BRPI0110506B1 - Uso de inibidores de il-18 para o tratamento e/ou prevenção da aterosclerose - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE INI- BIDORES DE IL-18 PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DA ATEROSCLEROSE".

Campo da Invenção A presente invenção situa-se no campo das doenças vasculares.

De modo específico, a invenção refere-se ao uso de inibidores de IL-18 para tratamento e/ou prevenção da aterosclerose.

Fundamentos da Invenção A aterosclerose é a doença vascular mais comum e mais im- portante, mas muitos outros distúrbios vasculares são reconhecidos. A ate- rosclerose afeta, principal mente artérias de tamanho grande e médias e su- as lesões compreendem camadas gordurosas, placas fibrolíticas e lesões complicadas. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica da parede arterial caracterizada por acúmulo progressivo de lipídios, como colesterol, células como macrófagos. Linfócitos T ou células do músculo liso e matriz extracelular (1). Maiores acúmulos são denominados ateromas ou placas, que freqüentemente contém cálcio. O tecido gorduroso pode romper a pare- de da artéria, diminuir a elasticidade da artéria e interferir com o fluxo san- güíneo. Eventualmente, podem formar-se coágulos em torno dos depósitos da placa, interferindo mais ainda com o fluxo sanguíneo, podendo conduzir a uma total oclusão do vaso sanguíneo. Normalmente, a aterosclerose está associada com níveis aumentados de colesterol LDL, fibrinogênio Lp(a) e fator VII, bem como níveis reduzidos de colesterol HDL. Fatores de risco in- cluem envelhecimento aumentado, sexo masculino, tabagismo, diabetes, obesidade, alto colesterol no sangue, uma dieta rica em gorduras, e história familiar ou pessoal de doença cardíaca. Ela é a causa principal de isquemia de órgão como infarto do miocárdio. O ateroma é a lesão mais comum das artérias, o que pode ser ainda complicado por tromboembolismo. Placas ateromatosas freqüente- mente estreitam o lúmen das artérias, ocasionando isquemia e algumas ve- zes, atrofia dos tecidos no território hipoperfusivo. Consequências sérias in- cluem o sintoma da angina devido à isquemia miocárdica, falha cardíaca devido à isquemia ou eventos não-isquêmicos, e hipertensão devido ao es- treitamento da artéria renal e hipoperfusão de um rim que responde fisiologi- camente por secreção aumentada de renina.

Algumas vezes a aterosclerose e arteriosclerose são referidas como condições patológicas separadas, e neste caso, a aterosclerose é de- finida como implicando no endurecimento (esclerose) ou perda da elastici- dade das artérias devido especificamente ao ateroma, enquanto a arterios- clerose é o endurecimento ou perda da elasticidade das artérias oriundo de qualquer causa.

Complicações ou consequências da aterosclerose incluem do- ença arterial coronária (aterosclerose das artérias coronárias), deficiência de suprimento sangüíneo, devido à obstrução (isquemia/angina), Ml agudo (in- farto do miocárdio, ataque cardíaco) ataque isquêmico passageiro (TIA) ou derrame, e dano aos vasos sangüíneos, músculos ou órgãos do corpo.

Aneurismas, que são permanentes, dilatações anormais dos va- sos sangüíneos também são causas comuns da aterosclerose. Aneurismas aóticos abdominais ateroscleróticos desenvolvem-se comumente em paci- entes mais idosos. Eles podem romper-se no espaço retroperitoneal. Em aneurismas ateroscleróticos, há normalmente uma perda pronunciada do tecido elástico e fibrose do meio, principalmente devido à isquemia do mús- culo do meio aórtico, seguido por liberação de enzimas de macrófago ocasio- nando fragmentação das fibras elásticas. A medicação recomendada para tratamento ou prevenção da aterosclerose, inclui redução de gorduras/colesterol sanguíneo. Em particu- lar, a terapia de redução do colesterol LDL é mais usada. Atualmente, estati- nas, que são inibidores específicos de HMG CoA redutase, são mais am- plamente usadas. Agentes adicionais de redução de gordura compreendem medicações como colestiramina, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozil, probucol, lovastatina e outros.

Uma outra abordagem é minimizar o risco de formação de trom- bo em lesões ateromatosas estabelecidas. Aspirina, que parece ser um ini- bidor específico de agregação de plaqueta mediado por tromboxano A2, ou anticoagulantes pode ser usada para reduzir o risco de formação de coágu- los. "Angioplastia de balão" percutânea utiliza um cateter com balão na ponta para aplainar a placa e aumentar o fluxo sangüíneo para além da oclusão. A técnica é similar da usada para abrir as artérias do coração, mas ela pode ser aplicada a muitas outras artérias do corpo. Estenoses arteriais coronárias são desviadas com segmentos da veia safena costurados na aorta proximal ou por dissecção da artéria mamária interna da parede toráci- ca e anastomose de sua extremidade distai para uma artéria na superfície anterior do coração. A remoção cirúrgica dos depósitos (endarterectomia) pode ser recomenda em alguns casos (exemplo : endarterectomia Ocarótida).

Contudo, a recomendação principal permanece no tratamento ou controle dos fatores de risco, como manutenção de dieta pobre em gordura, baixo colesterol e baixo teor de sal, seguindo as recomendações do aten- dente de cuidado de saúde para tratamento e controle da hipertensão, dia- betes e outras doenças, redução de peso corporal e interrupção do tabagis- mo, bem como exercícios regulares para aumentar a aptidão do coração e circulação. O processo inflamatório está envolvido por todo os diferentes estágios da aterosclerose (1). A ativação endotelial, por vários fatores, in- cluindo baixo estresse de corte, lipoproteínas modificadas e citocinas pró- inflamatórias, pensa-se ser a primeira etapa n aterosclerose e está sob con- trole infamatório (1). Muitos testes recentes demonstraram que, interações entre células vasculares e inflamatórias são cruciais na aterogênese (1).

Particularmente, a inibição de passos pró-inflamatórios definidos reduziu o desenvolvimento da aterosclerose (1). A inflamação também desempenha um papel principal no rom- pimento da placa aterosclerótica e trombose (2-5) e, portanto, influencia a ocorrência de síndromes isquêmicas agudas e sua mortalidade relacionada (6). De fato, manifestações clínicas graves de aterosclerose, incluindo infar- tos do coração, cérebro e quaisquer outros órgãos afetados por aterosclero- se, são principalmente, devido à oclusão do lúmen do vaso por um trombo formado no contato de uma placa aterosclerótica rompida (3,4). Testes pa- tológicos demonstraram, que placas vulneráveis ou instáveis, ou seja, placas com tendência a romper-se ou com ruptura, diferenciam-se em muito na composição celular e da matriz comparada com placas estáveis, não sujeitas à ruptura (7). As placas vulneráveis são ricas em células inflamatórias (ma- crófagos e linfócitos T), contém um núcleo lipídico trombogênico e são ca- racterizadas por uma capa fibrosa fina com uma perda substancial na matriz extracelular (7). A síntese do colágeno diminuída, mediada pela citocina pró- inflamatória (IFNy, e atividade aumentada de metaloproteinases que degra- dam a matriz derivada de macrófago ao responsáveis pelo adelgaçamento e fragilidade da capa fibrosa (7). A ruptura da capa fibrosa frágil expõe o nú- cleo lipídico altamente trombogênico ao sangue circulante e resulta na for- mação do trombo oclusivo (1,7). Conseqüentemente, a densidade das célu- las inflamatórias em uma dada lesão aterosclerótica é considerada como um bom indicador de sua instabilidade. O prognóstico clínico de um paciente com aterosclerose depen- de somente em parte do tamanho das lesões (19,20). É agora amplamente reconhecido que, a qualidade (composição da placa) e não o tamanho da lesão podería ser até mesmo um melhor indicador da ocorrência e eventos isquêmicos. De fato, manifestações clínicas graves de aterosclerose (infartos do coração e cérebro) soa principalmente devido à oclusão do lúmen do vaso por um trombo formado no contato de uma placa aterosclerótica rompi- da (9). Estudos patológicos demostraram que placas vulneráveis ou instá- veis. que são sujeitas a romper-se ou terem se rompido são ricas em células inflamatórias e apresentam uma perda substancial no teor de célula muscu- lar lisa e colágeno (20,21. Além disso, tais placas demonstram aumento si- gnificativo na morte celular por apoptose, levando à formação de um núcleo lipídico altamente trombogênico (13,22).

Citocinas pró-inflamatórias estão envolvidas na inflamação. A citocina interleucina-18 (IL-18) foi inicialmente descrita como um fator de in- dução de interferon-γ (IFN-γ) (8). É um sinal inicial no desenvolvimento de resposta tipo 1 de célula auxiliares linfócito-T (T-R1). IL-18 atua juntamente com IL-12, IL-2, antígenos, mitógenos, e, possivelmente outros fatores, para induzir a produção de IFN-γ. IL-18 também intensifica a produção de GM- CSF e IL-2, potencializa a proliferação de célula T induzida por antiCD3 e aumenta a morte mediada por Fas de células aniquiladoras naturais. IL-18 maduro é produzido de seu precursor pela enzima de conversão 11-1 β (ICE, caspase-1). O receptor IL-18 consiste em, pelo menos dois componentes cooperando na ligação ao ligante. Sítios de ligação de lata e baixa afinidade para IL-18 foram vistos em células T estimuladas por 11-12 de murino (9), sugerindo um múltiplo complexo receptor de cadeia. Duas subunidades re- ceptoras foram identificadas até agora, ambas pertencentes à família do re- ceptor de 11-1 (10). A transdução de sinal de IL-18 envolve ativação de NF- KB(11).

Recentemente, uma proteína solúvel com uma alta afinidade para IL-18 foi isolada de urina humana, e os cDNAs de seres humanos e camundongo, bem como o gene humano foram clonados (12; WO 99/09063). A proteína foi designada proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP). II18BP não é o domínio extracelular de um dos receptores IL-18 conhecidos, mas uma proteína naturalmente circulante, secretada Ela per- tence a uma nova família de proteína secretada, incluindo ainda várias pro- teínas codificadas pelo vírus da varíola (12). IL18BP é essencialmente ex- presso no baço (12). IL18BP urinário, bem como recombinante, liga especifi- camente 1118 com uma alta afinidade e modula a afinidade biológica de IL- 18. O gene de N18BP foi localizado no cromossoma humano 11 q 13 e nenhuma codificação exon para um domínio de transmembrana foi encon- trado em uma seqüência genômica de 8,3 kb. Quatro variantes de emenda ou isoformas de IL18BP fora encontradas em seres humanos, e indicadas como IL18BP a, b, c e d, todas dividindo o mesmo N-terminal e diferindo no C-terminal (12).

Quatro isoformas humanas e duas de camundongo de IL-18BP resultantes de emenda de mRNA e encontradas em várias bibliotecas de cDNA tendo sido expressas, purificadas e avaliadas para ligação e neutrali- zação das atividades biológicas de IL-18(23). A isoforma IL-18BP em seres humano, uma (IL-18Bpa) apresentou a maior afinidade para IL-18 com um rápido coeficiente de ligação, um lento coeficiente de desligamento, e uma constante de dissociação (K(d)) de 399 pM. IL-18BPc divide o domínio Ig de IL-18Bpa exceto para os 29 aminoácidos C-terminais; o K(d) de IL-18BPc é 10 vezes menos (2,94 nM). Não obstante, IL-18BPa e IL-18BPc neutralizam IL-18 >95% a um excesso molar de dois. Isoformas IL-18BPb e IL-18BPd carecem de um domínio Ig completo e carecem da capacidade de ligar ou neutralizar IL-18. Isoformas IL-18BPC e IL-18BPd de murino, dotadas do domínio Ig idêntico, também neutralizam >95% de IL-18 de murino a um ex- cesso molar de dois. Contudo, IL-18BPd de murino que divide um motivo C- terminal comum com IL-18BPa de humano, também neutraliza IL-18 huma- no. A modelagem molecular identificou um grande sítio de ligação eletrostá- tico e hidrofóbico misto no domínio Ig de IL-18BP, que poderia responder por sua grande afinidade de ligação ao ligante (23).

Sumário da Invenção A invenção tem como base a descoberta de que um inibidor de IL-18 teve um pronunciado efeito benéfico no desenvolvimento de placa, progresso de placa e estabilidade de placa em um modelo de murino de ate- rosclerose. O inibidor de IL-18 não apenas preveniu formação de lesão na aorta torácica, mas também induziu uma mudança no sentido de um fenótipo de placa estável nas placas ateroscleróticas já formadas.

Portanto, a invenção refere-se ao uso de um inibidor de IL-18 para produção de um medicamento para prevenção e/ou tratamento da ate- rosclerose. A invenção refere-se ainda a métodos de tratamento para uma abordagem terapêutica genética de tratamento e/ou prevenção da ateroscle- rose.

Figura 1 ilustra um histograma visualizando a percentagem de sobrevivência de células endoteliais da veia umbilical humana após incuba- ção com, apenas lipoproteínas oxidadas ou incubação com uma combinação de lipoproteínas oxidadas e um anticorpo de IL-18 ou IL-18BP, respectiva- mente.

Figura 2 ilustra um Borrão Western realizado em extratos de proteína de artérias ateroscleróticas em comparação com artérias de con- trole. No Borrão Western foram usados os anticorpos direcionados contra IL- 18BP (hll_18BP), subunidade ct do receptor de IL-18 (hll18Ra), IL-18(hll18) e Caspase-1 (Caspase-1 p10) Figura 3 mostra um gel de agarose manchado com brometo de etídio ilustrando o resultado de uma análise RT-PCR para mRNA de IL-18 e IL-18BP em células de placa aterosclerótica.

Figura 4 Resultados RT-PCR representativos para IL-18BP e IL- 18 em placas ateroscleróticas em comparação com expressão ha-actina (controle) em placas sintomáticas e assintomáticas.

Figura 5 mostra o mapeamento do vetor de expressão usado para eletrotransferência intramuscular em camundongos.

Figura 6 mostra um histograma ilustrando a área de mancha- mento lipídica em artérias ateroscleróticas. A análise de imagem auxiliada por computador quantitativa da deposição lipídica. Os dados representam valores médios com s.e.m (n = 19 para plasmídeo vazio, n = 14 para plasmí- deo de IL-18BP). Asteriscos quádruplos indicam P<0,0001.

Figura 7 ilustra um histograma mostrando a área de lesão do seio aórtico após tratamento com IL-18BP se comparado com o controle (plasmídeo vazio). Análise de imagem auxiliada por computador quantitativa da área da lesão. Os dados representam valores médios com s.e.m. (n = 19 para plasmídeo vazio, n = 14 para plasmídeo IL-18BP), asteriscos duplos indicam P<0,01.

Figura 8 mostra o efeito de tratamento com IL-18BP no teor de célula inflamatória na lesão. Análise de imagem por computador quantitativa foi usada para se determinar a percentagem de áreas macrófago positivas (barras negras) e o número de linfócitos T infiltrantes por mm2 (barras grisa- das) em lesões do sinus aórtico de controle (n = 12) para manchamento de macrófago η = 15 para manchamento com linfócito T) ou camundongo trata- do com IL18BP (n = 13 para macrófagos, n = 12 para linfócitos T). Os dados representam valores médios com s.e.m. Asteriscos tríplices indicam P<0,005; e asteriscos quádruplos indicam P<0,0001.

Figura 9 mostra o efeito de tratamento com IL-18BP no teor de célula muscular lisa lesionada e colágeno. A análise de imagem por compu- tador quantitativa foi usada para determinar a percentagem de áreas célula- positivas musculares lisas (barras negras) e acúmulo de colágeno (barras grisadas) em lesões do sinus aórtico de controle (n = 6) para células do músculo liso, n = 11 para colágeno) e camundongos tratados com IL-18BP (n = 6 para células do músculo liso n = 13 para colágeno). Os dados repre- sentam valores médios com s.e.m. Asterisco simples indicam P<0,05; e as- teriscos duplos indicam P<0,01.

Descrição da Invenção A invenção está baseada na descoberta de níveis aumentados de IL-18 circulante em pacientes com síndromes coronárias agudas e produ- ção de IL-18 aumentada em placas ateroscleróticas de carótidas instáveis responsáveis por derrame. Além disso, demonstrou-se que a eletrotransfe- rência in vivo de um DNA de plasmídeo de expressão codificando para IL- 18BP previne o desenvolvimento de estrias gordurosas na aorta torácica e reduz o progresso de placas ateroscleróticas avançadas no sinus aórtico em um modelo de aterosclerose de murino já formado. Mais importante, a transfecção com plasmídeo de IL-18BP induz profundas alterações na com- posição da placa (diminuição em macrófago, célula T morte celular e teor de lipídio e aumento de célula muscular lisa e teor de colágeno) levando a um fenótipo de placa estável. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, um importante papel para inibidores de IL-18, na redução do desenvolvi- mento/progresso da placa e na promoção de estabilidade da placa. A invenção, portanto refere-se ao uso de um inibidor de IL-18 para produção de um medicamento no tratamento e/ou prevenção da ate- rosclerose. O termo "prevenção" dentro do contexto desta invenção refere- se não apenas a uma prevenção completa de um determinado efeito, mas também a qualquer prevenção parcial ou substancial, atenuação, redução, diminuição ou lentidão no efeito antes ou logo no início da doença. O termo "tratamento" dentro do contexto desta invenção refere- se a qualquer efeito benéfico no progresso da doença, incluindo atenuação, redução lentidão ou diminuição do desenvolvimento patológico após o início da doença. O termo "inibidor de IL-18" dentro do contexto desta invenção refere-se a qualquer molécula que modula a produção de IL-18 e/ou ação de modo tal que, a produção de IL-18 e/ou sua ação fique atenuada, reduzida ou parcial, substancial ou completamente prevenida ou bloqueada.

Um inibidor da produção pode ser qualquer molécula que afete negativamente a síntese, processamento ou maturação de IL-18. Os inibido- res considerados de acordo com a invenção podem ser por exemplo, su- pressores da expressão genética de interleucina IL-18, mRNAs antisentido que reduzem ou previnem a transcrição de mRNA de IL-18 ou que condu- zam à degradação de mRNA, proteínas que conferem dobramento correto, ou prevenindo parcial o substancialmente a maturação ou secreção de IL-18, proteases que degradam IL-18, uma vez que esta foi sintetizada, e similar.

Um inibidor da produção pode ser um inibidor Caspase-1 ou um inibidor ICE, por exemplo, prevenindo a maturação de IL-18.

Um inibidor da ação de IL-18 pode ser um antagonista de IL-18, por exemplo. Antagonistas podem, ou ligar-se a ou seqüestrar a própria molécula de ILK-18 com afinidade suficiente especificidade para neutralizar parcial ou substancialmente IL-18 ou os sítios de ligação a IL-18, responsá- veis para ligação de IL-18 a seus ligantes (como, por exemplo, a seus re- ceptores). Um antagonista pode também inibir o passo de sinalização de IL- 18, ativado dentro das células com a ligação a IL-18/receptor.

Inibidores da ação de IL-18 também podem ser receptores de IL- 18 solúveis ou moléculas que imitam os receptores ou agentes que bloquei- am os receptores de IL-18, anticorpos de IL-18, como anticorpos monoclo- nais, por exemplo, ou qualquer outro agente ou molécula que previna a liga- ção de IL-18 a seus alvos, diminuindo ou prevenindo assim a realização de reações intra- ou extracelulares mediadas por IL-18. A aterosclerose também é denominada arteriosclerose ou endu- recimento das artérias. Dentro do contexto da presente invenção o termo aterosclerose abrange todas as doenças ou condições doentias das artérias normalmente descritas como aterosclerose, em que material gorduroso é depositado na parede dos vasos, resultando, eventualmente no estreita- mento prejudicial do fluxo sanguíneo, bem como na ruptura e/ou erosão com formação de trombo.

De acordo com a presente invenção, aterosclerose pretende compreender tanto esclerose ou perda da elasticidade das artérias, devido a ateroma (aterosclerose) e devido a qualquer outra causa (arteriosclerose).

As condições patológicas da aterosclerose, bem como as complicações ou conseqüências da aterosclerose, que se destinam a estar incluídas no termo "aterosclerose" conforme aqui empregado, foram descritas em detalhes em "fundamentos da invenção" acima. O progresso da aterosclerose inclui formação de placas ateros- cleróticas e seu desenvolvimento em formas cada vez mais instáveis. A in- venção, portanto, também se refere ao uso de um inibidor de IL-18 para pro- dução de um medicamento para reduzir ou prevenir o progresso da ateros- clerose. A oclusão dos vasos por um trombo formado em uma placa ate- rosclerótica é o evento crítico nos infartos do coração e do cérebro, que são as conseqüências mais danosas da aterosclerose. Portanto, a invenção também se refere ao uso de um inibidor de IL-18 para produção de um me- dicamento para o tratamento e/ou prevenção de trombose de uma placa ate- rosclerótica. A estabilidade da placa influencia o desenvolvimento de uma placa aterosclerótica em uma placa prejudicial ou vulnerável, que está su- jeita a iniciar a trombose. Portanto, a invenção refere-se adicionalmente ao uso de um inibidor de IL-18 para produção de um medicamento para pre- venção e/ou tratamento da instabilidade da placa aterosclerótica.

Uma placa instável está afeita ao rompimento e o rompimento de uma placa pode levar à trombose. A invenção, portanto, refere-se ainda ao uso de um inibidor de IL-18 para produção de um medicamento na preven- ção da erosão ou rompimento da placa aterosclerótica. A instabilidade da placa e trombose, pode, por exemplo, ser de- vido a morte celular apoptótica, que confere alta atividade procoagulante e deve ser um evento chave na condução da trombose de placas ateroscieró- ticas erodidas ou rompidas, bem como a eventos embólicos (13,14). De- monstrou-se que, lipoproteínas oxidadas (oxLDL) induzem apoptose de ma- crófago e célula endotelial em cultura (15). Como se vê nos exemplos abai- xo, foi agora descoberto que, um inibidor de IL-18 é capaz de reduzir em muito a morte celular induzida por oxLDL.

De acordo com a presente invenção, foi surpreendentemente descoberto, que os níveis de iL-8 no sangue foram significativamente eleva- dos em pacientes de falha cardíaca sofrendo de eventos recorrentes, como por exemplo, morte, isquemia recorrente, re-vascularização, progresso de aterosclerose ou re-hospitalização para falha cardíaca, se comparado com pacientes que não retornaram ao hospital. Este aumento nos níveis de IL-18 foi especialmente pronunciado naqueles pacientes que morreram mais tarde, se comparado com os que sobreviveram. Níveis de IL-18 elevados na circu- lação sangüínea foram observados em ambos, pacientes com isquemia, bem como em pacientes não isquêmicos.

Conseqüentemente, a invenção refere-se também ao uso de ini- bidores de IL-18 para produção de um medicamento no tratamento e/ou pre- venção de eventos recorrentes de falha cardíaca. Os eventos recorrentes podem ser quaisquer eventos após falha cardíaca, como morte, isquemia recorrente, re-vascularização, progresso de aterosclerose ou re-hospitaliza- ção por falha cardíaca.

Em uma modalidade preferida da invenção a falha cardíaca é is- quêmica, ou seja devido à isquemia miocárdica.

Em uma modalidade mais preferida, a falha cardíaca é não- isquêmica como a devida a hipertensão sistêmica, doença cardíaca valvular ou doença pulmonar levando à falha cardíaca direita e a seguir congestiva.

Em uma modalidade preferida da invenção o inibidor de IL-18 é selecionado do grupo que consiste em inibidores de ICE, anticorpos contra IL-18, anticorpos contra quaisquer das subunidades do receptor de IL-18, inibidores do trajeto de sinalização do receptor de IL-18, antagonistas de IL- 18 que competem com IL-18 e bloqueiam o receptor de IL-18, e proteínas de ligação à IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fundidas, derivados funcio- nais, frações ativas ou derivados trocados circularmente destes com a mes- ma atividade.

Como aqui empregado, o termo "muteínas" refere-se a análogos de um IL-18BP, ou análogos de um IL-18BP viral, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido de um IL-18BP natural ou IL-18BP viral são substi- tuídos por diferentes resíduos de aminoácido ou são deletados ou um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à seqüência natural de um IL- 18BP ou um IL-18BP viral, sem alterar consideravelmente a atividade dos produtos resultante se comparado com o tipo selvagem IL-18BP ou IL-18BP viral. Essas muteínas são preparadas por síntese conhecida e/ou por técni- cas de mutagênese direcionada ao sítio, ou quaisquer outras técnicas co- nhecidas adequada para estas.

Quaisquer dessas muteínas de preferência tem uma seqüência de aminoácidos suficientemente duplicativa daquela de um IL-18BP, ou sufi- cientemente duplicativa de um IL-18BP viral, de modo a ter atividade subs- tancialmente similar a IL-18BP. Uma atividade de IL-18BP é sua capacidade de ligação a IL-18. Desde que a muteína tenha atividade de ligação substan- cial a IL-18, ela pode ser usada na purificação de IL-18, como por meio de cromatografia de afinidade e assim pode ser considerada por ter atividade substancialmente similar a IL-18BP. Assim, pode-se determinar se qualquer dada muteína tem substancialmente a mesma atividade de IL-18BP por meio de experimentação rotineira compreendendo submissão dessa muteína, por exemplo, a um ensaio de competição entremeado simples, para se determi- nar se ela liga ou não a um IL-18 apropriadamente rotulado como por radi- oimunoensaio ou por teste ELISA.

Muteínas de polipeptídeos de IL-18BP ou muteínas de IL-18BPs viral, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção ou ácido nucléico codificando para esta, incluem um conjunto finito de seqüências substancialmente correspondentes como peptídeo ou polinucleotídeos de substituição, que podem ser rotineiramente obtidos pelos versados na técni- ca sem experimentação indevida com base nos ensinamentos e orientação aqui apresentados.

Mudanças preferidas para muteínas de acordo com a presente invenção são pelo que se conhece como substituições "conservativas".

Substituições de aminoácido conservativas de polipeptídeo IL-18BP ou pro- teínas ou IL-18BPs virais, podem incluir sinonímia de aminoácidos dentro de um grupo que possui propriedades físico-químicas suficientemente similares que a substituição entre elementos do grupo preservará a função biológica da molécula (16). Fica evidente que inserções e deleções de aminoácidos podem também ser feitas nas seqüências supraindicadas, sem alterar sua função, particularmente se as inserções ou deleções envolvam apenas uns poucos aminoácidos por exemplo, cerca de 30, e, preferivelmente cerca de dez, e não removam ou desloquem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. Proteínas e mu- teínas produzidas por tais deleções e/ou inserções se enquadram no escopo da presente invenção.

De preferência os grupos de aminoácido sinônimos são os defi- nidos na Tabela 1. Mais preferivelmente, os grupos de aminoácido sinôni- mos são os definidos na Tabela II e mais preferivelmente, os grupos de ami- noácido sinônimos são os indicados na Tabela III.

Tabela I 3 Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinônimos Aminoácido Grupo de sinônimos Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Por Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Por, Ala Vai Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Vai Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Vai, Leu, Met Trp Trp Tabela II

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinônimos Aminoácido Grupo de Sinônimos Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, lie Gly Gly He lie, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, lie, Vai, Leu Trp Trp Tabela III

Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinônimos Aminoácido Grupo Sinônimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, He, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Vai Vai Gly Gly lie lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Exemplos de produção de substituições de aminoácido em pro- teína que podem ser usados para obter muteínas de polípeptídeos ou pro- teínas de IL-18BP, ou muteínas de IL-18BPs viral, para uso na presente in- venção incluem quaisquer etapas do método conhecido, como apresentado nas Patentes US 4.959.314, 4.588.585 e 4.737.462 a Mark et al, 5.116.943 a Koths et al., 4.965.195 a Namen et al. 4.879.111 a Chong et al., e 5.017.6912 a Lee et al, e proteínas substituídas com lisina apresentadas na Patente US n° 4.904.584 (Shaw et al). O termo "proteína fundida" refere-se a um polipeptídeo compre- endendo uma IL-18BP ou um IL-18BP viral ou uma sua muteína, fundida com uma outra proteína, que tem, por exemplo, um tempo de residência prolongado nos fluidos corporais. Um IL-18BP ou um IL-18Bp viral pode as- sim, ser fundida a uma outra proteína, polipeptídeo ou similar, por exemplo, uma imunoglobulina ou um seu fragmento. "Derivados funcionais" como aqui empregado, abrange deriva- dos de IL-18BPs ou um IL-18BP viral e suas muteínas e proteínas fundidas, que podem ser preparados de grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos N- ou C-terminal por meios conhecidos na técnica e estão incluídos na invenção, desde que permaneçam farma- ceuticamente aceitáveis, ou seja, não destruam a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade de IL-18BP ou IL-18BPS viral e não confiram propriedades tóxicas às composições que os contenham. Esses derivados podem, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietilenoglicol que podem mascaram sítios antigênicos e prolongar a residência de um IL- 18BP ou um IL-18BP viral nos fluidos corporais. Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila por rea- ção com amônia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acila de grupos amino livres de resíduos de aminoácido formados com porções acila (por exemplo, alcanoíla ou aroil carboxíclicos) ou derivados O-acila de grupos hidroxila livres (por exemplo, grupos de resíduos serila ou treoni- la)formados com porções acila.

Como "frações ativas" de um IL-18BP ou um IL-18BP viral, mu- teínas e proteínas fundidas a presente invenção abrange qualquer fragmento ou precursores da cadeia polipeptídica da molécula de proteína sozinha ou juntamente com moléculas associadas ou resíduos ligados a ela, por exem- plo, açúcar ou resíduos fosfato, ou agregados de molécula de proteína, ou resíduos de açúcar por eles próprios, contanto que a fração tenha atividade substancialmente similar com IL-18BP.

Em uma modalidade adicionalmente preferida da invenção, o inibidor de IL-18 é um anticorpo de IL-18. Anticorpos antilL-18 podem ser policlonais ou monoclonais, quiméricos humanizados ou mesmo totalmente humanos. Anticorpos recombinantes e seus fragmentos são caracterizados por alta afinidade de ligação a IL-18 in vivo e baixa toxicidade. Os anticorpos que podem ser usados na invenção caracterizados por sua capacidade em tratar pacientes por um período suficiente para ter boa a excelente regressão ou alívio da condição patogênica ou qualquer sintoma ou grupo de sintomas relacionados com uma condição patogênica e uma baixa toxicidade.

Anticorpos neutralizantes são prontamente gerados em animais como coelhos, cabra ou camundongos por imunização com IL-18. Camun- dongos imunizados são particularmente úteis para providenciar fontes de células B para produção de hibridomas, que por sua vez são cultivados para produzir grandes quantidades de anticorpos monoclonais antilL-18.

Anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina caracte- rizadas por dois ou mais segmentos ou partes derivadas de diferentes espé- cies animais. Geralmente, a região variável do anticorpo quimérico é deriva- da de um anticorpo de mamífero não-humano, como anticorpo monoclonal de murino, e a região constante de imunoglobulina é derivada de uma molé- cula de imunoglobulina humana. De preferência ambas as regiões e a com- binação têm baixa imunogenicidade como determinado rotineiramente (24).

Anticorpos humanizados são moléculas de imunoglobulina criadas por técni- cas de engenharia genética em que regiões constantes de murino são subs- tituídas com contrapartes humanas, enquanto retém as regiões de ligação ao antígeno de murino. O anticorpo quimérico camundongo-humano resul- tante, de preferência, tem imunogenicidade reduzida e propriedades farma- cocinéticas melhoradas em seres humanos (25).

Assim, em uma outra modalidade preferida, anticorpo IL-18 é um anticorpo IL-18 humanizado. Exemplos preferidos de anticorpos antilL-18 humanizados estão descritos no Pedido de Patente Europeu EP 0 974 600, por exemplo.

Em uma modalidade preferida adicional ainda, o anticorpo IL-18 é completamente humano. A tecnologia de produção de anticorpos humanos está descrita em detalhes, por exemplo, em WOOO/76310, WO99/53049, US 6.162.963 ou AU 5336100. Anticorpos totalmente humanos são preferivel- mente anticorpos recombinantes, produzidos em animais transgênicos, por exemplo, xenocamundongo, compreendendo todo ou partes de sítios de Ig de humano.

Em uma modalidade grandemente preferida da presente inven- ção o inibidor de IL-18 é um IL-18BP ou uma isoforma, uma muteína, proteí- na fundida derivado funcional, fração ativa ou derivado permutado circular- mente do mesmo. Essas isoformas, muteínas, proteínas fundidas ou deriva- dos funcionais retém a atividade biológica do IL-18BP, em particular a liga- ção a IL-18, e, preferivelmente têm essencialmente, pelo menos uma ativi- dade similar a IL-18BP. De forma ideal, tais proteínas têm uma atividade bi- ológica que é até mesmo aumentada em comparação com IL-18BP não mo- dificado. Frações ativas preferidas têm uma atividade que é melhor do que a atividade de IL-18BP, ou que têm vantagens adicionais, como uma melhor estabilidade ou uma menor toxicidade ou imunogenicidade, ou elas são mais fáceis de produzir em grandes quantidades, ou mais fáceis de purificar.

As seqüências de IL-18Bp e suas variantes/isoformas de emen- da podem ser vistas de WO 99/09063 ou de (12) bem como de (23).

Derivados funcionais de IL-18BP podem ser conjugados em po- límeros de modo a melhorar as propriedades da proteína, como estabilidade, meia-vida, biodisponibilidade, tolerância pelo corpo humano ou imunogenici- dade. Para se conseguir este objetivo, IL18-BP pode ser ligado, por exem- plo, a polietilenoglicol (PEG). A PEGilação pode ser realizada por métodos conhecidos, descritos em, por exemplo, WO 92/13095.

Portanto, em uma modalidade preferida da presente invenção IL- 18BPé PEGilado.

Em uma modalidade preferida da invenção, o inibidor de IL-18 é uma proteína fundida compreendendo toda ou parte de uma proteína de li- gação a IL-18, que é fundida em toda ou parte de uma imunoglobulina. O técnico versado na técnica compreenderá que a proteína de fusão resultante retém a atividade biológica de IL-18BP, em particular a ligação a IL-18. A fusão pode ser direta ou via peptídeo ligado curto, que pode ser tão curto quanto 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento ou maior, por exem- plo, 13 resíduos de aminoácido em extensão. Tal ligador pode ser um tri- peptídeo da seqüência E-F-M (Glu-Phe-Met), por exemplo, ou uma seqüên- cia ligadora de 13 aminoácidos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu- Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzida entre a seqüência IL-18BP e a se- qüência de imunoglobulina. A proteína de fusão resultante possui proprieda- des melhoradas como tempo de residência prolongada nos fluidos corporais (meia-vida) atividade específica aumentada, nível de expressão aumentado, ou é facilitada a purificação da proteína de fusão.

Em uma modalidade preferida, IL-18BP é fundida à região constante de uma molécula de Ig. De preferência ela é fundida a regiões de cadeia pesada como os domínios CH2 e CH3 de lgG1 humano, por exem- plo. A geração de proteína de fusão específicas compreendendo IL-18BP e uma parte de uma imunoglobulina está descrita no exemplo 11 de WP99/09063, por exemplo. Outras isoformas de moléculas Ig também são adequadas para geração de proteína de fusão de acordo com a presente invenção, como as isoformas lgG2 ou lgG4, ou outras classes de Ig, como IgM ou IgA, por exemplo. Proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas.

Interferons são predominantemente conhecidos por efeitos ini- bitórios na replicação viral e proliferação celular. Interferon-γ, por exemplo, desempenha um importante papel na promoção de respostas imune e infla- matórias. Interferon β (IFN-β um interferon tipo I) é visto desempenhar um papel antiinflamatório. A invenção também se refere ao uso de uma combinação de um inibidor de IL-18 e um interferon na produção de um medicamento para tra- tamento da aterosclerose.

Interferons também podem ser conjugados a polímeros de modo a melhorar a estabilidade das proteínas. Um conjugado entre Interferon β e o poliol polietilenoglicol (PEG) foi descrito em WO 99/55377, por exemplo.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, o interferon é lnterferon-β (IFN-β) e mais preferivelmente IFN-β 1a. O inibidor de produção e/ou ação de IL-18 é de preferência usa- do simultaneamente, em seqüência ou separadamente com o interferon.

Em ainda uma modalidade adicional da invenção, um inibidor de IL-18 é usado em combinação com um antagonista de TNF. Antagonistas de TNF exercem sua atividade de várias maneira. Primeiro, antagonistas po- dem ligar-se ou seqüestrar a própria molécula de TNF com suficiente afini- dade e especificidade para neutralizar parcial ou substancialmente, o epitopo ou epitopos de TNF responsáveis pela ligação ao receptor de TNF (a seguir denominado "antagonistas sequestrantes"). Um antagonista seqüestrante pode ser, por exemplo, um anticorpo direcionado contra TNF.

Alternativamente, antagonistas de TNF podem inibir o trajeto de sinalização de TNF ativado pelo receptor de superfície celular após a ligação a TNF (a seguir denominado "antagonistas de sinalização"). Ambos os gru- pos de antagonistas são úteis, seja sozinhos ou juntos, em combinação com um inibidor de IL-18, na terapia da aterosclerose.

Antagonistas de TNF são facilmente identificados e avaliados por seleção de via de candidatos para seu efeito na atividade de TNF nativo em linhas celulares suscetíveis in vitro, por exemplo, células B de humano, em que TNF ocasiona proliferação e secreção de imunoglobulina. O teste contém formulação de TNF em diluições variadas do antagonista candidato, por exemplo, de 0,1 a 100 vezes a quantidade molar de TNF usada no en- saio, e controla sem TNF ou apenas antagonista (26).

Antagonistas sequestrantes são os antagonistas de TNF preferi- dos para uso de acordo com a presente invenção. Dentre antagonistas se- questrantes, os polipeptídeos que ligam TNF com alta afinidade e possuem baixa imunogenicidade são preferidos. Moléculas do receptor de TNF solú- veis e anticorpos de neutralização a TNF são particularmente preferidas. Por exemplo, TNF-RI solúvel e TNF-RII são úteis na presente invenção. Formas truncadas desses receptores, compreendendo os domínios extracelulares dos receptores ou partes funcionais destes, são antagonistas mais particu- larmente preferidos de acordo com a presente invenção. Receptores de TNF solúvel truncado tipo-l e tipo-ll estão descritos em EP914431, por exemplo.

Formas truncadas dos receptores de TNF são solúveis e foram detectados na urina e soro como proteínas de ligação inibitórias de TNF de 30 kDa e 40 kDa, denominadas TBPI e TBPII, respectivamente (27). O uso simultâneo, seqüencial ou separado do inibidor de IL-18 com o antagonista de TNF e/ou um Interferon é preferido de acordo com a presente invenção.

De acordo com a invenção TBPI e TBPII são antagonistas de TNF preferidos para uso em combinação com um inibidor de IL-18. Deriva- dos, fragmentos, regiões e partes biologicamente ativas da funcionalidade de moléculas receptoras simulam as moléculas receptoras que também po- dem ser de utilidade na presente invenção. Tais equivalentes ou derivados biologicamente ativos da molécula receptora, referem-se à parte do poli- peptídeo, ou da seqüência codificando a molécula receptora, que é de tama- nho suficiente e capaz de ligar-se a TNF com uma tal afinidade que a intera- ção com o receptor de TNF ligado à membrana fica inibida ou bloqueada.

Em uma modalidade preferida ainda TNF-RI solúvel humano (TBPI) é o antagonista de TNF para uso de acordo com a invenção. As mo- léculas do receptor de TNF solúvel naturais e recombinantes e métodos de sua produção foram descritos nas Patentes européias EP 308 378, EP 398 327 e EP 433 900. O inibidor de IL-18 pode ser usado simultaneamente, seqüenci- almente ou separadamente com o inibidor de TNF. Vantajosamente, é utili- zada uma combinação de um anticorpo de IL-18 ou antisoro e um receptor solúvel de TNF com atividade de inibição a TNF.

Em uma modalidade preferida ainda da invenção, o medica- mento compreende ainda um inibidor-COX de preferência um inibidor de COX-2. Inibidores COX são conhecidos na técnica. Inibidores COX-2 espe- cíficos estão descritos em WO 01/00229, por exemplo.

Inibidores de tromboxano, em particular tromboxano A2, são atualmente muito usados no tratamento da aterosclerose. Portanto, em uma modalidade preferida ainda da invenção, o medicamento compreende ainda um inibidor de tromboxano, e, em particular, um inibidor de tromboxano A2, para uso simultâneo, seqüencial ou separado. Aspirina é especialmente preferida para uso em combinação com o inibidor de IL-18, de acordo com a invenção.

Uma das causas da aterosclerose parece ser uma alta concen- tração de lipídios no sangue. Portanto, em uma modalidade preferida ainda, o medicamento compreende ainda um agente redutor de lipídio para uso simultâneo, seqüencial ou separado. Qualquer agente redutor de lipídio co- nhecido na técnica pode ser usado de acordo com a invenção, como agen- tes redutores de gordura que compreendem medicações como colestirami- na, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozil, probucol e outros. São especial- mente preferidos são inibidores de HMG CoA redutase, e, preferivelmente as denominadas estatinas. Muitas estatinas são conhecidas na técnica como Simvastatina ou lovastatina.

De modo a evitar e/ou tratar aterosclerose ainda melhor, uma modalidade preferida da invenção é pertinente ao uso de um inibidor de IL- 18 em combinação com uma dieta de baixo teor de gordura e/ou baixo co- lesterol e/ou baixo teor de sal.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,0001 a 10 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 a 3 mg/kg de peso corporal ou cerca de 1 a 2 mg/kg de peso corporal. Em uma modalidade ainda mais preferida, o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,1 a 1000 pg/kg de peso corporal ou 1 a 100 pg/kg de peso corporal ou cerca de 10 a 50 pg/kg de peso corporal. A invenção refere-se ainda ao uso de um vetor de expressão compreendendo a seqüência de codificação de um inibidor de IL-18 na pre- paração de um medicamento para prevenção e/ou tratamento da ateroscle- rose. Uma abordagem terapêutica genética é assim usada para tratamento e/ou prevenção da doença. Vantajosamente, a expressão do inibidor de IL- 18 estará então in situ, bloqueando assim, eficientemente IL-18 diretamente nos tecidos ou células afetadas pela doença.

Como explicado em detalhe nos exemplos abaixo, demonstrou- se que, uma expressão eficiente de IL-18BP podería ser mostrada em um modelo de murino de doença após eletrotransferência de um vetor de ex- pressão compreendendo a seqüência de codificação IL-18BP.

Portanto, em uma modalidade preferida, o vetor de expressão é administrado por eletrotransferência, de preferência do modo intramuscular. O uso de um vetor para induzir e/ou intensificar a produção en- dógena de um inibidor de IL-18 em uma célula normalmente muda para ex- pressão de um inibidor de IL-18, ou que expresse quantidades do inibidor que não são suficientes, também são abrangidos de acordo com a invenção. O vetor pode compreender seqüência regulatórias funcionais nas células desejadas para expressar o inibidor ou IL-18. Tais seqüências regulatórias podem ser promotores ou intensificadores, por exemplo. A seqüência regu- latória pode se tratar de promotores ou intensificadores, por exemplo. A se- qüência regulatória pode então ser introduzida ao local direito do genoma por recombinação homóloga, ligando operavelmente assim, a seqüência re- gulatória com o gene, cuja expressão é necessária para ser induzida ou in- tensificada. A tecnologia é normalmente referida como "ativação genética endógena" (EGA) e está descrita, por exemplo, em WO 91/09955.

Será entendido pelo versado na técnica que também é possível encerrar a expressão IL-18 usando a mesa técnica, ou seja, introduzir um elemento de regulação negativo, por exemplo, um elemento silenciador, ao locus genético de IL-18, levando assim, uma regulação ascendente ou pre- venção da expressão de IL-18. A pessoa versada na técnica compreenderá que, tal regulação decrescente ou silenciadora da expressão de IL-18 possui o mesmo efeito do uso de um inibidor de IL-18, de modo a prevenir e/ou tratar a doença. A invenção refere-se ainda ao uso de uma célula que foi geneti- camente modificada para produzir um inibidor de IL-18 na produção de um medicamento para tratamento e/ou prevenção da aterosclerose. A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas, parti- cularmente adequada para prevenção e/ou tratamento da aterosclerose, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de IL- 18 e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um interferon. Como inibi- dor de IL-18, a composição pode compreender inibidores caspase-1, anti- corpos contra IL-18, anticorpos contra quaisquer subunidades receptoras de IL-18, inibidores do passo de sinalização de IL-18, antagonistas de IL-18 que competem com IL-18 e bloqueiam o receptor de IL-18, e proteínas, isofor- mas, muteínas, proteínas fundidas, derivados funcionais frações ativas de ligação a IL-18 ou derivados de permutação circular do mesmo dotados da mesma atividade. IL-18BP e suas isoformas, muteínas, proteínas fundidas, deriva- dos funcionais, frações ativas ou derivados de permutação circular conforme descrito acima são os ingredientes ativos preferidos das composições far- macêuticas. O interferon compreendido na composição farmacêutica é de preferência IFN-β.

Em ainda uma outra modalidade preferida, a composição farma- cêutica compreende quantidades terapeuticamente eficazes de um inibidor de IL-18 opcionalmente um interferon e um antagonista de TNF. Os antago- nistas de TNF podem ser anticorpos de neutralização da atividade de TNF, ou fragmentos do receptor de TNF truncados ou solúveis, também denomi- nados TBPI e TPBII. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ainda compreender um ou mais inibidores COX, de preferência inibido- res COX-2. A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ain- da compreender um inibidor tromboxano, como aspirina, e/ou um agente redutor de lipídio como uma estatina. A definição de "farmaceuticamente aceitável" pretende abranger qualquer veículo que não interfira com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e que não seja tóxica ao hospedeiro à qual esta sendo ad- ministrado. Por exemplo, para administração parenteral, as proteínas ativas podem ser formuladas em uma forma de dosagem unitária para injeção em veículos como solução salina, solução de dextrose, albumina de soro e solu- ção de Ringer.

Os ingredientes ativos da composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo em uma série de modos. As vias de administração incluem vias intradérmicas, transdérmicas (por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intraperito- neal, intravenosa, subcutânea, oral, epidural, tópica e intranasal. Qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz pode ser usada, por exemplo, absorção através do epitélio ou tecidos endoteliais ou por terapia genética onde uma molécula de DNA codificando o agente ativo é adminis- trada ao paciente (por exemplo, via vetor) que ocasiona o agente ativo a ser expresso e secretado in vivo. Além disso, as proteínas de acordo com a in- venção podem ser administradas juntamente com outros componentes dos agentes biologicamente ativos como tensoativos farmaceuticamente aceitá- veis, veículos, diluente e veículos.

Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, sub- cutânea, intramuscular), as proteínas ativas podem ser formuladas como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantém a isotonicidade (por exemplo, manitol) ou a estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas comuns. A biodisponibilidade das proteínas ativas, de acordo com a in- venção também pode ser melhorada usando procedimentos conjugados que aumentam a meia-vida da molécula no corpo humano, por exemplo, ligação da molécula a polietilenoglicol conforme descrito no Pedido de Patente PCT WO 92/13095.

As quantidades terapeuticamente eficazes das proteínas ativas serão uma função de muitas variáveis, incluindo o tipo de antagonista, a afi- nidade do antagonista para IL-18, qualquer atividade citotóxica residual apresentada pelo antagonista, a via de administração, a condição clínica do paciente (incluindo o desejo de manter um nível não-tóxico da atividade de IL-18 endógena.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é tal que quando ad- ministrada o inibidor de IL-18 resulta na inibição da atividade biológica de IL- 18. A dosagem administrada, como doses únicas ou múltiplas, a um indiví- duo irá variar, dependendo de uma série de fatores, incluindo propriedades farmacocinéticas do inibidor de IL-18, da via de administração das condições e características do paciente (sexo, idade, peso corpóreo, saúde, altura) ex- tensão dos sintomas, tratamento concorrentes, freqüência de tratamento e do efeito desejado. O ajuste e manipulação das faixas de dosagem ofereci- das estão dentro da capacidade dos versados na técnica, bem como dos métodos in vitro e in vivo de determinação da inibição de IL-18 em um indiví- duo.

De acordo com a invenção, o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,0001 a 10 mg/kg ou cerca de 0,01 a 5 mg/kg de peso corpóreo, ou cerca de 0,01 a 5 mg/kg de peso corpóreo ou cerca de 0,1 a 3 mg/kg de peso corpóreo, ou cerca de 1 a 2 mg/kg de peso corpóreo.

Quantidades mais preferidas dos inibidores de IL-18 são quantidades de cerca de 0,1 a 1000 pg/kg de peso corpóreo ou cerca de 1 a 100 pg/kg de peso corpóreo ou cerca de 10 a 50 pg/kg de peso corpóreo. A via de administração preferida de acordo com a invenção é administração por via subcutânea. A administração intramuscular é mais preferida de acordo com a invenção.

Em modalidades mais preferidas, o inibidor de IL-18 é adminis- trado diariamente ou em dias alternados.

As dosagens diárias são normalmente oferecidas em doses divi- didas ou na forma de liberação prolongada eficazes para obter os desejados resultados. A segunda ou subseqüente administração pode ser realizada a uma dosagem que é igual, menor ou maior do que a dose inicial ou prévia administrada ao indivíduo. Uma segunda ou subseqüente administração pode ser dada durante ou antes do início da doença.

De acordo com a invenção, o inibidor de IL-18 pode ser admi- nistrado profilaticamente ou terapeuticamente a um indivíduo antes de, si- multaneamente e/ou seqüencialmente com outros regimes ou agentes tera- pêuticos (por exemplo, regimes de múltiplas drogas) em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Agentes ativos que são administrados simultanea- mente com outros agentes terapêuticos podem ser administrados na mesma ou em diferentes composições. A invenção refere-se ainda a um método de tratamento e/ou prevenção da aterosclerose compreendendo a administração a um hospe- deiro em necessidade do mesmo de uma quantidade inibidora eficaz de um inibidor de IL-18. A invenção refere-se ainda a um método de prevenção e/ou tra- tamento da aterosclerose compreendendo a administração a um hospedeiro em necessidade do mesmo de um vetor de expressão compreendendo a seqüência de codificação de um inibidor de IL-18.

Em modalidades preferidas da invenção, o vetor de expressão é administrado sistemicamente, e, mais preferivelmente por injeção intramus- cular. A invenção refere-se ainda ao uso de IL-18 como um marcador de diagnóstico para um prognóstico clínico ruim na falha cardíaca. Prognós- tico clínico ruim abrange qualquer piora no estado dos pacientes, como eventos recorrentes, ou até mesmo morte, seguinte ao primeiro infarto do miocárdio.

De preferência, IL-18 é usado como um marcador de diagnóstico de eventos recorrentes após um primeiro evento de falha cardíaca. Eventos recorrentes incluem, sem limitação a morte, isquemia recorrente, re- vascularização, progresso da aterosclerose ou nova hospitalização por moti- vo de falha cardíaca.

Tendo agora descrito a invenção, esta ficará mais prontamente entendida pela referência aos exemplos a seguir que são dados à guisa de ilustração e não devendo ser limitadores da presente invenção.

Exemplos Materiais e Métodos Espécimes Foram coletadas quarenta e uma placas ateroscleróticas huma- nas removidas de 36 pacientes que passaram por endarterectomia carótida.

Para os controles, 2 carótidas e 3 artérias mamárias internas isentas de ate- rosclerose (2 com espessamento mínimo fibromuscular) foram obtidas na autópsia ou durante cirurgia de desvio coronário. Elas foram rapidamente imersas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. As placas usadas para extração de proteína e RNA foram rapidamente lavadas, imersa em nitrogênio líquido antes de serem armazenadas a -80°C. Para testes imuno- histoquímicos, as placas foram colocadas por 2 horas em paraformaldeído fresco a 4%, a seguir transferidas para solução de PBS-sacarose a 30% sendo congeladas rapidamente em meio de processamento de tecido a tem- peratura de corte ótima (O.C.T. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division) com nitrogênio líquido e armazenada a-80°C para secionamento criostático. Vários cortes de 8- a 10 pm foram obtidos e cada espécime para análise histológica e testes imunohistoquímicos.

Classificação do Paciente De modo a estudar a relação potencial entre expressão de IL- 18/IL-18BP e sinais de instabilidade da placa, coletou-se de modo prospecti- vo e cego dados clínicos de 23 pacientes consecutivos (dos 36) passando pelo procedimento de endarterectomia, entre maio e agosto de 2000. A pre- sença ou ausência de uma úlcera no interior da placa no exame macroscó- pico foi sistematicamente relatada pelo cirurgião que executou o procedi- mento de endarterectomia. Isto nos permitiu classificar as placas como pla- cas ulceradas ou não-ulceradas. Além disso, os pacientes foram classifica- dos de acordo com sintomas clínicos em dois grupos separados. Os paci- entes que se apresentaram com sintomas clínicos de ataque isquêmico ce- rebral relatados com estenose carótida foram classificados como sintomáti- cos. A endarterectomia foi realizada 2-66 dias (17,6 ± 5,3 dias) após o início dos sintomas clínicos nesses pacientes. Pacientes que nunca experimenta- ram sintomas de isquemia cerebral no território da artéria carótida foram classificados como assintomáticos. Estenose da carótida assintomática foi detectada com base no exame clínico sistemático de pacientes com doença coronária ou periférica, e sua gravidade foi determinada usando repetida ecografia Doppler por um ecografista experiente disponível. Mesmo que os pacientes assintomáticos nunca tivessem tido um episódio isquêmico no lo- cal da estenose da carótida, a endarterectomia da carótida demonstrou ser benéfica nesses pacientes, como se vê por Asymptomatic Carotid Atheros- clerosis Study (ACAS) Investigators (28).

Análise por Manchamento Western Extraíram-se proteínas de 12 placas ateroscleróticas e 5 artérias normais de controle. Amostras congeladas foram pulverizadas sob nitrogênio líquido. Os pós foram ressuspensos em tampão de lise congelados [20 mmol/L Tris-HCI, pH7,5, 5 mmol/L EGTA, 150mmol/L NaCI, 20 mmol/L glice- rofosfato, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L ortovanadato de sódio, 1% Triton X-10, 0,1% de Tween 20, 1 pg/ml aprotinina, 1 mmol/L PMSF, 0,5 mmol/L N-tosil- L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), 0,5 mmol/L N(a)-paratosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK)] a uma relação de 0,3 ml/10 mg de peso úmido. Os extratos foram incubados em gelo por 15 minutos e a seguir centrifugados (12.000 g, 15 minutos, 4°C). As frações do sobrenadante solúveis em deter- gente foram retidas, e concentrações de proteína nas amostras foram equa- lizadas mediante uso de um ensaio de proteína Bio-Rad.

De modo a realizar os ensaios de manchamento western para IL-18 e IL-18R, os extratos protéicos foram fervidos por 5 minutos e introdu- zidos em um gel de SDS-poliacrilamida a 7,5% ou 15%. Para IL-18BP, rhlL- 18 purificado de E.Coli (Serono Pharmaceutical Research Institute, Genebra) foi acoplado a Affligel 15 (Biorad) a 1 mg/ml de resina de acordo com o pro- tocolo do fabricante. O extrato de proteína (60 pg) foi incubado durante a noite a 4°C em um cilindro com 20 μΙ de resina ajustada para 500 ul de Twe- en 0,05% em PBS. De modo a remover qualquer ligação não-específica a resina foi centrifugada e lavada com 1 mM de Tris pH 8, 140 mM de NaCI, 0,5% de Triton-X-100 (Fluka), 0,5% de desoxicolato, a seguir com 50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCI, 0,05% de TX100, 0,05% de nonidet P40 (Fluka) 2mM CHAPS (Boehringer Mannheim), seguido por uma lavagem final com 50 mM de Tris pH 8. A resina foi a seguir centrifugada, ressuspensa em tampão de amostra sob condições reduzidas fervida por 5 minutos e, final- mente introduzida em um gel NuPAGE SDS-poliacrilamida a 10% (Invitro- gen).

As amostras foram transferidas eletroforeticamemte dos géis de poliacrilamida sobre nitrocelulose. As membranas de nitrocelulose foram saturadas por 2 horas a temperatura ambiente em TBST [50 mmol/L Tris- HCI (pH 7,5), 250 mmol/L NaCI, e 0,1% de solução salina Tween ] contendo 5% de leite em pó desnatado a 5%. As membranas foram a seguir incuba- das com anticorpos policlonais de IL-18 e IL-1R (cadeia-a) (1 ug/ml) antihu- mano de cabra (R & D Systems), anticorpo monoclonal de IL-18 BP antihu- mano de camundongo (Mab 657,27 a 5 pg/ml) (Corbaz et al, 2000 manus- crito cedido) anticorpo policlonal caspase-1 antihumano de coelho (1 ug/ml) (A-19) Santa Cruz. A especificidade de Mab 657,27 foi analisada em mem- brana retirada por competição usando um excesso molar de 200 vezes de rhlL-18BP-6his (purificado de células ovarianas de hamster chinês, Serono Pharmaceutical Research Institute) co-incubadas com o Mab 657,27 a 5 μg/ml durante 1 hora. A seguir à incubação com anticorpo correspondentes conjugados com HRP, substratos quimioluminescentes (ECL, manchamento Western, Amersham Corp) foram usados para revelar faixas positivas de acordo com as instruções do fabricante e as faixas foram visualizadas após exposição a Hyperfilm ECL (Amersham Corp.) Imunohistoquímica Cortes congelados de 6 placas ateroscleróticas foram incubados com 1:10 de soro de cavalo normal ou soro de cabra normal 1:10 por 30 mi- nutos a temperatura ambiente, lavados uma vez em PBS, a seguir incuba- dos com, seja um anticorpo monoclonal de camundongo primário contra CD68 para identificação e macrófago (DAKO-CD68, KP1) ou um anticorpo monoclonal de camundongo primário contra α-actina de músculo liso huma- no (1A4, DAKO) para identificação da células musculares lisas). Para identi- ficar IL-18 e receptor de IL-18 dentro das placas ateroscleróticas, anticorpos policlonais de cabra específicos (R & D Systems) foram usados a uma dilui- ção de 5 pg/ml. IL-18 BP foi detectado com o uso de um anticorpo monoclo- nal específico direcionado contra isoforma IL-18BP humana recombinante (H20) (Corbaz et al. 2000 manuscrito cedido). Após lavagem em PBS, as lâminas foram incubadas com os seguintes anticorpo biotinilados secundári- os: um IgG anticamundongo de cavalo biotinilado (Vector Laboratories, Inc) a uma diluição de 1:200 para detecção de manchas com anticorpos contra CD68, α-actina muscular lisa e IL-18 BP e um IgG anticabra de cavalo bioti- nilado (Vector) a uma diluição de 1:200 para detecção de anticorpos antilL- 18 e receptor de antilL-18.lmunomanchamentos foram visualizados com o uso de sistemas de visualização HRP avidina-biotina (kit da Vectastain ABC PK-6100 Vector). Para controles negativos, cortes adjacentes foram man- chados com anticorpos irrelevantes isótipo-pareados no lugar de anticorpos primários.

Preparação de RNA RNA total foi extraído de 29 placas ateroscleróticas em uma so- lução de ácido tiocianato de guanídio e extraído com fenol e clorofórmio de acordo com o método de Chomczynski e Sacchi (29). O RNA purificado foi dissolvido em água e a concentração medida por absorbância a 260 nm. A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em géis de agarose a 1%. cDNA foi sintetizado de 1 μρ de RNA total usando o sistema de transcrição reversa da Promega de acordo com o protocolo do fabricante. PCR semiquantitativo e em tempo real de IL-18 e IL-18Bp de humano em placas ateroscleróticas humanas Reações PCR semiquantitativas foram realizadas em um volume total de 50 μΙ na presença de 1U de DNA Polymerase AmpliTaq (Perkin El- mer, Roche. USA), 2,5 mM de dNTPs (Amersham, USA) e 50 pmoles de iniciadores PCR dianteiros e reversos. As reações foram incubadas em um Ciclizador de efeito térmico Peltier PCT-200 (MJ Research, USA) sob as se- guintes condições: desnaturação 1 minutos a 94°C, recozimento por 1 mi- nuto a 55°C e prolongamento por 1 minutos a 72°C. Para garantir a compa- ração da quantidade de produtos PCR durante a fase linear da reação PCR, IL-18BP, IL-18 e β-actina foram analisados após 25, 28 e 31 ciclos. O núme- ro ótimo de ciclos para IL-18BP, IL-18 e β-actina antes da saturação das fai- xas foi determinado (31, 28 e 25 respectivamente). Iniciadores PCR foram projetados com base nas seqüências publicadas (AF110799, D49950, X00351) como segue: IL-18, 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'reverso; 5- GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'dianteiro; IL-18BP, 5'-ACCTGTCTACCTG GAGTGAA-3' dianteiro, 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'reverso, β-actina, 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'reverso, 5-GCTCACCATGGATGA TGATATCGC-3'dianteiro. A fim de excluir a amplificação do DNA genômico potencial contaminando as amostras, realizaram-se reações PCR na ausên- cia da matriz de cDNA. Produtos PCR (10 μΙ) foram analisados em géis de agarose a 1% eletroforisados em tampão 1x TAE. O tamanho dos produtos PCR foi verificado por comparação com um escalonamento de 1 kb (Gibco) seguinte ao manchamento dos géis. A quantificação relativa das faixas man- chadas de brometo de etídio foi realizada sob luz UV usando software analí- tico Digital-Sciences da Kodak, e relatou-se como a relação de gene alvo (hlL-18BP, hlL-18) para gene doméstico (ΐΊβ-actÍna).

Iniciadores PCR SYBR Green Real Time para IL-18, IL-18BP e GAPDH (controle doméstico) foram projetados usando o software Iniciador Express de PE Biosystems de acordo com as seqüência publicadas (AF110799, D49950, NM 002046) a seguir: IL-18, 5'-CAGCCGCTTTAGCA GCCA-3'reverso, 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3' dianteiro, IL18BP, 5'- AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3'reverso, 5'-TCCC AT GT CT CT G CT C ATTT A GTC-3'dianteiro; GAPDH, 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3'reverso, 5'- CCACCCATGGCAAATTCC-3'dianteiro, íntron-GAPDH, 5'-CCTAGTCCCAG GGCTTTGATT-3' reverso, 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3'dianteiro. A especificidade e concentração do iniciador ótimas foram testadas. A con- taminação por DNA genômico potencial foi excluída por realização de rea- ções PCR com iniciadores íntron-GAPDH específicos. A ausência de ampli- ficação não-específica foi confirmada por análise dos produtos PCR por ele- troforese de gel de agarose a 3,5%. Realizou-se PCR SYBR Green Real- Time com 5 μΙ/cavidade de produtos RT (0,5 ng de RNA total), 25 μΙ/cavidade de mistura master PCR SYBR Green (PE Biosystem, CA, USA) com AmpErase Uracil N-glicosilase (UNG) (0,5 unidade/cavidade) e 20 μΙ de iniciadores (300 nM). A PCR foi realizada a 50°C por 2 minutos (para Am- pERase incubação UNG para remover qualquer uracil incorporado ao cDNA), 95°C por 10 minutos (para ativação AmpliTaq Gold) e a seguir tra- balhado por 40 ciclos a 95°C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto no siste- ma de Detecção ABI PRISM 7700. As amostras de cDNA de transcriptase reversa foram assim ampliadas e seus valores Ct (limite do ciclo) determina- dos. Todos os valores Ct foram normalizados para o gene doméstico GAPDH. Uma faixa específica única de DNA para IL-18, IL-18BP e GAPDH foi observada usando análise de eletroforese de gel. O princípio da detecção em tempo real usando o "SYBR Green PCR master mix" é baseado na detecção direta do produto PCR medindo-se o aumento na fluorescência causada por ligação do corante SYBR Green ao DNA de duplo filamento.

Análise Estatística Os dados são expressos como média ± SEM. Níveis de IL-18 fo- ram comparados entre grupos usando o teste de Mann-Whitney. Um valor de p = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Exemplo 1 Proteção por inibidores de 11-8 de morte celular endotelial indu- zida por lipoproteínas oxidadas (oxLDL) Células endoteliais de veia umbilical humana cultivada (HU- VECs) foram expostas por 16 horas a oxLDL na presença ou ausência de proteína de ligação a IL-18 ou anticorpo antilL-18. Como se vê da Figura 1,83% das HUVECs morreram após exposição a oxLDL. A co-incubação com IL-18BP ou anticorpo antilL-18 resgatou quase totalmente as células da morte. Não se observou nenhuma morte usando IL-18BP. 89% das células sobreviveram usando o anticorpo antilL-18. O experimento mostra claramente o efeito protetor dos dois dife- rentes inibidores de IL-18 contra morte celular devido a apoptose dentro da placa aterosclerótica.

Exemplo 2 Expressão de proteína IL-18 e seu inibidor endógeno IL-18BP em placas ateroscleróticas.

Ensaios de manchamento Western foram realizados em extratos de proteína de 12 artérias carótidas ateroscleróticas e 5 controles normais.

Proteína IL-18 incluindo a forma ativa, foi altamente expressa em todas as placas ateroscleróticas enquanto pouca ou nenhuma expressão foi observa- da nas artérias normais (Figura 2). Faixas 1 a 4 contém amostras de placas ateroscleróticas, faixas 5 a 7 artérias normais. De modo significativo, a de- tecção da forma ativa onde IL-18 pareceu correlacionar-se com a expressão da forma ativa de caspase-1, que está envolvida no processamento de IL-18 (figura 2 fileira adiante). A expressão significativa da proteína receptora de IL-18 (a cadeia a) também foi detectada em todas as placas ateroscleróticas em comparação com um nível muito baixo de expressão em artérias normais (figura 2 segunda fileira). Além disso, uma maior parte de placas ateroscle- róticas expressou IL-18BP embora o nível de expressão fosse heterogêneo (Figura 2 primeira fileira).

Exemplo 3 Localização celular de proteína IL-18 e seu inibidor endógeno IL- 18BP em placas ateroscleróticas.

De modo a determinar a localização celular de IL-18 e IL-18BP realizaram-se estudos imunohistoquímicos em 6 placas ateroscleróticas ca- rótidas. Como se vê na figura 2, IL-18 foi expresso principalmente em ma- crófagos, sendo essas células provavelmente a fonte principal e IL-18 na paca (não-mostrado). Essas áreas também eram ricas em linfócitos CD3- positivos. Contudo, linfócitos T não pareceram estar diretamente envolvidos na produção de IL-18. IL-18 também foi expresso e algumas células muscu- lares lisas íntimas e em células endoteliais ocasionais. Por contraste, a ex- pressão significativa de IL-18BP foi detectada em células endoteliais de mi- crovasos de placa e naqueles da superfície luminal, embora a expressão não fosse encontrada em todos os vasos. A expressão de IL-18 BP relativa- mente baixa e mais heterogênea também foi detectada, principalmente ex- tracelularmente, em algumas áreas ricas e macrófago.

Exemplo 4 Expressão de transcrição de mRNA de IL-18 e IL-18BP em pla- cas ateroscleróticas e relação com a instabilidade da placa.

De modo a determinar se mRNA de IL-18 e IL-18BP humano foi expresso em placas ateroscleróticas da carótida humana, RT-PCR semi- quantitativo foi realizado em seis placas ateroscleróticas (Figura 3). mRNA de IL-18 e IL-18BP foi detectado em todas as placas ateroscleróticas embora a quantidade de mRNA para IL-18 e IL-18BP fosse heterogênea. Conse- qüentemente, e modo a quantificar precisamente os níveis da expressão de mRNA de IL-18 e IL-18BP, 23 placas ateroscleróticas foram ainda analisa- das com o método PCR SYBR Green de Tempo-Real (figura 4). As placas foram caracterizadas por exame clínico e patológico como sintomáticas (instáveis) ou assintomáticas (estáveis), contendo úlcera macroscópica ou não. As características clínicas dos pacientes estão resumidas na Tabela 4. A percentagem de redução do diâmetro da carótida (60%-95%) e fatores de risco, incluindo idade, diabetes, hipercolesterolemia, hipertensão e tabagis- mo não se diferenciou entre os dois grupos.

Tabela 4 Características do paciente Assintomáticas Sintomáticas Pacientes (n = 9) Pacientes1 (n = 14) Idade 66,9±4,0 70,2±3,9 Gênero Masculino(8) Masculino(9) hipertensão2 8 9 hipercolesterolemia3 4 8 Diabetes 3 1 Tabagismo atual 7 8 doença arterial coronária_____5________________ 4 1 Esses pacientes apresentaram-se com ataque cerebral isquê- mico passageiro ou persistente 2-66 dias antes da endarterectomia. 2 Número de pacientes com hipertensão clínica sendo tratado com agentes anti-hipertensivos. 3 Número de pacientes com hipercolesterolemia clínica sendo tratados com drogas redutoras de lipídio. A proporção de IL-18 foi vista ser regulada ascendentemente na sintomatologia comparada com as placas ateroscleróticas assintomáticas (2,03± 0,5 versus 0,67 ±0,17, respectivamente) (figura 4A). A análise esta- tística demonstrou que este aumento na produção de IL-18 observada nas placas sintomáticas foi altamente significativa (p <0,0074), enquanto a pro- porção aumentada de IL-18BP observada nas placas sintomáticas versus assintomáticas não foi (4,64 ± 0,98 versus 2,5 ± 0,92 respectivamente) (Fi- gura 4B). Em outras palavras, embora ambos os grupos sintomáticos e as- sintomáticos mostrassem correlação positiva entre mRNA de IL-18 e IL- 18BP, as inclinações foram significantemente diferentes entre os 2 grupos (grupos sintomático: inclinação 1.16 ([0,19-2,14], r2 = 0,36 versus grupos assintomáticos: inclinação 4,79 [2,39-7,20], r2 = 0,76 p<0,05). Portanto, pa- rece que o aumento relativo na expressão de IL-18BP no grupo sintomático não é suficiente o bastante para compensar o aumento na expressão de IL- 18. Além do mais, como a presença de ulceração é considerada como as- pecto de instabilidade nas placas, a análise estatística foi ainda realizada nas placas sem ou com úlceras intraplaca e demonstrou uma regulação as- cendente significativa de IL-18 nas placas apresentando úlcera (p<0,018) Figura 4C).

Estes dados mostram que o aumento na expressão de IL-18 vista nas placas ateroscleróticas correlaciona-se com a instabilidade da pla- ca.

Exemplo 5 IL-18BP modula o desenvolvimento de lesão aterosclerótica e estabilidade no modelo de doença in vivo Métodos Características do paciente Amostras de plasma foram obtidas de pacientes com síndrome coronárias isquêmica agudas (angina instável e infarto do miocárdio), menos que 7 dias a seguir início dos sintomas. A angina instável foi definida como associação de dor no peito típica com, seja alterações isquêmicas no eletro- cardiograma ou a presença de doença arterial coronária. O infarto do mio- cárdio foi diagnosticado com base nas alterações isquêmicas típicas no ele- trocardiograma, associada com aumentos significativos nas enzimas do mio- cárdio (creatina fosfoquinase e troponina I) no sangue circulante. Pacientes não-isquêmicos foram recrutados no mesmo departamento de cardiologia e estavam completamente isentos de sinais isquêmicos. Níveis de plasma de IL-18 humano foram determinados usando um kit comercialmente disponível (MBL, Japão).

Eletrotransferência intramuscular in vivo de plasmídeo de ex- pressão IL-18BP de murino Quatorze camundongos machos C57BL/6 apoE KO, de 14 se- manas de idade, receberam a intervalos de 3 semanas, 3 injeções com o plasmídeo de expressão de IL-18BP pcDNA3-IL18BP. Os camundongos de controle (n = 19) foram injetados com o plasmídeo vazio de controle. cDNA da isoforma d IL-18BP de murino isolado conforme descrito (número de acesso Q9ZOM9) (23) foi subclonado para os sítios EcoR1/Not1 do vetor de expressão celular de mamífero pcDNA3 sob o controle do promotor de cito- megalovírus (Invitrogen). O constructo denominado 334.yh vê-se na Figura 5. Plasmídeo de controle foi um constructo similar destituído de cDNA tera- pêutico. O IL-18BP ou plasmídeo de expressão de controle (60 μg) foi inje- tado em ambos os músculos cranianos da tíbia do camundongos anestesia- do conforme descrito antes (13).Em resumo, pulsos elétricos transcutâneos, (8 pulsos elétricos de onda quadrada de 200 V/cm, 20 msegundos de dura- ção a 2 Hz) foram fornecidos por um eletropulsador PS-15 (Genetronics, França) usando dois eletrodos de placa de aço inoxidável colocados 4,2 a 5,3 mm de distância em cada lado da perna.

mlL-18BP ELISA AS placas foram revestidas durante a noite com anticorpo poli- clonal de coelho purificado com r-mlL-18BPd-afinidade (5 pg/cavidade). De- tectou-se mll_-18BP solúvel usando um anticorpo policlonal de coelho bioti- nilado (0,3 pg/ml) construído contra E.coli r-mlL-18BP (Peprotec) seguido por extravidina peroxidase (1/1000) (Sigma). O anticorpo policlonal de coe- lho captor foi testado por Manchamento Western de modo a confirmar a es- pecificidade para mlL-18BP. mlL-18BPd recombinante produzido por células HEK 293 foi usado como padrão. A sensibilidade do teste ELISA foi de 5 ng/ml.

Análise dos camundongos Cortes criostáticos (8 μιτι) foram obtidos do sinus aórtico e foram usados para detecção de deposição lipídica usando óleo vermelho, detecção de colágeno usando vermelho Sirius e para análise imunohistoquímica como antes descrito (13). Os cortes foram manchados com anticorpos primários específicos : macrófago anticamundongo, MOMA2 de clone (BioSource), antia-actina fosfatase alcalina-conjugada para células musculares lisas e antiCD3 para linfócitos T (Dako) como antes descrito (13). A detecção da morte celular foi realizada usando a técnica TUNEL (13). Células CD3 positi- vas foram microscopicamente contadas em um modo às cegas. Placas ate- roscleróticas no sinus aórtico e áreas que mancharam positivo para macró- fagos, células musculares lisas, colágeno ou TUNEL foram medida usando quantificação de imagem auxiliada por computador (NS15000, Microvision) como previamente descrito (13). O manchamento com imunoglobulinas pa- readas com isótipo não-imune avaliou a especificidade do imunomancha- mento. A especificidade de TUNEL foi avaliada por omissão da enzima ter- minal desoxinucleotidil transferase. As aortas torácicas, estendendo-se da artéria subclaviana esquerda para as artérias renais, foram fixas com forma- lina tamponada a 10% e manchadas para deposição de lipídio com vermelho Oil. Elas foram a seguir abertas longitudinalmente e a percentagem de de- posição lipídica foi calculada usando quantificação de imagem por computa- dor (NS15000, Microvision).

Resultados No estudo atual, a hipótese foi testada que a regulação de IL- 18/IL-18BP desempenha um papel crítico em ambas, aterogênese e estabili- dade da placa. Níveis plasmáticos de IL-18 em pacientes com síndromes coronárias agudas (30 machos, 18 fêmeas, idade média 66,2± 1,8 anos, dos quais 14 tinham angina instável e 34 tiveram infarto do miocárdio) e em pa- cientes de controle não-isquêmicos avaliados no mesmo departamento car- diológico (10 machos, 3 fêmeas, idade média 60,0±5,2 anos) foram medidos. Níveis plasmáticos de IL-18 eram significativamente elevados em pacientes com coronária aguda comparado com controles (146,9±17,1 versus 73,0+12,2 pg/ml, respectivamente, p < 0,05) em contraste com níveis circu- lantes de IL-18BP que foram ligeiramente aumentados (20,1 ± 2,7 versus 7,5 ± 2,5 ng/ml, respectivamente, p = 0,06). Além disso, níveis IL-18 correlacio- naram-se com a gravidade da doença quando níveis mais altos foram obser- vados nos pacientes com disfunção cardíaca isquêmica grave e sinais clíni- cos de edema pulmonar (224,03 ±39,1 pg/ml, p< 0,001 comparado com controles). Esses resultados obtidos de pacientes com doença coronária aguda, juntamente com observações prévias que IL-18 é elevado em placas ateroscleróticas de pacientes com derrame [Mallat, 2001] sugere um papel potencial mente importante para regulação de IL-18/IL-18BP no processo aterosclerótico.

Testou-se, portanto, esta hipótese usando camundongos (KO) nocaute apoE, os quais desenvolvem espontaneamente lesões ateroscleró- ticas similares as de humano. Quatorze camundongos machos de 14 sema- nas de idade receberam suplementação de IL-18BP através de eletrotransfe- rência intramuscular in vivo de um DNA de plasmídeo de expressão codifi- cando para IL-18BPd de murino, enquanto 19 controles de idade igual rece- beram o plasmídeo vazio. A eletrotransferência de plasmídeo foi repetida cada 3 semanas e os camundongos foram sacrificados a 23 semanas de idade seguindo-se 9 semanas de tratamento. Níveis plasmáticos de IL-18BP de murino foram mais baixos do que os limites de detecção (5 ng/ml) em camundongos KO apoE injetados com o plasmídeo vazios, contudo, uma única injeção do plasmídeo IL-18BP resultou em níveis altos de IL-18BP no sangue com uma elevação máxima 2 dias após injeção (323,5 ± 100,9 ng/ml) e 127,4+35,4 ng/ml medidos após 2 semanas. Seguinte 9 semanas de tratamento com, seja IL-18BP ou plasmídeo vazio, o colesterol total (489,4±34,6 versus 480,8 ± 36,3 mg/dl, respectivamente) e níveis sorológi- cos lipoprotéicos de alta densidade (52,3 ±9,4 versus 48,8 ± 5,1 mg/dl, res- pectivamente) não eram diferentes entre os 2 grupos. Um aumento pequeno, porém significativo no peso do animal foi observado no grupo tratado com IL- 18BP, comparado com o grupo de controle (31,8 ± 0,9 versus 28,6 ± 0,8 g, respectivamente p< 0,05). O resultado da suplementação com IL-18BP na aterosclerose foi examinado em 2 diferentes locais: a aorta torácica descendente e o sinus aórtico. A aorta torácica foi escolhida para determinar o papel de IL-18BP no desenvolvimento de riscas de gordura (aterogênese) desde que lesões ate- roscleroticas torácicas são quase ausentes na idade de 14 semanas (dados não-mostrados) onde a transfecção com IL-18BP foi iniciada. O sinus aórtico onde lesões ateroscleróticas estavam já presentes em 14 semanas de idade (dados não mostrados) foi examinado para progresso da placa avançado e comprimido, um determinante importante de estabilidade da placa. O trata- mento com IL-18BP de camundongos KO apoE afetou significativamente o desenvolvimento e progresso da lesão aterosclerótica. O exame da aorta torácica mostrou uma redução acentuada na deposição de lipídio em ca- mundongos tratados com o plasmídeo IL-18BP comparado com o plasmídeo vazio (Figura 6). Análise de imagem por computador quantitativa mostrou 69% de redução na extensão das lesões ateroscleróticas (p < 0,0001) (figura 6) apontando para um papel permissivo crítico par IL-18 na aterogênese.

Além disso, o tratamento com plasmídeo IL-18BP por apenas 9 semanas, limitou significativamente o progresso de placas ateroscleróticas avançadas no sinus aórtico (24% de redução no tamanho da placa, p = 0,01) compara- do com o tratamento com o plasmídeo vazio (figura 7).

Mais importante, a composição das lesões avançadas, um de- terminante principal de instabilidade da placa, ficou profundamente afetada pelo tratamento com IL-18BP. Lesões ateroscleróticas de camundongo tra- tados com o plasmídeo IL-18BP apresentaram uma redução muito significa- tiva (50%) na infiltração de macrófago (p < 0,0001) figura 8, continha, 67% menos linfócitos T (p <0,005)) (figura 8) e mostraram um aumento duplo no acúmulo celular muscular liso (p < 0,05) (figura 9). Além disso, essas mu- danças importantes na composição celular da lesão foram associadas com um aumento de 85% significativo no teor de colágeno (p < 0,0005) conforme determinado por machamento com vermelho Sirius, e uma redução no teor lipídico total.

Portanto, o tratamento com IL-18BP atenuou significativamente o processo inflamatório dentro de lesões ateroscleróticas e induziu um pro- cesso de cura característico de placas ateroscleróticas estáveis. Além disso, a redução acentuada no componente inflamatório das lesões em camundon- go tratado com IL-18BP estava associada com uma redução substancial na ocorrência de morte celular dentro das placas (2,9 + 0,9% em camundongos tratados com IL-18BP versus 10,5 ± 3,6 nos controles, p <0,05), limitando assim, a expansão e trombogenicidade do núcleo lipídico acelular (Mallat, 1999).

Conclusões: Usando um modelo de camundongo bem comprovado de ate- rosclerose similar à humana, os resultados acima expostos estabelecem cla- ramente um papel não suspeitado e crucial para a regulação de IL-18 e IL- 18BP no desenvolvimento, progresso e estabilidade da placa aterosclerótica.

Embora a prevenção da formação de lesão inicial na aorta torácica, inibição de atividade IL-18 por suplementação de IL-18BP também afetasse profun- damente a composição de lesão avançada no sinus aórtico, induzindo uma mudança no sentido de um fenótipo de placa estável. O prognóstico clínico de um paciente com aterosclerose depen- de apenas em parte do tamanho das lesões. É agora amplamente reconhe- cido que a qualidade (composição da placa), ao invés do tamanho da lesão poderia ser um indicador até mesmo melhor da ocorrência de eventos is- quêmicos. De fato, manifestações clínicas graves de aterosclerose (infartos do coração e cérebro) são principalmente devidos à oclusão do lúmem do vaso por um trombo formado no contato de uma placa aterosclerótica rompi- da (19). Estudos patológicos demonstraram que placas vulneráveis ou instá- veis, que são sujeitas a romper ou terem-se rompido, são ricas em células inflamatórias e apresentam uma perda substancial em célula muscular lisa e teor de colágeno (20,21). Além do mais tais placas mostra aumento signifi- cativo em morte celular apoptótica levando à formação de um núcleo lipídico altamente trombogênico (13, 22). É digno de nota que todos esse sinais de instabilidade de placa aumentada foram marcadamente atenuados em ca- mundongos tratados com IL-18BP, indicando que a sinalização de IL-18 é um determinante principal de instabilidade da placa.

A relevância dos resultados obtidos em camundongos KO apoE para a doença humana é reforçada pela descoberta de níveis aumentados de IL-18 circulante em pacientes com síndromes coronárias agudas e produ- ção de IL-18 aumentada em placas ateroscleróticas da carótida responsá- veis pelo derrame. Essas descobertas, consideradas juntas, identificam ini- bidores da atividade de IL-8 como novas ferramentas terapêuticas na pre- venção e tratamento do desenvolvimento da placa aterosclerótica e no limi- tar complicações de placa.

Exemplo 6 Níveis elevados de IL-18 estão correlacionados com eventos re- correntes em paciente com falha cardíaca.

Os níveis de IL-18 foram medidos no soro sanguíneo de paci- entes por EIISA com um anticorpo específico para IL-18.

Sem exceção, 56 pacientes isquêmicos ou não-isquêmicos com ou sem falha cardíaca foram submetidos a teste.

Em pacientes que morreram mais tarde os níveis de IL-18 foram 216,0 ± 41,5 pg/ml versus 112,2 ± 12,2 pg/ml em pacientes sem resultado mortal (p = 0,0018).

Em pacientes com qualquer evento recorrente, tal como morte, isquemia recorrente, revascularização, progresso de aterosclerose ou nova hospitalização por falha cardíaca, os níveis IL-18 seguintes foram medidos: 165,8 ± 23,8 versus 107, ± 14,6 em pacientes sem qualquer evento recor- rente (p = 0,03).

Esses resultados demonstram que níveis IL-18 são significati- vamente elevados em pacientes com um prognóstico clínico ruim, como eventos recorrentes ou até mesmo morte.

Amostras de sangue em 16 pacientes não-isquêmicos com ou sem falha cardíaca, foram medidas quanto a seus níveis IL-18. Nos pacien- tes que morreram mais tarde, os níveis eram 199,0 ± 34,8 pg/ml versus 95,3 ± 20,4 pg/ml nos pacientes que sobreviveram (p = 0,09).

Pacientes com qualquer evento recorrente: 146,6 ± 34,4 pg/ml IL-18 versus 95,4 ± 23,9 pg/ml em paciente sem evento recorrente (p = 0,03). Embora as diferenças em níveis de IL-18 não atingissem significância estatística, devido ao número pequeno de pacientes, pode-se observar uma clara tendência para níveis elevados de IL-18.

Em pacientes isquêmicos níveis de IL-18, eram 214,2 ± 45,9 pg/ml nos pacientes que morreram versus 118,4 ± 12,8 pg/ml nos que so- breviveram (p = 0,007. 162,8 ± 24,7 pg/ml de IL-18 foi medido nos pacientes que tive- ram qualquer evento recorrente, versus 116,2 ± 16,0 naqueles sem quais- quer eventos recorrentes.

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Claims (8)

1. Uso de um inibidor de IL-18, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento no tratamento e/ou prevenção de uma condição selecionada a partir de trombose de placa aterosclerótica, úlcera de placa aterosclerótica, desestabilização de placa aterosclerótica, e rompi- mento de placa aterosclerótica, em que o inibidor de IL-18 é selecionado a partir de proteína de ligação IL-18 (IL-18BP) de acordo com a Seq ID No 2 ou 4, uma muteína de IL-18BP compreendendo substituições de aminoáci- dos de conservação, uma proteína de fusão de IL-18BP e regiões de cadeia pesada de imunoglobulina, ou IL-18BP PEGuilado, em que a muteína, a pro- teína de fusão ou IL-18BP PEGuilado retém a atividade biológica de ligação à IL-18.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina na proteína de fusão é do isótipo lgG1 ou lgG2.

3. Uso de um vetor de expressão compreendendo a sequência de codificação para um inibidor de IL-18, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de uma condição selecionada a partir de trombose de placa aterosclerótica, úlcera de placa aterosclerótica, desestabilização de placa aterosclerótica e rompi- mento de placa aterosclerótica, em que o inibidor de IL-18 é selecionado a partir do grupo que consiste em uma IL-18BP de acordo com a Seq ID No 2 ou 4, uma muteína de IL-18BP compreendendo uma substituição de amino- ácido de conservação, uma proteína de fusão de IL-18BP e regiões de ca- deia pesada de imunoglobulina, ou IL-18BP PEGuilado, em que a muteína, proteína de fusão ou IL-18BP PEGuilado retém a atividade biológica de liga- ção à IL-18.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é administrado via eletrotransferência.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é administrado sistemicamente.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é administrado intra- muscularmente.

7. Uso de uma célula que foi geneticamente modificada para produzir um inibidor de IL-18, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma condição selecionada a partir de trombose de placa aterosclerótica, úlcera de placa aterosclerótica, desestabilização de placa aterosclerótica e rompimento de placa aterosclerótica, em que o inibidor de IL-18 é selecionado a partir do grupo que consiste em uma IL-18BP de acordo com a Seq ID No 2 ou 4, uma muteína de IL-18BP compreendendo uma substituição de aminoácido de conservação, uma proteína de fusão de IL-18BP e regiões de cadeia pe- sada de imunoglobulina, ou IL-18BP PEGuilado, em que a muteína, proteína de fusão ou IL-18BP PEGuilado retém a atividade biológica de ligação à IL- 18.

8. Uso de IL-18, caracterizado pelo fato de que é como um mar- cador diagnóstico de progressão de aterosclerose.