CN107837391A

CN107837391A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107837391A
Application number: CN201711105009.9A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 张海洋; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2018-03-27
Also published as: CN104248761B; CN104248761A

Abstract

本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及猪瘟病毒、猪链球菌的疫苗组合物及其制备方法，所述组合物包含猪瘟病毒、猪链球菌抗原。本发明还涉及将所述疫苗组合物用于制备预防和/或治疗与猪瘟病毒、猪链球菌相关的疾病和由猪瘟病毒、猪链球菌导致的感染的组合物的应用。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

本申请为专利申请201410289029.6的分案申请，原案发明名称为“一种疫苗组合物及其制备方法和应用”，原案申请日为2014年6月24日。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，特别是涉及一种疫苗组合物及其制备方法和应用。更具体地，本发明涉及猪瘟病毒(classical swine fever virus)、猪链球菌(Streptococcus suis)的疫苗组合物及其制备方法，所述组合物包含猪瘟病毒、猪链球菌抗原。本发明还涉及将所述疫苗组合物用于制备预防和/或治疗与猪瘟病毒、猪链球菌相关的疾病和由猪瘟病毒、猪链球菌导致的感染的组合物的应用。

背景技术

猪链球菌是一种重要的猪病原体，可导致许多病理疾病诸如关节炎、心内膜炎、脑膜炎、肺炎和败血病。其还是对于接触污染的猪或它们的副产物的人的重要的动物传染病病原体，导致脑膜炎和心内膜炎。目前已知基于荚膜抗原的三十三种血清型(1-31型、33和1/2型)，是引起猪链球菌病的重要的病原，虽然还不完全了解涉及猪链球菌的发病机理和致病力的机制，但临床上猪链球菌作为一种常在菌，常常定植于猪的呼吸道(特别是扁桃体和鼻腔)、生殖道和消化道，以隐形感染的形式存在，表现为亚临床感染。

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染、严重危害养猪业的毁灭性传染病，具有高度传染性和致死性。该病死亡率高达80％-90％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为OIE疾病名录，我国也将其列为一类传染病。猪瘟的防治历来是全世界猪瘟存在国非常重视的课题，为此各国都投入了大量的人力、物力，并取得了很大的成绩。目前疫苗接种仍是控制猪瘟的重要手段。但由于免疫抑制的原因会造成猪瘟疫苗免疫失败，造成严重的经济损失。

发明内容

本发明人意外发现，亚临床感染猪链球菌的猪只免疫猪瘟疫苗，会引起免疫抑制，不能有效的引起免疫应答，是造成免疫失败的一个原因。

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种预防和/或治疗亚临床感染猪链球菌猪只猪瘟疫苗免疫失败的疫苗组合物，包含免疫量的猪瘟病毒抗原、猪链球菌抗原及兽医学上可接受的载剂。

优选地，所述的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒、灭活的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段；更优选地，所述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段；进一步优选的，所述减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒兔化弱毒株，所述起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒E2蛋白；最优选地，所述猪瘟病毒E2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。。

优选地，所述的猪链球菌抗原为减毒的猪链球菌全菌、灭活的猪链球菌全菌或起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段；更优选地，所述的猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌或起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段；进一步优选地，所述灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌2型全菌，所述起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链球菌38KDA蛋白、SaoA蛋白或38KDA蛋白和SaoA蛋白的组合；最优选地，所述灭活的猪链球菌2型全菌为灭活的猪链球菌2型SC株全菌，所述猪链球38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述猪链球菌SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的猪链球菌抗原优选的全菌抗原还包括广东永顺生物制药股份有限公司生产猪链球菌2型灭活疫苗所含的灭活的猪链球菌2型HA9801株全菌、山东华宏生物工程有限公司生产的猪链球菌病蜂胶灭活疫苗所含的猪链球菌2型BHZZ-L4株全菌、武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌病灭活疫苗所含的猪链球菌2型LT株全菌以及猪链球菌7型YZ株全菌。

术语“猪链球菌全菌抗原”指猪链球菌病原的完整菌体。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原和灭活的猪链球菌2型SC株全菌抗原以及载剂组成。

作为本发明的另外一种实施方式，本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原和猪链球菌38KDA蛋白、SaoA蛋白以及载剂组成。

作为本发明的另外一种实施方式，本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒E2蛋白和灭活的猪链球菌2型SC株全菌抗原以及载剂组成。

作为本发明的另外一种实施方式，本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒E2蛋白和猪链球菌38KDA蛋白、SaoA蛋白以及载剂组成。

优选地，所述猪链球38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述猪链球菌SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述猪瘟病毒E2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物中猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒含量为10^5.0～10^6.0TCID₅₀/头份或猪瘟病毒亚单位抗原猪瘟病毒E2蛋白含量为20-120μg/ml；灭活的猪链球菌2型SC株全菌含量为10⁹～10¹⁰CFU/ml或猪链球菌亚单位抗原猪链球菌38KDA蛋白含量为10-100μg/ml，猪链球菌SaoA蛋白含量为50-300μg/ml。

更优选地，本发明疫苗组合物中猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒含量为10^6.0TCID₅₀/头份或猪瘟病毒亚单位抗原猪瘟病毒E2蛋白含量为50μg/ml；灭活的猪链球菌2型SC株全菌含量为10⁹CFU/mL或猪链球菌亚单位抗原猪链球菌38KDA蛋白含量为50μg/ml，猪链球菌SaoA蛋白含量为150μg/ml。

本发明的组合物的成分或组分的“免疫量”优选地是“治疗有效量”。所述“治疗有效量”是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

术语“预防”指通过其与猪瘟、链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与猪瘟、链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。

术语“亚临床感染猪链球菌”又称“猪链球菌亚临床感染”，指猪只体内携带有猪链球菌病原，与猪链球菌血清呈阳性反应，但无典型临床症状，表征健康；主要定植部位为猪的上呼吸道(特别是扁桃体和鼻腔)、生殖道、消化道，无其他病原侵入自然状态下不会发病。

术语“兽医学上可接受的载剂”包括任何及全部佐剂、稳定剂及诸如此类。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。

本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。

本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

术语“稳定剂”指能增加溶液、胶体、固体、混合物的稳定性能化学物，它可以减慢反应，保持化学平衡，降低表面张力，防止光、热分解或氧化分解等作用。本发明所述的稳定剂尤指耐热保护剂，包括谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸、葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇、DL-苏氨酸、肌醇、木糖醇、精氨酸、组氨酸、白蛋白、黏性蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类、脱脂牛奶、血清等其中的一种或几种。

本发明的一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：(1)制备猪瘟病毒抗原、猪链球菌抗原；(2)将步骤(1)制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分别加入载剂各自制备疫苗或按比例混合后加入载剂制备混合疫苗。

优选地，步骤(2)中将步骤(1)制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分别加入载剂各自制备疫苗包括：将猪瘟病毒抗原加入耐热保护剂制备冻干活疫苗，以及灭活猪链球菌抗原并加入佐剂制备灭活疫苗。

优选地，制备猪瘟病毒冻干活疫苗的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒，制备猪链球菌灭活疫苗的猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌；更优选地，减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒乳化弱毒株，灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌2型全菌；最优选地，灭活的猪链球菌2型全菌为灭活的猪链球菌2型SC株全菌。

优选地，猪瘟病毒抗原加入的耐热保护剂为明胶与乳糖；猪链球菌抗原加入的佐剂为水溶性佐剂中的一种gel佐剂。

优选地，用所述猪链球菌灭活疫苗稀释猪瘟病毒活疫苗，即得含有猪瘟病毒抗原、猪链球菌抗原的二联疫苗组合物。

优选地，步骤(2)中将步骤(1)制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原按比例混合后加入载剂制备混合疫苗包括：将猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原按比例混合，加入耐热保护剂制备冻干疫苗或加入佐剂制备灭活疫苗或亚单位疫苗。

优选地，制备冻干疫苗的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒，猪链球菌抗原为起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段；更优选地，减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒乳化弱毒株，起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链球菌38KDA蛋白、SaoA蛋白或38KDA蛋白和SaoA蛋白的组合；最优选地，猪链球38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪链球菌SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，制备灭活疫苗的猪瘟病毒抗原为起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段，猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌；更优选地，起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒E2蛋白，灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌2型全菌；最优选地，猪瘟病毒E2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，灭活的猪链球菌2型全菌为灭活的猪链球菌2型SC株全菌。

优选地，制备亚单位疫苗的猪瘟病毒抗原为起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段，猪链球菌抗原为起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段；更优选地，起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒E2蛋白，起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链球菌38KDA蛋白、SaoA蛋白或38KDA蛋白和SaoA蛋白的组合；最优选地，猪瘟病毒E2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，猪链球38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪链球菌SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

起免疫作用的亚单位蛋白片段的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸；“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列；或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪瘟病毒、猪链球菌亚单位蛋白片段的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪瘟病毒、猪链球菌亚单位蛋白片段的制备还包括通过人工合成的方式来实现。

优选地，加入的耐热保护剂为明胶与乳糖。

优选地，加入的佐剂为水溶性佐剂中的一种gel佐剂。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备预防和/或治疗亚临床感染猪链球菌猪只猪瘟疫苗免疫失败的药物中的应用以及在制备预防和/或治疗猪瘟病毒、猪链球菌相关疾病或感染的药物中的而应用。

本发明具有以下突出优点：

(1)本发明首次找到了一种猪瘟疫苗免疫失败的原因——猪链球菌亚临床感染，利用本发明疫苗组合物进行免疫，可以解决猪瘟疫苗免疫失败的问题；

(2)本发明疫苗组合物包含的猪链球菌38KDA蛋白和SaoA蛋白组合可诱导产生协同作用的免疫效果；

(3)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点；与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性；

(4)本发明的疫苗组合物意外地发现，能增强猪瘟病毒抗原的免疫应答，而且如本发明后续实施例所证明的，在猪链球菌亚临床感染的猪只免疫猪瘟疫苗失败的情况下，本发明疫苗组合物能产生很好的免疫反应，而这出乎本领域普通技术人员预料的。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

本发明所涉及的猪瘟病毒兔化弱毒株购自北京市海淀区中关村南大街8号，由中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412；猪链球菌2型SC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏(CCTCC)，编号为CCTCCM2011351，地址为湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期为2011年10月12日；猪链球菌2型CVCC606菌株购自中国北京中国兽医药品监察所；猪瘟病毒强毒石门系毒株购自中国兽医药品监察所。

实施例1

猪瘟、猪链球菌抗原的制备

1猪瘟抗原的制备

1.1将长成良好单层的对猪瘟病毒兔化弱毒株高敏感的ST细胞(购自ATCC)用含0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液,进行消化分散，细胞计数后接种细胞培养瓶，加入3％犊牛血清的MEM细胞培养液，同时按照M.O.I.＝0.1接毒剂量加入种毒,置于37℃温箱中进行培养。

培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加含1.5％犊牛血清的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，可连续收毒5次。收毒后将抗原混合置于-20℃储藏。

1.2猪瘟病毒含量测定：各收次病毒培养液分别采用间接免疫荧光法进行TCID₅₀测定。每ml病毒含量为10^6.5TCID₅₀。

2猪链球菌抗原的制备

2.1一级种子的繁殖

将猪链球菌2型SC株冻干菌种用缓冲马丁肉汤稀释，分别划线接种于Clumbia羊血琼脂(法国梅里亚公司)，37℃培养24h，选择有明显溶血环、光滑、稍大的菌落接种于Clumbia羊血琼脂(法国梅里亚公司)斜面，37℃培养18～24h作为一级种子。

2.2二级种子的繁殖

用少量缓冲马丁肉汤冲洗一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于含1.5％(v/v)犊牛血清的缓冲马丁肉汤，同时加入0.2％葡萄糖(制成50％溶液灭菌后按比例加入)，37℃静置培养16～18h，经检验纯粹后即为二级种子。

缓冲马丁肉汤的配制：将蛋白胨20g，氯化钠2g加入1000ml牛肉汤中，加热至80～90℃，用氢氧化钠调整pH值为7.2，再缓缓加入磷酸氢二钠1g，碳酸氢钠2g，煮沸90分钟，静置2～8h，吸取上清液，116℃高压灭菌40分钟，灭菌后pH值为7.6～8.0。将葡萄糖配成50％溶液，116℃高压灭菌30分钟，在接种时加入。

2.3制苗用菌液的制备

将缓冲马丁肉汤预热至37℃左右，按10％～20％接种二级种子液，37℃静置培养16～18h，培养期间振摇2～3次，收获菌液做纯粹检验后，置2～8℃保存备用。

2.4抗原制备

将培养液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为1000Kda道尔顿)进行浓缩，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录方法进行活菌计数，并灭活。制备的猪链球菌2型SC株抗原含量为灭活前10¹¹CFU/ml。

3猪链球菌亚单位抗原的制备

3.1材料

本发明采用的pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌DH5α感受态购自宝生物工程(大连)有限公司。

大肠杆菌培养基:LB液体培养液及固体培养基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，用10mol/LNaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用)。

引物设计与合成：

根据SEQ ID NO.1所示的38KDA基因序列，设计上游引引物CGGGATCCCGATGGATATTAGACAGGTTAGA与下游引物GCTGCAGCTTAGTTCTTAAAGCTATGA扩增38KDA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

根据SEQ ID NO.2所示的SaoA基因序列，设计上游引物AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC与下游引物GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA扩增SaoA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

3.2抗原蛋白制备

将猪链球菌2型菌种CVCC606株接种于含有10％灭活新生牛血清的TSA固体培养基(购自Sigma公司)上，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基(购自Sigma公司)中，置于摇床中(150r/min)，37℃震荡培养过夜。

遵照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(购自武汉大风生物技术有限公司)说明书提供的操作方法提取基因组DNA。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

基因组模板	3μl
		10XPCR Buffer(Mg2+plus)	5μl
上、下游引物(50pmol/μl)	2X0.5μl
		Taq酶	2μl
灭菌去离子水	35μl
		2.5mmol/L dNTP Mixture	4μl

反应程序为:94℃预变性5min；94℃1min；52℃、30sec,72℃、1min，30个循环；延伸72℃10min。

PCR产物回收:采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行。

抗原基因的TA克隆：分别将目的基因38KDA蛋白、SaoA蛋白的PCR回收产物和载体pMD18-T于16℃水浴过夜进行连接反应，转化DH5α感受态细胞，37℃在含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，将其分别命名为pMD-38KDA和pMD-SaoA。

重组质粒的双酶切鉴定:利用BamHI和PstI分别酶切pMD-38KDA和pMD-SaoA表达质粒，酶切后出现预期大小的目的片段和载体片断即为正确的重组质粒。

重组表达菌株的构建:分别回收上述步骤酶切产物38KDA和SaoA，并分别与pQE30(BamHI和PstI酶切线性化)于16℃水浴连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，于37℃在LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养12h后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，并分别命名为pQE30-38KDA和pQE30-SaoA。

目的基因的诱导表达:将含重组质粒pQE30-38KDA和pQE30-SaoA的表达菌株接种于含有25μg/ml Kna的3ml LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μl接种于10mL含有25μg/ml Kna的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/l，继续培养3h后收集菌体。

将诱导后的重组大肠杆菌于8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mMTris-Cl(pH5.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。收集蛋白。用Bradford蛋白测定法测量蛋白浓度，并分别将用PH为7.4的PBS溶液调整为1mg/ml。

实施例2

猪瘟、猪链球菌疫苗组合物的制备

1灭活疫苗稀释活疫苗联合使用形式

1.1取实施例1制备的猪瘟全病毒抗原，加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为猪瘟活疫苗。

1.2取实施例1制备的猪链球菌全菌抗原，缓缓加入到水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪链球菌灭活疫苗。

1.3使用时，用猪链球菌灭活疫苗稀释猪瘟活疫苗，疫苗具体配比如表2。

表2猪瘟、猪链球菌疫苗组合物的成分配比

2猪链球菌亚单位抗原与猪瘟抗原联合制备冻干疫苗

取实施例1制备的猪瘟全病毒抗原同猪链球菌38KDA蛋白及SaoA蛋白抗原按比例混合，加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为猪瘟、猪链球菌二联冻干疫苗组合物。具体配比见表3。

表3猪瘟、猪链球菌冻干疫苗组合物的成分配比

实施例3

猪瘟、猪链球菌疫苗组合物的免疫原性试验

1仔猪的免疫程序

将25-30日龄猪瘟、猪链球菌抗原抗体阴性的仔猪170头，试验分17组，第1-2组为疫苗1免疫组，第3-4组为疫苗2免疫组，第5-6组为疫苗3免疫组，第7-8组为疫苗4免疫组，第9-10组为疫苗5免疫组，第11-12组为疫苗6免疫组，第13-14组为疫苗7免疫组，第15-17组为PBS对照组。PBS对照组每头猪注射1ml配比10％(V/V)gel佐剂的PBS，疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗1ml，单次免疫。

2免疫仔猪攻毒保护试验

免疫后21天，对第1组、第3组、第5组、第7组、第9组、第11组、第13组、第15组分别用猪瘟病毒强毒石门系毒株肌肉注射1ml(10⁵MLD)，观察14天，免疫组全部保护，第15组全部发病。对第2组、第4组、第6组、第8组、第10组、第12组、第14组、第16组分别使用猪链球菌2型强毒株SC株进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为5×10⁸CFU，攻毒后观察10天，每天固定时间观察临床状况。每天的临床评分为每只动物的姿势和运动性评分的总和，其基于神经、肌骨骼或呼吸系统疾病的指标如下：

姿势：

0＝正常的姿势和对刺激反应

1＝不活跃并且反应缓慢；眼鼻有分泌物

2＝仅对重复的刺激有反应，情感淡漠

3＝不活动，无反应，对环境没有意识

4＝死亡

运动性：

0＝正常步态和体位

1＝轻微失调，跛，和/或关节肿胀，但是没有辅助可以站起

2＝明显不协调或跛，但是没有辅助可以站起

3＝严重的跛、失调，不能保持站立

4＝死亡

结果在该攻毒剂量下第16组仔猪攻毒后24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡；免疫组2和免疫组4全部保护；免疫组6死亡1头，9头保护并无明显临床症状；免疫组8和免疫组10各死亡1头，其余保护并无明显临床症状；免疫组12死亡3头，其余存活，其中2头出现短暂临床体征并在36小时后逐渐恢复正常；免疫组14死亡2头，其余存活，其中2头出现短暂临床体征并在36小时后逐渐恢复正常。第17组PBS对照组存活，无异常现象发生。具体结果见表4。

表4免疫仔猪攻毒保护结果

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行得，临床评分结果见表5。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率，使用Mann-Whitney分析来比较疫苗对临床评分的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5免疫效果差异不显著(P＞0.05)，疫苗6和疫苗7差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5同疫苗6、疫苗7之间差异极显著(P＜0.01)，而所有疫苗免疫组同攻毒对照组之间差异极显著(P＜0.01)。

表5免疫仔猪猪链球菌感染临床评分结果

通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗3、疫苗4和疫苗5的免疫效果要显著高于疫苗6和疫苗7。证明了本发明包含猪链球菌亚单位抗原38KDA蛋白和SaoA蛋白两种抗原的疫苗组合物免疫效果要优于单一抗原疫苗，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病显著少于单一抗原疫苗，说明本发明疫苗组合物包含的猪链球菌亚单位抗原38KDA蛋白和SaoA蛋白两种抗原协同作用增强了免疫应答，出人意料的达到了较好的免疫保护效果。

实施例4

猪链球菌亚临床感染试验

将15-20日龄猪链球菌抗原抗体阴性并无其他病原感染的仔猪30头，随机分3组，每组10头。其中第1组人工滴鼻感染猪链球菌2型强毒株SC株，剂量为10⁵CFU；第2组人工喷雾感染猪链球菌2型强毒株SC株，剂量为10⁵CFU；第3组作对照。观察10天，第1组和第2组无明显临床症状，第3组无异常现象发生。通过无菌采集鼻拭子进行猪链球菌分离，结果第1组和第2组皆分离到猪链球菌，第3组未分离到猪链球菌。具体结果见表6。

表6猪链球菌亚临床感染试验猪链球菌分离情况

组别	感染方式	感染剂量(CFU)	数量	细菌分离率(％)
					第1组	滴鼻	10⁵	10	100
第2组	喷雾	10⁵	10	100
					第3组	—	—	10	0

通过PCR检测，所有猪只在试验前均未检测到猪链球菌菌血症。人工感染第7天，第1组和第2组分别有6头和5头发生猪链球菌菌血症；人工感染第10天，第1组和第2组全部发生菌血症；第3组对照组无异常现象发生，始终未检测出猪链球菌菌血症。具体结果见表7。

表7试验猪猪链球菌菌血症检测结果

证明在人工感染少量猪链球菌后，猪只体内携带有一定数量的细菌，进而发生菌血症，但就其整个试验过程中，感染猪只无明显的临床体征。分析猪链球菌亚临床感染造成猪瘟疫苗免疫失败的原因，尽管受感染的猪只表面看起来仍然保持健康，但亚临床感染猪链球菌发生菌血症，会造成其免疫系统受损，免疫力下降，免疫无应答反应，造成免疫失败，特别是在外源病原侵入情况下会造成临床病征的发生。

实施例5

猪瘟、猪链球菌疫苗组合物对亚临床感染猪链球菌的免疫效果试验1仔猪的免疫程序

将15-20日龄猪瘟、猪链球菌抗原抗体阴性的仔猪60头，随机分6组，每组10头，其中第2组、第3组和第4组人工滴鼻感染猪链球菌2型强毒株SC株，剂量为10⁵CFU。感染后观察10天，第2组、第3组和第4组无明显临床症状，第1组、第5组和第6组无异常现象发生。

观察10天后进行疫苗免疫，其中第1组和第2组免疫实施例2制备的疫苗2的活疫苗部分猪瘟活疫苗，第3组免疫实施例2制备的疫苗2，第4组免疫实施例2制备的疫苗5，第5组和第6组免疫不免疫。疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗1ml，单次免疫。

2抗体监测

免疫后每周进行采血，分离血清后，采用IDEXX公司生产的阻断ELISA试剂盒检测猪瘟抗体，具体检测结果见表8。表明第1组疫苗2的活疫苗部分免疫后，猪瘟病毒抗体呈上升趋势，免疫后21天，猪瘟抗体阻断率已达47％，呈阳性；第3组和第4组疫苗分别免疫疫苗2和疫苗5，猪瘟病毒抗体也呈上升趋势，免疫后21天，抗体阻断率分别达到51％和45％，均呈阳性；而第2组在人工亚临床感染猪链球菌后免疫疫苗2的活疫苗部分，然而，其猪瘟病毒抗体水平与免疫前变化不大，免疫后21天，猪瘟抗体阻断率依然≤30％，为阴性；第5组和第6组无感染、无免疫组，无异常现象发生，抗体水平均呈阴性。证明了第2组猪瘟病毒免疫失败是由于亚临床感染了猪链球菌，单独的猪瘟疫苗免疫后无应答，而本发明的猪瘟、猪链球菌疫苗组合物在同样亚临床感染猪链球菌的情况下，却依然能引起猪瘟抗体免疫应答，21天后，猪瘟抗体呈阳性，出乎本领域技术人员意料。

表8疫苗免疫后仔猪产生猪瘟病毒抗体的动态变化(10头平均值)

用阻断率判定，阻断率＝(N－S)/N*100％，其中N为标准阴性对照OD值，S为样品血清检测OD值。阴性对照的平均OD₄₅₀大于0.50，阳性对照的阻断率大于50％，该检测结果成立。待检血清当阻断率≥40％，判为阳性；当阻断率≤30％，判为阴性；当阻断率介于30％-40％之间，判为可疑。

3攻毒保护试验

免疫后28天对4组免疫猪及第5组对照组分别用猪瘟病毒强毒石门系毒株肌肉注射1ml(10⁵MLD)，观察14天，免疫组第1组、第3组和第4组全部获得保护，免疫组第2组和攻毒对照组第5组全部发病死亡，第6组对照组存活，无异常现象发生。具体结果见表9。

表9免疫仔猪28天攻毒保护结果

注：()内数字表示连续发烧的天数

攻毒保护试验进一步证明了在亚临床感染猪链球菌的情况下，本发明的疫苗组合物依然能抵抗猪瘟病毒的感染，对猪瘟病毒感染起完全的免疫保护作用。

实施例6猪瘟、猪链球菌二联冻干疫苗的免疫效力试验

1仔猪的免疫程序

将25-30日龄猪瘟、猪链球菌抗原抗体阴性的仔猪70头，试验分7组，第1-2组为实施例2制备的疫苗2免疫组，第3-4组为实施例2制备的疫苗5免疫组，第5-7组为PBS对照组。PBS对照组每头猪注射1ml配比10％(V/V)gel佐剂的PBS，疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗1ml，单次免疫。

2免疫仔猪攻毒保护试验

免疫后21天，对第1组、第3组、第5组分别用猪瘟病毒强毒石门系毒株肌肉注射1ml(10⁵MLD)，观察10天。结果免疫组全部保护，第5组全部发病。攻毒保护结果见表10。证明了本发明疫苗疫苗组合物疫苗2和疫苗5对猪瘟病毒的感染具有完全的保护作用，可有效预防猪瘟病毒的感染。

对第2组、第4组、第6组分别进行腹腔注射攻毒，攻毒用猪链球菌菌液包含有33种血清型的猪链球菌，攻毒剂量为5×10⁸CFU，攻毒后观察10天，并按照实施例3中对攻毒仔猪的临床指标进行评分。

结果第6组仔猪攻毒后24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡；免疫组2死亡5头，5头保护，2头曾出现短暂临床体征的在36小时后逐渐恢复正常，最终保持健康；免疫组4死亡1头9头保护并无明显临床症状。第7组PBS对照组存活，无异常现象发生。具体结果见表10。

表10免疫仔猪攻毒保护结果

组别	免疫方式	免疫类别	数量	攻毒剂量	死亡数	保护率(％)
							1	肌肉注射	疫苗2	10	10⁵MLD	0	100
2	肌肉注射	疫苗2	10	5×10⁸CFU	5	50
							3	肌肉注射	疫苗5	10	10⁵MLD	0	100
4	肌肉注射	疫苗5	10	5×10⁸CFU	1	90
							5	肌肉注射	佐剂PBS	10	10⁵MLD	10	0
6	肌肉注射	佐剂PBS	10	5×10⁸CFU	10	0
							7	肌肉注射	佐剂PBS	10	—	0	—

证明本发明疫苗组合物疫苗5较疫苗2具有更好的保护作用，不仅对猪瘟病毒的感染具有完全的保护作用，还出人意料的对多种血清型猪链球菌的感染具有较好的免疫保护作用。

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行得，临床评分结果见表11。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率，使用Mann-Whitney分析来比较疫苗对临床评分的作用。结果显示疫苗5同疫苗2差异极显著(P＜0.01)，所有免疫组同攻毒对照组之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5的免疫效果要显著高于疫苗2。

表11免疫仔猪猪链球菌临床评分结果

组别	1天	2天	3天	4天	5天	6天	7天	8天	9天	10天
											2	1.2	3.6	4	4.4	4.4	4	4	4	4	4
4	1	1.6	1.8	1.4	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
											6	4.5	6.5	7	7.2	8	8	8	8	8	8

证明了本发明包含两种猪链球菌亚单位抗原的疫苗组合物在抵抗多种血清型猪链球菌感染的保护效果要优于单一血清型全菌抗原疫苗组合物，通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明包含两种猪链球菌亚单位抗原的疫苗组合物临床疾病也显著少于单一血清型全菌抗原疫苗组合物。本发明包含两种猪链球菌亚单位抗原的疫苗组合物可有效抵抗猪瘟病毒的感染的同时，也有效抵抗不同血清型猪链球菌的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪瘟病毒、猪链球菌感染的途径。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种疫苗组合物及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)

<400> 1

atggatatta gacaggttag agaaaccatt gaaatgattg aggagcagaa tttcgatatt 60

cggaccatca ccatggggat ttccctcttg gactgtatcg actcggatat cgacaaggct 120

gcggagaaag tgtataccaa gattgtcacc aaggccaaga acttggtagc agtcggcgat 180

gagattgcgg cagaactagg acttcccatt gtcaacaaac gggtgtcagt aacgcctatt 240

gctttgattg gtgcggcgac ggatgccacg gattaccttc ccctagctca tgccttggac 300

aaggcggctc atgagatcgg catcgatttt atcggtggtt tttcagctct tgctcaaaag 360

ggctaccaaa aaggtgatga aatcctcatc aactctattc cgcaggcatt ggcccaaacc 420

tctaaggtct gctcgtcagt caatatcggc tcgaccaaga cgggtatcaa tatgacggct 480

gtgcgggaca tggggcggat cattaaggag acggcggagg cttctgatat gggggctgcc 540

aagttggtgg tctttgccaa tgcggttgag gacaatcctt tcatggcggg ggccttccac 600

ggtgtcggcg aggcggatgt ggtcatcaat gtcggcgtgt ctgggcctgg tgtggtcaag 660

cgtgcccttg aaaaagtgcg tggtgagagc tttgatgtgg tggcggagac cgtcaagaag 720

acggctttca agattacccg tatcggtcag ttggtcggca atatggccag tgaacgcctg 780

ggggttaagt tcggtatcgt ggacctgtcg cttgctccaa caccagctgt tggcgactca 840

gtagcacggg ttttggagga aatgggctta gaaaccgttg gtacgcacgg aacgactgct 900

gccctggctt tgctcaatga cgcagtcaaa aagggtgggg tcatggcctg caaccaagtc 960

ggtggcttgt caggtgcctt tatccctgtg tctgaggatg agggcatgat tgcggcggtg 1020

caaaatggct cgctcaacct tgaaaaattg gaagccatga cggctatctg ttctgtaggt 1080

ttggacatga ttgccattcc agaaacaacg cctgctgaaa ccattgcggc tatgattgcg 1140

gatgaagcgg ctattggggt tatcaatcag aaaacaactg cggttcgtat tattccgctt 1200

ggaaaagaag gagacatgat tgaatttggc ggccttctgg gaacagctcc tgttatgaag 1260

gtcaatcaag cttcgtctgt ggactttatc aaccgtggtg gtcagattcc agcaccgatt 1320

catagcttta agaactaa 1338

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)

<400> 2

caacctgatg ggggacaggc tacttcaaag gcggttaatg tcaaaatacc agcagtagta 60

cgactatttg gtcgtgagct tctagaaaat gaatttaaat ttgagcttag agaagcgaat 120

ggcgaggaac tccctgtcct tgatacagct caaaatacaa aagagggtca agttagattt 180

aaaaatctat cattcgataa gcctggcaaa tactggtata caatttcaga agtaaaagat 240

gagcttggtg gtattgagta tgattcgaaa tatattgtag caaaaataac tgtagaagat 300

cgaaacgggc aattacaggc aatgatcgaa tttattgata atgacaatgt ctttaacaat 360

ttctatacac ctgctccagc tgctgctagt ctttcgataa aaaaagtcct cgagggacgt 420

accttaaaca ccggtgaatt cgaatttgtt ttaaaaaatg aaaaaggcga tgaaatcgaa 480

aaggtaagca atcaagcaga tggttctgta aactttagtg ccctaacatt tacaaaagag 540

ggaacctata cctacactgt ttcagaagtt gatggtggac ttggcgatat tatctatgac 600

aaatcagata ttaaggccac tgttactgtg aaagataaca atcacggaca actagtctca 660

acagtgactt atgaaaatag cgatcaaatc ttcgagaata ttttgaatcc tgggaagtta 720

atagcgccaa ccacggatag cgttattact gataatgaag tctctaagga agcaatg 777

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)

<400> 3

Met Asp Ile Arg Gln Val Arg Glu Thr Ile Glu Met Ile Glu Glu Gln

1 5 10 15

Asn Phe Asp Ile Arg Thr Ile Thr Met Gly Ile Ser Leu Leu Asp Cys

20 25 30

Ile Asp Ser Asp Ile Asp Lys Ala Ala Glu Lys Val Tyr Thr Lys Ile

35 40 45

Val Thr Lys Ala Lys Asn Leu Val Ala Val Gly Asp Glu Ile Ala Ala

50 55 60

Glu Leu Gly Leu Pro Ile Val Asn Lys Arg Val Ser Val Thr Pro Ile

65 70 75 80

Ala Leu Ile Gly Ala Ala Thr Asp Ala Thr Asp Tyr Leu Pro Leu Ala

85 90 95

His Ala Leu Asp Lys Ala Ala His Glu Ile Gly Ile Asp Phe Ile Gly

100 105 110

Gly Phe Ser Ala Leu Ala Gln Lys Gly Tyr Gln Lys Gly Asp Glu Ile

115 120 125

Leu Ile Asn Ser Ile Pro Gln Ala Leu Ala Gln Thr Ser Lys Val Cys

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Gly Ser Thr Lys Thr Gly Ile Asn Met Thr Ala

145 150 155 160

Val Arg Asp Met Gly Arg Ile Ile Lys Glu Thr Ala Glu Ala Ser Asp

165 170 175

Met Gly Ala Ala Lys Leu Val Val Phe Ala Asn Ala Val Glu Asp Asn

180 185 190

Pro Phe Met Ala Gly Ala Phe His Gly Val Gly Glu Ala Asp Val Val

195 200 205

Ile Asn Val Gly Val Ser Gly Pro Gly Val Val Lys Arg Ala Leu Glu

210 215 220

Lys Val Arg Gly Glu Ser Phe Asp Val Val Ala Glu Thr Val Lys Lys

225 230 235 240

Thr Ala Phe Lys Ile Thr Arg Ile Gly Gln Leu Val Gly Asn Met Ala

245 250 255

Ser Glu Arg Leu Gly Val Lys Phe Gly Ile Val Asp Leu Ser Leu Ala

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Val Gly Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Glu Glu Met

275 280 285

Gly Leu Glu Thr Val Gly Thr His Gly Thr Thr Ala Ala Leu Ala Leu

290 295 300

Leu Asn Asp Ala Val Lys Lys Gly Gly Val Met Ala Cys Asn Gln Val

305 310 315 320

Gly Gly Leu Ser Gly Ala Phe Ile Pro Val Ser Glu Asp Glu Gly Met

325 330 335

Ile Ala Ala Val Gln Asn Gly Ser Leu Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ala

340 345 350

Met Thr Ala Ile Cys Ser Val Gly Leu Asp Met Ile Ala Ile Pro Glu

355 360 365

Thr Thr Pro Ala Glu Thr Ile Ala Ala Met Ile Ala Asp Glu Ala Ala

370 375 380

Ile Gly Val Ile Asn Gln Lys Thr Thr Ala Val Arg Ile Ile Pro Leu

385 390 395 400

Gly Lys Glu Gly Asp Met Ile Glu Phe Gly Gly Leu Leu Gly Thr Ala

405 410 415

Pro Val Met Lys Val Asn Gln Ala Ser Ser Val Asp Phe Ile Asn Arg

420 425 430

Gly Gly Gln Ile Pro Ala Pro Ile His Ser Phe Lys Asn

435 440 445

<210> 4

<211> 259

<212> PRT

<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)

<400> 4

Gln Pro Asp Gly Gly Gln Ala Thr Ser Lys Ala Val Asn Val Lys Ile

1 5 10 15

Pro Ala Val Val Arg Leu Phe Gly Arg Glu Leu Leu Glu Asn Glu Phe

20 25 30

Lys Phe Glu Leu Arg Glu Ala Asn Gly Glu Glu Leu Pro Val Leu Asp

35 40 45

Thr Ala Gln Asn Thr Lys Glu Gly Gln Val Arg Phe Lys Asn Leu Ser

50 55 60

Phe Asp Lys Pro Gly Lys Tyr Trp Tyr Thr Ile Ser Glu Val Lys Asp

65 70 75 80

Glu Leu Gly Gly Ile Glu Tyr Asp Ser Lys Tyr Ile Val Ala Lys Ile

85 90 95

Thr Val Glu Asp Arg Asn Gly Gln Leu Gln Ala Met Ile Glu Phe Ile

100 105 110

Asp Asn Asp Asn Val Phe Asn Asn Phe Tyr Thr Pro Ala Pro Ala Ala

115 120 125

Ala Ser Leu Ser Ile Lys Lys Val Leu Glu Gly Arg Thr Leu Asn Thr

130 135 140

Gly Glu Phe Glu Phe Val Leu Lys Asn Glu Lys Gly Asp Glu Ile Glu

145 150 155 160

Lys Val Ser Asn Gln Ala Asp Gly Ser Val Asn Phe Ser Ala Leu Thr

165 170 175

Phe Thr Lys Glu Gly Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Ser Glu Val Asp Gly

180 185 190

Gly Leu Gly Asp Ile Ile Tyr Asp Lys Ser Asp Ile Lys Ala Thr Val

195 200 205

Thr Val Lys Asp Asn Asn His Gly Gln Leu Val Ser Thr Val Thr Tyr

210 215 220

Glu Asn Ser Asp Gln Ile Phe Glu Asn Ile Leu Asn Pro Gly Lys Leu

225 230 235 240

Ile Ala Pro Thr Thr Asp Ser Val Ile Thr Asp Asn Glu Val Ser Lys

245 250 255

Glu Ala Met

<210> 5

<211> 362

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒(classical swine fever virus)

<400> 5

Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp Leu Leu Leu Val Thr

1 5 10 15

Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp His Arg Tyr Ala Ile

20 25 30

Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr

35 40 45

Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val

50 55 60

Arg Ala Ile Cys Ile Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr

85 90 95

Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu

100 105 110

Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr

115 120 125

Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala

130 135 140

Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr

145 150 155 160

Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys

165 170 175

Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile Val

180 185 190

Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys

195 200 205

Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Thr Gly Gly Gln Val Arg Gln Cys

210 215 220

Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr

225 230 235 240

Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val

245 250 255

Asp Ser Pro Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly

260 265 270

Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu

275 280 285

Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser

290 295 300

Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys

305 310 315 320

Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln

325 330 335

Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr

340 345 350

Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu Phe

355 360

Claims

1.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的猪链球菌抗原及兽医学上可接受的载剂。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒、灭活的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段；优选地，所述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段；更优选地，所述减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒，所述起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒E2蛋白；最优选的，所述的猪瘟病毒E2蛋白是由SEQ ID NO.5编码的蛋白。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪链球菌抗原为减毒的猪链球菌全菌、灭活的猪链球菌全菌；优选地，所述猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌；更优选地，所述灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌2型全菌。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原和灭活的猪链球菌2型SC株全菌抗原以及载剂组成。

5.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物由猪瘟病毒E2蛋白和灭活的猪链球菌2型SC株全菌抗原以及载剂组成。

6.一种制备权利要求1-5所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

1)制备猪瘟病毒抗原、猪链球菌抗原；

2)将步骤(1)制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分别加入载剂各自制备疫苗或按比例混合后加入载剂制备混合疫苗。

7.根据权利要求1-5所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗亚临床感染猪链球菌猪只猪瘟疫苗免疫失败的药物中的应用。

8.根据权利要求1-5所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒、猪链球菌相关疾病或感染的药物中的应用。