NO20121254A1 - Forbindelse og sammensetning for kontroll av parasitter - Google Patents

Abstract

Det beskrives carvacrol og/eller tymol eller en sammensetning omfattende en eller begge av disse aktive forbindelser for anvendelse i behandling av lusangrep på fisk og en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere lus, fortrinnsvis innen fiskeoppdrettsindustrien, og likeledes et fôr for fisk.

Description

Området for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører carvacrol og/eller tymol, eller en sammensetning omfattende én eller begge av de aktive forbindelsene, og en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere lus i fisk. Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av carvacrol og/eller tymol for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for å fore en fisk.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Smittsomme parasittiske sykdomsutbrudd er et alvorlig problem i akvakultur av mange forskjellige arter. Økonomiske tap forårsaket av disse sykdommer kan være voldsomme og betydelig forskningsinnsats har vært dedikert for å behandle og forebygge disse sykdommene i akvakulturproduksjon. I tillegg er de parasittiske angrep i oppdrettede akvatiske dyr ikke bare skadelig for de kultiverte dyrene, men de representerer også en konstant og alvorlig trussel for ville populasjoner som kan bli smittet av oppdrettsdyr. Dette er en annen grunn til hvorfor en effektiv kontroll og behandling av parasitter og andre smittsomme sykdommer er av stor viktighet ut fra et miljømessig synspunkt.

Alvorlige sykdomsutbrudd forårsaket av ektoparasittiske marine lus ("sea lice") har i mange år og inntil i dag utgjort et økende problem i lakseproduksjon i land så som Norge, Chile, Skottland, Irland og Canada. Angrep av oppdrettsfisk, særlig av atlantisk laks, Salmo salar, av de ektoparasittiske kopepodene Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus og Caligus rogercresseyi er ikke bare skadelig for fisken, men de kan omsider også føre til økt dødelighet i alvorlige tilfeller av infeksjoner.

Angrep av lus (for eksempel Caligus rogercresseyi og L. salmonis) er for tiden en av de viktigste helsemessige utfordringer for produksjons av laks. Denne eksterne parasitten forringer produksjonseffektiviteten, forårsaker stress og skader på fisken og er som en sekundær infeksjon en mulig vektor for andre patogener, så som laksealfavirus (for Pancrease Disease), infeksiøs lakseanemivirus (ISAv) og Piscirickettsia salmonis. I Chile, som i mange andre land som produserer laksefisk, har angrepshyppigheten økt betydelig og påvirker hovedsakelig arter så som atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss) og sølvlaks { Oncorhynchus kisutch). I Norge er luseinfeksjoner betraktet som en av de mest alvorlige helseproblemer i akvakultur av laks. Denne høyere angrepsraten er sannsynligvis en konsekvens av en kombinasjon av faktorer, blant annet at lusen har utviklet utstrakte resistenser til de fleste av de anvendte kjemiske antiparasittmidler som brukes i behandlingen per i dag.

Vanligvis anvendte kjemoterapeutiske midler for behandlingen av lusinfeksjoner er for eksempel tilhørende gruppen av organofosfater, pyretroider, hydrogenperoksider, kitin synteseinhibitorer og emamektin. Resistenser, som innbefatter også ofte multiple og kryssresistenser, resulterer imidlertid ofte i begrenset suksess ved anvendelse av mange av de ovenfor nevnte vanligvis brukte antilusforbindelser.

Giftigheten av mange farmakologisk effektive forbindelser for de behandlete dyrene, samt en begrenset biologisk nedbryting, er begrensende for deres anvendelse for akvakulturformål. Fortrinnsvis bør forbindelsene være ikke-toksisk for fisken i de anvendte konsentrasjoner, og på grunn av miljøspørsmål, bør forbindelsene være raskt og enkelt nedbrytbare i det naturlige miljøet uten noe uønsket og skadelig akkumulering i næringskjeden. Når de tilføres med dietten, bør forbindelsene enten nedbrytes eller utskilles av organismen etter en rimelig tidsperiode. Dette er særlig viktig fordi oppdrettsdyr til slutt konsumeres av mennesker.

Derfor er det veldig viktig å finne nye forbindelser og måter å behandle og forebygge ektoparasittinfeksjoner i fisk, særlig av lus.

Det objektive tekniske problem ved den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe nye effektive midler og framgangsmåter for dreping av kopepod ektoparasitter, og/eller hemming av angrep av ektoparasitter i fisk, så som lus og andre kopepod-parasitter.

Sammendrag av oppfinnelsen

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører carvacrol og/eller tymol eller en sammensetning omfattende én eller begge av disse aktive forbindelser for anvendelse i behandling og/eller profylakse av ektoparasittisk kopepod infeksjon og/eller angrep i en fisk.

Fortrinnsvis, nevnte ektoparasittiske kopepod er en lus.

Fortrinnsvis, nevnte lus er valgt blant Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus og Caligus rogercresseyi.

Fortrinnsvis, forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, mest foretrukket ca. 1:1 basert på vekt.

Fortrinnsvis, nevnte fisk er en laksefisk, og mer foretrukket en fisk valgt blant gruppen som består av atlantisk laks { Salmo salar), regnbueørret { Onchorhynkuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

Fortrinnsvis, de aktive forbindelser anvendes for reduksjon i totalt antall voksne former av lus som angriper eller re-angriper fisken.

Fortrinnsvis, carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning i en total konsentrasjon på mellom 0,001 % til 0,8% av foret, fortrinnsvis 0,003% til 0,6% og mer foretrukket mellom 0,003 og 0,012 vekt% av foret.

Fortrinnsvis, den totale konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol er 30 mg/kg eller mer, mer foretrukket 45 mg/kg for eller mer, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

Fortrinnsvis, carvacrol og tymol er i et forhold av 1:1.

Foretrukket, foret omfatter andre konvensjonelle foringredienser i fiskeforet.

Fortrinnsvis, foret omfatter ytterligere én eller flere av følgende ingredienser valgt blant gruppen som består av nukleotider, prebiotika, vitamin C og immunstimulanter, som kan være spesifikke eller ikke-spesifikke.

Fortrinnsvis, forbindelsen eller sammensetningen forsynes til fisk i minst 7 dager, mer foretrukket minst 21 dager og mest foretrukket minst 28 dager.

Fortrinnsvis, behandlingen med de aktive forbindelser kombineres med andre kjemiske og medisinske midler mot lus.

Foretrukket, de aktive forbindelser anvendes spesifikt til å bekjempe visse livsformer av lusen.

Foretrukket, de aktive forbindelser anvendes for å redusere angrep av gravide hunnkjønnlus på fisken.

Foretrukket, fisken fores kontinuerlig med foret som omfatter de aktive forbindelser som en del av deres daglige diett.

Foretrukket, den aktive forbindelse eller forbindelser appliseres i form av en vannbadbehandling.

Et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere ektoparasittiske kopepoder, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere carvacrol og/eller tymol eller en sammensetning omfattende én eller begge av de aktive forbindelser for å drepe lusen, for å gjøre de døsige eller å hindre angrep på fisken.

Fortrinnsvis, nevnte ektoparasittiske kopepod er en lus.

Foretrukket er lusen Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus eller Caligus rogercresseyi.

Fortrinnsvis, nevnte fisk er en laksefisk, fortrinnsvis valgt blant gruppen som består av atlantisk laks { Salmo salar), regnbueørret { Onchorhynkuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

Fortrinnsvis, nevnte aktive forbindelse, blanding av forbindelser eller sammensetning appliseres til et lokus som skal beskyttes mot parasittene.

Fortrinnsvis, nevnte lokus er et vandig miljø hvor den aktive forbindelse eller sammensetning som omfatter den aktive forbindelse appliseres direkte til det vandige lokus.

Fortrinnsvis, nevnte lokus inneholder fisk og hvor nevnte lus er lokalisert på nevnte fisk eller nevnte fisk er mottakelig til angrep eller infeksjon av nevnte lus, hvor den aktive forbindelse eller blanding av forbindelser appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis med topikal eller oral applisering.

Fortrinnsvis, den aktive forbindelse eller blanding av forbindelser appliseres til fisken som en komponent i foret som gis fisken.

Fortrinnsvis, forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.

Fortrinnsvis, én eller flere av de aktive forbindelser eller en sammensetning omfattende de aktive forbindelser forsynes til fisken som en del av foret i minst 7 dager, mer foretrukket minst 21 dager, og mest foretrukket minst 28 dager.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av carvacrol og/eller tymol for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling og/eller profylakse av ektoparasittisk kopepod infeksjon og/eller angrep i en fisk.

Fortrinnsvis, nevnte ektoparasittiske kopepod er en lus.

Fortrinnsvis, nevnte lus er valgt blant Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus og Caligus rogercresseyi.

Fortrinnsvis, forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, mest foretrukket ca. 1:1 basert på vekt.

Fortrinnsvis, nevnte fisk er en laksefisk.

Mer foretrukket, nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

Fortrinnsvis, den farmasøytiske sammensetning er for reduksjon av det totale antall voksne lusformer som angriper eller re-angriper fisken.

Fortrinnsvis, den farmasøytiske sammensetning som omfatter carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning i en total konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol fra 0,001 % til 0,8% av foret, fortrinnsvis fra 0,003% til 0,6% og mer foretrukket fra 0,003 og 0,012 vekt% av foret.

Fortrinnsvis, den farmasøytiske sammensetning omfattende carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning, som har en total konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol på minst 30 mg/kg for, fortrinnsvis minst 45 mg/kg for, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

Fortrinnsvis, nevnte carvacrol og tymol er i et forhold 1:1.

Foretrukket, foret omfatter andre konvensjonelle foringredienser i fiskeforet.

Fortrinnsvis, foret omfatter ytterligere én eller flere av følgende ingredienser valgt blant gruppen av nukleotider, prebiotika, vitamin C og immunstimulanter, som kan være spesifikke eller ikke-spesifikke.

Fortrinnsvis, forbindelsen eller sammensetningen forsynes til fisken i minst 7 dager, mer foretrukket minst 21 dager og mest foretrukket minst 28 dager.

Foretrukket behandlingen med den aktive forbindelse kombineres med andre kjemiske eller medisinske midler mot lus.

Fortrinnsvis, de aktive forbindelser anvendes spesifikt for å bekjempe visse livsformer av lusen.

Foretrukket, de aktive forbindelser anvendes for å redusere angrep av gravide hunnkjønnlus på fisken.

Fortrinnsvis, fisken mates kontinuerlig med foret omfattende de aktive forbindelser som del av deres daglige forinntak.

Fortrinnsvis, den farmasøytiske sammensetning appliseres i form av en vannbadbehandling.

I et fjerde aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et for for fisk omfattende carvacrol og/eller tymol i en total konsentrasjon på 0,001 % til 0,8% av foret, fortrinnsvis 0,003% til 0,6% og mer foretrukket mellom 0,003 og 0,012 vekt% av foret.

Fortrinnsvis, den totale konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol er minst 30 mg/kg, fortrinnsvis minst 45 mg/kg for, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

Fortrinnsvis, forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, mest foretrukket ca. 1:1 basert på vekt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Utførelser av oppfinnelsen skal nå beskrives ved hjelp av eksempler hvor det henvises til følgende figurer, hvori;

Figur 1 viser den observerte dødelighet av kopepoditter av C. rogercresseyi (i forhold til antall lus ved starten av studien), over en periode på 48 timer ved forskjellige doser av carvacrol. Hvert panel representerer et tidspunkt (null til 48 timer) fra starten av studien. Figur 2 viser prosentvis dødelighet av kopepoditter av C. rogercresseyi utsatt for forskjellige doser av carvacrol (ul/l) i løpet av 48 timer. "Error bars" representerer standardavvik oppnådd for replikatene i hver dose av carvacrol. Figur 3 viser den observerte dødelighet av voksne C. rogercresseyi (1 forhold til starten) over en periode på 48 timer ved forskjellige doser av carvacrol. Figur 4 viser prosentvis dødelighet av voksne C. rogercresseyi utsatt for forskjellige doser av carvacrol (pl/1) i løpet av 48 timer. "Error bars" representerer standardavvik oppnådd for replikatene i hver dose av carvacrol. Figur 5 viser forholdet (%) for reduksjon i forventete lus (C. rogercresseyi) angrep på fisken når de er foret to doser av carvacrol + tymol () i foret i sammenlikning til kontrollforet. Figur 6 viser (for eksempel 4) foret konsumert av fisken i hver behandling gjennom forsøket, a) Spesifikk foringsrate (SFR) for fisk foret med høy dose av carvacrol, b) SFR for fisk foret med lav dose av carvacrol og c) SFR for fisk foret med kontrollfor. Figur 7 viser (for eksempel 4) lus (C. rogercresseyi) angrep uttrykt som totalt antall av lus per beholder som inneholder 35 fisk, hvor punkt er gjennomsnittlig angrep og linjene indikerer troverdige intervaller (95%) i hver dosering (lav og høy) og kontroll. Figur 8 viser forventet gjennomsnittlige Caligus-tellinger over hele monitoreringsperioden (posterior median) for hvert livstrinn og behandling med 95% pålitelighetsintervaller (feilmargin) (eksempel 5, eksperiment 1). Figur 9 viser forventete Caligus reangrepstellinger (reinfestion counts) (posterior median, heltrukne linjer) for ungfisk, voksne og totalt lus med hver behandling med 95% pålitelighetsintervaller (skravert område, vist kun for 0 og 120 ppm). Svart linje indikerer kontroll med 0 ppm (eksempel 5, eksperiment 2). Figur 10 viser forventet Caligus reangrepstellinger for gravide hunkjønn, hunkjønn og voksne for hver behandling med 95% pålitelighetsintervaller (skyggelagt område). Svart linje betyr kontroll (eksempel 5, eksperiment 2). Figur 11 viser lineære og kvadratiske koeffisienter for doseresponsmodellen med 95% pålitelighetsintervaller for hver prøvedag (eksempel 5, eksperiment 2). De kvadratiske effekter forstørres (x 100) for å gjøre dem synlige i det samme plott som de lineære termer. Se tekst for forklaring.

Eksperimentell del

Eksempel 1 - Effekt av carvacrol på kopepoditter av Caligus rogercresseyi

Vi har testet forbindelsen carvacrol mot kopepoditter av Caligus rogercresseyi ved en in vitro metode.

Formålene med denne studie er å; i) bestemme om carvacrol forårsaker dødelighet av kopepoditter av Caligus rogercresseyi, og ii) å bestemme LD50 (dødelig dosering som forårsaker 50% dødelighet) av carvacrol mot kopepoditter av Caligus rogercresseyi in vitro.

Materialer og metoder

En studie ble gjennomført i løpet av januar 2009 for å bestemme LD50 av carvacrol mot kopepodittstadier av Caligus rogercresseyi i de eksperimentelle fasiliteter ved EWOS Innovation, Puerto Montt, Chile.

Kopepoditter for undersøkelsen kom fra dyrkingsenheten av Caligus rogercresseyi i Fundacion Chile eksperimentelle fasiliteter, lokalisert i Puerto Montt, Chile. Lusene benyttet i denne undersøkelsen ble tatt etter 9 generasjoner Caligus, som ble dyrket under kontrollerte betingelser uten eksponering til antilusforbindelser.

Tjueåtte (28) petriskåler ble fylt med 40 ml av mikrofiltrert (5 um), luftet og sterilisert sjøvann (med UV lys ved 70 uW/cm<3>). Ved begynnelsen av undersøkelsen ble 10 kopepoditter plassert i hver petriskål. Sju doser av carvacrol ble testet ved anvendelse av fire replikater per dose. Dosene som ble testet var: 0,1,5, 3,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 ul/l. Kontrollgruppen omfattet kopepoditter som bare ble eksponert til sjøvann.

Alle petriskålene ble plassert i et inkubasjonskammer med konstant temperatur innstilt på 14°C. Dødeligheten av kopepodittene ble evaluert ved 0, 1, 6, 16, 24 og 48 timer av inkubering. Beskrivelsen av de forskjellige behandlinger er vist i tabell 1. De oppnådde dataene ble analysert ved anvendelse av "R language" og dets korresponderende pakker (http://www.r-project.org/). LD50 ble modellert ved hjelp av en generalisert lineær modell ved bruk av binomial modell med logit link (http://cran.r-project.org/doc/manuals/fullrefman.pdf).

Resultater og diskusjon

Dataene viser at den høyeste dose av carvacrol (20 pl/1) induserer 100 % dødelighet etter 3 timer av eksponering (figur 1). Videre ble det observert at kopepodittene ble letargiske ved doser over 7,5 ul/l etter få minutter av eksponering til carvacrol (>2 min).

Som et monoterpenoid, er carvacrol lipofil og derfor mener vi at en mulig virknings-mekanisme er passering av celleveggen og cytoplasmamembranen og oppbryting av strukturelle sjikt av polysakkarider, fettsyrer og fosfolipider fra cellene. Ingen negative effekter av carvacrol har blitt beskrevet eller rapportert for salmonider.

En tid-dose-responskurve kan observeres som indikerer at når konsentrasjonen av carvacrol øker, skjer dødeligheten av lusene tidligere (figur 2). Alle doser over 5 ul/l induserer 100 % dødelighet av kopepodittene (figur 2).

Resultater av LD50 analysene er vist i tabell 2. Det kan observeres at den LD50 for kopepoditter har en nedre og øvre tillitsgrense av 1,87 ul/l og henholdsvis 3,33 ul/l etter 48 timer av eksponering til carvacrol med en beregnet LD50 av 2,58 ul/l.

I den foreliggende LD50 undersøkelse var det mulig å oppnå smale pålitelighets-grenser, som ikke var langt fra den beregnete LD50 (2,58 ul/l) som ble oppnådd. Dette resultatet øker nøyaktigheten av beregningen.

Resultatene viste at carvacrol induserte en høy dødelighet av kopepoditter av Caligus rogercresseyi ved alle eksponeringstider som ble testet i det foreliggende eksperimentet (tabell 2).

Følgende konklusjoner kunne oppnås fra dette eksperimentet:

1. Carvacrol induserer høy dødelighet for kopepoditter av Caligus rogercresseyi ved de testede konsentrasjoner i dette eksperiment. 2. Den beregnete LD50 for carvacrol var 2,58 ul/l, med smal pålitelighetsgrense.

Eksempel 2 - Effekt av carvacrol på voksne stadier av C. rogercresseyi

I eksempel 1 var det mulig å vise at carvacrol har antilusaktivitet mot kopedittstadier av Caligus rogercresseyi. Derfor var neste trinn å bestemme om carvacrol har en liknende aktivitet mot voksenstadier av C. rogercresseyi.

Formålet med dette eksperimentet er å bestemme LD50 av carvacrol mot voksne Caligus rogercresseyi in vitro.

Materialer og metoder

En studie ble gjennomført i løpet av januar 2009 for å bestemme LD50 av carvacrol mot voksne stadier av Caligus rogercresseyi i eksperimentfasilitetene til EWOS Innovation, Puerto Montt, Chile.

Voksne Caligus for undersøkelsen kom fra dyrkingsenheten av Caligus rogercresseyi i Fundacion Chile, eksperimentelle fasiliteter, lokalisert i Puerte Montt, Chile. De voksne benyttet i denne undersøkelsen ble oppnådd etter 9 generasjoner av Caligus dyrket under kontrollerte betingelser uten noen eksponering til antilusforbindelser.

Tjuefire (28) petriskåler ble fylt med 40 ml av mikrofiltrert (5 um), lufttilsatt og sterilisert sjøvann (med UV lys ved 70 uW/cm<3>). Ved begynnelsen av undersøkelsen ble 10 voksne plassert i hver petriskål. Syv doser av carvacrol ble testet ved bruk av fire replikater per dose. De testete dosene var: 0; 1,5; 3,5; 5,0; 7,5; 10 og 20 ul/l. Kontrollgruppen omfattet voksne Caligus som ble holdt i petriskåler med sjøvann.

Alle petriskåler ble plassert i et inkubasjonskammer med konstant temperatur innstilt ved 14°C. Dødeligheten av lus ble undersøkt ved 0, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36 og 48 timer av eksponering til den aktive forbindelsen som skulle testes. De forskjellige behandlinger er vist i tabell 3.

De oppnådde data ble analysert ved anvendelse av statistikkprogrammet SPSS, versjon 13.0. PROBIT varden statistiske testen som ble anvendt for å bestemme LD50.

Resultater og diskusjon

Lignende til resultatene som ble oppnådd i den foregående studien med kopepoditter, induserte carvacrol i nåværende eksperiment en høy dødelighet av de voksne stadier av Caligus rogercresseyi ved alle testede konsentrasjoner (figur 3).

Alle doser av carvacrol som ble testet i denne biologiske testen drepte 100 % av lusene ved 48 timer av eksponering. Den høyeste dose (20 ul/l) induserte 100 % dødelighet i 2 timer (figur 3). Videre induserte en dose av 10 ul/l 100 % dødelighet etter 12 timer av eksponering (figur 3). Sammenlikning av resultatene fra denne biologiske testen med den foregående studien med kopepoditter, viser at de voksne stadier av C. rogercresseyi kan være mer resistente til carvacrol enn de juvenile.

En tid-dose-respons kan observeres som indikerer at når konsentrasjonen av carvacrol øker, skjer dødeligheten av voksne lus tidligere (figur 4).

Resultatene av LD50 analysen for hver eksponeringstid er vist i tabell 4. Beregningene av LD50 doser varierer vidt og ikke systematisk mellom eksponeringstidene (tabell 4). Etter 12 timer av eksponering med en mindre variabilitet, kan det observeres at LD50 har en nedre og øvre konfidensgrense på 0,45Ml/l og henholdsvis 394,36 ul/l, med en beregnet LD50 av 8,26 ul/l.

Følgende konklusjoner kunne oppnås fra dette eksperimentet:

1. Carvacrol viste seg å indusere en høy dødelighet over voksne Caligus rogercresseyi ved de konsentrasjoner som ble testet i dette eksperimentet.

2. Den beregnete LD50 var 8,26 ul/l etter 12 timer av eksponering.

Eksempel 3 - Effekt av et fiskefor inneholdende carvacrol på lus

I overensstemmelse med resultatene oppnådd i eksemplene 1 og 2, har carvacrol et overraskende høyt potensial til å redusere lus (C. rogercresseyi) angrep. Ingen tidligere studie har vært utført for å teste disse fenoliske forbindelser direkte mot lus, så som for eksempel carvacrol og/eller tymol. Videre ble ingen tidligere studie utført for å undersøke virkeevnen av carvacrol og tymol mot lus når fisken er foret et for inneholdende slike forbindelser.

Formålet med denne studien er å undersøke virkeevnen av carvacrol og tymol mot lus { Caligus rogercresseyi) ved foring av fisk med et fiskefor inneholdende forskjellige doser av fenolkomponenter, det vil si carvacrol og tymol.

Materialer og metoder

Studien ble gjennomført i august 2009 i fasilitetene til Fundacion Chile, Quillaipe, Experimental Station, Puerto Montt, Chile.

Firehundreogåtti (480) fisk (-390 g/fisk) ble pit-tagged og fordelt i tolv (12) beholdere av 0,35 m<3>, 40 fisk/beholder, med filtrert sjøvann (60 um). Det ble gjennomført en akklimatiseringsperiode på 7 dager med et kommersielt for. Ved dag 8 ble det kommersielle foret skiftet til de eksperimentelle forene (se tabell 5 nedenfor): a) kontroll, b) 0,17% carvacrol+tymol i for og c) 0,61% carvacrohtymol i for. Fire replikater ble brukt for hver behandling. Etter 12 dagers foring av fisken med de eksperimentelle forene ble laksene befengt med kopepoditter av C. rogercresseyi (med en gjennomsnittlig angrepsrate på 118 kopepoditter/fisk) i 12 beholdere på 0,35 m3 med et åpent sjøvannstrømningssystem og en gjennomsnittlig temperatur på omtrent 13°C. Ti (10) dager etter angrepet ble 20 fisk per beholder tatt som prøve for å telle antall festede lus på fisken, hvorved fisken på forhånd ble bedøvet med AQUI-S (BAYER, Tyskland) i et bad i omtrent 5 minutter. Lus ble telt på levende fisk av 3 trente teknikere uten å få informasjonen om fordeling av behandlingene i de ulike beholderne.

Resultater og diskusjon

Etter 10 dager av angrep ble det oppnådd en høy reduksjon i total lus festet til fisken, når fisken ble foret et for med carvacrol + tymol i sammenlikning med kontrollforet (figur 6).

Tabell 6 gir beregninger av den prosentvise reduksjon i total Caligustall for carvacrol + tymol dosene i sammenlikning med kontrollen.

For carvacrol+tymol, synes økningen av dosen fra 0,17 til 0,61 ikke å ha en tilleggseffekt på Caligus-tellingene ved reduksjoner av 23,7% og henholdsvis 22,6% (tabell 6). Det testede produktet (begge doser) hadde en gjennomsnittlig reduksjon på omtrent 24% og en moderat sannsynlighet (81%) støtter en reell effekt (tabell 7).

Følgende konklusjoner kunne oppnås fra dette eksperimentet:

1. Carvacrol+tymol reduserer angrepet av Caligus rogercresseyi når fisken ble behandlet med carvacrol og tymol tilsatt som en bestanddel av

forsammensetningen.

2. En dose av 0,17% av carvacrol+tymol (1:1) i foret gitt i 22 dager til atlantisk laks (390 g/fisk i gjennomsnitt) reduserte angrep av lus (C. rogercresseyi) med omtrent 24%.

Fra de foregående resultater kan det konkluderes med at carvacrol var effektivt i kontrollen og reduksjonen av parasitter som er sykdomsframkallende i laks.

Eksperimentene viser tydelig effekten av carvacrol og/eller tymol direkte på fiskeparasitten C. rogercresseyi og også indirekte når carvacrol og/eller tymol ble gitt til fisken i fiskeforsammensetningen. Den foreliggende oppfinnelse demonstrerer derved det overraskende potensial av disse komponentene i behandlingen og forebyggelse av parasittiske infeksjoner.

Eksempel 4 - effekt av carvacrol i reduksjonen av Caligus rogercresseyi angrep

Formålet med studien var å måle virkeevnen til carvacrol i reduksjonen av Caligus rogercresseyi angrep når atlantisk laks { Salmo salar) ble foret et for med forbindelsen i to forskjellige doser.

Til å begynne med ble 528 atlantiske laks fordelt i 4 beholdere på 3 m3, med 132 fisk per beholder og en maksimal tetthet på 16 kg/m<3>, med et gjennomstrømningssystem og filtrert sjøvann (60 um). Fiskene ble pit-tagged og veid ved fordelingen i hver beholder. I løpet av 14 dager frisknet fiskene til (7 dager) og akklimatiserte seg (7 dager) i de samme beholderne med foring av et kommersielt for. Deretter ble atlantisk laks utfordret med kopepoditter av C. rogercresseyi (72 kopepoditter/fisk) og 20 fisk ble tatt som prøve (basal prøvetaking) for å få lever, slim (5ml), muskel (hver filet) og skinn. Prøvene ble lagret og frosset ved -80°C for videre kjemisk analyse. Etter 10 dager av angrep ble alle fisk tatt som prøve for å fortelle antall lus per fisk (35 fisk/beholder). Deretter ble fiskene fordelt i 15 beholdere, 0,35 m<3>/beholder, med 35 atlantiske laks for hver beholder. For 20 dager ble fisk foret tre (3) for: a) kontrollfor, b) lav dose av carvacrol i for (30 mg carvacrol/kg for) og c) høy dose av carvacrol i for (120 mg carvacrol/kg for). Kilden av carvacrol brukt i det foreliggende eksperiment var en blanding av 50:50 våtvekt/våtvekt carvacrol+tymol. Den siste dagen (dag 20) ble graden av angrepet bestemt ved telling av lus i alle fisk. Fiskene ble individuelt veid og prøver av 5 fisk per beholder ble tatt for å få leveren, slim (5 ml), muskel (hver fillet) og skinn. Prøvene ble lagret og frosset ved - 80°C for videre kjemiske analyser av carvacrolkonsentrasjon i hvert vev.

Dødelighet ble registrert daglig. Miljøvariabler for hvert beholder ble registrert fire ganger per dag, særlig oppløst oksygen i sjøvann (mg/l) og vanntemperatur (°C).

Statistiske analyser

Oppnådde data ble analysert ved bruk av "R language" og dets korresponderende pakker (http://www.r-project.org). For å sammenlikne tellinger av lus mellom ulike testfor ble lustellingene gjort i 35 individuelle prøvetatte fisk konvertert til en total telling per beholder ved å oppsummere de individuelle tellingene (gitt at antall fisk tatt som prøver er det samme for alle beholderne). Denne metoden er for ikke bundne tellinger, så som lustellinger og de er antatt å følge Poisson fordelingen. Lustellingene kan også være overdispergerte, det vil si variansen følger ikke standard Poisson-fordelingen. Dette påvirker ikke koeffisientberegningene som sådan, men bare deres standardfeil. Derfor var modellen en generalisert lineær modell beregnet med glm-funksjonen i "R language". Familien er Poisson idet overdispergering modelleres. Behandlingsberegningene ble basert på posterior simulering (n=2500) med 95% pålitelige intervaller som absolutt og proporsjonale til referansenivået. Posteriorestimater ble midlet over de mulige kovariater og blokker (http://cran.r-project.org/doc/manuals/fullrefman.pdf).

Resultater

I løpet av forsøket varierte vanntemperaturen i beholderne mellom 17,8°C and 12,7 °C og oppløst oksygen varierte fra 100% og 80% saturering. Forkonsum til atlantisk laks viste en liknende trend mellom behandlingene (kontroll, lav dose og høy dose)

(figur 6). Den spesifikke foringsraten (SFR) varierte mellom 0,4% og 0,9% med et gjennomsnitt på 0,7%, med de laveste konsumeringer observert i de første dagene av forsøket og den høyeste konsum mot slutten av studien.

Ved slutten av forsøket viste lusangrepet i atlantisk laks (S. salar) en høy variabilitet mellom replikate beholderne innenfor hver behandling, noe som ikke er uvanlig for denne typen av studier. Tellingene varierte med omtrent 2 ganger innenfor replikatene (tabell 9). På grunn av denne store variabiliteten, viste beregningene av doseeffekter vide pålitelighetsintervaller (tabell 9) (figur 7). Resultatene indikerer at sannsynligheten for å oppnå en bedre respons (reduksjon av lusangrep) er med doseringer av 120 (mg/kg) og 30 (mg/kg) av carvacrol tilnærmet 70% og henholdsvis 80%, sammenliknet med kontrollgruppen. Ingen signifikante statistiske forskjeller ble observert mellom behandlingene (p> 0,05).

Eksempel 5 - effektivitet av carvacrol og tymol mot Caligus rogercresseyi i regnbueørret ( Onchorhynchus mykiss ).

Effekten av carvacrol og tymol mot de forskjellige utvekslingstrinn i Caligus rogercresseyi har blitt undersøkt og dosering av carvacrol og tymol I foret ble undersøkt for signifikant å redusere angrep av lus (Caligus rogercresseyi) i regnbueørret (O. mykiss).

Materialer og metoder

Effekten av syntetiske former av carvacrol og tymol over angrepsraten av Caligus rogercresseyi i regnbueørret (O. mykiss) ble undersøkt i to eksperimenter utført i sjøbur. Det første forsøk (Eksperiment 1) ble utført i et kommersielt sjøanlegg lokalisert ved Xl-regionen i Chile. I dette eksperiment ble tre (3) diettbehandlinger sammenlignet: 1) et kommersielt kontrollfor (EWOS Silva 1500 og 2500) uten noe tilsetning av noen type; 2) den samme formulering som i 1, men tilsatt to funksjonelle komponenter, nukleotider og en prebiotisk (EWOS pre-harvest); og 3) det samme behandling som i 2, men tilsatt 30 g/tonn av foret (0,003%) av ren carvacrol og tymol (50:50 vekt) (pre-harvest + ny). Basisformuleringen av forene inneholder som hovedingredienser fiskemel, fjærkre biprodukter, soyabønneprodukter, solsikkemel, maisgluten, hvete, hvetegluten og en blanding av fisk- og vegetabilske oljer (94,4% av formuleringen).

Kontroll, pre-harvest (PH) og pre-harvest + carvacrol og tymol (PH + ny) forene, ble avgitt til 7, 3 og 4 bur, respektivt. Alle burene tilhørte den samme lokalisasjon. Hvert bur inneholdt ca. 50.000 fisk. Eksperimentet ble utført fra 1. november 2009 til 28. februar 2010. Fiskevekten økte fra 1,7 kg til 2,5 kg under forsøksperioden. Under denne periode ble to pulser med diettbehandlinger gitt til ørretene. Den første puls var fra 16. november til 7. desember 2009, og den andre puls var fra 20. januar til 9. februar 2010. Caligustellinger ble registrert på 10 fisk per bur en gang i uken i løpet av de to pulser. Målingene for lakseangrep ble utført i to bur per behandling. Livsformene av lusen som ble registrert i hver fisk var totale ungfisk, totale voksne, gravide hunnkjønn og totalt luseantall.

Det andre forsøk (Eksperiment 2) ble utført i januar 2011 i X-regionen i Chile, ved forsøkssjølokalisasjonen til EWOS Innovation. Denne lokalisasjon har 16 bur på 15 x 15 m med et automatisk foringssystem. I dette eksperiment ble regnbueørret ( O. mykiss) anvendt i alle burene. Den gjennomsnittlige fiskevekt ved starten av forsøket var 2,0 kg. Hvert bur inneholdt ca. 10.000 fisk. Under dette forsøk ble fire (4) diettbehandlinger undersøkt. Et av forene var et kommersielt kontrollfor (EWOS Silva 2000) uten noen tilsetning av noen type. Dietter 2, 3 og 4 hadde samme basis-formulering som kontrollforet, men tilsatt med en blanding av nukleotider, prebiotika, vitamin C og en immunstimulant (EWOS boost). Disse tre dietter ble tilsatt 30, 45 og 120 g/tonn av foret av carvacrol og tymol (50:50 vekt%), respektivt. Basisformuleringen av disse for inneholdt som hovedingredienser fiskemel, biprodukter fra fjærkre, soyabønneprodukter, solsikkemel, maisgluten, hvete, hvetegluten og en blanding av fisk- og vegetabilsk olje (94,6% av formuleringen).

Kilden av carvacrol og tymol som ble anvendt var den samme som i Eksperiment 1 og inneholdt 25% carvacrol og 25% tymol. Derfor, konsentrasjonene av kilden av carvacrol og tymol i de tre eksperimenter som ble foret var 60, 90 og 240 g/tonn av foret, respektivt. Således, som en prosentandel av foret, var ren carvacrol og tymol tilsatt ved 0,003, 0,006 og 0,012%, respektivt.

EWOS Innovations sjølokalisasjon er lokalisert i et produksjonsområde med naturlig angrep av Caligus. For å redusere og nivellere nivået av angrep i alle fisk før start av eksperimentperioden, ble en badbehandling med deltametrin (Alphamax®, 0,2 ml/m<3>i 30 min) utført i alle fisk i en nær tarpaulinsystem. Etter badbehandlingen ble en innledende prøvetaking av 30 fisk per bur utført for å telle luseangrepsraten. Den innledende prøve representerer basal innfestingsrate kort tid etter anti-parasitt-behandling og før startforing av eksperimentforene. Alle fisk ble anestetisert med Aqui-S og ble veiet, merket og talt for lus, slik standardprosedyre som appliseres av EWOS Innovation. Under hver eksperimentperiode ble 30 fisk per bur tatt prøver av på ukentlig basis for telling av lus. Lus-livsfasene ble registrert, inkludert ungdyrfase av kopepodider, Chalimus I, II, II og IV og voksne hunnkjønnsstadier, gravide hunnkjønn og hannkjønn.

Statistiske analyser

Caligustellinger forventes å følge Poisson-fordelingen men at den er overdispergert. Tilpasning av slikt multinivå overdispergert Poisson-modeller utføres best med MCMC (Markov chain Monte Carlo)-metoder.

I Eksperiment 1 ble tellinger av forskjellige Caligus livsfaser modellert som overdispergert Poisson og estimert med en MCMCglmm-pakke av R-language (R: A

Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2008, ISBN 3-900051-07-0, http://www.R-project.org). Diffuse flate normale priorer sentrerte rundt null men med en stor varians (108) ble anvendt for de fikserte effekter og svakt informative invers Wishart-priorer for variansparametrene (vilkårlige effekter). Tilsvarende, en multi-nivåmodell for gjennomsnittlige tellinger over hele monitoreringsperioden ble estimert ved anvendelse av både bur- og prøvetakingsdata som vilkårlige kovariater. Modellen ble estimert med MCMCglmm som beskrevet over.

Eksperiment 2 er et dose-responseksperiment og den potensielt ikke-lineære effekt av dosen ble modellert med en andre grads polynomial. Bemerk: dag for prøvetaking ble vurdert som en faktor, som i praksis betyr at de polynomiale dose-respons-modeller mellom forskjellige prøvinger er uavhengige. Den tilpassede modell ble anvendt for å beregne utvikling av forventede lusetall og de forventede reangrepstellinger (ved å substrahere posteriorfordelingen ved dag = 0). Det siste er viktig siden de innledende lusetall kan variere mellom behandlinger på grunn av effektiviteten av badbehandlingen. Tallene for forskjellige livsfaser viser typisk høyere variasjon mellom behandlingene enn den totale telling. Alle statistiske modeller ble utført med R-language og dets korresponderende pakker (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2008, ISBN 3-900051-07-0, http://www.R-project.org).

Resultater

Eksperiment 1

Forventede gjennomsnittlige tellinger over hele monitoreringsperioden for hver behandling med luselivsfase er vist i Figur 8. Forskjellene i de forventede gjennomsnittlige tellinger eksisterer mellom behandlingene. Der er en generell trend for alle livsfaser at PH-behandling har noe lavere forventet telling enn kontrollen, og PH+ny-behandling (med carvacrol og tymol) har en enda lavere forventet telling. For gravide hunnkjønn og totale lus kan det påstås et sterkt bevis på lavere tellinger for PH+ny-behandling (med carvacrol og tymol) sammenlignet med kontroll. Dette er spesielt relevant og interessant på grunn av at det er åpenbart at gravide hunnkjønn er en viktig utløsningsfaktor i utvikling av en luspopulasjon. En sammenlignbar effekt av lavere tellinger er også observert for PH-behandling når man kun vurderer gravide hunnkjønn. Der er en forskjell mellom PH og PH+ny-behandling idet PH+ny-dietten

(med carvacrol og tymol) synes å påvirke også ungdyr og voksne mens PH-dietten kun påvirker gravide hunnkjønn.

Eksperiment 2

Ved starten av forsøket ble angrepet av lus { Caligus rogercresseyi) forskjellig mellom de forskjellige eksperimentgrupper (Tabell 10)

Reinnfestingen ble beregnet fra posteriore fordelinger av modellen ved å substrahere de posteriore fordelinger av kontroll og eksperimentbehandlingene ved dag=0 fra fordelingene på de andre dagene. Reinnfestingstellingene kan være negative dersom lusetallet for et spesifikt livstrinn er redusert fra den innledende telling. Resultatene vises i figurene 9 og 10. Disse grafer viser at fisken som er foret med carvacrol og tymol har en lavere reinnfestingsrate for ungdyr, voksne og total lus i en dose avhengig trend (Figur 9). En inkludering av så lav som 0,003% carvacrol og tymol i foret var overraskende effektiv for reinnfestingen av lus til tross for den sammenlignbare lave dosering.

Selv om høyere doseringer av carvacrol og tymol hadde en sterkere effekt enn de lavere doser som ble testet. En tilsvarende effekt observeres for gravide hunnkjønn, hunnkjønn og hannkjønn (Figur 10).

For bedre å forstå og se effektene av doseringen av carvacrol og tymol på de forskjellige livsfaser til lusen, plottes de lineære og kvadratiske koeffisienter av doseresponsmodellen for hver prøvetakingsdag mot deres 95% pålitelighetsintervaller (Figur 11). Denne figur krever noe forklaring. De lineære og kvadratiske koeffisienter beskriver formen av doseeffekten og pålitelighetsintervallene viser hvordan visse slike effekter er. Derfor, vi ser etter statistisk signifikante koeffisienter som har 95% pålitelighetsintervall som ikke krysser null-linjen markert på grafen.

På dag 7 kan noen lineære koeffisienter sees for Ch l&ll, gravide hunnkjønn, hunnkjønn, hannkjønn og totale antall lus, og alle er negative, noe som betyr at carvacrol og tymol lineært og signifikant reduserer reinnfestingen av disse livsfaser. De lineære koeffisienter impliserer at doseringen har en lineær effekt på lusetallene. Den eneste kvadratiske koeffisient som er signifikant er den positive koeffisient for gravide hunnkjønn men mange andre livsfaser som har signifikante lineære koeffisienttrender synes også å ha en positiv kvadratisk koeffisient. Ved å plassere en negativ lineær og positiv kvadratisk koeffisient sammen så betyr dette at doseringen har innledningsvis en reduserende effekt på lusetallet men at effekten avtar ved høyere doseringer. Ved dag 14 er bildet svært lik dag 7. Flere kvadratiske koeffisienter kan nå vurderes som signifikante, dvs. de bekrefter typen av doseringseffekten forklart ovenfor for dag 7. En tilsvarende effekt på kopepodider er også forklart. Der synes nå å være positiv lineær koeffisient med negativ kvadratisk koeffisient for Ch lll&IV, noe som indikerer at den innledende økning i doseringen har liten eller ingen effekt og kun de høyeste doseringene kan være effektive for denne livsfase. Ved dag 21 er de eneste signifikante effekter i negativ lineære og positive kvadratiske koeffisienter for gravide hunnkjønn og det motsatte for Ch lll&IV.

Konklusjoner

Følgende konklusjoner oppnås fra dette forsøk:

- Diett-tilsetning av carvacrol og tymol reduserer signifikant reinnfestingen av forskjellige livsfaser av Caligus rogercresseyi under en periode på 3-4 uker i regnbueørret. - Ved svært lave og høyere doseringer av carvacrol og tymol (0,003 til 0,012%), var effekten mer åpenbar på gravide hunnkjønn, mens en dosering på 0,012% var nødvendig for også å redusere innfesting på ungdyr.

Således, med foreliggende oppfinnelse er det videre vist for første gang at der er klare forskjeller i effektiviteten av tymol og carvacrol på forskjellige livsfaser av ektoparasittisk kopepodlus, avhengig både av perioden av applisering og konsentrasjon av de aktive forbindelser. Allerede sammenlignbare lave doseringer er effektive for gravide hunnkjønn mens høyere doseringer synes å være nødvendig for å bekjempe ungdyr. Der er også en praktisk relevans for anvendelse av de aktive forbindelser i behandling av lusangrep. Den antyder at carvacrol og tymol kan anvendes i regulering av lus hvor man spesifikt retter angrepet og bekjempelsen mot gravide hunnkjønn i spesifikke perioder ved å anvende lave konsentrasjoner av de aktive forbindelser.

Effektiviteten av carvacrol og tymol i behandlingen av lus økes med nærvær av immunstimulanter i foret som vist i Eksempel 5. Tilsetning av immunstimulanter er ikke begrenset til ikke-spesifikke immunstimulanter, men kan også velges blant spesifikke immunstimulanter.

Det er foretrukket at behandlingen med et for som omfatter carvacrol og/eller tymol utføres på en kontinuerlig basis over en forlenget tidsperiode, hvor de aktive forbindelser fortrinnsvis tilsettes til foret og konsumeres av fisken på daglig basis. Det er foretrukket at fisken fores i minst 7 dager med dietten, mer foretrukket i 3-4 uker. Imidlertid, lengre perioder som går ut over 28 dager kan også anvendes.

Det antas at de samme effekter som vist for lus også vil være relevante for andre ektoparasittiske kopepoder i fisk og at de to aktive ingredienser kan anvendes for behandling og hindring av sykdommer og infeksjoner forårsaket av andre parasittiske kopepodinfeksjoner.

Det skal anerkjennes at utførelser av oppfinnelsen beskrevet i det foregående kan modifiseres uten å avvike fra oppfinnelsens ramme.

Definisjoner anvendt i søknaden

Carvacrol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol (C6H3CH3(OH)(C3H7)), og er en monoterpenoid fenol. Den har en karakteristisk sterk, varm lukt av oregano og en pizzalignende smak. Den foreligger i den essensielle oljen av Origanum vulgare, olje av timian, olje oppnådd fra karser, og vill bergamott.

Tymol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol, og er en monoterpenoid fenolderivat av cymen, isomerisk med carvacrol, som finnes i timian, og ekstraheres som et hvitt krystallinsk substans med en god aromatisk lukt og sterke antiseptiske egenskaper.

Prebiotika er foringredienser som stimulerer vekten og/eller aktiviteten av bakterier i fordøyelsessystemet som er nyttig for helsen.

Immunstimulanter er substanser (medikamenter og ernæringsmidler) som stimulerer immunsystemet ved å indusere aktivering eller økende aktivitet av noen av dets komponenter. De kan være ikke-spesifikke eller spesifikke immunstimulanter.

Konvensjonelle foringredienser er foringredienser som vanligvis anvendes i forsammensetninger for en spesifikk dyreart så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater, mineraler etc.

Nukleotider omfatter enhver kjent fosforester av et nukleosid så som AMP, GMP,

UMP, CMP, UMP.

Claims (48)

1. Carvacrol og/eller tymol eller en sammensetning omfattende én eller begge av de aktive forbindelser for anvendelse i behandling og/eller profylakse av ektoparasittisk kopepodinfeksjon og/eller innfesting i en fisk.

2. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 1, hvor den ektoparasittiske kopepod er en lus.

3. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 2, hvor lusen er valgt blant Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus og Caligus rogercresseyi.

4. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 1, hvor forholdet carvacroktymol er i område 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, mest foretrukket ca.

1:1, basert på vekt.

5. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1-4, hvor nevnte fisk er en laksefisk.

6. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 5, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

7. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav for reduksjon av det totale antall voksne lusfaser angrepet eller reangrepet fisken.

8. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning i total konsentrasjon på mellom 0,001% til 0,8% av foret, fortrinnsvis 0,003% til 0,6% og mer foretrukket mellom 0,003 og 0,012 vekt% av foret.

9. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 1, hvor den totale konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol er 30 mg/kg eller mer, fortrinnsvis 45 mg/kg for eller mer, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

10. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 8 eller 9, hvor carvacrol og tymol er i et forhold av 1:1.

11. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav hvor foret omfatter andre konvensjonelle foringredienser i fiskeforet.

12. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor foret ytterligere omfatter én eller flere av følgende ingredienser valgt blant gruppen av nukleotider, prebiotika, vitamin C og immunstimulanter, som kan være spesifikke eller ikke-spesifikke.

13. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor forbindelsen eller sammensetningen forsynes til fisk i minst 7 dager, mer foretrukket minst 21 dager og mest foretrukket minst 28 dager.

14. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor behandlingen med de aktive forbindelser kombineres med andre kjemiske og medisinske midler mot lus.

15. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av de foregående krav, hvor de aktive forbindelser spesifikt anvendes for å bekjempe visse livsformer av lus.

16. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 15, hvor de aktive forbindelser anvendes for å redusere innfesting av gravide hunnkjønn lus på fisken.

17. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 13, hvor fisken fores kontinuerlig foret som omfatter de aktive forbindelser som del av deres daglige diett.

18. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med krav 1, hvor den aktive forbindelse eller forbindelser appliseres i form av en vannbadbehandling.

19. Fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere ektoparasittiske kopepoder, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere carvacrol og/eller tymol eller en sammensetning omfattende én eller begge av de aktive forbindelser for å drepe lusen, å gjøre dem døsige eller for å hindre innfesting til fisk.

20. Fremgangsmåte i samsvar med krav 19, hvor nevnte ektoparasittiske kopepod er en lus.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 20, hvor nevnte lus er Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus eller Caligus rogercresseyi.

22. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor nevnte fisk er en laksefisk, fortrinnsvis valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

23. Fremgangsmåte i samsvar med krav 19, hvor nevnte aktive forbindelse, blanding av forbindelse eller sammensetning appliseres til et lokus som skal beskyttes fra parasittene.

24. Fremgangsmåte i samsvar med krav 23, hvor nevnte lokus er et vandig miljø og hvor den aktive forbindelse eller sammensetning omfattende den aktive forbindelse appliseres direkte til det vandige lokus.

25. Fremgangsmåte i samsvar med krav 24, hvor nevnte lokus inneholder fisk og hvor lusen er lokalisert på nevnte fisk eller nevnte fisk er mottakelige for angrep eller infeksjon av nevnte lus, hvor den aktive forbindelse eller blanding av forbindelser appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis med topikal eller oral applisering.

26. Fremgangsmåte i samsvar med krav 19, hvor den aktive forbindelse eller blanding av forbindelse appliseres til fisken som en komponent i foret som fores til fisken.

27. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 21-26, hvor forholdet carvacrohtymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest fortrinnsvis ca. 1:1, basert på vekt.

28. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, hvor én eller flere av de aktive forbindelser eller en sammensetning omfattende de aktive forbindelsene forsynes til fisken som del av foret i minst 7 dager, mer foretrukket i minst 21 dager og mest foretrukket minst 28 dager.

29. Anvendelse av carvacrol og/eller tymol for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling og/eller profylakse av ektoparasittisk kopepodinfeksjon og/eller innfesting i en fisk.

30. Anvendelse i samsvar med krav 29, hvor nevnte ektoparasittiske kopepod er en lus.

31. Anvendelse i samsvar med krav 30, hvor nevnte lus er valgt blant Lepeophtheirus salmonis, Caligus elongatus og Caligus rogercresseyi.

32. Anvendelse i samsvar med krav 29, hvor forholdet carvacrol/tymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest fortrinnsvis ca. 1:1, basert på vekt.

33. Anvendelse i samsvar med et av kravene 29-32, hvor nevnte fisk er en laksefisk.

34. Anvendelse i samsvar med krav 33, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss), Coho laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

35. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav for reduksjon av det totale antall lusformer som innfestes eller reinnfestes på fisken.

36. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor den farmasøytiske sammensetning omfattende carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning i en total konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol fra 0,001% til 0,8% av foret, fortrinnsvis 0,003% til 0,6% og mer foretrukket fra 0,003 og 0,012 vekt% av foret.

37. Anvendelse i samsvar med krav 29, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning som omfatter carvacrol og/eller tymol tilsettes til en forsammensetning, som har en total konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol på minst 30 mg/kg for, fortrinnsvis minst 45 mg/kg for, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

38. Anvendelse i samsvar med krav 36 eller 37, hvor nevnte carvacrol og tymol er i et forhold på 1:1.

39. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor foret omfatter andre konvensjonelle foringredienser i fiskeforet.

40. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor foret ytterligere omfatter én eller flere av følgende ingredienser valgt blant gruppen som består av nukleotider, prebiotika, vitamin C og immunstimulanter, som kan være spesifikke eller ikke-spesifikke.

41. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor forbindelsen eller sammensetningen forsynes til fisk i minst 7 dager, mer foretrukket minst 21 dager og mest foretrukket minst 28 dager.

42. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor behandlingen med de aktive forbindelser kombineres med andre kjemiske og medisinske midler mot lus.

43. Anvendelse i samsvar med et av de foregående krav, hvor de aktive forbindelser spesifikt anvendes for å bekjempe visse livsformer av lus.

44. Anvendelse i samsvar med krav 43, hvor de aktive forbindelser anvendes for å redusere innfesting av gravide hunnkjønn lus på fisken.

45. Anvendelse i samsvar med krav 41, hvor fisken fores kontinuerlig foret som omfatter de aktive forbindelser som del av deres daglige for.

46. Anvendelse i samsvar med krav 29, hvor den farmasøytiske sammensetning appliseres i form av en vannbadbehandling.

47. For for fisk, omfattende carvacrol og/eller tymol hvor den totale konsentrasjon av carvacrol og/eller tymol er minst 45 mg/kg for, mer foretrukket minst 100 mg/kg og mest foretrukket minst 120 mg/kg for.

48. For i samsvar med krav 47, hvor forholdet carvacrol:tymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, mest foretrukket ca. 1:1 basert på vekt.