BRPI9917787B1

BRPI9917787B1 - pestivírus csfv atenuado

Info

Publication number: BRPI9917787B1
Application number: BRPI9917787A
Authority: BR
Inventors: Gregor Meyers
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2016-09-06
Also published as: PT1084251E; JP2010259445A; PE20000552A1; SI1203812T1; JP2013099357A; TR200003622T2; BR9911619A; BR9911619B1; EP1203812A3; WO1999064604A2; DE69928700D1; EP1614423A2; ES2253457T3; ATE311193T1; JP4632540B2; EP1084251A2; EP0965639A1; EP1203813B1; HU228468B1; JP5755265B2

Abstract

esta invenção refere-se a pestivirus atenuados caracterizados pelo fato de que sua atividade enzimática presente na glicoproteina erns é inativada, processos para preparar, usar e deletar os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PESTIVÍRUS CSFV ATENUADO".

Dividido do PI9911619-7, depositado em 26.05.1999.

Campo da Invenção A presente invenção se refere a um processo para atenuar pestivírus inativando a atividade de ribonuclease (atividade RNase) presente na glicoproteína ERNS. A invenção refere-se também a pestivírus atenuados de acordo com a invenção, ácidos nucléicos para preparar os pestivírus, vacinas e composições farmacêuticas compreendendo os pestivírus atenuados da invenção. A invenção refere-se ainda a processos para distinguir entre os vírus atenuados da invenção e vírus patogênicos.

Antecedentes da invenção Pestivírus são agentes causadores de doenças economicamente importantes de animais em muitos países do mundo. Vírus presentemente conhecidos foram agrupados em três espécies diferentes que, juntas, formam um gênero dentro da família Flaviviridae. I Diarréia viral de bovinos (BVDV) causa diarréia viral em bovinos (BVD) e doença mucosal (MD) em gado (Baker, 1987; Moennig e Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). II Vírus da febre suína clássica (CSFV), denominado formalmente vírus do cólera de suínos, é responsável pela febra de suínos clássica (CSF) ou cólera de suínos (HC) (Moennig e Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). III Vírus da doença de Border (BDV) é encontrado tipicamente em ovelhas e causa doença de Border (BD). Descreveu-se que sintomas similares a MD em gado também ocorrem após infecção intrau-terina de ovelhas com BDV (Moenning e Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

Uma classificação alternativa de pestivírus é dada por Becher et al. (1995) ou outros.

Pestivírus são vírus pequenos envelopados com um genoma de RNA de filamento único de polaridade positiva desprovidos de ambas as se-qüências 5’ cap e 3’ poli (A). O genoma viral codifica uma poliproteína de cerca de 4000 aminoácidos dando aumento a produtos de divagem finais por processamento co- e pós-translacional envolvendo proteases celular e viral. As proteínas virais são arranjadas na poliproteína na ordem NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NSE-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Rice, 1996). Proteína C e as glicoproteínas ERNS, E1 e E2 representam componentes estruturais do virion de pestivírus (Thiel et al., 1991). Verificou-se que E2 e, em uma extensão menor, ERNS são marcações para neutralização de anticorpos (Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijin et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). Erns é desprovido de uma âncora de membrana e é secretado em quantidades consideráveis de células infectadas; descreveu-se que esta proteína demonstra atividade RNase (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). A função desta atividade enzimática para o ciclo de vida viral é, presentemente, desconhecida. No caso de uma cepa de vacina de CSFV, descreveu-se que destruição experimental de RNase por mutagênese dirigida ao sítio resulta em um vírus citopatogênico que tem características de crescimento em cultura de célula equivalente ao vírus do tipo selvagem (Huls et al., 1998). A atividade enzimática depende da presença de dois pedaços de aminoácidos conservados entre os pestivírus ERNS e RNases conhecidas diferentes, de origem em planta e fúngicas. Ambas as seqüências conservadas contêm um resíduo de histidina (Schneider et al., 1993). Mudança de cada um destes resíduos contra lisina na proteína ERNS de uma cepa de vacina de CSFV resultou na destruição da atividade RNase (Hulst et al., 1998). Introdução destas mutações no genoma da cepa de vacina de CSFV não influencia viabilidade viral ou propriedades de crescimento, mas leva a um vírus demonstrando um fenótipo levemente citopatogênico (Huls et al., 1998).

Vacinas compreendendo vírus atenuados ou mortos ou proteínas virais expressadas em sistemas de expressão heterólogos foram geradas para CSFV e BVDV e são usadas presentemente. A base estrutural da atenuação destes vírus usados como vacinas vivas não é conhecida. Isto leva ao risco de inversões imprevisíveis por retromutação ou subsequente recombinação para vacinação. Por outro lado, a eficácia de vacinas inativa-das ou proteínas virais expressadas heterologamente (vacinas de subunida-de) na indução de imunidade é muito baixa.

Em geral, vacinas vivas com mutações definidas como uma base para atenuação podem admitir que se impeça as desvantagens da presente geração de vacinas. Marcações potenciais para atenuar mutações em pestivírus não estão disponíveis atualmente.

Uma outra vantagem de referidas mutações atenuantes recai em sua singularidade molecular que permite o uso das mesmas como rótulos distintivos para um pestivírus atenuado e para distinguir as mesmas de pestivírus do campo.

Devido à importância de uma profilaxia eficaz e segura bem como detectável e tratamento de infecções virais, existe uma forte necessidade para vacinas vivas e, especificamente, atenuadas com um potencial alto para indução de imunidade, bem como uma base definida de atenuação que também pode ser distinguida de pestivírus patogênicos.

Conseqüentemente, um problema técnico subjacente a presente invenção é prover pestivírus detectavelmente rotulados e especificamente atenuados para uso como vacinas atenuadas vivas com uma alta eficácia para a indução de imunidade que, como um resultado deste processo, também podem ser distinguidos de pestivírus patogênicos do campo.

Descrição da invenção A solução para o problema técnico acima é obtida pela descrição e modalidades caracterizadas nas reivindicações.

Verificou-se surpreendentemente que pestivírus podem ser especificamente atenuados pela inativação da atividade RNase presente na glicoproteína ERNS.

Os pestivírus atenuados provêem agora vacinas de alta imuno-genicidade. Conseqüentemente, em um aspecto a presente invenção provê uma vacina viva compreendendo um pestivírus, em que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada. O termo "vacina", como usado aqui, refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um componente imunologicamente ativo que induz uma resposta imunológi-ca em um animal e, possivelmente, mas não necessariamente, um ou mais componentes adicionais que melhoram a atividade imunológica de referido componente ativo. Uma vacina pode compreender, além disso, outros componentes típicos para composições farmacêuticas. O componente imunologicamente ativo de uma vacina pode completar organismos vivos tanto em sua forma original como organismos atenuados em uma denominada vacina viva modificada (MLV) ou organismos inativados por processos apropriados em uma denominada vacina morta (KV). Em outra forma, o componente imunologicamente ativo de uma vacina pode compreender elementos apropriados de referidos organismos (vacinas de subunidade), em que estes elementos são gerados tanto destruindo o organismo total como as culturas de crescimento destes organismos e etapas de purificação subse-qüentes dando a (s) estrutura (s) desejadas, ou por processos sintéticos induzidos por uma manipulação apropriada de um sistema adequado como, mas não restrito a bactérias, insetos, mamíferos ou outras espécies mais procedimentos de purificação e de isolamento subseqüentes ou por indução de referidos processos sintéticos no animal necessitando de uma vacina por incorporação direta de material genético usando composições farmacêuticas apropriadas (vacinação com polinucleotídeos). Uma vacina pode compreender um ou simultaneamente mais do que um dos elementos acima descritos.

Componentes adicionais para melhorar a resposta imune são constituintes comumente referidos como adjuvantes, como por exemplo, hidróxido de alumínio, óleos minerais e outros ou moléculas ancilares adicionadas à vacina ou geradas pelo corpo após a indução respectiva por estes componentes adicionais, como, mas não restritos a interferons, interleucinas ou fatores de crescimento.

Uma "composição farmacêutica" consiste essencialmente de um ou mais ingredientes capazes de modificar funções fisiológicas, por exemplo, imunológicas, do organismo e é administrada a, ou de organismos vivos em ou sobre sua superfície como, mas não restrito a antibióticos ou antiparasíti-cos, bem como outros constituintes adicionados à mesma a fim de obter determinados objetivos como, mas não limitados, a traços de processamento, esterilidade, estabilidade, praticabilidade de administrar a composição por vias enterais ou parentais como oral, intranasal, intavenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou outra via apropriada, tolerância após administração, propriedades de liberação controlada.

Uma vacina da invenção refere-se a uma vacina como definida acima, em que um componente imunologicamente ativo é um pestivírus ou de origem pestiviral. O termo "vacina viva" refere-se a uma vacina compreendendo um componente vivo, em particular um componente ativo viral vivo. O termo "pestivírus", como usado aqui, refere-se a todos os pestivírus, caracterizados por pertencerem ao mesmo gênero como BVDV, CSFV e BDV da família Flaviviridae e por sua expressão de glicoproteína Erns. Naturalmente, referido termo refere-se também a todos os pestivírus como caracterizados por Becher et al. (1995) ou outros que expressam glicoproteína erns. "Atividade RNase", como aqui usado, refere-se à capacidade da glicoproteína ERNS hidrolisar RNA.

Deve ser notado que o termo glicoproteína EO é freqüentemente usado sinonimamente a glicoproteína ERNS nas publicações. O termo "inativação da atividade RNase presente em referida glicoproteína" refere-se à incapacidade ou capacidade reduzida de uma glicoproteína Erns modificada hidrolisar ERNS como comparado ao tipo selvagem não modificado de referida glicoproteína ERNS.

Inativação da atividade RNase presente na glicoproteína ERNS pode ser obtida por deleções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido de referida glicoproteína como demonstrado aqui por Hulst et al. (1998). Comseqüentemente, em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a vacinas vivas, em que referida atividade RNase é inativada por deleções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido de referida glicoproteína.

Mostrou-se que a glicoproteína ERNS forma um homodímero ligado a dissulfeto de cerca de 97 kD, em que cada monômero consiste de 227 aminoácidos correspondendo aos 268 a 494 aminoácidos da poliproteína CSFV como descrito por Rümenapt et al. (1993). Os primeiros 495 aminoácidos como expressados pela cepa Alfort de CSFV são mostrados na figura 1 para fins de referência somente. A seqüência de genoma da cepa de Alfort de CSFV está disponível na biblioteca de dados GenBank/EMBL sob o número de acesso J04358; alternativamente, a seqüência de aminoácidos para a cepa CP7 de BVDV pode ser acessada na biblioteca de dados GenBank/EMBL (número de acesso U63479). Duas regiões de aminoácidos são altamente conservadas na glicoproteína ERNS bem como em algumas proteínas ativas em RNase de plantas e fúngicas (Schneider et al., 1993). Estas duas regiões são de particular importância na atividade enzimática de RNase. A primeira região consiste da região dos aminoácidos na posição 295 a 307 e a segunda região consiste dos aminoácidos na posição 338 a 357 de referida poliproteína viral, como exemplificado pela figura 1 para a cepa Alfort de CSFV (numeração de acordo com a seqüência de aminoácidos deduzida publicada da cepa CSFV (Meyers et al., 1989). Os aminoácidos de importância particular para a atividade RNase, como acima mencionado, não são de modo algum limitados à posição exata como definido pela cepa Alfort de CSFV, mas são usados simplesmente de um modo exemplar para apontar os aminoácidos preferidos estando naquela posição ou correspondendo àquela posição em outras cepas como encontradas em BVDV, BDV e pestivírus em geral, uma vez que eles são altamente conservados. Para pestivírus diferentes da cepa Alfort de CSFV a numeração das posições dos aminoácidos preferidos é freqüentemente diferente, mas um versado no campo da biologia molecular de pestivírus identificará facilmente estes aminoácidos preferidos por sua posição relativa aos aminoácidos altamente conservados de referida glicoproteína. Em um exemplo não limitati-vo particular, a posição de Alfort de CSFV 346 é idêntica à posição 349 da cepa cp7 de BVDV.

Como uma conseqüência, a presente invenção refere-se, em uma modalidade mais preferida, a uma vacina da invenção, em que referidas deleções e/ou mutações inativantes estão localizadas nos aminoácidos na posição 295 a 307 e/ou posição 338 a 357, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Em uma modalidade muito preferida, a presente invenção descreve que a inativação de referida atividade RNase por deleção ou mutação do aminoácido na posição 346 de referida glicoproteína leva a vacinas vivas particularmente utilizáveis. Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a vacinas de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada por deleção ou mutação do aminoácido na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína. A presente invenção demonstra que pestivírus são viáveis e codificam uma proteína ERNS sem atividade RNase quando o resíduo de histi-dina na posição 346 da poliproteína viral (numeração de acordo com a se-qüência publicada de Alfort/Tübingen de CSFV (Meyers et al., 1989)), que representa um dos resíduos do sítio ativo putativo conservado de RNase de Erns ^ deletado. Demonstra-se, também, por esta invenção que a deleção da histidina respectiva no Erns de um pestivírus BVD (posição 349, numeração de acordo com a seqüência da biblioteca de dados GenBank/EMBL CP7 de BVDV (número de acesso U63479)) resulta em um vírus viável em que a glicoproteína ERNS perde a atividade RNase. Em contraste com mutações de ponto trocando aminoácido por outro, um mutante de deleção é geralmente mais estável com respeito a revertantes. Infecção de suínos com um mutante de erns expressando Alfort/Tübingen de CSFV com esta deleção não leva a febre ou outros sinais clínicos típicos de infecções com CSFV enquanto a infecção com vírus do tipo selvagem resultou em febre, diarréia, anorexia, apatia, depleção de células B e distúrbios dos nervos centrais. Os suínos foram exterminados em um estágio moribundo, mostrando hemorragias graves na pele e órgãos internos 14 dias após inoculação. Os suínos infectados com o mutante nem mostraram viremia nem depleção de células B, como testado nos dias 3, 5, 7, 10, 14 após infecção, enquanto CSFV foi facilmente isolado de amostras de sangue dos suínos inoculados com vírus do tipo selvagem. O mutante de deleção replicou, aparentemente, nos animais como indicado pela indução de anticorpos neutralizantes (ver exemplo 3, tabela 3c). A resposta imune no vírus mutante foi suficiente para permitir sobreviver um desafio letal com 2x105 TCID50 da infecção altamente patogênica com a cepa Eystrup de CSFV (Kõnig, 1994) que é heteróloga à cepa de Alfort. A-lém disso, os animais testados não exibiram nenhum sinal clínico típico para infecção com CSFV como febre, diarréia, hemorragias, depleção de células B ou anorexia após a infecção de desafio. Esta dado demonstra que infecção de suínos com o mutante de deleção induz uma resposta imune suficiente para proteção contra um desafio estringente.

Conseqüentemente, em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a vacinas de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo e-xemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicopro-teína.

Em uma outra modalidade mais preferida, a invenção refere-se a vacinas BVDV de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas de BVDV, de referida glicopro-teína.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a pestivírus atenuados, em que a atividade RNase na glicoproteína ERNS é inativada por deleções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido de referida glicoproteína com a condição de que os aminoácidos na posição 297 e/ou 346 de referida glicoproteína, como descrito na figura 1 para CSFV, não sejam lisi-na. Um pestivírus recombinante, em que aminoácidos na posição 297 e/ou 346 de referida glicoproteína são lisina foi descrito por Hulst et al. em 1998. Estes pestivírus particulares demonstraram efeitos citopáticos em células de rim de suíno. Até agora, existe uma falta de conhecimento total do aspecto surpreendente e de novidade devido à inativação da atividade enzimática de Erns Em uma modalidade preferida, pelas razões acima descritas para vacinas, a presente invenção refere-se também a pestivírus de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada por deleções e/ou mutações localizadas nos aminoácidos na posição 295 a 307 e/ou posição 338 a 357, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glico-proteína.

Em uma modalidade mais preferida, pelas razões acima descritas para vacinas, a presente invenção refere-se também a pestivírus da invenção, em que referida atividade RNase é inativada por deleção ou mutação do aminoácido na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Em uma modalidade mais preferida, pelas razões acima descritas, para vacinas, a presente invenção refere-se também a pestivírus, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidi-na na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína. - Em uma outra modalidade mais preferida, a presente invenção refere-se a pestivírus BVDV, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas de BVDV, de referida glicoproteína.

Os pestivírus atenuados e componentes ativos para vacinas da presente invenção podem ser preparados facilmente por técnicas recombi-nantes modificando ácido nucléico resultando na expressão de uma seqüên-cia de aminoácidos mutante na glicoproteína ERNS. Conseqüentemente, um outro aspecto da presente invenção refere-se a ácidos nucléicos codificando uma glicoproteína ERNS, em que a atividade RNase presente em referida gli- coproteína é inativada por deteções e/ou mutações de pelo menos um ami-noácido de referida glicoproteína com a condição de que os aminoácidos na posição 297 e/ou 346 da glicoproteína, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV, não sejam lisina.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a presente invenção refere-se, pelas razões acima mencionadas, a ácidos nucléicos de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada por deleções e/ou mutações que estão localizadas nos aminoácidos na posição 295 a 307 e/ou posição 338 a 357, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção refere-se, pelas razões mencionadas para vacinas, a ácidos nucléicos de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada por deleção ou mutação do aminoácido na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Em uma outra modalidade mais preferida, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos de BVDV de acordo com a invenção, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas de BVDV, de referida glicoproteína.

Nucleotídeos, por exemplo, DNA ou RNA, também são úteis para preparar vacinas de DNA, RNA e/ou de vetores. Nestas vacinas, os nucleotídeos são aplicados diretamente ao animal ou indiretamente nos vetores diferentes do vírus original. Vacinas de nucleotídeos e vacinas de veto- res são bem conhecidas do presente estado da técnica e não serão ainda elaboradas.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de ácidos nucléicos da presente invenção para preparar vacinas de nucleotí-deos e/ou de vetores.

As vacinas, pestivírus atenuados e/ou ácidos nucléicos de acordo com a invenção são particularmente úteis para a preparação de uma composição farmacêutica.

Em conseqüência, um outro aspecto da presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo uma vacina de acordo com a invenção, e/ou um pestivírus de acordo com a invenção, e/ou uma seqüência de nucleotídeos de acordo com a invenção. Um exemplo não limi-tativo de uma composição farmacêutica, dado somente para fins de demonstração, pode ser preparado como a seguir: Sobrenadante de cultura de células de uma cultura de células infectadas é misturado com um agente de estabilização (por exemplo, espermidina e/ou BSA (albumina de soro bovino) e a mistura é subseqüentemente liofilizada ou desidratada por outros processos. Antes da vacinação, referida mistura é então reidratada em soluções aquosas (por exemplo, solução salina, PBS (solução salina tamponada com fosfato)) ou não aquosas (por exemplo, emulsão de óleo, adjuvante baseado em alumínio).

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um processo de atenuação para pestivírus. A invenção provê um processo único e inesperado para atenuar pestivírus, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada.

Os pestivírus especificamente atenuados são especialmente ú-teis para a preparação de vacinas. Conseqüentemente, em um outro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a processos para produzir uma vacina de pestivírus especificamente atenuada caracterizada pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada. A inativação da atividade RNase presente na glicoproteína ERNS provê um processo novo e surpreendente para rotular detectavelmente pes- tivírus. Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para rotular detectavelmente pestivírus, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada. O aspecto de ausência de atividade RNase presente na glicoproteína ERNS de pestivírus da invenção possibilita, agora, rotular detectavelmente estes pestivírus. Pestivírus rotulados e não rotulados ou o ERNS secretado de células infectadas com pestivírus nos fluidos do corpo podem ser claramente distinguidos pela ausência ou presença de atividade RNase das glicoproteínas ERNS quando do isolamento e teste da atividade enzimática.

Para pestivírus inativados em sua atividade RNase presente na glicoproteína ERNS por deleção e/ou mutação, um número de outras técnicas pode ser usado. Estes pestivírus podem ser facilmente detectados devido às consequências estruturais resultantes destas deleções e/ou mutações. Por exemplo, a diferença de sequência da seqüência de ácidos nucléicos de glicoproteína Erns alterada é detectável por técnicas de seqüenciamento de ácidos nucléicos ou por técnicas PCR (reação de cadeia de polimerase), como demonstrado no exemplo 8; a seqüência de proteína alterada pode ser detectada por anticorpos monoclonais específicos, que não reconhecem proteínas não alteradas. Vice-versa, também é possível detectar as proteínas alteradas e deste modo proteínas rotuladas estruturalmente pela ausência de ligação a anticorpos monoclonais específicos que reconhecem glicoproteínas Erns não alteradas, com a condição de que a presença de pestivírus pode ser de outro modo estabelecida. E, naturalmente, as deleções e/ou mutações abolindo a atividade RNase nos vírus rotulados resultarão em respostas imunes diferentes em animais quando comparadas às respostas resultantes de infecções com pestivírus não rotulados.

Uma modalidade preferida para todos os aspectos referindo-se a processos para atenuar pestivírus, processos para produzir uma vacina de pestivírus especificamente atenuada e processos para rotular detectavelmente pestivírus de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada por deleções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido da referida glicoproteína.

Uma modalidade mais preferida para todos os aspectos referindo-se a processos para atenuar pestivírus, processos para produzir uma vacina de pestivírus especificamente atenuada e processos para rotular detec-tavelmente pestivírus de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referidas deleções e/ou mutações estão localizadas nos aminoácidos na posição 295 a 307 e/ou posição 338 a 357, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Uma modalidade muito preferida para todos os aspectos referindo-se a processos para atenuar pestivírus, processos para produzir uma vacina de pestivírus especificamente atenuada e processos para rotular detectavelmente pestivírus de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada por deleção e/ou mutação do aminoácido na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Uma modalidade mais preferida para todos os aspectos referindo-se a processos para atenuar pestivírus, processos para produzir uma vacina de pestivírus especificamente atenuada e processos para rotular detectavelmente pestivírus de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína. A presente invenção provê vacinas e ou outras composições farmacêuticas que são particularmente úteis para a profilaxia e tratamento de infecções por pestivírus em animais. Conseqüentemente, um outro aspecto da presente invenção refere-se a processos para a profilaxia e tratamento de infecções por pestivírus em animais, caracterizado pelo fato de que uma vacina de acordo com a invenção ou outra composição farmacêutica de acordo com a invenção é aplicada a um animal necessitando de profi-laxia ou tratamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para a preparação de pestivírus especificamente atenuados, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativa-da.

Em um aspecto, a presente invenção provê um processo para a preparação de pestivírus especificamente rotulados, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada.

Uma modalidade preferida para todos os aspectos referindo-se a um processo para a preparação de pestivírus especificamente atenuados, um processo para a preparação de pestivírus especificamente rotulados de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada por de-leções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido de referida glicoproteína.

Uma modalidade mais preferida para todos os aspectos referindo-se a um processo para a preparação de pestivírus especificamente atenuados, um processo para a preparação de pestivírus especificamente rotulados de-acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referidas deleções e/ou mutações estão localizadas nos aminoácidos na posição 295 a 307 e/ou posição 338 a 357, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Uma modalidade muito preferida para todos os aspectos referindo-se a um processo para a preparação de pestivírus especificamente atenuados, um processo para a preparação de pestivírus especificamente rotulados de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada pordele-ção e/ou mutação do aminoácido na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

Uma modalidade mais preferida para todos os aspectos referindo-se a um processo para a preparação de pestivírus especificamente atenuados, um processo para a preparação de pestivírus especificamente rotulados de acordo com a invenção são os processos referindo-se à inativação da glicoproteína ERNS, em que referida atividade RNase é inativada pela de-leção do resíduo de histidina na posição 346, como descrito na figura 1 para a cepa Alfort de CSFV de um modo exemplar ou correspondendo à mesma em outras cepas, de referida glicoproteína.

As vacinas ou outras composições farmacêuticas da presente invenção são úteis para a profilaxia e tratamento de infecções por pestivírus em animais.

Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma vacina de acordo com a invenção para a profilaxia e tratamento de infecções por pestivírus em animais. Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para a profilaxia e tratamento de infecções por pestivírus em animais.

Pestivírus e/ou ácidos nucléicos de acordo com a invenção são componentes ativos úteis de uma composição farmacêutica ou uma vacinar Conseqüentemente, a presente invenção refere-se em um outro aspecto ao uso de um pestivírus da invenção e/ou um ácido nucléico da invenção para a preparação de uma vacina ou uma composição farmacêutica.

Como acima mencionado, a inativação da atividade RNase presente na glicoproteína ERNS provê um processo novo e surpreendente para rotular pestivírus. Como uma conseqüência, um aspecto da presente invenção refere-se a processos para distinguir os pestivírus detectavelmente rotulados de acordo com a invenção de pestivírus não rotulados e possivelmente patogênicos. Estes processos são especialmente úteis para traçar a eficácia de pestivírus rotulados em animais. Um animal tratado com vacina provará ser positivo no rótulo após obter uma amostra deste animal e testar referido rótulo. Animais não rotulados e especialmente animais não rotulados que provam ser positivos para pestivírus podem ser imediatamente separados, isolados ou abatidos para remover o perigo iminente de espalhar a infecção patogênica para outros animais. A presente invenção provê um processo para rotular detecta-velmente pestivírus, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada. Este aspecto de ausência de atividade RNase presente na glicoproteína ERNS dos pestivírus da invenção possibilita, agora, rotular detectavelmente estes pestivírus. Como um resultado, pestivírus rotulados e não rotulados podem ser claramente distinguidos pela ausência ou presença de atividade RNase da glicoproteína ERNS quando do isolamento e teste da atividade enzimática. A determinação da presença ou ausência desta atividade enzimática quando obtendo uma amostra contendo um pestivírus de interesse ou material do mesmo pode ser realizada de a-cordo com processos padrões como, por exemplo, descrito no exemplo 2 ou em Hulst et al. (1994).

Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um processo para distinguir animais infectados por pestivírus de animais vacinados com uma pestivírus especificamente atenuado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas: (1) Obter uma amostra de um animal de interesse suspeito de infecção com pestivírus ou um animal vacinado; (2) Determinar a ausência ou presença de atividade RNase de uma glicoproteína ERNS com referida amostra; (3) Correlacionar a ausência de atividade RNase da glicoproteína Erns com um animal vacinado e correlacionar a presença de referida atividade com uma infecção com pestivírus de referido animal. A presente invenção provê pestivírus inativados em sua atividade RNase presente na glicoproteína ERNS por deleção e/ou mutação. Estes pestivírus são detectados facilmente devido às conseqüências estruturais resultantes de tais deleções e/ou mutações. A diferença de seqüência do gene ERNS codificando a glicoproteína ERNS alterada é detectável por técni- cas de seqüenciamento ou técnicas PCR. Como um resultado, a presente invenção provê em uma modalidade preferida um processo para distinguir animais infectados por pestivírus de animais vacinados com um pestivírus especificamente atenuado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas. (1) Obter uma amostra de um animal de interesse suspeito de infecção com pestivírus ou um animal vacinado; (2) Identificar a seqüência de nucleotídeos de genoma de pestivírus ou proteína em referida amostra; (3) Correlacionar as deleções e/ou mutações da seqüência de nucleotídeo de erns, como presente na vacina com um animal vacinado e correlacionar a ausência de referidas deleções e/ou mutações com uma infecção com pestivírus de referido animal.

Além disso, as mudanças estruturais resultantes da seqüência de proteínas alterada da glicoproteína ERNS dos pestivírus da invenção podem ser detectadas por anticorpos monoclonais ou policlonais específicos, que não reconhecem proteínas inalteradas.

Conseqüentemente, em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para distinguir animais infectados com pestivírus de animais vacinados com um pestivírus atenuado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas: (1) Obter uma amostra de um animal de interesse suspeito de infecção com pestivírus ou um animal vacinado; (2) Identificar uma glicoproteína ERNS modificada de um pestivírus atenuado pela ligação específica de anticorpos monoclonais ou policlonais na glicoproteína ERNS presente em referida amostra, referidas glico-proteínas sendo modificadas por um processo de acordo com a invenção, em que referidos anticorpos monoclonais ou policlonais não se ligam a gli-coproteínas ERNS não modificadas; (3) Correlacionar a ligação específica de referidos anticorpos monoclonais ou policlonais com um animal vacinado e correlacionar a ausência de ligação de anticorpos a uma infecção com pestivírus de referido animal com a condição de que a presença de material pestiviral em referido animal e/ou referida amostra seja de outro modo estabelecida.

Vice-versa, também é possível detectar as proteínas alteradas e, assim, estruturalmente rotuladas, pela ausência de ligação a anticorpos mo-noclonais ou policlonais específicos que reconhecem somente glicoproteínas Erns não alteradas, se a presença de pestivírus pode ser de outro modo estabelecida. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um processo para distinguir animais infectados com pestivírus de animais vacinados com um pestivírus atenuado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas: (1) Obter uma amostra de um animal de interesse suspeito de infeção com pestivírus ou um animal vacinado; (2) Identificar uma glicoproteína ERNS não modificada de um pestivírus pela ligação específica de anticorpos monoclonais ou policlonais a glicoproteínas ERNS presentes em referida amostra, referidas glicoproteínas não sendo modificadas por um processo de acordo com a invenção, em que referidos anticorpos monoclonais ou policlonais não se ligam a glicoproteínas Erns modificadas; (3) Correlacionar a ligação específica de referidos anticorpos monoclonais ou policlonais com uma infecção com pestivírus em referido animal e correlacionar a ausência de ligação de anticorpos a um animal vacinado com a condição de que a presença de material pestiviral em referido animal e/ou referida amostra seja de outro modo estabelecida.

Naturalmente, a modificação estrutural e ausência de atividade RNase nos vírus rotulados da invenção resultarão em respostas imunes diferentes em animais quando comparadas às respostas resultantes de infecções com pestivírus não rotulados. Os pestivírus da invenção elicitam uma resposta imune diferente e distinta, celular bem como humoral, que difere de respostas imunes não modificadas e possivelmente patogênicas. Por exemplo, glicoproteínas ERNS de acordo com a invenção resultarão em anticorpos policlonais que são diferentes em sua especificidade de ligação quando comparados a anticorpos policlonais resultantes de glicoproteínas não modi- ficadas. Esta diferença na especificidade de ligação provê um rótulo para distinguir animais vacinados com pestivírus da invenção de animais infectados com pestivírus do campo. Testes para triar soros para anticorpos poli-clonais específicos que tanto ligam-se a um epítopo do tipo selvagem como a uma mutação de deleção marcadora deste epítopo, para o fim de diferenciar animais infectados e vacinados, foram descritos, por exemplo, para suínos vacinados e infectados com pseudo-raiva (Kit et al., 1991).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um processo para distinguir animais infectados com pestivírus de animais vacinados com um pestivírus atenuado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas: (1) Obter uma amostra de anticorpos policlonais de um animal de interesse suspeito de infecção com pestivírus ou um animal vacinado; (2) Identificar qualquer ligação específica de referidos anticorpos policlonais a glicoproteína ERNS não modificada ou glicoproteína ERNS como modificada de acordo com a invenção. (3) Correlacionar a ligação de referidos anticorpos policlonais a glicoproteína ERNS não modificada com uma infecção com pestivírus e correlacionar a ligação de referidos anticorpos policlonais a glicoproteína ERNS modificada de acordo com a invenção com uma vacinada.

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Exemplos Exemplo 1 - Geração de mutantes de pestivírus negativos para RNase Iniciando com os clones de cDNA pA/CSFV de comprimento completo (Meyers et al., 1996a) ou pA/BVDV (Meyers et al., 1996b), dos quais cRNA infeccioso pode ser obtido por transcrição in vitro, subclones foram gerados. Para CSFV, fragmento Xhol/Sspl de pA/CSFV foi clonado em pBluescript SK+, cortado com Xhol e Smal. Para BVDV, um fragmento Xhol/Bglll de pA/BVDV foi clonado no plasmídeo pCITE-2C, cortado com as mesmas enzimas. DNA de plasmídeo de filamento único foi produzido das construções de acordo com o processo de Kunkel (Kunkel et al., 1987) u-sando células CJ 236 de E. coli (BioRad) e o fago de filamento único VCMS (Stratagene). O DNA de filamento único foi convertido em filamentos duplos usando o "Phagemid in vitro Mutagenesis Kit" (BioRad). Alguns dos oligonu-cleotídeos sintéticos que foram usados como iniciadores para gerar os mutantes de pestivírus desejados são relacionados abaixo de um modo exemplar: C-297-L: AG G AGCTT ACTT G G G AT CT G

C-346-L: GG AACAAACTT GG AT GGT GT

C-297-K: ACAGG AG CTT AAAAG G G AT CT GGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

Β-346-d: CATGAATGG AACAAAGGTTGGTGCAACTGG O DNA de plasmídeo de filamento duplo foi usado para transformação de células XL1-Blue de E. coli (Stratagene) Colônias bacterianas abrigando plasmídeos foram isoladas via seleção de ampicilina. DNA de plasmídeo foi preparado e ainda analisado por seqüenciamento de nucleotí-deo usando o kit de seqüenciamento de polimerase T7 (Pharmacia). Plasmí- deos contendo as mutações desejadas e nenhuma mudança no segundo sítio foram usados para a construção de clones de cDNA de comprimento completo. No caso de CSFV, um fragmento Xhol/Ndel do plasmídeo muta-genizado foi inserido junto com um fragmento Ndel/Bglll derivado do plasmídeo 578 (pCITE 2A, contendo o fragmento Xhol/Bglll de pA/CSFV) em pA/CSFV cortado com Xhol e Bglll. Para obter o mutante CP7 BVDV, um fragmento Xhol/Bglll contendo a deleção foi inserido em pA/BVDV cortado com Xhol e Ncoll junto com um fragmento Bglll/Ncol isolado de pA/BVDV/Ins-. Da construção pA/BVDV/INS-, um cRNA foi transcrito, que dá aumento a um BVDV não citopatogênico em transfecção em células apropriadas (Meyers et al., 1996b). Os clones de comprimento completo diferentes foram ampliados, e os plasmídeos isolados. A presença de mutações desejadas foi provada por seqüenciamento de DNA. Após linearização com Srfl (clones de comprimento completo de CSFV) ou Smal (clones de comprimento completo de BVDV), cRNA foi transcrito como descrito anteriormente (Meyers et al., 1996ab). RNA foi purificado porfiltração com gel e extração com fenol/clorofórmio e usado para transfecção de células (PK15) de rim de suíno ou células (B2 clone MDBK) de rim bovino (construções CSFV ou BVDV, respectivamente). As transfecções foram analisadas por imunofluorescência com anti-soros específicos de vírus. Nos casos onde os mutantes desejados podem ser recuperados (imunofluorescência positiva), os vírus foram amplificados por passagem nas mesmas linhagens de células usadas para as experiências de transfecção. Outra análise dos mutantes CSFV incluiu determinação de curvas de crescimento em uma etapa e caracterização do RNA viral por Northern blot com sondas de cDNA específicas de vírus bem como reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e seqüenciamento subseqüente dos fragmentos PCR para verificar a presença de mutantes desejados no genoma viral. Em todos os casos, provou-se a presença de mutações desejadas. Todos os vírus recuperados cresceram i-gualmente bem e produziram quantidades similares de RNA exatamente como o vírus resultante do plasmídeo exibindo a seqüência do tipo selvagem. A viabilidade do mutante BVDV foi mostrada por transfecção do cRNA respectivo e divisão das células 3 dias depois. Parte das células foi semeada em um prato de 3,5 cm de diâmetro, fixada com aceto-na/mmetanol no dia seguinte e analisada por imunofluorescência com uma mistura de naticorpos monoclonais específicos de BVDV (Weilland et al., 1989). Verificou-se que todas as células foram positivas, enquanto um controle de células transfectadas com RNA não infeccioso não mostrou nenhum sinal. De uma parte das células transfectadas com o cRNA respectivo, um extrato foi produzido por um ciclo de congelamento e descon-gelamento. Células novas foram infectadas com este extrato de células e provaram ser positivas para BVDV por imunofluorescência específica de BVDV 3 dias após infecção. A tabela 1 resume as diferentes mudanças introduzidas nas se-qüências conservadas de ERNS representando o sítio ativo putativo de RNa-se que são codificadas pelos mutantes de vírus indicados.

Tabela 1 Tabela 1 (continuação) Legenda da tabela 1: Teste para atividade RNase foi feito em um teste tran-siente. Células BHK21 foram infectadas com vírus vTF7-3 Vaccina (Fuerst et al., 1986) e então transfectadas com a construção de cDNA respectiva (5 pg do DNA de plasmídeo, transfecção usando Superfect como recomendado pelo fornecedor (Qiagen)). Após 10 h de incubação a 37°C em um incubador de CO2, as células transfectadas foram lisadas e processadas para determinação da atividade RNase como descrito abaixo). A viabilidade foi determinada como descrito abaixo.

Exemplo 2 - Efeito de diferentes mutações na atividade RNase de ERNS

Para testar o efeito das diferentes mutações na atividade RNase de Erns, células apropriadas foram infectadas com os vírus mutantes. Para CSFV, a invenção foi realizada com uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 0,01. Infecção com vírus do tipo selvagem serviu como um controle positivo, enquanto células não infectadas foram usadas como um controle negativo. Quarenta e oito horas após infecção, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e lisadas em 0,4 ml de tampão de lise (Tris/HCI 20 mM; NaCI 100 mM, EDTA 1 mM, 2 mg/ml de albumina de soro bovino; 1% de Triton X100; 0,1% de ácido deoxicólico; 0,1% de dodecil sulfato de sódio). O lisado foi distribuído em tubos de reação de 1,5 ml, sonica-do (sonificador Branson, B12, 120 watt, 20 s em um banho de água em forma de copo), clareado por centrifugação (5 min, 14.000 rpm, centrífuga Ep-pendorf, 4°C) e o sobrenadante submetido a ultracentrifugação (Ultracentrí-fuga de topo de mesa Beckmann, 60 min a 4°C e 45.000 rpm em um rotor TLA 45). Determinação da atividade RNase foi feita em um volume total de 200 μΙ contendo 5 ou 50 μΙ de sobrenadante da segunda etapa de centrifugação e 80 μg de Poly(rU) (Pharmacia) no tampão de teste de RNase (Tris-acetato 40 mM (pH 6,5), EDTA 0,5 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM). Após incubação da mistura de reação a 37°C durante 1 h, 200 μΙ de ácido perclórico 1,2 M, LaS04 20 mM foram adicionados. Após 15 min de incubação em gelo, a mistura foi centrifugada durante 15 min a 4°C e 14.000 rpm em uma centrífuga Eppendorf. Ao sobrenadante adicionou-se 3 volumes de água e uma alíquota da mistura foi analisada medindo-se a densidade ótica a 260 nm, usando um espectrofotômetro Ultrospec 3000 (Pharmacia). Em todos os casos, as mutações introduzidas no gene Ems aboliu completamente atividade RNase (tabela 1).

Para o mutante BVDV, atividade RNase foi testada com material obtido após transfecção de RNA sem passagem dos vírus recuperados. Células transfectadas com o RNA apropriado foram divididas 72 h após transfecção e semeadas em dois pratos. Vinte e quatro horas depois, de um prato, extratos de células foram preparados e analisados para atividade RNase como descrito acima. Para provar infecção, as células do segundo prato foram analisadas por imunofluorescência com anticorpos monoclonais específicos de BVDV (Weilland et al., 1989) e verificadas 100% positivas. Transfecção foi realizada com RNA transcrito de pA/BVDV/Ins- e de ρΑ/Β-346-d, o plasmídeo equivalente a pA/BVDV/Ins-, mas contendo a deleção do códon equivalente ao códon 346 no genoma Alfort de CSFV. Células MDBK não transfectadas serviram como um controle negativo.

Tabela 2A - Determinação da atividade RNase de diferentes vírus Descrição da tabela 2A: Células PK15 foram infectadas com os vírus indicados em um m.o.i. (multiplicidade de infecção) de 0,01, incubadas a 37°C durante 48 h em um incubador de C02, e então lisadas e submetidas a teste de RNase. O RNA solúvel em ácido da incubação com os diferentes extratos de células foi quantificado medindo-se a densidade ótica a 260 nm. As diferenças observadas na atividade RNase não foram devido a quantidades diferentes da proteína ERNS nas amostras uma vez que valores similares foram obtidos após quantificação de Erns por rotulação radioativa, imunoprecipitação e análise de radioatividade com um formador de imagem de fósforo. Além disso, redução da concentração de Ems no teste decrescida para somente um décimo da quantidade usual não muda os valores OD resultantes consideravelmente, indicando, que com as condições de escolha, o teste foi saturado com Ems.

Cepa Alfort de CSFV; todos os outros vírus foram recuperados de RNA transcrito in vitro de plasmídeos: por exemplo, C-WT de pA/CSFV; C-297-L de pA/C-297-L; etc.; C-346-d/ vírus Rs foi recuperado de pA/C-346-d/Rs (gerado por reversão de mutação em pA/C-346-d por troca do fragmento de cDNA respectivo contra o fragmento equivalente derivado de pA/CSFV); controle: extrato de células PK15 não infectadas.

Tabela 2b Descrição da tabela 2B Células MDBK foram infectadas com RNA transcrito in vitro, di- vididas 72 h após transfecção e analisadas 24 h depois para atividade RNa-se. Infecção das células foi provada por análise de imunofluorescência domo descrito no teste. B-WT: vírus recuperado de pA/BVD/Ins-; vírus Β-346-d recuperado de ρΑ/Β-346-d; controle; extrato de células MDBK não infectadas. Exemplo 3 - Patogenicidade de CSFV após inativacão de RNase Para testar se a destruição da atividade RNase influencia a patogenicidade de pestivírus em seu hospedeiro natural, experiências com a-nimais foram conduzidas com mutante V (pA/C-346-d) (C346-d nas tabelas). Vírus recuperado do clone de comprimento completo CSFV sem mutação (V (pA/CSFV)) serviu como um controle positivo (C-WT nas tabelas). Para cada mutante, três porquinhos (raça: German landrace; cerca de 25 kg de peso do corpo) foram usados. A dosagem de infecção foi 1x105 TCID50 por animal; dois terços do inoculado foram administrados intranasalmente (um terço em cada narina), um terço intramuscularmente. Os dois grupos foram alojados em unidades de isolamento separadas. Sangue foi tomado dos animais duas vezes antes da infecção e nos dias 3, 5, 7, 10, 12 e 14. Além disso, a temperatura foi registrada diariamente (figura 2). Os animais infectados com o vírus do tipo selvagem mostraram sintomas típicos da febre suína clássica como febre, ataxia, anorexia, diarréia, distúrbios dos nervos centrais, hemorragias na pela (tabela 3a). O vírus pode ser recuperado do sangue nos dias 3 (animal #68) e nos dias 5, 7, 10, 14 (animais #68, #78, #121) (tabela 3b). Os animais foram exterminados em um estágio moribundo no dia 14 após infecção. Nesta ocasião, nenhum anticorpo neutralizando o vírus pode ser detectado. Em contraste, os animais infectados com o mutante não desenvolveram sintomas clínicos (tabela 3a). A temperatura permaneceu normal (figura 2) durante todo o período experimental e os animais nunca pararam de se alimentar. Em momento algum o vírus pode ser recuperado do sangue. Contudo, os animais foram claramente infectados e o vírus mais provavelmente replicado uma vez que todos os animais desenvolverem anticorpos neutralizantes (tabela 3c).

I

Tabela 3a: Sinais clínicos após infecção de leste Descrição da tabela 3a: 6 porquinhos (raça German land; cerca de 25 kg do peso do corpo), em dois grupos (cada grupo foi alojado separadamente), foram incluídos no estudo. 3 animais foram infectados com CSFV-WT (1-105 TClD5o) e 3 animais com C-346-d (1-105 TCID50). Temperatura retal e sinais clínicos foram registrados e sumarizados como detalhado na tabela; n.a.: nenhuma necrópsia foi realizada.

Tabela 3b: Viremia de células do sangue após infecção de teste Descrição da tabela 3b: Viremia de células do sangue foi detectada por co-cultivo do sangue com células PK15. Após incubação a 37°C durante 72 h, as células foram lavadas com PBS, fixadas com metanol/acetona resfriado com gelo e analisadas para infecção por imunofluorescência com um anticorpo mono-clonal específico para glicoproteína 2E (mAb A18, Weiland et al., 1990). Tabela 3c: Desenvolvimento do título de neutralização de soro específico de CSFV

Descrição da tabela 3c: Títulos de anticorpos de suínos infectados com vírus mutante C-346-d determinaram em pontos de tempo diferentes durante a experiência com animais: 50 μΙ do soro diluído foram misturados com 50 μΙ do meio contendo 30 TCID50 de vírus (Alfort de CSFV/ Tübingen). Após 90 min de incubação a 37°C, 100 μΙ de células (1,5x104 células) foram adicionados e a mistura semeada em placas de 96 reservatórios. Após 72 h, as células foram misturadas com metanol/acetona resfriado com gelo e analisadas para infecção por imunofluorescência com um anticorpo monoclonal específico para glicoproteína E2 (mAb, A18, Weiland et al., 1990). No dia 69 após infecção, os animais foram desafiados com 2x105 TCID50 da cepa Eystrup de CSFV. A tabela dá a diluição de soro mais alta resultando na neutralização completa do vírus de entrada.

Exemplo 4 - Indução de imunidade protetora por infecção com vírus negativo em RNase Para analisar se a infecção com o vírus mutante levou a uma imunidade protetora, uma experiência de desafio foi conduzida cerca de 9 semanas após a infecção com mutante CSFV usando uma cepa de CSFV heteróloga altamente patogênica (cepa Eystrup, originada de Behring). 2x105 TCID50 de vírus foram usados para a infecção. Esta quantidade de vírus foi verificada ser suficiente para induzir doença letal em várias experiências precedentes (Kõnig, 1994). No entanto, os animais previamente infectados com o mutante RNase de CSFV não mostraram sintomas de doença após infecção de desafio. Nem febre (figura 3) nem viremia pode ser detectada, mas um aumento nos anticorpos neutralizantes indicou infecção produtiva e replicação do vírus de desafio.

Exemplo 5 - Confirmação do princípio de atenuação Para mostrar que a atenuação observada do vírus mutante é certamente devido à deleção de histidina na posição 346 da poliproteína e não uma conseqüência de um segundo sítio de mutação não identificado, a seqüência do tipo selvagem foi restaurada por troca de um fragmento Xhol/Ndel de 1,6 kb do clone pA/C-346-d de comprimento completo contra o fragmento correspondente de pA/CSFV exibindo a seqüência do tipo selvagem. O fragmento excisado de pA/C-346-d foi analisado por seqüenciamen-to de nucleotídeos durante mutações. Exceto para a deleção do tripleto codi- ficando histidina 346 da poliproteína, nenhuma diferença com respeito à se-qüência do tipo selvagem foi encontrada. Da construção de cDNA com o mutante resgatado, vírus V (pA/C-346-d/Rs) pode ser recuperado o qual cresce igualmente bem como o vírus do tipo selvagem e mostrou atividade RNase equivalente (tabela 2A).

Em uma segunda experiência, o vírus resgatado foi usado para infecção de suínos. Como um controle, o mutante de deleção foi usado. Novamente, dois grupos consistindo de três animais foram usados. Como os animais eram mais jovens (German landrace, cerca de 20 kg) do que os da primeira experiência, 5x104 TCID50 de vírus foram usados para infecção nesta ocasião. Novamente, os animais infectados com o mutante não mostraram nenhum sinal clínico (tabela 5, figura 4). Somente um animal teve febre durante um dia. Contudo, estes animais desenvolveram anticorpos neutrali-zantes e foram protegidos contra um desafio com CSFV letal. Desafio foi novamente realizado por infecção com 2x105 TCID50 da cepa Eystrup de desafio. Os animais não mostraram sinais clínicos após desafio e a temperatura permaneceu normal (figura 5). Em contraste com os suínos infectados com o mutante de deleção, os animais inoculados com o vírus do tipo selvagem desenvolveram febre suína clássica fatal. Um animal deve que ser exterminado 11 dias após infecção, o outro dois 3 dias depois. Todos os animais mostraram sintomas típicos de febre suína clássica, isto é, febre, diarréia, anorexia, e sinais patológicos como hemorragias em diferentes órgãos incluindo o rim.

Tabela 5a: Sinais clínicos após infecção de teste Tabela 5a: 6 porquinhos (raça German land; cerca de 20 kg de peso do corpo), em dois grupos (cada grupo foi alojado separadamente em condições de isolamento), foram incluídos no estudo. 3 animais foram infectados com mutante C-346-d (5.104 TCID50) e 3 animais com C-346-d/RS (5.104 TCID50). C-346-d/RS derivou do mutante C-346-d restaurando a seqüência do tipo selvagem do gene ERNS. Temperatura retal e sinais clínicos foram registrados e sumarizados; n.a.: nenhuma necrópsia foi realizada.

Tabela 5b: Teste diagnóstico de RNase com vírus recuperados de animais infectados durante viremia Vírus recuperados do sangue dos animais 3 e 5 no dia 5 após infecção e dos animais 27, 28 e 30 da experiência #2 com animais (descrita no exemplo 5) no dia 7 após infecção foram propagados em cultura de tecidos, titulados e testados para atividade RNase como descrito acima. Células PK15 não infectadas e células (controle) infectadas com CSFV do tipo selvagem (Alfort) serviram como controles. Animais 3 e 5 foram infectados com mutante C-297-K, enquanto os animais 27, 28 e 30 foram infectados com mutante C-346-d/RS, como indicado na tabela.

Exemplo 6: Efeitos de mutação dupla em ERNS

Para testar os efeitos de uma mutação dupla em ERNS sobre a capacidade do vírus respectivo replicar em seu hospedeiro natural e sobre a patogenicidade, uma experiência com animais foi conduzida com mutante V (pA/C-297-L/ 346-L). Vírus recuperado de clone de comprimento completo de CSFV sem mutação (V(pA/CSFV) serviu como um controle positivo. Para cada mutante, três porquinhos (raça: German land; cerca de 25 kg de peso do corpo) foram usados. A dosagem de infecção foi 1x105 TCID50 por animal; dois terços do inoculado foram administrados intranasalmente (um terço em cada narina), um terço muscularmente. Sangue foi tomado dos animais antes da infecção (dia 0) e nos dias 5, 8, 12 e 20. Além disso, temperatura foi registrada diariamente (figura 6). Os animais infectados com o mutante duplo não desenvolveram quaisquer sintomas clínicos, e os animais nunca pararam de se alimentar. Os animais mostraram nenhuma febre durante todo o período experimental (animais 45/2 e 45/3), exceto animal 45/1 no dia 8, provavelmente devido a infecção bacteriana causada por dano à perna traseira direita. Após tratamento deste animal com um antibiótico no dia 10, a temperatura retornou aos valores normais em um dia (figura 6). Para todos os animais, vírus foi recuperado do sangue no dia 5, enquanto nenhuma vi-remia foi detectada nos últimos pontos de tempo (tabela 6a). Todos os animais desenvolveram anticorpos neutralizantes (tabela 6b). Para os animal 45/1, o título de neutralização foi determinado novamente cerca de 4,5 meses p.i. e verificou-se ser 1: 4374. Assim, a infecção com o mutante duplo resultou em memória imunológica duradoura, favor copiar página 29, com legendas Tabela 6a: Teste para viremia Tabela 6b: Títulos de neutralização Exemplo 7 - Imunoqenicidade e princípio de atenuação do vírus "Β-346-d" BVDV

Esta experiência foi designada para investigar o princípio de a-tenuação bem como a imunogenicidade do vírus BVDV "Β-346-d" recuperado de ρΑ/Β-346-d, comparando o mesmo com o vírus "B-WT" de pA/BVDV/Ins-. O vírus "Β-346-d" é, naturalmente, mudado na posição 349 de BVDV original, mas denominado "B-346" para indicar a posição relativa à posição 346 de Alfort de CSFV da figura 1.

Três grupos de animais soronegativos BVDV de 3-6 meses de idade foram selecionados. Os grupos 1 e 2 compreendiam 5 animais cada, enquanto o grupo 3 compreendia 3 animais. Os animais do grupo 1 e 2 foram infectados por administração de 2x106 TCID5o de Β-346-d (grupo 1) ou B-WT (grupo 2) em um volume de 5 ml por via. Os animais foram infectados intramuscularmente (músculo do glúteo), intranasalmente e subcutaneamen-te (sobre escápula). Durante um período de 14 dias após infecção, viremia em ambos os grupos foi monitorada através de parâmetros como viremia de células do sangue e depósito de vírus em esfregaços nasais. Além disso, parâmetros clínicos como temperaturas retais, contagens de células de sangue brancas e parâmetros de saúde gerais foram monitorados. A imunidade protetora contra uma infecção com um isolado de BVDV (#13) virulento e antigeneticamente heterólogo foi investigada por in-feção de desafio 77 dias após infecção dos animais do grupo 1 com Β-346-d. Animais do grupo 3 serviram como controle de desafio e foram infectados de acordo com o procedimento para os animais do grupo 1 com o isolado de BVDV virulento. O vírus BVDV (#13) pertence a um grupo antigenético diferente (tipo II), enquanto o vírus Β-346-d pertence ao grupo antigenético (tipo I), de acordo com a classificação descrita por (Pellerin, C. et al., 1994). Animais do grupo 1 e 3 foram infectados por administração de 2x106 TCID50 do isolado de BVDV (#13) em um volume de 5 ml por via. Os animais foram infectados pela via intramuscular (músculo do glúteo), intranasal e subcutâ-nea (sobre escápula). Durante um período de 14 dias após infecção, viremia em ambos os grupos foi monitorada por parâmetros como viremia de células do sangue e depósito de vírus em esfregaços nasais. Além disso, parâmetros clínicos como temperaturas retais, contagens de células de sangue branco e parâmetros de saúde gerais foram monitorados.

Após infecção com Β-346-d, os animais não mostram quaisquer sintomas clínicos típicos de uma infecção com BVDV como aumento da temperatura retal (tabela 7a), ou quaisquer sintomas clínicos respiratórios (não mostrados). A viremia de células do sangue (tabela 7b) e depósito de vírus em esfregaços nasais (tabela 7c) não indicam claramente uma atenuação de Β-346-d comparado a B-WT. O isolado #13 de BVDV virulento não induz nos animais do grupo 3 uma viremia forte com sinais típicos de uma infecção com BVDV, como aumento da temperatura retal durante um período de vários dias (tabela 7d), leucopenia forte (tabela 7e), viremia de células do sangue estendida (tabela 7f) e depósito de vírus em fluido de esfregaços nasais (tabela 7g). Em contraste, os animais do grupo 1, que foram vacinados por infecção com B-346- d, mostram quase nenhum sintoma clínico típico para uma infecção com BVDV após a infecção de desafio com o isolado #13 de BVDV virulento. Não houve aumento significativo nas temperaturas retais após infecção (tabela 7d). A leucopenia observada foi muito marginal com respeito à magnitude e duração (tabela 7e). Nenhum BVDV pode ser isolado do sangue (tabela 7f) e, somente para um animal, depósito de vírus no exsudato de esfregaços nasais pode ser detectado (tabela 7g).

Conseqüentemente, infecção com Β-346-d induz uma imunidade forte que reduz claramente sinais clínicos, depósito de vírus e viremia de células do sangue após infecção de desafio com um isolado de BVDV hete-rólogo.

Tabela 7a: Temperaturas relais médias no grupo 1 (Β-346-d) e 2 (B-WT) Animais do grupo 1 foram infectados no dia 0 com 6x106 TCID50 Β-346-d, enquanto animais do grupo 2 foram infectados com 6x106 TCID50 B-WT.

Figura 7b: Viremia de células do sangue dos grupos 1 e 2 Amostras de EDTA de sangue foram retiradas até o dia 10 após infecção com Β-346-d e B-WT, respectivamente. 0,2 ml de sangue foi adicionado a cada uma das 3 culturas de células de testículos de bezerro (Cte) com meio contendo heparina (1 unidade/ml para evitar coagulação). Após incubação durante a noite, inóculo/meio foi substituído com meio novo sem heparina. Após incubação durante 4 a 6 dias, células infectadas com BVDV foram detectadas por imunofluorescência com um soro policlonal específico para BVDV.

Culturas negativas foram congeladas e subseqüentemente descongeladas. 0,2 ml das mesmas foi passado em uma segunda passagem em células Cte para confirmar a ausência de BVDV. favor copiar página 32, com legendas Tabela 7c: Depósito de vírus no fluido nasal: Exsudato nasal foi centrifugado (1000 g) para remover resíduos grosseiros e contaminantes. Fluido do sobrenadante foi removido e 0,2 ml foi semeado em cada uma das três culturas de células. Após incubação durante a noite, o inóculo/meio foi substituído com 2 ml de meio novo. Após incubação durante 4-6 dias, células infectadas com BVDV foram detectadas por imunofluorescência com um soro policlonal específico para BVDV. favor copiar página 33, com legendas Tabela 7d: Temperaturas retais médias dos grupos í e 3 Temperaturas retais foram registradas até 16 dias após infecção de desafio. Animais do grupo 1 e 3 foram infectados por 6x106 TCID5o do isolado #13 de BVDV virulento.

Tabela 7e: Contagens médias de células do sangue brancas Amostras de células do EDTA de sangue foram tomadas diariamente dos dias 2 a 14 após desafio de cada animal em ambos os grupos. Contagens de células do sangue brancas em amostras de EDTA de sangue foram determinadas usando um contador F800 Sysmex Micro-Cell. favor copiar página 33, com legendas Tabela 7f: Isolado de BVDV de amostras de sangue Amostras de EDTA de sangue foram tomadas diariamente até o dia 10 após desafio. 0,2 ml de sangue foi adicionado a cada uma das 3 culturas de células de testículos de bezerros (Cte) com meio contendo heparina (1 unidade/ml para evitar coagulação). Após incubação durante a noite, inó-culo/médio foi substituído com meio novo sem heparina. Após incubação das células durante 4 a 6 dias, células infectadas com BVDV foram detectadas por imunofluorescência com um soro policlonal específico de BVDV.

Culturas negativas foram congeladas e subseqüentemente descongeladas. 0,2 ml das mesmas foi passado em uma segunda passagem nas células Cte para confirmar a ausência de BVDV. favor copiar página 34, com legendas Tabela 7q: Depósito de vírus no fluido nasal Exsudato nasal foi centrifugado (1000 g) para remover resíduos grosseiros e contaminantes. Fluido do sobrenadante foi removido e 0,2 ml do mesmo foi semeado em cada uma das três culturas de células. Após incubação durante a noite, o inóculo/meio foi substituído com 2 ml de meio novo. Após incubação durante 4-6 dias, as células infectadas com BVDV foram detectadas por imunofluorescência com um soro policlonal específico para BVDV.

Exemplo 8 - Discriminação entre C-346-d e CSFV sem deleção do códon de histidina 346 por RT-PCR A seqüência de RNA codificando o motivo RNase conservado na glicoproteína ERNS de CSFV é altamente conservada. Dentre as seqüências de CSFV conhecidas, nenhuma troca de nucleotídeos foi verificada na região correspondente aos resíduos 1387 a 1416 da seqüência publicada da cepa Alfort de CSFV (Meyers et al., 1987). Assim, iniciadores de oligonucleo-tídeos derivados desta região conservada do genoma podem ser usados em um teste RT-PCR para detecção de todos os isolados de CSFV (ver figura 7). Consequentemente, a ausência do tripleto codificando histidina 346 (nucleotídeos 1399- 1401) pode ser detectada por um teste RT-PCR com um iniciador apropriadamente designado. Oligonucleotídeos diferentes cobrindo a região conservada foram sintetizados que tanto continham o códon de histidina como não. Estes oligonucleotídeos serviram como iniciadores a mon- tante nas reações RT-PCR com oligonucleotídeos ERNS-Stop como iniciador a montante. RNA purificado de células de cultura de tecidos infectadas com C-346-d, C-WT, C-346-L ou C-346-K, respectivamente, foi usado como gabarito. Transcrição reversa de 2 pg de RNA desnaturado com calor (2 min a 92°C, 5 min em gelo em 11,5 μΙ de água na presença de iniciador reverso 30 pMoles) foi feita após adição de 8 μΙ da mistura RT (Tris/HCI 125 mM, pH 8,3, KCI 182,5 mM, MgCI2 7,5 mM, ditiotreitol 25 mM, 1,25 mM de cada um de dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U de RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Alemanha) e 50 U de Superscript (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Alemanha) durante 45 min a 37°C. Após o término da transcrição reversa, os tubos foram colocados em gelo e 30 μΙ da mistura PCR (Tris/HCI 8,3 mM, pH 8,3; KCI 33,3 mM; MgCI2 2,2 mM; 0,42 mM de cada um de dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 0,17% de TritonX100; 0,03% de albumina de soro bovino; 5 U de polimerase Taq (Appligene, Heidelberg, Alemanha) e 16,7% de DMSO) foram adicionados. Quando o iniciador OI H+3 foi usado, a mistura de reação para amplificação não continha nenhum DMSO. Amplificação foi realizada em 36 ciclos (30 s, 94°C; 30 s, 57°C; 45 s, 74°C). 1 μΙ da reação de amplificação foi carregado em um gel agarose a 1%, os produtos amplificados foram separados por eletroforese e coloridos com brometo de etídio. Como demonstrado na figura 7, par de iniciadores ΟΙ H-3/OI EmsStop permitiu amplificar especificamente uma banda derivada de RNA contendo a deleção do códon 346, enquanto com as outras duas combinações de iniciadores contendo códon 346 foram amplificados e nenhuma banda foi observada quando o RNA com a deleção deste códon foi usado como um gabarito. Iniciadores para RT-PCR: a montante: OI H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT

OI H+2 TGGAACAAACATGGATGG

OI H+3:GAATGGAACAAACATGGA a jusante: OI EmsStop: GG AATT CT CAG G C AT AG G CACC AAACC AGG

Legendas das figuras Figura 1: Os primeiros 495 aminoácidos como expressado pela cepa Alfort de CSFV A listagem das seqüências mostra os primeiros 495 aminoácidos como expressado pela cepa Alfort de CSFV (Meyers et al., 1989). Um mo-nômero da glicoproteína ERNS da referida cepa corresponde aos aminoácidos 268 a 494 como descrito por Rümenapf et al. (1993). Resíduos 295 a 307 e 338 a 357 representando as regiões mostrando homologia em RNases de planta e de fungo (Schneider et al., 1993) são salientados.

Figura 2: Curva de temperatura retal dos animais após infecção de teste Temperatura retal diária foi registrada do dia 2 antes até o dia 18 após infecção. Curva de temperatura retal é detalhada para cada animal do grupo infectado com o vírus V (pA/CSFV) (linha contínua) derivado do plas-mídeo pA/CSFV ou com o vírus V (pA/C-346-d) derivado do plasmídeo pA/C-346-d (linha pontilhada).

Figura 3: Curva de temperatura retal dos animais após infecção de desafio Temperatura retal diária foi registrada nos dias 1-21 após infecção de desafio com vírus. Os animais desafiados com uma dosagem letal da cepa Eystrup de CSFV de desafio foram infectados com mutante C-346-d [V(pA/C-346-d)] 69 dias antes como detalhado no texto. Curva de temperatura retal é detalhada para cada animal do grupo desafiado com 2x105 TCID50 da cepa Eystrup de CSFV de desafio.

Figura 4: Curva de temperatura retal dos animais após infecção de teste Temperatura retal diária foi registrada nos dias 0-18 após infecção. Curva de temperatura retal é detalhada para cada animal dos dois grupos infectados tanto com C-346-d [V (pA/C-346-d)] (linha pontilhada) como com o vírus C-346-d/RS recuperado [V (pA/C-346-d/Rs)] (linha contínua). Figura 5: Temperatura retal após experiência #2 de animais com infecção de desafio Temperatura retal diária foi registrada nos dias 1-10 pós-infecção de desafio com vírus. Animais desafiados com uma dosagem letal (2x105 TCID50) da cepa Eystrup de CSFV de desafio foram infectados com mutante C-346-d 37 dias antes.

Figura 6: Temperatura retal dos animais tratados com um mutante duplo de acordo com o exemplo 6 Temperatura retal diária foi registrada antes e após infecção de desafio com vírus com mutante V (pA/C-297-L/346-L).

Figura 7: Discriminação entre C-346-d e CSFV sem deleção do códon 346 de histidina por RT-PCR de acordo com o exemplo 8 a) Par de iniciadores ΟΙ H-3/OI EmsStop permite amplificar especificamente uma banda derivada de RNA contendo a deleção do códon 346 (C-346-d) como descrito em detalhe no exemplo 8. Em contraste, RNA não contendo a referida deleção não interage com referido par de iniciadores (C-WT, C-346-L, C-346-K). b) e c) As outras duas combinações de iniciadores (OI H+2 e OI H+3) amplificam bandas derivadas de RNA que não contêm a deleção do códon 346 (OI H+2 e OI H+3). Nenhuma banda pode ser observada quando RNA do mutante de deleção 346, C-346-d, é usado como um gabarito.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Pestivírus CSFV atenuado, caracterizado pelo fato de que a atividade RNase presente na glicoproteína ERNS é inativada por deleções e/ou mutações de pelo menos um aminoácido da referida glicoproteína, sendo que a referida atividade RNase é inativada por deleções e/ou mutações selecionadas do grupo consistindo em: i) 295-S ou 295-G; i) 300-W ou 300-G; iii) 346-D; iv) 297-L e 346-L; e v) deleção de H-346 de acordo com a SEQ ID NO:25.

2. Pestivírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida atividade RNase é inativada pela deleção do resíduo de histidina na posição 346, de acordo com a SEQ ID NO:25.

3. Pestivírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida atividade RNase é inativada pela mutação do resíduo de histidina nas posições 297 e 346 para leucina, de acordo com a SEQ ID NO:25.