BE1020480A5

BE1020480A5 - Werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren, en gebruik ervan.

Info

Publication number: BE1020480A5
Application number: BE2012/0656A
Authority: BE
Inventors: Jan Hilda Marie Jozef Spaas
Original assignee: Global Stem Cell Technology
Priority date: 2012-10-01
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2013-11-05
Also published as: WO2014053420A1; WO2014053418A9; WO2014053418A2; WO2014053418A3

Description

WERKWIJZE VOOR DE ISOLATIE VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN UIT BLOED VAN ZOOGDIEREN, EN GEBRUIK ERVAN

TECHNISCH DOMEIN

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit het bloed van zoogdieren en de expansie ervan. De geïsoleerde stamcellen kunnen onder andere ingezet worden in regeneratieve therapieën voor gewricht-, kraakbeen- en peesletsels, alsook ter ondersteuning en verbetering van het immuunsysteem.

STAND DER TECHNIEK

Stamceltherapie is een veelbelovende toepassing in het vrij nieuwe veld van regeneratieve geneeskunde en chirurgie, onder andere voor veterinaire toepassingen. Stamcellen bezitten de eigenschap om te differentiëren naar verschillende celtypes, kunnen massaal vermenigvuldigen, migreren spontaan naar beschadigde weefsels, produceren belangrijke factoren voor weefselherstel en bezitten immuno-modulerende eigenschappen. Verschillende bronnen van mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn beschreven bij mensen, paarden en andere zoogdieren; voornamelijk werden reeds mesenchymale stamcellen uit beenmerg, vetweefsel, navelstreng matrix en navelstrengbloed beschreven (Guest et al., 2008; Hoynowski et al, 2007; Koch et al, 2009; Radcliffe et al, 2010). Een nadeel echter is dat de staalname om mesenchymale stamcellen uit onder andere beenmerg of vet te isoleren zeer invasief is en er een lage vergelijkbaarheidsgraad tussen de verschillende klinische studies bestaat (onder andere gezien in studies in paarden). Aldus is er nood aan een andere, betere bron van mesenchymale stamcellen. Bloed blijkt een optimale bron van deze MSCs. Bloed is niet alleen een niet-invasieve en pijnloze bron, maar ook veilig en eenvoudig te verzamelen en bijgevolg makkelijk toegankelijk. Bovendien blijken MSCs geïsoleerd uit bloed een veelbelovend therapeutisch hulpmiddel voor bepaalde degeneratieve of traumatische ziekten in verschillende diersoorten, vanwege hun enorme plasticiteit en differentiatie-capaciteit (Giovannini et al, 2008; Koerner et al, 2006; Martinello et al, 2010; Zvaifler et al, 2000). Een nadeel van het gebruik van autologe MSCs (van het individu zelf) is echter dat een isolatie veel tijd in beslag neemt (waardoor de therapie soms te laat komt), niet altijd succesvol is en de kwaliteit van MSCs varieert tussen de verschillende dieren. Een oplossing hiervoor is het gebruik van allogène MSCs van geselecteerde donoren. Het veilig gebruik van allogène MSCs is voorts reeds gerapporteerd voor mensen (Fang et al, 2007; Ringden et al., 2006) en paarden (Carrade et al, 2011a; Carrade et al, 2011b). WO 2008 034 740 beschrijft een werkwijze voor isolatie en expansie van MSCs uit perifeer bloed van zoogdieren, middels toevoeging van MCSF (macrophage colony stimulating factor) waarbij de cellen geëxpandeerd en vervolgens gesorteerd worden. Echter, deze werkwijze leidt niet tot een volledig homogene populatie van MSCs, maar tot een mengsel van hematopoëtische, mesenchymale en pluripotente stamcellen.

Er is aldus nood aan een werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed waarbij een homogene populatie aan MSCs wordt bekomen, en aan composities bestaande uit deze homogene populatie MSCs, voor onder ander gebruik in regeneratieve toepassingen. Voorts dient de werkwijze op snelle en eenvoudige manier tot een MSC compositie van hoogwaardige, zuivere kwaliteit te komen. Het is algemeen bekend dat behandelingen met stamcellen het hoogste slagingspercentage hebben wanneer deze onmiddellijk toegediend worden na de ontstekingsfase van de eerste schade (voor infiltratie met fibroblasten en littekenweefselvorming) vanwege de ideale omgeving voor celgroei op dat moment (Richardson et al, 2007).

Met een dergelijke, zuivere compositie van MSCs zijn de theoretische toepassingsmogelijkheden vrijwel onbeperkt en zeer toegankelijk (zeker bij gebruik van allogène bloed MSCs).

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De uitvinding betreft hiervoor een werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren volgens conclusie 1.

In een tweede aspect betreft de uitvinding een compositie omvattende mesenchymale stamcellen volgens conclusie 10.

In een finaal aspect betreft de uitvinding een werkwijze voor het toedienen van een dergelijke compositie volgens conclusie 23.

BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Figuur 1 toont een voorbeeld van mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit het paard volgens onderhavige uitvinding, waarbij de stamcellen positief zijn voor vimentine, fibronectine en Ki67.

Figuur 2 toont een voorbeeld van mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit humaan bloed, waarbij de stamcellen positief zijn voor vimentine, fibronectine en Ki67.

Figuur 3 is een schematische weergave van de drie-fasige verdeling van bloed na centrifugatie. Laag A is de plasmalaag, laag B de buffy coat, laag C bevat ondermeer de erythrocyten.

Figuur 4 tonen voorbeelden van composities volgens onderhavige uitvinding, bewaard in specifieke monsterflesjes, bij voorkeur bewaard in een reservoir, geschikt voor langdurige opslag bij minimaal -80° en voor onmiddellijke toediening na ontdooiing.

Figuur 5 toont het effect van opmenging van dragers (bijvoorbeeld op basis van hyaluronzuur of glycosaminoglycanen) op de vitaliteit van de mesenchymale stamcellen.

Figuur 6 toont een grafische weergave van het belang van de binnendiameter van een naald gebruikt voor opname van de compositie volgens onderhavige uitvinding uit een container.

Figuur 7 toont de effecten van verscheidene DMSO concentraties, gebruikt bij invriezen van de composities volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige uitvinding, op de vitaliteit van de cellen bij twee verschillende ontdooiingsmethodes.

Figuur 8 geeft een weergave van mesenchymale stamcellen geïsoleerd volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige werkwijze.

Figuur 9 geeft een weergave van mesenchymale stamcellen geïsoleerd volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige werkwijze, geïnduceerd voor de vorming van tenocyten.

Figuur 10 A toont ongedifferentieerde mesenchymale stamcellen volgens onderhavige uitvinding (linkerfoto) die gedifferentieerd worden tot tenocyten (rechterfoto) met duidelijke vezel-oriëntatie. Differentiatie werd bevestigd middels expressie van collageen type I (Figuur 10 B) en Smooth Muslce Actin (Figuur 10 C).

Figuur 11 toont mesenchymale stamcellen geïsoleerd volgens onderhavige werkwijze, waarbij de cellen geselecteerd werden op diameter.

Figuur 12 A is een echografie van een patiënt met tendinitis, figuur B geeft de evolutie weer na 6 maand intensieve, conservatieve therapie.

Figuur 13 A is een echografie van een patiënt met tendinitis, figuur B geeft de evolutie weer, 29 dagen na behandeling met een compositie volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige uitvinding.

Figuur 14 A is een echografie van een patiënt met chronische desmitis, figuur B geeft de evolutie weer, 35 dagen na behandeling met een compositie volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige uitvinding.

Figuur 15 toont statistische resultaten van patiënten (lijdend aan tendinitis of desmitis) behandeld met composities volgens uitvoeringsvormen van onderhavige uitvinding. Score 0 geeft 0% verbetering weer 6 weken na behandeling en score 5 100% verbetering (1=20%, 2=40%, 3=60% en 4=80%).

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

De uitvinding betreft een werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren, alsook een compositie van mesenchymale stamcellen bekomen volgens onderhavige uitvinding, en een werkwijze voor het toedienen ervan aan een subject.

De werkwijze voorziet een relatief eenvoudige en snelle procedure om tot een zeer zuivere populatie van MSCs uit (bij voorkeur perifeer) bloed te komen. In bloed is voor elke 1 x 105 leukocyten slechts 1 MSC aanwezig. Isolatie en aanrijking is bijgevolg noodzakelijk om tot een homogene populatie te komen. De bekomen populatie van MSCs kan in een volgende stap geïnduceerd en vervolgens gedifferentieerd worden tot verscheidene specifieke celsoorten, of gebruikt worden als dusdanig. De toepassingsmogelijkheden van de MSCs zijn als dusdanig vrijwel onbeperkt. In de onderhavige uitvinding worden deze voornamelijk ingezet in het behandelen van letsels, alsook bij behandeling van frequent voorkomende ziektebeelden of neurologische aandoeningen.

Tenzij anders gedefinieerd hebben alle termen die gebruikt worden in de beschrijving van de uitvinding, ook technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals ze algemeen begrepen worden door de vakman in het technisch veld van de uitvinding. Voor een betere beoordeling van de beschrijving van de uitvinding, worden de volgende termen expliciet uitgelegd. "Een", "de" en "het" refereren in dit document naar zowel het enkelvoud als het meervoud tenzij de context duidelijk anders veronderstelt. Bijvoorbeeld, "een segment" betekent een of meer dan een segment.

Wanneer "ongeveer" of "rond" in dit document gebruikt wordt bij een meetbare grootheid, een parameter, een tijdsduur of moment, en dergelijke, dan worden variaties bedoeld van +/-20% of minder, bij voorkeur +/-10% of minder, meer bij voorkeur +/-5% of minder, nog meer bij voorkeur +/-1% of minder, en zelfs nog meer bij voorkeur +/-0.1% of minder dan en van de geciteerde waarde, voor zoverre zulke variaties van toepassing zijn in de beschreven uitvinding. Hier moet echter wel onder verstaan worden dat de waarde van de grootheid waarbij de term "ongeveer" of "rond" gebruikt wordt, zelf specifiek wordt bekendgemaakt.

De termen "omvatten", "omvattende", "bestaan uit", "bestaande uit", "voorzien van", "bevatten", "bevattende", "behelzen", "behelzende", "inhouden", "inhoudende" zijn synoniemen en zijn inclusieve of open termen die de aanwezigheid van wat volgt aanduiden, en die de aanwezigheid niet uitsluiten of beletten van andere componenten, kenmerken, elementen, leden, stappen, gekend uit of beschreven in de stand der techniek.

Het citeren van numerieke intervallen door de eindpunten omvat alle gehele getallen, breuken en/of reële getallen tussen de eindpunten, deze eindpunten inbegrepen.

In een eerste aspect betreft de uitvinding een werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren. In het bijzonder omvat de werkwijze minstens volgende stappen: a) het collecteren van één of meerdere bloedmonsters van donordieren in een monsterflesje, gecoat met een anti-coagulant; b) het centrifugeren van de bloedmonsters tot het bekomen van een 3-fasige verdeling bestaande uit een plasma-fase, buffy coat en erythrocyten-fase; c) het collecteren van de buffy coat en het laden ervan op een densiteitsgradiënt; d) het collecteren van de bloed-interfase verkregen uit de densiteitsgradiënt van stap c) e) het isoleren van mesenchymale stamcellen uit de bloed-interfase middels centrifugatie; f) het uitzaaien van minimaal 2.5 x 105/cm2 mesenchymale stamcellen en het in cultuur houden ervan in een laag glucose groeimedium gesupplementeerd met dexamethasone, antibiotica en serum.

Bij voorkeur zullen er in stap f) minimaal 2.5 x 105/cm2 cellen worden uitgezaaid, meer bij voorkeur worden er tussen de 2.5 x 105/cm2 en 5 x 105/cm2 uitgezaaid. Dit aantal is cruciaal om uiteindelijk tot een zuivere en levensvatbare populatie MSCs te verkrijgen aan een aanvaardbare concentratie. De densiteit waarmee de cellen in stap f) van de onderhavige werkwijze worden uitgezaaid is essentieel, daar een te dense populatie aanleiding zal geven tot massale celsterfte tijdens de expansie en een niet homogene populatie van mesenchymale stamcellen. Een te lage cel-concentratie zal echter leiden tot weinig of geen kolonie-vorming van mesenchymale stamcellen, waardoor expansie niet of nauwelijks mogelijk is, of te veel tijd in beslag zal nemen, wat de viabiliteit van de cellen negatief beïnvloedt.

Met de term anti-coagulant wordt een samenstelling bedoeld die coagulatie van het bloed kan tegengaan. Voorbeelden van gebruikte anticoagulantia in onderhavige uitvinding zijn ondermeer EDTA of heparine.

Met de term 'buffy coat' wordt in onderhavige uitvinding de fractie van niet-gecoaguleerd bloed bedoeld, bij voorkeur bekomen middels centrifugatie of een densiteitsgradiënt, waarbij de fractie aangerijkt is aan witte bloedcellen en bloedplaatjes. Figuur 3 toont een schematische weergave van een 3-fasige verdeling van een bloedstaal bekomen middels centrifugatie. De buffy coat is de middelse fase B, gelegen tussen de plasma-fase A en de erythrocyten-fase C.

In het bijzonder zal de buffy coat geïsoleerd worden van de andere bekomen fracties. Meer in het bijzonder wordt deze verdund middels een geschikte fysiologische buffer, zoals bijvoorbeeld een fosfaat-, Tris of bicarbonaat buffer, bij voorkeur met een minimale factor van 1:2. Deze verdunningsfactor is belangrijk, daar lagere verdunningsfactoren aanleiding kunnen geven tot problemen bij het laden ervan op de densiteitsgradiënt uit stap c, wegens een te zware buffy coat fractie.

Bij voorkeur komt de densiteitsgradiënt uit stap c en d van onderhavige werkwijze tot stand middels gebruik van Percoll®. Meer in het bijzonder zal de Percoll® een dichtheid tussen de 1.08 g/ml en 1.077 g/ml bevatten.

Met de term bloed-interfase wordt in onderhavige uitvinding deze fractie van het bloed bedoeld, bij voorkeur bekomen middels een densiteitsgradiënt, gelegen tussen de onderste fractie, hoofdzakelijk bestaande uit erythrocyten en polymorfe nucleaire cellen, en de bovenliggende fractie, hoofdzakelijk bestaande uit plasma polymorfe nucleaire cellen. De bloed-interfase is de bron van bloed mononucléaire cellen (BMCs) omvattende monocyten, lymfocyten en mesenchymale stamcellen.

In onderhavige uitvinding zullen de lymfocyten worden weggewassen op 37°C, terwijl de monocyten afsterven binnen 2 weken bij gebrek aan noodzakelijke cytokinen om deze in leven te houden. Op deze manier worden de MSCs opgezuiverd.

In een verder aspect gebeurt de isolatie van de mesenchymale stamcellen uit de bloed-interfase bij voorkeur middels centrifugatie van de bloed-interfase (na isolatie van de interfase), waarna de celpellet minstens éénmaal gewassen wordt met een geschikte buffer, zoals een fosfaatbuffer.

In het bijzonder zullen de mesenchymale cellen minimaal 2 weken in groeimedium worden gehouden. De dexamethasone in het groeimedium zorgt ervoor dat de stamcellen hun specifieke eigenschappen behouden en niet gaan differentiëren. Bij voorkeur wordt 1% dexamethasone gebruikt.

Na een minimale periode van 2 weken (14 dagen), bij voorkeur 3 weken (21 dagen) zullen duidelijke kolonies van mesenchymale stamcellen zichtbaar worden in de cultuurflessen.

In een daaropvolgende stap g) worden minstens 6 x 103 sta meel len/cm2 overgebracht naar expansiemedium omvattende laag glucose medium, serum en antibiotica voor het expanderen van de mesenchymale stamcellen.

In het bijzonder zal dit groeimedium maximaal 20% serum omvatten (zoals FBS of FCS). Te hoge serum-concentraties kan leiden tot een soort van 'gewenningsfase' bij de mesenchymale stamcellen aan de groeifactoren aanwezig in het serum, waardoor de cellen in afwezigheid van serum niet langer optimaal delen. Dit kan nadelig gevolgen hebben wanneer de cellen gebruikt worden voor bijvoorbeeld regeneratieve doeleinden.

Bij voorkeur zal de expansie van de mesenchymale stamcellen gebeuren in minimaal vijf cel passages. Aldus kunnen voldoende cellen bekomen worden. Bij voorkeur worden de cellen gesplitst bij 70 tot 80% confluentie. De mesenchymale stamcellen kunnen maximaal 50 passages in cultuur gehouden worden. Hierna treedt de kans op verlies in viabiliteit, senescentie of mutatievorming op.

De verkregen celpopulatie middels de werkwijze volgens onderhavige uitvinding zal bij voorkeur voor 90% bestaan uit mesenchymale stamcellen. Meer bij voorkeur zal deze voor minstens 95% uit mesenchymale stamcellen bestaan, meer bij voorkeur uit minimaal 99%, meest bij voorkeur uit 100%.

De aard van de cellen verkregen via onderhavige werkwijze kan worden nagegaan middels merkers, waarbij deze merkers specifiek zijn voor mesenchymale stamcellen. Bij voorkeur worden deze merkers gekozen uit de groep van vimentine, fibronectine, Ki67 of elke combinatie hiervan. Aldus kan de zuiverheid van de bekomen celpopulaties geanalyseerd worden en het percentage aan mesenchymale stamcellen bepaald worden middels deze merkers. Figuren 1 en 2 tonen mesenchymale stamcellen verkregen volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige uitvinding, respectievelijk geïsoleerd uit paard (figuur 1) en menselijk bloed (figuur 2). Beide stamcel-populaties zijn positief voor vimentine, fibronectine en Ki67.

Indien gewenst, kunnen de bekomen mesenchymale stamcellen geïnduceerd of gedifferentieerd worden tot adulte cellen. Inductie en differentiatie gebeuren bij voorkeur door toevoeging van specifieke groeifactoren en/of andere differentiatie-inducerende factoren aan het medium van de cellen. De aard van deze factoren zal in sterke mate afhangen van de gewenste differentiatie en soort van cellen die bekomen dient te worden. In het bijzonder kunnen de mesenchymale stamcellen verkregen volgens de werkwijze van onderhavige uitvinding differentiëren tot tenocyten, chondrocyten, osteocyten, myocyten, adipocyten of fibroblasten. Figuren 9 en 10 tonen mesenchymale stamcellen verkregen volgens onderhavige uitvinding die geïnduceerd en gedifferentieerd werden tot tenocyten. De aard van de gedifferentieerde cellen werd morfologsich bevestigd middels het waarnemen van de typische vezelstructuur (figuur 10 A), en tevens via expressie van specifieke merkers, zoals smooth muscle actine (figuur 10 C) en collageen type I (figuur 10 B).

Na de expansiefase kunnen de mesenchymale stamcellen in principe onmiddellijk gebruikt worden voor verscheidene doeleinden, zoals regeneratieve therapieën en dergelijke. Echter, bij voorkeur zal de bekomen stamcelpopulatie of afgeleiden hiervan (geïnduceerde of gedifferentieerde cellen) ingevroren en bewaard worden bij een temperatuur van minstens -80°C, eventueel in vloeibare stikstofvaten. Een voorbeeld van een werkwijze voor het invriezen en bewaren van de mesenchymale stamcellen is weergeven in voorbeeld 3. Bij voorkeur worden de cellen ingevroren in monsterflesje, waarbij het monsterflesje (1) voorzien is van een doorprikbaar septum (2) in de sluiting (3) van het monsterflesje, waarbij het doorprikbaar septum (2) uit een buigzaam materiaal zoals bijvoorbeeld rubber bestaat. Meer bij voorkeur wordt het monsterflesje (1) verder bewaard in een afsluitbaar reservoir (4), waarbij het reservoir (4) preferentieel afsluitbaar is middels een schroefdraad mechanisme (5). Zowel monsterflesje als reservoir zijn bij voorkeur vervaardigd uit materiaal geschikt voor cryogene toepassing. Figuur 4 geeft uitvoeringsvormen weer van het monsterflesje en reservoir omvattende een compositie volgens onderhavige uitvinding.

Cruciaal bij het invriezen van de mesenchymale stamcellen is de samenstelling van het cryogene medium, in het bijzonder de concentratie aan DMSO. DMSO voorkomt ijskristalvorming in het medium tijdens het in vriesproces, maar kan in te hoge concentratie toxisch zijn voor de cellen. In een voorkeursvorm bedraagt de concentratie aan DMSO maximaal 20%, meer bij voorkeur bedraagt de DMSO concentratie in het cryogene medium 10%. Het cryogene medium omvat verder bij voorkeur laag glucose medium zoals laag glucose DMEM. Figuur 7 toont de invloed van de DMSO concentratie op de vitaliteit van de stamcellen of composities volgens onderhavige uitvinding bij ontdooiing. Een percentage van 10% DMSO gaf hierbij de beste resultaten.

Invriezen volgens de werkwijze van onderhavige uitvinding resulteert in een minimale bewaarperiode van de cellen bij minstens -80°C van 6 maand.

Bij voorkeur worden de stamcellen volgens onderhavige uitvinding geïsoleerd uit bloed van zoogdieren, meer bij voorkeur uit perifeer bloed. In het bijzonder wordt bloed gebruikt van mens, kat, hond of paard, meest bij voorkeur van paard. Voorbeelden 1 en 2 beschrijven protocols volgens onderhavige uitvinding voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit bloed van enerzijds paard en mens.

In een mogelijke uitvoeringsvorm wordt bloed gebruikt van een donor die later ook tevens ontvanger zal zijn van de geïsoleerde mesenchymale stamcellen. In een andere uitvoeringsvorm wordt bloed gebruikt van donoren, waarbij de donoren bij voorkeur van eenzelfde familie, geslacht of ras zijn als de ontvanger van de mesenchymale stamcellen, geïsoleerd uit het bloed van de donoren.

In het bijzonder zullen, bij gebruik van donorbloed, deze donoren getest worden op courant voorkomende ziektes of pathologieën, om het risico op horizontale transmissie van deze pathologieën of ziektes via de stamcellen te voorkomen. Bij voorkeur worden de donordieren tevens in quarantaine gehouden.

Bij gebruik van donorpaarden kunnen deze bijvoorbeeld getest worden op volgende pathologieën: equine infectieve anemie (EIA), equine rhinopneumonia (EHV-1, EHV-4), equine virale arteritis (EVA), West-Nijl virus (WNV), Afrikan Horse Sickness (AHS), Dourine (Trypanosoma), piroplasmosis, kwade droes (malleus, glanders), equine influenza A, Borreliosis (Borrelia burgdorferi, ziekte van Lyme).

In een tweede aspect omvat onderhavige uitvinding een compositie omvattende mesenchymale stamcellen en/of geïnduceerde of gedifferentieerde cellen afkomstig van mesenchymale stamcellen, geïsoleerd uit het bloed van zoogdieren volgens bovenvermelde werkwijze.

In een voorkeursvorm zal de compositie minstens 90%, meer bij voorkeur minstens 95% mesenchymale stamcellen omvatten. Bij voorkeur omvat de compositie minstens 99% mesenchymale stamcellen, meer bij voorkeur 100%. De niet-geïnduceerde, niet-gedifferentieerde mesenchymale stamcellen uit de compositie expresseren bij voorkeur vimentine, fibronectine, Ki67 of elke combinatie hiervan.

In een andere voorkeursvorm zal de compositie minstens 90%, meer bij voorkeur minstens 95% geïnduceerde of gedifferentieerde cellen afkomstig van mesenchymale stamcellen omvatten. Bij voorkeur omvat de compositie minstens 99% geïnduceerde of gedifferentieerde cellen afkomstig van mesenchymale stamcellen geïsoleerd volgens de werkwijze van onderhavige uitvinding, meer bij voorkeur 100%. Bij voorkeur zullen de geïnduceerde of gedifferentieerde mesenchymale stamcellen tenocyten, chondrocyten, osteocyten, myocyten, adipocyten, keratinocyten, neuronen of fibroblasten zijn.

In het bijzonder is de compositie geformuleerd voor intraveneuze, intra-articulaire, intramusculaire, intra-lesionale toediening aan zoogdieren. Deze toedieningswijzen zullen sterk afhangen van de gewenste toepassing van de stamcellen en/of van hun gedifferentieerde vorm.

In een uitvoeringsvorm kan de compositie, in het bijzonder voor gewrichtsaandoeningen en peesletsels, opgemengd worden met componenten gekozen uit de groep van platelet-rich plasma (PRP), hyaluronzuur, composities op basis van hyaluronzuur, glycosaminoglycanen of composities op basis van giycosaminoglycanen. Opmenging van de compositie met dergelijke dragerstoffen kan in bepaalde gevallen wenselijk zijn om de doeltreffendheid van de compositie te verhogen of een synergistisch effect te creëren. PRP is bijvoorbeeld een substantie rijk aan groeifactoren en stimuleert de stamcellen na implantatie. Bij voorkeur zullen zowel de stamcellen als PRP van dezelfde donoren afkomstig zijn wegens compatibiliteitsredenen. Dragerstoffen kunnen ook ingezet worden om de zwaartekracht tegen te gaan: stamcellen volgen de wet van de zwaartekracht en kunnen daardoor hoger gelegen letsels soms moeilijk bereiken zonder een drager waarin ze kunnen migreren. Bovendien kunnen de dragerstoffen zelf ook een gunstig effect hebben op een pathologische omgeving waarin ze enerzijds het weefsel mee herstellen en anderzijds een goede stamcelniche vormen en de differentiatie ter plaatse helpen voltooien.

Voorbeelden van hyaluronzuur, glycosaminoglycanen of composities op basis hiervan zijn onder meer Ostenil®, Ostenil® +, Adant® en Adequan® (zie figuur 5). Figuur 5 geeft een schematische weergave van het effect van opmenging van de compositie met hyaluronzuur- of glycosaminoglycaan-componenten op de vitaliteit van de compositie volgens onderhavige uitvinding. Arthramid® of R-Gel ® zijn toxisch en dienen vermeden te worden in combinatie met MSCs.

Bij voorkeur zijn de cellen uit de compositie geïsoleerd uit bloed van mens, kat, hond of paard.

De compositie volgens onderhavige uitvinding heeft zeer brede toepassingsmogelijkheden. In het bijzonder is de compositie geschikt voor volgende doeleinden: - behandeling van trauma's gekozen uit de groep omvattende huid trauma's, kraakbeen trauma's, pees-trauma's, trauma's van de ligamenten, trauma's van de beenderen, trauma's van de mucus membranen, cystes of breuken; en/of - behandeling van neurologische en neurodegeneratieve ziektebeelden gekozen uit de groep omvattende het syndroom van Cushing, ademhalingsmoeilijkheden of parese van de ledematen; en/of - behandeling van acute of chronische inflammatoire ziektebeelden gekozen uit de groep van laminitis, periostitis, gastritis, artrose, ontstekingen veroorzaakt door virale, bacteriële, parasitaire of mycotische agentia in zoogdieren; en/of - behandeling van overgevoeligheidsreacties zoals insectenovergevoeligheid (zomer eczeem bijvoorbeeld), medicatie-overgevoeligheid, stofovergevoeligheid en andere soorten overgevoeligheid; en/of - behandeling van maagdilatatie en -torsiecomplexen; en/of - behandeling van onvruchtbaarheid in merries of vroegrijpheid van veulens.

In het bijzonder omvat elke toepassing het toedienen van de compositie aan een subject dat gebaat is bij het krijgen van de compositie. Het subject kan hierbij een paard, kat, hond of mens zijn. Meer in het bijzonder omvat de werkwijze voor het toedienen van een compositie volgens onderhavige uitvinding aan een subject, volgende stappen: a) het ontdooien van een monsterflesje omvattende de compositie, ingevroren bij minstens -80°C, waarbij het ontdooien gebeurt bij een temperatuur gelegen tussen de 20°C en 37°C, bij voorkeur gelegen tussen de 25°C en 37°C en in een tijdspanne van maximaal 20 minuten, meer bij voorkeur maximaal 5 minuten; b) het opnemen van het monster uit het monsterflesje in een reservoir middels een injectienaald met een binnen-diameter van de injectienaald minimaal 0.3 mm, bij voorkeur minimaal 0.35 mm; c) het optioneel opmengen van de compositie met componenten gekozen uit de groep van platelet-rich plasma (PRP), hyaluronzuur of glycosaminoglycanen; d) het toedienen van de compositie of mengsel ervan aan een subject middels intraveneuze, intra-articulaire, intramusculaire, intra-lesionale injectie.

De celdiameter van de injectienaald is hierbij cruciaal, om schade aan de compositie te vermijden. Figuur 6 toont het cruciaal effect van de binnen-diameter van de naald gebruikt voor opname van de compositie. Een 23G injectienaald (binnen-diameter 0.33 mm) had hierbij een beduidend positiever effect op de vitaliteit van de cellen uit onderhavige compositie dan een 25G injectienaald (binnen-diameter 0.26 mm)

Ontdooien van de compositie kan gebeuren middels opwarming in een warmwaterbad of in de hand of middels elke andere methode binnen de gewenste temperatuursg renzen.

Bij voorkeur wordt de compositie binnen de 2 minuten na ontdooiing toegediend, om de viabiliteit van de compositie te vrijwaren.

In wat volgt, wordt de uitvinding beschreven a.d.h.v. niet-limiterende voorbeelden die de uitvinding illustreren, en die niet bedoeld zijn of geïnterpreteerd mogen worden om de omvang van de uitvinding te limiteren.

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1: Voorbeeldprotocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van paarden - Neem vijf monsters perifeer bloed van paarden en collecteer deze in EDTA tubes (5 x 10 ml)

- Transporteer het bloed bij 4°C - Centrifugeer de tubes voor 20 minuten bij kamertemperatuur (accel 10 &decel 10) - Collecteer de buffy coat in een steriele 15 ml tube en verdun de cellen 1:2 met PBS bij kamertemperatuur - Breng de oplossing over op eenzelfde hoeveelheid Percoll (tussen 1.08 en 1.77 g/ml) bij kamertemperatuur - Centrifugeer voor 15 minuten op kamertemperatuur (zonder rem: accel 10 & decel 2) - Collecteer de interfase - Was de interfase 3x met PBS door centrifugatie voor 8 minuten bij kamertemperatuur - Resuspendeer de bekomen pellet in groeimedium met dexamethasone en tel de cellen - Zaai 20 tot 40 x 106 BMCs per T75 falcon (zaai 4 flessen uit) - Ververs 2 maal per week het groeimedium - Trypsiniseer de cellen bij 70-80% confluentie - Zaai 0.5 x 106 cellen per T75 falcon van de eerste passage naar expansiemedium - Splits cellen bij 70-80% confluentie tot passage 5 (P5)

Figuur 1 toont mesenchymale stamcellen geïsoleerd volgens het protocol uit voorbeeld 1, waarbij de cellen positief zijn voor de merkers vimentine, fibronectine en Ki67.

Voorbeeld 2: Voorbeeldprotocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van mensen, katten of honden

Het protocol uit voorbeeld 1 kan zonder problemen toegepast worden op bloedmonsters van andere zoogdieren, zoals mens, hond of kat. Figuur 2 toont mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit humaan bloed, positief voor de merkers vimentine, fibronectine en Ki67.

Voorbeeld 3; Voorbeeldprotocol voor de cryo-preservatie - Trypsine 0.25% -EDTA 0.02% [50ml]: • 10% Trypsine (stock solution = 2.5%) [5ml] • 1% Versene (EDTA) [500pl] • Verdun met PBS lx [44.5ml] (of commercieel verkrijgbaar Tryp-EDTA 0.25%) a. Verwijder het medium b. Voeg 0.25% trypsine-EDTA toe aan de cellen; c. Incubeer voor maximum 10 minuten bij 37°C (controleer of alle cellen losgekomen zijn); d. Voeg eenzelfde hoeveelheid warm medium toe (37°C, containing FBS) of zuivere FBS om de trypsine activiteit te blokkeren; e. Centrifugeer de oplossing bij 300G voor 8 minuten bij kamertemperatuur (accel 10 8i decel 10); f. Verwijder het supernatans; g. Voeg 10ml PBS lx en resuspendeer de cellen om het resterende medium weg te wassen, centrifugeer bij 300G voor 8 minuten bij kamertemperatuur (accel 10 & decal 10); h. Verwijder het supernatans; i. Resuspendeer de cellen in een aangepaste hoeveelheid medium. j. . Voeg lml cellen/cryotube; k. Plaats de cryotubes in a plastic container met isopropanol (KT) bij -80°C overnacht. l. Breng de tubes in a gelabelde box bij -80°C.

Algemeen principe: [lml/ cryotube] • MSC's + DMEM low glucose [0.9ml] • +10% DMSO [ΙΟΟμΙ]

Voorbeeld 4: Voorbeeld van samenstelling van gebruikte media

Groeimedium [50ml]: • Laag glucose DMEM [39ml] • 30% FBS [10ml] • 1% laag dexamethasone (stock = 10-9 Μ) [500μΙ] • 1% Antibiotica - antimycotica (penicilline /streptomycine /amphotericine B) [500μΙ]

Expansie medium [500ml]: • Laag glucose DMEM [395ml] • 20% FBS [100ml] • 1% Antibiotics - antimycotics [5ml]

Voorbeeld 5

Composities volgens onderhavige uitvinding zullen ondermeer op de markt gebracht worden onder de merknamen Arti-Cell®, Arti-Cell® PLUS, Tendo-Cell®, Veno-Cell® of Veno-Cell® Plus. a. Arti-Cell® omvat een compositie van niet-gedifferentieerde mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit zoogdieren, bij voorkeur voor toepassing in orthopedische laesies en pathologieën zoals artrose, kraakbeen schade, cyste structuren (zie figuur 8). Bij voorkeur wordt Arti-Cell® intra-articulair toegediend. b. Arti-Cell® Plus omvat een compositie van mesenchymale stamcellen geïnduceerd naar chondrocyten, bij voorkeur voor toepassing bij ernstige kraakbeen kwetsuren. c. Tendo-Cell® omvat een compositie van mesenchymale stamcellen geïnduceerd naar tenocyten. Tendo-cell® wordt bij voorkeur gebruikt bij toepassingen van pees-laesies, kwetsuren van de ligamenten en andere tendinopathieën (zie figuur 9 en 10). d. Veno-Cell® omvat een compositie van niet-gedifferentieerde mesenchymale stamcellen, met diameter kleiner dan 40 pm, bij voorkeur voor gebruik bij behandeling van musco-skeletale pathologieën, endocriene pathologieën of voor perfusie (zie figuur 11). De compositie wordt bij voorkeur intraveneus toegediend. e. Veno-Cell® Plus is gelijkaardig aan Veno-Cell®. De stamcellen zijn hierbij gestimuleerd opdat deze een verhoogde migratiecapaciteit naar pathologische plaatsen in het lichaam.

Voorbeeld 6

Behandeling van tendinitis bii paarden met een compositie omvattende mesenchymale stamcellen geïnduceerd naar tenocyten

Tien paarden met ernstige tendinitis van de oppervlakkige buigpees en 15 paarden met chronische desmitis van de musculus interosseus médius werden behandeld met een compositie volgens onderhavige uitvinding, omvattende mesenchymale stamcellen geïnduceerd (pre-differentiatie) tot tenocyten in combinatie met PRP als dragerstof.

Toediening van de compositie gebeurde intra-laesionaal onder echo-begeleiding in de gekwetste pees. 80% van de behandelde paarden vertoonden een verbetering na slechts 6 weken, waar normaal slechts na minimaal 6 maand van intensieve, conventioneel conservatieve therapie soortgelijke resultaten worden verkregen.

Figuur 12 A is een voorbeeld van een echografie van een patiënt met tendinitis, dat behandeld werd middels conventioneel conservatieve therapie. Beterschap werd pas na 6 maand van therapie waargenomen (figuur 12 B).

Figuur 13 A is een voorbeeld van een echografie van een patiënt met tendinitis, behandeld met een compositie van tenocyten volgens onderhavige uitvinding. Figuur 13 B geeft de evolutie weer, 29 dagen na behandeling. Een opmerkelijke beterschap was zichtbaar.

Figuur 14 A is een echografie van een patiënt met chronische desmitis, figuur B geeft de evolutie weer, 35 dagen na behandeling met een compositie volgens een uitvoeringsvorm van onderhavige uitvinding. Opnieuw werd een opmerkelijke beterschap in zeer korte tijd waargenomen. Bovendien bleek lokale calcificatie van de pezen vóór de behandeling tevens verdwenen na behandeling.

Figuur 15 toont statistische resultaten van patiënten (tendinitis of desmitis) behandeld met composities volgens uitvoeringsvormen van onderhavige uitvinding. Score 0 geeft 0% verbetering weer 6 weken na behandeling met Tendo-Cell® in combinatie met PRP en score 5 100% verbetering (1=20%, 2=40%, 3=60% en 4=80%). Uit deze figuur kan afgeleid worden dat 20 van de 25 paarden (80%) een score 4 of meer gekregen hebben van onafhankelijke dierenartsen 6 weken na de behandeling.

Voorbeeld 7: Geïnfecteerde buikwonde na koliekoperatie

Na een koliekoperatie bij een Arabische Volbloed hengst zijn de hechtingen geïnfecteerd geraakt ter hoogte van de linea alba waardoor de patiënt een geïnfecteerde huidwonde ontwikkeld heeft ter hoogte van de buik. Na 3 maanden conservatieve therapie was de wonde nog steeds niet genezen en hebben de eigenaars besloten de volbloed te behandelen met mesenchymale stamcellen uit het bloed van een ander donorpaard en na een 4-tal weken was de wonde volledig genezen verklaard door de behandelende dierenarts.

Voorbeeld 8: Peesschedeproblemen en Laesies van de ligamenten

Drie paarden met een opgezette peesschede gedurende 6 maanden werden behandeld met de beschreven compositie met als gevolg het volledige herstel na 2 maanden.

Een patiënt leed aan kreupelheid als gevolg van een laesie aan de collateraalbanden van de kogel: minder dan 2 maanden na een plaatselijke injectie met een compositie volgens de uitvinding kon het paard opnieuw normaal lopen, er werd geen terugval waargenomen.

Voorbeeld 9: Breuken

Een 4-jarige ruin met een moeilijk helende hoefbeenfractuur gedurende 10 maanden van conservatieve behandelingen werd lokaal behandeld met een compositie volgens onderhavige uitvinding. Volledig herstel trad op na 4 maanden.

Voorbeeld 10: Slijmvliezen

Beterschap bij een paard met ernstig ontstoken zweren (polyfolliculaire lymfangitis) in de keelstreek trad reeds op 4 weken na behandeling. Na 6 weken waren de laesies volledig genezen.

Voorbeeld 11: Syndroom van Cushino

Een 19-jaar oud paard met het Syndroom van Cushing werd behandeld met 2 consecutieve behandelingen met de beschreven compositie (telkens met verschil van 2 maanden). Na 2 cycli waren de symptomen opmerkelijk verbeterd. Nog 2 paarden werden behandeld op dezelfde wijze met hetzelfde resultaat.

Voorbeeld 12: Hoofdschudden

Dit is een neurologische pathologie van het centrale zenuwstelsel wat leidt tot voortdurend hoofdschudden. Een paard dat reeds 4 maand leed onder de symptomen werd eenmalig behandeld. Al in de derde week verdwenen de symptomen.

Voorbeeld 13: Vasculaire wederopbouw

In een paard beïnvloed door laminitis (loslating van de lamellen thv de voet met als gevolg ook vernietiging van de perifere vascularisatie in de voet) verdween de pijn nagenoeg na 24 uur nadat een dosis werd toegediend. Wel merkten we dat dit paard herviel na 3 weken.

Voorbeeld 14: Overgevoeligheidsreactie

Een paard met verspreide nodules (bultjes) op zijn lichaam veroorzaakt door een overgevoeligheidsreactie is behandeld geworden door de beschreven compositie met als gevolg het verdwijnen van de bulten de daaropvolgende dag. Dit bleef zo gedurende 2 maanden.

Een ander paard met zomereczeem (overgevoeligheid veroorzaakt door culicoidesmuggen) schuurde gedurende de eerste 2 zomermaanden zijn volledige manenkam en staart kaal. Door een eenmalige behandeling met een beschreven component is dit paard gedurende de verdere zomer gespaard gebleven van het schuren en herstelden de manenkam en staart volledig.

Claims

Werkwijze voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit bloed van zoogdieren, omvattende het isoleren van mesenchymale stamcellen uit de bloed- interfase van bloedmonsters en het in cultuur houden ervan in een laag glucose groeimedium gesupplementeerd met antibiotica, serum en laag dexamethasone, ter verhindering van de differentiatie van de cellen.
Werkwijze volgens conclusie 1, omvattende de stappen:
a) het collecteren van één of meerdere bloedmonsters van donordieren in een monsterflesje, gecoat met een anti-coagulant;
b) het centrifugeren van de bloedmonsters tot het bekomen van een 3-fasige verdeling bestaande uit plasma-fase, buffy coat en erythrocyten fase;
c) het collecteren van de buffy coat en het laden ervan op een densiteitsgradiënt;
d) het collecteren van de bloed-interfase verkregen uit de densiteitsgradiënt van stap
c);
e) het isoleren van mesenchymale stamcellen uit de bloed-interfase middels centrifugatie;
f) het uitzaaien van minimaal 2.5 x 105/cm2 mesenchymale stamcellen in groeimedium.
Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat stap d) voorafgegaan wordt door een stap c') waarbij de buffy coat uit stap c) minimaal 1:2 verdund wordt in een fysiologische buffer.
Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 3, met het kenmerk, dat de mesenchymale stamcellen minimaal 2 weken in groeimedium worden gehouden. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat in een stap
g) minstens 6 x 103 cellen/cm2 worden overgebracht naar een expansiemedium omvattende een laag glucose medium, serum en antibiotica voor het expanderen van de mesenchymale stamcellen.
Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het expansiemedium maximaal 20% FBS of FCS omvat.
Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het expanderen van de mesenchymale stamcellen gebeurt in minimaal vijf cel passages.
Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 7, met het kenmerk, dat de mesenchymale stamcellen minimaal 6 maand bewaard kunnen worden in een oplossing van laag glucose medium en 10% dimethylsulfoxide bij minstens -80°C. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 8, met het kenmerk dat de mesenchymale stamcellen geïsoleerd worden uit bloed van mens, kat, hond of paard.
). Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de mesenchymale stamcellen geïsoleerd worden uit bloed van paarden.
..Compositie omvattende mesenchymale stamcellen en/of geïnduceerde of gedifferentieerde cellen afkomstig van mesenchymale stamcellen, geïsoleerd uit het bloed van zoogdieren volgens één van de conclusies 1 tot 10, met het kenmerk, dat de mesenchymale stamcellen vimentine, fibronectine, Ki67 of een combinatie hiervan expresseren.
».Compositie volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de compositie minstens 90%, bij voorkeur minstens 95% mesenchymale stamcellen omvat.
I. Compositie volgens conclusie 11 of 12, met het kenmerk, dat de compositie minstens 90%, bij voorkeur minstens 95% geïnduceerde of gedifferentieerde cellen afkomstig van mesenchymale stamcellen omvat.
k Compositie volgens conclusies 11 tot 13, met het kenmerk, dat de compositie geformuleerd is voor intraveneuze, intra-articulaire, intramusculaire, intra-lesionale toediening aan zoogdieren.
i. Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 14, met het kenmerk, dat de gedifferentieerde mesenchymale stamcellen tenocyten, chondrocyten, osteocyten, myocyten, adipocyten, keratinocyten, neuronen of fibroblasten zijn.
>. Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 15, met het kenmerk, dat de compositie opgemengd is met componenten gekozen uit de groep van platelet-rich plasma (PRP), hyaluronzuur of glycosaminoglycanen.
'.Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 16, met het kenmerk, dat de mesenchymale stamcellen geïsoleerd zijn uit bloed van mens, kat, hond of paard.
I. Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 17 voor behandeling van trauma's gekozen uit de groep omvattende huid trauma's, kraakbeen trauma's, pees-trauma's, trauma's van de ligamenten, trauma's van de beenderen, trauma's van de mucus membranen, cystes of breuken.
•.Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 17 voor behandeling van neurologische en neurodegeneratieve ziektebeelden gekozen uit de groep omvattende het syndroom van Cushing, ademhalingsmoeilijkheden of parese van de ledematen.
•.Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 17 voor de behandeling van acute of chronische inflammatoire ziektebeelden gekozen uit de groep van laminitis, periostitis, gastritis, artrose, ontstekingen veroorzaakt door virale, bacteriële, parasitaire of mycotische agentia in zoogdieren.
.Compositie volgens één van de conclusie 11 tot 17 voor de behandeling van overgevoeligheidsreacties.
.Compositie volgens één van de conclusie 11 tot 17 voor de behandeling van maagdilatatie en -torsiecomplexen.
.Compositie volgens één van de conclusies 11 tot 17 voor de behandeling van onvruchtbaarheid in merries of vroegrijpheid van veulens.
.Werkwijze voor het toedienen van een compositie volgens één van de conclusies 11 tot 23 aan een subject, waarbij het subject een paard, kat, hond of mens is, omvattende de stappen:
a) het ontdooien van een monsterflesje omvattende de compositie, ingevroren bij minstens -80°C, waarbij het ontdooien gebeurt bij een temperatuur gelegen tussen de 20°C en 37°C, bij voorkeur gelegen tussen de 25°C en 37°C en in een tijdspanne van maximaal 20 minuten, meer bij voorkeur maximaal 5 minuten;
b) het opnemen van het monster uit het monsterflesje in een reservoir middels een injectienaald met een binnen-diameter van minimaal 0.3 mm, bij voorkeur minimaal 0.35 mm.;
c) het optioneel opmengen van de compositie met componenten gekozen uit de groep van platelet-rich plasma (PRP), hyaluronzuur of glycosaminoglycanen;
d) het toedienen van de compositie of mengsel ervan aan een subject middels intraveneuze, intra-articulaire, intramusculaire of intra-lesionale injectie.