NL8000173A - Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen. - Google Patents

Description

» 0A/8007-067 Douma Akzo N.V. te Arnhem - 1 -

Titel: TOEPASSING VAN IN WATER DISPERGEERBARE, HYDROFOBE KLEURSTOFFEN ALS LABEL IN IMMUNOCHEMISCHE TESTEN.

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van een immuno-chemisch reactieve component, zoals een hapteen, antigeen of antilichaam, in een waterig testmedium, waarbij ge-5 bruik gemaakt wordt van het principe van de specifieke interactie tussen dergelijke immunochemisch reactieve componenten.

Er is een groot aantal methoden bekend waarbij op kwalitatieve en/of kwantitatieve wijze stoffen worden 10 bepaald, gebaseerd op de vorming van specifieke immuun-complexen. Diverse analytische technieken staan ter beschikking voor de directe of indirecte detectie van de uiteindelijk gevormde immuuncomplexen. Naast aflezing met het blote oog, zijn fysische methoden zoals spectro-15 fotometrie, fluorimetrie, nefelometrie en electronen-/ donkerveld-microscopie veelvuldig in gebruik. Deze methoden kunnen worden gecombineerd met de toepassing van een zogenaamde label of merkstof. In plaats van het immuuncomplex zelf wordt dan de label, gekoppeld aan één 20 van de componenten van het complex, gedetecteerd, waardoor een aanzienlijk lagere detectiegrens kan worden bereikt.

800 0 1 73 it * - · - 2 -

Als voorbeelden van kwalitatieve immunochemische technieken kunnen worden genoemd de klassieke precipitine reactie (Heidelberger en Kendall, 1930) en de, eveneens op immuunprecipitatie gebaseerde, immunodiffusie 5 (Ouchterlony, 1948), in 1953 gevolgd door de immuno-electroforese ontwikkeld door Grabar. In de laatstgenoemde twee methoden ontmoeten antigeen en antistof elkaar via diffusie in een agar gel. De hierbij ontstane precipitatielijn kan, al dan niet na voorafgaande 10 kleuring, met het oog worden waargenomen. Een nadeel van deze, op zichzelf eenvoudige, methoden is dat de diffusie vrij. lang duurt en dat de detectiegrens relatief vrij hoog ligt.

Kwantitatieve bepalingsmethoden, gebaseerd op het 15 principe van de immuunprecipitatie, werden ontwikkeld door Mancini (1965; radiale immunodiffusie) en Laurell (1966; rocket-electroforese). Nadelen van deze methoden zijn eveneens een vrij lange bepalingsduur en/of een relatief hoge detectiegrens.

20 Naast deze niet-gelabelde immunochemische tech nieken is er in de loop der jaren een aantal gelabelde technieken ontwikkeld, waartoe kunnen worden genoemd de haemagglutinatie test, waarbij één der componenten wordt gehecht aan het oppervlak van erythrocyten; de 25 techniek van immunofluorescentie, waarbij één der componenten wordt gemerkt met een fluorescerende verbinding (fluorofoor); de door Yalow en Berson rondom 1959 ontwikkelde radio-immunologische bepaling, waarbij in plaats van een fluorofoor een radio-actief 30 atoom of radio-actieve groep als merkstof wordt toegepast; en de meest recente techniek van enzym-immuno-logische bepaling, waarover in 1971 de eerste publicaties verschenen van twee onafhankelijk van elkaar werkende groepen, nl. de Zweedse onderzoekers Engvall 35 en· Perlmann en de Nederlanders Schuurs en van Weemen. Laatstgenoemde bepaling is in principe analoog aan de bekende radio-immunologische bepalingen met dit 8000173 Λ » - 3 - > , · verschil, dat in plaats van een radio-actieve merking een enzym als label wordt toegepast.

De veelvuldig toegepaste radio-immunologische bepaling heeft ontegenzeggelijk grote verdiensten, 5 maar er kleven toch een aantal belangrijke bezwaren aan deze methode, zoals de risicofactor vanwege het werken met radio-actief materiaal, de hoge kosten van reagentia en apparatuur, de korte houdbaarheid van radio-actief gelabelde reagentia, en de vereiste, dat 10 slechts gekwalificeerd personeel deze bepalingen kan verrichten.

De enzym-immunologische bepalingsmethode bezit deze nadelen niet, maar niettemin is het gewenst, dat nieuwe bepalingstechnieken worden ontwikkeld, die nog 15 gevoeliger zijn, sneller kunnen worden uitgevoerd, gemakkelijker geautomatiseerd kunnen worden, en/of die bepalingen van meerdere immunocomponenten tegelijkertijd mogelijk maken.

De onderhavige uitvinding nu heeft betrekking op 20 een immunochemische bepalingsmethode, die daardoor gekenmerkt is dat voor de uiteindelijke detectie van het immuuncomplex gebruik gemaakt wordt van één of meer gemerkte immunochemisch reactieve componenten, verkregen door directe of indirecte koppeling van een dergelijke 25 component resp· componenten aan deeltjes van een waterige dispersie van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met §en dergelijke kleurstof of pigment, waarbij tijdens of na een bepaalde reactietijd van de immunochemische reactie, 30 eventueel na scheiding van de vrije en gebonden gemerkte component(en), in het testmedium resp. in één van de na scheiding verkregen fracties de aard en/of de hoeveelheid van de kleurstof wordt bepaald met daarvoor bekende methoden, welke bepaling een kwalitatieve resp. kwanti-35 tatieve aanduiding geeft van de te bepalen immunochemisch reactieve component(en).

8000173 • ^ i * - 4 -

De volgens de uitvinding ontwikkelde "Dispersed Dye Immunoassay" (DIA) is beduidend eenvoudiger dan de "Radio-Immunoassay" (RIA), daar bij de uiteindelijke detectie gebruik kan worden gemaakt van simpele 5 aflezing op het oog en/of van een eenvoudige colorimeter. In vergelijking met de "Enzyme-Immunoassay" (EIA, ELISA1*, EMITR) is de bepaling eenvoudiger en sneller daar de enzym/substraat incubatie achterwege kan blijven. Bovendien is het, door de toepassing van 10 spectraal duidelijk te onderscheiden chromoforen als label, mogelijk om simultaan twee of meer componenten te bepalen. Tenslotte is het voordeel van een synthetisch reproduceerbaar bereidbare, analytisch-chemisch exact te definiëren en stabiele kleurstof als label 15 (in de vorm van een colloïdaal deeltje) evident in vergelijking met beperkt stabiele, en/of in batch kwaliteit variërende, radio-actieve en enzym labels.

Dit alles bovendien bij op zijn minst gelijkwaardige detectie grenzen.

20 Tot de groep van gekleurde organische verbindingen, die in de vorm van een hydrofoob sol bruikbaar zijn in de hier beschreven uitvinding, behoren alle, in water niet of slechts in zeer geringe mate oplosbare, hydrofobe organische kleurstoffen en pigmenten.

25 Hiertoe dienen ook gerekend te worden de in water oplosbare organische kleurstoffen, voorzover deze bij bruikbare concentraties associatiecolloïden vormen die, a‘1 dan niet na bijvoorbeeld "cross-linking", gestabiliseerd kunnen worden. Verder kunnen ook de in alkalisch 30 waterig milieu oplosbare leuco-kuipkleurstoffen gebruikt worden, die door oxydatie om te zetten zijn in hun oorspronkelijke, gekleurde en water onoplosbare vorm; hiertoe behoren ook de in de vorm van een sulfaat half-ester water oplosbare en gestabiliseerde leuco-35 kuipkleurstoffen. Een andere bruikbare groep is de groep van kleurstofcomponenten die, op zichzelf oplosbaar in water en al of niet gekleurd, na koppeling aan elkaar 80 0 0 1 73 m % " ft - 5 - in situ, bijvoorbeeld via oxydatie of diazokoppeling, omgezet kunnen worden in water-onoplosbare kleurstoffen.

Als voorbeelden van bovenstaande kleurstoffen kunnen, onder gebruikmaking van de officiële Colour Index 5 nomenclatuur, de volgende groepen genoemd worden: "disperse dyes", "solvent dyes", "pigments", "vat dyes", "sulfur dyes", "mordant dyes", "solubilized(leuco) vat dyes", "solubilized(leuco) sulfur dyes", "azoic dyes", "oxidation bases", "ingrain dyes", 10 en de nog niet officieel benaamde "transfer dyes".

De als label toe te passen colloïdale kleurstof-deeltjes kunnen op een groot aantal, volgens op zichzelf bekende methoden bereid worden; zie hiervoor bijvoorbeeld: Kruyt (Ed.)(1952) "Colloid Science", Vol. I, Elsevier, 15 Amsterdam; Venkataraman (Ed.): "The Chemistry of

Synthetic Dyes", Academie Pres, New York, Vol. I (1952), II (1952), III (1970), IV (1971), V (1971), VI (1972), VII (1974), VIII (1978); Dollmetsch (1976): "Unter suchungen über die Ursachen der Agglomeration von 20 Dispersionsfarbstoffen durch Farbstoffhilfsmittel beim Farben", Forschungsbericht Neue Serie Nr. 2, Institut für Chemiefasern der Institute fur Textil- und Faser-forschung Stuttgart; Leube (1978) Textil Praxis International, Heft 6,733-737; Heft 7, 823-831.

25 De werkwijze volgens de uitvinding is in het bijzonder geschikt voor de kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van een immunochemisch reactieve component, zoals een hapteen, antigeen of antillchaam, aanwezig in een waterig testmedium, maar kan ook toegepast worden 30 voor de histologische of cytologische bepalingen van dergelijke componenten.

De uitvinding heeft derhalve eveneens betrekking op de nieuwe, immunochemische reagentia, bestaande uit een waterige dispersie van deeltjes van een hydrofobe 35 kleurstof of pigment, gewoonlijk organisch van aard, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment, waaraan direct of indirect een immunochemisch 800 0 1 73 rf * · - 6 - reactieve component is gekoppeld.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op nieuwe testkisten, bevattende een dergelijk immunochemisch reagens.

5 Onder koppeling van de immunochemisch reactieve component aan het deeltje, direct of indirect, wordt .verstaan iedere chemische, physische of physisch-chemische binding, zoals een chemisch covalente binding, via waterstof bruggen, polaire attractie, of adsorptie 10 omvattende biospecifieke adsorptie.

De deeltjes van de waterige dispersie van een hydrofoob kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment, hebben een deeltjesgrootte van tenminste 5 nm, en bij voorkeur 15 van 10 tot 500 nm. Deze dispersies zijn gewoonlijk solen, maar ook andere typen van dispersies kunnen voorkomen.

De kleurstofsol deeltjes dragen een lading, hetgeen een. stabiliserend effect oplevert door onderlinge 20 afstoting. Door toevoeging van voornamelijk sterke electrolyten wordt het ladingspatroon gewijzigd, waardoor aggregatie en uitvlokking optreedt. Dit kan worden voorkomen door de deeltjes te omhullen met macromoleculen die polaire groepen bezitten, zoals eiwitten, polysacchariden, 25 polyethyleenglycolen, polyvinylalcoholen, etc.

Als beschermende eiwitten kunnen worden toegepast antigenen, antistoffen (antilichamen) of, nog immuno-chemische actieve, polypeptide brokstukken daarvan. Daarnaast kan gedacht worden aan haptenen gekoppeld aan 30 macromoleculen (bijvoorbeeld eiwitten, polysacchariden) die, in de desbetreffende immunoassay, geen storende reactie geven met de overige componenten. Hierbij wordt dan tegelijkertijd de kleurstofsol gelabelde, immunochemisch actieve, component verkregen.

35 Het kan voorkomen dat, ter stabilisering van het kleurstofsol, een dermate hoge concentratie van bijvoorbeeld antistof op het oppervlak van de colloïdale 800 0 1 73 Ί. . · . * - 7 - deeltjes nodig is dat de effectieve immunochemische activiteit van dit geïmmobiliseerde eiwit, door bijvoorbeeld sterische hindering, nadelig wordt beïnvloed,

In dat geval kan de coating in twee stadia worden uit-5 gevoerd: 1) coating met een te bepalen optimale hoeveelheid van bijvoorbeeld een antistof, gevolgd door: 2) coating met eeri macromoleculaite verbinding (bijvoorbeeld een eiwit, een polysaccharide, polyethyleenglycol, polyvinylalcohol) die, in de desbetreffende immuno-10 assay, geen storende reactie geeft met de overige componenten, Deze "na-coating”, bijvoorbeeld met runderserum albumine, kan tevens dienen ter verlaging van mogelijke nonspecifieke adsorptie effecten.

Een andere mogelijkheid van een beschermend eiwit 15 kan zijn Protein A of de groep van lectines (bijvoorbeeld Con A)· Na een eerste coating van de sol deeltjes met deze eiwitten kan, door de specifieke affiniteit van genoemde eiwitten, selectief een tweede laag .aangebracht worden door adsorptie van respectievelijk immuunglobu-20 linen (via het Pc gedeelte) en glycoproteïnen (waaronder ook immuuniglobu linen), en wel via de aanwezige suiker-rest(en)·

Een andere mogelijkheid is dat de kleurstofsol deeltjes eerst omhuld worden met een, in de uiteinde-25 lijke immunoassay, inert polymeer of co-polymeer, waarna vervolgens door adsorptie en/of covalente koppeling een immunochemisch actieve component kan worden gehecht aan het omhullende materiaal. Bij het coaten van de sol deeltjes met de inerte polymeer of co-polymeer kan · 30 ieder deeltje afzonderlijk omhuld worden, maar ook is het mogelijk dat meer colloïdale deeltjes in één en dezelfde omhulling worden ingesloten·

De omhulling van de kleurstofsol deeltjes door het inerte polymeer kan op twee manieren plaatsvinden, en 35 wel door het kleurstofsol in contact te brengen met het polymeer, gevolgd door adsorptie en/of covalente koppeling aan de sol deeltjes, ofwel door het sol te brengen 8000173 I « v β - 8 - in een milieu van een monomeer, respectievelijk verschillende monomeren, en deze laatste in situ te laten polymeriseren respectievelijk co-polymeriseren. De polymerisatie kan op gang gebracht worden door bijvoor-5 beeld straling of door toevoeging van een geschikte initiator, zoals bijvoorbeeld een persulfaat.

De omhulling van een kleurstofsol deeltje door in situ polymerisatie van de monomeer oplossing, waarin zich het deeltje bevindt, onder invloed van een anorganische 10 initiator zoals een persulfaat, stuit op practische moeilijkheden, omdat het sol bij toevoeging van een dergelijke initiator uitvlokt. Gevonden werd nu, dat een dergelijke omhulling toch mogelijk is door de sol deeltjes eerst te beschermen, daarna de beschermde 15 deeltjes in de monomeer oplossing te brengen en daarna pas de polymerisatie te initiëren. Als beschermende agentia komen de hiervoor eerder genoemde verbindingen in aanmerking.

De coating van de colloïdale kleurstofdeeltjes 20 met als doelstelling(en): stabilisering van het sol, het aanbrengen van een immunochemisch reactieve component, de eliminatie van nonspecifieke adsorptie effecten, en/of het aanbrengen van een intermediaire polymeer respectievelijk co-polymeer laag, kan geschieden via 25 directe/indirecte adsorptie aan de colloïdale kleurstof-deeltjes maar ook door covalente chemische koppeling.

Dit laatste wordt bepaald door de aanwezigheid van geschikte functionele groepen in het coatingsmateriaal en in de kleurstof. Zo kan bijvoorbeeld gedacht worden 30 aan de diazotering van aromatische, aminogroepen gevolgd door diazokoppeling aan een geactiveerd aromatisch ringsysteem; carboxylgroepen kunnen worden geactiveerd met een carbodiimide en vervolgens, al dan niet via een actieve ester, aan een primaire aminocomponent 35 gekoppeld worden. Alifatische primaire aminogroepen, en hydroxylgroepen kunnen worden geactiveerd met bijvoorbeeld cyanogeen bromide of halogeen-gesubstitueerde β ___ 800 0 1 73 # * - 9 - » * * ft di- of triazines, waarna koppeling met een primaire aminocomponent of met b.v. een -SH, -OH of imidazolyl-groep bevattende component kan plaatsvinden. Ook kan van bifunctionele reactieve verbindingen gebruik gemaakt 5 worden; zo kan bijvoorbeeld glutaaraldehyde gebruikt worden voor de onderlinge koppeling van primaire aminocomponenten, terwijl bijvoorbeeld een heterobi-functioneel reagens als N-succinimidyl 3-(2-pyridyldi-thio) propionaat toegepast kan worden voor de koppeling 10 van een primaire amino-coraponent aan een thiolgroep bevattende component.

In dit verband kunnen ook de reactieve dispersie-, en andere reactieve, niet in water oplosbare, kleurstoffen genoemd worden, waarbij de kleurstof bestaat 15 uit een chromofoor covalent gekoppeld aan een op zichzelf reeds reactieve groep, zoals bijvoorbeeld halogeen gesubstitueerde di- en triazines, epoxy groepen, vinyl-sulfongroepen en dihalochinoxalines (cf. Siegel(1972) in: Venkataraman (Ed.J: "The Chemistry of Synthetic Dyes", 20 Academie Press, New York, Vol. VI; Harms (1979) in:

Banks(Ed·): "Organofluorine Chemicals and their Industrial Applications", Ellis Horwood Ltd., Chichester; pp. 188-204).

De met colloïdale kleurstof deeltjes gemerkte, 25 immunochemisch reactieve componenten worden als reagens gewoonlijk in combinatie met andere reagentia toegepast, en wel voor het aantonen en/of kwantitatief bepalen van bijvoorbeeld haptenen, antigenen en antistoffen (anti-lichamen), waarvoor allerlei immunochemische technieken, 30 zoals in gebruik bij RIA en EIA, in aanmerking komen.

De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op "testkits", te gebruiken bij dergelijke immunochemische technieken, die als belangrijkste component bevatten een kleurstofsol gelabelde, immunochemisch reactieve 35 component, bestaande uit een kleurstof sol, waarvan de deeltjes direct of indirect, adsorptief en/of covalent gecoat zijn met de immunochemisch reactieve component.

8000173 - 10 - Eén van de gebruikelijke immunochemische technieken is de competitieve immunoassay, die toegepast kan worden voor het aantonen en/of bepalen van iedere immunochemisch reactieve component. Voor het aantonen van bijvoorbeeld 5 een bepaald antigeen bestaat deze methode hierin, dat een testmonster, bevattende een onbekende hoeveelheid antigeen, in contact gebracht wordt met ofwel een bepaalde hoeveelheid van het desbetreffende, met een kleurstofsol gemerkt antigeen en een, aan een onoplos-10 bare drager gehechte antistof, gericht tegen dit antigeen, ofwel, een bepaalde hoeveelheid, aan een onoplosbare drager gehecht, antigeen en een met een kleurstof-sol gemerkt antistof, gericht tegen dit antigeen.

Na afloop van de reactie wordt de aard en/of de 15 hoeveelheid van de kleurstof bepaald in de gebonden en/of de vrije fractie, hetgeen een kwalitatieve en/of kwantitatieve aanduiding geeft voor het te bepalen antigeen. Mutatis mutandis geldt een analoge procedure voor de bepaling van andere immunochemisch reactieve 20 componenten.

Veelvuldig in gebruik is ook de zogenaamde Sandwich-techniek, die zich ook leent voor het toepassen van met colloïdale kleurstofdeeltjes gemerkte, immunochemisch reactieve componenten. Volgens deze techniek 25 wordt zo’n component, bijvoorbeeld een antistof in het geval dat een antigeen moet worden bepaald, geïmmobiliseerd op een onoplosbaar dragermateriaal. Dit drager-materiaal kan bijvoorbeeld de binnenzijde van het reactievat zijn, waarin de immunochemische reactie 30 wordt uitgevoerd; ook dragermaterialen in de vorm van parels of staafjes kunnen toegepast worden. Na een eerste incubatie met het antigeen bevattende monster, eventueel gevolgd door een wasstap, vindt een tweede incubatie plaats met een kleurstofsol gelabelde anti-35 stof, waarna de kleurstof wordt bepaald in de gebonden en/of de vrije fase..

o 8000173 » ί, - 11 -

Naast de hiervoor genoemde technieken bestaan er talloze andere immunochemische technieken» waarbij de kleurstofsol gelabelde immunochemisch reactieve component als reagens kan worden toegepast* In het 5 bijzonder wordt hier gedacht aan een immunochemische test, gebaseerd op het agglutinatie principe* Hierbij wordt bijvoorbeeld een kleurstofsol gelabelde antistof toegevoegd aan een monster van een te bepalen, antigeen bevattende vloeistof* De scheiding van ge-10 bonden en vrije fractie van de gemerkte component kan hierbij achterwege blijven, terwijl de detectie gebaseerd is op een visuele beoordeling van het kleurstof sol of op een spectrofotometrische/colorimetrische bepaling.

15 De beschreven uitvinding maakt het ook mogelijk verschillende, immunochemisch reactieve componenten, zoals bijvoorbeeld haptenen, antigenen en antistoffen, of combinaties daarvan simultaan in één testmonster aan te tonen, door voor elk der aan te tonen componenten 20 een daarmee corresponderende, immunochemisch reactieve component toe te passen, die gemerkt is met een voor die component karakteristiek, colloïdaal kleurstof-deeltje.

De bepaling van de aard en/of de concentratie 25 van de kleurstof aan het einde van de test kan met diverse, op zichzelf bekende technieken uitgevoerd worden* Als voorbeelden hiervan worden genoemd de visuele beoordeling, die, juist door de toepassing van kleurstoffen, voor een kwalitatieve bepaling 30 uitermate geschikt is; voor een kwantitatieve bepaling kan bijvóorbee d gebruik gemaakt worden van colori-metrie/spectrofotometrie. Genoemde methoden zijn ook geschikt voor de uiteindelijke detectie in de agglutinatie test, waarbij het niet zozeer gaat om de 35 concentratie van de kleurstof maar om het uiterlijk van het kleurstofsol (meer of minder aggregatie, eventuele uitvlokking, spectrale veranderingen hier- 800 0 1 73 .·, * I . * - 12 - door). Voorts kan voor de kwantitatieve bepaling van de kleurstof (respectievelijk kleurstoffen in een simultane bepaling) gedacht worden aan fluorimetrie en, in.het geval van metaalcomplex kleurstoffen en/of 5 pigmenten, aan "normale” en/of vlamloze atomaire absorptie spectrofotometrie.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

10 Voorbeeld 1

Colorimetrische en/of visuele bepaling van humaan chorion gonadotrofine (HCG) volgens het beschreven DIA principe ("Sandwich test").

1.1. Bereiding van het kleurstofsol 15 Palanil Rood BP (BASF; 7 g) wordt gedispergeerd in gedestilleerd water (140 ml); de dispersie wordt gedurende 45 min. bij kamertemperatuur geroerd, en vervolgens gecentrifugeerd (30 min., 125 g = 1 225 N/kg). De supernatant wordt overgebracht in een andere centri-20 fugebuis en afgedraaid (30 min., 7 500 g » 73 500 N/kg). De supernatant wordt nu verwijderd en de pellet wordt driemaal gewassen met gedestilleerd water (3x 140 ml; centrifuge: 30 min., 7 500 g » 73 500 N/kg). De pellet wordt geresuspendeerd in gedestilleerd water (70 ml), 25 en vervolgens worden zoveel glasparels (0 = 3 mm en 0 = 4 mm; mengsel 1:2) toegevoegd dat het vloeistof niveau gelijk staat met dat van de parels. Vervolgens wordt vijf dagen bij kamertemperatuur gerold op een rollenbank. De vloeistof wordt afgegoten en gecentri-30- fugeerd (30 min., 300 g * 2 940 N/kg); de supernatant wordt daarna overgebracht in een andere centrifuge-buis en wederom gecentrifugeerd (30 min., 1 000 g = 9 800 N/kg). Van deze laatste supernatant wordt voorzichtig 3/4 (52,5 ml) afgezogen en dit geconcentreerde 35 kleurstofsol wordt bij kamertemperatuur bewaard. De extinctie bij 553 nm van een 20x verdund monster van dit sol bedraagt 1,57.

o 800 0 1 73 .- 13 - 1.2. Bereiding van het konijne anti-HCG immuunglobuline/ kleurstof sol conjuqaat

Een monster (0,8 ml) van het kleurstof sol beschreven onder 1.1. wordt verdund met gedestilleerd 5 water (4,2 ml) en de pH wordt ingesteld op 7,0 met 0,1 mol/1 NaOH of HC1. De extinctie van dit sol bedraagt 5,0 bij 533 nm. Vervolgens wordt konijne anti-HCG immuunglobuline oplossing (0,1 ml)*^ toegevoegd ; het reactiemengsel wordt gedurende 1 uur bij 10 kamertemperatuur om het kwartier geschud waarna een oplossing van runderserum albumine (BSA) wordt toegevoegd (1 ml; 307,2 g BSA + 0,1 g natrium merthiolaat + 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). De dispersie wordt gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om het kwartier geschud, 15 en vervolgens gecentrifugeerd (30 min., 4 000 g = 39 200 N/kg). De supernatant wordt verwijderd, en de pellet wordt geresuspendeerd tot een volume van 5 ml, in een oplossing van de volgende samenstelling: 51,2 g BSA +0,1 g natrium merthiolaat + 5 mmol 20 NaCl/1 (pH ingesteld op 7,0 met 0,1 mol/1 NaOH).

De oplossing van konijne anti-HCG immuunglobuline wordt als volgt gemaakt: De immuunglobuline fractie van konijne anti-HCG serum wordt geïsoleerd via de bekende Na2S0^ precipitatie methode; het precipitaat 25 wordt opgelost en gedialyseerd tegen een waterige oplossing van 5 mmol/1 NaCl, waarvan de pH is ingesteld op 7,0 met vast Na2C03« De gedialyseerde oplossing wordt tenslotte verdund tot een eiwitconcentratie van 1 mg/ml (volgens de Warburg-Kalckar formule: 30 eiwitconcentratie (mg/ml) »1,45 x A~QEm - 0,75 x A1 cm> a260 '* 8000173

o I

a - 14 -

R

1.3. "Coaten" van Microelisa platen met konilne anti-HCG immuunqlobuline

Fosfaa.tbuffey. (FFB): 0,04 rnol/1 Na2HP04 en 0,04 mol/1

NaH2P04 mengen tot een oplossing 5 van pH 7,4; vervolgens NaCl toe voegen tot een concentratie van 0,15 mol/1 2Ei222^22-£ : konijne anti-HCG immuunglobuline (cf. 1.2.) opgelost in FFB tot 10 een concentratie van 30 mg/1 • 0glossingJ3 : 20 g BSA + 0,1 g natrium merthio- laat/1 FFB.

In de putjes van de Microelisa platen wordt oplossing A (0,11 ml) gepipetteerd, waarna de platen gedurende 15 16 uur bij 0-4 °C worden geïncubeerd. Vervolgens wordt aan alle putjes oplossing B (0,11 ml) toegevoegd, waarna de platen gedurende 30 min. bij kamertemperatuur worden geincubeerd. Tenslotte worden de putjes leeggezogen, en driemaal gewassen met gedestilleerd water, 20 waarna de platen worden gedroogd (16 uur bij kamertemperatuur boven vooraf gedroogde silica gel), verpakt in aluminium laminaat zakjes (met silica gel sachet) en bewaard bij 4 °C.

1.4. Bepaling van een standaardcurve voor HCG in 25 fosfaatbuffer, en in blanco urine S22É22ÏËHË: a-Ls beschreven in 1.3., maar met 1 g BSA/1 Wasbuffer_I : fosfaatbuffer

Wasbuffer II . : 0,1 mol TRIS ( (H0CH2)3CNH2 ) + 30 0,1 mol NaCl + 0,5 g TweenR-20 + 0,1 g natrium merthiolaat/1, ingesteld op pH 7,4 met 4 mol/1 HC1

Ethanol : P.A., 96% (v/v) 35 HCG : een oplossing van humaan chorion gonadotrofine met een gehalte van

1.000 IE immunochemisch/ml FFB

8000173 - 15 - ———————————— : urine van niet-zwangere vrouwen,

R

gefiltreerd over Hyflo en vervolgens ingevroren; voor gebruik gefiltreerd door vouwfilter 5 Con^ugaat : het kleurstof sol/anti-HCG conju- gaat, bereid zoals beschreven in 1.2·, (9 ral) wordt gemengd met geconcentreerde fosfaatbuffer (1 ml; lOx geconcentreerde FFB)· 10 Procedure: 1. Van de HCG-oplossing wordt de volgende verdunnings-reeks gemaakt in FFB en resp. urine: 4 000, 1 000, 250, 62,5, 15,6, 3,9 m IE (immuno-chemisch)/ml.

15 2. Vervolgens wordt van deze oplossingen, en van blanco FFB en urine, 0,1 ml gepipetteerd in de

R

putjes van een Microelisa plaat, die tevoren "gecoat” zijn zoals beschreven in 1.3., met konijne anti-HCG immuunglobuline (cf. 1.3.). Het geheel 20 wordt in duplo uitgevoerd.

3. Sluit de plaat af met een bijbehorende deksel, met een inleg van vochtig filtreerkarton, en incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 °C in een met waterdamp verzadigde atmosfeer.

25 4. Zuig de putjes leeg, en pipetteer wasbuffer I

(0,3 ml) in elk putje/ en zuig weer leeg.

5. Pipetteer het conjugaat (0,1 ml) in elk putje.

6. Incubeer als beschreven onder punt 3, maar nu gedurende 18 uur.

30 7. Zuig de putjes leeg, beoordeel de kleur van de putjes visueel, en/of pipetteer wasbuffer II (0,3 ml) in de putjes; zuig leeg, en herhaal deze procedure nog tweemaal.

8. Voeg aan alle leeggezogen putjes ethanol (0,12 ml) 35 toe, schud voorzichtig en beoordeel de kleurenreeksen op het oog en/of meet de extinctie bij 516 nm.

8000173

, I

- 16 -

Wanneer volgens de beschreven procedure ook monsters met een onbekend HCG gehalte worden meegenomen, kan de HCG concentratie op het oog goed worden geschat; een nauwkeuriger bepaling kan dan desgewenst 5 volgen door extinctie meting en vergelijking met de standaard-curve. Op deze wijze bepaalde standaardcurven voor HCG in urine en PPB zijn weergegeven in figuur 1,

De detectiegrens, gedefinieerd als (blanco + 2x 10 standaarddeviatie), bedraagt voor FPB 3,9 m IE (immunochemisch)/ml, en voor urine 15,6 IE (immunochemisch)/ml.

1.5. Bepaling van HCG in de urine van vrouwen voor detectie van zwangerschap 15 Reagentia ï zie 1.4.

Procedure:

Zoals beschreven in 1.4., maar nu met medename van de desbetreffende urinemonsters al of niet verdund. Resultaten zijn vermeld in onderstaande tabel: 20 __· ____ ΓΊ "jpregnos- I ~~ |hcg conc.

monster verdunning ticonK visueel "All—In” (mlE/ml) 1374 onverdund + + 0,588 > 4 000 25. 1374 1:10 + + 0,595 >40 000 * 1130 onverdund + + 0,659 > 4 000 305 onverdund + + 0,707 > 4 000 726 onverdund - - 0,057 80 546 onverdund - - 0,043 65 30 1123 onverdund - - 0,047 65 M in het onverdunde monster

De conclusie wel of niet zwanger komt overeen met de

O

35 resultaten van de zwangerschapstest Pregnosticon "All-In". In deze laatste test betekent: "+" ^1000 mlE/ml en <500 mIE/ml.

8000173 . I · - 17 -

Voorbeeld 2

Colorimetrische en/of visuele bepaling van humaan chorion gonadotrofine (HCG) volgens het beschreven DIA principe ("agglutinatie test").

5 2.1. Bereiding van het kleurstofsol

Zie 1.1.

2.2, Bereiding van het konijne anti-HCG immuunqlobuline/ kleurstofsol con juqaat *

Zie 1.2.; de BSA oplossing bevat in dit geval echter 10 2,4 g/1, terwijl de pellet wordt geresuspendeerd in een oplossing van de beschreven samenstelling, maar mèt 0,4 g BSA/1. Het conjugaat wordt uiteindelijk verder verdund tot een waarde van A^^10 * 2,2.

2.3. Bepaling van HCG in fosfaatbuffer of urine 15 TRIS_buffer : 1 mol TRIS + 1 mol NaCl +10 g BSA/1, op pH 7,4 ingesteld met 4 mol/1 HC1 HCG ï zie 1.4.

Urine : zie 1.4.

Fosfaatbuffer: zie 1.4.

20 Oonjugaat : zie 2.2.

Procedure: 1. HCG oplossingen van 5 000 en 1 000 m IE (immuno-chemisch)/ml worden gemaakt door de standaard HCG oplossing te verdunnen met ffb of urine.

25 2. Pipetteer in een cuvet (1 cm lichtweg): conjugaat (1 ml), TRIS buffer (0,1 ml) en HCG oplossing (0,11 ml). Meng goed en neem direct een absorptie-spectrum op in het gebied 750-360 nm, met FFB resp. urine als referentie.

30 3. Laat de cuvetten rustig bij kamertemperatuur staan gedurende 20 uur; beoordeel de inhoud vervolgens op het oog, en schud de cuvetten vervolgens en neem daarna weer een absorptie-spectrum op in het gebied 750-360 nm.

35 Representatieve spectra zijn weergegeven in figuur 2, terwijl numerieke gegevens zijn samengevat in onderstaande tabel: 800 0 1 73 .·**.’** · - 18 -

J

(IE/ml) visueel ^533^^533^ ^575^0^575^

0-0 O

51 + 0,15 0,14 5 ++ 0,40 0,21 m) »-*· · geen agglutinatie/aggregatie; kleurstof sol stabiel 10 »+» : beginnende agglutinatie/aggregatie; de supernatant wordt lichter van kleur dan bij overeenkomstige blanco (0 IE HCG/ml) door sedimentatie "++" volledige agglutinatie/aggregatie; het 15 kleurstofsol is geheel uitgevlokt en de kleurstof geprecipiteerd.

*χ)0 : 0 IE HCG/ml x : 1 respectievelijk 5 IE HCG/ml.

20 De detectiegrens kan verlaagd en/of de reactietijd kan verkort worden door het sol vooraf in te stellen met bijv. MgS04, polyethyleenglycol of een poly-electrolyt.

25 Voorbeeld 3

Varianten op de bereiding van kleurstofsolen zoals beschreven in.voorbeeld 1 (1.1.).

3.1. Dispersiekleurstoffen ("disperse dyes")

R

In plaats van het in 1.1. genoemde Palanil 30 Rood BP (BASF), zijn ook andere dispersiekleurstoffen gebruikt voor het bereiden van kleurstofsolen volgens

R

de in 1.1. beschreven procedure, en wel: Palanil

Violet 6R (BASF), ResolinR Briljant Blauw RRL (Bayer)

R

en Procinyl Blauw R (ICI). De laatstgenoemde is een 35 representant van de zogenaamde reactieve dispersiekleurstoffen.

8000173 - 19 -

Het fractioneren van. de kleurstofdispersie in water werd uitgevoerd via centrifugering, zoals beschreven in 1.1.. Practionering op deeltjesgrootte is ook uitgevoerd met behulp van filters van ge-5 definieerde porie-grootte; op deze wijze werden bruikbare solen gemaakt, maar de opbrengst aan kleurstof was duidelijk geringer dan in het geval van centrifugeren, terwijl de methode bovendien vrij tijdrovend is.

10 Hydronamische chromatografie, en het toepassen van gradiënten tijdens dè centrifugering vormen een bruikbare aanvulling op bovenstaande methoden.

3.2. Transferkleurstoffen ("transfer dyes”)

Transferkleurstoffen zijn kleurstoffen die toege-15 past worden bij transfer druk, waarbij een gekleurd patroon overgebracht wordt van het ene oppervlak op een ander, en wel in het algemeen van papier op textiel. Het "Sublistatic-, sublimation-, dry heat-, of thermoprinting process” maakt gebruik van sublimeer-20 bare organische kleurstoffen, die in het algemeen onoplosbaar zijn in water en oplosbaar in organisch milieu. Ook van dit type kleurstoffen zijn solen gemaakt in water, en wél via de zogenaamde condensatie methode (cf. J.Th.G.' Overbeek in: H.R. Kruyt(Ed.) 25 "Colloid Science", Vol. I, pp. 59-60; 1952, Elsevier, Amsterdam)· 3.2.1. LurafixR Blauw FFR (BASF)

Oplossingen (1 ml) van Lurafix Blauw FFR in aceton met de volgende concentraties: 2, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 30 0,4, en 0,2 g/1, werden onder intensief roeren toege- t voegd aan steeds 49 ml gedestilleerd water. De verkregen suspensies worden gecentrifugeerd (30 min·, 1 000 g * 9 800 N/kg), en de pellets worden gewassen met gedestilleerd water (50 ml) en weer afgedraaid 35 onder genoemde condities. Vervolgens worden de pellets opgenomen in een zodanig volume gedestilleerd water dat de eindconcentratie 0,1 mg/ml bedraagt; de uit- 800 0 1 73 - 20 - eindelijke kleurstofsolen werden verkregen door de diverse suspensies te onderwerpen aan een ultrasone behandeling (Branson Sonifier B-12; 2 min., 70 Watt).

Van deze kleurstofsolen werd het absorptiespectrum 5 opgenomen in het gebied 750-360 nm. De waarde van daalde van 716 naar 617 nm, gaande van het sol max overeenkomend met een oorspronkelijke kleurstof/aceton concentratie van 2 g/1 naar 0,2 g/1. Deze spectrale veranderingen zijn indicatief voor een afnemende 10 deeltjesgrootte (cf. H.R. Kruyt: "Colloids", p. 132; 1930, Wiley, New York; G.H. Jonker in H.R. Kruyt (Ed.): "Colloid Science", Vol. I, p. 102; 1952,

Elsevier, Amsterdam; F.B. Gribnau, Dissertatie, Utrecht 1935).

15 3.2.2. LurafixR Rood BF (BASF) a. Een oplossing van Lurafix Rood BF in aceton (1 ml; 0,5 g/1) wordt onder intensief roeren toegevoegd aan gedestilleerd water (24 ml). Vervolgens wordt onder vacuum en bij kamertemperatuur de 20 aceton geleidelijk afgedampt. Via een aanvankelijk stabiel sol ontstaat er uiteindelijk een precipi-taat. De suspensie wordt gecentrifugeerd (30 min., 1 000 g = 9 800 N/kg) en de pellet wordt geresus-pendeerd in gedestilleerd water (25 ml), gevolgd 25 door een ultrasone behandeling (Branson Sonifier B-12; 2 min., 70 Watt).

O

b. Een oplossing van Lurafix Rood BF in aceton (1 ml; 5 g/1) wordt onder intensief roeren toegevoegd aan gedestilleerd water (249 ml, 50 °C); na 1 min.

30 50 °C wordt het mengsel afgekoeld tot kamertempera tuur. Na 1 dag staan bij kamertemperatuur begint het aanvankelijk stabiele sol gedeeltelijk uit te vlokken.

Van beide, vers bereide, solen werden foto's gemaakt 35 met behulp van een scanning electronenmicroscoop (zie figuur 3 en 4).

8000173 - 21 - 3.3. Vet kleurstoffen ("solvent dyes”)

Een groep van hydrofobe organische kleurstoffen, die onoplosbaar zijn in water, maar oplosbaar in organische oplosmiddelen of mengsels daarvan. Via condensatie-5 methoden zoals beschreven in 3.2. kunnen van deze kleurstoffen solen gemaakt worden in waterig milieu.

3.4. Kuipkleurstoffen ("vat dves")

Deze water-onoploshare, anthrachinoïde of indigoïde kleurstoffen kunnen door reductie in alkalisch 10 milieu worden omgezet in de overeenkomstige, wateroplosbare leuco verbindingen. Hieruit kunnen vervolgens kleurstofsolen worden bereid door gecontroleerde oxydatie. Ook de als sulfaat ester gestabiliseerde leuco verbindingen ("solubilized vat dyes") kunnen 15 hiervoor worden gebruikt.

3.5. Organische pigmenten

Deze per definitie in water en organisch milieu onoplosbare verbindingen kunnen via een dispersie-methode (cf. P. Nylén en E. Sunderland: "Modern Surface 20 Coatings", Interscience Publishers, London, 1965) worden omgezet in colloïdale "oplossingen".

Voorbeeld 4

Varianten op de bereiding van kleurstofsol/immuun-25 globuline conjugaten zoals beschreven in voorbeeld 1 (1.2.).

4.1. Immobiliserinq van immuunqlobulines op colloidale kleurstofdeeltles 4.1.1. LurafixR Blauw PPR (BASF) 30 Een oplossing van Lurafix Blauw PPR in aceton (5 ml; 1 g/1) wordt onder intensief roeren toegevoegd aan gedestilleerd water (245 ml). Na centrifugeren (30 min., 1 000 g » 9 800 N/kg) wordt de supernatant verwijderd en de pellet gewassen met gedestilleerd 35 water (50 ml). De pellet wordt geresuspendeerd in gedestilleerd water (tot 50 ml) en de suspensie wordt ultrasoon behandeld (Branson Sonifier B-12; 2 min., 800 0 1 73 - 1 - 22 - 70 Watt). Het verkregen sol wordt doorverdund tot een A617m van 1,0‘

Konijne anti-HCG immuunglobuline oplossing (0,2 ml; 1 mg/ml in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) 5 wordt toegevoegd aan 10 ml van dit sol, en het mengsel wordt 16 uur bij kamertemperatuur bewaard. Vervolgens wordt een oplossing van Carbowax -2OM (0,2 ml; 10 g/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) toegevoegd, en na 30 min. bewaren bij kamertemperatuur wordt het 10 sol afgedraaid (30 min., 4 000 g * 39 200 N/kg). De

O

pellet wordt tweemaal gewassen met een Carbowax -20M oplossing (0,2 g/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0), en vervolgens daarin geresuspendeerd tot een eindvolume van 5 ml.

15 Bovenstaande procedure wordt herhaald, maar nu met normaal konijne immuunglobuline. De immuun-activiteit van de conjugaten wordt op de volgende wijze bepaald:

Monsters (2 ml) van beide conjugaten worden verdund

R

20 met laatstgenoemde Carbowax -20M oplossing. Hieraan wordt toegevoegd een oplossing van met mierikswortel peroxidase ("horse-radish peroxidase", HRP) gemerkt HCG (0,1 ml) en het reactiemengsel wordt gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens 25 wordt gecentrifugeerd (30 min., 4 000 g = 39 200 N/kg),

de pellèts worden gewassen met de laatstgenoemde R

Carbowax -20M oplossing (tweemaal) en geresuspendeerd in een oplossing van chromogeen/substraat (o-phenyleen-diamine/ureum peroxide). Na 1 uur kamertemperatuur 30 wordt de enzymreactie gestopt met 4 mol/1 zwavelzuur, en wordt na centrifugeren (30 min., 4 000 g 39 200 N/kg) de A4^2 van de supernatants bepaald. Kleurstof/anti-HCG Ig conjugaat: A4g2 = 0,556 Kleurstof/normaal Ig conjugaat: A4g2 “ 0,275.

35 8000173 , * · . « - 23 - 4»l»2.^Palanil^goog BF (BASF)

Immobillsering van b.v. eiwitten op vaste drager-materialen kan worden uitgevoerd via adsorptie en via, directe of indirecte, covalente koppeling. Dit 5 laatste is afhankelijk van de aanwezigheid van geschikte functionele groepen in de chemische structuur van de kleurstof. Zo kunnen b.v. aromatische amino-groepen worden gebruikt in een diazokoppeling, terwijl carboxylgroepen geactiveerd kunnen worden met behulp 10 van een carbodiimide. Alifatische primaire amino- groepen, en hydroxylgroepen kunnen geactiveerd worden met behulp van cyanogeen bromide. Ook kan van bifunctionele verbindingen worden gebruik gemaakt; zo kan b.v. glutaaraldehyde worden gebruikt voor de 15 onderlinge koppeling van aminocomponenten.

Ook reactieve dispersiekleurstoffen, kleurstoffen waarin de chromofoor gekoppeld is aan een op zichzelf reeds reactieve groep zoals b.v. halo-triazines en halo-pyrimidines, kunnen in dit verband worden toege-20 past.

De volgende voorbeelden zijn uitgewerkt aan de

R

hand van de dispersiekleurstof Palanil Rood BF (BASF) en wel met een fractie die op de volgende wijze werd geïsoleerd: 25 Een dispersie van deze kleurstof in water (62,5 g/1) wordt gecentrifugeerd (30 min., 750 g * 7 350 N/kg).

De pellet wordt vijfmaal gewassen met gedestilleerd water, en tweemaal met een oplossing van poly(vinyl alcohol) (PVA) in water (1 g PVA/1; PVA: MowiolR 28-99, 30 Hoechst). Tenslotte wordt de pellet geresuspendeerd tot een eindvolume van 21 in een PVA oplossing (0,1 g PVA/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0).

Monsters (25 ml) van dit kleurstofsol werden, al dan niet na voorafgaande bewerking zoals hieronder nader 35 aangegeven, vermengd met een oplossing van schaap anti-HCG immuunglobuline (0,65 ml; 40 mg/ml in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0).

8000173 >1 t* - 24 -

Adsorptie en/of koppeling van dit eiwit aan de colloïdale kleurstofdeeltjes werd uitgevoerd gedurende 16 uur onder de aangegeven condities: 4.1.2.1. Adsorptie 5 a. adsorptie bij pH 4,0 en 0 mol NaCl/1 b. adsorptie bij pH 4,0 en 0,1 mol NaCl/1 c. adsorptie bij pH 7,0 en 0 mol NaCl/1 d. adsorptie bij pH 7,0 en 0,1 mol NaCl/1 e. adsorptiè bij pH 6,0 en O mol NaCl/1 (sol 10 en eiwit werden gemengd bij pH 4,0) f. adsorptie bij pH 6,0 en 0,1 mol NaCl/1 (sol en eiwit werden gemengd bij pH 4,0) 4.1.2.2. Diazokoppeling

De kleurstof werd bij 4 °C gediazoteerd met 15 NaNOg/HCl, en vervolgens werd de pH van het reactiemengsel gebracht op 8,6 met vast Na^O^. Tenslotte werd eiwit toegevoegd; de koppeling werd uitgevoerd bij 4 °C. a, NaN02: 0,1 mol/1 HC1: 0,1 mol/1 20 b. NaN02: 0,05 mol/1 HC1: 0,05 mol/1 c. NaN02: 0,01 mol/1 HC1: 0,01 mol/1 4.1.2.3. Cross-linking m.b.v. glutaaraldehyde

De glutaaraldehyde concentratie van het kleurstofsol werd gebracht op respectievelijk 25 . 1 en 10 mmol/1, waarna de pH werd ingesteld op 7,4 respectievelijk 10,0. Na 1 uur kamertemperatuur werd pH 10 teruggebracht tot 9,0. Tenslotte werd eiwit toegevoegd; de koppeling werd uitgevoerd bij kamertemperatuur.

30 a. glutaaraldehyde: 1 mmol/1 pH 7,4 b. ” : 10 mmol/1 pH 7,4 c. ” : 1 mmol/1 pH 10,0 4.1.2.4. CNBr activering

Het kleurstofsol werd gecentrifugeerd en de 35 pellet gewassen met een oplossing van 5 mmol

NaCl/1 pH 7,0. Daarna volgt resuspenderen in dezelfde oplossing of in een oplossing van 8000173 > * fc - 25 - PVA (10 g/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) . De; CNBr-concentratie van de diverse solen werd gebracht op 0,045 respectievelijk 0,005 mol/1, waarna de pH 5 werd ingesteld op 11,0 met 4 mol/1 NaOH.

Na 12,5 min. kamertemperatuur worden de reactiemengsels gecentrifugeerd en worden de pellets tweemaal gewassen met 0,1 mol/1 NaHC03 pH 8,5 (4 °C). Daarna volgt resuspenderen 10 tot het uitgangsvolume in 0,025 mol/1 NaHCO^ pH 8,5. De eiwitkoppeling wordt uitgevoerd bij 4 °C.

a. PVA concentratie: 0 g/1 CNBr conc.: 0,045 i mol/1 15 b. " : 10 g/1 " : 0,045 1 mol/1 c. " : 10 g/1 ” : 0,005 mol/1

De diverse reactiemengsels werden na 16 uur 20 gecentrifugeerd (30 min., 1 000 g 9 800 N/kg). De supernatanten werden verwijderd en de pellets tweemaal gewassen met een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0, en geresuspendeerd tot een eindvolume van 20 ml in dezelfde oplossing.

25 De immuunactiviteit van de diverse conjugaten werd bepaald door 5 ml van ieder conjugaat te incuberen (16 uur, 4 °C, in het donker) met HCG, gemerkt met mierikswortel peroxidase ("horse-radish peroxidase", HRP). Daarna worden de reactiemengsels gecentrifugeerd 30 (1 000 g » 9 800 N/kg, 30 min.); de pellets worden tweemaal gewassen met 3 ml van een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0, en vervolgens geresuspendeerd in een oplossing Van chromogeen/substraat (o-phenyleen-diamine/ureum peroxide). Na een reactietijd van 1 uur 35 bij kamertemperatuur (in het donker) wordt de enzym-reactie gestopt met 4 mol/1 zwavelzuur, en na centrifugeren (30 min., 1 000 g = 9 800 N/kg) wordt de 8000173 - 26 - gemeten van de supernatanten.

Bovenstaande procedure werd ook uitgevoerd met HRP alleen, ter controle van de specificiteit.

5 conjugaat A492. A492~ A492 .

___(HCG-HRP; ' (HRP)8*7 (HCG-HRP)**; 4.1.2.1- a 0,195 0,094 b 0,420 0,098 0,750 c 1,738 0,109 1,970 10 d 0,942 0,109 1,280 e 0,230 0,109 f 1,129 0,103 1,496 4.1.2.2- a 0,738 0,120 1,260 b 0,568 0,113 1,316 15 c 0,777 0,086 1,505 4.1.2.3- a 1,097 0,062 1,920 b . 0,489 0,073 c 0,443 0,065 d 0,436 0,118 20 4.1.2.4-a 1,900 0,088 2,153 b 1,300 0,137 2,020 c 1,022 0,118 1,671 u ) de conjugaten werden op drie verschillende dagen 25 bepaald: dag 1: 4.1.2.1-a/f dag 2: 4.1.2.2-a/c en 4.1.2.3-a/c dag 3: 4.1.2.4-a/c deze conjugaten werden bepaald op dezelfde dag.

30 4.2. De invloed van "nacoatinq" van kleurstofsol/ immuuncflobuline conjugaten op de immuunactiviteit De experimenten werden uitgevoerd met als voor-

TD

beeld Palanil Rood BF (BASF), en wel met het type sol bereid volgens de methode zoals beschreven in 1.1..

35 Dit sol wordt op pH 7,0 gebracht met 0,1 mol/1 NaOH of HC1 en de extinctie (bij 533 nm) werd ingesteld op 5,0.

8000173 * * % - 27 -

Monsters (37 ml) van dit sol worden vermengd met een oplossing van konijne anti-HCG immuunglobuline (0,74 ml; 1 g/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0); de Ig-concentratie in de reactieroengsels bedraagt dan 5 20 mg/1. Na 1 uur incuberen bij kamertemperatuur wordt aan de solen respectievelijk toegevoegd: a. niets

R

b. Carbowax -20M tot een concentratie van 0,2 g/1 c. BSA tot een concentratie van 0,2 g/1.

10 Na wederom 1 uur incuberen bij kamertemperatuur worden de solen gecentrifugeerd (30 min., 4 000 g * 39 200 N/kg); de pelléts worden geresuspendeerd tot een eind-volume van 37 ml in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 met respectievelijk geen extra toevoeging, 0,2 g 15 CarbowaxR-20M/l en 0,2 g BSA/1.

De diverse conjugaten en het blanco kleurstofsol werden uitgetest in een DIA ("Sandwich test") volgens de procedure beschreven in 1.4.; als verdunningsreeks voor HCG werd gebruikt 0, 0,25, 1,0 en 4,0 IE(immuno-20 chemisch)/ml fosfaatbuffer.

conjugaat A516 HCG(IE/ml) 0 0,25 1,0 4,0 25 4.2-a 0,579 0,773 0,722 0,480 b 0,165 0,178 0,165 0,166 c 0,621 0,967 1,300 1,591 blanco kleur- Λ ncc 30 stof sol °*056 800 0 1 73 - 28 - 4.3. Zuiverinqsmethoden ter isolering van het conjuqaat na bereiding

Als zuiveringsmethoden komen o.a. de volgende technieken in aanmerking: 5 - centrifugering - gelchromatografie - affiniteitschromatografie - membraanfiltratie - partiële precipitatie (uitvlokking, gevolgd door 10 wassing en rec'onstitutie van het sol).

Centrifugering en gelchromatografie werden nader onderzocht en de resultaten werden vergeleken met een niet gezuiverd, doch overigens identiek bereid conjugaat. Hiertoe werd niet gezuiverd conjugaat 4.2-c gebruikt.

15 4.3-a Gelchromatografie 4 ml conjugaat (A333m = 5,0) wordt gebracht op een SepharoseR CL 2B kolom (Pharmacia K 16/20, bedvolume 35 ml; geëquilibreerd met een oplossing van 5 mmol NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g 20 NaN^/l pH 7,0). De kolom wordt geëlueerd met equilibratie buffer (kamertemperatuur; 30 ml/uur); detectie van het eluaat door meting van de A2gQ.

Er worden.fracties van 1,3 ml opgevangen; de hoofdfracties uit de kleurstof piek worden ge-25 mengd.

4.3- b Centrifugering X cm 4 ml conjugaat (A533 = 5,0) wordt afgedraaid (30 min., 4 000 g » 39 200 N/kg) en geresuspen-deerd tot een eindvolume van 4 ml met een oplos-30 sing van 5 mmol NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g NaN3/l pH 7,0.

4.3- c Geen zuivering

Het niet gezuiverde conjugaat 4.2-c wordt als zodanig gebruikt.

35 800 0 1 73 * - « - 29 -

De drie conjugaten werden uitgetest in een DIA (’’Sandwich test") volgens de procedure beschreven in 1.4.; de HCG verdunningsreeks uit 4.2. werd gebruikt.

5 -_ conjugaat A516 " HCG(IE/ml)j o[ 0,25| l,o| 4,0 I bg^gst ^ 4.3-a 0,228 0,551 0,713 0,505 4,3 10 b 0,218 0,339 0,456 0,557 93,6 c 0,234 0,418 0,583 0,700 100,0 4.4. Invloed van de aangeboden immuunqlobullne concentratie tijdens de bereiding van het conjugaat. op 15 de uiteindelilke immuunactlviteit

Monsters (5 ml) van een kleurstofsol bereid uit o

Palanil Rood BP (BASF) volgens de methode beschreven in 1.1., worden vermengd met 0,1 ml van een konijne anti-HCG immuunglobuline oplossing (5 mraol NaCl/1 20 pH 7,0) resulterende in eindconcentraties van: 4.4-a 10 mg/1 b 20 mg/1 c 40 mg/1 d 80 mg/1 25 Na 1 uur incuberèn bij kamertemperatuur wordt 0,1 ml van een BSA oplossing (5 mmol NaCl + 20 g BSA/1 pH 7,0) toegevoegd, resulterende in een eindconcentratie van 0,4 g BSA/1. Na 1 uur incuberen bij kamertemperatuur worden de solen afgedraaid (30 min., 4 000 g « 39 200 30 N/kg), de supernatanten worden verwijderd en de . pellets worden geresuspendeerd tot een eindvolume van 5 ml met een oplossing van 5 mmol NaCl + 0,4 g BSA + 0,1 g natrium merthiolaat/1 pH 7,0.

35 800 0 1 73 ♦ » * - 30 -

De immuunactiviteit van de conjugaten wordt bepaald met een DIA ("Sandwich test") volgens de procedure beschreven in 1.4.; de HCG verdunningsreeks uit 4.2. werd gebruikt.

5 __;_'

conjugaat A516 I

HCG(IE/ml) 0 0,25 1,0 4,0 4.4-a 0,268 0,499 0,761 1,000 10 b 0,362 0,658 0,902 1,141 c 0,511 0,741 0,913 . 1,107 d 0,507 0,681 0,847 0,955 4.5. Invloed van het type anti-HCG immuunqlobuline op 15 de immuunactiviteit van het conjugaat; toepassing van anti-HCG immuunqlobuline geïsoleerd uit schapeen konijne anti-HCG serum, en van monoclonaal muize anti-HCG immuunglobuline De anti-HCG immuunglobuline/kleurstof sol conjugaten 20 werden bereid door monsters (5 ml, A^g10 = 5,0) van een PalanilR Rood BF sol, gemaakt volgens de methode beschreven in 1.1., op de volgende wijze te coaten: 4.5-a Schaap anti-HCG immuunglobuline

De eiwitoplóssing (0,1 ml; 1 g/1 in een oplossing 25 van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) wordt toegevoegd aan het sol, en het reactiemengsel wordt 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna wordt een BSA oplossing (0,1 ml; 20 g/1 in een oplossing van 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) toegevoegd, en na 30 1 uur incuberen bij kamertemperatuur wordt het sol gecentrifugeerd (30 min., 4 000 g * 39 200 N/kg). De supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd tot een eindvolume van 5 ml in een oplossing van 5 mmol NaCl + 35 0,4 g BSA + 0,1 g natrium merthiolaat/1 pH 7,0.

800 0 1 73 - 31 - 4.5- b Konijn anti-HCG immuunglobuline

Als 4.5-a, maar nu met het konijne immuunglobuline· 4.5- c Monoclonaal muls anti-HCG immuunglobuline 5 Als 4,5-a, maar nu met het muize immuun globuline en wel de volgende hoeveelheden: 4.5- c-l: 0,1 ml immuunglobuline oplossing (1 g/1, 5 mmol NaCl/1 pH 7,0) 4.5- C-2: 0,1 ml immuunglobuline oplossing 10 (0,25 g/1, 5 mmol NaCl/1 pH 7,0).

De immuunactiviteit van de conjugaten werd bepaald met een DIA ("Sandwich test") volgens de procedure beschreven in 1.4,j waarbij de volgende HCG ver-dunningsreeks werd gebruikt: 0, 15,6, 62,5, 250, 15 1 000 en 4 000 mlE(immunochemisch)/ml.

conjugaat A516 ünIE/ml) 0 15’6 62)5 250 1 000 4 000 20 4.5-a 0,483 0,509 0,552 0,618 0,789 1,032 4.5- b 0,5560,6080,6490,7100,8771,114 4.5- c-l 0,406 0,432 0,450 0,503 0,536 0,586 4.5- c-2 0,437 0,495 0,497 0,528 0,559 0,653 25 4.6. Invloed van de aangeboden BSA concentratie tijdens de "na-coatinq" op de immuunactiviteit van het conluqaat

D

Conjugaten van de dispersiekleurstof Palanil Rood BF (BASF) werden gemaakt volgens de procedure beschreven 30 in 1.1. en 1.2·, met echter de volgende variaties in de BSA concentraties: 800 0 1 73 I β - 32 - BSA cone, in toegevoegde BSA cone, in het oplossing (g/1) reactiemengsel (g/1) 4.6-a 9,6 1,6 5 b 19,2 3,2 c 38,4 6,4 d 76,8 12,8 e 153,6 25,6 f 307,2 51,2 10 De conjugaten werden geïsoleerd zoals beschreven in 1.2., en.tenslotte geresuspendeerd in een oplossing van de volgende samenstelling: 5 mmol NaCl + 0,1 g natrium merthiolaat + x g BSA/1 (pH ingesteld op 7,0 met 0,1 mol/1 NaOH); de BSA concentratie is steeds 15 gelijk aan die gedurende de "na-coating", dus respectievelijk: x = 1,6, 3,2, ····., 51,2 g/1 (zie tabel).

De immuunactiviteit van de conjugaten werd bepaald met een DIA ("Sandwich test") volgens de procedure beschreven in 1.4.; hierbij werd de volgende 20 HCG verdunningsreeks gebruikt: 0, 3,9, 15,6, 62,5, 250, 1 000, 4 000, 16 000 mlE(immunochemisch)/ml.

8000173 - 33 -

O O U5 CM ro CM

O n 10 O in M· 00 o o σ* σ\ co co co «* #» 0» «k Ψ*

10 rH O O O O O

rH

O 'sf (Μ (M CO 0\ co O m ch h in o O ON 00. 00 P* Γ- 00 ’ I» «k n «k «t » 'ü' o o o o o o rt. P rl <f W ffl' O p* o ω on p* cm O i> p* ω m in to #k «k ψ» * *k *

H O O O O O O

O in cr* p* r- n o m vo co on on co h μ m n cm N m

O O O O O O

LD

• 10 ^ tn h O η

N M 'ï (O 1 ri H

«O <ƒ <n (Μ Η Η H

•k fk «k «k |k *

vo O O O O O O

H '· -------------

Ifl <iocovomin^^ ► p» co p* cr> in ^

in η <m η O O O

r—| ·»#»·» n » ·»

O O O O O O

ON h N <# 00 o Φ

·· φ CO W P ·<# (M

rocoCMHOOO

•k «k «k ' «k |k * o o o o o o (M P (Μ Οι H'

(M m η ιό η (M

O ro cm «H O O O

Ik «k‘ Ik fk fk »

O O O O O O

rH

ε

N

ca

H

E

8

X

4j (Ö (0

ON

P

C to ,Q U Ό O CU

O I

u Φ kf 8000173 t 9 - 34 -

Voorbeeld 5 . Colorimetrische en/of visuele bepaling van testosteron volgens het beschreven DIA principe ("Sandwich test")· 5»1. Bereiding van het kleurstofsol 5 Zie 1.1.

5.2. Bereiding van testosteron-llg-hemisuccinvl-BSA/kleurstofsol coniuqaat

Testosteron-lla-hemisuccinaat wordt opgelost in 2 ml dimethylformamide (DMF) en vervolgens wordt de 10 oplossing afgekoeld tot -15 °C.

Runderseruraalbumine (BSA, 140 mg) wordt opgelost in gedestilleerd water (3 ml), waarna 40 μΐ 4 mol/1 NaOH en 2 ml DMF wordt toegevoegd. De oplossing wordt . vervolgens afgekoeld tot -15 °C.

15 Aan de oplossing van het testosteron derivaat wordt du 12,5 μΐ N-methylforfoline en 12,5 μΐ iso-butylchloroformiaat toegevoegd. Na 3 minuten wordt dit reactiemengsel toegevoegd aan de BSA-oplossing.

Het reactiemengsel wordt, onder roeren, 1 uur bij 20 -15 °C gehouden en daarna 3 uur bij 0 °C. Hierna wordt het reactiemengsel gedialyseerd tegen gedestilleerd water, gedurende 16 uur en bij 4 °C, onder regelmatig verversen van het gedestilleerde water. De gedialyseerde oplossing wordt vervolgens gecentrifugeerd, en de heldere 25 supernatant wordt drooggevroren.

Het testosteron-lla-hemisuccinyl -BSA/kleurstofsol conjugaat wordt nu bereid volgens de methode beschreven voor de immobilizering van konijne anti-HCG immuun-

R

globuline op een Palanil Rood BF sol, onder gebruik-30 making van dezelfde concentratie voor het testosteron-BSA derivaat als voor het konijne anti-HCG immuun-globuline.

__________o 800 0 1 73 - 35 -

R

5.3. "Coaten” van Microellsa platen met konijne anti-testosteron immuunqlobulinen

De coating werd uitgevoerd zoals beschreven in 1.3., onder gebruikmaking van de immuur>globuline 5 fractie geïsoleerd uit een konijne antiserum, opgewekt door immunisering met testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA.

5.4, Bepaling van testosteron

Onder gebruikmaking van de reagentia en de test 10 procedure zoals beschreven voor HCG in 1.4., wordt een standaardcurve bepaald voor testosteron, waarmee vervolgens de testosteron concentratie van onbekende monsters wordt berekend via de Α,-^g van deze monsters, verkregen volgens de genoemde test procedure. De 15 detectiegrens van deze bepaling bedraagt 1 ng/ml.

Ook door aflezing op het oog (vergelijking van de kleurintensiteit na afloop van de reactie voor standaard en onbekende monsters) kan het testosterongehalte goed worden geschat.

20

Voorbeeld 6

Overeenkomstig de hiervoorgaande voorbeelden zijn eveneens methoden ontwikkeld voor de bepaling van Hepatitis antigeen, FSH, Rubella antilichamen en 25 digoxine.

80 0 0 1 73

Claims (12)

1. Werkwijze voor de kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van een immunochemisch reactieve component, zoals een hapteen, antigeen, of antilichaam, in een waterig testmedium onder gebruikmaking van de immuno-chemische reactiviteit van dergelijke componenten t.o.v. elkaar, met het kenmerk, dat één of meer gemerkte immunochemisch reactieve componenten worden toegepast, verkregen door directe of indirecte koppeling van een dergelijke component resp. componenten aan deeltjes van een waterige dispersie van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een de'rgelijke kleurstof of pigment, waarbij tijdens of na een bepaalde reactietijd van de immunochemische reactie, eventueel na scheiding van de vrije en gebonden gemerkte component(en), in het testmedium resp. in één van de na scheiding verkregen fracties de aard en/of de hoeveelheid van de kleurstof wordt bepaald met daarvoor bekende methoden, welke bepaling een kwalitatieve resp. kwantitatieve aanduiding geeft van de te bepalen immunochemisch reactieve component (en),. 8000173 -37-

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de uiteindelijke detectie plaats vindt door fysisch-chemische veranderingen van de kleurstofsol visueel of door meting vast te stellen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 en/of 2, met het kenmerk, dat simultaan twee of meer immunochemisch reactieve componenten worden bepaald, door voor elk der aan te tonen resp. te bepalen componenten een daarmee corresponderende immunochemisch reactieve component te gebruiken, die gemerkt is met een voor die component karakteristiek kleurstofsol deeltje, en wel door toepassing van spectraal en/of visueel duidelijk van elkaar te onderscheiden chromoforen.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door aan de kleurstof of pigment dispersie toe te voegen een bepaalde hoeveelheid van de te merken immunochemisch reactieve component, welke laatste de gedis-pergeerde deeltjes geheel of gedeeltelijk omhult, waarna desgewenst een completerende omhulling kan plaatsvinden met een in de desbetreffende bepaling immunochemisch inert polair macromolecuul.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, . dat de gemerkte component wordt verkregen door aan de dispersie van een kleurstof of pigment toe te voegen één of meer in de desbetreffende bepaling immunochemisch inerte macromoleculen, die de sol-deeltjes omhullen, waarna door, eventueel bio-specifieke, adsorptie of via covalente koppeling de immunochemisch reactieve component wordt gehecht aan het omhullende materiaal.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door een kleurstof en/of organisch pigment sol te brengen in een milieu van monomeren, deze laatsten in situ te laten polymeriseren, respectievelijk co-polymeriseren, 8000173 -38 - f- * waardoor omhulling van de soldeetjes volgt, en vervolgens de immunochemisch reactieve component te adsorberen of covalent te koppelen aan het polymere materiaal·

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door de immunochemisch reactieve component covalent te koppelen· aan colloïdale kleurstofdeeltjes, en wel na voorafgaande chemische activering van daarvoor in aanmerking komende functionele groepen in de . kleurstof en/of de immunochemisch reactieve component, dan wel door toepassing van conjugaten van organische hydrofobe chromoforen en reactieve groepen, de z.g. reactieve (dispersie)-kleurstoffen.

8. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de kleurstof en/of organisch pigment soldeeltjes eerst worden beschermd door een hydrofiel macromolecuul, waarna (co-)polymerisatie onder invloed van een anorganische initiator plaatsvindt.

9. Testkit, te gebruiken bij de bepaling van één of meer immunochemisch reactieve componenten in een waterig medium, bevattende: a) één of meer gemerkte immunochemisch reactieve componenten, verkregen door directe of indirecte koppeling van een dergelijke component resp. componenten aan deeltjes van een waterige dispersie van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment, b) overige reagentia.

10, Werkwijze ter bereiding van een nieuw, immuno chemisch reagens, welke gebruikt kan worden bij .de in de hiervoorgaande conclusies beschreven bepalingsmethoden, door directe of indirecte koppeling van een immunochemisch reactieve component aan deeltjes van een 8000173 -39 - waterige dispersie van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment·

11· Een nieuw, immunochemisch reagens volgens conclusie 10, bestaande uit een waterige dispersie van deeltjes van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment, waaraan direct of indirect een immunochemisch reactieve component is gekoppeld.

12· Een drooggevroren of gesproeidroogd reagens, welke kan worden toegepast bij de methoden volgens conclusies 1-8, bevattende één of meer gemerkte immunochemisch reactieve componenten, verkregen door directe of indirecte koppeling van een dergelijke component resp· componenten aan deeltjes van een waterige dispersie van een hydrofobe kleurstof of pigment, of van polymere kernen gecoat met een dergelijke kleurstof of pigment· 800 0 1 73