RS65796B1 - Postupak za pripremu sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, i njegove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za pripremu sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktora rasta, iz koncentrata sisarskih trombocita, prema preambuli prvog patentnog zahteva.

[0002] Sisarski trombociti sadrže veliki broj bioaktivnih agenasa sa važnim fiziološkim funkcijama. Među njima su od posebnog interesa faktori rasta, zbog svoje uloge u poboljšanju proliferacije različitih ćelijskih linija i u regeneraciji tkiva, pri čemu su oba ova procesa od veoma velikog značaja u regenerativnoj medicini, zarastanju rana i čireva.

[0003] Koncept upotrebe plazme bogate trombocitima (PRP), dobijene od samog pacijenta, u stomatologiji, plastičnoj hirurgiji i regenerativnoj medicini razvijen je već početkom 1990-ih. Trombociti se dobijaju ili centrifugiranjem antikoagulisane pune krvi dobijene od samog pacijenta, ili korišćenjem posebnih uređaja kao što su Magellan kompanije Medtronic ili SmartPrep kompanije Harvest. Ova upotreba autologih trombocita, međutim, može da bude ugrožena kod anemičnih pacijenata ili u slučaju kada postoji potreba da se koriste velike količine ili da upotreba traje duži vremenski period. Jedno od najvažnijih ograničenja autologe PRP je potreba za namenskom mašinom ili laboratorijom za pripremu koncentrata trombocita. Da bi bili pogodni za upotrebu, trombociti se aktiviraju kako bi se idukovali da oslobađaju sadržaj svojih alfa granula. Međutim, neophodno je da se PRP iskoristi u roku od nekoliko sati nakon odvajanja od pacijenta, jer u suprotnom postoji rizik da u njoj sadržani faktori rasta izgube značajan deo svoje bioaktivnosti.

[0004] Opisano je nekoliko tehnika za prezervaciju trombocita. Dodavanje DMSO i trehaloze su dva primera pogodnih metoda za produženje prezervacije trombocita, kako za trombocite koji su bili podvrgnuti liofilizaciji (sušenju zamrzavanjem), tako i za one koji nisu. Krioprotektivne kompozicije koje se koriste uz procese liofilizacije dovele su do sličnog rezultata u pogledu prezervacije. Nedostaci ovih pristupa koji samo koriste konzervanse i/ili liofilizaciju na intaktnim trombocitima, odnose se na činjenicu da se proteini, receptori i slično zadržavaju na površini trombocita ili unutar trombocita. Na primer, nekoliko receptora membrane trombocita ostaje intaktno za vezivanje sa ekstracelularnim faktorima kao odgovor na aktivaciju trombocita, npr., za adheziju trombocita, agregaciju itd.

[0005] Stoga bi bilo korisno kada bi na raspolaganju bio univerzalniji postupak koji bi omogućio da se krvne pločice konvertuju u preparat pogodan za efikasnu upotrebu u širokom spektru primena, uključujući zarastanje rana, tretman kože, tretman poremećaja telesnih tkiva (uključujući telesne organe), kao što je plućno tkivo i slično. Stoga, verovatno, rizik od neželjene interakcije ovakvog preparata sa ekstracelularnim faktorima treba da bude minimalan.

[0006] WO2013113024 otkriva postupak pripreme kompozicije koja je pogodna za terapeutsku upotrebu ili za upotrebu kao medijum za gajenje, pri čemu se trombociti koncentruju i podvrgavaju liziranju kako bi se razorila membrana trombocita. Najmanje 30% trombocita može da bude lizirano. Liofilizovani lizati trombocita se formiraju u kompoziciji koja takođe sadrži oslobođene koncentracije dostupnih faktora rasta, citokina i hemokina. WO2013113024 takođe otkriva postupak za lečenje sisarskog tkiva, koji obuhvata korake primene na mestu gde je sisarsko tkivo, radi lečenja, prethodno opisane kompozicije koja uključuje liofilizovane lizate trombocita. U jednom primeru, liofilizovani lizati trombocita se pripremaju od izvornih trombocita, pri čemu je najmanje 30% izvornih trombocita lizirano kako bi se formirali liofilizovani lizati trombocita. Međutim, u lizatu nije smanjen sadržaj fibrinogena i WO2013113024 ne prepoznaje problem infekcije virusom ili patogenom, pa i ne rešava taj problem.

[0007] EP2389942 otkriva postupak za pripremu lizata trombocita koji sadrži faktore rasta, sa smanjenim sadržajem faktora rasta dobijenog iz trombocita (PDGF) i faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF), i sa inaktiviranim virusima, koji je pogodan za in vitro ili ex vivo ćelijsku kulturu i za pospešivanje proliferacije i/ili diferencijacije matičnih ćelija ka osteoblastnoj liniji i/ili hondrocitima. Postupak sadrži korake dovođenja u kontakt i inkubacije koncentrata trombocita sa 0,2 do 5 zap. % rastvarača i/ili deterdženta, u periodu od 5 minuta do 6 sati, na pH od oko 6,0 do oko 9,0, i na temperaturi između 2°C i 50°C, uklanjanja rastvarača i/ili deterdženta ekstrakcijom pomoću ulja kako bi se dobila vodena proteinska faza i inkubacijom vodene proteinske faze sa ugljem kako bi se uklonio rastvarač/deterdžent. Preliminarni korak može da obuhvata pripremu početnog koncentrata trombocita, aferezom ili izolacijom sloja sa leukocitima i trombocitima iz pune krvi, koja može da bude ili sveža ili sa isteklim rokom trajanja i uskladištena tečna, ili sa isteklim rokom trajanja i uskladištena smrznuta. U poželjnom primeru izvođenja, lizat trombocita sadrži faktore rasta TGF-β, IGF, EGF i/ili bFGF. Međutim, postupak otkriven u EP2389942 ima nekoliko nedostataka. Iako bi lizat trombocita mogao da bude pogodan za in vitro ili ex vivo ćelijske kulture, očekuje se da će biti nedovoljno efikasan za kliničku primenu u svrhe regenerativne medicine, uključujući zarastanje preloma kostiju, pošto je za kliničku upotrebu lizata trombocita u regenerativnoj medicini, kao i u zarastanju rana, neophodan kompletan koktel svih faktora koji potiču iz trombocita, posebno PDGF i VEGF. Ekstrakcija rastvaračem daje nizak prinos trombocita, često od samo 10-15 zap. % u odnosu na originalnu zapreminu. EP2389942 ne uključuje korak smanjenja sadržaja fibrinogena i ne uključuje korak liofilizacije. Inaktivacija virusa rastvaračem/deterdžentom primenjiva je samo na viruse sa omotačem, ali nije moguće da se njome inaktiviraju virusi bez omotača kao što su virus hepatitisa A i parovirus B19, a tretman rastvaračem/deterdžentom ne uklanja ni druge potencijalne kontaminante kao što su bakterije ili drugi mikroorganizmi.

[0008] US8734854 otkriva postupak za oslobađanje faktora rasta iz pune krvi ili plazme pacijenta u nedestruktivnom medijumu. Faktori rasta dobijeni ovim postupkom su pogodni za topikalnu primenu na površini rane radi podsticanja zarastanja rana, za injeciranje u meko tkivo kao što je pokidana tetiva, kako bi se podstakao rast i zarastanje tkiva. U drugom postupku faktori rasta se oslobađaju iz izvora pune krvi i suše zamrzavanjem putem konvencionalne liofilizacije. Smrznuti i osušeni proizvod može da se rekonstituiše normalnim fiziološkim rastvorom u cilju lečenja rane pacijenta ili za upotrebu u hirurškoj proceduri. Iako US8734854 otkriva da finalni proizvod može da bude liofilizovan, pokazalo se da je sama liofilizacija nedovoljna da obezbedi pouzdano uklanjanje patogena. Osim toga, faktori rasta dobijeni postupkom iz US8734854 nemaju smanjen sadržaj fibrinogena.

[0009] Drugi poznati faktori rasta koje oslobađaju trombociti uključuju one iz hemoderivata Allogeneic Pooled Human Platelet Lisate koje je razvila kompanija Cambium Medical Technologies. Proizvod još nije prisutan kao komercijalni proizvod i iako se kaže da je u njemu smanjen sadržaj fibrinogena, nema naznaka da je bio podvrgnut tretmanu za redukciju patogena/virusa.

[0010] U brojnim člancima se diskutuje o ulozi faktora rasta koje oslobađaju trombociti kao zamene za fetalni goveđi serum. Pregled je dat u publikaciji Platelet Lysate as Replacement for Fetal Bovine Serum in Mesenchymal Stromal Cell Cultures, Transfus Med Hemother 2013; 40: 326-335.

[0011] EP2757879 otkriva postupak za pripremu lizata trombocita, koji može da deluje kao ko-adjuvans za izolaciju i/ili rast i/ili ekspanziju matičnih ćelija, fibroblasta ili dendritskih ćelija. Postupak se sastoji od koraka (a) izolovanja frakcije sa slojem leukocita i trombocita iz smeše uzoraka pune krvi dobijenih od najmanje dva subjekta; (b) izlaganja izolovane frakcije sa slojem leukocita i trombocita fotohemijskom agensu i UV zračenju kako bi se uklonili svi prisutni kontaminiranjući agensi; (c) podvrgavanja frakcije sa slojem leukocita i trombocita najmanje jednom ciklusu zamrzavanja/odmrzavanja kako bi se postiglo liziranje u njoj sadržanih trombocita; (d) centrifugiranja frakcije i sakupljanje tečne faze. Ovako dobijeni lizat trombocita može da se koristi kao ko-adjuvans za gajenje, rast i/ili ekspanziju matičnih ćelija, posebno mezenhimalnih, mezenhimalnih matičnih ćelija dobijenih iz masnog tkiva, fibroblasta i dendritskih ćelija. Lizat trombocita dobijen postupkom koji je otkriven u EP2757879, međutim, nema smanjen sadržaj fibrinogena, upitno je da li ciklusi zamrzavanja/odmrzavanja mogu da dovedu do efikasnog oslobađanja faktora rasta i da li na aktivnost faktora rasta ponovljeni ciklusi zamrzavanja/odmrzavanja utiču ili ne, i u postupku se koristi samo jedan korak uklanjanja patogena.

[0012] Dostupni su komercijalni lizati trombocita, na primer kompanije Macopharma. Nažalost, ovi lizati su dostupni kao velike zamrznute količine, koje je nakon odmrzavanja potrebno smanjiti na manje alikvote, sa potencijalnim rizikom od mikrobiološke kontaminacije. Lizat humanih trombocita kompanije Millipore, PLTMax, i lizati koje obezbeđuje kompanija Zenbio, takođe su dostupni samo u velikim zamrznutim količinama; namenjeni su samo za istraživačke svrhe, a nisu namenjeni za ex vivo terapeutsku upotrebu.

[0013] Prema T. Burnouf et al., Biomaterials 76 (2016), 371-387, faktori rasta i citokini uskladišteni u granulama trombocita mogu da se oslobađaju direktnom aktivacijom putem dodavanja rastvora soli kalcijum hlorida, formiranjem fibrina i degranulacijom trombocita, ili pomoću trombina. Druge tehnike za indukvanje oslobađanja faktora rasta i drugih biomolekula iz trombocita uključuju ponovljene cikluse zamrzavanja/odmrzavanja, sonifikaciju, samu ili u kombinaciji sa ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja, ili tretman rastvaračem/deterdžentom koji takođe inaktivira viruse sa lipidnim omotačem. Međutim, smatra se da podvrgavanje trombocita ponovljenim ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja utiče na faktore rasta. Rizik od prenošenja infektivnih agenasa se kontroliše tako što se obavezno testira svaka pojedinačna donacija, i što se ne koriste donacije koje su pozitivne na testu. Obavezno testiranje se savetuje za detekciju HIV-1/HIV-2, antitela, površinskog antigena hepatitisa B, antitela na virus hepatitisa C.

[0014] Prema tome, još uvek postoji potreba za postupkom za pripremu faktora rasta dobijenih iz trombocita, koji obezbeđuje optimalan prinos faktora rasta i pokazuje minimalan rizik od prisustva patogena, uključujući viruse sa lipidnim omotačem, bez omotača, i bakterije.

[0015] Stoga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi postupak za pripremu faktora rasta dobijenih iz trombocita, iz koncentrata sisarskih trombocita, koji omogućava da se postigne optimalan prinosa faktora rasta, koji pokazuje minimalan rizik od prisustva virusa sa i bez omotača, bakterija, gljivica i drugih mikroorganizama koji se prenose krvlju.

[0016] U poželjnom primeru izvođenja, cilj ovog pronalaska je da se obezbedi postupak za dobijanje faktora rasta dobijenih iz trombocita sa poboljšanom inaktivacijom patogena ne samo za najčešće patogene, već i za patogene koji ne mogu ili teško mogu da se inaktiviraju postojećim tehnikama.

[0017] Još jedan poželjan primer izvođenja ovog pronalaska ima za cilj da obezbedi sadržaj oslobođen iz trombocita koje je pogodan za upotrebu u regenerativnoj medicini i lečenju rana. Dalji poželjan primer izvođenja ima za cilj da obezbedi sadržaj oslobođen iz trombocita koji može da se koristi kao zamena za fetalni goveđi serum u medijumu za gajenje ćelija.

[0018] Problem obezbeđivanja postupka za pripremu faktora rasta dobijeni iz trombocita, iz koncentrata sisarskih trombocita, a koji obezbeđuje optimalan prinos faktora rasta, pri čemu faktori rasta dobijeni iz trombocita pokazuju minimalan rizik od prisustva patogena, uključujući viruse sa lipidnim omotačem kao i bez omotača, bakterije i druge patogene koji se prenose krvlju, koji su prethodno navedeni, može da se reši, u skladu sa predmetnim pronalaskom, postupkom koji prikazuje tehničke karakteristike karakterističnog dela prvog patentnog zahteva.

[0019] Dakle, postupak za pripremu lizata trombocita koji sadrži faktore rasta, prema ovom pronalasku obuhvata konsekutivne korake

a. podvrgavanja koncentrata trombocita prvom koraku smanjenja koncentracije patogena, sa ciljem da se degraduju i DNK i RNK mikroorganizama prisutnih u koncentratu trombocita;

b. podvrgavanja koncentrata trombocita koraku aktivacije, njegovim dovođenjem u kontakt sa agensom za aktiviranje, kako bi se trombociti indukovali da oslobode najmanje deo alfa granula i u njima prisutnih faktora rasta, čime se obezbeđuje fluidni sadržaj oslobođen iz trombocita;

c. podvrgavanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita koraku smanjenja koncentracije fibrinogena i izdvajanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena; ovaj korak ima za cilj da smanji koncentraciju fibrinogena u fluidnom sadržaju oslobođenom iz trombocita

d. podvrgavanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena, drugom koraku smanjenja koncentracije patogena u cilju razaranja virusa sa omotačem;

e. podvrgavanja sadržaja oslobođenog iz trombocita sterilnoj filtraciji i izdvajanja, iz koraka filtracije, tečnosti filtrata koja sadrži faktore rasta;

f. podele tečnosti filtrata u pojedinačne porcije, pri čemu se zapremina pojedinačne porcije podešava tako da svaka porcija sadrži približno isti broj trombocita; i

g. podvrgavanja tako dobijenih pojedinačnih porcija tečnosti filtrata liofilizaciji.

[0020] Postupak za pripremu lizata trombocita koji sadrži faktore rasta, prema ovom pronalasku, obuhvata konsekutivne korake

(a) podvrgavanja koncentrata trombocita prvom koraku smanjenja koncentracije patogena. U poželjnom primeru izvođenja, prvi korak smanjenja koncentracije patogena obuhvata korak inkubacije koncentrata trombocita sa fotohemijskim aktivnim agensom i izlaganje koncentrata trombocita UV zračenju. Ovaj korak omogućava dobijanje koncentrata trombocita sa smanjenim sadržajem patogena, usled inaktivacije ili prekida RNK i/ili DNK mikroorganizama prisutnih u koncentratu trombocita. Konkretno, dobija se koncentrat trombocita u kome je smanjena koncentracija virusa sa omotačem i bez omotača. Ovaj prvi korak može takođe da omogući da se inaktiviraju drugi mikroorganizmi koji se prenose krvlju sadržani u koncentratu trombocita;

(b) podvrgavanja tako tretiranog koncentrata trombocita koraku aktivacije, dovođenjem u kontakt koncentrata trombocita sa agensom za aktiviranje, kako bi se trombociti indukovali da oslobode najmanje deo svog sadržaja, posebno najmanje deo alfa granula prisutnih u trombocitima kao i sadržaj ovih alfa granula koje uključuju faktore rasta, i da obezbede sadržaj oslobođen iz trombocita. Sadržaj oslobođen iz trombocita će obično imati oblik fluidne kompozicije, koja sadrži ono što preostaje od aktiviranih trombocita i sadržaj trombocita koji je oslobođen u koraku aktivacije. Kao rezultat ovog koraka aktivacije, pored fibrinogena, u kompoziciju ili rastvor koji sadrži koncentrat trombocita, iz trombocita će se osloboditi suprafiziološke doze faktora rasta i citokina. Ovo je važno jer alfa granule obično sadrže većinu faktora rasta. Aktivacija trombocita i njihovih koncentrata kod sisara može da se postigne dovođenjem u kontakt sa aktivatorom trombocita koji može da izazove rupturu trombocita i da izazove oslobađanje najmanje dela sadržaja, uključujući suprafiziološke doze faktora rasta, citokina i hemokina. Pogodni aktivatori uključuju vodene rastvore kalcijumovih soli, na primer kalcijum hlorida, trombin, kolagen, tromboksan A2 i adenozin difosfat (ADP). Dodavanje trombina dovodi do formiranje ogromnog koagulata, koji sadrži gotovo ceo sadržaj koncentrata trombocita. Inkubacija na temperaturi oko telesne temperature, oko 37°C tokom vremena koje je dovoljno dugo, često 3 sata ili više, uzrokuje da se ugrušak smanji na zanemarljivu veličinu, uz ekspresiju svih faktora rasta unutar zarobljenih trombocita. Ovim pronalaskom dakle može da se postigne oslobađanje zapremine faktora rasta suspendovanih u plazmi koja je skoro identična početnoj zapremini koncentrata trombocita.

(c) Podvrgavanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita koraku redukcije fibrinogena i izdvajanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena. Ovaj korak u stvari sadrži korake izolovanja fibrinskog ugruška formiranog nakon interakcije fibrinogena oslobođenog iz trombocita sa agensom za aktivaciju dodatim u prethodnom koraku kako bi indukovao oslobađanje sadržaja trombocita. Preporučljivo je da se fibrinogen koji se oslobađa nakon aktivacije trombocita što je više moguće ukloni iz oslobođenog sadržaja, jer može da dovede do formiranja polučvrstog gela koji može da uzrokuje smetnje kada se krvna plazma sa povećanim udelom trombocita (PRP) dalje koristi, na primer, kao intraleziona injekcija kod povreda mišićno-skeletnog sistema, uključujući tetive, ligamente i zglobove, ili kod podmlađivanja lica ili bilo kog drugog tretmana. Svejedno, koncentracija fibrinogena u krvnim pločicama je niža nego u plazmi. Postupak ovog pronalaska može dalje da sadrži korak izolovanja fibrinogena iz sadržaja oslobođenog iz trombocita i izdvajanja za dalju upotrebu sadržaja oslobođenog iz trombocita, u kome je smanjen sadržaj fibrinogena;

(d) podvrgavanja sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena, drugom koraku smanjenja koncentracije patogena da bi se uništili ili inaktivirali virusi sa omotačem, i izdvajanje vodene proteinske faze koja sadrži faktore rasta. Primarni cilj ovog koraka je da se potvrdi uklanjanje virusa sa omotačem kao što su HBC, HCV sa lipidnim omotačem i HIV virusi sa omotačem. Upotreba dva ortogonalna koraka (korak a i korak d) inaktivacije patogena kao što se radi u predmetnom pronalasku je posebno važna, jer omogućava da se postigne inaktivacija i virusa bez omotača i virusa sa omotačem, kao i inaktivacija većih mikroorganizama kao što su bakterije i parazita kao što su protozoe. Postupak ovog pronalaska time odgovara suštinskom zahtevu savremenih propisa o proizvodima biofarmaceutske industrije dobijenim iz krvi. Ovaj korak osigurava da se rizik od neželjene interakcije sa ekstracelularnim faktorima smanji u najvećoj meri.

(e) podvrgavanja sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena, sterilnoj filtraciji u cilju uklanjanja preostalog čvrstog materijala i bakterija i izdvajanja tečnog ili fluidnog filtrata koji sadrži faktore rasta. Pošto trombociti potiču iz krvi sisara, tečni ili fluidni filtrat će uglavnom biti na bazi vode ili će biti vodeni rastvor koji sadrži proteinsku fazu.

[0021] U prethodno opisanom postupku, poželjno je da se koraci izvode konsekutivno, u opisanom redosledu

[0022] Pored prvog koraka (a) koji dozvoljava da se postigne inaktivacija virusa bez omotača prisutnih u koncentratu trombocita, postupak prema ovom pronalasku takođe obuhvata korak za inaktivaciju virusa sa omotačem, generalno virusa sa lipidnim omotačem, koji mogu da budu sadržani ili u koncentratu trombocita ili u trombocitima kao takvim. Poželjan postupak za postizanje ovoga je podvrgavanje sadržaja oslobođenog iz trombocita rastvaraču i/ili deterdžentu ili kontaktu sa njim, sa ciljem da se rastvore lipidne membrane sadržane u oslobođenom sadržaju i unište nukleinske kiseline koje se u njemu nalaze, nakon čega sledi korak ekstrakcije, poželjno uljem, kako bi se uklonio rastvarač i/ili deterdžent koji sadrži rastvorene lipidne membrane, i korak filtracije u cilju uklanjanja svih preostalih čvrstih materija. Zbog prisustva koraka ekstrakcije i filtracije, virusi sa lipidnim omotačem kao i drugi patogeni poput bakterija i parazita kao što su protozoe, mogu da se inaktiviraju, a lipidi iz plazme i trombocita koji mogu da budu sadržani u inicijalnom koncentratu trombocita, mogu da se uklone. Koraci procesa ekstrakcije uljem i filtracije dozvoljavaju laku, brzu i efikasnu pripremu sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, i u kojima su virusi i bakterije inaktivirani, pri čemu se koncentracije rastvarača i deterdženta uklapaju u granice koje regulatorna tela odobravaju za terapeutske proizvode dobijene iz parenteralne krvi.

[0023] Predmetni pronalazak nam obezbeđuje postupak za pripremu sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktore rasta,, sa kojim je moguće svesti na minimum rizik od prenošenja rezidualnih bolesti koje se prenose krvlju sa izuzetno velikim faktorom, posebno u slučaju trombocitnih proizvoda koji potiču od proizvoda od krvi koji se sistematski podvrgava uklanjanju leukocita. Uklanjanje leukocita, naime, utiče na to da se u velikoj meri, a često i potpuno, gubi sposobnost samosterilizacije krvi. Ovo je važno jer plazma predstavlja optimalan medijum za preživljavanje ili rast širokog spektra patogena.

[0024] Štaviše, zbog odabrane kombinacije tretmana za inaktivaciju patogena može da se osigura apsolutna bezbednost faktora rasta iz trombocita dobijenih predmetnim pronalaskom.

Mogu, dakle, da se obezbede smeše faktora rasta iz trombocita, u kojima su virusi inaktivirani, a koje mogu efikasno da se standardizuju za upotrebu u terapeutskim tretmanima, ćelijskoj terapiji ili gajenju ćelija. Dvostruki korak inaktivacije virusa/patogena kvalifikuje proizvod dobijen postupkom ovog pronalaska da se bezbedno koristi u kliničkim istraživanjima i ekspanziji mezenhimskih matičnih ćelija za in vivo primenu. Kao rezultat toga, eliminiše se potreba da se kod pacijenta koriste autologi trombociti, sa povezanim ograničenjima. Pored toga, umesto nametanja upotrebe autologih trombocita, predmetni pronalazak otvara mogućnost upotrebe sadržaja oslobođenog iz trombocita dobijenih iz pula proizvoda od sisarske, poreklom od nekoliko subjekata, sa minimalanim rizikom od transmisije bolesti koje se prenose krvlju, a koje mogu da potiču od jednog ili više subjekata od kojih potiče koncentrat trombocita.

[0025] Postupak ovog pronalaska nije pogodan samo za pripremanje faktora rasta iz ljudskih trombocita, već takođe može da se koristi uz minimalna prilagođavanja za proizvodnju faktora rasta poreklom od konja, iz životinjskih trombocita, na primer iz trombocita konja, sa sličnim medicinskim primenama. Rekonstituisani liofilizovani faktori rasta iz trombocita mogu dodatno da se koriste kao alternativa fetalnom goveđem serumu u medijumima za gajenje ćelija i u ekspanziji mezenhimskih matičnih ćelija.

[0026] Uzimajući u obzir činjenicu da, delom zbog rizika od bakterijske kontaminacije i gubitka funkcionalne aktivnosti za hemostazu, trombociti obično imaju ograničen rok trajanja od 5 ili 7 dana, prilikom kliničke intravenske primene za korekciju kvantitativne ili funkcionalne trombocitopenije, veliki broj jedinica trombocita starijih od 5 ili 7 dana se obično odbacuje svake godine. Time što omogućava da se zalihe trombocita kojima je istekao rok upotrebe za pripremu proizvoda dobijenih iz trombocita, kao što je sadržaj oslobođen iz trombocita prema ovom pronalasku, postupak prema pronalasku otkriva perspektivan ekonomski interes.

[0027] Ovaj pronalazak dalje dozvoljava da se maksimalno poveća količina dobijene zapremine oslobođenog sadržaja, tako što se koraci procesa izvode po prethodno opisanom redosledu. Savremene tehnike kao što je Mirasol<™>sistem, dozvoljavaju da se velike količine koncentrata trombocita prikupljenih ferezom trombocita podvrgnu inaktivaciji patogena, uz minimalni rizik od smanjenja zapremine sakupljenih trombocita. Pošto se korak ekstrakcije uljem izvodi tek nakon što je izvedena prva virusna inaktivacija, gubitak ili smanjenje količine raspoloživog oslobođenog sadržaja, kao posledica tretmana za uklanjanje patogena, može da se svede na minimum.

[0028] Pošto upotreba ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja može da se izbegne, predmetni pronalazak predstavlja kao dodatnu prednost to što postoji minimalan rizik da faktori rasta dobijeni ovim postupkom pretrpe negativne efekte koji potiču od sadržaja glavnih proteina kao što su albumin i imunoglobulini, kao i od koncentracije drugih faktora rasta u oslobođenom sadržaju koji nisu faktori rasta izvedeni iz trombocita (PDGF) i faktori rasta vaskularnog endotela (VEGF), kao što su TGF-β1, EGF i IGF.

[0029] U poželjnom primeru izvođenja, sadržaj oslobođen iz trombocita koji sadrži faktore rasta, dobijen postupkom ovog pronalaska, mogu da se liofiliziraju u bočicama male zapremine koje u kojima mogu lako da se rekonstituišu u jednom koraku, dodavanjem vode ili fiziološkog rastvora, u skladu sa aktulenim potrebama. Pri tome je zapremina poželjno odabrana tako da sadrži određeni broj faktora rasta koji je dovoljan za jedan tretman. Koncentracija faktora rasta po bočici u jednoj i u različitim serijama može da se standardizuje podešavanjem zapremine oslobođenih faktora rasta koja se sipa u svaku bočicu, prema početnom broju trombocita, tj. količini trombocita koja je podvrgnuta konsekutivnim koracima (a) do (e ) prethodno opisanim u tekstu. U poželjnom primeru izvođenja, tečni filtrat dobijen u prethodno opisanom koraku (e) je podeljen na pojedinačne zapremine, pri čemu je svaka pojedinačna zapremina podešena tako da potiče iz između 2 × 10<5>i 2 × 10<7>trombocita po cm<3>, poželjno oko 2 × 10<6>trombocita po cm<3>. Po želji, sadržaj oslobođen iz trombocita može da bude sa povećanim sadržajem određenog skupa faktora rasta, u zavisnosti od namene. Ako se standardizuje broj faktora rasta po svakoj bočici, može da se izbegne potreba za pravljenjem manjih alikvota od veće količine zaliha, koje nosi potencijalne rizike od kontaminacije i gubitka aktivnosti zbog ponovljenih ciklusa odmrzavanja i zamrzavanja kojima se zaliha mora podvrgnuti da bi bila omogućena ekstrakcija željenog malog alikvota.

[0030] U prethodnom tekstu, izraz „koncentrat trombocita“ odnosi se na bilo koji fluid, bilo biološki ili veštački, koji sadrži trombocite. Neograničavajući primeri takvih fluida obuhvataju različite oblike pune krvi, krvne plazme, plazme bogate trombocitima, koncentrovanih trombocita u bilo kom medijumu, ili slično, dobijene iz sisara, koji mogu biti ljudi ili životinje. Fluid je uglavnom na bazi vode. Dakle, fluid može da bude autolog ili može da bude pul alogenih fluida koji potiču od nekoliko različitih subjekata, na primer iz afereze ili koncentrata trombocita dobijenih iz sloja sa leukocitima i trombocitima sa određenim minimalnim sadržajem trombocita, koji se rutinski pripremaju u bankama krvi. Proizvodnja je obično standardizovana za alogene proizvode na lageru. Koncentrati trombocita se generalno pripremaju korišćenjem postupka sa slojem sa leukocitima i trombocitima u kome se koristi puna krv, PRP postupkom ili trombocita iz afereze, koji potiču iz uskladištenih individualno doniranih porcija krvi. Upotreba ovog poslednjeg je poželjna, posebno kada se dodatno podvrgne redukciji leukocita pre skladištenja. Štaviše, koncentrati trombocita koji ne mogu da se koriste za transfuziju jer su dostigli ograničenje skladištenja od pet do sedam dana, mogu da se zamrznu, čuvaju i koriste kao suplementi za medijum za rast.

[0031] Koncentrat trombocita se može da se održava u plazmi ili u smeši plazme i rastvora aditiva. Da bi se produžio rok trajanja, koncentrati trombocita mogu da se sastoje od velikih količina smrznutih koncentrata trombocita.

[0032] Izraz „koncentrat“ ili „koncentrovanje“ može da se odnosi na odvajanje trombocita iz mase plazme, pune krvi ili drugog fluida u kome je prisutan, ali takođe može da se odnositi na originalni proizvod kao na primer, na punu krv ili plazmu. Centrifugiranje, spektrometrija, filtracija, dekantovanje, gravitaciono taloženje ili druge metode za koncentrovanje trombocita iz fluida koji sadrže trombocite, mogu da se koriste za proizvodnju koncentrata. Kada se trombociti koncentruju, može da bude poželjno da se koristi antikoagulans (posebno za centrifugiranje ili gravitaciono taloženje), zajedno sa izvorom trombocita, kako bi se sprečilo zgrušavanje tokom odvajanja trombocita od drugih komponenti krvi, plazme ili drugih fluida. Izraz „antikoagulans“ se odnosi na kompozicije koje inhibiraju koagulaciju kada se trombociti koncentruju ili sakupljaju za upotrebu u skladu sa primerima prema predmetnom otkriću. Antikoagulansi su generalno dostupni kao inhibitori sinteze faktora zgrušavanja, inhibitori trombina ili antitrombocitni lekovi. Inhibitori sinteze faktora zgrušavanja koji inhibiraju proizvodnju određenih faktora zgrušavanja u jetri, uključuju kompozicije kao što je varfarin (Coumadin). Inhibitori trombina ometaju zgrušavanje krvi blokirajući aktivnost trombina i uključuju kompozicije kao što su heparin i lepirudin (Refludan). Antiagregacioni lekovi stupaju u interakciju sa samim trombocitima i uključuju lekove kao što su aspirin, tiklopidin (Ticlid), klopidogrel (Plavix), tirofiban (Aggrastat), eptifibatid (Integrilin) itd.

[0033] U tekstu koji prethodi, izraz „sadržaj oslobođen iz trombocita“ se odnosi na kompoziciju koja se dobija kada se koncentrat trombocita podvrgne koraku aktivacije i sadržaj oslobođen iz trombocita se izdvoji kao što je prethodno opisano, posebno korak b kao što je prethodno u tekstu opisan.

[0034] U prethodnom tekstu „podvrgavanje koncentrata trombocita koraku aktivacije ili aktivacionom tretmanu“ označava uništavanje trombocita razaranjem njihove ćelijske membrane kako bi se postiglo da trombociti otpuste svoj sadržaj granula, posebno alfa granule sadržane u trombocitima. Aktivirani trombociti mogu da oslobode širok spektar jedinjenja sadržanih u njima, između ostalog, proteine, ćelijske mikro vezikule, na primer mikročestice dobijene od plazma membrane, egzozome, faktore rasta kao što su VEGF, bFGF, PDGF, TGF-β i druge citokine. Ovo može da se uradi hemijski, mehanički, homogenizacijom fluida ili sonifikacijom, ili liziranjem. Ali prema ovom pronalasku, aktivacija se poželjno izvodi dovođenjem u kontakt koncentrata trombocita sa agensom za aktivaciju, jer to omogućava da se maksimalno poveća oslobađanje sadržaja trombocita u fluidni sadržaj oslobođen iz trombocita. Pogodni agensi za liziranje uključuju trombin, kolagen, tromboksan A2 ili ADP i rastvore kalcijumovih soli ili smešu dve ili više ovih stavki. Primer pogodne kalcijumove soli je kalcijum hlorid. Međutim, može da se koristi i bilo koji drugi agens za liziranje koji stručnjak smatra pogodnim.

[0035] Mehaničko liziranje može, na primer, da se izvodi pomoću ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja, tako što se suspenzija trombocita zamrzne, a zatim materijal odmrzne na temperaturi iznad sobne, npr., 30 °C do 45 °C. Ovaj postupak dovodi do bubrenja ćelija i pucanja, pošto se formiraju kristali leda, nakon čega sledi kontrakcija pri odmrzavanju. Ciklično bubrenje i kontrakcija na kraju izazivaju potpuno pucanje i otvaranje trombocita. U zavisnosti od broja ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja, mogu da se postignu različiti stepeni citolize trombocita, npr., najmanje 30%, najmanje 50%, najmanje 70%, najmanje 90% ili do 100% citoloze, određeno brojanjem trombocita . U okviru predmetnog pronalaska mehaničko liziranje može da se uzme u obzir, ali se poželjno izbegava zbog pretpostavljenog gubitka kvaliteta oslobođenog sadržaja.

[0036] Unutar obima ovog pronalaska „liofilizovani sadržaji oslobođeni iz trombocita“ uključuju „liofilizovane sadržaje oslobođene iz plazme bogate trombocitima“ ili „LPRRL“ kao specifičan tip liofilizovanog sadržaja oslobođenog iz trombocita, a da pri tome ipak nisu na njega ograničeni.

[0037] Unutar obima ovog pronalaska „antikoagulans“ je kompozicija koja inhibira zgrušavanje kada se trombociti koncentruju ili sakupljaju za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom. Antikoagulansi su u principu dostupni kao agensi za kompleksovanje/helaciju jona kalcijuma, inhibitori sinteze faktora zgrušavanja, inhibitori trombina ili anti-trombocitni lekovi. Inhibitori sinteze faktora zgrušavanja koji inhibiraju proizvodnju određenih faktora zgrušavanja u jetri, uključuju kompozicije kao što je varfarin (Coumadin). Inhibitori trombina uključuju kompozicije kao što su heparin i lepirudin (Refludan). Anti-trombocitni lekovi interaguju sa samim trombocitima i uključuju lekove kao što su aspirin, tiklopidin (Ticlid), klopidogrel (Plavix), tirofiban (Aggrastat), eptifibatid (Integrilin). itd.

[0038] UV zračenje koje se sprovodi u koraku a postupka ovog pronalaska poželjno uključuje izlaganje sadržaja oslobođenog iz trombocita UVA zračenju, poželjno izlaganje UVA zračenju gustine energije između 1 i 10 J/cm<2>, poželjnije oko 3 J/cm<2>. Izlaganje UV zračenju se poželjno sprovodi nakon što se sadržaj oslobođen iz trombocita inkubira sa fotohemijskim agensom, naročito psoralenom, naročito amotosalenom ili riboflavinom.

[0039] U koraku (d) postupka ovog pronalaska gde se sadržaj oslobođen iz trombocita dovodi u kontakt sa rastvaračem i/ili deterdžentom kako bi se rastvorila membrana virusa sa omotačem ili drugih patogena, poželjno se za inkubaciju koncentrata trombocita koristi rastvarač izabran iz grupe di- ili trialkilfosfata, a poželjno je to tri-n-butilfosfat. Pogodni deterdženti za upotrebu u koraku (d) postupka ovog pronalaska uključuju deterdžente izabrane iz grupe polioksietilenskih derivata masnih kiselina, parcijalnih estara sorbitol anhidrida, nejonskih deterdženata, natrijum deoksiholata i sulfobetaina, a poželjno je Triton X-45, Triton X-100 ili Tween 80.

[0040] Količina ulja koja se koristi u sledećem koraku ekstrakcije sa ciljem uklanjanja rastvarača i/ili deterdženta i komponenti rastvorenih u njima, može da varira u širokom opsegu, ali poželjno se količina ulja kreće od 2 do 20 težinskih %, poželjno od 5 do 15 težinskih %, poželjnije od 5 do 10 težinskih %, na bazi ukupne zapremine smeše koncentrata trombocita i rastvarača i/ili deterdženta. Pri tome, poželjno se koristi ulje farmaceutskog kvaliteta, na primer ricinusovo ulje. U procesu ekstrakcije obično se određena zapremina ulja dodaje u sadržaj oslobođen iz trombocita i podvrgava mućkanju na mešalici za krv tokom određenog vremenskog perioda, obično 30, 20 ili 15 minuta ili manje. Nakon toga, posuda u kojoj se vrši ekstrakcija može da se suspenduje u obrnutom položaju tokom određenog vremenskog perioda, na primer 10 minuta ili manje ili duže, kako bi se dobila gornja faza ulja i donja faza sadržaja oslobođenog iz trombocita, koja se od gornje faze odvaja gravitacijom. Ovaj korak može da se ponoviti jednom ili dvaput ili više puta, u zavisnosti od efikasnosti ekstrakcije.

[0041] Postupak prema predmetnom pronalasku može da uključuje, posle koraka ekstrakcije e, najmanje jedan korak centrifugiranja kako bi se trombociti odvojili od ulja i vodene proteinske faze. Obično se sadržaj oslobođen iz trombocita podvrgava centrifugiranju na niskoj temperaturi, obično ispod 10°C, poželjno ispod 5°C, tipično oko 4°C, poželjno u obrnutom položaju, kako bi se odvojili svi ostaci ulja u gornjoj fazi i sadržaj oslobođen iz trombocita u donjoj fazi koja se dobija gravitacijom.

[0042] Posupak prema predmetnom pronalasku može da uključuje, nakon koraka filtracije e, korak liofilizacije, kako bi se produžio rok trajanja sadržaja oslobođenog iz trombocita. Pre nego što se podvrgne liofilizaciji, tečni ili fluidni filtrat dobijen u koraku e može da se podeli na nekoliko zapremina, pri čemu se zapremina podešava tako da svaka zapremina sadrži sadržaj oslobođen iz predefinisane količine trombocita po cm<3>, na primer sadržaj oslobođen iz oko 2 × 10<5>do 2 × 10<7>trombocita, poželjnije sadržaj oslobođen iz oko 2 × 10<6>trombocita po cm<3>, ali stručnjak u oblasti može da izabere i bilo koju drugu koncentraciju trombocita. Proizvod dobijen postupkom ovog pronalaska kombinuje karakteristike liofilizacije u razumnim zapreminama koje su pogodne za neposrednu upotrebu, bez potrebe za dodatnim deljenjem na pogodne alikvote, sa lakoćom skladištenja i rekonstitucije, i sa smanjenim sadržajem fibrinogena.

[0043] U poželjnom primeru izvođenja, da bi se postigla krio-protekcija faktora rasta, humani albumin se pre liofilizacije uvodi u tečni filtrat dobijen u koraku e.

[0044] U okviru ovog pronalaska, "liofilizacija" se odnosi na proces sušenja zamrzavanjem ili dehidratacije koji se često koristi za konzervaciju trombocita. Međutim, liofilizacija takođe može da se koristi ne samo kao proces za konzervaciju, već i kao tretman za liziranje trombocita, kako bi se trombociti dodatno lizirali nakon početnog zamrzavanja-odmrzavanja ili druge tehnike liziranja. Drugim rečima, u skladu sa primerima predmetnog otkrića, nakon što se oslobađeni sadržaj formira kao što je ovde opisano, liofilizacija obezbeđuje dodatnu korist u vidu konzervacije faktora rasta, citokina, hemokina i drugih sadržaja koji su inicijalno zatvoreni u trombocitima ili vezani za površinu trombocita, ali koji se oslobađaju kada se trombociti liziraju kao što je ovde opisano, npr., zamrzavanjem i odmrzavanjem. Proces se uobičajeno izvodi zamrzavanjem materijala i smanjenjem okolnog pritiska kako bi se omogućilo da zamrznuta voda u materijalu sublimira direktno iz čvrste faze u gasnu fazu.

[0045] Po želji, koncentrat trombocita može da se podvrgne koraku uklanjanja leukocita, pre nego što se podvrgne koraku aktivacije trombocita koji indukuje oslobađanje njihovog sadržaja. Uklanjanje leukocita uglavnom ima za cilj da se smanjenje rizika od pojave neželjenih komplikacija povezanih sa transfuzijom belih krvnih zrnaca prisutnih u jedinicama crvenih krvnih zrnaca i trombocita.

[0046] Postupak prema predmetnom pronalasku je namenjen za pripremanje sadržaja oslobođenog iz trombocita, bogatog faktorima rasta i sa smanjenim sadržajem fibrinogena, iz koncentrata sisarskih trombocita koji mogu da budu ljudski ili životinjski trombociti, na primer trombociti konja. Oslobođeni sadržaj može da bude ili da ne bude liofilizovan.

[0047] Sadržaji oslobođeni iz trombocita, dobijeni postupkom ovog pronalaska, mogu da se koriste za lečenje rana, čireva ili opekotina. Sadržaji oslobođeni iz trombocita mogu da se primenjuju u suvom obliku ili obliku koji je rehidriran pre primene, ili kao gel. Alternativno, čak i ako koža nije oštećena zbog rane, čira ili opekotinoe, može da se koristiti za reparaciju drugih vrsta oštećenja koja nastaju kao rezultat starenja, fotooštećenja, patološke ili degenerativne bolesti ili slično. Koncentracija trombocita u sadržajima oslobođenim iz trombocita koji su dobijeni postupkom ovog pronalaska može da varira u širokim granicama, ali je poželjno je da koncentracija bude što je moguće veća kako bi se postigao maksimalni efekat.

[0048] U prethodno navedenom terminu „rana“ se odnosi na svako oštćenje bilo kog tkiva subjekta, uključujući oštećenje kože, kao i oštećenje dubljeg tkiva. Pri tome, rana može da bude uzrokovana slučajno ili namerno, ili može da bude uzrokovana normalnim tokom patologije, bolesti ili degenerativnog stanja. Na primer, oštećenje može da bude posledica povrede ili operacije. Neograničavajući primeri povreda uključuju čireve, opekotine, slomljene kosti, ubode, posekotine i ogrebotine, razderotine, hirurške rezove, upale, infekcije i slično.

[0049] Sadržaji oslobođeni iz trombocita mogu da se primenjuju postupcima primene koji su poznati stručnjaku, uključujući upotrebu fluida, aerosola, sprejeva, magli, losiona, krema, masti, gelova, žvakaćih guma, nebulizovanih kapljica ili prahova, boca za doziranje, pre -natopljenih tkanina, špriceva, zavoja, dermalnih flastera ili flastera, itd. U poželjnom primeru izvođenja, sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen postupkom ovog pronalaska, može da se čuva u stabilnom obliku u kompletu za upotrebu u hitnim situacijama za lečenje rana. Sadržaj oslobođen iz trombocita može da se rekonstituiše za neposrednu upotrebu kada je to potrebno. U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na aerosol, fluid za tretman, sprej, maglu, losion, kremu, mast, gel, žvakaću gumu, zavoj, dermalni flaster, flaster sa sadržajem oslobođenim iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, dobijen postupkom ovog pronalaska.

[0050] Sadržaji oslobođeni iz trombocita, dobijeni postupkom ovog pronalaska, mogu da sadrže povećane količine faktora rasta, citokina, hemokina, itd. Primeri faktora rasta i drugih materijala koji mogu da budu prisutni u oslobođenom sadržaju uključuju, bez ograničenja, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1, IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1, IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1, KGF-2, fibropeptid A, fibrinogen, albumin, osteonektin, gro-alfa, vitronektin, fibrin D-dimer, faktor V, antitrombin III, a2 makroglobulin, angiogenim, Fg-D i elastazu. Detaljnije, faktori rasta, citokini, i slično, koji mogu da budu prisutni, uključuju, bez ograničenja, LIF, antikancerske faktore rasta kao što su IGFBP3, eikozanoidi, PG ili leukotrieni, IL-1, TNF alfa, INF, TNF, IL-6, IL-1 (a/b), metaboliti prostanoida, komponente komplementa, reaktivne kiseonične intermedijere, metabolite arahidonske kiseline, faktore koagulacije, nitrate i hemokine. Faktori rasta, hemokini, citokini i hormoni humanog porekla mogu da uključuju alfa defensin, alfa sinuklein, beta sinuklein, 4-1 BBL, 6Ckine, kiseli FGF, aktivin A, aktivin R1b, angiopoetin 2, B-DNF, BAFF, BCA-1 , BCA-1 , BD-1, BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPRA1, BDNF, CNTF, CT-GF, CTI_A-4Fc, CXCL1 , CXCL2, kardiotrofin-1 , Kripto, Cistatin C, Dkk-1, EGF AOF, EGF, EMAP II, ENA-78, EPO, eotaksin, FGF bazni AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN alfa A, IFN alfa A/D, IFN alfa D, IFN alfa a2b, IFN, beta 1A, IFN-gama, IGF1, IGFil, IGFBP-4, IGFBP6, ILI alfa, IL-1Beta, IL10, IL11, IL12, IL13, IL15, IL17, IL17A. IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21, IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ITAC, KGF2, Kalikrein1 1, Kalikrein4, Kalikrein7, LEFTY-A, LIF, Leptin, MCSF AOF, MCSF, MCP-1, MCP2, MCP3, MCP4, MDC, MIG, MIP1 alfa, MIP1 beta, MIP3 alfa, MIP3 beta, MIP4, MIP5, midkine, NAP2, NT3, NT4, Neurotaktin, neurturin, Onkostatin, osteoprotegrerin, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, Rank ligand, Rank receptor, RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 alfa, SDF-1 Beta, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARC, TECK, TGF alfa, TGF1 Betal, TGF Beta2, TGF Beta3, TNF beta/limfotoksin, TNF-alfa, TPO, TRAIL, TWEAK i VEGF.

[0051] Sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen postupkom prema predmetnom pronalasku, ima dve glavne indikacije za koje se pokazalo da ima značajnu vrednost, iako se može koristiti i u drugim indikacijama. Prva indikacija je njegova upotreba kao terapeutskog agensa za poboljšanje proliferacije ćelija poreklom od više linija u regenerativnoj medicini i u lečenju rana koje ne zarastaju i rezistentnih čireva. U ovim primenama, primenjeni sadržaj oslobođen iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, pripremljen je ili od ljudskih ili konjskih trombocita. Sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen postupkom ovog pronalaska, može takođe da se koristi u medijumima za gajenje ćelija, naročito matičnih ćelija, fibroblasta ili dendritskih ćelija. Druga indikacija je kao zamena za fetalni goveđi serum u medijumu za gajenje ćelija. Sadržaji oslobođeni iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena, ne podležu neželjenim efektima formiranja gela, a kada oslobođeni sadržaj prođe kroz dva koraka redukcije patogena/virusa, obezbeđuje se bezbednost proizvoda. Kao rezultat toga, autologi koncentrati trombocita više nisu obavezni, a koncentrat sisarskih trombocita koji se koristi u postupku ovog pronalaska može da sadrži pul trombocita koji potiču iz različitih sisarskih subjekata.

[0052] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan u primeru koji sledi.

PRIMER 1

[0053] Čovek je povezan sa mašinom za ferezu (Haemonetics_MCS 9000<a>) da bi se dobio koncentrat bogat trombocitima, sa brojem trombocita 3-5 puta većim od početnog broja trombocita. Koncentrat bogat trombocitima je inkubiran sa riboflavinom i ozračen UV zracima pomoću MIRASOL<™>sistema kao prvi korak redukcije patogena. Zatim je dodat sterilni trombin<b>u odgovarajućoj koncentraciji od 500 jedinica/cmm da bi se aktivirali trombociti u navedenom koncentratu. Ovo je dovelo do naknadnog oslobađanja suprafizioloških doza faktora rasta i citokina iz granula trombocita. Pored toga, aktivirani trombociti oslobađaju u sadržaju alfa granula fibrinogen koji se aktivira trombinom kako bi se formirao nerastvorljivi ugrušak. Kada se centrifugira, koncentrat trombocita tretiran trombinom se odvaja u supernatant koji sadrži bistru svetlo crvenu tečnost ili fluid koji se u suštini sastoji od liziranih trombocita, čiji sadržaj su suprafiziološke doze faktora rasta oslobođenih iz granula trombocita i depozita nerastvorljivog fibrinskog ugruška. Supernatant je prebačen u novi kontejner za dalje korake pripreme. Sadržaj oslobođen iz trombocita je tretiran sistemom rastvarača i deterdženta (0,3% TNBP<c>i 1% Tween 20<d>), tokom 1 sata na 31°C. Ovaj korak je u stanju da uništi viruse sa omotačem (uglavnom HBC, HCV i HIV). Rastvarač i deterdžent su nakon toga uklanjeni u tri konsekutivna koraka ekstrakcije biljnim uljem. Sterilno ricinusovo ulje (7,5% ukupne zapremine) se dodaje u sadržaj oslobođen iz trombocita i smeša se mućka na mešalici za krv 15 minuta, a zatim se posuda suspenduje u obrnutom položaju 10 minuta da bi se dobila gornja uljna faza i donja faza sa lizatom trombocita, koja je gravitacijom odvojena od gornje faze. Ovaj korak se ponavlja još dva puta, zatim se sadržaj oslobođen iz trombocita centrifugira 20 minuta na 4 °C i 1500 g, u obrnutom položaju da bi se odvojili ostaci ulja u gornjoj fazi i sadržaj oslobođen iz trombocita u donjoj fazi koja se dobija gravitacijom.

[0054] Zatim se sadržaj oslobođen iz trombocita podvrgava koraku sterilne filtracije kako bi se osiguralo uklanjanje bilo kakvog bakterijskog kontaminanta, a zatim se tečni ili fluidni filtrat dozira u unapred određenim zapreminama, (podešenim prema početnom broju trombocita u koncentratu kako bi se obezbedio ekvivalent oko 1 milion trombocita po cm<3>) u staklenim bočicama, i liofilizacije ovog filtrata koji se sastoji uglavnom od faktora rasta dobijenih iz trombocita.

PRIMER 2.

[0055] Sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen u primeru 1 je korišćen za postizanje podmlađivanja lica. Jedna bočica koja potiče od 2 × 10<6>trombocita je ubrizgana sa obe strane lica žene u bradu, obraz i nazolabijalni nabor. Crvenilo, bol i otok su se značajno smanjili. Regenerativni efekat traje najmanje 6 meseci.

UPOREDNI EKSPERIMENT.

[0056] Zapremina koja je sadržala 2×10<6>autologih trombocita ubrizgana je sa obe strane lica žene, koja je patila od istih defekata kao u primeru 2. Crvenilo, bol i otok su se smanjili samo u ograničenoj meri.

PRIMER 3.

[0057] Sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen u primeru 1, korišćen je za postizanje ublažavanja bola pri lečenju bolova u donjem delu leđa. Dve bočice koje potiču od 2×10<6>trombocita su ubrizgane u donji deo leđa. Bol se značajno smanjio. Tretman je ponovljen nedelju dana kasnije, injekcijom jedne bočice. Regenerativni efekat je trajao nekoliko meseci.

PRIMER 4.

[0058] Sadržaj oslobođen iz trombocita, dobijen u primeru 1, inkorporiran je u oblogu za rane sa kolagen natrijum alginat hidrogelom, i primenjen na dijabetičke čireve koji nisu mogli da se zaleče više od 6 meseci. U roku od nekoliko dana ostvareno je značajno zarastanje rana.

PRIMER 5.

[0059] Sadržaj oslobođen iz trombocita je pripremljen u skladu sa postupkom iz primera 1, ovog puta koristeći konjsku krv. Dve bočice od kojih svaka potiče od 2×10<6>trombocita su ubrizgane u povređeni mišić konja. Tretman je ponovljen posle nedelju dana. Mišić je zacelio bez zaostale povrede.

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, iz fluidnog koncentrata sisarskih trombocita, koji obuhvata konsekutivne korake

a. podvrgavanja koncentrata trombocita prvom koraku smanjenja koncentracije patogena, sa ciljem da se degraduju i DNK i RNK mikroorganizama prisutnih u koncentratu trombocita;

b. podvrgavanja koncentrata trombocita koraku aktivacije, njegovim dovođenjem u kontakt sa agensom za aktiviranje, sa ciljem da se trombociti indukuju da oslobode najmanje deo alfa granula i u njima prisutnih faktora rasta, čime se obezbeđuje fluidni sadržaj oslobođen iz trombocita;

c. podvrgavanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita koraku smanjenja koncentracije fibrinogena i izdvajanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena;

d. podvrgavanja fluidnog sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem fibrinogena, drugom koraku smanjenja koncentracije patogena u cilju razaranja virusa sa omotačem;

e. podvrgavanja sadržaja oslobođenog iz trombocita sterilnoj filtraciji i izdvajanja, iz koraka filtracije, tečnosti filtrata koja sadrži faktore rasta,

f. podele tečnosti filtrata u pojedinačne porcije, pri čemu se zapremina pojedinačne porcije podešava tako da svaka porcija sadrži približno isti broj trombocita, g. podvrgavanja tako dobijenih pojedinačnih porcija tečnosti filtrata liofilizaciji.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je agens za aktiviranje rastvor koji sadrži jedno ili više jedinjenja odabranih iz grupe u kojoj su kalcijumova so, trombin, kolagen, tromboksan A2 i adenozin difosfat (ADP), poželjno rastvor koji sadrži trombin.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi korak smanjenja koncentracije patogena obuhvata inkubaciju koncentrata trombocita sa fotohemijskim aktivnim agensom i izlaganje koncentrata trombocita UV zračenju.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je UV zračenje UVA zračenje, poželjno UVA zračenje gustine energije između 1 i 10J J/cm<2>, poželjnije, UVA zračenje gustine energije od 3 J/cm<2>.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačen time što je fotohemijski aktivni agens psoralen, posebno amotosalen ili riboflavin.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što drugi korak smanjenja koncentracije patogena obuhvata inkubaciju sadržaja oslobođenog iz trombocita sa rastvaračem i/ili deterdžentom, nakon čega sledi uklanjanje rastvarača i/ili deterdženta i izdvajanje sadržaja oslobođenog iz trombocita, sa smanjenim sadržajem rastvarača i/ili deterdženta.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što je rastvarač za inkubaciju koncentrata trombocita odabran iz grupe di- ili trialkilfosfata, poželjno tri-n-butilfosfat.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 6 ili 7, naznačen time što je deterdžent odabran iz grupe koja sadrži jedno ili više od, polioksietilenskih derivata masnih kiselina, parcijalnih estara sorbitol anhidrida, ne-jonskih deterdženata, natrijum deoksiholata i sulfobetaina, a poželjno je Triton X-45, Triton X-100 ili Tween 80.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 6-8, naznačen time što se rastvarač i/ili deterdžent uklanja iz sadržaja oslobođenog iz trombocita pomoću ekstrakcije uljem.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što se ekstrakcija uljem izvodi u prisustvu količine ulja koja se kreće od 2 do 20 težinskih %, poželjno od 5 do 15 težinskih %, poželjnije od 5 do 10 težinskih %, na bazi ukupne težine smeše koncentrata trombocita i rastvarača i/ili deterdženta.

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje obuhvata najmanje jedan korak centrifugiranja sadržaja oslobođenog iz trombocita, nakon uklanjanja rastvarača i/ili deterdženta u drugom koraku smanjenja koncentracije patogena.

12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što se tečni filtrat deli na pojedinačne porcije koje sadrže oslobođeni sadržaj iz oko 2 × 10<5>- 2 × 10<7>trombocita po cm<3>, poželjno oslobođeni sadržaj iz oko 2 × 10<6>trombocita po cm<3>.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time što se humani albumin uvodi u tečnost filtrata dobijenu u koraku e, pre nego što se tečnost filtrata podvrgne liofilizaciji.

14. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se pre podvrgavanja koncentrata trombocita koraku aktivacije b, koncentrat trombocita podvrgava koraku inaktivacije leukocita.

15. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je koncentrat sisarskih trombocita bogat faktorima rasta iz ljudskih trombocita ili konjskih trombocita.

16. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što koncentrat sisarskih trombocita sadrži pul koncentrata trombocita koji potiču iz različitih subjekata.

17. Sadržaj oslobođen iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, dobijen postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, za upotrebu u regenerativnoj medicini, naročito za jednu ili više primena odabranih iz grupe koju čine pojačavanje proliferacije ćelija poreklom od više linija i pospešivanje zarastanje rana i zarastanja čireva.

18. Upotreba sadržaja oslobođenog iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, dobijenog postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, u jednom ili više medijuma za gajenje ćelija odabranih od matičnih ćelija, fibroblasta ili dendritskih ćelija.

19. Formulacija koja sadrži sadržaj oslobođen iz trombocita, koji sadrži faktore rasta, dobijen postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, izabrana od jedne ili više stavki iz grupe u kojoj su aerosol, fluid za tretman, sprej, magla, losion, krema, mast, gel, žvakaća guma, zavoj, transdermalni flaster, flaster.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

22