuvantado com Carbopol (16 ug de vORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 3, administrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 3, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inativado adjuvantado com Carbopol (16 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 4, administrada a 1 χ dose de 1 ml ao Grupo 4, foi uma alta dose (dose de 16 ug/1 ml) de um antíge- no de ORF2 de PCV2 gerado por VIDO R-1 parcialmente purificado adjuvanta- do com Carbopol (16 ug de vORF2 - Carbopol). Vacina N°. 5, administrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 5, foi uma dose de 4 ug/2 ml de um antígeno de ORF2 recombinante inativado adjuvantado com Carbopol (4 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 6, administrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 6, foi uma dose de 1 ug/2 ml de um antígeno de ORF2 recombinante inativado adju- vantado com Carbopol (1 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 7, admi- nistrada a dose de 1 χ 2 ml ao Grupo 7, foi uma dose baixa (dose de 0,25 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inativado adjuvantado com Carbopol (0,25 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 8, administrada a dose de 1 χ 2 ml do Grupo 8, foi uma alta dose (título pré-inativação > 8,0 log/dose de 2 ml) de antígeno PCV2 Struve gerado por VIDO R-1 Convencional Inativado adju- vantado com Carbopol (>8,0 Iog KV - Carbopol). No Dia 0, os Grupos 1 a 8 fo- ram tratados com suas vacinas atribuídas. Os Grupos 1 a 3 e 5 a 8 receberam reforços de suas vacinas respectivas novamente no Dia 14. A eficácia de uma única dose de 16 pg de vORF2 - Carbopol foi testada sobre o Grupo 4 o qual não receber um reforço no Dia 14. Os leitões foram observados para eventos adversos e reações no sítio de injeção depois de ambas as vacinações. No Dia 21 os leitões foram movidos para um segundo sítio de estudo onde os Grupos 1 a 9 foram alojados em grupo em uma construção e o Grupo 10 foi alojado en uma construção separada. Todos os porcos receberam hemocianina de keyho- le limpet emulsificada com adjuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA) nos Dias 22 e 28. No Dia 25, os Grupos 1 a 9 foram testados com aproximadamen- te 4 Iogs de vírus PCV2 virulento. Pelo Dia 46, tinham ocorrido muito poucas mortes no grupo controle de ataque. Em uma tentativa de imunoestimular os porcos e aumentar a virulência do material de ataque de PCV2, todos os Gru- pos foram tratados com INGELVAC® PRRSV MLV (Vacina Reprodutiva e Res- piratória Porcina, Vírus Vivo Modificado) (Porcine Reproductive and Respiratory Vaccine, Modified Live Virus) no Dia 46.

Amostras de sangue pré- e pós-ataque foram colhidas para so- rologia de PCV2. Foram colhidos dados de peso corporal pós-ataque para determinação do ganho de peso diário médio (ADWG) e observações de sinais clínicos. No Dia 50, todos os porcos sobreviventes foram necropsia- dos, lesões macroscópicas foram registradas, os pulmões foram classifica- dos para patologia, e tecidos selecionados foram preservados em formalina para exame por Imuno-histoquímica (IHC) para detecção de antígeno de PCV2 em uma data posterior.

Materiais e Métodos

Este foi um estudo-cego parcialmente da viabilidade do ataque de vacinação conduzido em porcos CDCD, de 6 a 16 dias de idade no Dia 0. Para serem incluídas no estudo, os títulos de PCV2 IFA de porcas foram < 1:1000. Adicionalmente, o estado sorológico das porcas foram de um reba- nho PRRS-negativo conhecido. Dezesseis (16) porcas foram testadas para estado sorológico de PCV2 e todas as dezesseis (16) tinham um título de PCV2 de ≤ 1000 e foram transferidas para o primeiro sítio de estudo. Cento e cinqüenta (150) leitões foram paridos por cirurgias por seção cesareana e estavam disponíveis para este estudo no Dia -3. No Dia -3, 150 porcos CDCD no primeiro sítio de estudo foram pesados, identificados com etique- tas de orelha, bloqueados por peso e atribuídos aleatoriamente a 1 de 10 grupos, conforme determinado acima na tabela 16. Foram colhidas amos- tras de sangue de todos os porcos. Se qualquer animal de teste satisfazen- do os critérios de inclusão for registrado no estudo e foi posteriormente ex- cluído por qualquer razão, o Investigador e Monitor consultados de modo a determinar o uso de dados colhidos do animal na análise final. Foi documen- tada a data de quais leitões registrados foram excluídos e a razão para ex- clusão. Não foram excluídas porcas satisfazendo os critérios de inclusão, selecionadas para o estudo e transportadas para o primeiro sítio de estudo. Nenhum leitão foi excluído do estudo, e nenhum animal de teste foi removi- do do estudo antes do término. A Tabela 17 descreve os frames de tempo para as atividades chave deste Exemplo.

Tabela 17. Atividades do Estudo

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Depois do completamente da fase in-life do estudo, tecidos fixa- dos com formalina foraom examinados por Imuno-histoquímica (IHC) para detecção de antígeno de PCV2 por um patologista, amostras de sangue fo- ram avaliadas para sorologia de PCV2, e foi determinado o ganho de peso diário médio (ADWG) do Dia 25 ao Dia 50.

Os animais foram alojados no primeiro sítio de estudo dentro de gaiolas individuais em sete ambientes a partir do nascimento até aproxima- damente 11 dias de idade (aproximadamente Dia O do estudo). Cada ambi- ente foi idêntico em disposição e consistiu de gaiolas de aço inoxidável indi- viduais empilhadas com ar aquecido e filtrado suprido separadamente para cada unidade de isolamento. Cada ambiente tinha calor e ventilação sepa- rados, deste modo prevenindo a contaminação cruzada de ar entre os am- bientes. Os animais foram alojados em dois prédios diferentes no segundo sítio de estudo. O Grupo 10 (o grupo controle Estrito negativo) foi alojado separadamente em um prédio de criadouro convertido e os Grupos 1 a 9 foram alojados em um prédio de parição convertido. Cada grupo foi alojado em uma pocilga separada (14 a 15 porcos por pocilga) e cada pocilga pro- porcionou aproximadamente 0,21 m2 (2,3 pés quadrados) por porco. Os Grupos 2, 4 e 8 foram encerrados em três pocilgas adjacentes sobre um lado da travessa e os Grupos 1, 3, 5, 6, 7, e 9 foram encerrados em seis pocilgas adjacentes sobre o outro lado da travessa. A separação dos Gru- pos foi devida a preocupação pelo Monitor do Estudo de que as vacinas administradas aos Grupos 2, 4, e 8 não tinham sido totalmente inativadas. Cada pocilga estava sobre um piso elevado com pisos feito de ripas de plás- tico. Um buraco abaixo das pocilgas serviu como um tanque de contenção para excremento e resíduos. Cada construção tinha seus próprios sistemas de aquecimento e ventilação separados, com pouca probabilidade de con- taminação cruzada do ar entre as construções.

No primeiro sítio de estudo, leitões foram alimentados com uma ração de leite especialmente formulada a partir do nascimento até aproxi- madamente 3 semanas de idade. Todos os leitões estavam consumindo ração mista especial sólida, pelo Dia 21 (aproximadamente 4 Vz semanas de idade). No segundo sítio de estudo, todos os leitões foram alimentados com uma ração de mistura comercial não-medicada personalizada apropriada para sua idade è peso, à vontade. Também estava disponível água em am- bos os sítios de estudo à vontade.

Todos os porcos de teste foram tratados com 1,0 mL de NAX- CEL®, IM, em pernas alternadas nos Dias 19, 20, e 21. Além disso, o Porco N°. 11 (Grupo 1) foi tratado com 0,5 mL de NAXCEL® IM no Dia 10, o Porco N°. 13 (Grupo 10) foi tratado com 1 mL de Penicilina e 1 mL de PREDEF® 2X no Dia 10, o Porco N°. 4 (Grupo 9) foi tratado com 1,0 mL de NAXCEL® IM no Dia 11, e os Porcos 1 (Grupo 1), 4 e 11 foram cada um tratado com 1,0 mL de NAXCEL® no Dia 14 por várias razões de saúde.

Enquanto em ambos os sítios de estudo, os porcos estavam sob cuidado veterinário. Foram conduzidos exames de saúde dos animais no Dia - 3 e foram registrados no Formulário de Registro de Exame de Saúde (Health Examiriation Record Form). Todos os animais estavam em bom estado de saúde e nutricional antes da vacinação conforme determinado por observação no Dia 0. Foi observado que todos os animais de teste estavam em bom es- tado de saúde e nutricional antes do ataque. As carcaças e os tecidos foram descartados derretendo. A disposição final dos animais do estudo foi registra- da no Registro de Disposição Animal (Animal Disposition Record).

Nos Dias 0 e 14, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 3 e 5 a 8 re- ceberam 2,0 mL das Vacinas de PCV2 1-4 atribuídas, respectivamente, IM na região direita e esquerda do pescoço, respectivamente, usando uma se- ringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ Υς". Porcos atribuídos ao Grupo 4 receberam 1,0 mL de PCV2 Vacina N°. 2, IM na regi- ão direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ Vz" no Dia 0 somente.

No Dia 22 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de K- LH/ICFA IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g x1". No Dia 28 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA na região da perna direita usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ 1".

No Dia 25, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 9 receberam 1,0 mL de material do ataque de PCV2 ISUVDL (3,98 Iogi0 TCID50/mL) IM na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ 1", Um adicional de 1,0 mL do mesmo material foi administrado IN a cada porco (0,5 mL por narina) usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-Iock e cânula nasal.

No Dia 46, todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de IN- GELVAC® PRRS MLV, IM, na região direita do pescoço usando uma serin- ga estéril de 3,0 mL de Luer-Iock e uma agulha estéril de 20 g χ 1". A PR- RSV MLV foi administrada em uma tentativa para aumentar a virulência do material do ataque de PCV2.

Os porcos de teste foram observados diariamente para saúde global e eventos adversos no Dia -3 e do Dia 0 ao Dia 21. Cada um dos por- cos foi clasificado para comportamento normal ou anormal, respiração ou tosse. Foram registradas observações sobre o Registro de Observações Clínicas. Todos os porcos de teste foram observados do Dia 0 ao Dia 7, e o Grupo 7 foi adicionalmente observado do Dia 14 ao 21, para reações no sí- tio de injeção. O ganho de peso diário médio foi determinado pesando cada porco em uma balança calibrada nos nos Dias -3, 25 e 50, ou no dia que um porco foi encontrado morto depois do ataque. Os pesos corporais foram re- gistrados no Formulário de Peso Corporal. Os pesos corporais do Dia -3 fo- ram utilizados para bloquear os porcos antes da randomização. Dados do peso do Dia 25 e Dia 50 foram utilizados para determinar o ganho de peso diário médio (ADWG) para cada porco durante estes pontos de tempo. Para porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 50, o ADWG foi ajus- tado para representar o ADWG do Dia 25 ao dia da morte.

De modo a determinar a sorologia de PCV2, sangue total veno- so foi colhido de cada leitão do seio venoso orbital nos Dias -3 e 14. Para cada leitão, foi colhido sangue do seio venoso orbital inserindo um tubo ca- pilar estéril no canto mediai de um dos olhos e drenando aproximadamente 3,IO mL de sangue total para dentro de um tubo separador de soro de 4,0 mL (SST). Nos Dias 25, 32, e 50, sangue total venoso de cada porco foi co- lhido da veia cava anterior usando uma agulha estéril de 20 g χ 1 Yzu Vacu- tainer® (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), uma agulha Vaccutainer® holder e um tubo separador de soro de 13 mL. As cole- tas de sangue em cada ponto de tempo foram registradas no Registro de Coleta de Amostra (Sample Collection Record). O sangue de cada tubo se- parador de soro foi deixado para coagular, cada tubo SST foi em seguida centrifugado e o soro foi colhido. Soro colhido foi transferido para um tubo de encaixe de pressão estéril e armazenado a -70 ± 10°C até ser testado em uma data posterior. Amostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos de PCV2 pela equipe da BIVI-R&D.

Os porcos foram observados uma vez ao dia do Dia 22 ao Dia 50 para sintomas clínicos e foram classificados para comportamento normal ou anormal, respiração ou tosse. As observações clínicas foram registradas no Registro de Observações Clínicas.

Os porcos Nos. 46 (Grupo 1) e 98 (Grupos 9) morreram no primeiro sítio de estudo. Ambas estas mortes foram classificadas como mortes por he- morragia e não foram conduzidas necrópsias sobre estes dois porcos. No se- gundo sítio de estudo, porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 50, e porcos eutanizados no Dia 50, foram necropsiados. Quaisquer lesões ma- croscópicas foram observadas e as percentagens de lobos pulmonares com lesões foram registradas no Formulário do Relatório de Necropsia.

De cada um dos porcos necropsiados no segundo sítio de estu- do, uma amostra de tecido de amídala, pulmão, coração, e Iinofonodo me- sentérico foi posta dentro de um único recipiente com formalina a 10% tam- ponada; enquanto outra amostra de tecido dos mesmos órgãos supracitados foi colocada dentro de um Whirl-pak® (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) e cada Whirl-pak® foi colocado sobre gelo. Cada recipiente foi adequadamente etiquetado. Coletas de amostra foram registradas no For- mulário do Relàtório de Necropsia. Depois disso, amostras de tecido fixadas com formalina e um Formulário de Solicitação de Diagnóstico foram subme- tidas a teste por IHC. Foi conduzido teste por IHC de acordo com procedi- mentos laboratoriais de rotina para técnicas de recebimento de amostras, preparação de amostras e placas, e de tingimento. Texidos frescos em Whirl-paks® foram despachados com sacos de gelo para o Monitor do Es- tudo para armazenamento (-70° ± 10°C) e possível uso futuro.

Tecidos fixados com formalina foram examinados por um patologis- ta para detecção de PCV2 por IHC e classificados usando o seguinte sistema de classificação: 0 = Nenhuma; 1 = Tingimento positivo insuficiente, poucos sí- tios; 2 = Tingimento positivo moderado, múltiplos sítios; e 3 = Abundante tingi- mento positivo, difuso por todo o tecido. Para fins analíticos, um escore de 0 foi considerado "negativo," e um escore de mais de 0 foi considerado "positivo."

Resultados

Os resultados para este exemplo são dados abaixo. Observa-se os Porcos N°. 46 e 98 morreram nos dias 14 e 25 respectivamente. Estas mortes foram classificadas como mortes por hemorragia. O Porco N°. 11 (Grupo 1) estava ofegante com respiração rápida no Dia 15. De modo diverso, todos os porcos foram normais para comportamento, respiração e tosse du- rante este período de observação e não foram observados eventos adversos sistêmicos com quaisquer grupos. Não foram observadas reações no sítio de injeção depois de vacinação no Dia 0. Depois de vacinação no Dia 14, sete (7) de quatorze (14) porcos do Grupo 1 (50,0%) tiveram tumefação com um escore de "2" no Dia 15. Quatro (4) de quatorze (14) do Grupo 1 (28,6%) ain- da tinham uma tumefação de "2" no Dia 16. Nenhum dos outros grupos expe- rimentou reações no sítio de injeção depois de qualquer vacinação.

Os resultados do ganho de peso diário médio (ADWG) são apre- sentados abaixo na Tabela 18. Os Porcos N°. 46 e 98 que morreram de he- morragia foram excluídos dos resultados do grupo. O Grupo 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2 - Carbopol1 teve o maior ADWG [0,53 ± 0,12 kg/dia (1,16 ± 0,26 lb/dia)], seguido pelos Grupos 1, 2, 3, 5, 6, e 10 que tive- ram ADWGs que variaram de 0,49 ± 0,10 kg/dia (1,07 ± 0,23 lb/dia) a 0,50 ± 0,12 kg/dia (1,11 ± 0,26 lb/dia). O Grupo 9 teve o menor ADWG [0,40 ± 0,13 kg/dia (0,88 ± 0,29 lb/dia)], seguido pelos Grupos 8 e 7, os quais tiveram ADWGs de 0,42 + 0,15 kg/dia (0,93 ± 0,33 lb/dia) e 0,45 ± 0,20 kg/dia (0,99 ± 0,44 lb/dia), respectivamente.

Tabela 18. Sumário dos Ganhos de Peso Diário Médio dos Grupos (ADWG)

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vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Os resultados da sorologia de PVC2 são apresentados abaixo na Tabela 19. Todos os dez (10) grupos foram soronegativos para PCV2 no Dia -3. No Dia 14, os títulos de PCV2 parmaneceram baixos para todos os dez (10) grupos (faixa de 50 a 113). No Dia 25, o Grupo 8, o qual recebeu a vacina do vírus morto de célula inteira, teve o maior título de PCV2 (4617), seguido pelo Grupo 2, o qual recebeu 16 ug de vORF2 - Carbopol, o Grupo 4, o qual recebeu como dose única de 16 ug de vORF2 - Carbopol, e o Gru- po 3, o qual recebeu 16 ug de rORF2 - Carbopol, os quais tiveram títulos de 2507, 1920 e 1503 respectivamente. No Dia 32 (uma semana pós-ataque), os títulos para os Grupos 1 a 6 e o Grupo 8 variaram de 2360 a 7619; ao passo que os Grupos 7 (0,25 ug de rORF2 - Carbopol), 9 (Controle de Ata- que), e 10 (Controle estrito negativo) tiveram títulos de 382, 129 e 78 res- pectivamente. No Dia 50 (dia da necropsia), todos os dez (10) grupos de- monstraram altos títulos de PCV2 (> 1257).

Nos Dias 25, 32, e 50, o Grupo 3, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2 - Carbopol teve títulos de anticorpos maiores do que o Grupo 1, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2 - IMS 1314. Nos Dias 25, 32 e 50, o Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 ug de vORF2 teve mai- ores títulos do que o Grupo 4, o qual recebeu somente uma dose da mesma vacina. Os Grupos 3, 5, 6, 7, os quais receberam níveis decrescentes de rORF2 - Carbopol, de 16, 4, 1, e 0,25 ug respectivamente, demonstraram títu- los de anticorpos correspondentemente decrescentes nos Dias 25 e 32.

Tabela 19. Sumário dos Títulos IFA do Grupo de PCV2

<table>table see original document page 119</column></row><table> vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

*Para fins de cálculo, um título IFA ≤ 100 foi designado como um título de "50"; um título IFA ≥ 6400 foi designado como um título de "12.800".

** Dia de Ataque

*** Dia de Necropsia

Os resultados das observações clínicas pós-ataque são apre- sentados abaixo. A Tabela 20 inclui observações para Comportamento A- normal, Respiração Anormal, Tosse e Diarréia. A Tabela 21 inclui os resul- tados do Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos por Grupo e a Tabela 22 inclui resultados do Sumário das Taxas de Mortalidade Pós- ataque por Grupo. A incidência de comportamento anormal, respiração e tosse pós-ataque foi baixa em porcos recebendo 16 ug de rORF2-IMS 1314 (Grupo 1), 16 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 3), 1 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 6), 0,25 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 7), e em porcos no Grupo Controle de Ataque (Grupo 9). A incidência de comportamento anormal, res- piração anormal e tosse pós-ataque foi zero em porcos recebendo 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 2), uma única dose de 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 4), 4 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 5), >8 log KV-Carbopol (Grupo 8), e em porcos no grupo controle estrito negativo (Grupo 10).

A incidência global de sintomas clínicos variou entre os grupos. Porcos recebendo 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 2), uma única dose de 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 4), e porcos no grupo controle Estrito negativo (Grupo 10) tiveram taxas de incidência de 0%; porcos recebendo 16 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 3), e 1 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 6) tiveram taxas de incidência de 6,7%; porcos recebendo 16 ug de rORF2-IMS 1314 (Grupo 1) tiveram um taxa de incidência global de 7,1%; porcos recebendo 4 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 5), 0,25 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 7), e >8 log vacina KV tiveram taxas de incidência de 13,3%; e porcos no Grupo Controle de Ataque (Grupo 9) tiveram uma taxa de incidência de 14,3%.

As taxas de mortalidade global entre os grupos variou também. O Grupo 8, o qual recebeu 2 doses de vacina KV teve a maior taxa de mortalidade de 20,0%; seguido pelo Grupo 9, o grupo controle de ataque, e o Grupo 7, o qual recebeu 0,25 ug de rORF2-Carbopol e teve taxas de mortalidade de 14,3% e 13,3% respectivamente. O Grupo 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2-Carbopol teve uma taxa de mortalidade de 6,7%. Todos os ou- tros Grupos, 1, 2, 3, 5, 6, e 10 tiveram uma taxa de mortalidade de 0%. Tabela 20. Sumário de Observações por Grupo para Comportamento Anor- mal, Respiração Anormal, e Tosse Pós-Ataque

<table>table see original document page 121</column></row><table>

1 Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer compor- tamento anormal por no mínimo um dia

2Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer respira- ção por no mínimo um dia

3Número total de porcos em cada grupo que demonstrou uma tosse por no mínimo um dia

Tabela 21. Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos Pós-Ataque por Grupo <table>table see original document page 122</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

1 Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer sintoma clínico por no mínimo um dia

Tabela 22. Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-Ataque por Grupo

<table>table see original document page 122</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

O Sumário da Percentagem Média de Lesões Pulmonares por Grupo e Diagnóstico Experimental é dado abaixo na Tabela 23. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve a maior percentagem de lesões pulmona- res com uma média de 10,81 ± 23,27%, seguido pelo Grupo 7, o qual rece- beu 0,25 ug de rORF2-Carbopol e teve uma média de 6,57 ± 24,74%, o Grupo 5, o qual recebeu 4 ug de rORF2-Carbopol e teve uma média de 2,88 ± 8,88%, e o Grupo 8, o qual recebeu a vacina KV e teve uma média de 2,01 ± 4,98%. os seis (6) grupos restantes tiveram menor percentagem média de lesões pulmonares que variaram de 0,11 ± 0,38% a 0,90 ± 0,15%.

O diagnóstico experimental de pneumonia variou entre os gru- pos. O Grupo 3, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2-Carbopol, teve o menor diagnóstico experimental de pneumonia, com 13,3%. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve 50% do grupo diagnosticado experimen- talmente com pneumonia, seguido pelo Grupo 10, o grupo controle estrito negativo e o Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 ug de vORF2- Carbopol, com 46,7% de 40% respectivamente, diagnosticado experimen- talmente com pneumonia.

Os Grupos 1, 2, 3, 5, 9, e 10 teve 0% do grupo diagnosticado experimentalmente como infectado com PCV2; ao passo que o Grupo 8, o qual recebeu duas doses se vacina KV, teve a maior taxa por grupo de di- agnóstico experimental de infecção por PCV2, a qual é 20%. O Grupo 7, o qual recebeu duas doses de 0,25 ug de rORF2-Carbopol, e o Grupo 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2-Carbopol teve diagnósticos ex- perimental por grupo de infecção por PCV2 em 13,3% e 6,7% de cada gru- po, respectivamente.

• Úlceras gástricas foram diagnosticadas somente em um porco no Grupo 7 (6,7%); ao passo que os outros 9 grupos permaneceram livres de úlceras gástricas. .

Tabela 23. Sumário da% Média de Lesão Pulmonar por Grupo e Diagnóstico Experimental

<table>table see original document page 123</column></row><table> <table>table see original document page 124</column></row><table>

vORF2 = 0RF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

O Sumário dos Resultados da Incidência IHC Positiva por Grupo são mostrados abaixo na Tabela 24. O Grupo 1 (16 ug de rORF2 - IMS 1314) teve a menor taxa por grupo de resultados IHC positivos com 0% dos porcos positivos para PCV2, seguido pelo Grupo 2 (16 ug de vORF2 - Car- bopol) e o Grupo 4 (dose única de 16 ug de vORF2 - Carbopol), o qual teve taxas de IHC por grupo de 6,7% e 13,3% respectivamente. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve a maior taxa de incidência IHC positiva com 100% dos porcos positivos para PCV2, seguidos pelo Grupo 10, o grupo controle estrito negativo, e o Grupo 8 (vacina KV), com 93,3% e 80% dos porcos positivos para PCV2, respectivamente.

Tabela 24. Sumáio do Taxa de Incidência IHC Positiva por Grupo

<table>table see original document page 124</column></row><table>

vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

Discussão

Sete vacinas PCV2 foram avaliadas neste exemplo, as quais incluíram uma alta dose (16 µg) de antígeno rORF2 adjuvantado com IMS 1314 administrado duas vezes, uma alta dose (16 µg) de antígeno vORF2 adjuvantado com Carbopol administrado uma vez a um grupo de porcos e duas vezes a um segundo grupo de porcos, uma alta dose (16 µg) de antí- geno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma dose de 4 µg de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma dose de 1 µg de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma baixa dose (0,25 µg) de antígeno rORF2 ad- juvantado com Carbopol administrado duas vezes, e uma alta dose (> 8 log) de vacina de PCV2 de célula inteira morta adjuvantada com Carbopol. Além de tudo, o Grupo 1, o qual recebeu duas doses de 16 µg de rORF2 - IMS 1314, teve performance ligeiramente melhor do que os Grupos 2 a 7, o qual recebeu vacinas contendo vários níveis de ou antígeno vORF2 ou rORF2 adjuvantado com Carbopol e muito melhor do que o Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina de PCV2 de célula inteira morta. O Grupo 1 teve o terceiro maior ADWG [0,82 + 0,14 kg/dia (1,80 ± 0,30 lb/dia)], a menor inci- dência de comportamento anormal (0%), a menor incidência de respiração anormal (0%), uma baixa incidência de tosse (7,1%), uma baixa incidência de sintomas clínicos .globais (7,1%), foi vinculado com três outros grupos para a taxa de mortalidade mais baixa (0%), a segunda taxa mais baixa pa- ra% média de lesões pulmonares (0,15 ± 0,34%), a segunda taxa mais bai- xa para pneumonia (21,4%) e a taxa de incidência mais baixa para tecidos IHC positivos (0%). O Grupo 1 foi, no entanto, o único grupo no qual foram observadas reações no sítio de injeção, que incluiu 50% dos vacinados 1 dia depois da segunda vacinação. As outras vacinas administradas aos Grupos 2 a 7 teveram performance melhor do que a vacina morta e quase tão boa quanto a vacina administrada ao Grupo 1.

O Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina de PCV2 mor- to adjuvantada com Carbopol, teve a pior série de resultados para qualquer grupo de vacina. O Grupo 8 teve o mair baixo ADWG [0,42 ±0,15 kg/dia (0,93 ± 0,33 lb/dia)], a segunda taxa mais alta de comportamento anormal (6,7%), a taxa mais alta de respiração anormal (6,7%), foi vinculado com três outros grupos para a taxa de incidência global mais alta de sintomas clínicos (13,3%), teve a taxa mais alta de mortalidade de todos os grupos (20%), e teve a taxa mais alta de IHC positiva (80%) de qualquer grupo de vacina. Houve preocupação de que a vacina de PCV2 de célula inteira morta pode não ter sido totalmente inativada antes de administração ao Grupo 8, o que pode explicar os pobres resultados deste grupo. Infelizmente, dados definitivos não estavam disponíveis para confirmar esta relação. Além de tudo, no contexto deste exemplo, uma vacina de PCV2 Morto Convencional não ajudou na redução de doença associada com PCV2.

Conforme previamente mencionado, não foram associados e- ventos adversos com as vacinas de teste com exceção da vacina adjuvan- tada com IMS 1314. Foram observadas reações no sítio de injeção em 50,0% dos porcos 1 dia depois da segunda vacinação com a vacina formu- lada com IMS 1314 e em 28,6% dos porcos 2 dias depois da segunda vaci- nação. Não foram observadas reações em quaisquer porcos recebendo va- cinas adjuvantadas com Carbopol. Quaisquer estudos adicional que incluem porcos vacinados com vacinas adjuvantadas com IMS 1314 devem continu- ar a monitorar rigorosamente os porcos para reações no sítio de injeção.

Todos os porcos foram soro-negativos para PCV2 no Dia -3 e somente o Grupo 2 teve um título acima de 100 no Dia 14. No Dia 25 (dia do ataque), o Grupo 8 teve o maior título de anticorpos para PCV2 (4619), se- guido pelo Grupo 2 (2507). Com a exceção do Grupos 7, 9 e 10, todos os grupos demonstraram uma forte resposta de anticorpos pelo Dia 32. Pelo Dia 50, todos os grupos incluindo os Grupos 7, 9 e 10 demonstraram uma forte resposta de anticorpos.

Um dos sinais patognomônicos da infecção por PCV2 em está- gio tardio e subseqüente desenvolvimento de PMWS é retardo do cresci- mento em porcos desmamados, e em casos graves, observa-se perda de peso. O ganho de peso diário médio dos grupos é um método quantitativo para demonstrar retardo do crescimento ou perda de peso. Neste exemplo, não houve uma grande diferença no peso corporal diário médio entre os grupos. O Grupo 8 teve o menor ADWG de 0,40 ± 0,13 kg/dia (0,88 ± 0,29 lb/dia), enquanto o Grupo 4 teve o maior ADWG de 0,53 + 0,12 kg/dia (1,16 ± 0,26 Ib/dia). Dentro do contexto deste estudo não houve uma diferença suficiente entre os grupos para basear a eficácia da vacina futura no peso corporal diário médio.

Além de perda de peso - dispnéia, letargia, palidez da pele e algumas vezes icterícia são sintomas clínicos associados com PMWS. Nes- te exemplo, comportamento anormal e respiração anormal e tosse foram observados de modo infreqüente para cada grupo. Conforme evidenciado neste estudo, este modelo de ataque e cepa de ataque não resultam em sintomas clínicos opressivos e este não é um parâmetro forte no qual base- ar a eficácia da vacina.

Além de tudo, as taxas de mortalidade não foram altas neste exemplo e a falta de uma alta taxa de mortalidade no grupo controle de ata- que limita este parâmetro no qual basear a eficácia da vacina. Antes do Dia 46, nos Grupos 4 e 7 cada um teve um porco morto em quinze porcos, o Grupo 9 teve dois porcos mortos em quatorze porcos e o Grupo 8 teve três porcos mortos em quinze porcos. Devido ao fato de que o Grupo 9, o grupo controle de ataque não estava demonstrando sintomas clínicos de PCV2 e somente ocorreram duas mortes neste grupo pelo Dia 46, A vacina MLV de vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRSV) foi administra- da a todos os porcos no Dia 46. Estudos anteriores utilizaram INGELVAC® PRRS MLV como um imunoestimulante para agravar doença PMWS asso- ciada com PCV2 e as taxas de mortalidade foram maiores nestes estudos anteriores. Ocorreram duas mortes logo depois de administrar a vacina de PRRS no Dia 46 - o Grupo 4 teve uma morte no Dia 46 e o Grupo 7 teve uma morte no Dia 47 - as quais provavelmente não foram associadas com a administração da vacina de PRRS. Pelo Dia 50, o Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina morta, teve a maior taxa de mortalidade (20%), segui- do pelo Grupo 9 (controle de ataque) e o Grupo 7 (0,25 ug de rORF2 - Car- bopol), com taxas de mortalidade de 14,3% e 13,3% respectivamente. Além de tudo, a administração da vacina de PRRS ao modelo de ataque tardio na fase de observação pós-ataque deste exemplo não aumentou significativa- mente as taxas de mortalidade.

Lesões macroscópicas em porcos com PMWS secundária a in- fecção por PCV2 tipicamente consistem de linfadenopatia generalizada em combinação com um ou mais dos seguintes: (1) pneumonia intersticial com edema interlobular, (2) palidez cutânea ou icterícia, (3) fígados atróficos mos- queados, (4) úlceras gástricas e (5) nefrite. Na necropsia (Dia 50), não foram observadas icterícia, hepatite, e nefrite em quaisqeur grupos. Uma úícera gás- trica foi observada em um porco do Grupo 7, mas não foi especificamente examinado para linfadenopatia. Com base na presença de lesões que foram consistentes com infecção por PCV2, três grupos tiveram no mínimo um porco diagnosticado experimentalmente com PCV2 (PMWS). O Grupo 8, o qual re- cebeu duas doses de vacina de vírus morto, teve 20% diagnosticados experi- mentalmente com PCV2, ào passo que o Grupo 7 e o Grupo 4 tiveram 13,3% e 6.7%, respectivamente, diagnosticados experimentalmente com PCV2. Os escores da% média de lesão pulmonar variou entre os grupos na necropsia. Os Grupos 1, 2, 3, 4, 6 e 10 tiveram baixos escores da% de lesão pulmonar que variaram de 0,11 ± 0,38% a 0,90 ± 0,15%. Conforme esperado, o Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve o maior escore da% média de lesão pul- monar (10,81 ± 23,27%). Em quatro grupos, os escores da% média de lesão pulmonar foram elevados devido a um a três porcos em cada um destes gru- pos terem escores de lesão pulmonar muito elevado. As lesões pulmonares foram vermelhas/púrpura e consolidadas. Tipicamente, lesões pulmonares associadas com PMWS são descritas como de cor castanha amarelada, não- flexíveis com edema interlobular. As lesões pulmonares observadas neste estudo foram ou não associadas com infecção por PCV2 ou um um segundo agente infeccioso pulmonar pode ter estado presente. Dentro do contexto deste estudo, os escores da% de lesão pulmonar provavelmente não refletem uma medida verdadeira da quantidade da infecção pulmonar devido a PCV2. Igualmente, diagnóstico experimental de pneumonia pode ter sido superutili- zado também. Quaisquer porcos com lesões pulmonares, algumas tão pe- quenas quanto 0,10%, foram listados com um diagnóstico experimental de pneumonia. Néste exemplo, não houve diferença suficiente entre os grupos com respeito a lesões macroscópicas e% de lesões pulmonares nas quais basear a eficácia da vacina.

Os resultados da IHC mostraram as maiores diferenças entre os grupos. O Grupo 1 (16 µg de rORF2 - IMS 1314) teve os menores resulta- dos IHC positivos para antígeno de PCV2 (0%); ao passo que os Grupos 9 e 10 tiveram os maiores resultados IHC positivos com taxas de incidência de 100% e 93,3% respectivamente. Os Grupos 3, 5, 6 e 7, os quais receberam 16, 4, 1 ou 0,25 µg de antígeno rORF2, respectivamente, adjuvantado com Carbopol, tiveram taxas positivas por IHC de 20%, 20%, 40% e 46.7%, res- pectivamente. O Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 µg de vORF2 adjuvantado com Carbopol teve uma taxa positiva por IHC de 6,7%, ao pas- so que o Grupo 4 o qual recebeu somente uma dose da mesma vacina, teve uma taxa positiva por IHC de 13,3%. Devido à natureza objetiva deste teste e do fato de que os resultados da IHC se correlacionam com os resultados esperados, o teste de IHC é provavelmente um dos melhores parâmetros nos quais basear a eficácia da vacina.

Portanto em um aspecto da presente invenção, é determinado a Dosagem Protetora Mínima (MPD) de antígeno de PCV2 rORF2 adjuvantado com Carbopol no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Os Grupos 3, 5, 6 e 7 cada receberam duas doses de antígeno rORF2 adjuvan- tado com Carbopol, mas o nível de antígeno rORF2 variou para cada grupo. Os Grupos 3, 5, 6 e 7 cada receberam 16, 4, 1 ou 0,25 µg de antígeno rORF2 respectivamente. Em geral, reduzindo o nível de antígeno rORF2 diminuiu os títulos de anticorpos contra PCV2, e aumentou a taxa de mortalidade,% médi- da de lesões pulmonares e a incidência de tecidos IHC positivos. Dos quatro grupos recebendo níveis variáveis de rORF2 - Carbopol, Grupos 3 e 5, os quais receberam duas doses de 16 ou 4 µg de antígeno rORF2, respectiva- mente, cada um teve uma taxa positiva por IHC de somente 20%, e cada um teve títulos de anticorpos semelhantes. Além de tudo, com base em resulta- dos positivos por IHC, a dosagem protetora mínima de antígeno rORF2 admi- nistrado duas vezes é aproximadamente 4 ug.

Em outro aspecto da presente invenção, foi avaliada a antigenici- dade de antígenos de PCV2 recombinantes (rORF2) e VIDO R-1 (vORF2). O Grupo 2 recebeu duas doses de 16 pg de vORF2 e o Grupo 3 recebeu duas doses de 16 pg de rORF2. Ambas as vacinas foram adjuvantadas com Car- bopol. Ambas as vacinas foram consideradas seguras e ambas tiveram 0% de taxa de mortalidade. O Grupo 2 teve um título de anticorpos contra PCV2 de 2507 no Dia 25, enquanto o Grupo 3 teve um título de anticorpos contra PCV2 de 1503. O Grupo 3 teve um menor escore da% média de lesão pulmonar do que o Grupo 2 (0,11 ± 0,38% vs. 0,90 ± 0,15%), mas o Grupo 2 teve uma me- nor taxa de incidência IHC positiva do que o Grupo 3 (6,7% vs. 20%). Além de tudo, ambas as vacinas tiveram antigenicidade similar, mas vORF2 foi associ- ado com resultados de IHC ligeiramente melhores.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a conveniência de dois adjuvantes diferentes (Carbopol e IMS 1314). Ambos os Grupos 1 e 3 receberam duas doses de vacina contendo 16 ug de antígeno rORF2, ma o Grupo 1 recebeu o antígeno adjuvantado com IMS 1314 ao pas- so que o Grupo 3 recebeu o antígeno adjuvantado com Carbopol. Ambos os grupos tiveram essencialmente o mesmo ADWG, essencialmente a mesma incidência de sinais clínicos pós-ataque, a mesma taxa de mortalidade, e es- sencialmente a mesma% média de lesões pulmonares; mas o Grupo 1 teve uma taxa IHC positiva de 0% ao passo que o Grupo 3 teve uma taxa IHC po- sitiva de 20%. No entanto, o Grupo 3, o qual recebeu a vacina adjuvantada com Carbopol teve maiores títulos de IFAT PCV2 nos Dias 25, 32 e 50 do que o Grupo 1, o qual recebeu a vacina adjuvantada com IMS 1314. Além de tudo, embora a vacina de PCV2 adjuvantada com IMS 1314 não tenha proporcio- nado melhores resultados de IHC, não proporcionou proteção esmagadora- mente melhor contra infecção por PCV2 e não induziu reação no sítio de inje- ção. Ao passo que a vacina de PCV2 adjuvantada com Carbopol teve perfor- mance quase tão boa quanto a vacina adjuvantada com IMS 1314, mas não foi associada com quaisquer eventos adversos.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a viabilidade de ORF2 de PCV2 como um produto de 1 dose de 1 ml. Ambos os Grupos 2 e'4 receberam 16 μρ de vacina vORF2 adjuvantada com Car- bopol no Dia 0, mas o Grupo 2 recebeu uma segunda dose no Dia 14. O Grupo 4 teve um ADWG ligeiramente maior e uma% médida menor de le- sões pulmonares do que o Grupo 2, mas o Grupo 2 teve maiores títulos de IFAT PCV2 no Dia 25, 32 e 50, e uma taca de incidência ligeiramente menor de tecidos IHC positivos. Todos os outros resultados para estes dois grupos foram similares. Além de tudo, uma dose de vORF2 adjuvantado com Car- bopol teve desepenho similar a duas doses da mesma vacina. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Roof, Mike

Eichmeyer, Mark Nitzel, Greg Schaeffer, Merrill Hayes, Phillip

<120> COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS DE PCV2 E MÉTODOS PARA PRODUZIR SE- MELHANTES COMPOSIÇÕES <130> 34816-CIPl <140> DESCONHECIDA <141> 2005-01-10 <150> Desconhecida <151> 2004-12-30 <160> 11 <170> Versão de Patente 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Esta é uma seqüência de Kozak modificada. <400> 1

ccgccatg 8

<210> 2 <211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Esta é uma seqüência Eco Rl recombinante.

<400> 2

gaattc 6

<210> 3 <211> 713 <212> DNA

<213> Circovírus porcino <400> 3

cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60

ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120

gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180

aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240

ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300

gaaággttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360

gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420

acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480

gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540

áaaggaatca gctttggctg aggetacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600

gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660

tacaattcag agaatttaat cfctaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> Circovírus porcino <400> 4

ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60

ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120

gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180

ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240

ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300

gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360

gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420

acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480

gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540

aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600

gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713

<210> 5 <211> 233 <212> PRT

<213> Circovírus porcino <400> 5

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys 225 230

<210> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> Circovírus porcino

<400> 6

Met Thr Tyr Pro Arg Arg 1 5

Ser His Leu Gly Gln Ile 20

Arg His Arg Tyr Arg Trp 35

Leu Ser Arg Thr Phe Gly 50

Pro Ser Trp Ala Val Asp 65 70

Pro Pro Gly Gly Gly Thr 85

Arg Ile Arg Lys Val Lys 100

Gln Gly Asp Arg Gly Val 115

Phe Val Thr Lys Ala Thr 130

Ser Ser Arg His Thr Ile 145 150

Phe Thr Pro Lys Pro Val 165

Asn Asn Lys Arg Asn Gln

Met TyrVal Gln Phe Arg Glu Phe 220

Pro

Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

10 15

Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

25 30

Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

40 45

Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 55 60

Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val

75 80

Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

90 95

Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

105 110

Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

120 125

Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 135 140

Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 155 160

Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

170 175

Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230

<210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Esta seqüência é de circovírus porcino tipo 2, estrutura de leitura

aberta 2, junto com uma porção do vetor pGEM T-easy. <400> 7

gcggçcgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60

caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaàat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc 756

<210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Este é ο circovírus porcino tipo 2, constructo ORF2, no qual

inclui baculovírus e seqüências codificantes pGEM T-easy. <400> 8

aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60

gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120

ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180

gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240

ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300

gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360

gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420

ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480

cacâccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540

aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600

tttaaçaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660

tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720

gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780

ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840

cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900

ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960

tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020

tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080

actcttgttt tttaacaagt itcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140

tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200

gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260

gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320

cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380

cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440

tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500

ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560

cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620

tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680 tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740

ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800

tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860

atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920

cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980

cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040

ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100

cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160

tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220

atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280

gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340

aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400

acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag ettgcgacgc aacgtgcacg 2460

atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520

tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580

atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640

tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700

agagcgtcat gtttagacaa gaaagctáca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760

àaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2 820

ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880

aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940

aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000

aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060

aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120

gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180

atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240

ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300

aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360

catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 342Ó

aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480

tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540

aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600 tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660

tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720

aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780

acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840

ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagtt.cacc tcccttttct atactattgt 3900

ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960

atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020

gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080

aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg 4140

cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa 4200

gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc 4260

cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca 4320

ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tca:caacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380

tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac 4440

cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca 4500

cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa 4560

aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc 4620

aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg 4680

attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa 4740

àtgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca 4800

atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg 4860

aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 4920

ggtacccggg atcctttcct igggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 4980

atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5040

tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5100

gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5160

ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5220

atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5280

ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5340

atcgatcgtg tcatctgigga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5400

gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5460

ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5520 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5580

aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5640

tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 5700

cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 5760

tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 5820

gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 5880

tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 5940

tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6000

ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6060

attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120

gattgcgggc gtttttgggç gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180

acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6240

ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6300

ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6360

ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6420

accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6480

tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6540

gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6600

ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6660

accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 6720

ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 6780

gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 6840

ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta 6900

cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa 6960

aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt 7020

tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt 7080

gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc 7140

tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa 7200

actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta 726Ó

ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt 7320

ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa 7380

tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc 7440 ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg acggattg.tg caaacacgaa aactcactta gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg atgagtgagc taactcacat taattgcgtt cctgtcgtgc cagctgcatt aatgàatcgg tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tcagaggtgg cgaaacccga caggactata cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtggtggcct aactacggct acactagaag gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca agatcctttg atcttttcta >cggggtctga gattttggtc atgagattat caaaaaggat aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga aatcagtgag gcacctatct çagcgatctg ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gataccgcga gacccacgct caccggctcc aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc

gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata 7500

atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg 7560

aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt 7620

gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta 7680

acgttt.cgtt tgactggtac gcggcgtgtt 7740

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 7800

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 7860

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 7920

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7980

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8040

acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8100

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8160

tgaicgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8220

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8280

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8340

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8400

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8460

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8520

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8580

gàcagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8640

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8700

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8760

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8820

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8880

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8940

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 9000

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 9060

agatttatca gcaataaacc agccagccgg 9120

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 9180

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 9240

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9300

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 9360 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 9420 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9480 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9540 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9600 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9660 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9720 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9780 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9840 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9900 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9960 aaataggcgt atcacgaggç cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10020 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10080 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 10140 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 10200 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 10260 agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 10320 aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 10380 cagtgcc 10387

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Circovírus porcino

<400> 9

Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser 1 5 10 15

His Leu Gly Gln 20

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> Circovírus porcino

<400> 10 Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr 1 5 10 15

Thr Leu Ser <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Esta é uma seqüência de aminoácidos para circovírus porcino tipo 2, estrutura de leitura aberta 2. <400> 11

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims (9)

1. Vacina de combinação multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir á gravidade de infecções por circovírus porcino tipo 2, e pelo menos um componente ativo imunogênico eficaz contra outro organismo causador de doença em suíno.

2. Vacina de combinação multivalente de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que o referido agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por circoví- rus porcino tipo 2 é um antígeno de circovírus porcino tipo 2.

3. Vacina de combinação multivalente de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus porcino tipo -2 é um antígeno de circovírus porcino tipo 2 inativado, um circovírus porcino tipo 2 vivo modificado ou atenuado, um vírus quimérico que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imunogênica de circovírus porcino tipo 2, ou qualquer outro polipeptídeo ou componente que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imunogênica de circovírus porcino tipo 2.

4. Vacina de combinação multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o referido antí- geno de circovírus porcino tipo 2 é uma proteína codificada por uma se- qüência de DNA apresentando no mínimo 80% de identidade de seqüência com ORF2 de um circovírus porcino tipo 2.

5. Vacina de combinação multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus porcino tipo 2 é o antígeno ORF2 expressado por baculovírus.

6. Vacina de combinação multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o referido componente ativo imunogênico eficaz contra outro organismo causador de doença em suíno é selecionado entre o grupo consistindo em um antígeno de: Actinobacillus pleuropneumonia; Adenovírus; Alphavirus tais como Vírus da Encefalomielite Eqüina Oriental; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferencialmente Β. hyodyentheriae; Β. piosicoli, Brucella suis, prefe- rencialmente biovars 1, 2, e 3; vírus da febre suína clássica; Clostridium spp., preferencialmente Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B, e C, Cl. novyi, Cl.septicum, Cl. tetani; Coronavirus1 preferencialmente Corona vírus Respi- ratório Porcino; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix rhsiopathiae; Esche- richia coli; Haemophilus parasuis, preferencialmente subtipos 1, 7 e 14; ví- rus da encefalomielite hemaglutinante; Vírus da Encefalite Japonesa; Law- sonia intracellularis; Leptospira spp., preferencialmente Leptospira australis; Leptospira canicola; Leptospira grippotyphosa; Leptospira icterohaemorrha- gicae; e Leptospira interrogans; Leptospira pomona; Leptospira tarassovi; Mycobacterium spp,, preferencialmente M. avium, M. intracellulare e M.bovis; Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo); Pasteurella multocida; Cito- megalovírus porcino; Parvovírus porcino; Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória (PRRS) Porcina; Pseudorabies vírus; Rotavirus; Salmonella spp., preferencialmente S. thyhimurium e S. choleraesuis; Staph. hyicus; Staphylococcus spp., preferencialmente Streptococcus spp., preferencial- mente Strep. suis; herpes vírus suíno; Vírus da Influenza suína; pox vírus suíno; pox vírus suíno; Vírus da estomatite vesicular; e Vírus de exantema vesicular dos suínos.

7.

Vacina de combinação multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o dito compo- nente ativo imunogênico eficaz contra outro organismo causador de doença em suíno é selecionado entre o grupo consistindo em qualquer antígeno contido em:

ErrterisoKS llejtis, Enterfeol® HeKiS FF, Enterisofô» SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Errterisol© ERY-ALC1 IngeIvacSAPP ALC, Ingetvac® AR4, fngelvac® HP-1, Ingeívae® HPE-1, IngeJvac® M. hyo, Ingetvac® PRRS MLV, Ingelvac® FRRS ATP1 IngeJvao® PRV-Gi, Reproeyü» PRRS PLE, ReprocyC® PtE, Tetguard™, Toxivac® AD+E, Toxlvae® Plus Parsius1 (toctas da Boehrínger IngeJheBT», St Joseph, MO, EUA); Cifcoverrt, PokSIís Goll1 Porals GRY + PARVO, Porcilte Ery1 PorçiUs Giasser, Percjlis Parvo. PoreiBs Porcoli DF, Porcllis APP, PorcHis AR-T1 Portslte AR-T OF, Porcílis Porooltt Porcilis PoreoS DBuvac forte, Porcilis PRRS, PorciHs PorocS 5, Petclls Aujeszky1 PorcBis Bogonia Ofluvac, Poralis Begorta (.OAL1 Pordiis Begonis Ufiisole1 Poralis M, hyo. Poreins Atrlnord, Myco Silencer® BPM, Myoo Slencer® K1ME, Myoo SBenoet® MEi Myoo Silence r® M, Myco Sitencei® Once1 Myoo Siteneer® MEH1 Rhinogsn® ΒΡΕ, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac@ EII, Sow 8ae® CEII, Sow Bac® TBEC1 ProSystem® CE, ProSystem© RCE1 ProSystem® TREC1 ProSystem® PWmune, ProSystem® Rotamune® com ImugamS Ilt ProSystem® Roía, ProSystemÉ» Rotaimme KV1 ProSystern® TG-Emune® Rote com ImogartID II, ProSystemeTQEirRota1 ProSystem® TG-Bnune® com Imugen®. ProSystenrwaTGE, MaGESTtC 7, MaQESTlC δ, MaGESTiC® com SptJi®, MaGESTte® 7 cem Spur®, MaGESTio® 8 com Spur®, End- FLUeoce© com Imugen® II, End-FLUence®2, PRRomlSBSs PRV-Begonia com Dllwae Forte®, Argus® SC/ST, Sfcrep Bac, Strep Ba®® eom Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Pwsovac pius, Erysorb Paivo (todas da Intenrei IrK-. Millsboro, OE1 EUA); Hyoresp, Ciroova c, Neocdipor, Parvoruvac, Parvosuint Progressis1 Vlrallu1 AKipor 6.3, Jtespur gl·, Jesflu gi· (todas da Matial LTD, Dulutfi, GA); Bi BAtf6 PUJSf ER BAC®, ei BAC® PLUS/LEPTOFEF1M-5®' ER BAC® LeptOíemi-5®, Farrowsure®, Farrowsure© B. FARROWSUREe PLUS B, FARROWSUREe PUJS, FARROWSURE® PRV, FARROWSUFffi B-PRV1 FLUSURE™, FLUSURE'» RTU1 FLUSURE^/ER BAC8 PLUS, FLUSURBStfER BAC PLUS®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSUREIM/RESPlSUREé RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE*/ER BAC® PLUSi FLUSUREO/RespíSure 1 ONEOiER BAC Pfus®, FLUSURE^/RESPISUREONHVFUJSUREij/RESPlSURE 1 mm FLUSURBFanowsure Pfus, FLUSURE/Farrowsure PIusS1 UTTERGUARDeLT- C, UTTEHGUARD® LT1 PIeuroGuanf 4, Pneumosuís IIli Steliainuite Ona1 Stellamune Uno, Stenamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasmaj Respisure One, Respisure®, Resptsure 1 ONE®, Respisure 1 OneSVER Bac Ptus®, ErtcIiracaI Ti Zytexis (formefly known como Baypamurte), Atrobac® 3, BratiVac®, BrafiVac^B, L^^fefm-SrjrjParvo-Vae©fijeptotefm-5€>, PR-vae®-Küted, PR-Vac®, PR-Vae PkisO (todas da Pfizer Inc., New York, NYi EUA); Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH1 Suvaxyn Myeoplasma, Suvaxyn AujesAy Badha + Dlluent, Suvaxyn Aujesj&y Bartha + o/w, Sinexyn Aufeszky-Flu, Sinraxyn AujesilQi 783 + oAv, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Ru, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn Wfrt-One1 Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespIFe ntÉ)APP. Suvaxyn RespiFend® HPS1 Suvaxyn RespiFend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFenO®» MH, Suvaxyn® AR/Γ/Ε, SuvaxyrtS EC-4, Suvaxyn® E, Suvãxyr«®KE, Suvaxyn® E-oraJ, Suvaxyn® PLE, Suvaxyrr® PLE/PrV gpt-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PUE+B/PrV gpí-, Suvaxyn® SlV1 Suvaxyn© ; SIV/Mh-one, Swaxyn® P, Suvaxyn® PrV gph Suvaxyn® PCV-2 0ne Stwt (totós da Fort Dodgo Animal HeaIBi1 Overland Partt1 KS1 BiA (Wyeth); SCOURMUNE®, SCOURMUNB&-C, SC0URMUNE®CR, AR-PAC@-PD+ER. AR-PARAPAO@+ER. M+ Rhusigefl®, MfPAO&i . MaxiVae ExeelKSQ, MaxiVac® H1N1, MaxíVae® H3N2, Max!Vao&-FLU, MaxiVac®-M+, MaxIVac Excel®, MaxIVac Exoalt 3, PARAPAO®, PNEU PAOS1 PNEU PAO(S)-ER1 PNEU PAO&+ER, PRV/Marker Gole®, PRV/Marker Goid®, PRV/Marker GokW-MaxiVac& FW, Rtiusigen™, GIeJvax 6, Covexin 8, M + PAC, Gletvax pius, M-ParapacQSS PAÕ® (todas da Schering-Plough Anhrtal Health Corporation, KenBwbrth, NJ, EUA); AMERVAC-PRRS, AUSHlPRA-BK1 AUSKIPRA-GN, COUSUIhKX1 COLlSUiN-TF, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLÂSSEa MYi1RAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, parvqsuin- MR/AD, RINIPRAVAODT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, T0X1PRA PLUS Podaa da Laboratórios Hipna SA, Amer1 Girona, Espanha); Ciostricol, CoSpore Pkis1 Haeppovac1 Per-CM1Orc1 Porciparvac. RESPIPORC ART + EP1 RESPIPORC FLUj Respiporc M. HY01 SHOT, Rhuslovaci Rotlauf-Lebendsnpfstoff. Safmoporc1 Suísatoral, AK vac MK35 (todas da (OT impfstofíwer* DessaTornau, Tomati, Aíemanhá); Mypravac Suis, (AIbrech) GmbH, Alemartfa); Haemo Shield® P1 Parapleuro St>isld®> P1 Parapleuro SJweIdfB P+BE, Rhinicell® FD, WiJni Shielcfô TX4, Prefarrow SWeldS 9, F^etarrow Strep Shield®, Clostmtox® BCD, Clostratox® C, Ctosbatox® Ultra C1300, Poreine EoolizeKSi -3 + C, Porcine Pili Shiekl ®+C, Porcim Ri Shield QPorcire Ecofi^i® 3, Ery Serum^Ery Shteld^Ery Vac Oral, Ery SWelct® +L5, PanSTAR® Ery1 EryoslKgParvo ShlekIS E, Parvo SWeld® L5E, Parvo Shieid® L5, Parvo Para SWeld®, PneumoSTAR SlV, PneumoSTAR® Myco1 Lepto Shield® S, MycO ShieldIJSahTKi Shteld® 2, Salmo ShieSd® Uve, Amftox Tet®C. Perfingene Typa A Toxoêd (todas da Novartis Animal Heafth, Basel, Suíça): Nitio-Sal (Alvo);