NO334811B1 - Anvendelse av vasopeptidase-inhibitorer for fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av nefropati i diabetiske pasienter. - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet anvendelse av vasopeptidase inhibitorer av formel (1) for behandling og/eller profylakse av nefropati i diabetiske eller ikke- diabetiske pasienter, innbefattende diabetisk eller ikke-diabetisk nefropati, glomerulonefiitt, glomerulær sklerose, nefrotisk syndrom, hypertensiv nefrosklerose, mikroalbuminuri eller sluttstadiet nyresykdom, eller insulinresistens eller av metabohske sykdommer forbimdet med avanserte glycerings-sluttprodukter, så som diabetiske komplikasjoner, diabetisk neuropati, diabetisk nefropati, diabetisk retinopati, katarakter, myokardialt infarkt og/eller diabetisk kardiomyopati, eller aterosklerose eller endotelisk dysfiinksjon.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av vasopeptidase-inhibitorer for fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av nefropati i diabetiske pasienter.

Angiotensin-omdannende enzym (ACE) er en peptidyl dipeptidase som katalyserer omdanningen av angiotensin I til angiotensin II. Angiotensin II er en vasokonstriktor som også stimulerer aldosteron-utskillelsen ved den adrenale cortex. ACE inhibering hindrer både omdanningen av angiotensin I til angiotensin II og metabolismen av bradykinin, som resulterer i redusert sirkulerende angiotensin II, aldosteron og forøkede sirkulerende bradykinin-konsentrasjoner. I tillegg til disse neurohormonelle endringene, observeres reduksjon i perifer motstand og blodtrykk, spesielt i individer med høyt sirkulerende renin. Andre farmakologiske effekter forbundet med ACE inhibering omfatter regresjon av venstreventrikulær hypertrofi, forbedring av de kliniske tegnene på hjertesvikt og reduksjon av mortalitet i pasienter med kongestiv hjertesvikt (CHF) eller venstreventrikulær dysfunksjon etter myokardialt infarkt.

Neutral endopeptidase (NEP) er et enzym som er ansvarlig for metabolismen av atrielt natriuretisk peptid (ANP). Inhibering av NEP resulterer i forøkede ANP konsentrasjoner, som i sin tur fører til natriurese, diurese og reduksjon i intravaskulært volum, venøs retur og blodtrykk. ANP frigis ved atrielle myocytter som respons på atriell tøyning (stretch) eller forøket intravaskulært volum. Forhøyede plasmakonsentrasjoner av ANP er demonstrert som en potensiell kompensatorisk mekanisme i forskjellige sykdomstilstander, innbefattende kongestiv hjertesvikt, nyresvikt, essensiell hypertensjon og cirrhose.

Utskillelsen av ANP ved atrielle myocytter forårsaker vasodilatering, diurese, natriurese og inhiberingen av reninfrigivelse og aldosteron-utskillelse. Derimot resulterer angiotensin II i vasokonstriksjon, natrium- og vanngjenabsorbsjon og aldosteronproduksjon. Disse to hormonelle systemene interagerer på en resiprok eller motbalanserende måte for å opprettholde normale fysiologiske vaskulære og hemodynamiske responser.

US patent 5.430.145, europeisk patent EP 481522 og WO 02/083671 Al beskriver tricykliske merkaptoacetylamidderivater av formel (I) nyttige som ACE og NEP inhibitorer, dvs. for behandling og/eller forebyggelse av hjertesvikt og hypertensjon.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot anvendelsen av en forbindelse av formel (II)

hvori

Ri er hydrogen, -CH2OC(0)C(CH3)3eller en acylgruppe;

R2er hydrogen; -CH20-C(0)C(CH3)3; en Ci-C4-alkyl; aryl, -(Ci-C4-alkyl)-aryl; eller difenylmetyl;

X er -(CH2)„ hvor n er et helt tall 0 eller 1, -S-, -O-,

hvori R3er hydrogen, en Ci-C4-alkyl, aryl eller aryl-(Ci-C4-alkyl) og R4er -CF3, Ci-Cio-alkyl, aryl eller aryl-(Ci-C4-alkyl); Bi og B2er uavhengig av hverandre hydrogen, hydroksy, -OR5, hvor R5er Ci-C4-alkyl, aryl eller-(Ci-C4-alkyl)-aryl, eller, når Bi og B2er festet til nabostilte karbonatomer, kan Bi og B2sammen med nevnte nabostilte karbonatomer danne en benzenring eller metylendioksy, hvori "aryl"refererer til en fenyl- eller naftylgruppe usubstituert eller substituert med fra en til tre substituenter valgt fra gruppen bestående av metylendioksy, hydroksy, C1-C4-alkoksy, fluor og klor; og hvori "acyl" betyr en (Ci-C4)alkanoylgruppe, benzoyl eller gruppen

for fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av nefropati i diabetiske pasienter.

I en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelser av en forbindelse av formel (II) hvori Ri er acetyl. I en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse de ovenfornevnte anvendelsene av en forbindelse av formel (II) hvori Ri er hydrogen. I en ytterligere utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse de ovenfornevnte anvendelsene av en forbindelse av formel (II) hvori R2er hydrogen. I en ytterligere utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse de ovenfornevnte anvendelsene av en forbindelse av formel (II) hvori Bi og/eller B2er hydrogen. I nok en ytterligere utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse de ovenfornevnte anvendelsene av en forbindelse av formel (II) hvori X er -CH2.

Ifølge en ytterligere utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse de ovenfornevnte anvendelsene av en forbindelse av formel (I), kjennetegnet ved en forbindelse av formel

(II-A):

hvori Ri er acetyl eller hydrogen.

Strukturen av de foretrukne forbindelsene av formlene (II-A) er av formel (II-B), også betegnet som forbindelse (II-B) eller forb. (II-B), og av formel (II-C) nedenfor:

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "Ci-C4-alkyl" til en mettet, rettkjedet eller forgrenet enverdig hydrokarbonkjede med ett, to, tre eller fire karbonatomer og omfatter metyl, etyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tertiær butyl og lignende grupper. Betegnelsen "Ci-Cio-alkyl" refererer til en mettet, rettkjedet eller forgrenet enverdig hydrokarbonkjede med 1 til 10 karbonatomer og omfatter metyl, etyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tertiær butyl, pentyl, isopentyl, heksyl, 2,3-dimetyl-2-butyl, heptyl, 2,2-dimetyl-3-pentyl, 2-metyl-2-heksyl, oktyl, 4-metyl-3-heptyl og lignende grupper.

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "Ci-C4-alkoksy" til en enverdig substituent som kan bestå av en rett eller forgrenet alkylkjede som har fra 1 til 4 karbonatomer forbundet gjennom et eteroksygenatom og som har den frie valensbindingen fra eteroksygenet og omfatter metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy, sek-butoksy, tert-butoksy og lignende grupper.

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "aryl" til en fenyl- eller naftylgruppe som er usubstituert eller substituert med fra 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av metylendioksy, hydroksy, Ci-C4-alkoksy, fluor og klor. Innbefattet innenfor omfanget av betegnelsen "-(Ci-C4-alkyl)-aryl" er fenylmetyl (benzyl), fenyletyl, p-metoksybenzyl, p-fluorbenzyl og p-klorbenzyl.

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "halogen" eller "hal" til et element fra familien fluor, klor, brom eller jod.

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "acylgruppe" til alifatiske og aromatiske acylgrupper og de som er avledet fra heterocykliske forbindelser. For eksempel kan acylgruppen være en lavere eller (Ci-C4)-alkanoylgruppe så som formyl eller acetyl, en aroylgruppe så som benzoyl eller en heterocyklisk acylgruppe omfattende et eller flere av heteroatomene O, N og S, så som gruppen

Slik betegnelsen her benyttes, er "stereoisomer" en generell betegnelse anvendt for alle isomerer av individuelle molekyler som adskiller seg i orientering av atomene i rommet. Betegnelsen stereoisomer omfatter speilbilde-isomerer (enantiomerer), geometriske (cis/trans eller E/Z) isomerer og isomerer av forbindelser med mer enn ett chiralt senter som ikke er speilbilder av hverandre (diastereoisomerer).

Slik betegnelsen her benyttes, er "R" og "S" anvendt som vanlig innenfor organisk kjemi for å betegne spesifikk konfigurasjon av et chiralt senter. Betegnelsen "R"

(rectus) refererer til den konfigurasjonen av et chiralt senter med en klokkeretnings relasjon av gruppeprioriteter (høyeste til nest laveste) sett langs bindingen mot den laveste prioritetsgruppen. Betegnelsen "S" (sinister) refererer til den konfigurasjonen av et chiralt senter med en mot klokkeretnings relasjon av gruppeprioriteter (høyeste til nest laveste) sett langs bindingen mot den laveste prioritetsgruppen. Prioriteten av grupper er basert på sekvensregler hvor prioritering først baseres på atomnummer (i rekkefølge av avtagende atomnummer). En opplisting og diskusjon av prioriteter finnes i Stereochemistry of Organic Compounds, Ernest L. Eliel, Samuel H. Wilen og Lewis N. Mander, redaktører, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994.

I tillegg til (R)-(S) systemet, kan det eldre D-L systemet også anvendes her for å betegne absolutt konfigurasjon, spesielt med referanse til aminosyrer. I dette systemet er en Fischer projeksjonsformel orientert slik at nummer 1 karbonet av hovedkjeden er ved toppen. Prefiksen "D" anvendes for å representere den absolutte konfigurasjonen av isomeren hvori den funksjonelle (bestemmende) gruppen er på høyre side av karbonet ved det chirale senteret og "L" er den av isomeren hvori det er på venstre side.

Slik betegnelsen her benyttes, betyr "behandle" eller "behandling" enhver behandling, omfattende lettelse av symptomer, eliminering av årsakene til symptomene enten på en temporær eller permanent basis, eller forebyggelse eller retardasjon av tilsynekomsten av symptomer og utviklingen av den angjeldende sykdommen, lidelsen eller tilstanden. Slik betegnelsen her benyttes, betyr "pasient" et varmblodig dyr, så som et pattedyr, som lider av en spesiell sykdom, lidelse eller tilstand. Det skal uttrykkelig understrekes at marsvin, hunder, katter, rotter, mus, hester, kveg, sauer og mennesker er eksempler på dyr som er innenfor omfanget av betegnelsens betydning.

Slik betegnelsen her benyttes, betyr "farmasøytisk akseptabelt salt" ethvert salt, enten det er tidligere kjent eller oppdages i fremtiden, som anvendes av fagmannen innen teknikken og som er et ikke-toksisk organisk eller uorganisk addisjonssalt som er egnet for anvendelse som et farmasøytisk middel. Eksempler på baser som danner egnede salter omfatter alkalimetall- eller jordalkalimetallhydroksider, så som natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumhydroksider; ammoniakk eller alifatiske, cykliske eller aromatiske aminer, så som metylamin, dimetylamin, trietylamin, dietylamin, isopropyldietylamin, pyridin og pikolin. Eksempler på syrer som danner egnede salter omfatter uorganiske syrer, så som for eksempel saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre og lignende syrer, og organiske karboksylsyrer, så som for eksempel eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyruvinsyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre og dihydroksymaleinsyre, benzosyre, fenyleddiksyre, 4-aminobenzosyre, 4-hydroksybenzosyre, antralinsyre, cinnaminsyre, salicylsyre, 4-aminosalicylsyre, 2-fenoksybenzosyre, 2-acetoksybenzosyre, mandelsyre og lignende syrer, og organiske sulfonsyrer så som metansulfonsyre og p-toluensulfonsyre.

Slik betegnelsen her benyttes, refererer "farmasøytisk bærer" til kjente farmasøytiske hjelpestoffer som er nyttige for formulering av farmasøytisk aktive forbindelser for administrering, og som er i det vesentlige ikke-toksiske og ikke-sensitiserende under bruksbetingelsene. Den nøyaktige andelen av disse hjelpestoffene bestemmes ved oppløseligheten og de kjemiske egenskapene av den aktive forbindelsen, den valgte administrasjonsmåten så vel som standard farmasøytisk praksis.

Preparatene av forbindelsen av formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til et objekt som har behov for behandling ved en rekke konvensjonelle administrasjonsfremgangsmåter, innbefattende oralt, topisk, parenteralt, f. eks. intravenøst, subkutant eller intramedullært. Videre kan de aktive preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres intranasalt, som et rektalt suppositorium eller ved anvendelse av en "flash" formulering, dvs. å la medisineringen oppløses i munnen uten behov for å anvende vann.

De aktive preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres alene eller i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere, vehikler eller fortynningsmidler, enten i enkelt- eller multiple doser. Egnede farmasøytiske bærere, vehikler og fortynningsmidler omfatter inerte, faste fortynningsmidler eller fyllstoffer, sterile vandige oppløsninger og forskjellige organiske oppløsningsmidler. De farmasøytiske preparatene dannet ved å kombinere de aktive sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse og de farmasøytisk akseptable bærerne, vehiklene eller fortynningsmidlene administreres lett i en rekke doseringsformer, så som tabletter, pulvere, pastiller, siruper, injiserbare oppløsninger og lignende. Disse farmasøytiske preparatene kan om ønsket inneholde ytterligere bestanddeler, så som smaksgivende midler, bindemidler, hjelpestoffer og lignende. For formålet oral administrering kan følgelig tabletter inneholdende forskjellige hjelpestoffer, så som natriumcitrat, kalsiumkarbonat og kalsiumfosfat anvendes sammen med forskjellige sprengmidler, så som stivelse, alginsyre og visse komplekse silikater, sammen med bindende midler så som polyvinylpyrrolidon, sukrose, gelatin og akasie. I tillegg er smørende midler, så som magnesiumstearat, natriumlaurylsulfat og talk ofte nyttige for tabletteringsformål. Faste preparater av en lignende type kan også anvendes som fyllstoffer i myke og hårde fylte gelatinkapsler. Fortrinnsvis omfatter materialet for dette formålet laktose eller melkesukker og polyetylenglykoler av høy molekylvekt. Når vandige suspensjoner eller eliksirer er ønskede for oral administrering, kan den essensielle aktive bestanddelen deri kombineres med forskjellige søtningsmidler eller smaksgivende midler, fargende materiale eller fargestoffer og, om ønsket, emulgerings- eller suspenderingsmidler, sammen med fortynningsmidler, så som vann, etanol, propylenglykol, glycerol og kombinasjoner derav.

For parenteral administrering kan oppløsninger av de aktive sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse i sesamolje eller peanøttolje, vandig propylenglykol eller i sterile vandige oppløsninger anvendes. Slike vandige oppløsninger bør hensiktsmessig være bufret om nødvendig og det flytende fortynningsmidlet først gjort isotonisk med tilstrekkelig saltvann eller glukose. Disse spesielle vandige oppløsningene er spesielt egnede for intravenøs, intramuskulær, subkutan og intraperitoneal administrering. I denne forbindelse er de sterile vandige mediene som anvendes alle lett tilgjengelige ved standard teknikker som er kjente for fagmannen.

Generelt administreres et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse oralt, parenteralt (f. eks. intravenøst, intramuskulært, subkutant eller intramedullært) eller topisk. For intranasal administrering eller administrering ved inhalering avleveres hensiktsmessig en eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen i form av en oppløsning eller suspensjon fra en pumpespraybeholder som klemmes eller pumpes av pasienten eller som en aerosol-spray presentasjon fra en trykksatt beholder eller en forstøvningsinnretning, med anvendelsen av et egnet drivmiddel, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller annen egnet gass. I tilfellet med en trykksatt aerosol kan doseringsenheten bestemmes ved å tilveiebringe en ventil for å avlevere en utmålt mengde. Den trykksatte beholderen eller forstøvningsinnretningen kan inneholde en oppløsning eller suspensjon av den aktive forbindelsen. Kapsler og patroner (fremstilt for eksempel av gelatin) for anvendelse i en inhaleringsinnretning eller insufflator kan formuleres inneholdende en pulverblanding av en forbindelse ifølge oppfinnelsen og en egnet pulverbasis, så som laktose eller stivelse. For formålene med transdermal (f. eks. topisk) administrering, fremstilles fortynnede sterile, vandige eller delvis vandige oppløsninger (vanligvis i ca. 0,1% til 5% konsentrasjon), for øvrig like de ovenfor omtalte parenterale oppløsningene. Fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige farmasøytiske preparater med en viss mengde av aktiv bestanddel er kjente, eller vil fremgå for fagmannen i lys av foreliggende beskrivelse. For eksempler på fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytiske preparater vises til Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19. utgave (1995).

Nefropati:

Nefropati er en kronisk sykdom som er definert som abnormalitet i utskillelsen av urinært albumin i diabetiske eller ikke-diabetiske pasienter. Urinære albumin ekskresjonsrater er mindre enn, eller lik, 40 mg/24 timer i friske mennesker. De kliniske trinnene av nefropati er mikroalbuminuri, klinisk nefropati (albuminuri) og slutt-stadium nyresykdom (ESRD).

En vanlig form for nefropati er diabetisk nefropati. Diabetisk nefropati utvikles i 35 til 40% av pasienter med type 1 diabetes mellitus og i 10 til 60% av pasienter med type 2 diabetes mellitus, avhengig av den etniske gruppen som undersøkes, og er den vanligste årsaken til slutt-stadium nyresykdom i USA. Det er akseptert at diabetisk nefropati er resultatet av hyperglykemi, enten alene eller i kombinasjon med andre faktorer, så som hypertensjon og genetisk mottagelighet for en nyresykdom. Egnet anti-hypertensiv terapi er vist å signifikant redusere renal og mulig kardiovaskulær mortalitet i proteinuri type 1 diabetes mellitus pasienter, så vel som å retardere hastigheten for reduksjon av glomerulær infiltreringsrate i visse pasienter med svekket nyrefunksjon (Lewis et al., N. Engl. J. Med. 1993, 329, 1456-1462). Følgelig er standardpleien for pasienter med diabetisk nefropati intens glykemisk kontroll og normalisering av blodtrykket ved anvendelse av primære angiotensinomdannende enzym (ACE) inhibitorer, så som ramipril.

Visse vasopeptidase-inhibitorer er vist å vise større nefrobeskyttende effekt enn ACE inhibitorer alene (Molinaro et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2002,2,131-141), så som omapatrilat som en av de tidligst utviklede og mest omfattende undersøkte vasopeptidase-inhibitorene. Chen et al. (Hypertension 2001, 38, 187-191) definerte den renale virkningen av akutt behandling med omapatrilat og ACE inhibitor fosinoprilat, hvor omapatrilat hadde større natriuretisk respons enn ACE inhibitoren. I en annen undersøkelse hadde vasopeptidase-inhibitoren CGS 30440 (Novartis, Sveits) en større nyrebeskyttende effekt enn ACE inhibitoren benazepril (Cohen et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 32, 87-95).

Det er nå vist at vasopeptidase-inhibitorer av formel (I) har en overlegen nefrobeskyttende effekt i albuminekskresjonsrate og er derfor nyttige for behandling og/eller forebyggelse av nefropati i diabetiske pasienter, det vil si diabetisk nefropati..

Effekten av forbindelse (II-B) er 6-8 ganger høyere enn den observert med ACE inhibitoren ramipril.

Eksempel 1 (Referanseeksempel): Reduksjon av proteinuri ved behandling med en forbindelse av formelen (II-B)

Protein- og kreatininutskillelse i urinen av ZDF hannrotter (ZDF Gmi fa/fa) og heterocygotiske kontrolldyr (ZDF Gmi -/+) av 10,17,27 og 37 ukers alder ble bestemt. I ytterligere grupper ble diabetiske rotter kronisk gitt enten ramipril (1 mg/kg/dag, drikkevann) eller en forbindelse av formelen (II-B) (30 mg/kg/dag, foret) over et tidsrom på 10 til 37 uker. Dyrene ble avlivet etter 37 uker, og deres nyre ble undersøkt histologisk.

Histologiske resultater:

I de etterfølgende tabellene er en sammenfatning av funnene på nyrene etter en behandlingsperiode på 6 måneder oppført.

De undersøkte gruppene var:

Histopatologiske funn som ble registrert var:

Armanni-Ebstein celler i nyre tubuluser indikerer en

diabetisk metabolisk tilstand. Glomerulosklerose indikerer kronisk nyreskade grunnet

en diabetisk metabolisk tilstand.

Atrofi: tubulus vanlig spontan degenerativ lesjon i

nyrer.

Avstøpninger (casts): tubulus vanlig spontan lesjon i nyrer.

Diktering: pelvis vanlig spontan lesjon i nyrer, ansett

å være en nedarvet utviklingsanomali.

Armanni-Ebstein celler var ikke til stede i de slanke ZDF kontrollrottene, men i hver gruppe av behandlede fete ZDF rotter.

Glomerulosklerose ble ikke funnet i slanke ZDF kontrollrotter og var heller ikke til stede i dyr behandlet med forbindelse (II-B). Tilsvarende ble degenerative lesjoner, atrofi av tubuluser og tubulære "casts" funnet med lav forekomst i disse dyrene.

Sammenlignet med fete ZDF kontroller i ramipril eller MDL 100.240 behandlede rotter var ingen forskjeller i forekomsten av glomerulosklerose eller assosierte degenerative lesjoner til stede. Disse resultatene indikerer at behandlingen med forbindelse (II-B) kan forhindre utviklingen av "diabetisk" glomerulosklerose og assosierte degenerative lesjoner. Lesjonene i de fete ZDF kontrollrottene var av lav alvorlighetsgrad.

I tillegg ble en høy forekomst av pelvisk diktering registrert i dyr behandlet med forbindelse (II-B).

Forklaring av koder og symboler:

Koder og symboler anvendt ved dyrenivå:

KO = terminal avlivelsesgruppe

Eksempel 2:

Albumin- og kreatininutskillelsen i Goto-Kakizaki (GK) rotter ble bestemt. GK rotter er en modell for type II diabetes. En gruppe forble ubehandlet, en ble behandlet med ACE/NEP inhibitoren av formel (II-B) og en gruppe ble behandlet med ACE inhibitoren ramipril.

Tabell 4: Urinutskillelse av albumin og kreatinin i GK rotter, ramipril-behandlet og rotter behandlet med en forbindelse av formel (II-B) ved start ved en dyrealder på 6 måneder:

Eksempel 3 (Sammenligningseksempel):

Albumin- og kreatininutskillelsen i Wistar rotter ble bestemt. En gruppe forble ubehandlet, en ble behandlet med ACE/NEP inhibitoren av formel (II-B) og en gruppe ble behandlet med ACE inhibitoren ramipril. Wistar rotter er ikke-diabetiske og utvikler proteinuri og strukturell nyreskade under voksenliv. Wistar rotter er derfor en modell for ikke-diabetisk nefropati.

Figur 1 viser aldersrelatert ikke-diabetisk nefropati i placebo-behandlede Wistar rotter (nyre av en placebo-rotte som viser moderate tubulo-interstitielle lesjoner (proteinformige avstøpninger (casts) i tubulene, inflammatorisk celleinfiltrasjon, basofiliske tubuluser)).

I den ikke-diabetiske modellen viser forbindelsen av formel (II-B) en signifikant høyere nefrobeskyttende effekt enn ramipril, som bestemt ved omfanget av proteinuri.

Aldersrelaterte sykdommer

Inkubering av proteiner eller lipider med aldosesukkere resulterer i ikke-enzymatisk glykering og oksidasjon av aminogrupper på proteiner for å danne Amadori addukter. Over tid undergår adduktene ytterligere omordninger, dehydratiseringer og tverrbinding med andre proteiner for å danne komplekser kjente som "Advanced Glycosylation End Products" (AGE'er). Dannelsen av AGE'er kan også beskrives som Maillard reaksjoner. Faktorer som fremmer dannelsen av AGE'er omfatter forsinket protein-turnover (f. eks. som i amyloidose), akkumulering av makromolekyler som har høyt lysininnhold og høye blodglukosenivåer (f. eks. som i diabetes) (Hori et al, J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)). AGE'er er implisert i en rekke lidelser omfattende komplikasjoner forbundet med diabetes og normal elding.

AGE'er viser spesifikk og mettbar binding til celleoverflatereseptorer på endotelceller av mikrovaskulaturen, monocytter og makrofager, glattmuskelceller, mesengialceller og neuroner. Reseptoren for avansert glykerte sluttprodukter (RAGE) er et medlem av immunoglobulin superfamilien av celleoverflatemolekyler.

Forøkede nivåer av RAGE finnes i aldrende vev (Schleicher et al., J. Clin. Invest. 1997, 99,457-468), og den diabetiske retina, vaskulatur og nyre (Schmidt et al., Nature Med. 1995, 1002-1004). Aktivering av RAGE i forskjellige vev og organer fører til et antall patofysiologiske følger. RAGE har vært implisert i en rekke tilstander omfattende: Akutt og kronisk inflammasjon (Hofmann et al., Cell 1999, 97, 889-901), utviklingen av diabetiske senkomplikasjoner, så som forøket vaskulær permeabilitet, nefropati, aterosklerose og retinopati ved akkumulering av AGE'er i nyrene eller annet vev Singh et al., Diabetologia 2001, 44,129-146), så vel som i Alzheimers sykdom (Yan et al., Nature 1996, 382, 685-691), erektil dysfunksjon, tumorinvasjon og metastase (Taguchi et al, Nature 2000, 405, 354-357).

ACE inhibitoren ramipril er kjent for å påvirke serumnivåene av avanserte glykerings sluttprodukter i høyrisikopasienter med koronar arteriesykdom: resultater fra en HOPE undersøkelse (B. Kihovd, E. M. Hjerkinn, I. Seljeflot, T. J. Berg, A. A. Reikvam).

Eksempel 4: Dot blot analyse

Nyreprøver for dot blot analysen ble oppnådd fra 17 uker gamle ZDF hannrotter, kontrollrotter og ZDF rotter behandlet i syv uker med 30 mg/kg/dag forbindelse (II-B) og 35 mg/kg/dag MDL 100.240. Tre dyr fra hver gruppe ble avlivet, nyrene ble fjernet og umiddelbart nedfrosset i flytende nitrogen. Maling av nyren ble utført i flytende nitrogen ved anvendelse av en frysemølle (Freezer 6750, C3 Analysetechnik GmbH). 10 mg nyreprøve ble oppløst i 1 ml fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS inneholdende 0,5 g/liter Tween 20, 0,5 mM PMSF, 1 ug/ml). Oppløsningen ble behandlet to ganger i fem sekunder med en ultralyd-celleoppbryter (45% kraft, Bandolin Sonoplus HD 2070), sentrifugert i 20 minutter ved 4000 omdr/min, og supernatanten ble anvendt for dot blot analyse. Nitrocellulosemembranen ble plassert i dot blot apparaturen og vasket to ganger med 100 ul TBS/brønn. For hver prøve ble 10 ug protein (proteinkonsentrasjon av prøvene ble bestemt med DC proteinanalysen, Bio Rad) fortynnet i 100 ul TBS og plassert på nitrocellulosemembranen (Amersham). Membranen ble inkubert over natten i TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% v/v Tween 20) med 5% ikke-fet tørrmelk ved 4°C og inkubert i 1 time ved romtemperatur ved anvendelse av følgende antistoffkonsentrasjon: anti-CML 011 (Biologo) 0,25 ug/ml, anti-CEL (Biologo) 0,25 ug/ml og anti-pentosidin 012 (Biologo) 0,25 ug/ml. Etter omfattende vasking i TBST med 5% ikke-fet tørrmelk, ble membraner eksponert mot alkalisk peroksidase-merkede anti-mus IgG antistoffer (Dianova) i en time ved romtemperatur. Membraner ble vasket igjen og eksponert mot det forbedrede kjemofluorescens deteksjonssystemet (Amersham) i henhold til fabrikantens instruksjoner. Relativ fluorescens ble bestemt med Fluor-Imager 595 (Molecular Dynamics) og kvantifisert ved anvendelse av Image-Quant software. Resultater ble uttrykt i relativ fluorescens (rf) tider 10<5>.

Verdier for AGE-undertype CML er signifikant høyere i nyrer fra ZDF rotter sammenlignet med kontrollrottene (P<0,05). Ingen signifikant forskjell mellom ZDF og kontrollrotter kunne vises for AGE-undertypene CEL og pentosidin. ZDF rotter behandlet med en forbindelse av formel (II-B) viser signifikant lavere AGE-verdier for AGE-undertype CML, CEL og pentosidin (P<0,05) sammenlignet med ubehandlede ZDF rotter. Lavere AGE-verdier for undertypene CEL og pentosidin kan også bestemmes i ZDF rotter behandlet med MDL 100.240 (P<0,01).

Eksempel 5: Reversfase høyytelse væskekromatografi (RP-HPLC)

Nyre- og hjerteprøver for RP-HPLC-analysen ble oppnådd fra 17 uker gamle ZDF hannrotter, kontrollrotter og ZDF rotter behandlet i 7 uker med 30 mg/kg/dag av forbindelsen av formel (II-B) og 35 mg/kg/dag MDL 100.240. To dyr fra hver gruppe ble analysert. Maling av nyren og hjertet ble utført i flytende nitrogen ved anvendelse av en frysemølle (Freezer 6750, C3 Analysetechnik GmbH). Hydrolyse av organprøvene ble utført med 6 M saltsyre (HC1) ved 110°C i 12 timer. Prøvederivatisering med o-ftaldialdehyd (OPA) og RP-HPLC ble utført som beskrevet i Drusch et al., Food Chem. 1999, 65, 547-553.

ZDF rotter viser signifikant høyere CML konsentrasjon i nyren av 17 og 37 uker gamle rotter og hjertet av 17 uker gamle rotter sammenlignet med kontrollrotter (P<0,05). Behandling med en forbindelse av formelen (II-B) reduserer CML konsentrasjonen i nyren av 17 og 37 uker gamle ZDF rotter, så vel som CML konsentrasjonen i hjertet av 17 uker gamle ZDF rotter. MDL 100.240 reduserer også CML konsentrasjonen i nyre og hjerte av 17 uker gamle ZDF rotter, men ikke i nyren av 37 uker gamle ZDF rotter.

Insulinresistens

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen viser i tillegg til aktivitet i forbindelse med nefropati i diabetiske pasienter også insulinsensitiserende aktivitet. Den profylaktiske virkningen av forbindelsene ved nefropati er også indikasjon på at et insulinsensitiserende middel kan ventes å forhindre, reversere, stabilisere eller retardere utviklingen av mikroalbuminuri til albuminuri. Dette er fordi mikroalbuminuri anses å være en prediktor for fremtidig nefropati, spesielt i pasienter med kliniske tegn på prediabetisk insulinresistens syndrom, alternativt betegnet som Syndrom X.

Anvendelsen av ACE eller vasopeptidase inhibitorer for behandlingen av insulinresistens har hittil ikke vært undersøkt.

Det er nå funnet at forbindelser ifølge oppfinnelsen signifikant reduserer blodglukose-konsentrasjoner og HbAlc-verdier og derved reduserer insulinresistens. HbAicer et mål for langtids glukoseverdier. Glysert HbAicer en tidlig AGE, et såkalt Amadori produkt.

Effekten av en forbindelse av formelen (II-B) på HbAicog blodglukoseverdi er tilsvarende Ml00.240, og begge forbindelser viser lavere verdier enn ACE inhibitoren ramipril.

Eksempel 6 (Referanseeksempel): Blodglukose og HbAicanalyse i ZDF rotter

Blodglukose og HbAicble målt i 10 og 17 uker gamle sukkerdiabetiske fete hannrotter (Genetic Modell Inc.), kontrollrotter (Genetic Modell Inc.) og ZDF hannrotter behandlet i syv uker med 30 mg/kg/dag forbindelse av formel (II-B), 35 mg/kg/dag MDL 100.240 og 1 mg/kg/dag ramipril. Femten dyr ble analysert i hver gruppe.

Blodprøver for glukosebestemmelse ble oppnådd fra ZDF rotter ved anvendelse av standard prøvetakingsrør. Etter 30 minutters samling, ble prøver separert fra cellene ved sentrifugering. Kvantitativ bestemmelse av blodglukose i serum ble utført med en enzymatisk in vitro test fra Roche Diagnostics GmbH (Gluco-quant, Roche Diagnostics GmbH) ved å anvende den automatiserte kliniske kjemianalyseringsinnretningen Boehringer Mannheim/Hitachi 912.

For å oppnå blodprøver for HbAicbestemmelse, ble engangs kapillærrør anvendt. HbAicverdier ble oppnådd fra hemolyserte fullblodsprøver med en turbidimetrisk inhiberingsimmunoanalyse (Tina-quant, Roche Diagnostics GmbH) og hemoglobin-konsentrasjoner ble bestemt i en annen kanal på den automatiserte kliniske kjemianalyseringsinnretningen (Boehringer Mannheim/Hitachi 912). HbAickonsentrasjon i prosent ble berergnet fra HbAictil totalt hemoglobin.

Blodglukosekonsentrasjon og HbAicverdier er signifikant lavere i kontrolldyr sammenlignet med ZDF rottene (P<0,01). De 17 uker gamle ZDF hannrottene behandlet med MDL 100.240 eller forbindelse (II-B) viser også signifikant lavere blodglukosekonsentrasjon og HbA]Cverdier sammenlignet med de ubehandlede ZDF rottene. Ingen signifikant forskjell for blodglukose eller HbAickan vises i ramipril-behandlede 17 uker gamle ZDF rotter sammenlignet med de ubehandlede ZDF rottene.

Endotelisk dysfunksjon og aterosklerotiske plakk

I den aterogeniske kaninmodellen (hvite New Zealand kaniner ble foret med 0,25%

kolesterol pluss 3% kokosnøttolje) ble det vist at sågar en kort periode med aterogenisk diett på 6 uker allerede fører til en vedvarende endotelisk dysfunksjon, selv om dyrene deretter i 3 måneder mottok en normal diett. I alle forsøk som er kjent hittil blir dyrene foret konstant under hele tidsforløpet med aterogenisk diett og hadde ufysiologiske, ekstremt høye kolesterolnivåer som ikke er sammenlignbare med situasjonen i mennesker.

Den endoteliske dysfunksjonen så vel som de aterogeniske endringene i blodkarene ble både forhindret og reversert ved behandling med ACE/NEP inhibitoren av forbindelsen med formel (II-B), for første gang undersøkt og vist i direkte sammenligning med ACE inhibitoren ramipril. Som mål for den endoteliske dysfunksjonen tjente den endoteliumavhengige relaksasjonen på isolerte aortaringer fra kaniner så vel som nitrogenoksid- og superoksidfrigivelse fra de endoteliske cellene.

Eksempel 7 (Referanseeksempel): Effekter av langvarig behandling med ACE/NEP inhibitoren av forbindelsen av formel (II-B) på endotelisk dysfunksjon og aterosklerotiske plakk i kaniner foret med en aterogenisk diett.

Grupper:

Standard: 18 ukers normal diett

Aterogenisk: 18 ukers aterogenisk diett (3% kokosnøttolje + 0,25% kolesterol) Variert diett (Var.): 6 ukers aterogenisk diett + 12 ukers normal diett

Variert diett + ramipril: 6 ukers aterogenisk diett + 12 ukers normal diett + ramipril Variert diett + forbindelse (II-B): 6 ukers aterogenisk diett + 12 ukers normal diett + forbindelse (II-B).

NO og O2" er markører for endotelisk funksjon: forøket relaksasjon og NO-nivåer er fordelaktig, mens forøket O2" dannelse inhiberer de fordelaktige effektene av NO.

Claims (8)

1. Anvendelse av en forbindelse med formel (II)

hvori Ri er hydrogen, -CH20C(0)C(CH3)3, eller en acylgruppe; R2er hydrogen; -CH20-C(0)C(CH3)3; en d-C4-alkyl; aryl, -(Ci-C4-alkyl)-aryl; eller difenylmetyl; X er -(CH2)nhvori n er et heltall 0 eller 1, -S-, -O-,

hvori R3er hydrogen, en Ci-C4-alkyl, aryl eller aryl-(C]-C4-alkyl) og R4er -CF3, Ci-Cio-alkyl, aryl, eller aryl-(Ci-C4-alkyl); Bi og B2er hver uavhengig av hverandre hydrogen, hydroksy, -OR5, hvori R5er Ci-C4-alkyl, aryl, eller -(Ci-C4-alkyl)-aryl eller, når Bi og B2er festet til nabostilte karbonatomer, kan Bi og B2sammen med nevnte nabostilte karbonatomer danne en benzenring eller metylendioksy, hvori 'aryl' refererer til en fenyl- eller naftylgruppe unsubstitutert eller substitutert med fra en til tre substituenter valgt fra gruppen bestående av metylendioksy, hydroksy, Ci-C4-alkoksy, fluor og klor; og hvori "acyl" betyr en (Ci-C4)alkanoylgruppe, benzoyl eller gruppen

for fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av nefropati i diabetiske pasienter.

2. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori Ri er acetyl.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori Ri er hydrogen.

4. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori Bi og/eller B2er hydrogen.

5. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori X er -CH2.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen av formel (II) er kjennetegnet ved en forbindelse av formelen (II-A):

hvori Ri er acetyl eller hydrogen.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen av formel (II) er kjennetegnet ved en forbindelse av formel (II-B)

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen av formel (II) er kjennetegnet ved en forbindelse av formel (II-C)