TARIFNAME TROMBOSITI'EN ZENGIN FIBRIN KAYNAKLI MEZENKIMAL KÖK HÜCRELER Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, tlîil ve saglllZlalanlElzla tedavi edici kök hücre uygulamalarlEtla insan kanlîitlan elde edilen Trombositten Zengin Fibrin (TZF) `den iyi imalat uygulama laboratuvar ortam-a (GMP lab) Mezenkimal Kök Hücre (MKH) eldesi, onun kültüre edilmesi ve ileri tedavi tIi ürünü olarak klinikte kullanIia hazElhale getirilmesi ile ilgilidir. Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Kök hücreler özellesmis, hücre bölünmesi SÜSIa kendi kendini yenileyebilen ve diger hücre tiplerine farklllâsabilen hücrelerdir. Kök hücreler embriyonik kök hücre (EKH), indüklenmis pluripotent kök hücre (IPKH) ve mezenkimal kök hücreler (MKH) olarak sIIflhndlEllIhaktadlEllar. MKH'Ier yetiskin kök hücreler olup insan ve hayvanlardan elde edilebilmektedirler. MKH'ler mezodermden gelisen özel hücrelere farklllâsabildikleri için bu sekilde isimlendirilmislerdir. Insan mezenkimal kök hücreler (hMKH), kendini yenileyebilen, multipotent, yaplglna özelligi olan (adherent), kolay elde edilebilen, laboratuvar sartlarIa genis çapta kültüre edilebilen ve osteosit, adiposit ile kondrosit gibi mezodermal hat hücrelerine farklllâsabilen multipotent hücrelerdir. hMKH'lerin karakterizasyonu için International Society for Cellular Therapy (ISCT- UluslararaslZIHücresel Terapi Toplulugu) tarafIan belirlenen minimum kriterler söyle sülanmaktadlE Bu hücreler; a. Plastik yüzeye yaplglna özelligi göstermelidir, b. CD73, CD90 ve CD105 belirteçleri ifade ederken; CD14, CD34, CD45 ve HLA-DR belirteci ifade etmemelidir, c. [n vitro olarak adiposit, kondrosit ve osteosite farklllâsabilme yetenegine sahip olmalIlE Bu karakteristik özellikler bütün MKH'Ier için geçerlidir. Teknigin bilinen durumunda hMKH'ler ilk olarak kemik iliginden izole edilmis olup ardian adipoz doku, amniyotik süljamniyotik membran, limb bud (embriyo uzuv tomurcugu) menstrual kan, periferal kari, plasenta ve fetal membran, tükrük bezi, deri ve sünnet derisi, sinovial SEEI endometrium, dental pulpa, umbilikal kord ve Wharton jeli gibi çesitli doku kaynaklarlEtlan elde edilmistir. hMKH'ler kendileri için özel olarak üretilmis besiyerlerinde uzun dönem kültüre edilebilirler. MKH'Ier immunmodulatör özellikleri, salgllâdllîlarEllaktörler, kendi mikroçevrelerini düzenledikleri immünreseptörler ve farklllâsabilme gibi özellikleriyle uzun zamandIE çesitli hastalilZlarI tedavisinde kullan [IEiaktad lEllar. sadece gebelik söz konusu iken elde etme yöntemlerindendir. Teknigin bilinen durumunda hMKH'Ierin elde edilmesiyle ilgili çesitli invaziv ya da girisimsel yöntemlere basvurulmaktadlü hMKH eldesini invaziv yönteme basvurulmaslîkisi konforu aç-an istenmeyen bir durumdur. Örnegin kemik iliginden MKH eldesinde kisinin kemik iliginden aI-n MKH'Ier kullanlIJElken; adipoz dokudan elde edilecek MKH'lerde genellikle liposuction (yag alma metodu) veya küçük operasyonlar ile göbek bölgesinden yag dokusu parçalarEialIrak uygulanmaktadE Dis pulpaslian elde edilecek MKH'ler ya süt dislerinden elde edilmelidir ki bu ancak çocukluk yasIda gerçeklesebileceginden yetiskin bireylerde kök hücre eldesine uygun degildir. Ileriki yaslarda 20 yas disi veya diger dislerden elde edilmektedir. Ancak bu islem de bir operasyon gerektirdiginden kisi konforu aç-ian uygun degildir. Limb bud, plasenta ve fetal membran, Wharton jeli ve umbilikal kord, amniyotik leIZIamniyotik membran, sünnet derisi gibi dokulardan elde edilecek MKH'Ier de yine belli bir zamanda allEtnasEgerektiginden kisinin yetiskin yaslarlEtla kullanilâbilecek bir kök hücre kaynagüjegildir. Yine sinoviyal slîlgendometrium ve tükürük bezi gibi kök hücre kaynaklarülla invaziv yöntemlerle hücre elde edilebilecek MKH kaynaklarIlB Önceki teknikte Periferal kandan MKH elde edildigi kandan Ficoll gradiyent hücre çöktürmesi yöntemiyle hem hematopoietik hem de MKH özelligi gösteren hücreler elde edilerek gösterilmistir. Ancak, bulus ile MKH eldesinde periferik tam kan kullanlßîamaktadEl MKH eldesi için trombositten zengin fibrin (TZF) doku kullanllIhIStE Önceki teknikte ise MKH eldesi için direkt tam kan kullanilIhEtlEl ve kan. içinde hem hematopoietik hem de MKH kök hücre oldugu gösterilmistir. Oysaki TZF, tam kandan hem içerik hem de yaplâlal olarak tamamen farklIlEl TZF, baslIEla trombosit ve sitokinleri içeren bir fibrin agdlE Bulus ile içerisinde aynüamanda MKH varllgiEtla gösterilmektedir. Vücutta bir çok bag dokusu stromaslZlçeren dokuda MKH varligiiZbildirilmistir. Kan stroma içeren bir organ/doku degildir. TZF eldesi için baslangßta periferik kan gerekiyor ise de TZF, periferik kandan tamamen ayrlîlanatomik, fizyolojik ve moleküler yaplgla sahiptir. DolayEEile TZF'den MKH eldesi için bilinen önceki bir teknik bulunmamaktadlE En yakI düsünülebilecek kandan MKH eldesi için kullanüân önceki teknikte, elde edilen hücrelerin yaplgfna özelligi olanlarECDlOS, KIT ve SLAMFl belirteçleriyle degerlendirilmis, hücrelerin morfolojisi uygun bulunmus ve sadece osteoblast ve osteoklast hücrelere farklllâsma yeteneklerine bakliBilsÇtlE Dolaylîlsîla ISCT taraflEdan belirlenen kriterleri saglayan bir çallgma yapilBiadlgilütlan plastik yüzeye yaplglan hücreler MKH karakteri gösteren hücreler olarak degerlendirilmistir. Trombositten Zengin Fibrin (TZF), Periferik kanI özel santirfüjleme teknikleri ile elde edilen fibrin bir matriks kEinIüifade eder. Bu k! trombositlerden zengindir, periferik kanI içeriginden hem hücresel hem de sitokinler aç-an tamamen farkIIIE Teknigin bilinen durumunda Trombositten Zengin Fibrin (TZF) içerisinde CD34+ hematopoietik kök hücrelerin varl[g]l:lbilinmesine ragmen Trombositten Zengin Fibrin (TZF) `nin mezenkimal kök hücre üretimi amaçlElluIlanIiünevcut degildir. Bulusun KIEla Aç[lilamas|]ie Amaçlarlîl Bulusun öncelikli amacEkiside invaziv herhangi bir islem olmadan, kisi konforunu etkilemeden, direkt olarak venöz damardan allîilan kan ile mezenkimal kök hücre elde edilmesini saglamaktlE Bulus ile her an ulasUâbilir bir kaynaktan, cerrahi bir islem gerektirmeden sadece 1 tüp kan allElnasEile trombositten zengin fibrin dokusunun eldesi ve bu dokudan mezenkimal kök hücre eldesi amaçlanmlgtlEI Bulus ile trombositten zengin fibrin dokusundan mezenkimal kök hücresi elde edilmis olup, üretilen hücreler ayrlEla klinikte kullanuâbilir üretim sartlarIia (GMP grade) da hazlîllanmlglve klinik olarak uygulanabilir hale getirilmistir. Bulusu Aç[|ilayan Sekillerin TanlB'ilarEI Sekil 1: TZF-MKH'lerin morfolojik görüntüsü Sekil 2: Hücrelerin akli sitometrisi ile karakterizasyon sonucu Sekil 3: Adipojenik olarak farklilâstEIlBilglhücrelerdeki yag damlaclEIarEl Sekil 4: Iki hafta boyunca osteojenik besiyerinde kalarak farklllâstlîllfhlgl hücrelerin mikroskobik görüntüsü Sekil 5: Iki hafta boyunca kondrojenik besiyerinde kalarak farklllâstlEIlBiE hücrelerin mikroskobik görüntüsü Bulusun DetaylEAçElilamaslZl Trombositten zengin fibrin (TZF) dogal kari dokusundan elde edilen, yap-a bol miktarda trombosit ve Iökosit Içeren fibrin matriks yapIîIJnlamIIiEliasaktadlE Gönüllülerden elde edilen kan ile; TZF'den Mezenkimal kök hücreler (MKH) elde edilmistir (Sekil 1). Bu amaç için öncelikle her bir kisiden enjektörle toplanarak cam kaplüilastik tüplere aIIElTüpler bilinen bir metoda göre göre 3000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüj edilerek TZF'Ier elde edildi. ArdIdan TZF'ler PBS ile y[Klandl:l Steril kosullarda, Iaminar ak! kabini aItIa bir bistüri yardnlýla mekanik olarak mümkün oldugunca küçük parçalara ayrIDEIde edilen küçük parçalar ilk önce D-Lysine kapIElilasklara aktarIü/e içerisine % 8- 20 hacimde insan serumu (Tercihen 12.5 ), hayvan serumu veya serumsuz sekilde %05- 2 hacimde penisilin-streptomisin (Tercihen %1), %0.5- 2 hacimde L- glutamin (Tercihen %1), inorganik tuzlardan kalsiyum klorür, potasyum klorür, magnezyum sülfat, sodyum klorür, sodyum bikarbonat, sodyum fosfat; amino asitlerden L-alanin, L- arginin, L-asparagin-HZO, L-aspartik asit, L-sistin, L-sistein-HCI-HZO, L-glutamik asit, L- glutamin, glisin, L-histidin, L-izolösin, L-Iösin, L-Iizin, L-metionin, L-fenil alanin, L-prolin, L- serin, L-treonin, L-triptofan, L-tirozin, L-valin; vitaminlerden L-askorbik asit, biyotin, D-Ca pantotenat, kolin klorür, folik asit, i-inositol, niacinamide, pridoksal HCI, riboflamin, tiamin HCI, 812 vitamini; D glukoz, lipoik asit, sodyum pirüvat, fenol klîilniîgüinaddelerinin tamamlEJEl içeren hazlEiticari besiyeri olan alfa MEM besiyeri eklenerek (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) ve 37 °C'de % 0.3- 5'lik COz içeren inkübatörde kültüre edildi. Bir gün sonra D-Lysine kaplEliIasktaki içerik bos flasklara aktarIIZIPrimer kültürü takip eden 3-4 gün boyunca hücreler çok fazla hareket ettirilmeden invert mikroskop aItIda takip edildi ve ardIan besiyeri degistirildi. Hücreler düzenli olarak takip edilip haftada en az iki kez besiyeri degistirildi. Pasajlama isleminde ise hücreler %85-90 konflüense geldiginde %0,01- 0,5 hacimde Tripsin-EDTA solüsyonu (Tercihen %005) kullanilârak hücreler yapEKI oldugu santrifüj sonrasElsüpernatant atilârak pellet yeni besiyeri ile yeni kültür kaplar. ekildi. Terapötik doza ulasiüba hücreler istege baglEloIarak belirlenen serum fizyolojik gibi bir fizyolojik sIîEliçinde kullanüâcak hastal[ga göre belirlenen dozda örnegin; 14 ml serum fizyolojik veya bir damar içi uygulanabilen fizyolojik bir SEDIçinde 30 x 106 (±5 x 106) olacak sekilde cam flakonlara alütlü MKH endikasyonunun mevcut oldugu graft versus host hastallgiükalp hastalllîlarübeyin hastalllîlarükaraciger hastalllîlarükanser, çene hastalllîlarü böbrek ve üriner sistem hastal[lZIarÇljinekoIojik hastaI[IZIar, enfeksiyon hastalilZIarÇI göz hastal[lZlarD osteoartrit, osteonekrozu içeren ortopedik-iskeletsel sistem hastallKlarIa ve antiaging amaclîclia içeren tüm dermatolojik olgular için klinik olarak uygulanabilir mezenkimal kök hücreler kullan a hazEhale gelmistir. TZF-MKH'Ierin ak! sitometrisi ile yapllâcak olan karakterizasyonunda 3. Pasaja gelmis in vitro olarak fenotipik MKH karakterizasyonu gösteren hücreler kullanIElBunun için 1x106 hücre kültür kaplar-n kald-üsantrifüj edildi ve DPBS içinde resüspanse edildikten BD Stem Flow hMSC kit (BD kat no:562245) ile üretici firmanI talimatlarthlogrultusunda inkübe edildi. ArdIdan Navios (Beckman Coulter, USA) akIi sitometri cihazEkullanIErak CD belirteçlerin varliglü/e oranlarEtespit edildi. Elde edilen sonuçlar KALUZA (Beckman Coulter, USA) programEile analiz edildi (Sekil 2). Negatif belirteçler olan CD11b, CD19, CD45, CD34 yüzey belirteç ekspresyonu %95,12 dir. MKH kriterlerine göre fenotiflendirmede negative yüzey belirteçlerinin %2 e esit veya az olmasüle pozitif yüzey belirteçlerinin %95' e esit veya yüksek olmasügerekmektedir. Elde edilen veriler kriterleri saglamaktadlEl 3.Pasaja gelmis TZF-MKH'ler adipojenik farklilâsmaylîindüklemek için 6 kuyucuklu hücreler üzerindeki kültür besiyeri aspire edildi ve 21 gün boyunca "adipojenik farklilâstlElna kiti" (Gibco, USA) ile kültüre edilerek hücrelerin adipojenik farklllâsmasElindüklendi. Farkluâsan hücreler yuvarlak Iipid damlac[IZIarl:içeren adipositlere dönüsmektedir. Adipojenik olarak farklilâsmaya indüklenen hücreler arasIaki yag damlalarüdipoRed Assay Kit (Lonza MD, USA) ile boyanarak hücrelerin farklilâsmaslîlincelendi. Boyama ile adipositler invert mikroskop aItIa pembe yag damlac[lZIarL_s`ekIinde gözlemlendi (Sekil 3). 3.Pasaja gelmis TZF-MKH'Ier 6 kuyucuklu tabakalara 3000 hücre/cm2 olacak sekilde ekildi ve hücreler %90-100 konflüense ulasülca kültür besiyeri "osteojenik farklilâstlüna kiti" (Biological Industries, Israil) ile degistirildi ve hücrelerin osteojenik olarak farklllâsmaslîl indüklendi. Besiyeri haftada en az iki kere degistirilerek hücreler iki hafta boyunca indüklendi. Iki hafta sonunda hücrelerdeki kalsiyum deposu %l'lik Alizarin Red ile boyanarak incelendi Boyama ile osteojenik farklilâsan hücrelerdeki kalsiyum depositleri invert mikroskop altlEbla gözlemlendi (Sekil 4). Kondrojenik farklüâsma için yine 3.Pasaja gelmis TZF-MKH'Ier 500.000 hücre 15 ml.lik falkon tüp içerisine alIdüie 300 9'de 5 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrasIia supernatant atilârak pellet yerinden kalkmadan yavasça "kondrojenik farklilâsma kiti" (Gibco, USA) ile degistirildi. Haftada en az iki kez besiyeri degistirilerek iki hafta boyunca hücrelerin kondrosite dönüsmesi indüklendi. Iki hafta sonunda farkllßsan hücreler human mesenchymal stem cell functional identification kit (R&D System, USA) ile boyanarak incelendi (Sekil 5). Bu amaçla, üç boyutlu sekilde falkon tüp içerisinde farklllâsan hücre pelleti cryomold Üzerine damlatllân frozen secting compound (kat no:3801480, Leica) solüsyonunun üzerine koyularak donduruldu ve cryostat yöntemi ile kesit alIdEIDondurma ve kesit alma islemi Leica CM1860 UV cihazEIçerisinde yapIEIArdlütlan Agrekan Antijeni Afinite ile saflastlülüîlgl Poliklonal Antikoru ile boyamaslîl/apllârak floresans mikroskop altlEtla ekstraselular maktiks yapElEUa bulunan agregan proteoglikanlarlîlgörüntülendi. Farklüâsan hücreler floresan mikroskop sayesinde görüntülendi. TR TR TR TR TR TR