BRPI0608818A2

BRPI0608818A2 - uso de antagonista opióides para atenuação de proliferação e migração de células endoteliais

Info

Publication number: BRPI0608818A2
Application number: BRPI0608818-0A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Moss; Mark Lingen; Patrick A Singleton; Joe G N Garcia
Original assignee: Univ Chicago
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2010-01-26
Also published as: AU2006220682B2; WO2006096626A2; US20080274119A1; AU2006220682A1; US20170258909A1; US9662390B2; CN104248763A; CA2600350C; JP2008531749A; JP2013107892A; CN101171010A; EP1861096B1; MX2007010833A; JP5241484B2; CA2600350A1; EP1861096A2; ES2714198T3; WO2006096626A3; CN101171010B

Abstract

USO DE ANTAGONISTAS OPIóIDES PARA ATENUAçãO DE PROLIFERAçãO E MIGRAçãO DE CéLULAS ENDOTELIAIS. A invenção provê métodos de atenuação, por exempio, inibição ou redução, de proliferação e migração celular, particularmente proliferação e migração de célula endotelial, incluindo aquela associada com angiogênese, usando antagonistas oplóldes, incluindo, mas não limitado a, aqueles que são antagonistas restritos perifericamente.

Description

"USO DE ANTAGONISTAS OPIÓIDES PARA ATENUAÇÃO DEPROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS"

Declaração Com Relação a Pesquisa ou Desenvolvi-mento Com Suporte Federal

Esta invenção foi suportada em parte por subven-ções de National Institutes of Health: DE12322; DE00470; eDE015830. 0 governo dos Estados Unidos tem certos direitosnesta invenção.

Pedidos Relacionados

Este pedido de patente reivindica beneficio sob 35U.S.C. 119 (e) das datas de depósito de USSN 60/659 193 depo-sitado em 7 de março de 2005, 60/725 703 depositado em 12 deoutubro de 2005, 60/731 009 depositado em 28 de outubro de2005, e 60/760 851 depositado em 20 de janeiro de 2006, asinteiras exposições dos quais são aqui incorporadas por re-ferência .

Campo da Invenção

A invenção refere-se a processos de atenuação demigração e/ou proliferação de células endoteliais, especial-mente associadas com tumores, utilizando antagonistas de o-pióides.

Introdução

Proliferação celular é um processo em andamentonormal em todos os organismos vivos que envolve numerososfatores e sinais que são delicadamente balanceados para man-ter ciclos celulares regulares. Se ou não células mamíferascrescerão e dividirão é determinado por uma variedade de me-canismo controle de retroalimentação, que inclui a disponi-bilidade de espaço onde uma célula pode crescer, e a secre-ção de específicos fatores estimuladores e inibidores no am-biente imediato.

Angiogênse e doenças relacionadas com angiogênesesão afetadas por proliferação celular. 0 processo de angio-gênese resulta na formação de novos vasos sangüíneos. Sobcondições fisiológicas normais, animais, incluindo humanos,sofrem angiogênese somente em situações restritas muito es-pecificas. Por exemplo, angiogênese é normalmente observadaem cura de ferimento, desenvolvimento fetal e embriônico eformação do corpus luteum, endométrio e placenta.

Durante o processo de angiogênese, células endote-liais, que normalmente existem em um estado quiescente comoparte de um vaso sangüíneo existente, entre em um estadoproliferativo, migratório. Este estado proliferativo, migra-tório de células endoteliais é eventualmente resolvido quan-do as células retornam ao estado quiescente como parte de umnovo vaso sangüíneo funcional. A geração de novos capilaresenvolve um processo complexo que requer um número de eventoscelulares e moleculares para ocorrer ambos, um padrão espa-cial e temporal. Algumas destas atividades incluem a degra-dação da membrana base circundante do vaso originário, a mi-gração das células endoteliais através de estroma de tecidoconjuntivo, proliferação de células, a formação de estrutu-ras semelhantes a tubos, e a maturação destes tubos forradosendoteliais em novos vasos sangüíneos. (Cliff, 1963;Schoefl, 1963; Ausprunck and Folkman, 1977). Alguns fatoresangiogênicos essenciais incluem fator básico de crescimentode fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular(VEGF), angiopoietinas, citocinas, proteínas de matriz ex-tracelular, e metaloproteases de matriz. Estes fatores sãoproduzidos localmente por células estromais e por leucócitosativados que são recrutados para a área (Risau, W. (1997)nature 386(6626) :671-674; Risau and Flamme (1995) Ann. Ver.Cell Dev. Biol. 11:73-91). Diferente de outros fatores angi-ogênicos, VEGF atua como um mitógeno especifico de célulaendotelial durante angiogênese (Terman et al. , 1992 and Ferrara, 1993) .

Angiogênese pode ser estimulada e utilizada poralguns neoplasmas (por exemplo, tumores) para aumento de to-mada de nutriente. Foi verificado que angiogênese é essenci-al para o crescimento de tumores sólidos além de 2-3 mm emdiâmetro e para metástase de tumor (Folkman, 1995; revistoem Bouck et al., 1996) . Em contraste a angiogênese normal,que conduz a anastomoses e maturação capilar, angiogêneseassociada com neoplasia é um processo continuo. Células en-doteliais são ativadas por células neoplásticas vizinhas para secretarem não somente VEGF que estimula angiogênese, mastambém metaloproteases matrizes (MMP) que degradam a matrizextracelular circundante. As células endoteliais então inva-dem a matriz extracelular onde elas migram, proliferam, e seorganizam para formação de novos vasos sangüíneos, que su-portam crescimento e sobrevivência de neoplasma .

O neoplasma recentemente vascularizado continua acrescer, conduzindo a ainda privação de nutriente e sinali-zação pró-angiogênica crônica. A vasculatura de neoplasmas écaracterizada pela presença de lacunas e uma baixa taxa deanastomoses. Esta vasculatura parcialmente disfuncional ali-menta a permanente requisição de angiogênese. Adicionalmen-te, esta vasculatura incompleta permite derramamento de cé-lulas neoplásticas na circulação sistêmica. Portanto, o po-tencial angiogênico de um neoplasma correlaciona-se com po-tencial de metástase. (Weidner et al. (1991) N. Engl. J.Med. 324(l):l-8; Folkman and Shing (1992) J.Biol. Chem.267(16) :10931-10934) .

Como uma significante proporção de neoplasmas sãodependentes de continuada angiogênese, inibição de angiogê-nese bloqueia crescimento de neoplasma o que freqüentementeconduz a completa necrose do neoplasma. (Weidner et al.(1991) N. Engl. J. Med. 324(l):l-8; Folkman and Shing (1992)J. Biol. Chem. 267(16):10931-10934).

Supressão de qualquer uma das etapas de e/ou fato-res envolvidos em angiogênese pode inibir a formação de no-vos vasos, e por isso, afetar crescimento de tumor e geraçãode metástases. Realmente, foi estimado que a eliminação deuma célula endotelial simples pode inibir o crescimento de100 células de tumor (Thorpe et al., 1995). Também foi veri-ficado que anticorpos elevados contra o fator angiogênicoVEGF foram mostrados suprimirem crescimento de tumor in vivo(Kim et al., 1993) .

Como parte de tratamento e gerenciamento de paci-entes com câncer e muitas condições médicas, agonistas deopióides, como morfina, são amplamente usados para dor asso-ciada. Por exemplo, morfina é usada na fase terminal de cui-dados de aproximadamente metade dos pacientes que morrem decâncer cada ano nos Estados Unidos. Agonistas de opióides,como morfina compreendem um grupo de compostos que atuam so-bre uma série de receptores de opióides endógenos, tais comomu-, kapa-, e delta-receptores em sistemas biológicos. Nor-malmente, estes receptores endógenos ligam opióides endóge-nos. Opióides endógenos são nativamente produzidos por célu-las mamíferas. Opióides endógenos incluem beta-endorfinas,encefalinas, e dinorfinas. Beta-endorfinas mostram uma pre-ferência por receptores mu, encefalinas por receptores deltae dinorfinas por receptores kapa. Agonistas de opióides sãoclassificados por seus efeitos preferenciais sobre os recep-tores opióides endógenos. Genericamente, o receptor - um es-tá associado com alivio de dor, e dependência quimica (porexemplo, vicio de drogas e alcoolismo). Morfina, por exem-plo, é um agonista de opióide-mu. Receptores de opióides nãosão limitados ao cérebro e sistema nervoso central (CNS),por exemplo, a receptores centrais. Receptores de opióidesperiféricos podem ser encontrados em outros tecidos por todoo corpo, por exemplo, tecido gastrointestinal.

A despeito de amplo uso em gerenciamento de dor,morfina e outras medicações opióides podem ter severos efei-tos colaterais que podem ser causados por ativação dos re-ceptores periféricos. Os efeitos colaterais podem ser de di-ficil gerenciamento e podem resultar em o paciente refutandogerenciamento de dor baseado em opióide. Efeitos colateraisde tratamento com opióide incluem náusea, constipação, ini-bição de motilidade gastrointestinal, supressão respiratóriae imuno-supressão. Adicionalmente, morfina e outros agonis-tas de receptor de opióide podem estimular proliferação decélulas endoteliais microvasculares humanas e angiogênese invitro e in vivo em concentrações tipicas no sangue de morfi-na ou equivalente de morfina. Esta atividade pró-angiogênesedos agonistas de opióides, embora paliativa para dor, podeacelerar progressão de tumor.

Antagonistas de opióides são classificados simi-larmente por seus efeitos sobre os receptores de opióides,por exemplo, por sua habilidade para antagonizar um receptormais efetivamente que um outro receptor. Por exemplo, o an-tagonista de opióide naloxona atua como um antagonista com-petitivo de todos os receptores de opióide, mas é aproxima-damente dez vezes mais efetivo em receptores-mu que em re-ceptores kapa, e é, por isso, classificado como um antago-nista de opióide-mu. Antagonistas de opióides podem antago-nizar receptores centrais, receptores periféricos ou ambos.Antagonistas de opióides, e em particular antagonistas deopióides periféricos, têm sido usados para diminuir os efei-tos colaterais de opióides administrados exogenamente, assimcomo para diminuição de indesejados efeitos de excessivosopióides endógenos. Antagonistas de opióides também foramexaminados para seu potencial uso como agentes anti-câncerpara particulares tipos de câncer, como descrito em patentesUS 6 384 044 e 6 136 780 e na literatura cientifica Gupta etal. Câncer Research, 62:4491-98 (2002). Os efeitos anti-câncer de antagonistas de opióides são controversos e nãobem entendidos, mas foi mantido que os efeitos anti-câncerde antagonista de opióide, na extensão em que eles forammostrados, não são relacionados a angiogênese (Poonawala T,et al., WoundRepair Regen. 2005 Mar-Apr; 13 (2):165-74; Po-pov I., Acta Chir. Iugosl. 2004;51 (2) : 117-221; Blebea J., etal., J Vasc Surg. 2002 Mar; 35(3):532-8; Balasubramanian S,et al., J Mol Cell Cardiol. 2001 Dec; 33 (12) : 217 9-87 ; ZagonIS, et al., Int J Oncol. 2000Nov;17(5):1053-61; Blebea J etal., J Vasc Surg. 2000 Aug; 32 (2): 364-73; Pasi A, et al. ,Gen Pharmacol. (991; 22 ( 6) : 1077-9) . De fato,, foi reportadoque em modelo de tumor de xenoenxerto em camundongos, o an-tagonista de opióide naloxona não exibe um efeito signifi-cante sobre angiogênese induzida por morfina. Gupta et al.Câncer Research, 62:4491-98 (2002). Por isso, é surpreenden-te que seja agora verificado que antagonistas de opióidespossam inibir proliferação e migração endotelial associadascom angiogênese.

Breve Descrição da Invenção

A invenção prove processos de atenuação, por exem-plo, inibição ou redução, de proliferação e migração celu-lar, particularmente proliferação e migração de células en-doteliais, incluindo aquelas associadas com angiogênese, u-sando antagonistas de opióides, incluindo, mas não limitadoàqueles que são antagonistas restritos perifericamente.

De acordo com um aspecto da invenção, um processode tratamento é provido. O processo envolve administração aum sujeito com um distúrbio caracterizado por indesejada mi-gração ou proliferação de células endoteliais de uma efetivaquantidade de um antagonista de opióide. O tratamento podeinibir uma ou ambas de migração e proliferação. A indesejadamigração ou proliferação de células endoteliais pode ser in-desejada migração ou proliferação de células endoteliaisvasculares, incluindo, mas não limitada a, indesejada neo-vascularização ou angiogênese. Exemplos de neovascularizaçãoindesejada incluem, mas não são limitadas a, neovasculariza-ção associada com câncer e neovascularização ocular. A de-sordem pode ser qualquer desordem caracterizada por indese-jada migração ou proliferação de células endoteliais. Taisdesordens importantes são câncer, anemia de célula foice,ferimentos vasculares, retinopatias proliferativas e indese-jada proliferação de células endoteliais nos rins e pulmão.

Em realizações importantes, o antagonista de opi-oide é um antagonista de opioide periférico. Antagonistas deopioide periféricos incluem, ma não são limitados a, deriva-dos de morfinan quaternários ou terciários, N-alquil carbo-xilatos de piperidina, e benzomorfans quaternários. Um talimportante antagonista de opioide periférico é metil naltre-xona. Um outro antagonista de opioide é alvimopan. Em reali-zações importantes, a quantidade efetiva é tal que o sujeitotem efetivos niveis em plasma de sangue circulante do anta-gonista de opioide continuamente por pelo menos 1 semana,pelo menos 2 semanas, pelo menos três semanas e, preferivel-mente, pelo menos 4 semanas.

A invenção também inclui a co-administração dosantagonistas de opióides com agentes que não são antagonis-tas de opióides, mas que são não obstante úteis em tratamen-to de distúrbios caracterizados por indesejada migração ouproliferação de células endoteliais. Exemplos de tais agen-tes incluem agentes anti-câncer, agentes anti-neovascularização (por exemplo, anticorpo monoclonal anti-VEGF), agentes anti-diabetes, agentes anti-célula foice, a-gentes de cura de ferimento, e agentes anti-proliferação decélulas endoteliais.

Será entendido que os sujeitos podem ou não estarem simultânea terapia de opioide, dependendo do particulardistúrbio que o sujeito tenha, a seriedade do distúrbio, e anecessidade que o sujeito tenha de gerenciamento de dor. Emalgumas realizações, o sujeito está tomando simultânea tera-pia de opioide. Em algumas realizações, o sujeito está to-mando simultânea terapia de opioide crônica. Em algumas rea-lizações, o sujeito não está tomando simultânea terapia deopioide crônica.

De acordo com um outro aspecto da invenção, umprocesso de inibição de atividade VEGF em células endoteli-ais é provido. 0 processo envolve contato de células com umaquantidade efetiva de um antagonista de opioide.

De acordo com um outro aspecto da invenção, umprocesso de inibição de migração ou proliferação celular in-duzida por opioide exógeno em células endoteliais é provido.O processo envolve contato de células com uma quantidade e-fetiva de um antagonista de opioide.

De acordo com um outro aspecto da invenção, umprocesso de inibição de ativação de Rho A em células endote-liais é provido. O processo envolve contato de células comuma quantidade efetiva de um antagonista de opioide.De acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, o antagonista de opióide preferivelmente é um an-tagonista de opióide periférico, e mais preferivelmente émetil naltrexona.

A invenção prove processos de atenuação de migração e/ou proliferação de células endoteliais de um tumor oucâncer, compreendendo contato de células com uma quantidadeanti-migratória ou anti-proliferativa de um antagonista deopióide. Em um outro aspecto, a invenção prove processos deatenuação de angiogênese associada com câncer. Assim, a in-venção contempla tratamento de um paciente de câncer humano,por exemplo, através de um processo de atenuação de angiogê-nese em um tecido canceroso de um paciente, compreendendoadministração ao tecido canceroso de uma quantidade efetivade um antagonista de opióide.

A invenção também prove um processo de tratamentode neovascularização anormal, compreendendo administração aum paciente em necessidade de tal tratamento, de uma quanti-dade de um antagonista de opióide efetiva para inibir a for-mação de vasos sangüíneos. A invenção também inclui um pro-cesso de atenuação de progressão e metástase de tumor em te-cidos animais, compreendendo contato de células ou tecidosde tumor com uma quantidade inibindo o crescimento de um an-tagonista de opióide, e um processo de atenuação de prolife-ração de células hiperproliferativas em um sujeito, compre-endendo administração ao sujeito de pelo menos um antagonis-ta de opióide, em uma quantidade que é efetiva para atenuarproliferação das células hiperproliferativas.Em uma realização, os antagonistas de opióides sãousados peri-operativamente. Por "peri-operativamente", épretendido antes (por exemplo, em preparação para), durante,e/ou imediatamente após uma cirurgia ou um procedimento en-doscópico ou cirúrgico, por exemplo, colonoscopia, gastrola-paroscopia, e especialmente uma cirurgia ou procedimento ci-rúrgico envolvendo a remoção de um tumor. Os antagonistas deopióides atuam para atenuar a recorrência de e/ou a metásta-se do tumor, especialmente aquele surgindo de angiogêneseassociada com o mesmo.

É antecipado que o antagonista de opióide serápreferivelmente dado em um regime de dosagem continuo, porexemplo, um regime que mantém um minimo, e mesmo mais prefe-rivelmente um nivel relativamente constante no sangue. É a-inda contemplado que os processos da presente invenção podemter valor profilático em certos distúrbios associados comangiogênese anormal. Assim, a invenção prove um processo deprevenção de aparecimento ou reaparecimento de um distúrbioem um mamífero, o distúrbio sendo caracterizado por indese-jada migração ou proliferação de células endoteliais, inclu-indo angiogênese anormal, compreendendo administração a ummamifero em necessidade de tal tratamento, de uma efetivaquantidade de um antagonista de opióide, onde o distúrbio éum câncer, anemia de célula foice, doenças neovasculares o-culares, diabetes, retinopatia ocular, ou outra indesejadaproliferação endotelial nos rins, olhos ou pulmões. Por issoserá entendido que, como aqui usado, tratamento de um sujei-to com um distúrbio caracterizado por indesejada prolifera-ção ou migração de células endoteliais inclui tratamento deum sujeito com um distúrbio ativo para inibir ou curar odistúrbio e tratamento de um sujeito para inibir um distúr-bio de re-ocorrência. Por exemplo, o sujeito pode ter tidoum tumor sólido removido, e o sujeito pode receber o trata-mento para inibir a re-ocorrência de tumor.

Em atenuação de proliferação de células, a inven-ção prove um processo para o tratamento de anormal prolife-ração de células de uma célula expressando fator de cresci-mento endotelial vascular (VEGF) em um mamífero que compre-ende administração ao mamífero de uma quantidade terapeuti-camente efetiva de um antagonista de opioide. A invençãotambém inclui um processo de tratamento de tecido cancerosoem um sujeito compreendendo, administração ao sujeito de umaquantidade de um antagonista de opioide suficiente para ini-bir produção de VEGF no tecido canceroso, assim como um pro-cesso de tratamento de doença angiogênica, o processo com-preendendo contato de um tecido ou uma população de célulasendoteliais com uma composição compreendendo uma quantidadede pelo menos um antagonista de opioide sob condições efeti-vas para inibir angiogênese induzida por VEGF e para tratardoença angiogênica.

Em um outro aspecto, a presente invenção prove umprocesso de inibição ou redução de angiogênese, particular-mente angiogênese induzida por opioide, por exemplo, de cé-lulas de tumor, através de administração ou provimento de umantagonista de opioide, particularmente um antagonista deopioide periférico, a células sofrendo angiogênese. Ainda emum aspecto, a invenção prove processos de tratamento de an-giogênese induzida por opióide em pacientes recebendo trata-mento de opióide ou em pacientes onde a angiogênese é indu-zida por opióides exógenos. 0 grupo anterior é de tipicamen-te pacientes de câncer em gerenciamento de dor baseado emopióide. Os processos compreendem administração de um anta-gonista de opióide a um paciente em uma quantidade antiangi-ogênica, por exemplo, em uma quantidade suficiente para ini-bir ou reduzir a angiogênese induzida por opióide. Naquelespacientes recebendo tratamento de opióide, o opióide e o an-tagonista de opióide periférico podem ser co-administrados.Antagonistas de opióides periféricos podem, assim, ser usa-dos para inibição ou redução de efeitos angiogênicos de opi-óides sobre células de tumor, e atenuarem o crescimento deum tumor. Apropriados antagonistas de opióides genericamenteincluem compostos amina heterociclicos que pertencem a vá-rias diferentes classes de compostos. Por exemplo, uma clas-se, é apropriadamente derivados de morfinan, e em particular,derivados terciários de noroximorfona. Em uma realização, oderivado terciário de noroximorfona é, por exemplo, naloxonaou naltrexona.

Apropriados antagonistas de opióides periféricossão também genericamente compostos amina heterociclicos quepodem pertencer a várias diferentes classes de compostos.

Por exemplo, uma classe é apropriadamente derivados quater-nários de morfinan, e em particular, derivados quaternáriosde noroximorfona. Em uma realização, o derivado quaternáriode noroximorfona é, por exemplo, N-metil naltrexona (ou sim-plesmente metil naltrexona). Uma outra classe é a de piperi-dinas N-substituidas. Em uma realização, a N-piperidina é umN-alquil carbonilato de piperidina, tal como, por exemplo,alvimopan. Uma outra classe de compostos que pode ser de va-lor nos processos da presente invenção são os derivados qua-ternários de benzomorfanos.

Em algumas realizações da invenção, o antagonistade opioide pode ser um antagonista de opióide-mu. Em outrasrealizações, o antagonista de opioide pode ser um antagonis-ta de opioide kapa. A invenção também abrange administraçãode mais de um antagonista de opioide, incluindo combinaçõesde antagonistas de mu, combinações de antagonistas kapa ecombinações de antagonistas de um e kapa, por exemplo, umacombinação de metil naltrexona e alvimopan, ou uma combina-ção de naltrexona e metil naltrexona.

Ainda em realizações, a invenção prove processosde tratamento de angiogênese induzida por opioide em pacien-tes recebendo um opioide, onde um antagonista de opioide pe-riférico e pelo menos um outro agente terapêutico que não éum opioide ou antagonista de opioide são co-administrados aopaciente. Apropriados agentes terapêuticos incluem agentesanti-câncer (incluindo agentes quimioterapêuticos e agentesanti-neoplásticos), assim como outros agentes anti-angiogênese.

Ainda em um outro aspecto, a invenção prove umprocesso de redução de risco de recorrência de câncer ou tu-mor após intervenção médica (tal intervenção inclui mas nãoé limitada a cirurgia, por exemplo, cirurgia pulmonar, pro-cedimentos endoscópicos e cirúrgicos, por exemplo, colonos-copia, gastrolaparoscopia, quimioterapia, etc.), compreen-dendo co-administração a um paciente de câncer de um antago-nista de opióide. Assim, a invenção contempla, por exemplo,um processo de minimização de recorrência pós-operatória de,por exemplo, câncer de mama em um paciente, compreendendoadministração ao paciente de uma quantidade efetiva de umantagonista de opióide. Antagonistas de opióides periféricosde acordo com a presente invenção, por exemplo, MNTX, tambémpodem inibir VEGF, fator de crescimento derivado de plaqueta(PDGF), ou proliferação de células estimulada ou induzidapor esfingosina 1-fosfato (SIP) nas células endoteliais.Breve Descrição de Desenhos

A invenção pode ser melhor entendida e apreciadapor referência à descrição detalhada de realizações especi-ficas aqui apresentadas em conjunção com os desenhos acompa-nhantes nos quais:

A Fig. 1 é um gráfico de barras de inibição depen-dente de dose de migração de célula endotelial microvascularhumana (HMVEC), mostrando os resultados de Exemplo 1.

A Fig. 2 é um gráfico de barras de inibição depen-dente de dose de migração de células endoteliais microvascu-lares humanas, mostrando os resultados de Exemplo 2.

A Fig. 3 é um gráfico de barras de inibição depen-dente de dose de migração de HMVEC usando MNTX e MNTX +DAMGO.

A Fig. 4 é um gráfico de barras de inibição depen-dente de dose de migração de HMVEC usando naloxona e naloxo-na + DAMGO.

A Fig. 5 é um gráfico de barras de efeito depen-dente de dose de M3G e M6G sobre migração de HMVEC.

A Fig. 6 é uma fotomicrografia que mostra migraçãode células endoteliais induzida por morfina na presença eausência de MNTX. Painel A = Controle, Painel B = MS (sulfa-to de morfina), Painel C = MNTX, e Painel D = MS + MNTX. Se-tas são mostradas no Painel A para destacar várias célulasque migraram com sucesso através de membrana.

A Fig. 7 é um gráfico de barras de porcentagem deproliferação (A) e migração (B) de células endoteliais mi-crovasculares pulmonares humanas na presença de VEGF, morfi-na e DAMGO com ou sem MNTX.

A Fig. 8 é um painel de manchas imuno indicando afosforilação (ativação) de tirosina de (A) de anti-VEGF R.l(Flt-1) e 2 (Flk-1) usando VEGF R.l ou 2 imuno-precipitado eanti-fosfo tirosina em células endoteliais microvascularespulmonares humanas na presença de VEGF, morfina e DAMGO comou sem MNTX e um gráfico de barras (B) de porcentagem deproliferação e migração de células endoteliais microvascula-res pulmonares humanas na presença de VEGF, morfina e DAMGOcom ou sem inibidor de VEGF R.

A Fig. 9 é um painel de manchas imuno indicandoativação de RhoA usando anti-RhoA em células endoteliais mi-crovasculares pulmonares humanas na presença de VEGF, morfi-na e DAMGO com ou sem MNTX (A) ou inibidor de VEGF R. (B).

A Fig. 10 é um painel de manchas imuno (A) de cé-lulas endoteliais microvasculares pulmonares humanas na pre-sença de siRNa misturado (alvejando nenhuma seqüência deARNm humana conhecida) ou RhoA siRNA e um gráfico de barrasde porcentagem de proliferação (B) e migração (C) de célulasendoteliais microvasculares pulmonares humanas na presençade VEGF, morfina e DAMGO com ou sem siRNA misturado (alve-jando nenhuma seqüência de ARNm humana conhecida) ou RhoAsiRNA.

A Fig. 11 é um diagrama esquemático resumindo omecanismo de efeitos de MNTX sobre angiogênese.

A Fig. 12 é um gráfico de barras de procentagem deproliferação acima de controle de células endoteliais micro-vasculares pulmonares na presença de SI P, VEGF, PDGF, mor-fina e DAMGO com ou sem MNTX.

A Fig. 13 é um gráfico de barras de porcentagem demigração acima de controle de células endoteliais microvacu-lares na presença de S1P, VEGF, PDGF, morfina e DAMGO com ousem MNTX.

A Fig. 14 é um gráfico de barras de porcentagem deproliferação acima de controle de células endoteliais micro-vasculares pulmonares na presença de S1P, VEGF, PDGF, morfi-na e DAMGO com siRNA misturado (controle) ou com siRNA dereceptor de opióide mu.

A Fig. 15 é um gráfico de barras de porcentagem demigração acima de controle de células endoteliais microvas-culares pulmonares na presença de S1P, VEGF, PDGF, morfina eDAMGO com siRNA misturado (controle) ou com siRNA de recep-tor de opióide mu.

A Fig. 16 é um painel de manchas imuno indicandofosforilação (ativação) do receptor de opióide mu usando re-ceptor de opióide mu imuno-precipitado e (A,C)anti-fosfo-serina, (B,D) anti-fosfo-treonina de células endoteliais mi-crovasculares pulmonares humanas na presença de morfina,DAMGO, S1P, VEGF, PDGF com MNTX (C,D) ou sem MNTX (A,B); (E)é uma mancha imuno de receptor de opióide anti-mu.

A Fig. 17 é uma mancha imuno anti-RhoA de (A,B)RhoA ativado e (C) RhoA total de células endoteliais micro-vasculares pulmonares humanas na presença de morfina, DAMGO,S1P, VEGF, PDGF com MNTX (B) e sem MNTX (A).

A Fig. 18 é um painel de manchas imuno de painelsuperior: (A,B) anti-fosfo-tirosina, (C) anti-VEGF R e pai-nel inferior: (A,B) anti-fosfo-tirosina, (C) anti-PDGF R, decélulas endoteliais microvasculares pulmonares humanas napresença de morfina, DAMGO, VEGF (painel superior) ou PDGF(painel inferior) com MNTX (B em cada painel) ou sem MNTX (Aem cada painel).

A Fig. 19 é um painel de manchas imuno indicandofosforilação (ativação) de tirosina do receptor de S1P3 u-sando receptor de S1P3 imunoprecipitado e (A,B) anti-fosfo-tirosina, (C) anti-SIPaR, de células endoteliais microvascu-lares pulmonares humanas na presença de morfina, DAMGO, eS1P com MNTX (B) ou sem MNTX (A).

A Fig. 20 é um gráfico de barras de porcentagem deproliferação acima de controle de células endoteliais micro-vasculares pulmonares na presença de S1P, VEGF, PDGF, morfi-na e DAMGO com siRNA misturado (controle) ou com RhoA siRNA.

A Fig. 21 é um gráfico de barras de porcentagem demigração acima de controle de células endoteliais microvas-culares pulmonares na presença de S1P, VEGF, PDGF, morfina eDAMGO com siRNA misturado (controle) ou com RhoA siRNA.

A Fig. 22 é um diagrama esquemático resumindo omecanismo de efeitos de MNTX sobre ativação de RhoA e angio-gênese.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção prove processos de atenuaçãode anormal ou indesejável migração e/ou proliferação de cé-lulas endoteliais. Como tal, a invenção prove processos paraatenuação de angiogênese em um tecido ou órgão de um sujeitoatravés do uso de antagonistas de opióides, e uma nova abor-dagem para tratamento de doenças relacionadas angiogênicas eoutras doenças hiperproliferativas em mamíferos. Por exem-pio, como descrito acima, tumores sólidos baseiam-se na ge-ração de novos vasos sangüíneos para nutrientes atingirem ascélulas dentro de tumor. Os fatores de crescimento requeri-dos para angiogênese podem ser produzidos pelas células detumores ou alternativamente, fatores exógenos, como opióidespodem estimular crescimento de novo vaso sangüíneo. A pre-sente invenção através do uso de antagonistas de opióidesprove uma nova abordagem terapêutica para o tratamento detais tumores, onde a geração de novos vasos sangüíneos- den-tro do tumor, antes que as próprias células de tumor, é oalvo. Este tratamento não é provável conduzir ao desenvolvi-mento de células de tumor resistentes.

São aqui descritos antagonistas de opióides queinibem proliferação e migração de células endoteliais indu-zidas por opióides, endógenos ou exógenos, e fatores decrescimento, como VEGF, PDGF, S1P, etc. Antagonistas de opi-óides periféricos, em particular, mostraram uma substancialeficácia em inibição de proliferação e migração de célulasendoteliais induzidas por fator de crescimento e opióide. Oantagonista de opióide periférico metil naltrexona (MNTX)inibiu ambas proliferação e migração induzidas por fator decrescimento e opióide em uma maneira dependente de concen-tração. Em adição, naloxona também inibiu migração endoteli-al induzida por opióide. Deve ser notado, entretanto, que ainibição de naloxona de DAMGO induziu migração de célulasendoteliais ocorrida em uma concentração micromolar, relati-vamente alta, de naloxona. Além disso, foi agora verificadoque antagonistas de opióides, e o antagonista de opióide pe-riférico MNTX em particular, inibe proliferação e migraçãode células endoteliais (EC) induzidas por agonista via ini-bição de receptor de fosforilação e/ou transativação e sub-seqüente inibição de ativação de RhoA. Os agonistas podemser opióides, exógenos e/ou endógenos, fatores angiogênicos(VEGF), e outros fatores de estimulação de proliferação e/oumigração (PDGF, S1P, receptor de A1P3, RhoA, etc). Estesresultados sugerem que inibição de angiogênese por antago-nistas de opióides pode ser uma intervenção terapêutica útilpara, entre outros distúrbios, câncer.

Antes de quaisquer realizações da invenção seremexplicadas em detalhes, é para ser entendido que a invençãonão é limitada em sua aplicação aos detalhes da estrutura efunção da invenção mostrada na seguinte descrição ou ilus-trada nas figuras apostas do desenho. A invenção é capaz deoutras realizações e de ser praticada ou realizada em váriasmaneiras. Também, é para ser entendido que a fraseologia eterminologia aqui usadas são para o propósito de descrição enão devem ser vistas como limitantes. 0 uso de termos taiscomo "incluindo", "compreendendo", ou "tendo" e suas varia-ções é aqui pretendido abranger o item listado a seguir eseus equivalentes assim como itens adicionais.

A menos que de outro modo notado, termos técnicossão usados de acordo com utilização convencional. Como aquiusadas, entretanto, as seguintes definições podem ser úteisno auxilio daqueles praticantes versados em entendimento dainvenção.

"Sujeito" refere-se a humanos, cães, gatos, e cavalos.

"Uso de opioide crônico" refere-se a e é caracte-rizado pela necessidade de niveis substancialmente maioresde opioide para produzir o beneficio terapêutico como um re-sultao de anterior uso de opioide, como é bem conhecido natécnica. Uso crônico de opioide como aqui usado inclui tra-tamento diário com opioide por uma semana ou mais ou uso in-termitente de opioide por pelo menos duas semanas.

"Alquila" refere-se a um grupo hidrocarboneto ali-fático que é saturado e que pode ser reto, ramificado ou ci-clico tendo de 1 a cerca de 10 átomos de carbono na cadeia,e todas as combinações e sub-combinações de cadeias ali.Grupos alquila exemplares incluem metila, etila, n-propila,isopropila, isobutila, butila, isobutila, sec-butila, t-butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila e decila.

"Alquila inferior" refere-se a um grupo alquilatendo a cerca de 6 átomos de carbono.

"Alquenila" refere-se a um grupo hidrocarbonetoalifático contendo pelo menos uma ligação dupla carbono -carbono e tendo de 2 a cerca de 10 átomos de carbono na ca-deia, e toda as combinações e sub-combinações de cadeias a-li. Grupos alquenila exemplares incluem grupos vinila, pro-penila, butenila, pentenila, hexenila, heptenila, octenila,nonenila, e decenila.

"Alquinila" refere-se a um grupo hidrocarbonetoalifático contendo pelo menos uma ligação tripla carbono -carbono e tendo de 2 a cerca de 10 átomos de carbono na ca-deia, e combinações e sub-combinações de cadeias ali. Gruposalquinila exemplares incluem grupos etinila, propenila, bu-tenila, pentenila, hexenila, heptenila, octenila, nonenila,e decenila.

"Alquileno" refere-se a um grupo hidrocarbonetoalifático bivalente tendo de 1 a cerca de 6 átomos de carbo-no, e todas as combinações e sub-combinações de cadeias ali.O grupo alquileno pode ser reto, ramificado ou ciclico. Podeexistir opcionalmente inseridos junto com o grupo alquilenoum ou mais átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio opcio-nalmente substituídos, onde o substituinte de nitrogênio éalquila como descrito anteriormente.

"Alquenileno" refere-se a um grupo alquileno con-tendo pelo menos uma ligação dupla carbono - carbono. Gruposalquenileno exemplares incluem etenileno (-CH=CH-) e prope-nileno (CH=CHCH2-).

"Ciclo alquila" refere-se a qualquer anel monoci-clico ou biciclico estável tendo de cerca de 3 a cerca de 10carbonos, e todas as combinações e sub-combinações de anéisali. O grupo cicloalquila pode estar opcionalmente substitu-ído com um ou mais substituintes grupo ciclo alquila. Gruposciclo alquila exemplares incluem grupos ciclo propila, ciclobutila, ciclo pentila, ciclo hexila, ciclo heptila, e ciclooctila.

"Alquila substituído com ciclo alquila" refere-sea um grupo alquila linear, preferivelmente um grupo alquilainferior, substituído em um carbono terminal com um grupociclo alquila, preferivelmente um grupo C3-8 ciclo alquila.Grupos alquila substituídos com ciclo alquila exemplares in-cluem ciclo hexil metila, ciclo hexil etila, ciclo pentiletila, ciclo pentil propila, ciclo propil metila e semelhan-tes .

"Ciclo alquenila" refere-se a um grupo ciclo ali-fático olefinicamente insaturado tendo de cerca de 4 a cercade 10 carbonos, e todas as combinações e sub-combinações deanéis ali.

"Alcoxi" refere-se a um grupo alquil-O- onde al-quila é como descrito anteriormente. Grupos alcoxi exempla-res incluem, por exemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi eheptoxi.

"Alcoxi alquila" refere-se a grupo alquil-O-alquila onde alquila é como descrito anteriormente.

"Acila" significa um grupo alquil-CO onde alquilaé como descrito anteriormente. Grupos acila exemplares in-cluem acetila, propanoila, 2-metil propanoila, butanoila epalmitoila.

"Arila" refere-se a um radical carbociclico aromá-tico contendo de cerca de 6 a cerca de 10 carbonos, e todasas combinações e sub-combinações de anéis ali. O grupo arilapode estar opcionalmente substituído com um ou dois ou maissubstituintes grupo arila. Grupos arila exemplares incluemfenila e naftila.

"Alquila substituído com arila" refere-se a umgrupo alquila linear, preferivelmente um grupo alquila infe-rior, substituído em um carbono terminal com um grupo arilaopcionalmente substituído, preferivelmente um anel fenil op-cionalmente substituído. Grupos alquila substituídos com a-rila exemplares incluem, por exemplo, fenil metila, feniletila e 3-(4-metil fenil) propila.

"Heterociclico" refere-se a radical carbociclicode sistema de anel monociclico ou multiciclico contendo decerca de 4 a cerca de 10 membros, e todas as combinações esub-combinações de anéis ali, onde um ou mais dos membros doanel é um elemento outro que não carbono, por exemplo, ni-trogênio, oxigênio ou enxofre. O grupo heterociclico podeser aromático ou não-aromático. Grupos heterociclicos exem-plares incluem, por exemplo, grupos pirrol e piperidina.

"Halo" refere-se a flúor, cloro, bromo ou iodo.

"Periférico", em referência a antagonistas de opi-óides, designa antagonistas de opióides que atuam primaria-mente sobre sistemas fisiológicos e componentes externos aosistema nervoso central, por exemplo, eles não cruzam facil-mente a barreira sangue - cérebro em uma quantidade efetivapara inibir os efeitos centrais de opióides. Em outras pala-vras, antagonistas de opióides periféricos não inibem efeti-vãmente os efeitos analgésicos de opióides quando adminis-trados perifericamente, por exemplo, eles não reduzem o e-feito analgésico dos opióides. Por exemplo, os compostos an-tagonistas de opióides periféricos empregados nos processosda presente invenção exibem altos niveis de atividade comrelação a tecido gastrointestinal, enquanto exibindo reduzi-da ou substancialmente.nenhuma atividade sobre sistema ner-voso central (SNC). Os compostos antagonistas de opióidesperiféricos empregados nos presentes processos apropriada-mente exibem menos que cerca de 5-15% de sua atividade far-macológica no CNS, com cerca de 0% (por exemplo, nenhuma a-tividade em CNS) sendo mais apropriado. A característica deatuação não-central de um antagonista de opióide periféricoé freqüentemente relacionada a carga, polaridade e/ou tama-nho da molécula. Por exemplo, antagonistas de opióides aminaquaternária atuando perifericamente são carregados positiva-mente enquanto os antagonistas deopióides amina terciária deatuação central são moléculas neutras. Os antagonistas deopióides periféricos úteis na presente invenção são tipica-mente antagonistas de opióides mu e/ou kapa.

Como aqui usado, "anti-angiogênese" ou "anti-angiogênico" é pretendido referir-se à capacidade de uma mo-lécula / composto para atenuar, por exemplo, inibir, reduzirou modular, proliferação de novos vasos sangüíneos, em ge-ral, e por exemplo, para reduzir ou inibir migração e proli-feração de células endoteliais microvasculares humanas emcultura na presença de certos fatores de crescimento. Comodescrito acima,.a formação de novos vasos sangüíneos por cé-lulas endoteliais envolve migração, proliferação e diferen-ciação das células.

Na seguinte descrição dos processos da invenção,etapas de processo são realizadas em temperatura ambiente epressão atmosférica a menos que de outro modo especificado.

É também especificamente entendido que qualquer faixa numé-rica aqui recitada inclui todos os valores a partir de valorinferior até o valor superior, por exemplo, todas as possí-veis combinações de valores numéricos entre o valor maisbaixo e o valor mais alto enumerados são para serem conside-rados serem expressamente estabelecido neste pedido de pa-tente . Por exemplo, se uma faixa de concentrações ou faixade efeito benéfico é estabelecida como 1% a 50%, é pretendi-do que valores tais como 2% a 40%, 10% a 30%, ou 1% a 3%,etc, são expressamente enumerados neste relatório descriti-vo. Estes são somente exemplos do que é especificamente pre-tendido .

Em um aspecto, a presente invenção refere-se aprocessos de atenuação de anormal ou indesejável migraçãoe/ou proliferação celular, particularmente endotelial, e an-giogênese em tecido ou um órgão de um sujeito. Os processoscompreendem provimento ou administração de um ou mais anta-gonistas de opióides em uma quantidade efetiva a células en-doteliais do tecido ou órgão de um paciente para inibir mi-gração e proliferação de células endoteliais, e angiogênese.A angiogênese Poe, em parte, ser o resultado de recebimentode tratamento com opióide, particularmente para gerenciamen-to de dor em pacientes de câncer, ou tendo altos niveis deopióides endógenos.

Foi observado que morfina e o agonista mu de ence-falina DAMGO([D-Ala2, N-McPhe4, Gly5-ol] encefalina), cadauma causa um aumento dependente de dose em migração de célu-las endoteliais similar àquele de fator de crescimento endo-telial vascular (VEGF) como medido por, por exemplo, um en-saio de quimiotaxia (como detalhado nos exemplos abaixo) ououtros ensaios similares usados para identificação de fato-res em angiogênese de tumor e as drogas que afetam os mes-mos. Em concentrações clinicamente relevantes de morfina, amagnitude do efeito é aproximadamente 70% daquele que é ob-tido por VEGF. Esta migração de células endoteliais baseadaem morfina é atenuada pelo antagonista de opióide mu metilnaltrexona (MNTX) em uma maneira dependente de dose. Por e-xemplo, migração de células endoteliais induzida por morfi-na, em contrações tão baixas como 10~7M, é significantementebloqueada por MNTX 10~7M (Fig. 2). Esta atenuação sugerindofortemente que migração de células endoteliais é mediada poração de morfina sobre o receptor de opióide mu (MOR) . Comodescrito nos exemplos abaixo, o efeito via o MOR antes queoutros receptores de opióide é confirmado através de experi-mentos que mostram que o agonista mu encefalina sintéticaaltamente seletivo DAMGO também induz migração. O efeito mi-gratório induzido por DAMGO é também bloqueado por MNTX(Fig. 3) .

Em uma revisão compreensiva (Neumann et al. Pain1982; 13:247-52), analgesia em pacientes de câncer foi asso-ciada com uma faixa de concentrações de estado estável demorfina em plasma variando de 6 a 364 ng/mL. Foi observadoque um efeito de morfina que causa migração de células endo-teliais em 100 ng/mL bem dentro de faixa de dose clinica.Por isso é acreditado pelos presentes inventores que uma do-se de MNTX que manterá niveis em plasma de MNTX em niveisminimos de MNTX em plasma entre cerca de 25 e 150 ng/mL po-dem ser apropriados. Tais doses são obteniveis e são bem to-leradas (Yuan et al., J Clin Pharmacol 2005;45:538-46).

Alvimopan, um outro antagonista de opióide perifé-rico seletivo dado oralmente, está no estágio final de de-senvolvimento para profilaxia de ileus pós-operatório e ogerenciamento de constipação induzida por opióide (Moss etal., Pain relief without side effects: peripheral opioid an-tagonists. In Schwartz, A.J., editor. 33rd ASA RefresherCourse in Anesthesiology. Philadelphia: Lippincott Williams& Wilkins (na prensa)). Existe alguma transposição de alvi-mopan através de membrana (J. Foss, et al., Clin. Pharm. &Ther. 2005, PII-90, p. 74) e ele pode, por isso, possuir ahabilidade para reverter alguns dos efeitos sistêmicos deopióides sem afetar analgesia mesmo quando dado oralmente.

Sem ser preso a qualquer particular teoria, podeser que o mecanismo de efeito de opióide mu sobre migraçãode células endoteliais ocorra no nivel de membrana na medidaem que MNTX, diferente de naloxona, é uma molécula carregadaem pH fisiológico. Morfina atua via receptores acoplados aproteina-G, enquanto VEGF atua através de receptor de tiro-sina cinases. Embora as ações de agonistas mu e VEGF possamser independentes, há uma crescente evidência de transativa-ção de receptor como um mecanismo. Uma investigação anteriordemonstrou que toxina pertussis dependente de GPCRs transa-tiva receptor de VEGF - 2/F1K1 (Zeng, H. et al. , J. Biol.Chem. 2003; 278:20738-45). Desta maneira morfina pode tran-sativar Fllc-1 e promover um ambiente onde proliferação decélulas endoteliais e crescimento de tumor podem ocorrer. Umrecente estudo de camundongos nocaute MOR infectados com cé-lulas de fibrosarcoma T241 demonstrou significantes diferen-ças nas incidências de crescimento de tumor e um aumento devezes em expressão de Fll c-1 em camundongos tratados commorfina versus controles, versus nenhum aumento em camundon-gos KO tratados com morfina (K. Gupta, comunicação pessoal).Isto ainda prove evidência de que morfina estimula prolife-ração de células endoteliais e promove crescimento de tumorprovavelmente através de transativação de fosforilação deFLK1. Como tal, a presente invenção prove potenciais estra-tégias clinicas usando MNTX assim como outros antagonistasde opióides periféricos em conjunção com terapias correntesalvejando VEGF.. Embora um efeito direto através de transati-vação de receptor seja possivel, um potencial fator adicio-nal envolvido na proliferação de tumores pode bem ser o pa-pel de quimiocinas como integradoras de dor e inflamação.Uma recente revisão sobre este objeto (White et al., NatureVer. Drug Discovery 2005; 4:834-44) também sugere um possi-vel papel para leucócitos em ativação de receptores de opi-óides.

Além disso, foi observado que morfina, DAMGO, eVEGF estimulam ativação de RhoA que é inibida por antagonis-tas de opióides, como MNTX. RhoA é uma importante moléculasinalizante envolvida em angiogênese (Aepfelbacher et al.,1997; Cascone et al. , 2003; Hoang et al., 2004; Liu and San-ger, 2004) . Transativação de receptor de VEGF é importantepara ativação de RhoA induzida por opiato. Silenciamento deexpressão de RhoA bloqueou proliferação e migração de EC in-duzidas por VEGF e opióide, demonstrando um papel para ati-vação de RhoA em atividade angiogênica EC induzida por ago-nista. A atenuação mediada por MNTX de ativação de RhoA podeser importante para o papel inibidor de MNTX sobre angiogê-nese induzida por VEGF e opióide.

Devido morfina e outros opióides em doses clinicasaperfeiçoarem migração de células endoteliais, a presenteinvenção pode ser de valor terapêutico em tratamento com an-tagonista de opióide para pacientes sobre significantes esustentadas doses de opióides que têm tumores se baseando noprocesso angiogênico. Ainda, embora as observações clinicasdo inventor tenham focalizado sobre morfina, que é adminis-trada exogenamente, opióides endógenos, que são liberadosatravés de tensão ou dor, também podem desempenha um papelem migração de célula endotelial. Baseado em experimentos demigração de células endoteliais detalhados abaixo nos exem-plos, MNTX e antagonistas de opióides são genericamente devalor terapêutico como uma terapia angiogênica mesmo ausenteadministração de opióide exógeno (como aqui detalhada). Éimaginado que os processos da presente invenção inibirão oureduzirão o crescimento de vasos sangüíneos dentro e para umtumor. Inibição de crescimento de vasos sangüíneos dentro detumores evita nutrientes e oxigênio serem supridos para otumor para suporte de crescimento além de um certo tamanho.Minimização de número de vasos sangüíneos ou outros tumorestambém diminui a probabilidade de.que o tumor sofra metásta-se.

A presente invenção pode ser de valor terapêuticoem tratamento de antagonista de opióide para pacientes quetêm tumores se baseando no processo angiogênico. Tumores quese baseiam em processos angiogênicos são tumores sólidos,leucemias e mielomas. Tumores sólidos incluem, mas não sãolimitados a carcinoma cortical adrenal, tumores da bexiga;carcinoma de célula escamosa, carcinomas uroteliais; tumoresdo osso; adamantinoma, cistos de osso aneurismais, condro-blastoma, condroma, fibroma condromixóide, condrosarcoma,displasia fibrosa do osso, tumor de célula gigante, osteo-condroma, osteosarcoma; tumores de mama; carcinoma de dutosecretor, cordoma; tumores de cólon: adenocarcinoma colo-retal; tumores dos olhos: melanoma uveal posterior, fibrogê-nese imperfecta ossium, carcinoma de célula escamosa de pes-coço e cabeça; tumores dos rins: carcinoma de célula renalcromofóbica, carcinoma de célula renal clara, nefroblastoma(tumor Wilms), rim: carcinoma de célula renal papilar, tumorASPSCR1-TFE3 renal primário, carcinoma de célula renal; tu-mores de figado: hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular;tumores de pulmão : carcinoma de célula não-pequena, câncerde célula pequena; melanoma maligno de partes moles; tumoresde sistema nervoso; meduloblastoma, meningioma, neuroblasto-ma, tumores astrociticos, ependimomas, tumores de bainha denervo periférico, feocromocitoma; tumores de ovário: tumoresepiteliais, tumores de célula germe, tumores estromaiscordão de sexo, pericitoma; adenomas de pituitária; tumorrabdóide; tumores de pele; histiocitomas fibrosos benignoscutâneos; tumores de músculo liso; leiomiomatose intraveno-sa; tumores de tecido macio; liposarcoma, liposarcoma mixói-de, sarcoma fibromixóide de baixo grau, leiomiosarcoma, sar-coma de parte macia alveolar, histiocitoma fibroso angioma-tóide (AFH), sarcoma de célula clara, tumor de célula redon-da pequena desmoplástica, elastofibroma, tumores de Ewing,condrosarcoma mixóide extra-esqueleto, tumor miofibroblásti-co inflamatório, lipoblastoma, tumores lipomatosos benignos/ lipoma, tumores lipomatosos malignos / liposarcoma, mioe-pitelioma maligno, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial, câncerde célula escamosa; tumores dos testículos: tumores de célu-las germes, seminoma espermatocitico; tumores de tiróide:carcinoma anaplástico (não-diferenciado) , tumores oncociti-cos, carcinoma papilar; tumores de útero: carcinoma e cérvi-ce, carcinoma endometrial, leiomioma, etc.

Em uma realização da invenção os tumores são cân-cer de próstata, tumores gastrointestinais como câncer decolo ou pancreático e os compostos da invenção são coadmi-nistrados com outros agentes anticâncer como aqui descritos.

Os antagonistas de opióides de acordo com a pre-sente invenção incluem ambos, antagonistas de opióides atu-ando centralmente e perifericamente. É contemplado que aque-les antagonistas de particular valor são apropriadamente osantagonistas de opióides periféricos. Especialmente apropri-ado pode ser um antagonista de opioide mu, especialmente umantagonista de opioide periférico mu. Antagonistas de opiói-des formam uma classe de compostos que pode variar em estru-tura enquanto mantendo a propriedade restritiva periférica.Estes compostos incluem morfinans terciários e quaternários,em particular derivados de noroximorfona, piperidinas N-substituidas, e em particular, N-alquil carboxilatos de pi-peridina, e 20 benzomorfanos terciários e quaternários. An-tagonistas perifericamente restritos, enquanto variados emestrutura, são tipicamente carregados, polares e/ou de altopeso molecular, cada um dos quais impede seu cruzamento dabarreira de sangue - cérebro.

Exemplos de antagonistas de opióides, que cruzam abarreira de sangue - cérebro e são centralmente ativos (eperifericamente), incluem, por exemplo, naloxona, naltrexona(cada um dos quais é comercialmente disponível de BaxterPharmaceutical Products, Inc.) e nalmefene (disponível de,por exemplo, DuPont Pharma). Estes podem ser de valor na a-tenuação de angiogênese no sistema nervoso central ou em pa-cientes não sendo tratados para gerenciamento de dor ou ou-tro tratamento opioide.

Um antagonista de opioide periférico útil para apresente invenção pode ser um composto que é um derivado demorfinam quaternário, e em particular, um noroxi morfonaquaternário de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 35</formula>

onde R é alquila, alquenila, alquinila, arila, al-quila substituído com ciclo alquila ou alquila substituído com arila, e X' é o na ion, especialmente um anion cloreto, brometo, iodeto ou metil sulfato. Os derivados de noroxi morfona de fórmula (I) podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o procedimento na patente US 4 176 186, que é a-qui incorporada por referência; ver também, patentes US 4 719 215; 4 861 781; 5 102 887; 5 972 954 e 6 274 591; pedidos de patente US 2002/0028825 e 2003/0022909; e publicações PCT WO 99/22737 e WO 98/25613, todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Um composto de fórmula (I) de particular valor é N-metil naltrexona (ou simplesmente metil naltrexona), onde Ré ciclo propil metila como representado na fórmula (II):<formula>formula see original document page 36</formula>

onde X' é como descrito acima. Metil naltrexona é um derivado quaternário do antagonista de opióide naltrexona. Metil naltrexona existe como um sal, e "metil naltrexona" ou "MNTX", como aqui usado, por isso abrange sais. "Metil naltrexona" ou "MNTX" especificamente inclui, mas não é limitado a, sais brometo, sais cloreto, sais iodeto, sais carbonato, e sais sulfato de metil naltrexona. Nomes usados para o sal brometo de MNTX na literatura incluem: brometo de metil naltrexona; brometo de N-metil naltrexona; metobrometo de naltrexona; metil brometo de naltrexona; SC-37359, MRZ-2663-BR, e metobrometo de N-ciclo propil metil noroxi morfina. Metil naltrexona é comercialmente disponível de , por exemplo, Mallinckrodt Pharmaceuticals, St. Louis, Mo. Metil naltrexona é provida como um pulverizado cristalino branco,livremente solúvel em água, tipicamente com o sal brometo. O composto como provido é 99,4% puro por HPLC de fase reversa, e contem menos que 0,011% de naltrexona não-quaternizada a-través do mesmo processo. Metil naltrexona pode ser preparada como uma solução estéril em uma concnetração de, por e-xemplo, cerca de 5 mg/mL. .

Outros apropriados antagonistas de opióides periféricos podem incluir piperidinas N-substituidas, e em particular, N-alquil carboxilatos de piperidina como representados pela fórmula (III) :

<formula>formula see original document page 37</formula>

onde

R1 é hidrogênio ou alquila;

R2 é hidrogênio, alquila, ou alquenila;

R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila ou alquila substituído com arila;

R4 é hidrogênio, alquila, ou alquenila;

A é OR5 ou NR6R7; onde

R5 é hidrogênio, alquila, alquenila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila ou alquila substituído com arila;

R6 é hidrogênio ou alquila;R7 é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila ou alquila substituído com arila, ou B substituído com alquileno ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados, R6 e R7 formam um anel heterociclico selecionado de pirrol e piperidina;

<formula>formula see original document page 38</formula>

onde R é hidrogênio ou alquila;

R9 é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila, ou alquila substituído com arila ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados, R8 e R9 formam um anel heterociclico selecionado de pirrol e piperidina;

W é OR10, NR11R12, ou OE; onde

R10 é hidrogênio, alquila, alquenila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquenila substituído com ciclo alquenila, ou alquila substituído com arila;

R11 é hidrogênio ou alquila;R é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila, alquila substituído com arila ou C(=0)Y substituído com alquileno ou, junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados, R11 e R12 formam um anel heterociclico selecionado de pirrol e piperidina;

E é

<formula>formula see original document page 39</formula>

onde

R13 é alquileno substituído com alquila;

R14 é alquila;

D é OR15 ou NR16R17; onde

R15 é hidrogênio, alquila, alquenila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila, ou alquila substituído com arila;

R16 é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, alquila substituído com arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, ou alquila substituído com ciclo alquenila;

R17 é hidrogênio ou alquila ou, junto com o átomode nitrogênio ao qual eles estão ligados, R e R formam um anel heterociclico selecionado do grupo consistindo em pir-rol ou piperidina;

Y é OR18 ou NR19R20; onde

R18 é hidrogênio, alquila, alquenila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila, ou alquila substituído com arila;

R19 é hidrogênio ou alquila;

R20 é hidrogênio, alquila, alquenila, arila, ciclo alquila, ciclo alquenila, alquila substituído com ciclo alquila, alquila substituído com ciclo alquenila, ou alquila substituído com arila ou, juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados, R19 e R20 formam um anel heterociclico selecionado de pirrol e piperidina;

R21 é hidrogênio ou alquila;

e n é 0 a 4.

Particulares N-alquil carbonilatos de piperidina que podem ser de valor são piperidinas N-alquil amino-3,4,4-20 substituídas, como alvimopan representado abaixo como fórmula (IV) :<formula>formula see original document page 41</formula>

Apropriadas piperidinas N-substituidas podem ser preparadas como mostrado nas patentes US 5 270 328; 6 451 806; 6 469 030, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Alvimopan é disponível de Adolor Corp., Exton, PA. Tais compostos têm pesos moleculares moderadamente altos, uma forma zwiteriônica e uma polaridade que evita penetração da barreira de sangue - cérebro.

Ainda outros compostos antagonistas de opióides periféricos apropriados podem incluir compostos benzomorfan quaternários. Os compostos benzomorfan quaternários empregados nos processos da presente invenção exibem altos niveis de antagonismo de morfina, enquanto exibindo reduzida, e preferivelmente substancialmente nenhuma, atividade agonis-ta.

Os compostos benzomorfan quaternários que podem ser empregados nos processos da presente invenção têm a seguinte fórmula (V):<formula>formula see original document page 42</formula>

onde;

R1 é hidrogênio, acila ou acetoxi; e

R2 é alquila ou alquenila;

R é alquila, alquenila ou alqueinila e

X é um anion, especialmente um anion cloreto, brometo, iodeto, ou metil sulfato.

Específicos derivados quaternários de compostos benzomorfan que podem ser empregados nos processos da presente invenção incluem os seguintes compostos de fórmula (V): brometo de 2 -hidroxi-5,9-dimetil-2,2-dialil-6,7-benzo morfanium; brometo de 2-hidroxi-5,9-dimetil-2-n-propil-2-alil-6,7-benzo morfanium; brometo de 2-hidroxi-5,9-dimetil-2-n-propil-2-propargil-6,7-benzo morfanium; e brometo de 2-acetoxi-5,9-dimetil-2-n-propil-2-alil)-6,7-benzo morfanium.

Outros compostos benzomorfan quaternários que podem ser empregados nos processos da presente invenção são descritos, por exemplo, na patente US 3 723 440, a inteira exposição da qual é aqui incorporada por referência.

Os compostos empregados nos processos da presente invenção podem existir em forma de pró-droga. Como aqui usa-do, "pró-droga" é pretendido incluir quaisquer carreadores ligados covalentemente que liberam a droga parente ativa de acordo com fórmulas (I) a (V) ou outras fórmulas ou compostos empregados nos processos da presente invenção in vivoquando tal pró-droga é administrada a um sujeito mamifero. Desde que pró-drogas são conhecidas aperfeiçoarem numerosas qualidades desejáveis de compostos farmacêuticos (por exemplo, solubilidade, biodisponibilidade, fabricação, etc), os compostos empregados nos presentes processos podem, se desejado, ser liberados em forma de pró-droga. Assim, a presente invenção contempla processos de liberação de pró-drogas. Pró-drogas dos compostos empregados na presente invenção podem ser preparadas através de modificação de grupos funcionais presentes no composto de modo que a as modificações sejam clivadas, tanto em manipulação de rotina como in vivo, para o composto parente.

Da mesma maneira, pró-drogas incluem, por exemplo, compostos aqui descritos nos quais um grupo hidroxi, amino ou carboxi está ligado a qualquer grupo que, quando a pródroga é administrada a um sujeito mamifero, cliva para formar uma hidroxila livre, amino livre, ou ácido carboxilico, respectivamente.

Exemplos incluem, mas não são limitados a, derivados acetato, formato e benzoato de grupos funcionais álcool e amina; e alquil, carboxilico, aril, e alquil aril ésteres tais como metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, s-butil, t-butil, ciclo propil, fenil, benzil e fenetil ésteres, e semelhantes.Como notado, os compostos empregados nos processos da presente invenção podem ser preparados em um número de maneiras bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Todas as preparações mostradas em associação com a presente invenção são contempladas serem praticadas em qualquer escala, incluindo miligrama, grama, multigrama, quilograma, multiquilograma, ou escala farmacêutica comercial.

Compostos empregados nos presentes processos podem conter um ou mais átomos de carbono substituídos assimetricamente, e podem ser isolados em forma oticamente ativa ou racêmica. Assim, todas as formas, quiral, diastereomérica, racêmica, epimérica e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a menos que a especifica estereoquimica ou forma isomérica seja especificamente identificada. É bem conhecido na técnica preparar e isolar tais formas oticamente ativas. Por exemplo, misturas de estereoi-sômeros podem ser separadas através de técnicas padrões incluindo, mas não limitadas a, resolução de forma racêmica, cromatografia normal, fase - reversa, e quiral, formação de sal preferencial, recristalização, e semelhantes, ou através de síntese quiral tanto a partir de materiais de partida quirais como através de sintese deliberada de centros qui-rais alvos.

Em algumas realizações da invenção, o antagonista de opióide pode ser um antagonista de opióide mu. Em outras realizações, o antagonista de opióide pode ser um antagonista de opióide kapa. A invenção também abrange administração de mais de um antagonista de opióide, incluindo combinaçõesde antagonistas mu, combinações de antagonistas kapa e combinações de antagonistas mu e kapa, por exemplo, uma combinação de metil naltrexona e alvimopan.

Os processos da presente invenção abrangem provimento de um papel terapêutico ou profilático em outras doenças baseadas em endoteliais, por exemplo, em uma variedade de doenças não-neoplásticas e neoplásticas relacionadas com proliferação e/ou angiogênese, por exemplo, doença de célula foice, doença neovascular do olho tal como retinopatia diabética, glaucoma neovascular, retinopatia de prematuridade, degeneração macular relacionada com idade), proliferação en-dotelial nos rins ou pulmões e psoriase. Condições não-neoplásticas que são suscetíveis a tratamento incluem artrite reumatóide, psoriase, aterosclerose, retinopatias diabéticas e outras proliferativas incluindo retinopatia de prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relacionada com idade, hiperplasias de tiróide (incluindo doença de Grave), transplante de córnea e outro tecido, inflamação crônica, inflamação de pulmão, sindrome nefrótica, pré-eclâmpsia, ascite, efusão pericardial (tal como aquela associada com pericardite), e efusão pleu-ral. Por exemplo, foi mostrado que morfina induziu retinopatia proliferativa em doença de célula foice (Gupta et al. , comunicação pessoal) . É antecipado que tratamento com um antagonista de opióide pode inibir significantemente a retinopatia, particularmente com retinopatia induzida por opióide em pacientes de célula foice que estão em terapia com opióide ativa, e recebem opióides por longos períodos de tempo,incluindo terapia crônica por semanas, meses ou mesmo anos.

Os processos da presente invenção também são imaginados serem de valor em redução de risco de recorrência de uma malignidade ou neoplasma após tratamento com outras modalidades terapêuticas, por exemplo, após intervenção cirúrgica. Por exemplo, a presente invenção prove um processo para redução de risco de recorrência de câncer pós-operatório. Os cânceres podem incluir, por exemplo, câncer de mama ou câncer de próstata, e reduzido risco pode ser obtido atravésde provimento para o paciente sofrendo de tal câncer de uma quantidade de um antagonista de opióide, particularmente um antagonista de opióide periférico. Por exemplo, como descrito acima, pacientes sofrendo cirurgia de câncer de mama tiveram uma significante diferença (quatro vezes) na incidência de recorrência em 2-4 anos dependendo de se os pacientes receberam anestesia regional ou geral (com morfina durante sua cirurgia inicial). Co-administração dos antagonistas de opióides, especialmente antagonista periférico, de acordo com a presente invenção com tratamento cirúrgico pode ser de valor para reduzir a incidência de recorrência do câncer.

Também é contemplado que a invenção prove um processo de inibição de atividade de VEGF através de provimento para as células afetadas ou sujeito, de uma quantidade de um antagonista opióide sob condições suficientes para inibirangiogênese induzida por VEGF. Em outras palavras, os compostos da presente invenção têm atividade antagonista ou inibidora de VEGF.

Como também mostrado nos exemplos abaixo, foi ain-da verificado que um antagonista de opióides periférico, MNTX, atenua não somente migração de células endoteliais induzida por VEGF, mas também indução de migração e/ou proliferação endotelial através de outros fatores pró-migração / pró-proliferativos tais como fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), ou esfingosina 1-fosfato (S1P). Tal atenuação varia de cerca de 10% a 60%, e ainda prove evidência de que os processos da presente invenção t~em valor em ini-bição de fatores pró-migração, pró-angiogênicos.

Os processos da invenção também abrangem tratamento de pacientes, por exemplo, pacientes de câncer, que estão sofrendo tratamento com agonistas de opióides. Agonistas de opióides incluem, mas não são limitados a, morfina, metado-na, codeina, meperidina, fentidina, fentanil, sufentanil, alfentanil e semelhantes. Como descrito acima, agonistas de opióides são classificados por sua habilidade para agonizar um tipo de receptor uma ordem de magnitude mais efetivamente que um outro. Por exemplo, a afinidade relativa de morfina para o receptor mu é 200 vezes maior do que para o receptor kapa, e é por isso classificado como um agonista de opióide mu. Alguns agonistas de opióides podem atuar como agonistas na direção de um receptor e antagonistas na direção de um outro receptor e são classificados como agonistas / antagonistas (também conhecidos como agonistas mistos ou parciais) . "Agonista / antagonista", "agonista parcial", e "agonista misto" são aqui usados intercambiavelmente. Estes opióides incluem, mas não são limitados a, pentazocina, butor-fanol, nalorfina, nalbufina, buprenorfina, bremazocina, ebezocina. Muitos do grupo agonista / antagonista de opióides são agonistas nos receptores kapa e antagonistas nos receptores mu. Ainda, é imaginado que os metabólitos ativos de agonistas de opióides também podem ser ativos como indutores de angiogênese. Por exemplo, os metabólitos de morfina, morfina 3-glicuronídeo (M3G) e morfina 6-glicuronideo (M6G) podem ser fatores pró-angiogênicos ativos.

Genericamente, os antagonistas de opióides periféricos de acordo com a presente invenção podem ser administrados em uma quantidade efetiva de modo que o nivel em plasma do paciente do antagonista de opióide periférico está na faixa de IO"5 M a IO"9 M. Niveis de droga em plasma de paciente podem ser medidos usando processos de HPLC rotineiros conhecidos por aqueles versados na técnica.

Como descrito nos exemplos abaixo, o análogo de encefalina DAMGO induz migração endotelial. Assim, os processos da presente' invenção podem ser de valor para paciente sofrendo de doenças relacionadas com angiogênese ou hiper-proliferativas, por exemplo, câncer, bem à parte de tratamento com agonistas de opióides.

O particular modo de administração do antagonista de opióide selecionado dependerá, é claro, da particular combinação de drogas selecionada, a seriedade da progressão de tumor sendo tratado, no paciente de câncer, a condiçãogeral de saúde do paciente, e a dosagem requerida para eficácia terapêutica. Os processos desta invenção, falando genericamente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração que seja medicamente aceitável, por exemplo,qualquer modo que produza niveis efetivos dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Tais modos de administração incluem oral, retal, tópica (como através de pulverizado, ungüento, gotas, emplastro trans dérmico ou dispositivo iontoforético), transdérmica, subli-gual, intramuscular, infusão, intravenosa, pulmonar, intramuscular, intracavidade, como um aerossol, aural (por exemplo, via gotas de ouvido), intranasal, inalação, intraocular ou subcutânea. Injeção direta também pode ser usada para liberação local. Administração oral ou subcutânea pode ser a-propriada para tratamento profilático ou de longo termo devido a conveniência do paciente assim como o esquema de dosagem. Para doenças oculares, formulações oftálmicas podem ser injetadas ou instiladas diretamente.

Adicionalmente, os antagonistas de opióides podem ser administrados como um comprimido ou cápsula com revestimento entérico. Em algumas realizações, o antagonista de o-pióide é administrado através de um processo de infusão lenta ou através de um processo de liberação com o tempo ou liberação controlada ou como um pulverizado liofilizado.

Quando administrados, os compostos da invenção são dados em quantidades farmaceuticamente aceitáveis e em composições ou preparações farmaceuticamente aceitáveis. Tais preparações rotineiramente podem conter sais, agentes tamponantes, preservativos, e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos. Quando usados em medicamento, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não-farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usa-dos para preparação de seus sais farmaceuticamente aceitáveis e não são excluídos do escopo da invenção. Tais sais famacológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados àqueles preparados a partir dos seguintes áci-dos: clorídrico, bromidrico, sulfúrico, nitrico, fosfórico, maléico, acético, salicilico, p-tolueno sulfônico, tartári-co, citrico, metano sulfônico, fórmico, succinico, naftale-no-2-sulfônico, pamóico, 3-hidroxi-2-naftaleno carboxilico, e benzeno sulfônico. Apropriaos agentes tamponantes incluem, mas não são limitados a, ácido acético e seus sais (1-2% WN) ; ácido citrico e seus sais (1-3% WN) ; ácido bórico e seus sais (0,5-2,5% WN); e ácido fosfórico e seus sais (0,8-2% WN).

Apropriados preservativos incluem, mas não são limitados a, cloreto de benzalcônio (0,003-0,03%, WN); cloro-butanol (0,3-0,9% W/N); parabenos (0,01-0,25% WN) e timero-sal (0,004-0,02% WN).

Para facilidade de administração, uma composição farmacêutica do antagonista de opióide periférico também pode conter um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como lubrificantes, diluentes, ligantes, carrea-dores e desintegrantes. Outros agentes auxiliares podem incluir, por exemplo, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar pressão osmótica, corantes, aromatizante e/ou compostos ativos aromáticos.

Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a material de enchimento, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação sólido, semi - só-lido ou liquido de qualquer tipo. Por exemplo, apropriados carreadores, diluentes, solventes ou veículos farmaceutica-mente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, água, soluções de sais (tampões), álcoois, goma arábica, óleos mine- rais e vegetais, álcoois benzilicos, polietileno glicóis, gelatina, carboidratos como lactose, amilose ou amido, este-arato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, óleos vegetais, monoglicerideos e diglicerideos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo de pentaeritritol, hidroxi metil celulose, polivinil pirrolidona, etc. Fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento como lecitina, através de manutenção do requerido tamanho de partícula no caso de dispersões e através do uso de tensoativos. Prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada através de inclusão de vários agentes antibacteriais e anti-fungos tais como parabeno, clorobuta-nol, fenol, ácido sórbico e semelhantes.

Se um carreador sólido farmaceuticamente aceitável é usado, a forma de dosagem dos análogos pode ser comprimi-dos, cápsulas, pulverizados, supositórios, ou losangos. Se um carreador liquido é usado, cápsulas moles de gelatina, emplastros transdérmicos, pulverizações de aerossóis, cremes tópicos, xaropes ou suspensões líquidas, emulsões ou soluções podem ser a forma de dosagem.

Para aplicação parenteral, são particularmente apropriadas soluções estéreis, injetáveis, preferivelmente soluções não-aquosas ou aquosas, assim como dispersões, suspensões, emulsões, ou implantes, incluindo supositórios. Am-polas são freqüentemente convenientes dosagens unitárias. Forma depósito injetável também pode ser apropriada e pode ser fabricada através de formação de matrizes microencapsu-ladas da droga em polímeros biodegradáveis como polilactideo-poliglicolideo, poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Dependendo da razão de droga para polímero e a natureza do particular polímero empregado, a taxa de liberação de droga pode ser controlada.

Formulações depósitos injetáveis também são preparadas através de arraste da droga em lipossomas ou micro-emulsões que são compatíveis com tecidos de corpo. As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro retendo bactéria ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composiçõessólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outros meios estéreis justo antes de uso.

Para aplicação enteral, são particularmente apropriados comprimidos, drágeas, líquidos, gotas, supositórios, ou cápsulas como cápsulas moles de gelatina. Um xarope, elixir, ou semelhante pode ser usado onde um veiculo adoçado é empregado.

Como notado, outro sistema de liberação pode incluir sistema de liberação com tempo, liberação retardada ou liberação sustentada. Tal sistema pode evitar repetidas administrações dos compostos da invenção, aumentando conveniência para o paciente e o médico e mantendo sustentados níveis de compostos em plasma. Muitos tipos de sistema de liberação controlada são disponíveis e conhecidos por aquelesversados na técnica. Composições de liberação sustentada ou controlada põem ser formuladas, por exemplo, como lipossomas ou aquelas onde o composto ativo é protegido com revestimentos de degradação diferenciada, tal como através de microen-capsulação, revestimentos múltiplos, etc.

Por exemplo, compostos desta invenção podem ser combinados com matrizes de liberação sustentada farmaceuti-camente aceitáveis, tais como polímeros biodegradáveis, para formação de composições terapêuticas. Uma matriz de liberação sustentada, como aqui usada, é uma matriz fabricada de materiais, usualmente polímeros, que são degradáveis por hi-drólise de ácido - base ou enzimática ou através de dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz é atuada por enzimas e fluidos do corpo. Uma matriz de liberação sustentada pode ser desejavelmente escolhida a partir de materiais bio-compativeis como lipossomas, sistema baseado em polímero como polilactideos (ácido poli lático), poliglicolideo (polímero de ácido glicólico), polilactideo co-glicolideo (copo-limeros de ácido lático e ácido glicólico), polianidridos,poli(orto)ésteres, polissacarideos, poliaminoácidos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, polinucleoti-deos, polivinil propileno, polivinil pirrolidona, e silicone; sistema não-polimero tal como ácidos carboxilicos, ácidos graxos, fosfolipideos, aminoácidos, lipideos como esteróis, sistema de liberação de hidrogel, sistema suástico; sistema baseado em peptideo; implantes e semelhantes. Exemplos específicos incluem, mas não são limitados a: (a) sistema erosional no qual o polissacarideo está contido em umaforma dentro de uma matriz, encontrado em patentes US 4 452 775, 4 675 189, e 5 736 152 (aqui incorporadas por referência em suas totalidades) , e (b) sistema difusional onde um componente ativo permeia em uma taxa controlada a" partir de um polimero tal como descrito na patente US 3 854 480, 5 133 974 e 5 407 686 (aqui incorporadas por referência em suas totalidades). Em adição, sistema de liberação hard-wired baseado em bomba pode ser usado, alguns dos quais são adaptados para implante. Apropriados revestimentos entéricos são descritos em PCT WO 98/25613 e patente US 6 274 591, ambas aqui incorporadas por referência.

Uso de um implante de liberação sustentada pode ser particularmente apropriado para tratamento de condições crônicas. Liberação de "longo termo", como aqui usada, significa que o implante é construído e arranjado para liberar niveis terapêuticos do ingrediente ativo por pelo menos 7 dias, e apropriadamente 30 a 60 dias. Implantes de liberação sustentada de longo termo são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem alguns dos sistemas de liberação descritos acima.

Para aplicação tópica, são empregados como forma não-espargivel, forma viscosa a semi-sólida ou sólida compreendendo um carreador compatível com aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica preferivelmente maior que água. Apropriadas formulações incluem, mas não são limitadas a, soluções, suspensões, emulsões, cremes, ungüentos, pulverizados, linimentos, salvas, aerossóis, etc, que são, se desejado, esterilizadas ou misturadas com agentes auxilia-res, por exemplo, preservativos, etc.

Liberação transdérmica ou iontoforética de composições farmacêuticas dos antagonistas de opióides periféricos também é possivel.

Com relação a MNTX especificamente, formulações aquosas podem incluir um agente quelante, um agente tampo-nante, um antioxidante e, opcionalmente, um agente de isoto-nicidade, preferivelmente pH ajustado para entre 3,0 e 3,5. Tais formulações preferidas que são estáveis para autoclavagem e estocagem de longo termo são descritas no pedido de patente 10/821811, agora publicado como 20040266806, inti-tlada "Pharmaceutical Formulation", a exposição da qual é aqui incorporada por referência.

Em uma realização, compostos da invenção são administrados em um regime de dosagem que prove um regime de dosagem continuo para o composto a um sujeito, por exemplo, um regime que mantém niveis minimos em plasma do antagonista de opióides, e preferivelmente elimina as pontas e através de um nivel de droga com regimes convencionais. Apropriadamente, uma dose continua pode ser obtida através de administração de composto a um sujeito em uma base diária usando qualquer um dos processos de liberação aqui mostrados. Em uma realização, a dose continua pode ser obtida usando infusão continua para o sujeito, ou via um mecanismo que facilite a liberação do composto com o tempo, por exemplo, um emplastro transdérmico, ou uma formulação de liberação sustentada. A-propriadamente, compostos da invenção são continuamente liberados para o sujeito em quantidades suficientes para man-ter uma concentração do composto no plasma do sujeito efetiva para inibir ou reduzir angiogênese induzida por opióide; ou em pacientes de câncer, para atenuar crescimento de um tumor. Compostos de acordo com a presente invenção, se providos sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos, são providos em uma quantidade anti-angiogênica efetiva. Será entendido, entretanto, que a utilização diária total dos compostos e composições da presente invenção serão decididas pelo médico atendente dentro do escopo de som de julgamento médico. O especifico nivel de dose terapeutica-mente efetivo para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a severidade do distúrbio; atividade do especifico composto empregado; a especifica composição empregada; a idade, peso de corpo, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a rota de administração; a taxa de excreção do especifico composto empregado; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou simultâneas com o especifico composto empregado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas. Por exemplo, está bem dentro do nivel de conhecimento comum na técnica iniciar doses do com posto em niveis menores que aqueles requeridos para obtenção de desejado efeito terapêutico e aumentar gradualmente a dosagem até o desejado efeito ser obtido.

Se desejado, a dose diária efetiva pode ser dividida em múltiplas doses para propósitos de administração. Conseqüentemente, composições de dose simples podem conter tais quantidades ou seus submúltiplos para constituição dedose diária. Como notado, aqueles versados na técnica facilmente otimizarão doses efetivas e regimes de co-administração (como aqui descrito) como determinado por boa prática médica e a condição clinica do paciente individual.

Genericamente, doses orais dos antagonistas de opióides, particularmente antagonistas periféricos, irão variar de cerca de 0,01 a cerca de 80 mg/kg de peso de corpo por dia. É esperado que doses orais na faixa de 1 a 20 mg/kg de peso de corpo renderão os desejados resultados. Genericamente, administração parenteral, incluindo administração in-travenosa e subcutânea, irá variar de cerca de 0,001 a 5 mg/kg de peso de corpo. É esperado que doses variando de 0,05 a 0,5 mg/kg de peso de corpo renderão os resultados desejados. Dosagem pode ser apropriadamente ajustada para obtenção de desejados niveis de droga, locais ou sistêmicos, dependendo do modo de administração. Por exemplo, é esperado que a dosagem para administração oral dos antagonistas de opióides em uma formulação revestida entericamente pode ser de 10 a 30% da dose oral não-revestida. No evento de que a resposta em um paciente seja insuficiente em tais doses, doses mesmo maiores (ou efetivamente dosagem maior que 30 através de uma rota de liberação mais localizada, diferente) pode ser empregada na extensão em que a tolerância do paciente permite. Doses múltiplas por dia são contempladas paraobtenção de apropriados niveis sistêmicos de compostos. Apropriados niveis de sistema podem ser determinados através de, por exemplo, medição do nivel da droga em plasma de paciente usando processos de HPLC rotineiros conhecidos poraqueles versados na técnica.

Em algumas realizações da invenção, os antagonistas de opióides são co-administrados com o opióide. 0 termo "co-administração" é pretendido referir-se a uma terapia de combinação através de qualquer rota de administração na qual dois ou mais agentes são administrados a um paciente ou sujeito. Co-administração de agentes também pode ser referida como terapia de combinação ou tratamento de combinação. Os agentes podem estar nas mesmas formulações de dosagem ou formulações separadas. Para tratamento de combinação com mais de um agente ativo, onde os agentes ativos estão em formulações de dosagem separadas, os agentes ativos podem ser administrados simultaneamente, ou cada um deles pode ser administrado separadamente em momentos alternados. Os agentes podem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente (por exemplo, um agente pode seguir diretamente administração do outro ou os agentes podem ser dados episodica-mente, por exemplo, um pode ser dado em um momento seguido pelo outro em um momento posterior, por exemplo, dentro de uma semana), tanto quanto eles sejam dados em uma maneira suficiente para permitir que ambos agentes obtenham efetivas concentrações no corpo. Os agentes também podem ser administrados através de rotas diferentes, por exemplo, um agente pode ser administrado intravenosamente enquanto um segundo agente é administrado intramuscularmente, intravenosamente ou oralmente. Em outras palavras, a co-administração do composto antagonista de opióide de acordo com a presente invenção com um opióide é apropriadamente considerada uma prepa-ração farmacêutica combinada que contém um antagonista de opióide e um agnete opióide, a preparação sendo adaptada para a administração do antagonista de opióide periférico em uma base diária ou intermitente, e a administração de agente opióide em uma base diária ou intermitente. Assim, os anta-gonistas de opióides podem ser administrados antes de, simultâneos com, ou após administração dos opióides. Agentes co-administráveis também podem ser formulados como uma mistura, como, por exemplo, em uma formulação simples ou comprimido simples. Estas formulações podem ser parenterais ou orais, como as formulações descritas, por exemplo, nas patentes US 6 277 384; 6 261 599; 5 958 452 e PCT WO 98/25613, cada uma aqui incorporada por referência.

É ainda contemplado que o presente processo pode ser usado .sozinho ou em conjunção com outros tratamentos para controle de crescimento ou migração de células endoteli-ais em conexão com as várias condições descritas acima. O antagonista de opióide periférico pode ser co-administrado com um outro agente terapêutico que não é um opióide ou an-tagonista de opióide. Apropriados tais agentes terapêuticos incluem agentes anti-câncer, por exemplo, agentes quimiote-rapêuticos, radioterapia, ou outros agentes anti-angiogênicos como suramin, ou mab anti-VEGF, uma endostatina ou radioterapia. É imaginado que os antagonistas de opióide de acordo com a presente invenção são de particular valor quando co-administrados com aqueles agentes que inibem atividade de VEGF, por exemplo, mab anti-VEGF. Os anticorpos anti-VEGF são úteis no tratamento de várias doenças neoplás-ticas e não-neoplásticas e distúrbios, incluindo hiperplasia endometrial, endometriose, proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tal como aquele associado com tumores de cérebro e sindrome de Meig) . Um exemplo de mab anti-VEGF é bevacizumab (Avastin, Genentech) descrito na patente US 6 884 879 e WO 94/10202 aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Em certas realizações da invenção, MNTX é co-administrado com Avastatina.

Em outras palavras, os compostos da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de câncer em pacientes, como descrito acima, tanto quando usados sozinhos como em combinação com um ou mais outros agentes anti-câncer, por exemplo, radioterapia e/ou outros tratamentos quimioterapêuticos, incluindo angiogênicos convencionalmenteadministrados a pacientes para tratamento de câncer. As principais categorias e exemplos de tais drogas são aqui listadas e incluem, mas não são limitadas a inibidores de metaloprotease, inibidores de proliferação / migração de célula endotelial, antagonistas de fatores de crescimento angiogênicos, inibidores de sinalização integrina / sobrevivência e quelantes de cobre.

Em certas realizações os compostos da invenção podem ser combinados com conhecidas combinações de agentes anti-câncer. Os compostos da invenção podem ser combinados com um agente anti-angiogênico e um agente quimioterapêutico e administrados a um paciente de câncer. Por exemplo, MNTX pode ser administrado a pacientes de câncer em combinação com Avastatina e 5-flúor uracila.É antecipado que os antagonistas de opióide co-administrados com várias drogas anti-cãncer, radioterapia ou outras drogas anti-angiogênicas podem originar a um efeito antiproliferativo signifÍcantemente aperfeiçoado sobre células cancerosas, e assim provendo um aumentado efeito terapêutico, por exemplo, emprego de antagonistas de opióide periférico para certos tumores pode potencializar sua resposta a outros regimes terapêuticos. Especificamente, um efeito anti-angiogênico signifÍcantemente aumentado é obtido com as combinações co-administradas mostradas acima utilizando menores concentrações do anti-câncer, uma menor dosagem de radiação, ou outras drogas anti-angiogênicas comparado aos regimes de tratamento nos quais as drogas ou radiação são usadas sozinhas, existe o potencial para prover terapia onde efeitos colaterais adversos associados com as drogas anti-câncer ou outras anti-angiogênicas ou radioterapia são consideravelmente reduzidos do que normalmente observado com as drogas anti-câncer ou outras anti-angiogênicas usadas sozinhas em maiores doses. Por exemplo, co-administração de um antagonista de opióide de acordo com a presente invenção com um agente anti-VEGF, por exemplo, mab anti-VEGF, pode reduzir a dose do agente anti-VEGF ou aumentar potência ou eficácia ou ambas. Ainda, como aqui detalhado, a co-administração de um antagonista de opióide de acordo com a presente invenção com outras modalidades anti-câncer pode ter valor profilático.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com inibidores de metaloprotease tais como, por exemplo: Marimastat, inibidor de metaloprotease de matriz sintética (MMPI), British Biotech; Bay 12-9566, MMPI sintético e inibidor de crescimento de tumor, Bayer; AG3340, MMPI sintético, Agouron/Warner-Lambert; CGS 27023A, MMPI sintético, Novartis; CGS 27023A, MMPI sintético; COL-3, MMPI sintético, derivado de tetraciclina, Collagenex; AE-941 (Ne-ovastat), MMPI ocorrendo naturalmente, Aeterna, BMS-275291, MMPI sintético, Bristol-Myers Squibb; penicilamina, inibidor de urocinase, NCI-NABTT.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com inibidores diretos de proliferação / migração de células endoteliais como: TNP-470 (derivado de fumagilina), inibe crescimento de célula endotelial, TAP Phar-maceuticals; esqualamina, inibe trocador de sódio- hidrogênio, NIHE3, Magainina; Combretastatina, indução de apoptose em células endoteliais proliferantes, Oxigene; endostatina, inibição de células endoteliais, EntreMed; penicilamina, bloqueia migração e proliferação de células endoteliais, NCI-NABTT; inibidor de farnesil transferase (FTI), bloqueia migração e proliferação de células endoteliais, NCI-NABTT, -L-778 123 Merck, -S.CH66336 Schering-Plough, -R115777 Jans-sen.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com anagonistas de fatores de crescimento an-giogênicos tais como: anticorpo anti-VEGF, anticorpo mono-clonal que inativa VEGF, Genentech; talidomida, bloqueia atividade de fatores de crescimento angiogênicos (bFGF, VEGF, TNF-alfa), Celgene; SU5416, bloqueia sinalização de receptor de VEGF (Flk-l/KDR) (tirosina cinase), Sugen-NCI; ribozima (Angiozima), atenua ARNm de receptores de VEGF, Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.; SU6668, bloqueia sinalização de receptor de VEGF, bFGF, e PDGF, Sugen; PTK787/ZK22584, bloqueia sinalização de receptor de VEGF, Novartis; Interferon-alfa, inibição de produção de bFGF e VEGF; Suramina, bloqueia ligação de fator de crescimento a seu receptor, NCI-NABTT.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com drogas que inibem sinalização de integrina / sobrevivência especifica endotelial: Vitaxina, anticorpo para alfa-v-beta3 integrina presente sobre a superfície de célula endotelial, Ixsys; EMD121974, bloqueador de molécula pequena de integrina presente sobre superfície de célula endotelial, Meck KGaA.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com quelantes de cobre, como: penicilamina, ligantes de grupo sulfidrila de cobre; limpeza de cobre através de excreção urinaria, NCI-NABTT; tetra tiomolibdato, grupos tióis ligam fortemente cobre, inativam cobre disponível para tumor, University of Michigan Câncer Center; captopril, quela cobre e zinco; também, inibidor de enzima de conversão de MMP e angiotensina, Northwestern University.Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com antagonistas de angiogênese com mecanismos distintos: CAI, inibidor de influxo de cálcio, NCI; ABT-627, antagonista de receptor de endotelina, Abbott/NCI; CM101/ZDO101, toxina Strep grupo B que interrompe seletivamente proliferação de endotélio através de interação com o receptor (CM201), CarboMed/Zeneca; interleucina-12, indução de interferon-gama, regulação descendente de IL-10, indução de IP-10, M.D. Anderson Câncer Center / Temple University, Genetics Institute, Hoffman LaRoche; IM862, bloqueia produção de VEGF e bFGF; aumenta produção do inibidor IL-12, Cy-tran; PNU-145156E, bloqueia angiogênese induzida por proteína Tat, Pharmacia and Upjohn.

Quando usados no tratamento de doenças hiperproli-ferativas, compostos da presente invenção podem ser co-administrados com agentes quimioterapêuticos tais como, por exemplo, alfa interferon, COMP (ciclofosfamida, vincristina, metotrexato e prednisona), etoposide, mBACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina e de-xametasona), PRO-MACE/MOPP (prednisona, metotrexato (resgate w/leucovina), doxorubicina; ciclo fosfamida, paclitaxol, do-cetaxol, etoposide / mecloretamina, vincristina, prednisona e procarbazina), vincristina, vinblastina, angioinibinas, TNP-470, poli sulfato de pentosan, fator de plaqueta 4, an-giostatina, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, talidomida, SP-PG e semelhantes.

Agentes anti-câncer que podem ser co-administradoscom compostos da presente invenção também incluem apropriadamente anti-metabólitos (por exemplo, 5-flúor uracila, me-totrexato, fludarabina), agentes antimicrotúbulos (por exemplo, vincristina, vinblastina, taxanos tais como paclitaxel, docetaxel), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, melfalan, biocloroetil nitroso uréia, hidroxi uréia), nitrogênio mostardas (por exemplo, mecloetamina, melfan, clorambucil, ciclofosfamida e ifosfamida); nitrouréias (por exemplo, carmustina, lomustina, semustina e estreptozocina); agentes platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxa-liplatina, JM-216, Cl-973), antraciclinas (por exemplo, do-xorubicina, daunorubicina), anticorpos (por exemplo, mitomi-cina, idarubicina, adriamicina, daunomicina) , inibidores de topoisomerase (por exemplo, etoposide, camptotecinas) , sulfonatos de alquila incluindo busulfan; triazinas (por exemplo, dacarbazina); etieniminas (por exemplo, tiotepa e hexa metil melamina); análogos de ácido fólico (por exemplo, me-totreaxato); análogos de pirimidina (por exemplo, 5-flúor uracila, citosina arabinosideo); análogos de purina (por exmeplo, 6-mercapto purina, 6-tioguanina); antibióticos anti-tumor (por exemplo, actinomicina D; bleomicina, mitomicina C e metramicina); hormônios e antagonistas de hormônios (por exemplo, tamoxifen, carticosteróides) e quaisquer outros a-gentes citotóxicos (por exmeplo, fosfato de estramustina, prednimustina).

Será entendido que agentes que podem ser combinados com os compostos da presente invenção para a inibição, tratamento ou profilaxia de angiogênese e/ou cânceres nãosão limitados àqueles listados acima, mas incluem, em principio, quaisquer agentes úteis para o tratamento de doenças angiogênicas e crescimento de tumor induzidos por opióide.

A presente invenção é ainda explicada através dos seguintes exemplos, que não devem ser construídos por meio de limitação de escopo da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1:Ensaio de Migração de Células Endoteliais

A atividade anti-angiogênica dos antagonistas de opióide periférico de acordo com a presente invenção foi a-valiada em experimentos testando a habilidade do antagonista para inibir ou modular migração de células endoteliais capilares usando uma câmara Boyden modificada.

O ensaio de migração de células endoteliais foi realizado como descrito por Lingen, M.W., Methods in Molecular medicine, 78:337-347 (2003), a exposição do qual é aqui incorporada por referência. Em resumo, células endoteliais microvasculares humanas (HMVEC) (Cell Systems, Kirkland, WA.) foram privadas por toda noite em meio de crescimento endotelial (EGM) contendo albumina de soro bovino 0,1% (BSA) . Células foram então tripsinizadas e resuspensas em meio Eagle Modificado Dulbecco (DME) com BSA 0,1% em uma concentração de lxlO6 células/mL. Células foram adicionadas ao fundo de uma câmara Boyden modificada de 48 cavidades (NeuroPore Corporation, Pleasanton, CA.) . A câmara foi montada e invertida, e células foram deixadas ligarem-se por 2 horas a 37°C a membranas de quimiotaxia de policarbonato (5um de tamanho de poro) (NeuroProbe) que foram encharcvadas em gelatina 0,1% por toda noite e secadas. A câmara foi então reinvertida e o composto a ser testado em concentrações variáveis em quádruplos, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (como um controle positivo) ou veiculo foram adicionados às cavidades da câmara superior (para um volume total de 50 mL); a aparelhagem foi então incubada por 4 horas a 37°C. Membranas foram recuperadas, fixadas e manchadas (DiffQuick, Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.) e o número de células que migraram para a câmara superior por 10 campos de alta energia foi contado. Migração de fundo para DME+BSA 0,1% foi subtraída e os dados reportados como o número de células que migraram por 10 campos de alta energia (400 vezes). Cada substância foi testada em quadruplicata em cada experimento, e todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. VEGF (R&D System, Minneapolis, MN) foi usado como um controle positivo em uma concentração de 200 pg/mL. A concentração ótima para VEGF foi determinada previamente através de experimentos de dose - resposta (dados não mostrados). Os compostos testados como descrito acima foram morfina, naloxona, metil naltrexona, e a combinação de metil naltrexona e morfina. As concentrações de cada substância testada variaram de 0,001 a 10,0 |aM. A concentração da morfina foi constante em 0,1 |J.M. Os resultados são mostrados na Fig. 1.

A Fig. 1 mostra que morfina aumentou migração em uma maneira dependente de concentração. A co-adição de metil naltrexona e morfina, entretanto, diminuiu migração em umamaneira dependente de concentração. Nem metil naltrexona nem naloxona sozinho afetou migração.

Exemplo 2: Ensaio de Migração de Células Endoteliais

Um outro conjunto de experimentos foi conduzido de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. Neste conjunto de experimentos, metil naltrexona e a combinação de metil naltrexona e morfina foram novamente testados para habilidade de inibirem migração de células endoteliais. As concentrações de metil naltrexona quando testada sozinha variaram de 0,001 a 10,0 uM. Em combinação, a concentrações de metil naltrexona variaram de 0,001 a 10,0 uM, enquanto a concentração de morfina permaneceu constante em 0,1 u.M como descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Fig. 2.

A Fig. 2 mostra que a combinação de metil naltrexona e morfina diminuiu migração em uma maneira dependente de concentração, enquanto metil naltrexona sozinha não afeta migração.

Exemplo 3:Migração de células endoteliais induzida por DAMGO

As drogas usadas neste estudo foram [D-Ala 2, N-McPhe4, Gly5-ol] encefalina ou DAMGO (Sigma, St. Louis, MO); naloxona (Sigma, St. Louis, MO); brometo de N-metil naltrexona ou metil naltrexona (Mallinckrodt Specialty Chemicals, Phillipsburg, NJ). O ensaio de migração de célula endotelial foi realizado como descrito anteriormente (9). Células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Kir-kland, WA) foram provadas por toda noite em meios contendo albumina de soro bovino 0,1% (BSA), colhidas, re-suspensas em meios Eagle modificados Dulbecco (DME) com BSA 0,1%, e revestidas sobre uma membrana gelatinizada semi - porosa em uma câmara Boyden modificada (Nucleoopore Corporation, Plea-santon, CA). Substâncias testes foram então adicionadas às cavidades da câmara superior e células foram deixadas migrarem por quatro horas a 37°C.

Membranas foram recuperadas, fixadas e manchadas e o número de células que migraram para a câmara superior por dez campos de alta energia contado por um observador cegado. Migração de fundo para DME + BSA 0,1% foi subtraída e os dados reportados como o número de células migradas por 10 campos de alta energia (400x) . cada substância foi testada em quadruplicata em cada experimento e todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. A concentração de DAMGO foi 1 uM, VEGF (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi suado como um controle positivo em uma concentração de 200 pg/mL. A concentração ótima para VEGF foi determinada previamente através de experimentos de dose - resposta (dados não mostrados).

Os resultados são mostrados na Fig. 3 que mostra que metil naltrexona e DAMGO diminuíram migração em uma maneira dependente de concentração. A Fig. 4 ilustra resultados similares com naloxona e DAMGO. O metabólito de morfina inativo M3G não exerce atividade angiogênica enquanto M6G conhecido atuar no receptor mu exibiu um efeito dependente de concentração sobre angiogênese (Fig. 5).Exemplo 4:Tratamento de sujeitos humanos e mamíferos com metil naltrexona

Em um primeiro conjunto de experimentos, camundon-gos são induzidos a desenvolverem tumores através de transformação, endogamia ou transplante de células de tumor. Trinta e seis camundongos, cada um transportando tumores tendo um volume de pelo menos 60 mm3, são randomicamente divididos em três grupos. O primeiro grupo recebe uma substância controle compreendendo nem um opioide nem um antagonista de opioide. O segundo grupo recebe um opioide, por exemplo, morfina administrada oralmente em uma dose de 0,5 mg/kg/dia. O terceiro grupo recebe um opioide, por exemplo, morfina administrada oralmente em uma dose de 0,5 mg/kg/dia, e o antagonista de opioide periférico metil naltrexona, administradooralmente em uma dose de 5 mg/kg/dia.

Os compostos são administrados diariamente por um período de oito semanas. Diferenças na taxa de crescimento de tumor, tamanho de tumor, uma redução em angiogênese no tumor e mortalidade dos camundongos entre cada um dos grupos são anotadas. Os resultados demonstram que uma redução em crescimento de tumor e angiogênese comparada a controles ou morfina sozinha.

Em um segundo conjunto de experimentos, pacientes de câncer humanos são arrolados em um estudo. Arrolados noestudo são controlados para idade, estágio de doença, tipos de tratamento e fatores familiares e genéticos. Participantes são divididos em dois grupos de acordo com se estão recebendo opióides, por exemplo, morfina. O grupo recebendoopióides é ainda randomicamente dividido em dois subgrupos. Um dos dois subgrupos recebendo opióides recebe um antago-nista de opióide periférico, por exemplo, metil naltrexona administrado oralmente em uma dose de 5 mg/kg/dia por um periodo de oito semanas. Os outros dois subgrupos recebem placebo pelo mesmo periodo. Diferenças em crescimento de tumor, tamanho de tumor, uma redução em angiogênese no tumor e mortalidade dos participantes em cada um dos grupos são anotadas .

Exemplo 5:Tratamento de sujeitos humanos e mamíferos com Alvimopan

Camundongos que foram induzidos ao desenvolvimento de tumores são submetidos ao protocolo como descrito no E-xemplo 3, exceto que o antagonista de opióide periférico é alvimopan. Os resultados demonstram uma redução em crescimento de tumor e angiogênese comparado a controles ou opióide sozinho.

Pacientes de câncer humanos são arrolados em um estudo conduzido como descrito no exemplo 4, exceto que o antagonista de opióide periférico é alvimopan.

Exemplo 6:Terapias compreendendo co-administração do antagonista de opióide periférico Metil naltrexona e segundo agente terapêutico

Em um primeiro conjunto de experimentos, camundongos são induzidos ao desenvolvimento de tumores através de transformação, endogamia ou transplante de células de tumor. Quarenta e oito camundongos, cada um transportando tumores tendo um volume de pelo menos 60 mm3, são randomicamente di-vididos em seis grupos. 0 primeiro grupo recebe uma substância controle que não compreende um opióide, um antagonista de opióide, ou um agente anti-câncer. 0 segundo grupo recebe um opióide, por exemplo, morfina administrada oralmente em dose de 0,5 mg/kg/dia. O terceiro grupo recebe um opióide, por exemplo morfina administrada oralmente em uma dose de 0,5 mg/kg/dia, e o antagonista de opióide periférico metil naltrexona, administrado oralmente em uma dose de 5 mg/kg/dia. O quarto grupo recebe um opióide, por exemplo, morfina administrada oralmente em uma dose de 0,5 mg/kg/dia, e o antagonista de opióide periférico metil naltrexona administrado oralmente em uma dose de 5 mg/kd/dia com um agente terapêutico anti-câncer, por exemplo, bevacizumab (Avastin) em uma dose de 5 mg/kg cada 14 dias. 0 sexto grupo recebe umopióide, por exemplo, morfina, em uma dose de 0,5 mg/kg/dia e um agente terapêutico anti-câncer, por exemplo, bevacizumab (Avastin) em uma dose de 5 mg/kg cada 14 dias.

Os compostos são administrados diariamente por um período de oito semanas. Diferenças na taxa de crescimentode tumor, tamanho de tumor, uma redução em angiogênese no tumor e mortalidade dos camundongos em cada um dos grupos são anotadas. Os resultados demonstram um resultado aperfeiçoado (por exemplo, redução em angiogênese e crescimento de tumor)para os grupos administrados com a combinação de opióide, antagonista de opióide, e agente anti-câncer comparada aos outros grupos.

Em um segundo conjunto de experimentos, pacientes de câncer humanos recebendo um opióide, por exemplo, morfi-na, um agente terapêutico anti-câncer, por exemplo, bevaci-zumab (Avastin) ou ambos são arrolados em um estudo. Arrolados no estudo são controlados para idade, estágio e tipo de doença, tipos de tratamento e fatores genéticos e familiares. Participantes recebendo um opioide são divididos rando-imicamente em primeiro e segundo grupos; participantes recebendo um agente terapêutico anti-câncer, por exemplo, beva-cizumab (Avastin) são randomicamente divididos em terceiro e quarto grupos; participantes recebendo um opioide plus agente terapêutico anti-cãncer, por exemplo, bevacizumab (Avastin) são randomicamente divididos em quinto e sexto grupos. 0 primeiro, terceiro e quinto grupos cada um recebe um anta-gonista de opioide periférico, por exemplo, metil naltrexoi-na administrado oralmente em uma dose de 5 mg/kg/dia por um periodo de oito semanas. O segundo, quarto e sexto grupos recebem placebo pelo mesmo periodo. Diferenças em taxa de crescimento de tumor, tamanho de tumor, uma redução em angi-ogênese no tumor e mortalidade dos participantes em cada um dos grupos são anotadas. Os resultados demonstram um resultado aperfeiçoado (por exemplo, redução em angiogênese e crescimento de tumor) para os grupos administrados com a combinação de opioide, antagonista de opioide, e agente anti-câncer comparados aos outros grupos.

Exemplo 7:Terapias compreendendo co-administração do antagonista de opioide periférico alvimopan e segundo agente terapêutico

Camundongos que foram induzidos ao desenvolvimento de tumores são submetidos ao protocolo como descrito no E-xemplo 5, exceto que o antagonista de opióide periférico é alvimopan. Os resultados demonstram um aperfeiçoado resultado (por exemplo, redução em angiogênese e crescimento de tumor) para os grupos administrados com a combinação de opióide, antagonista de opióide, e agente anti-câncer comparados aos outros grupos.

Pacientes de câncer humanos são arrolados em um estudo conduzido como descrito no Exemplo 6, exceto que o antagonista de opióide periférico é alvimopan. Os resultados demonstram um resultado aperfeiçoado (por exemplo, redução em angiogênese e crescimento de tumor) para os grupos administrados com a combinação de opióide, antagonista de opióide, e agente anti-câncer comparados aos outros grupos.

Exemplo 8:Efeito de antagonistas de opióide sobre migração / proliferação de células endoteliais

Cultura de células e reagentes - células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Kirland, WA) e células endoteliais microvascul.ares pulmonares humanas (Clonetics, Walkersville, MD) foram cultivadas como descritoanteriormente em meio completo EBM-2 (Clonetics) a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5% C02, 95% ar, com passagens 6-10 usadas para experimentação (Garcia et al., 2001). A menos que de outro modo especificado, reagentes foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO). Reagentes para eletroforese de SDS-PAGE foram adquiridos de Bio-Rad (Richmond, CA), membrana de transferência Immobilon-P de Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA) . As drogas usadas neste estudo foram [D-Ala2, N-MePhe4, Gly5-ol] encefalina ou DAMGO (Sigma, St. Louis,MO); naloxona, morfina-3-glicuronideo (M3G) e morfina-6-glicuronídeo (M6G) (Sigma, st. Louis, MO); brometo de N-metil naltrexona ou metil naltrexona (Mallinckrodt Specialty Chemicals, Phillipsburg, NJ) , morfina (Baxter, Deerfield, Illinois). Inibidor tirosina cinase receptor de VEGF foi ad-guirido de Calbiochem (San Diego, CA) . Anticorpo anti-RhoA camundongo, anticorpo anti-fosfotirosina camundongo e pérolas conjugadas com dominio de ligação rho (RBD) foram adqui-ridos de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Anticorpos receptor 1 anti-VEGF coelho (Flt-1) e receptor 2 anti-VEGF (Flk-1) foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . Anticorpo anti-beta-actina camundongo foi adquirido de Sigma (St. Louis, MO) . Anticorpos marcadors com pe-roxidase de raiz forte (HPR) secundários foram adquiridos de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Materiais de imuno-precipitação e imuno-manchamento celular foram incubados com tampão IP (HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl2 20 mM, Triton X-100 1%, SDS 0,1%, Na3V04 0,4 mM, NaF 40 mM, ácido okadáico 50 uM, fluoreto de fenil metil sulfonila, diluição 1:250 de mistura de inibidor de Calbiochem protease 3). As amostras foram então imuno-precipitadas coim receptor 1 anti-VEGF ou IgG receptor 2 anti-VEGF seguido por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida 4-15%, transferir sobre membranas de ImmobilonTM, e desenvolvidas com anticorpos primários e secundários específicos. Visualização de bandas imuno-reativas foi obtida usando qui-mioluminescência aperfeiçoada (Amersham Biosciences).

Determinação de fosforilação de tirosina de recep-tores 1 e 2 de VEGF - Proteínas solubilizadas em tampão IP (ver acima) foram imuno-precipitadas com anticorpo receptor 1 anti-VEGF coelho ou receptor 2 anti-VEGF coelho seguido por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida 4-15% e transferir sobre membranas ImmobilonTM (Millipore Corp., Bedford, MA). Após bloqueio de sitios não específicos com albumina de soro bovino 5%, as manchas foram incubadas com anticorpo receptor 1 anti-VEGF coelho, anticorpo receptor 2 anti-VEGF coelho ou anticorpo anti-fosfotirosina camundongo seguido por incubação com Igg anti-camundongo cabra ou anti-coelho cabra marcado com peroxidase de raiz forte (HRP). Visualização de bandas imuno-reativas foi obtida usando quimioluminescência aperfeiçoada (Amersham Biosciences).

Construção e transfecção de siRNA contra RhoA - A seqüência de siRNA alvejando humano contra RhoA foi gerada usando seqüência de ARNm de Genbank (gi:33876092). Para cada ARNm (ou misturado), dois alvos foram identificados. Especificamente, seqüência alvo RhoA 1 (5'-AAGAAACTGGTGATTGTTGGT-3') (SEQ ID NO:l), seqüência alvo RhoA 2 (5'-AAAGACATGCTTGCTCATAGT-3') (SEQ ID NO:2), seqüência misturada 1 (5'-AAGAGAAATCGAAACCGAAAA-3') (SEQ ID NO:3), e seqüência misturada 2 (5'-AAGAACCCAATTAAGCGCAAG-3') (SEQ ID NO:4), foram utilizadas. Oligonucleotideos sentido e anti-sentido foram adquiridos de Integrated DNA Technologies (Coraville, IA). Para construção do siRNA, um kit baseado em transcrição de Ambion foi usado (Silencer siRNA construction kit) . EC microvascula de pulmão humano foram então transfectadas com siRNA usando siPORTamineTM como o reagente de transfecção(Ambion, TX) de acordo com o protocolo provido por Ambion. Células (-40% confluentes) foram privadas de soro por 1 hora seguido por incubação com 3 jiM (1,5 uM de cada siRNA) de siRNA (ou siRNA mistrado ou nenhum siRNA) por 6 horas em meios livres de soro. Os meios contendo soro foram então adicionados (concentração final de soro de 1%) por 42 horas antes de experimentos bioquímicos e/ou ensaios funcionais serem conduzidos.

Ensaio de ativação de Rho-A - Após tratamento com agonista e/ou inibidor, EC são solubilizadas em tampão de solubilização e incubadas com pérolas conjugadas com dominio de ligação rho (RBD) por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante é removido e as pérolas RBD com a forma ligada a GTP de RhoA ligada são lavadas extensivamente. As pérolas RBD são ebulidas em tampão amostra SDS-PAGE e o material RhoA ligado é corrido sobre SDS-PAGE, transferido para ImmobilonTm e imu-no-manchado com anticorpo anti-RhoA (Garcia et al. 2001).

Ensaio de migração de EC microvascular dérmicas humanas - O ensaio de migração de células endoteliais foi realizado como descrito anteriormente (Lingen 2002). Células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Kirkland, WA) foram privadas por toda noite em meios contendo albumina de soro bovino 0,1% (BSA), colhidas, re-suspensas em meios Eagle Modificado Dulbecco (DME) com BSA 0,1%, e revestidas sobre uma membrana gelatinizada semi-porosa em uma câmara Boyden modificada (Nucleopore Corporation, Pleasanton, CA) . Substâncias testes foram então adicionadas às cavidades da câmara superior, e células foramdeixadas migrar por 4 horas a 37°C. membranas foram recuperadas, fixadas, e manchadas e o número de células que migraram para a câmara superior por 10 campos de alta energia foi contado por um observador cegado. Migração de fundo de DME + BSA 0,1% foi subtraída, e os dados foram reportados como o número de células migradas por 10 campos de alta energia (400x). cada substância foi testada em quadruplicata em cada experimento e todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, R&D Systems, Minneapolis, MN) foi usado como um controle positivo em uma concentração de 200 pg/mL. A concentração ótima para VEGF foi determinada previamente através de experimentos de dose - resposta (dados não mostrados).

Ensaio de migração de EC microvasculares pulmonares humanas - Vinte e quatro unidades Transwell com tamanho de poro de 8 M foram usadas para monitoração de migração de células in vitro. HPMVEC (~lxl04 células / cavidade) foram revestidas com vários tratamentos (MNTX 100 nM, inibidor de tirosina cinase de receptor de VEGF ou siRNA) para a câmarasuperior e vários agonistas foram adicionados à câmara inferior (MS, DAMGO ou VEGF, 100 nM). Células foram deixadas migrarem por 18 horas. Células das câmaras superior e inferior foram quantificadas usando o ensaio CellTiter96 MTS (Prome-ga, San Luis Obispo, CA) e lidas em 492 nm. % de migração foi definida como o # de células na câmara inferior % de número de células em ambas câmaras superior e inferior. Cada ensaio foi feito em triplicata, repetido pelo menos cinco vezes e analisado estatisticamente por teste t de Student(com significância estatística fixada em P < 0,05).

Ensaio de proliferação de EC microvasculares pulmonares humanas - Para medição de crescimento de células, HPMVEC [5xl03 células / cavidade pré-tratadas com vários agentes (MNTX 100 nM, inibidor de tirosina cinase de receptor de VEGF 10 p.M ou siRNA) foram incubadas com 0,2 mL de meios livres de soro contendo vários agonistas MS, DAMGO ou VEGF 100 nM) por 24 horas a 37°C em 5%C02 / 95% ar em placas de cultura de 96 cavidades. O ensaio de proliferação de células in vitro foi analisado através de medição de aumentos em número de células usando o ensaio CellTiter96 MTS (Promega, San Luis Obispo, CA) e lidas em 492 nm. Cada ensaio foi feito em triplicata, repetido pelo menos cinco vezes e analisado estatiscamente por teste t de Student (com significância estatística fixada em P < 0,05) .

Usando o ensaio de migração de cendotelial, foi verificado com MS causou um aumento dependente de concentração em migração endotelial. Naloxona e MNTX sozinhos não tiveram efeito sobre migração de células endoteliais sobre umaampla faixa de concentrações. Isto é demonstrado em fotomi-crografias representativas e quantitativamente (Figs. 6 e 1, respectivamente). Em concentrações clinicamente relevantes de morfina, a magnitude do efeito foi aproximadamente 70% daquele obtido por VEGF. Migração de células endoteliais induzida por morfina em concentrações tão baixas como 10~7M (Fig. 2). Migração de células endoteliais baseada em morfina foi atenuada pelos antagonistas de opióide mu naloxona e MNTX (em doses tão baixas como IO"8 uM) em uma maneira de-pendente de concentração, sugerindo fortemente que migração de célula endotelial é mediada por ação de morfina sobre o receptor de opióide mu (MOR). Que o efeito é via o MOR antes que outros receptores de opióide foi confirmado por nossas observações de que o agonista mu de encefalina sintética altamente seletivo DAMGO também induziu migração em uma maneira dependente de concentração. 0 efeito de DAMGo também foi bloqueado por MNTX (Fig. 3). Que o metabólito de morfina inativado M3G não exerce atividade angiogênica, enquanto M6G, conhecido atuar no receptor mu, exibe um efeito dependente de concentração sobre angiogênese, confirma nossa hipótese de que efeito de morfina sobre o endotélio é mediado por receptores mu (McQuay et al. 1997) (Fig. 5).

De modo a avaliar os mecanismos de efeitos induzidos por opióide e MNTX sobre angiogênese, uma linha EC bem caracterizada foi usada, células endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HPMVEC). Em concordância com os efeitos sobre EC microvasculares dérmicas humanas, foi observado que MS, DAMGO e VEGF induzem migração de HPMVEC que é inibidapor MNTX (Fig. 7B). Foi mostrado que MS, DAMGO e VEGF também estimulam proliferação de HPMVEC que é atenuada por MNTX (Fig. 7A).

Considerando os efeitos inibidores de MNTX, um an-tagonista de receptor de opióide mu, sobre proliferação e migração de EC induzidas por VEGF, o papel de opióides sobre transativação de receptor de VEGF foi examinado. A Fig. 8A mostra que MS e DAMGO induzem fosforilação de tirosina de ambos receptor 1 (Flt-1) e 2 (Flk-1) de VEGF que é bloqueadapor MNTX. Ainda, MNTX atenua a fosforilação de tirosina de receptores 1 e 2 de VEGF induzida por VEGF. Estes resultados indicam que opióides induzem transativação de receptor de VEGF.

De modo a endereçar se atividade tirosina cinase de receptor de VEGF é requerida para angiogênese induzida por opióide, EC foram pré-tratadas com inibidor de tirosina cinase de receptor 1 e 2 de VEGF e medida a proliferação e migração de EC induzidas por opióide (Fig. 8B) . Os resultados indicam que a atividade tirosina cinase de receptores de VEGF é importante em funções angiogênicas de EC induzidas por opióide.

Uma importante molécula sinalizante envolvida em • angiogênese é a proteina-G pequena, RhoA (Aepfelbacher et al. 1997; Cascone et al. , 2003; Hoang et al. 2004; Liu and Senger 2004) . Foi observado que MS, DAMGO e VEGF estimulam ativação de RhoA que é inibida por MNTX (Figura 9A) . Ainda, transtivação de receptor e VEGF é importante para ativação de RhoA induzida por opióide (Figura 9B) . Silenciamento de expressão de RhoA bloqueia proliferação e migração de EC induzidas por opióide e VEGF (Fig. 10). Estes resultados indicam o papel central de ativação de RhoA sobre atividade an-giogênica de EC induzida por agonista.

Tomadas como um todo estas verificações sugerem um modelo no qual o antagonista de receptor de opióide mu periférico, MNTX, atenua ativação de RhoA e receptor de VEGF induzida por VEGF. Esta atenuação é importante para o papel inibidor de MNTX sobre angiogênese mediada por opióide eVEGF (Fig. 11).

Exemplo 9: Metil naltrexona inibe angiogênese induzida por S1P, VEGF e PDGF: papel de transativação de receptor

Ensaios foram conduzidos de acordo com o procedimento similar àquele descrito em exemplos 1-3. Foi observado que SIP, VEGF, PDGF, morfina e DAMGO induziram proliferação (Fig.12) (como medida pelo Ensaio MTS CellTiter colorimétri-co (Promega) e migração (Figura 13) (como medida pelo ensaio de filtro de membrana permeável Transwell (diâmetro de poro de 8 (om) ) de EC que foram inibidas por pré-tratamento com MNTX (0,1 (J.M, 1 hora) . Silenciamento de expressão de receptor de opióide mu (siRNA) bloqueia proliferação (Fig. 14) e migração (Fig.15) de EC induzida por morfina e DAMGO enquanto também inibindo significantemente proliferação (Fig. 14) e migração (Fig. 15) de EC induzidas por VEGF e PDGF. Imuno-precipitação seguida por análises de mancha imuno indicam que tratamento com SIP, VEGF e PDGF de fosforilação de seri-na / treonina induzida por EC do receptor de opióide mu (Fig. 16) (indicando transativação de receptor) e ativação da proteina G pequena reguladora cito-esqueletal, RhoA (Fig. 17) . Ainda, tratamento com morfina e DAMGO de EC induziu fosforilação de tirosina do receptor de VEGF (Figura 18), receptor de PDGF (Fig. 18) e receptor de SI P3 (Fig. 19) junto com ativação de RhoA. Pré-tratamento com MNTX de EC atenuou eventos de fosforilação de receptor induzidos por morfina, DAMGO, SIP, VEGF e PDGF e ativação de RhoA. Finalmente, silenciamento de expressão de RhoA (siRNA) bloqueouproliferação (Fig. 20) e migração (Fig. 21) de EC induzidas por agonista. Tomados juntos, estes resultados indicam que MNTX inibe proliferação e migração de EC induzidas por agonista via inibição de fosforilação / transativação de receptor e subseqüente inibição de ativação de RhoA (Fig. 22). Estes resultados sugerem que inibição de angiogênese de MNTX pode ser ma intervenção terapêutica útil para tratamento de câncer.

Em resumo, a presente invenção prove processos de atenuação de migração e/ou proliferação de células endoteli-ais associadas com angiogênese e/ou aperfeiçoamento de função barreira de células endoteliais em tecido ou um órgão de um sujeito em sua necessidade através de administração de um ou mais antagonistas de opióides, especialmente antagonistasde opióides periféricos, em uma quantidade efetiva para o paciente para inibir a migração e/ou proliferação e angiogênese, e/ou aperfeiçoar função barreira. Os processos da presente invenção também podem envolver administração de um an-tagonista de opióide periférico a um paciente recebendo tratamento de opióide. Especialmente apropriado pode ser um an-tagonista de opióide periférico mu. A presente invenção também prove processos de co-administração de um opióide e um antagonista de opióide periférico a um sujeito em sua necessidade. O antagonista de opióide periférico também pode serco-administrado com um agente anti-câncer, como pode a combinação do opióide e antagonista de opióide periférico ser co-administrada com um agente anti-câncer.

Embora a presente invenção tenha sido agora des-crita e exemplificada com alguma especificidade, aquelesversados na técnica apreciarão as várias modificações, in-cluindo variações, adições, e omissões que podem ser feitasno que foi descrito. Da mesma maneira, é pretendido que es-tas modificações também sejam abrangidas pela presente in-venção e que o escopo da presente invenção seja unicamentelimitado pela mais ampla interpretação que juridicamente po-de ser acordada pelas reivindicações apostas.

Todas as patentes, publicações e referências aquicitadas são inteiramente aqui incorporadas por referência.Em caso de conflito entre a presente exposição e patentes,publicações e referências incorporadas, a presente exposiçãodeve controlar.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> THE UNIVERSITY OF CHICAGO

<120> "USO DE ANTAGONISTAS OPIÓIDES PARA ATENUAÇÃO DEPROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS"

<130> 092234-9035-WO00

<150> 60/659,193

<151> 2005-03-07

<150> 60/725,703

<151> 2005-10-12

<150> 60/731,009

<151> 2005-10-28

<150> 60/760,851

<151> 2006-01-20

<160> 4

<170> Patentln version 3.2

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Horao saplens

<400> 1

aagaaactgg tgattgttgg t

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

aaagacatgc ttgctcatag t

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

aagagaaatc gaaaccgaaa a

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

aagaacccaa ttaagcgcaa g

Claims

1. Método de tratamento, CARACTERIZADO pelo fatode compreender- administração a um sujeito com um distúrbiocaracterizado por indesejada migração ou proliferação de cé-lulas endoteliais, de uma quantidade efetiva de um antago-nista opióide.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a migração ou proliferaçãoindesejada de células endoteliais é indesejada migração ouproliferação de células endoteliais vasculares.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista opióide é umantagonista opióide periférico".

4. Método, de acordo ' com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a indesejada migração ou pro-liferação de células endoteliais vasculares é angiogêneseindesej ada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é um câncer.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade efetiva é talque o sujeito tem niveis em plasma de sangue circulante efe-tivos do antagonista opióide continuamente por pelo menos 1semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos três semanas, e,preferivelmente, pelo menos 4 semanas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender co-administração ao sujeito de uma quantidade de um agente an-ti-câncer.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente. anti-câncer é um a-gente anti-neovascularização.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-neovascularização é um anticorpo monoclonal anti-VEGF.

10. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é diabetes.

11. Método., de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é anemia de célu-la foice.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é um ferimentovascular.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é CARACTERIZADOpor indesejada neovascularização ocular.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio é uma retinopatiaproliferativa.

15. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista opióide é umantagonista opióide periférico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está tomando simul-tânea terapia opióide.

17. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito não está tomandosimultânea terapia opioide.

18. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está tomando simul-tânea terapia opioide crônica.

19. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO .pelo fato de que o sujeito não está tomandosimultânea terapia opioide crônica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista opioide é sele-cionado do grupo consistindo em: derivado morfinam quaterná-rio ou terciário, um N-alquil carboxilato de piperidina, eum benzomorfam quaternário.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista opioide perifé-rico é metil naltrexona.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista opioide perifé-rico é alvimopam.

23. Método de inibição de atividade VEGF em célu-las endoteliais, CARACTERIZADO pelo fato de compreender con-tato de células com uma quantidade efetiva de um antagonistaopioide.

24. Método de inibição de migração ou proliferaçãocelular induzida por opioide exógeno em células endoteliais,CARACTERIZADO pelo fato de compreender contato de célulascom uma quantidade efetiva de um antagonista opioide.

25. Método de inibição de ativação de Rho A em cé-lulas endoteliais, CARACTERIZADO pelo fato de compreendercontato de células com uma quantidade efetiva de um antago-nista opióide-

26. Método de atenuação de indesej ada migraçãoe/ou proliferação de células endoteliais, CARACTERIZADO pelofato de compreender contato de células com uma quantidadeefetiva de um antagonista opióide.

27. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que uma quantidade do antagonistaopióide é administrada a um paciente de câncer humano, cujaquantidade é efetiva para atenuar a indesejada migração e/ouproliferação.

28. Método de redução de risco de recorrência de um câncer ou tumor após intervenção médica, CARACTERIZADOpelo fato de compreender co-administração de um antagonistaopióide a um paciente de câncer no momento da intervenção.