NL8702769A

NL8702769A - Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste een gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten.

Info

Publication number: NL8702769A
Application number: NL8702769A
Authority: NL
Original assignee: Holland Biotechnology
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1987-11-19
Publication date: 1989-06-16
Also published as: DK173781B1; GR3005396T3; PT89017A; EP0321008B1; EP0369546A1; ES2042720T3; IL88410A0; FI93904B; DK648388A; IE62737B1; FI885312L; IE883460L; JP2714964B2; DE3883729D1; ZA888602B; ATE93971T1; DE3883729T2; GR3005455T3; PT89017B; JPH01250066A

Description

it VO 9441

Titel: Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste één gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen in een testmonster van een of meer componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof waarbij gebruik 5 wordt gemaakt van de onderlinge reactiviteit van dergelijke componenten en van ten minste één gemerkte component, welke verkregen is door deeltjes van een sol van de merker direct of indirect te koppelen of adsorberen aan de component, waarbij tijdens of na afloop van 10 de reactie, eventueel na scheiding van de gebonden en de vrije gemerkte component, in het testmonster of in één van de na scheiding verkregen fracties de aanwezigheid en/of de hoeveelheid van de merker wordt bepaald met een daarvoor geschikte methode, welke 15 bepaling een kwalitatieve respectievelijk kwantitatieve indicatie geeft van de te bepalen component.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een gemerkte component van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit 20 en de bijbehorende bindbare stof door deeltjes van een sol van de merker direct of indirect te koppelen • of adsorberen aan de component, alsmede op een testkit voor gebruik bij de bepaling van een immunocomponent in een waterig testmonster.

25 Met de aanduiding "component van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof" wordt gedoeld op stoffen of delen daarvan zoals receptoreiwitten en antigene determinanten, die zich aan het oppervlak van cellen kunnen bevinden, .8702769 -2- en op immunochemische stoffen zoals haptenen, antigenen en antilichamen die in waterige media, in het bijzonder lichaamsvloeistoffen zoals bloedplasma, serum e.d. of kweekmedia van cellen aanwezig kunnen zijn. De 5 uitvinding ligt derhalve op de gebieden van histologie (weefsel- en celkleuring om bepaalde delen of componenten van cellen zichtbaar te maken) en immunoanalyse voor bijv. diagnostische doeleinden (bepaling van antilichamen, antigenen of haptenen in waterige testmonsters). In 10 het hierna volgende gedeelte van de beschrijving zal de uitvinding nader worden toegelicht aan de toepassing van de uitvinding op het laatstgenoemde gebied, d.w.z. diagnostische immunotests, maar de uitvinding dient niet tot deze toepassing beperkt te worden geacht, 15 aangezien hij evenzeer van toepassing is op histologische en histochemische onderzoeksmethoden.

In EP-A-0007654 wordt een overzicht gegeven van bekende immunochemische methoden waarbij de aanwezigheid van een bepaalde immunologische component kwalitatief 20 en/of kwantitatief wordt vastgelegd onder gebruikmaking van de onderlinge reacties tussen dergelijke componenten, zoals de reactie tussen antigeen en de daartegen gerichte antistof of antilichaam. Deze bekende methoden hebben elk bepaalde nadelen of tekortkomingen, die volgens 25 deze Europese octrooiaanvrage opgeheven kunnen worden door in een werkwijze van de in de aanhef vermelde soort gebruik te maken van een met metaal gemerkte component, verkregen door de component direct of indirect te koppelen of adsorberen aan deeltjes van een waterige 30 dispersie van een metaal of metaalverbinding of van polymeerkernen die met een metaal of metaalverbinding zijn bekleed, waarbij de deeltjes een grootte van 6-100 nm bezitten.

De beschreven metaalimmunochemische techniek 35 is niet alleen gevoeliger dan de bekende radio- en enzymimmuno technieken, maar maakt het bovendien mogelijk simultaan meerdere immunologische componenten in hetzelfde testmedium aan te tonen en te bepalen door toepassing 67 027 6 9 » -3- van verschillende metaallabels.

De metaalsolen kunnen zijn van metalen, of metaalverbindingen, zoals metaaloxyden, metaalhydroxyden of metaalzouten. Als voorbeelden worden genoemd de 5 metalen of metaalverbindingen van goud, zilver, ijzer, nikkel, aluminium, chroom, lood, vanadium, kwik, mangaan, en in het algemeen al die metalen, die gemakkelijk met behulp van de bekende technieken aan te tonen zijn.

10 Solen van metalen zijn bijv. die van zilver, goud en platina. Solen van metaalverbindingen zijn bijv. die van zilverjodide, ijzeroxyde, aluminiumhydroxyde, chroomhydroxyde, vanadiumoxyde, ijzerhydroxyde, mangaan-hydroxyde en kwiksulfide.

15 Bij voorkeur worden metalen of metaalverbindingen gebruikt, die in het testmedium niet voorkomen, en daarvan in het bijzonder die, welke met een gekozen techniek in een zo laag mogelijke concentratie aan te tonen zijn.

20 Verrassenderwijze is thans gevonden dat ook niet-metallische elementen of verbindingen daarvan als merker kunnen worden gebruikt en bepaalde voordelen hebben ten opzichte van het gebruik van metaal-bevattende merkers.

25 De werkwijze volgens de uitvinding wordt dan ook gekenmerkt doordat men voor het merken een sol gebruikt van een niet-metallisch element of een verbinding daarvan.

Het heeft volgens de uitvinding de voorkeur 30 dat als soldeeltjes worden toegepast seleen, telluur, zwavel, fosfor, koolstof en/of silicium. Volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm worden als soldeeltjes verbindingen van seleen, telluur, fosfor, zwavel en/of silicium toegepast.

35 Dergelijke niet-metallische solen kunnen op een groot aantal, volgens op zichzelf bekende methoden bereid worden.

.8702769

V

·# * -4-

Voor de bereiding van bijv. een seleensol wordt verwezen naar een artikel van Gotbier, in Z. für Anorg. Chemie 31, 448-450, 1902. Voor een telluursol naar een artikel van Brintzinger in Kolloid Zeitschrift 5 78, 22-23, 1936 en voor een siliciumsol naar een artikel van G. Wegelin in Kolloid Z. 14, 65-69, 1914.

De soldeeltjes van niet-metallische elementen dragen een lading, hetgeen een stabiliserend effect oplevert door onderlinge afstoting. Door toevoeging 10 van voornamelijk sterke electrolyten wordt het ladings-patroon gewijzigd, waardoor samenklonteren en uitvlokking optreedt. Dit kan worden voorkomen door de deeltjes te omhullen door macromoleculen met polaire groepen, zoals eiwitten, polyethyleenglycolen, polymere koolhy-15 draten, polyvinylalcoholen, e.d. Als beschermende eiwitten kunnen worden toegepast antigenen, antilichamen en anti-antilichamen of immunochemisch actieve brokstukken daarvan, of haptenen, welke laatstgenoemde gekoppeld zijn aan immunochemisch inerte, beschermende macromole-20 culen, hetgeen direct resulteert in met soldeeltjes van niet-metallische elementen gelabelde immunocomponenten.

Het verdient echter de voorkeur voor de omhulling van de soldeeltjes van niet-metallische elementen niet uitsluitend immunocomponenten toe te passen, 25 omdat daardoor wel een stabiliserend effect wordt verkregen, maar de immunochemische reactiviteit geringer is dan verwacht mocht worden, waarschijnlijk door sterische hindering. Het is dan ook van voordeel gebleken de omhulling slechts gedeeltelijk uit te voeren met 30 een immunocomponent, en de omhulling te completeren met een ander beschermend, doch immunochemisch inert materiaal, zoals inerte eiwitten, bijvoorbeeld albumine, een polyethyleenglycol of een ander polair macromolecuul. Als omhullend materiaal kan ook worden toegepast protein 35 A of verwante eiwitten, die reactiviteit bezitten t.o.v. het Fc gedeelte van antilichamen. Na de omhulling . 87 0 27 69 m * -5- van de soldeeltjes van niet-metallische elementen • door protein A kan een verdere omhulling tot stand worden gebracht met een gewenst antilichaam.

Een andere mogelijkheid bestaat hierin, dat 5 men de soldeeltjes van niet-metallische elementen eerst omhult met een inert hydrofiel polymeer of co-poly-meer, waarna vervolgens door adsorptie of via covalente bindingen de immunologische component wordt gekoppeld aan het omhullende materiaal.

10 De na omhulling verkregen bolletjes kunnen een enkel soldeeltje bevatten/ maar het is ook mogelijk/ dat het polymeer meerdere soldeeltjes omsluit.

De omhulling van de soldeeltjes door het inerte polymeer kan op verschillende wijzen geschieden, zoals 15 in de genoemde Europese octrooiaanvrage is beschreven.

De volgens de uitvinding te gebruiken niet-metallische soldeeltjes hebben een aantal voordelen t.o.v. de in de bovengenoemde octrooiaanvrage beschreven metaal soldeeltjes.

20 Als voordelen zijn o.a. te noemen: 1. Het goedkoper zijn van bijv. seleen t.o.v. goud.

2. De bereidingswijze van bijv. seleen solen is eenvoudiger en sneller dan van goud solen.

3. Goud soldeeltjes zijn of klein en monodispers 25 of groot en niet monodispers (J.H.W, Leuvering

Dissertatie 1984), terwijl dit bij selenium solen niet of althans in veel mindere mate het geval is (A. Watillon, J. Colloid and Interface Science 27 (3) 507-15 1968). Deze deeltjes 30 zijn monodispers in vrijwel elke grootte.

4. Solen van bijv. seleen kunnen naar gelang de bereidingswijze zowel een negatieve als een positieve lading bezitten, dit is niet het geval bijv. bij goudsolen.

.8702769 -6-

De met soldeeltjes van niet-metallische elementen gemerkte immunocomponenten worden toegepast als reagens, gewoonlijk in combinatie met andere reagentia, voor het aantonen en kwantificeren van haptenen, antigenen 5 en antilichamen in een waterig testmedium, waarvoor allerlei immunochemische technieken, zoals in gebruik bij radio-immuno testen en enzym-immuno testen, in aanmerking komen.

De uitvinding heeft derhalve ook betrekking 10 op testkitten, te gebruiken bij dergelijke immunochemische technieken, die als belangrijkste component bevatten een met niet-metallisch element of verbinding hiervan gelabelde immunocomponent, bestaande uit een sol van een niet-metallisch element, waarvan de deeltjes ofwel 15 direct omhuld zijn door de gewenste immunocomponent, ofwel door een inert polymeer, waaraan de immunocomponent is gekoppeld of geadsorbeerd.

Een van de gebruikelijke immunochemische technieken is de competitieve immunotest, die toegepast kan worden 20 voor het aantonen en bepalen van een immunocomponent.

Voor het aantonen van bijvoorbeeld een bepaald antigeen bestaat deze methode hierin, dat men een testmonster, bevattende een onbekende hoeveelheid antigeen, in contact brengt met ofwel een bepaalde hoeveelheid 25 van het desbetreffende, met een niet-metallisch element gelabelde antigeen en een onoplosbaar gemaakt antilichaam, gericht tegen dit antigeen, ofwel een bepaalde hoeveelheid onoplosbaar gemaakt antigeen en een met een niet-metallisch element of verbinding hiervan gelabeld antilichaam 30 gericht tegen dit antigeen.

Na afloop van de reactie wordt de aard en/of de hoeveelheid van het niet-metallisch element bepaald in de gebonden of vrije fractie, hetgeen een kwalitatieve respectievelijk een kwantitatieve aanduiding geeft 35 voor het te bepalen antigeen. Mutatis mutandis geldt . 87 02769 r -7- een analoge methodiek voor de bepaling van andere immunocomponenten.

Veelvuldig toegepast zijn ook de zgn. Sandwich-tech-nieken, die zich ook in het bijzonder lenen voor het 5 gebruik van een met een niet-metallisch element gelabelde component volgens de uitvinding. Volgens deze technieken wordt een immunologische component, bijvoorbeeld een antilichaam in het geval een antigeen moet worden bepaald, onoplosbaar gemaakt door deze te koppelen 10 aan een vaste drager.

Deze vaste drager is bijvoorbeeld de binnenzijde van het reactievat, waarin de immunochemische reactie wordt uitgevoerd. Na een eerste incubatie, eventueel gevolgd door een wasstap, vindt een tweede incubatie 15 plaats met een, met een niet-metallisch element gelabeld antilichaam, waarna het niet-metallische element of een verbinding hiervan wordt bepaald in de gebonden of de vrije fase.

De met een niet-metallisch element gelabelde 20 immunocomponenten lenen zich ook goed voor toepassing in zogenaamde homogene immunoassays, d.w.z. immunoassays waarbij een scheiding tussen de in de immunochemische reactie gebonden en de nog vrije, gelabelde immunologische component niet noodzakelijk is.

25 Dergelijke bepalingen hebben als voordeel dat ze eenvoudig uitvoerbaar zijn, relatief snel de gewenste informatie leveren en zich bij uitstek lenen voor automatisering.

Bij de feitelijke assay wordt b.v. testmonster 30 (of standaardoplossing) met het te bepalen antigeen, tezamen met de gelabelde antistof geincubeerd in de wells van een microtiter-plaat. De immunochemische reactie tussen antigeen en (gelabelde) antistof zal resulteren in agglutinatie. De aldus geïnduceerde 35 samenklontering van de deeltjes in een sol van een .8702763 -8- * niet-metallisch element gaat gepaard met een spectrofoto-metrisch te vervolgen kleursverandering.

Ter bepaling van kleine antigenen, die in immuno-chemisch opzicht monovalent zijn, wordt gebruik gemaakt 5 van een agglutinatie-inhibitie reactie, die op hetzelfde principe gebaseerd is.

Naast de hiervoor genoemde technieken bestaan er talloze andere immunochemische technieken, waarbij de met een niet-metallisch element gelabelde immunocom-10 ponent als reagens kan worden toegepast. De onderhavige uitvinding maakt het ook mogelijk verschillende haptenen, antigenen, antilichamen, of combinaties daarvan tegelijkertijd in een testmonster aan te tonen, door voor elk der aan te tonen componenten een immunocomponent 15 als reagens toe te passen, die gelabeld is met een ander soldeeltje van een niet-metallisch element.

De meting van de aard en/of de concentratie van het niet-metallisch element in een bepaalde fase van het reactiemengsel kan op talloze, volgens op 20 zich zelf bekende technieken plaats vinden. Als voorbeelden daarvan worden genoemd de colorimetrische bepaling, waarbij gebruik gemaakt wordt van de eigenschap, dat sommige solen van niet-metallische elementen sterk gekleurde dispersies zijn, - seleen = rood -—} blauw, 25 telluur = bruin -^ blauw, silicium = bruin -> geel, fosfor = fluorescerend blauw, die bovendien van kleur veranderen bij fysisch-chemische wijzigingen? de visuele methode, die vaak voor kwalitatieve bepalingen reeds toepasbaar is, gezien het hiervoor genoemde feit, 30 dat sommige solen van niet-metallische elementen gekleurd zijn? het gebruik van vlam emissie spectrofotometrie of een andere plasma emissie spectrofotometrische methode, die een simultane bepaling mogelijk maakt, en de zeer gevoelige methode van vlamloze atomaire 35 absorptie spectrofotometrie.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende .8702769 t -9- w voorbeelden nader toegelicht.

Uitgaande van voorschriften die bekend zijn uit de literatuur is het mogeijk intens gekleurde, monodisperse, colloïdale oplossingen te bereiden, 5 bestaande uit: 1. hetzij sferische Se-deeltjes met de navolgende grootteverdeling en bijbehorend kleurenspectrum.

10 deeltjesgrootte in nm Kleur diameter 40-500 blauw - rood 2. hetzij langgerekte Te-deeltjes met een grootteverde- 15 ling annex kleurenspectrum volgens deeltjesgrootte in nm Kleur lengte 30-180 bruin -) blauw; 20 breedte 12-25

Door modificatie van bereidingswijzen kan de grootte-range van de colloidale deeltjes uitgebreid worden tot het traject 1-1000 nm. Wijzigingen in het 25 protocol voor de Te-sol bereiding kunnen er zorg voor dragen dat colloidale Te-deeltjes die volgens een dergelijk voorschrift bereid worden, sferisch van vorm zijn.

30 Voorbeeld 1

Se-deeltjes geconjugeerd met anti-solanidinegly-coside IgG voor kwantitatieve bepaling van solanidinegly-cosiden in aardappel.

8701763 # -10-

Inleiding:

Conjugaten, verkregen door chemische of fysische binding van gezuiverde antilichamen aan colloidale 5 Se-deeltjes worden in een homogene immunoassay toegepast ter bepaling van solanidineglycosiden in aardappelextracten.

De toets is gebaseerd op inhibitie van het agglutinatieproces in het reactiemengsel door vrije solanidineglycosiden in het monster. Dit reactiemengsel 10 bestaat uit het te testen monster (of standaardoplossing), het conjugaat van Se-deeltjes en anti-solanidineglycoside IgG en een voor een bepaalde toetsgevoeligheid vereiste hoeveelheid solanidineglycoside-thyroglobuline conjugaat. (Door koppeling van monovalente haptenen (solanidinegly-15 coside-moleculen) aan een drager-eiwit (thyroglobuline) wordt een in immunochemisch opzicht multivalent hapteen complex verkregen dat in staat is om het Se-deeltje anti-solanidineglycoside conjugaat te agglutineren.

Deze agglutinatie van het Se-deeltje anti-solanidinegly-20 coside conjugaat door het solanidineglycoside-thyroglobu-line complex kan geïnhibeerd worden door vrij solanidine-glycoside in het monster (of de standaardoplossing)).

la. Bereiding van de Se-sol 25 0,5073 g SeC>2 wordt voorzichtig, onder voortdurend roeren, toegevoegd aan 6 ml koud 80% hydrazinehydraat; hierbij ontstaat een olieachtig mengsel met een bloedrode kleur, dat gedurende 30 minuten geroerd wordt op ijs.

30 Vervolgens wordt 1 ml van het mengsel zeer snel en onder krachtig roeren toegevoegd aan 999 ml kokend gedestilleerd water. De Se-sol wordt gedurende 15 minuten gekookt.

Aldus ontstaat een licht troebele, oranje-rode 35 Se-sol bestaande uit (sferische) Se-deeltjes met een . 8702769 -11- gemiddelde diameter van (100 nm) (Watillon, Van Grunderbeeck, 1956).

1 cm

De pH van de sol bedraagt 9,4 terwijl A =1,35 400 nm 5 2. Bereiding solanidineglycoside-eiwit conjugaat

Zowel het solanidineglycoside-BSA conjugaat (antigeen) als het solanidineglycoside-thyroglobuline 10 conjugaat worden gesynthetiseerd volgens de periodate methode (Butler, V.P.; Chen., J.P. Digoxin-specific antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1967; 57, 71-78).

3. Bereiding van konijne-solanidineglycoside-antisera 15

Solanidineglycoside-antisera worden bereid door konijnen volgens onderstaand protocol met een solanine-BSA conjugaat te immuniseren.

Hiertoe wordt 5 mg solanine-BSA (gevriesdroogd) 20 opgelost in 5 ml medium bestaande uit: 1 deel (steriele) saline (9 mg/ml NaCl) 1 deel Freund's Complete Adiuvant 1 deel Tween-80 (10 mg/ml) 25

Injecties: 4 x (1 x per maand) 0,25 ml subcutaan in de rug lx 1 ml intramusculair in de achterpoot 30 Dit injectieschema wordt (eventueel) herhaald totdat de titer van het antiserum voldoende hoog is.

Uit het konijn wordt het ruwe serum gewonnen.

.9702789 f -12- 4. Zuivering van IgG-fractie uit ruw konijneserum

Een Cl0/10 kolom wordt gevuld met 1 ml protein A-sepharose C1-4B. De doorstroomsnelheid van de kolom 5 bedraagt 0,8 ml/min. De kolom wordt geëquilibreerd m.b.v. 5 ml bindingsbuffer (zie onder).

Vijf ml serum, verdund met eenzelfde volume startbuffer, wordt op de kolom gebracht. De geladen kolom wordt vervolgens stapsgewijs geëlueerd m.b.v.

10 buffers met afnemende pH.

De geëlueerde fracties worden gedurende 24 uur gedialyseerd tegen 5 mMol NaCl, pH 7,0 (4°C) en vervolgens 30 min. gecentrifugeerd bij 20.000 x g (4°C).

15 Het supernatant wordt tenslotte geanalyseerd m.b.v. SDS-PAGE en ELISA (eventueel kan de anti-BSA IgG fractie uitgeschud worden m.b.v. een BSA-oplossing).

Het IgG-gehalte wordt spectrofotometrisch bepaald door meting van de 20 1 cm 1 cm A en A van een 10-voudig verdunde oplossing van de 280 nm 260 nm 25 verschillende fracties.

Het gehalte G (in mg/ml) wordt berekend volgens 1 'cm 1 cm 30 G = 10 x [(1,45 x A ) - (0,75 x A )] 280 nm 260 nm

,870276S

-13- *

Samenstelling buffers:

Bindingsbuffer : 1,5 M glycine, 3 M NaCl pH 8,9 stellen m.b.v. 5 M NaOH 5

Elutiebuffers : 100 mMol citroenzuur pH 4,0; 5,0 of 6,0 stellen m.b.v.

5 M NaOH

10 Regeneratiebuffer: 100 mMol citroenzuur

pH 3,0 stellen m.b.v. 5 M NaOH

5. Bereiding van Se-deeltjes anti-solanidineglycoside conjugaat.

15 (Alle volgende handelingen worden verricht bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld).

500 ml van de Se-sol (bereidingswijze zie punt 20 1.) wordt op pH 7,0 gebracht m.b.v. 10% en 0,1% HCl-op- lossingen.

1,5 ml van de gezuiverde konijne anti-solanidineglycoside immunoglobuline oplossing met een gehalte van 200 /ug/ml wordt druppelsgewijs, onder krachtig 25 roeren, toegevoegd aan 25 ml van de geneutraliseerde Se-sol.

1 ml van een 25 g/1 normaal konijne IgG oplossing in 5 mMol NaCl, pH 7,0; wordt vervolgens op dezelfde wijze toegevoegd.

30 Het aldus verkregen Se-deeltje-konijne anti-sola nidineglycoside immunoglobuline conjugaat wordt gedurende 10 min. bij 30.000 x g gecentrifugeerd. Het supernatant wordt afgezogen terwijl het pellet, bestaande uit het conjugaat, geresuspendeerd wordt in een zodanig 35 groot volume 0,1 M Tris/HCl buffer, pH 7,6 (zie punt 6.) dat . 8702769 c -14- \ 1 cm A = 1,0 400 nm 6.Samenstelling Tris-buffer 5 0,1' mol/1 Tris/HCl 30 g/1 sucrose 0,1 g/1 thimerosal 0,25 mol/1 NaCl 10 1,5 g/1 PEG 6000 pH 7,6 7. Detectielimiet 15 De detectielimiet voor solanidineglycoside wordt gedefinieerd als die concentratie van solanidineglycoside, die resulteert in een 1 cm A -waarde in de toets, die gelijk is aan de gemiddelde 20 max 1 cm A -waarde max van de blanco's, vermeerder met 3 maal de waarde van 25 de 1 cm standaarddeviatie van A van de blanco's.

max 30 8. Testprocedure (Alle hierna genoemde handelingen kunnen bij kamertemperatuur uitgevoerd worden).

35 50 ul van een gebufferde solanidineglycoside . 870276 9 -15- standaardoplossing of 50 ul van het monster wordt • gepipetteerd in de wells van een niet-gecoate 96-well microtiter ELISA plaat.

Na minstens 5 min. wordt per well 100 ul gebufferde 5 1 cm

Se-(anti-solanidineglycoside) conjugaat met A =1,0 toe- max gevoegd.

10 Na nog eens minstens 5 minuten wordt per well 50 ul van een gebufferde solanidineglycoside-thyroglobu-line oplossing ingepipetteerd. (concentratie is afhankelijk van de gewenste toetsgevoeligheid).

Na een incubatieperiode van 2 uur bij kamertempe-15 ratuur wordt de Amax gemeten m.b.v. een micro-ELISA reader.

Voorbeeld 2 20 In dit voorbeeld wordt gebruik gemaakt van

Te-solen.

1. Bereiding van de Te-sol.

25 100 ml 0,5% (w/v) HgTeC^ wordt gemengd met 30 ml 0,1 N K2CO3 en gedurende 15 minuten gekookt.

Hierna wordt snel en onder krachtig roeren 5 ml 0,65-0,85% (w/v) ascorbinezuur toegevoegd. Het mengsel wordt nogmaals gedurende 15 minuten doorgekookt.

30 Er ontstaat een heldere, bruin-rode Te-sol, bestaande uit langgerekte Te-deeltjes met een gemiddelde lengte-as van (31 nm) en met een gemiddelde breedte-as van (12 nm; Johnson, 1953).

1 cm 35 De pH van de sol bedraagt 9,1, A =1,0 265 nm .8702763 1.

i -16-

De verdere gang van zaken is identiek aan voorbeeld

Voorbeeld 3 en 4 5

Bereiding en zuivering van gelabelde colloidale Se-sol, resp. Te-sol, voor zowel electronenmicroscopische als lichtmicroscopische toepassing binnen de immunohistoen de iiranunocytochemie.

10 Aan 25 ml van een Se-sol, resp. Te-sol, bestaande uit deeltjes met een gemiddelde diameter van hetzij 5 nm, 10 nm, 15 nm, danwel 20 nm en waarvan de pH van te voren op pH 7,0 is gesteld, wordt onder krachtig roeren druppelsgewijs 1,0 ml van een gezuiverde konijne 15 anti-solanidineglycoside immunoglobuline oplossing met een gehalte van 100 /ug/ml toegevoegd. (N.B.: De IgG-fractie dient uitgeschud te worden met een BSA-oplos-sing).

Dit mengsel wordt gedurend 2 minuten bij kamer-20 temperatuur geroerd.

Voeg vervolgens 10% (w/v) BSA-oplossing in water (pH 7,0) toe tot een eindconcentratie van 1% (w/v) bereikt wordt.

25 Centrifugeer het mengsel bij 4°C volgens:

Diameter (in nm) 5 45.000 xg gedurende 45 minuten 30' 10 45.000 x g gedurende 30 minuten 15 12.000 xg gedurende 45 minuten 20 12.000 xg gedurende 30 minuten

Verwijder het supernatant tot 10% van het oorspronkelijke 35 volume.

.87 027 6 0 $ -17-

Resuspendeer het (losse) pellet in het resterende supernatant.

Maak in 10,5 ml centrifugebuizen een 10-30% glycerol 5 gradient in 1% (w/v) BSA-Tris buffer, pH 8,2 met een lengte van 8 cm.

Buffer ï 20 mM Tris 150 mM NaCl 10 1% (w/v) BSA

pH 8,2 te stellen m.b.v. IN HC1

Laad de gradient met 2 ml van het geresuspendeerde pellet en centrifugeer in een SW41-rotor bij 18°C 15 volgens

Voorbeeld 3 Voorbeeld 4 Diameter (in nm) Se Té 5 125.000 x g gedurende 200 minuten 135 minuten 10 50.000 x g gedurende 200 minuten 135 minuten 20 15 15.000 x g gedurende 200 minuten 135 minuten 20 15.000 x g gedurende 135 minuten 90 minuten

Verzamel bovenste 3 cm van de gradient.

25 Verwijder de glycerol door dialyse (24 uur bij kamertemperatuur) tegen 1% (w/v) BSA-Tris buffer, pH 8,2 1 cm

Meet de A van de monsters en verdun als volgt; max 30 1 cm

Diameter (in nm) A

max 5 2,5 10 2,5 15 3,5 35 20 5,0 .8702763 * -18-

Voor de toebereiding van de E.M.- en L.M. preparaten wordt verwezen naar

Bullock, G.R. Petrusz, P. (eds.). Techniques in immuno-cytochemistry, 2 Academic Press, London, pp. 217-284 5 (1983)

Geuze, H.J., Slot, J.W., Ley, P.A., Scheffer, R.C.T. and Griffith, J.M. The Journal of cell biology. Vol.

89 pp. 653-665 (1981).

Horrisberger, M. and Rosset, J. J. Histochem. Cytochem. 10 25: 295-305 (1977).

.8702769

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van een of meer componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof waarbij gebruik wordt gemaakt van de onderlinge 5 reactiviteit van dergelijke componenten en van ten minste één gemerkte component, welke verkregen is door deeltjes van een sol van de merker direct of indirect te koppelen of adsorberen aan de component, waarbij tijdens of na afloop van de reactie, eventueel 10 na scheiding van de gebonden en de vrije gemerkte component, in het testmonster of in één van de na scheiding verkregen fracties de aanwezigheid en/of de hoeveelheid van de merker wordt bepaald met een daarvoor geschikte methode, welke bepaling een kwalita-15 tieve respectievelijk kwantitatieve indicatie geeft van de te bepalen component, met het kenmerk, dat men voor het merken een sol gebruikt van een niet-metallisch element of een verbinding daarvan.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 20 dat de gemerkte component wordt verkregen door aan een sol van een niet-metallisch element of 'verbinding daarvan toe te voegen een bepaalde hoeveelheid van de te merken component, welke laatste de soldeeltjes geheel of gedeeltelijk omhult, waarna desgewenst een 25 verdere omhulling kan plaatsvinden met een inert polair macromolecuul.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gemerkte component wordt verkregen door aan een sol van een niet-metallisch element of verbinding 30 daarvan toe te voegen een of meer inerte hydrofiele macromoleculen, die de niet-metallische deeltjes omhullen, waarna door adsorptie of via covalente bindingen de component wordt gekoppeld aan het omhullende materiaal. 97 0 27 6 9 -20-

4. Werkwijze volgens conclusie 1/ met het kenmerk, . dat de gemerkte component wordt verkregen door een sol van een niet-metallisch element of verbinding daarvan te brengen in een milieu van monomeren, deze 5 laatsten in situ te laten polymeriseren, resp. co-polyme-riseren, waardoor omhulling van de soldeeltjes van het niet-metallisch element of verbinding daarvan volgt, en vervolgens de component te adsorberen of covalent te koppelen aan het polymere materiaal.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de soldeeltjes van een niet-metallisch element of verbinding daarvan eerst worden beschermd door een hydrofiel macromolecuul, waarna (co-)polymerisatie onder invloed van een anorganische initiator plaats 15 vindt.

6. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat als soldeeltjes worden toegepast seleen, telluur, zwavel, fosfor, koolstof en/of silicium.

7. Werkwijze volgens een of meer der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat als soldeeltjes worden toegepast verbindingen van seleen, telluur, fosfor, zwavel en/of silicium.

8. Werkwijze volgens een of meer van de voorafgaande 25 conclusies, met het kenmerk, dat de te bepalen component of componenten uit een of meer receptoreiwitten en/of antigene determinanten, aanwezig aan het oppervlak van cellen, bestaan.

9. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 30 1-7, met het kenmerk, dat de te bepalen component of componenten uit een of meer immunologische componenten zoals haptenen, antigenen of antilichamen, aanwezig in een waterig testmonster, bestaan.

10. Werkwijze voor het bereiden van een gemerkte 35 component van de reactie tussen een specifiek bindend . 8702769 -21- eiwit en de bijbehorende bindbare stof door deeltjes van een sol van de merker direct of indirect te koppelen of adsorberen aan de component, met het kenmerk, dat men voor het merken een sol gebruikt van een niet-metal-5 lisch element of een verbinding daarvan.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men voor het merken een sol gebruikt van deeltjes uit seleen, telluur, zwavel, fosfor, koolstof, en/of silicium, of een verbinding van seleen, telluur, fosfor, 10 zwavel en/of silicium.

12. Testkit, te gebruiken bij de bepaling van een immunocomponent in een waterig testmonster, omvattend (a) een gemerkte immunocomponent, welke als merker soldeeltjes bevat van een niet-metallisch element 15 of een verbinding daarvan; en (b) andere reagentia. .87 027 63