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KR101851117B1 - 샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지 - Google Patents

샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지 Download PDF

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KR101851117B1
KR101851117B1 KR1020127022494A KR20127022494A KR101851117B1 KR 101851117 B1 KR101851117 B1 KR 101851117B1 KR 1020127022494 A KR1020127022494 A KR 1020127022494A KR 20127022494 A KR20127022494 A KR 20127022494A KR 101851117 B1 KR101851117 B1 KR 101851117B1
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KR
South Korea
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diaphragm
chamber
hydraulic
pneumatic
downstream
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씨. 프레데릭 바트렐
아이작 스프라규
매튜 스코트 브래그드
제이슨 카포단노
Original Assignee
마이크로닉스 인코포레이티드.
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Abstract

그 위에서 진단, 분자 또는 생화학적 분석을 수행하기 위한 마이크로유체 카트리지 및 방법으로서, 분석을 위해 필요한 모든 건조된 및/또는 액체 시약이 카트리지 내에 포함되고 분석은 단지 샘플의 첨가만을 필요로 한다. 공압유압 특징부, 챔버 및 다이어프램 기술이 마이크로유체 카트리지의 작동 중에 기포 간섭 및 시약 세척의 문제점을 극복하기 위해 도입된다. 카트리지는 분석의 수행을 위해 호스트 기구 내에 삽입되고 카트리지는 소모품으로서 공급된다.

Description

샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지 {SAMPLE-TO-ANSWER MICROFLUIDIC CARTRIDGE}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2010년 1월 29일 출원된 미국 가특허 출원 제 61/299,534호를 35 USC §119(e) 하에서 이득을 청구하고, 이 출원은 그대로 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다.
분야
본 발명은 진단, 분자 및 생화학 분석용 마이크로유체 디바이스 및 방법에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 온-카트리지(on-cartridge) 시약 저장조로부터 유체를 분배 및 배분하고, 펌핑, 가열 및 혼합하고, 기포 혼입 없이 그리고 시약 세척 없이 건조된 시약을 재수화하기 위한 마이크로유체 기술에 관한 것이다.
마이크로유체 디바이스는 진단 분석을 위한 도구로서 증가하는 사용이 발견되고 있다. 미국 특허 제 5,304,487호에서 윌딩(Wilding)에 의해 설명된 디바이스는 오프-카트리지(off-cartridge) 주사기 펌프로부터 유체 시약으로 주입되는 재사용 가능한 실리콘 기판 상에 형성된 챔버 및 "메소스케일(mesoscale)" 채널로 이루어진다. 온-카트리지 유체 및 시약 저장 및 전달에 대한 어떠한 고려도 제공되어 있지 않다. 그러나, 실용적인 상업적 용례는 "소모품" 카트리지 - 특정 분석 또는 분석 패널을 위해 요구된 모든 시약을 위한 자급식인 1회용 단일 사용 "샘플-투-앤서(sample-to-answer)" 카트리지의 경향을 유도하고 있다. 이는 특히 샘플 이월 또는 취급과 연관된 오염이 절대적으로 회피되어야 하는 분자 생물학 분석 용례의 경우에 특히 해당한다.
온 보드 시약(on board reagent)은 액체 및 건조 시약 형태의 모두를 포함한다. 이러한 양 시약 종류는 성공적인 제품의 실현시에 특정 문제점을 받고 있다. 여기서 본 출원인은 카트리지의 채널 및 챔버의 초기 습윤 및 건조된 시약의 재수화와 연관된 액체 취급 문제점을 처리한다. 마이크로유체 채널 및 챔버를 포함하는 카트리지, 특히 플라스틱 본체를 갖는 이들 카트리지의 충전 및 작동 중에, 액체 습윤은 종종 불균일하여 공기 포켓이 표면에 대해 및 코너에서 메니스커스(meniscus)를 전진함으로써 유체 칼럼 내에 종종 혼입되게 된다. 생물학적 샘플의 펌핑 및 혼합 중에, 디바이스의 분석 성능에 악영향을 미치는 포말 및 기포가 형성될 수 있다. 기포는 건조된 시약을 수납하는 채널 또는 챔버의 불균일한 충전에 기인하여 발생할 수 있다. 시약 재수화, 습윤 및 통기는 기포 형성의 문제점과 상호 연관된다. 문제점은 예를 들어 더브로우(Dubrow)의 미국 특허 제 6,068,752호 및 케네디(Kennedy)의 미국 특허 제 6,086,740호에 설명된 바와 같은 더 복잡한 유체 네트워크 및 부에쉴러(Buechler)의 미국 특허 출원 공개 제 2005/0136552호 또는 위즈골(Wyzgol)의 미국 특허 출원 공개 제 2004/024051호에 설명된 바와 같은 모세관 유동 구동 디바이스에서 악화되는데, 이들은 플라스틱 본체 디바이스 내에서 악명높게 어려운 것으로 입증되어 있다.
기포는 또한 탈가스에 기인하여 샘플 액체의 가열 중에 발생할 수 있다. 가스 용해성은 온도에 역관계되고 가열되는 용액은 즉시 과포화되게 되는 것이 잘 알려져 있다. 또한 탈가스에 의한 기포의 소스는 마이크로유체 캐비티 내의 기계적 또는 초음파 혼합 중에서와 같이 유체가 공유되는 캐비테이션이다.
기포는 마이크로유체 "큐벳(cuvette)" 내의 액체의 광학 인터로게이션(interrogation)과 간섭한다. 광의 경로는 가스 기포면의 곡률에 의해 생성된 렌즈 효과에 기인하여 및/또는 광을 굴절하는 가스 기포에 기인하여 변경될 수 있다. 기포는 기포 계면에서 용질 농도를 변경함으로써, 단백질 구조를 변성함으로써, 그리고 액체 내의 벌크 가열 레이트 및 온도의 균질성에 영향을 미침으로써 생화학적 반응과 또한 간섭할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 폴리메라아제가 타겟 핵산의 카피를 증폭하는데 사용되는 PCR 반응에서, 가열 및 냉각은 유체 내의 기포의 존재 하에서 불균일하여, 프로세스의 효율을 감소시키고 감도를 제한한다. 기포의 존재는 또한 반응 챔버 내의 유체의 체적을 감소시키고, 10 내지 50 μL 이하의 체적의 분석물을 검출하는 것에 의존하는 분석에서, 반응 챔버 내의 큰 포획된 기포의 존재는 분석물을 효과적으로 사멸할 수 있다.
레이트 결정에 의존하는 반응에서, 기포는 기판의 적절한 이용 가능성과 반응을 시작하는데 요구되는 바와 같이, 기울기의 광학적 결정 및 건조된 시약의 균질한 급속 재수화와 상당히 간섭할 수 있다. 형광성 프로브, 효소, 버퍼 또는 제어 분석물과 같은 다양한 건조된 시약이 마이크로유체 디바이스의 챔버 내에 배치될 수 있고 분석의 적절한 수행을 위해 요구된다. 습윤 중에, 하나 이상의 기포의 포집은 건조 시약과 샘플의 불완전한 용해 및 혼합을 초래할 수 있고, 이에 의해 반응 효율을 손상시키고 테스트의 감도를 감소시킨다.
레이(Lei)의 미국 특허 제 6,637,463호는 다수의 유동 경로를 통한 압력 강하, 및 따라서 유동을 평형화하기 위해 표면 장력 특징 및/또는 단면적의 사용을 통해 병렬 채널 내의 유동 임피던스를 변경하는 것을 제안하고 있다. 일 경우에, 복수의 출구 채널이 유체의 비효율적인 세척 및 공기 기포의 포획의 경향이 있을 수 있는 재순환 흐름 또는 유체 정체(stagnation)의 형성을 회피하기 위해 우물로부터 유체를 배수하는데 사용된다. 그러나, 각각의 이러한 특징부는 시행오차에 의해 설계되어야 하고, 따라서 디자인은 강인하지 않고 또는 상이한 분석을 위해 즉시 적응되지 않는다. 치수 및 표면 화학에서 미시적 변동은 마이크로유체 회로 제조에 있어서 제어가 곤란하기 때문에, 방법은 마이크로유체 카드 내의 병렬 서브회로들 사이에 유동을 균등하게 분배하는 문제점에 대한 실용적인 해결책인 것으로 입증되어 있지 않다. 습윤을 향상시키기 위한 특징부를 갖는 다이어프램의 사용의 어떠한 설명도 제공되어 있지 않다.
울마넬라(Ulmanella)(미국 특허 출원 공개 제 2007/0280856호)는 예를 들어 챔버의 바닥을 교차함에 따라 메니스커스의 선단 에지를 감속하거나 정지시키기 위한 에너지 배리어를 설치함으로써, 또는 저부면 상에 복수의 홈 또는 기둥의 사용에 의해 또는 모세관 작용을 조절하기 위해 챔버의 깊이를 조각함으로써, 또는 주사기 펌프를 사용함으로써, 원심력에 의해, 또는 챔버의 출구측 상의 진공의 인가에 의해, 챔버의 저부면을 물리적으로 개질함으로써 마이크로유체 챔버를 충전하는 유체의 메니스커스를 제어하기 위한 노력을 보고하고 있다. 이들 방법의 어느 것도 문제점에 대한 실용적인 해결책인 것으로 입증되어 있지 않다. 모세관 작용은 고도로 예측 불가능하고, 종래 기술에서 통상적으로 실시되는 바와 같이, 공기 포켓의 형성 및 주사기 펌프 또는 진공의 인가를 촉진하는 경향이 있고, 유체를 전단하고 최소 저항의 경로로 유체를 하강시키는 경향이 있어 문제점을 더 악화시킨다. 예를 들어, 평행한 다수의 진단 분석 경로들 사이에 샘플 또는 시약을 분할하기 위해 유용한 바와 같이, 단일의 입구로부터 분기하는 2개 이상의 마이크로유체 채널이 유체에 제시될 때, 유체는 가장 즉시 습윤되는 경로를 충전하고 더 높은 유체 저항을 갖는 경로를 비어 있게 방치할 것이다. 채널들 사이의 저항의 매우 미세한 차이가 당 기술 분야의 숙련자들에게 잘 알려진 문제점인 단일의 채널의 우선적인 습윤 및 분기하는 병렬 채널의 비습윤을 유도한다.
울마넬라는 마이크로유체 챔버의 습윤에 있어서 건조된 시약의 효과를 더 다루고 있고, 중앙 스폿 배치된 건조된 시약을 수납하는 챔버의 충전 효율이 50% 미만이었고, 입구측 스폿 배치된 시약을 갖는 챔버는 65% 효율에서 습윤되고, 그러나 출구측 스폿 배치된 시약을 갖는 챔버에 대해 충전 효율은 기포 없이 95%로 증가되었다는 결론을 내렸다. 그러나, 제조 중에 밀리미터 정확도를 갖는 시약 스폿의 위치 설정은 필요하지 않고 또한 건조된 시약 스폿의 존재 하에 습윤을 성취하는 만족스러운 수단도 아닌데, 이는 건조 시약이 챔버로부터 하류측 출구에 위치되면 매우 가능성이 있는 바와 같이, 시약의 농도가 하류측 채널 내로 세척에 의해 희석되지 않도록 시약이 재수화되기 전에 챔버가 완전히 습윤되는 것이 바람직하기 때문이다.
마이크로유체 채널 또는 챔버 내의 계면 및 표면 장력의 감소는 예를 들어 소수성을 감소시키기 위한 기판(들)의 플라즈마 처리 또는 계면 활성제의 채택에 의해, 그리고 채널 교점에 반경을 인가함으로써 성취될 수 있다는 것이 더 알려져 있다. 이들 처리는 또한 습윤성을 향상시키는 것으로 알려져 있지만, 혼입된 기포 및 열적 탈가스, 캐비테이션 또는 정체 구역으로부터 발생하는 기포를 기계적으로 제거하는데 있어서 효과적이지 않다. 실제로, 계면 활성제는 이들의 지속성에 의해 분석의 성능을 열화시킬 수 있는 안정한 기포 및 포말을 형성하기 위한 기체 상태의 경향을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 플라즈마 처리와 같은 프로세스에 의한 표면의 개질은 제조시에 제어가 곤란한 것으로 예측되고, 비영구적이어서 디바이스 저장 중에 점진적으로 열화된다. 따라서, 분석 채널의 초기 습윤 중에, 건조 시약의 재수화 중에 기포의 형성 및 혼입을 감소시키고, 디바이스의 작동 중에 기포의 축적 및 간섭을 방지하거나 감소시키기 위한 기계적 수단 및 방법을 개발하는 것이 바람직하고 본 발명의 목적이다.
본 명세서에서 더 일반적으로 "디바이스"라 명명하는 본 발명의 마이크로유체 카트리지는 일반적으로 그 내부에서 수행될 진단 또는 생화학적 분석의 요구에 따라 패터닝되고 유동적으로 상호 접속하는 유동 채널 및 챔버를 수용하는 가요성 플라스틱 본체로 형성된다. 분석은 샘플 내의 분석물의 존재 또는 부재(absence)를 지시하는 검출 가능한 생성물을 형성하는데 효과적인 온도 및 시간에, 하나 이상의 단계에서 통상적으로 디바이스의 하나 이상의 채널 또는 챔버에서 하나 이상의 시약과 샘플을 반응시킴으로써 행해진다. 카트리지는 통상적으로 소모품인데, 즉 이들은 1회 사용된 다음 폐기되고, 하나 이상의 분석을 위해 필요한 모든 시약을 포함한다.
분석을 수행하기 위해, 본 발명의 디바이스는 임의의 관심 타겟 분석물의 존재, 부재 및/또는 양을 지시하는 색소포 또는 형광소의 검출을 위한 분광 광도계 또는 형광 기기와 같은 광학 검출(또는 다른 검출 수단)에 의존하는 호스트 기구 내에 삽입된다. 바람직한 실시예에서, 디바이스 내의 광학 윈도우는 호스트 기구 내의 검출 수단과 인터페이스된다. 그러나, 광학 윈도우 내의 하나 이상의 가스 기포의 존재는 분석물의 검출을 손상시킬 수 있다. 기포는 또한 예를 들어 생화학적 또는 분자 반응의 앰플리콘(amplicon) 또는 다른 생성물과 같은 검출 가능한 생성물을 형성하는데 요구되는 반응과 간섭할 수 있고, 여기서 기포는 반응 혼합물의 불균일한 가열, 부적절한 혼합 또는 건조 시약의 불완전한 또는 시기 부적절한 재구성의 책임이 있을 수 있다.
사용시에, 샘플 유체는 본 발명의 디바이스 내로 도입되고, 디바이스의 유동적으로 상호 접속하는 채널 및 챔버가 이어서 생물학적 액체 샘플 단독으로, 액체 시약으로 또는 샘플과 하나 이상의 액체 시약의 혼합물로 습윤된다. 디바이스의 습윤 가능한 유동적으로 상호 접속하는 양태는 디바이스의 "유압 작업부"라 명명하고, 채널 및 챔버를 갖는 하나 이상의 마이크로유체 서브회로를 포함한다. 유압 기기의 제어는 디바이스 내의 챔버와 채널의 개별의 2차 네트워크 또는 매니폴드로서 중첩되고 가압된 공기 및 진공의 외부 소스에 의해 공급된다. 이 2차 네트워크는 디바이스의 "공압 작업부"라 명명된다. 따라서, 디바이스는 액체 또는 액체들을 이송하기 위한 1차 "유압 작업부" 및 가스를 이송하기 위한 2차 "공압 작업부"로 구성된다. 공압 네트워크는 카트리지가 분석을 수행하기 위해 인터페이스되는 호스트 기구의 밸브 및 펌프 논리에 따라, a) 프로세스 제어 및 b) 유압 네트워크를 통해 액체 또는 액체들을 구동하기 위한 포지티브 및 네거티브 압력을 제공한다.
디바이스의 유압 채널 및 챔버 내에 배치된 임의의 건조 시약의 재수화를 포함하는 샘플 취급 및 액체 시약의 혼합은 유압 기기의 습윤 중에 유체 내에 기포가 즉시 혼입되게 되는 점에서 문제가 있어 왔다. 이는 특히 초기 습윤 중에 발생하는데, 여기서 기포는 디바이스를 통해 급속하게 전진하는 메니스커스에 의해 이후에 혼합 및 가열과 연관된 캐비테이션 또는 탈가스에 의해 흡입된다. 본 발명은 하나 이상의 유체 취급 메커니즘 및 방법을 통해 이 문제점을 다룬다.
본 발명의 메커니즘, 특징부 및 방법은
1) 유압 압력 하에서 액체 체적을 수동으로 저장하고 습윤 가능한 마이크로유체 서브회로의 하류측 채널 또는 챔버의 습윤 중에 액체 체적을 배출하도록 구성된 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램,
2) 액체 시약을 저장하고 배출하기 위한 액체 중심을 갖는 이중 적층형 공압유압 다이어프램,
3) 습윤 중에 유압 챔버로부터 헤드공간을 제거하도록 구성된 공압유압 다이어프램, 또는
4) 밸브형 입구와 제 1 유압 챔버를 인터페이스하는 제 1 공압유압 다이어프램 및 밸브형 출구와 제 2 유압 챔버를 인터페이스하는 제 2 공압유압 다이어프램, 및 제 1 및 제 2 유압 챔버 사이의 상승된 상호 연통 채널을 포함하는 한 쌍의 공압유압 다이어프램으로서, 쌍은 제 1 및 제 2 공압유압 다이어프램을 가로질러 대향 압력차를 인가함으로써 채널을 통해 유체를 상호 교환하도록 구성되는 한 쌍의 공압유압 다이어프램, 및
유압 챔버 및 다이어프램은 분석의 습윤, 충전, 펌핑 또는 재수화 단계 중에 기포 혼입 또는 시약 세척을 방지하거나 감소시키도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
다양한 예시적인 실시예에 따르면, 하나 이상의 액체 시약은 제조된 바와 같이 디바이스 상의 밀봉된 저장조 내에 배치된다. 건조 시약은 채널 또는 챔버 내에 인쇄되거나 "스폿"되고, 사용시에 재수화된다. 액체 시약은 버퍼, 희석제, 용제, 용리액, 세척 시약 및 재수화 시약으로서 기능한다. 이들 능력에서, 액체는 공압 작동에 의해 이들의 밀봉된 저장조로부터 디바이스의 유압 기기 내로 요구된 바와 같이 분배된다.
바람직한 액체 시약 실시예에서, 본 발명의 밀봉된 액체 저장 저장조는 액체 중심을 갖는 2층 다이어프램으로서 구성되고, 듀플렉스 다이어프램은 디바이스의 공압 작업부 및 유압 작업부를 밀봉식으로 분리한다. 듀플렉스 다이어프램은 다이어프램이 유압 챔버 및 공압 챔버를 분리하도록 디바이스 내에 밀봉되고 에지 주위에 크림프되거나 융착되고 액체 중심에 의해 분리된 2개의 불투과성 필름층으로 구성된다. 디바이스의 공압 작업부에 대면하는 상부층은 천공에 저항하기 위한 조성물을 갖는 필름으로 형성되고, 디바이스의 유압 작업부에 대면하는 하부층은 천공에 더 민감한 조성물을 갖는 필름으로 구성된다. 다이어프램의 공압측을 가압하는 것은 유체 수용 배신 내에 배치된 첨예부(sharp) 또는 "미늘(barb)"에 대해 액체 충전된 저장조를 가압하고 상부층이 아니라 하부층을 천공한다. 파열 후에, 액체는 이어서 유압 챔버 내로 그리고 거기로부터 디바이스의 마이크로유체 습윤 가능한 채널 내로 유동한다. 다이어프램의 공압측 상에 압력을 인가함으로써, 시약의 하나 이상의 체적은 유압 작업부 내로 압력 하에서 가압될 수 있고, 압력을 반전함으로서 유체는 리플럭스하게 될 수 있다.
이 양태에서, 본 발명의 분석 카트리지는
a) 공압 작업부의 공압 챔버와 유압 작업부의 유압 챔버를 밀봉적으로 분리하는 이중 적층형 다이어프램으로서, 이중 적층형 다이어프램은 공압 작업부에 대면하는 제 1 측면 및 유압 작업부에 대면하는 제 2 측면, 제 1 측면을 형성하는 제 1 층, 및 제 2 측면을 형성하는 제 2 층을 갖고, 제 1 층 및 제 2 층은 그 사이에 액체 중심으로서 액체 체적을 포위하는 이중 적층형 다이어프램,
b) 액체 체적을 수용하고 하류측 마이크로유체 서브회로에 이송하기 위한 유체 출구, 및
c) 유압 챔버 내에 배치된 첨예부 또는 "미늘"로서, 첨예부는 이중 적층형 다이어프램이 다이어프램을 가로지르는 압력차의 인가에 의해 첨예부와 접촉하도록 관통적으로 압박될 때 제 2 층을 파열하고 유압 작업부 내로 액체 체적을 배출하기 위한 것인 첨예부를 갖는 것을 특징으로 한다.
놀랍게도, 액체는 그대로 유지되는 다이어프램의 제 1 층에 인가된 공압 압력의 직렬 펄스의 작용에 의해 일련의 더 소형의 액체 체적 내의 온-보드 시약 저장조로부터 배출될 수 있다.
선택적으로, 이중 적층형 다이어프램의 제 1 층은 파열 저항성 층이고, 제 2 층은 파열 민감성 층이다. 액체 중심은 액체 반응제, 버퍼, 재수화 유체, 용제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 액체의 온-보드 저장은 예를 들어 하류측 챔버 또는 채널 내에 배치된 건조 시약을 재수화하기 위해, 고체 상태를 헹굼하기 위해, 고체 상태 기판으로부터 타겟 분석물 또는 분석물들을 용출하기 위해, 희석물을 제조하기 위해, 색층 분석 분리를 수행하기 위해, 반응을 작동하거나 정지하기 위해, 또는 타겟 분석물 또는 분석물들을 검출하기 위해 유용하고, 오염물 이송의 가능성을 최소화한다. 선택적으로 액체 체적은 탈가스되고 이중 적층형 다이어프램은 가스 불투과성이다. 유리하게, 임의의 혼입된 기포가 탈가스된 액체 내에 재흡수되는 가능성이 있고, 탈가스된 액체는 PCR에서 열순환을 위해 유용한 바와 같이, 가열시에 탈가스에 민감하지 않다.
디바이스는 일반적으로 평면형이지만, 이들은 통상적으로 편평으로부터 약 15도로 기울어진 위치(즉, 접지 평면에 대해 각도를 이룸)에서 호스트 기구 내에 장착될 수 있고 각각의 마이크로유체 서브회로의 하류측 양태에서 통기된다. 액체 샘플 또는 시약이 유압 서브회로 내로 상류측에서 도입됨에 따라, 공기는 하류측으로 변위되고 통기된다. 액체 샘플 및 시약은 디바이스를 통해 점진적으로 충전하고 이동한다. 10 내지 35도의 각도로 카드를 기울어지게 함으로써, 프라이밍(priming)(여기서 "습윤"이라 명명함) 중에 디바이스 내의 공기는 유압 작업부로부터 즉시 더 변위되는 것으로 판명되었다. 기울어진 카드의 초기 충전 중에 전진하는 메니스커스의 주의깊은 관리에 의해, 특히 충전 중에 기포 혼입의 문제점이 실질적으로 감소되거나 방지된다.
따라서, 선택적으로, 유압 작업부는 호스트 기구의 기울어진 스테이지 상의 접지 평면에 대해 10 내지 35도의 각도로 장착될 때 작동을 위해 구성될 수 있고, 적어도 하나의 유압 챔버는 챔버로부터 기포를 배출하거나 가스를 통기하기 위해 이 챔버에 대해 위에 위치된 상호 연통 채널 및 출구를 갖고 구성된다.
본 발명의 다른 양태에서, 습윤 중에 기포의 혼입은 탄성적으로 연신된 또는 팽창된 공압유압 다이어프램의 수동 이완을 수반하는 충전 메커니즘에 의해 제한된다. 이 수동 메커니즘은 모세관에 의한 충전 및 포지티브 변위 펌프 작용 또는 진공에 의한 충전에 비해 우수한 것으로 판명되었다. 액체는 먼저 "유압 챔버"의 상부에 적층된 "공압 챔버"를 갖는 특정하게 설계된 매니폴드 내로 압력 하에서 강제 이동되고, 여기서 2개의 챔버는 유압 챔버의 루프(roof) 위로 연신하는 탄성 다이어프램에 의해 분리된다. 선택적으로, 액체는 대신에 하부 챔버 내로 흡입될 수 있지만, 유리하게는 상부 공압 챔버는 통기되고 대기압으로 개방된다. 2개의 챔버의 위치는 설명을 위해 "상부" 및 "하부" 또는 "상부" 및 "저부" 챔버로 명명되지만 상대적이고, 디바이스의 작동을 한정하지 않는다. 액체 체적이 액체 수용 챔버에 진입함에 따라, 다이어프램은 체적을 유지하도록 연신되고 변형의 에너지, 복귀력을 갖는 위치 에너지의 형태 및 스프링 상수를 탄성적으로 저장한다. 다이어프램 재료 및 변형 조건은 재료의 "탄성 한계"가 초과되지 않도록 선택된다. 다음에, 하류측 채널 또는 채널들로의 밸브를 개방함으로써, 팽창식으로 연신된 다이어프램은 그 이완된 상태로 복귀하고, 유체는 전진하는 메니스커스 내의 기포의 혼입 없이 하류측 유체 구조체를 완만하게 충전한다.
이 메커니즘 및 방법은 유동이 다수의 채널로 분할되는 경우에 놀랍게도 유리한 것으로 입증되었다. 동기하여 개방되는 개별적으로 밸브형 출구를 각각 갖는 탄성 다이어프램을 갖는 다수의 액체 수용 챔버를 상류측 스테이징 매니폴드에 제공함으로써, 병렬로 다수의 하류측 유체 서브회로 내로 액체 유동을 개시하여 지속하기 위한 유압 압력이 분리되거나 "정량화"되어 모든 채널 내로의 유동이 본질적으로 동일하고 충분해지게 된다. 하류측 채널당 총 압력 및 체적은 탄성 다이어프램 부재의 스프링 상수 및 변형의 선택에 의해 정밀하게 캘리브레이션되어 하류측 채널 내로의 액체의 복원 유동은 하류측 채널을 원하는 마크(mark; 표시부)까지 충전하기 위해 요구되는 체적이고, 스테이징 매니폴드의 각각의 다이어프램에 의해 전달되는 변위된 체적은 불충분하거나 다수의 병렬 채널 또는 서브회로 중에 균등하게 유동을 분할하는 유동 작업에 대해, 병렬로 다수의 분석을 위해 의도된 디바이스 내의 필수 유동 작동을 초과하지 않는다. 이는 당 기술 분야의 기술적인 진보이다. 임의의 공기 하류측이 전진하는 메니스커스에 의해 즉시 변위되고 이 수단에 의해 하류측 통기구로 이송된다.
이 양태에서, 본 발명의 분석 카트리지는
a) 복수의 챔버를 갖는 스테이징 매니폴드로서, 복수의 챔버의 각각의 챔버는 그 사이에 밀봉식으로 장착된 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램에 의해 유압 챔버와 공압 챔버로 분리되어, 직렬로 또는 병렬로 각각의 유압 챔버 내로 입구를 통해 유입된 액체 체적이 그 변위 체적에 상기 스테이징 매니폴드 전체를 통해 비례하는 등압 압력에 따라 각각의 에너지 저장 공압유압 다이어프램을 팽창시키게 되는 스테이징 매니폴드,
b) 입구는 충전이 완료된 후에 스테이징 매니폴드 전체에 걸쳐 유압 압력을 평형화하기 위해 밸브식으로 폐쇄 가능하고, 그리고
c) 병렬의 복수의 통기된 하류측 채널로서, 복수의 채널 중 하나의 채널은 스테이징 매니폴드의 각각의 유압 챔버와 유체 연통하고, 각각의 통기된 하류측 채널은 충전 및 가압 중에 폐쇄를 위한 그리고 배수 및 가압 해제 중에 개방을 위한 밸브를 갖고, 팽창된 상태의 탄성 공압유압 다이어프램의 유압 압력은 병렬의 복수의 통기된 하류측 채널의 초기 습윤 중에 메니스커스를 전진시키는 작업으로 수동으로 변환되는 복수의 통기된 하류측 채널을 포함한다.
더 일반적으로, 습윤 또는 "프라이밍"은 그에 유동적으로 접속된 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 회로를 통해 메니스커스를 전진시키고 이에 의해 그 내부의 임의의 가스를 기포 혼입 없이 하류측 통기구로 변위시키는 작업을 행하기 위해 유동적으로 팽창된 상태에서 탄성 공압유압 다이어프램에 기계적 특성을 장착함으로써 향상된다. 이 원리는 병렬로 복수의 하류측 마이크로유체 서브회로로 유체를 균등하게 분할하는데 있어서 특히 유리하다. 이 방식에서, 다수의 분석이 병렬로 수행될 수 있고, 단일의 샘플이 개별 하류측 검출 수단을 갖는 병렬 분석을 위해 균등하게 분할될 수 있다. 놀랍게도, 탄성 다이어프램의 기계적 특성은 예를 들어 규정된 체적 내의 건조된 시약의 규정된 질량을 재구성하는데 유용한 바와 같이, 하나 이상의 하류측 마이크로유체 서브회로를 마크까지 충전하기 위해 캘리브레이션될 수 있다.
마이크로유체 디바이스는 통상적으로 하류측 유압 네트워크 내에 배치된 적어도 하나의 건조된 시약을 또한 포함한다. 이들 시약은 통상적으로 제조 중에 스폿되거나 인쇄된다. 분석 중에, 건조된 시약은 전술된 바와 같이 분배된 액체 시약과 접촉에 의해 또는 샘플에 의해 재수화된다. 뜻하지 않게, 본 출원인은 여기에 설명된 수동 액체 습윤 메커니즘 및 방법이 당 기술 분야의 다른 기술적 진보인 기포의 혼입 없이 건조 시약의 재수화에 유리하게 적합된다는 것을 발견하였다.
관련 실시예에서, 본 출원인은 건조된 시약이 스폿되는 하류측 챔버 내에 공압식으로 작동되는 다이어프램을 제공함으로써, 이들 시약 스폿 상위에 있는 다이어프램은 a) 챔버 습윤 프로세스 중에 벌크 유체와의 접촉으로부터 시약 구역을 일시적으로 밀봉하고(통상적으로 챔버의 바닥에 중심으로 및 챔버의 바닥 상에), b) 건조된 시약 위에 헤드공간의 본질적으로 모두를 제거하거나 추출하기 위해 가압될 수 있다. 유압 챔버를 충전하기 위해 변형될 때, 다이어프램은 챔버의 주연부 주위에 완전히 밀봉되지 않는다. 다이어프램 주위에서 챔버에 진입하는 액체는 챔버의 하부 에지 주위에 분기되고 충전 중에 유압기기로부터 통기되는 임의의 잔류 공기를 즉시 변위시킨다. 다이어프램을 가로질러 압력차를 이완시키거나 반전시킴으로써, 부가의 유체가 가스 기포의 형성 또는 혼입 없이 챔버 내로 즉시 흡입된다. 시약은 단지 챔버의 하류측 출구가 밸브식으로 개방된 후에 재수화되어, 이에 의해 시약의 세척 손실을 감소시킨다. 건조 시약 챔버의 감소된 사체적(dead volume)은 따라서 유리한 것으로 판명되었다. 다행히도, 이 방식으로, 건조 시약 스폿이 재수화 시약 또는 샘플의 원하는 체적을 갖고 정밀하게 재구성될 수 있어, 시약의 생물학적 활성도가 당 기술 분야의 유용한 개선예인 분석 조건을 위해 정량적으로 정확하게 되는 것을 보장한다.
따라서, 본 발명은 또한 상류측 입구 및 하류측 통기구를 갖는 하류측 반응 챔버를 갖는 적어도 하나의 마이크로유체 서브회로를 특징으로 할 수 있고, 하류측 반응 챔버는 건조된 시약 스폿 또는 스폿들을 포함하고, 공압유압 다이어프램은 다이어프램이 헤드공간 공기를 변위시키기 위해 그리고 습윤 중에 시약 스폿 또는 스폿들 주위 및 위에 일시적 보호 텐트(tent)를 형성하기 위해 챔버의 바닥에 대해 팽창되는 제 1 위치와, 상기 다이어프램이 액체 체적으로 챔버를 충전하기 위해 그리고 기포 혼입 또는 시약 세척 없이 최대 강도에서 시약 스폿을 언커버하고 용해하기 위해 챔버의 루프에 대해 이완되어 위치되거나 흡입되는 제 2 위치를 갖고 작동하도록 구성되는 것을 또한 특징으로 한다. 건조된 시약 스폿은 버퍼, 효소, 보효소, 공동 인자, 폴리메라아제, 프라이머, 분자 비콘, 프로브, 형광소, 탈수소 효소, 산화제, 반응제, 색소포, 기판, 항체, 항원 또는 대조일 수 있다.
그 내부의 기포 혼입을 제한하면서 마이크로유체 카트리지의 습윤을 위한 방법으로서,
a) 각각의 유압 챔버 내의 액체 체적 상위에 있는 탄성 공압유압 다이어프램이 연신적으로 팽창하여 복수의 유압 챔버 내의 액체 체적을 등압식으로 가압하도록 마이크로유체 카드의 복수의 유압 챔버 내로 입구를 통해 액체 체적으로 펌핑하는 단계,
b) 각각의 유압 챔버로부터 출구를 밸브식으로 개방하는 단계로서, 각각의 출구는 통기된 하류측 마이크로유체 서브회로로의 유동 접속되는 단계, 및
c) 기포 혼입 없이 팽창된 탄성 다이어프램을 수동 이완함으로써 실질적으로 동일한 양으로 액체 체적을 각각의 습윤 가능한 마이크로유체 서브회로로 분할하는 단계를 포함하는 방법이 또한 청구된다.
탄성 다이어프램의 수동 이완에 의해 마이크로유체 디바이스를 습윤하는 것은 모세관 작용에 의해 또는 능동 펌핑에 의한 습윤과는 즉시 구별되고, 당 기술 분야에 알려진 바와 같이 기포 혼입에 의한 어려움을 극복하는데 놀랍게 유리한 것으로 입증되었다.
그 내부의 기포 혼입을 제한하면서 건조된 시약 스폿을 포함하는 마이크로유체 카트리지의 습윤을 위한 방법으로서,
a) 각각의 유압 챔버 내의 액체 체적 상위에 있는 탄성 공압유압 다이어프램이 팽창되어, 액체 체적을 등압식으로 가압하도록 마이크로유체 카드의 복수의 유압 챔버 내로 입구를 통해 액체 체적으로 펌핑하는 단계,
b) 복수의 하류측 반응 챔버 내의 제 2 다이어프램을 가압하는 단계로서, 각각의 하류측 반응 챔버는 건조된 시약 스폿을 포함하고, 제 2 다이어프램은 시약 스폿 주위 및 위를 밀봉하기 위해 그리고 하류측 반응 챔버로부터 헤드공간 공기를 변위시키기 위해 일시적 보호 텐트를 형성하는 단계,
c) 각각의 유압 챔버로부터 출구를 밸브식으로 개방하는 단계로서, 각각의 출구는 복수의 하류측 반응 챔버 중 하나로의 유동 접속되는 단계,
d) 일시적 보호 텐트 주위에 하류측 반응 챔버를 습윤하고 팽창된 탄성 공압유압 다이어프램이 이완되게 함으로써 반응 챔버로부터 임의의 잔류 공기를 변위시키는 단계로서, 액체 체적은 전진하는 메니스커스를 형성하는 단계,
e) 하류측 반응 챔버로부터 하류측의 밸브를 선택적으로 폐쇄하는 단계, 및
f) 일시적 보호 텐트를 상승시키고 각각의 챔버 내로 액체 체적의 잔여부를 이송하여, 이에 의해 기포 혼입 또는 시약 세척 없이 최대 강도로 시약 스폿을 용해하는 단계를 포함하는 방법이 또한 청구된다. 일시적 텐트는 제 2 다이어프램 부재를 가로지르는 압력차를 완화하거나 또는 반전시킴으로써 상승된다.
다른 방법에서, 공압유압 다이어프램을 갖는 챔버의 쌍이 PCR을 위해, 그리고 채널에 의해 직렬로 상호 접속될 때 유체를 상호 펌핑하기 위해 습윤 및 시약 용해를 보조하는데 사용될 수 있다. 제 1 챔버 내의 제 1 다이어프램에 교번하는 포지티브 및 네거티브 공압 펄스의 인가에 의해, 제 2 챔버 내의 제 2 다이어프램이 동기하여 구동된다. 제 2 다이어프램은 제 1 다이어프램의 펄스화된 에너지를 수용하여 탄성적으로 저장하는데 있어서 기능하는 탄성 다이어프램일 수 있다. 혼합은 2개의 챔버 사이에서 전후방으로 액체 체적을 이송함으로써 즉시 성취된다. 얇은 열교환 필름 및 적합한 접촉 가열 요소를 각각의 유압 챔버에 제공함으로써, "2-구역" PCR이 즉시 성취된다. 개량된 디바이스에서, 챔버들 사이의 상호 연통 채널은 윤곽 형성되고 상승하여 위치되어 기포가 초기 습윤 및 펌핑 중에 챔버를 소거하도록 중력으로 압박되고 가열 중에 형성하는 임의의 부가의 기포를 포집할 수 있게 된다. 상호 연통 채널은 바람직하게는 10 내지 35도의 기울기에서 작동되도록 구성되고 윤곽 형성되고, 기포로부터의 간섭을 감소시키기 위해 쌍형성된 챔버의 높은 측면에 위치된다. 유체는 타겟 핵산의 변성 온도에서 제 1 챔버와 어닐링 온도에서 제 2 챔버 사이에서 순환된다. 디바이스의 플라스틱 본체는 PCR 중에 디바이스의 기생 열 캐패시턴스를 제한한다. 열적 사이클당 8초 이하의 속도에서 핵산 증폭이 즉시 성취된다.
PCR을 위해, 증폭 시약은 디바이스에 제공된다. 통상적으로, 제 1 챔버는 제 1 시약 또는 시약들을 포함하고, 제 2 챔버는 제 2 시약 또는 시약들을 포함한다. 통상적으로, 시약은 각각의 챔버 내의 중심 또는 페리센트릭(pericentric) 구역 내에 스폿된다. 초기 습윤 중에, 챔버 내의 다이어프램은 재수화 유체 또는 샘플의 메니스커스가 스폿된 시약을 용해하고 이들을 용제를 정면으로 하여 하류측으로 이송함에 따라 발생할 수 있는 재수화 및 임의의 세척을 제한하기 위해 시약을 아래로 누르고 커버하도록 팽창식으로 확장된다. 초기 습윤 후에, 흡입 압력이 챔버 내로 유체를 흡입하고 그 내부에 시약을 용해하기 위해 다이어프램에 인가될 수 있다. 대안적으로, 상류측 챔버가 하류측 챔버를 유압식으로 팽창시키고 시약을 용해하기 위해 가압될 수 있다. 유동의 유체 방향은 혼합 및 재수화를 향상시키기 위해 1회 이상 반전될 수 있다.
따라서, 본 발명은 "2-구역 열순환"을 위한 열적 인터페이스 및 PCR 증폭을 구동하고 제어하기 위한 공압 수단과의 공압 인터페이스를 갖는 호스트 기구와 함께 사용을 위한 카트리지를 또한 포함할 수 있다. 디바이스는 타겟 핵산을 주기적으로 변성하고 어닐링하기 위해 2개의 상호 접속된 유압 챔버 내의 쌍형성된 다이어프램의 상호 공압유압 작용에 의해 동작하고, 카트리지는 유리하게는 기포의 혼입 없이 액체로의 챔버의 습윤을 향상시키기 위해 본 발명의 하나 이상의 습윤성 특징을 갖는다. 디바이스는 또한 습윤 중에 세척 손실 없이 고정 체적 내에 시약을 용해시키기 위해 유리하여, 프라이머, 버퍼 및 다른 시약이 재구성될 때 고정 강도에 있는 것을 보장한다.
따라서, 본 발명의 다양한 양태는 진단 및 생화학적 분석을 위한 마이크로유체 카트리지의 작동에 신규한 실용성을 제공하고, 이들 디바이스에 의한 다년간의 문제점의 원천이 되어 왔던 기포 간섭의 제한을 위한 메커니즘 및 방법으로서 유리한 것으로 판명되었다.
이하의 설명에서, 본 발명의 특정 양태 및 실시예가 명백해질 것이다. 이들 양태 및 실시예는 단지 예시적이고 설명적인 것이고 발명을 한정하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 다른 특징 및 장점이 이어지는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 카트리지가 분석을 위한 모든 시약을 수납하고 단지 생물학적 샘플의 도입만을 필요로 하는, 본 발명의 1회용 단일 사용 샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지의 2개의 사시도.
도 2는 그 위에서 분석의 수행을 위한 호스트 기구 내의 분석 카트리지의 삽입을 도시하는 도면.
도 3a는 호스트 도구의 메커니즘 내에 삽입된 상태의 카트리지의 상세도이고, 메커니즘은 도 3b에 도시된 가열 매니폴드 및 공압 제어 인터페이스를 포함하는 도면.
도 4는 액체 시약을 운반하는 액체 중심 포일 다이어프램 팩을 갖는 1회용 마이크로유체 카트리지의 분해도.
도 5a는 바이오샘플로부터 핵산 타겟의 추출을 위한 마이크로유체 회로의 사시도이고, 도 5b는 추출 프로세스의 개략도.
도 6a 내지 도 6g는 마이크로유체 디바이스의 유압 작업부 내로 천공하여 액체를 배출하기 위한 액체 시약 중심 및 첨예부 또는 "미늘"을 갖는 2층 듀플렉스 다이어프램으로 형성된 시약 저장조의 도면.
도 7a 및 도 7b는 호스트 기구 내에 장착된 상태로서 경사를 갖고 기울어진 마이크로유체 카트리지를 도시하는 도면.
도 8a 및 도 8b는 마이크로유체 카트리지 상에서 PCR을 수행하기 위한 채널 및 챔버의 네트워크의 앙시도(worms-eye view).
도 8c 및 도 8d는 대안 카트리지 구성의 앙시도.
도 9a 내지 도 9l은 스테이징 매니폴드(staging manifold)를 갖는 수동 초기 습윤 메커니즘을 개략적으로 도시하는 도면.
도 10a 내지 도 10c는 시약이 PCR을 위해 준비시에 재수화되는 스테이징 매니폴드의 작동을 도시하는 도면으로서, 작동 시퀀스가 도 10d 내지 도 10g에 도시되어 있는 도면.
도 10d 내지 도 10g는 상호 다이어프램 작용을 갖는 듀얼 챔버를 사용하는 PCR 증폭을 도시하는 도면.
도 11은 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 방법의 단계를 도시하는 도면으로서, 액체 중심을 갖는 2층 듀플렉스 다이어프램이 시약을 분배하는데 사용되는 도면.
도 12는 액체 중심을 갖는 2층 듀플렉스 다이어프램으로부터 액체가 분배되는 유압 작업부의 마이크로유체 채널을 프라이밍하기 위한 방법의 단계를 도시하는 도면.
도 13은 기포 혼입 없이 건조 시약을 재수화하기 위한 방법의 단계를 도시하는 도면.
도 14a 및 도 14c는 역전사효소 매개물 PCR을 위한 마이크로유체 채널 및 챔버의 네트워크의 앙시도이고, 도 14b는 cDNA의 생성을 위한 인라인 챔버의 상세도.
도 14d 및 도 14e는 변형된 형태를 갖는 카트리지의 대안 구성을 도시한 도면.
도 15는 형광 종단점을 모니터링하기 위한 본 발명의 디바이스의 검출 챔버의 광학 윈도우의 사용을 도시하는 도면.
도 16은 호환성 호스트 기구와 카드를 인터페이스하기 위한 가스켓과의 공압 인터페이스 및 PCR을 수행하기 위한 2 부분 마이크로유체 카드 조립체의 더 상세도.
도 17은 반응 혼합물의 온도를 증가시키는 동안 샘플의 다수의 스캔을 포함하는 카트리지의 검출 챔버 내의 포지티브 및 네거티브 형광 분석을 도시하는 플롯.
도 18a 및 도 18b는 도 17의 통합 데이터(pooled data)를 분석하는 도면으로서, 분자 비콘-앰플리콘 듀플렉스가 호환성 호스트 기구와 인터페이스될 때 카트리지의 FRET 용융 곡선 능력을 설명하는 도면.
도 19는 그와 호환성이 있는 호스트 기구에 사용될 때 본 발명의 디바이스로 얻어지는 앰플리콘에 대한 FRET 데이터를 도시하는 도면.
이하의 상세한 설명은 도시의 목적으로 특정 상세를 포함하지만, 당 기술 분야의 숙련자는 이하의 상세에 대한 다수의 변형 및 변경이 청구된 발명의 범주 내에 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이하의 정의는 청구된 바와 같은 발명을 설명하는데 있어서 보조로서 설명된다.
정의
"카트리지"는 호스트 기구 내로의 삽입에 의해 작동을 위해 설계된 분석 디바이스이다. 호스트 기구는 분석의 수행을 위한 공압 압력, 펄스 및 검출 수단을 공급한다. 카트리지는 유압 작업부 및 공압 작업부를 포함하고, 매립형 마이크로유체 채널 및 챔버를 갖는 매립형 마이크로유체 "카드"를 포함할 수 있다. 샘플 및 시약 액체가 카트리지 또는 카드의 유압 네트워크 내에서 이송되고, 유체 유동은 선택된 접합부, 채널 및 챔버에서 유압 기기와 인터페이스하는 공압 네트워크에 의해 제어되고 구동된다. 통상적으로, 카트리지 또는 카드의 본체는 가요성 플라스틱으로 제조되고 적층, 성형 또는 이들의 조합에 의해 형성될 수 있다. 플라스틱은 이들에 한정되는 것은 아니지만, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 고리형 폴리올레핀, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 폴리스티렌, 이식편 및 블록 공중합체 및 이들의 복합 재료를 포함할 수 있다. 바람직한 카트리지는 롤스톡(rollstock)으로부터 제조되고, 그 위에 인쇄된 건조 시약을 포함한다.
디바이스의 "유압 작업부"는 분석 도중에 샘플 또는 액체 시약에 의해 습윤되도록 의도된 상호 연통 채널 및 챔버의 네트워크 또는 네트워크들을 포함한다. 유압 네트워크는 분석의 단계를 수행하기 위한 마이크로유체 서브회로를 갖고 구성된다.
디바이스의 "공압 작업부"는 디바이스의 유압 기기에 동력 공급하고 제어하기 위해 유용한 공압 작동식 밸브, 펌프 및 다이어프램 및 상호 연통 회로 및 매니폴드의 네트워크 또는 네트워크들을 포함한다. 카트리지 디바이스의 공압 작업부는 호스트 기구 상의 포지티브 및 네거티브 압력 소스 및 유압 작업부 내의 액체를 제어하고 구동하는 다른 공압 작동식 요소와 인텨페이스한다.
디바이스의 "마이크로유체 작업부"는 분석 도중에 습윤된 내부 채널 및 챔버의 네트워크 또는 네트워크들로 형성된 유압 작업부 및 호스트 기구 상에 포지티브 및 네거티브 압력 소스에 의해 동력 공급된 회로를 구동하는 펌프 및 밸브 제어부로 형성된 공압 작업부를 포함한다.
마이크로유체 작업부는 각각의 서브회로가 액체 샘플 또는 시약 상에 특정 기능을 수행하기 위한 채널 및 챔버를 포함한다. 마이크로유체 서브회로는 직렬 서브회로(예를 들어, 핵산 타겟 또는 타겟들의 추출, 증폭 및 검출을 위한) 및 샘플을 분할함으로써 단일 샘플 상의 다수의 타겟을 위한 동시 분석을 위한 것과 같은 병렬 서브회로 및 네트워크로 편성될 수 있다.
"상부", "저부", "상", "하", "위", "아래", "상향", "하향", "~보다 위의", "바닥", "루프(roof)" 등은 교차 수직 라인에 직교하는 것으로서 취해지는 "접지 평면"과 같은 특정 기준 프레임에 대한 참조가 이루어지지 않으면, 절대적인 위치가 아니라 상대적인 위치의 지시이다.
"습윤"("습윤하다")은 카트리지의 유압 작업부의 내부에서의 플라스틱 표면의 초기 수화를 칭한다. 계면 장력 효과에 기인하여, 초기 습윤은 상당한 에너지 배리어를 극복하는 것을 수반할 수 있고, 이들 디바이스 내의 모세관 유동에 대한 저항의 주요 팩터이다.
"타겟 분석물" 또는 "관심 분석물" 또는 "타겟 분자"는 핵산, 단백질, 항원, 항체, 탄수화물, 세포 성분, 지질, 수용체 리간드, 약물과 같은 소형 분자 등을 포함할 수 있다. 타겟 핵산은 유전자, 유전자의 부분, 유전자의 조절 배열, mRNA, rRNA, tRNA, siRNA, cDNA를 포함하고, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 3중 가닥일 수 있다. 몇몇 핵산 타겟은 다형성(polymorphism), 단일 뉴클레오티드 다형성, 삭제 및 대립 변형과 같은 교대 스플라이스 배열을 갖는다. 다중 타겟 도메인은 단일 분자로 존재할 수 있는데, 예를 들어 면역원이 다중 항원 결정자를 포함할 수 있다. 항체는 가변 영역, 일정 영역 및 고정 항체 내의 값을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 타겟 분석물은 일반적으로 제조된 바와 같은 카트리지를 구비하지 않지만, 분석될 액체 샘플 내에 포함되는데, 반대로 "표본 분석물"은 통상적으로 카트리지를 구비하고 또는 특정 유형의 샘플 내에 통상적으로 존재하고 분석의 적절한 수행을 보장하기 위해 분석된다. 스파이크된 샘플이 당 기술 분야에 공지된 바와 같이 계산을 위해 특정 품질 제어 시험에 사용될 수 있다.
"증폭 수단": 그 선행 기술이 미국 특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호 및 제 4,800,159호, 오수벨(Ausubel) 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 미국 메릴랜드주 볼티모어, 1989년) 및 이니스(Innis) 등("PCR Protocols", Academic Press, Inc. 미국 캘리포니아주 샌디에이고, 1990년)에 상세히 설명되어 있는 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR이라 칭함)이다. 폴리메라아제 연쇄 반응 방법론은 열순환을 필요로 하고 당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 간략하게, PCR에서, 타겟 배열의 대향하는 상보형 가닥 상의 영역에 상보적인 2개의 프라이머 배열이 준비된다. 과잉의 디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트가 DNA 폴리메라아제, 예를 들어 Taq 폴리메라아제와 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 타겟 배열이 샘플 내에 존재하면, 프라이머는 타겟에 결합되고 폴리머라아제는 뉴클레오티드 상에 첨가함으로써 마커 배열을 따라 연장되게 될 수 있다. 반응 혼합물의 온도를 상승 및 하강함으로써, 연장된 프라이머는 반응 생성물을 형성하기 위해 템플레이트로부터 해리될 수 있고, 과잉의 프라이머가 템플레이트 및 반응 생성물에 결합되고 프로세스가 반복된다. 형광성 개재제(intercalating agent)를 첨가함으로써, PCR 생성물은 실시간으로 검출될 수 있다.
다른 증폭 프로토콜은 LAMP(DNA의 루프-매개 등온 증폭) 역전사 폴리메라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 리가제 연쇄 반응("LCR"), 핵산 배열 기반 증폭(NASBA)을 포함하는 전사 기반 증폭 시스템(TAS), "롤링 서클", "RACE"를 포함하고 또한 검출 가능한 프로브에 상보적인 가닥이 과잉으로 합성되는 점에서 장점을 갖는 "비대칭 PCR"이라 명명된 "편측성 PCR"이 또한 사용될 수 있다.
이들 다양한 비-PCR 증폭 프로토콜은 진단 분석에서 다양한 장점을 갖지만, PCR은 분자 생물학 연구실 및 임상 진단에 주력을 남기고 있다. 마이크로유체 PCR을 위해 여기에 개시된 실시예는 하나 또는 다양한 증폭 프로토콜을 실행하는 것이 가능한 일반적인 종류의 마이크로유체 디바이스를 대표하고 예시하는 것으로 고려되어야 한다.
통상적으로, 핵산 증폭 또는 확장은 증폭 반응을 수행하고 이 반응 혼합물이 타겟 핵산의 증폭을 허용하는 온도 조건을 받게 하기 위해 반응 성분을 함유하는 "마스터 혼합물"과 상이한 배열을 가질 수 있는 하나 이상의 타겟 핵산을 혼합하는 것을 수반한다. 마스터 혼합물 내의 반응 성분은 반응 혼합물의 pH를 조절하는 버퍼, 핵산의 합성을 위해 필요한 에너지 및 뉴클레오사이드를 제공하는 천연 뉴클레오티드(A, C, G 및 T 또는 U - 종종 동등한 농도로 존재함 - 에 대응), 핵산 합성의 개시를 용이하게 하기 위해 템플레이트에 결합하는 프라이머 또는 프라이머 쌍 및 합성되는 상보형 핵산 가닥에 뉴클레오티드를 첨가하는 폴리메라아제를 포함할 수 있다. 그러나, 증폭 수단은 핵산 타겟을 검출하기 위한 보조로서 프루던트(Prudent)의 미국 특허 제 7,514,212호 및 마샬(Marshall)의 미국 특허 제 7,517,651호 및 제 7,541,147호에 설명된 것과 같은 개질된 또는 "비표준형" 또는 "비천연" 염기의 사용을 또한 포함한다.
"검출 수단": 본 명세서에 사용될 때, 정량적 또는 정성적일 수 있고 분광 광도계, 형광 기기, 조도계, 광전자증배관, 포토다이오드, 탁도기, 광자 카운터, 전압계, 전류계, pH 미터, 용량성 센서, 무선 주파수 송신기, 자기저항계 또는 홀 효과 디바이스를 포함할 수 있는 종점, 즉 분석의 결과를 표시하기 위한 장치를 칭한다. 커버 플레이트 내의 배율 렌즈, 광학 필터, 착색 유체 및 라벨 부착된 프로브가 분석 결과의 검출 및 해석을 향상시키는데 사용될 수 있다. "라벨" 또는 "태그"는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 색소포 및 형광소와 같은 염료 및 당 기술 분야에 공지된 바와 같은 화학 발광원을 포함한다. 자기 비드 상에 장식된, ZnS로 코팅된 CdSe와 같은 QDots 또는 QDots의 아말감화 및 상자성 Fe3O4 마이크로입자가 본 발명의 분석의 감도를 향상시키는 편리한 방법이다. 형광성 켄칭(quenching) 검출 종점이 또한 예상된다. 효소 결합 면역분석과 연관된 다양한 기판 및 생성물 색소포가 또한 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 "업컨버팅(un-converting)" 형광소와 같은 분석의 감도를 향상시키기 위해 검출된 신호를 증폭하기 위한 수단을 제공한다.
"분자 비콘": 용액 내의 특정 핵산의 존재를 보고하도록 설계된 단일 가닥 헤어핀형 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 분자 비콘은 4개의 구성 요소, 즉 스템, 헤어핀 루프, 종단 라벨 부착된 형광소 및 대향하는 종단 라벨 부착된 켄처(quencher)로 이루어진다. 헤어핀형 비콘이 타겟에 결합되지 않을 때, 형광소 및 켄처는 함께 근접하여 위치되고 형광이 억제된다. 상보형 타겟 뉴클레오티드 배열의 존재시에, 비콘의 스템은 타겟을 혼성체화하도록 개방된다. 이는 형광소 및 켄처를 분리하여, 형광소가 형광하게 한다. 대안적으로, 분자 비콘은 종단 라벨 부착된 공여자의 부근에서 방출하는 형광소를 또한 포함한다. '파장 시프트 분자 비콘'은 형광소가 더 강하게 방출하게 하는 부가의 수확자 형광소를 구비한다. 분자 비콘의 현재의 리뷰는 왕 케이(Wang K) 등, 2009년, Molecular engineering of DNA: molecular beacon, Angew Chem Int Ed Engl, 48(5): 856-870과, 시셀 케이 에이(Cissel K A) 등, 2009년, Resonance energy transfer methods of RNA detection, Anal Bioanal Chem 393(1): 125-35 및 리 와이(Li Y) 등의 2008년의 Molecular Beacons: an optimal multifunctional biological probe, Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61을 포함한다. 최근의 진보는 캐디 엔씨(Cady NC), 2009년, Quantum dot molecular beacons for DNA detection, Methods Mol Biol 554:367-79를 포함한다.
형광 핵산 분석은 태그 부착된 프라이머 및 프로브 기반 검출 화학으로의 증폭을 포함한다. 형광성 생성물은 분석의 종료시에 또는 실시간으로 증폭된 제품의 양을 측정함으로써 분석될 수 있다. 한정적인 것은 아니지만, 3' 켄처 구성을 갖는 5' 리포터 다이의 변위 및 폴리메라아제 매개 가수 분해에 의존하는 TaqMan 프로브[어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)], FRET 혼성체화 프로브, 듀얼 올리고 FRET 기반 프로브[로쉐(Roche)], 마이너 홈 바인더 공액 혼성체화 프로브(MGB 프로브, 어플라이드 바이오시스템즈), Eclipse 프로브, Locked NA 프로브[엑시콘(Exiqon)/로쉐], Amplifluor 프라이머 화학, Scorpions 프라이머 화학, LUX 프라이머, Qzyme 프라이머, RT-PCR이 무엇보다도 본 발명에 모두 적합하다. 형광성 프로브는 Syber Green
Figure 112012069207843-pct00001
[몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)], 에티듐 브로마이드 또는 티아졸 오렌지, FRET 프로브, TaqMan
Figure 112012069207843-pct00002
프로브(로쉐 몰레큘러 시스템즈), 분자 비콘 프로브, Blck Hole QuencherTM[바이오서치 테크놀로지스(Biosearch Technologies)], MGB-Eclipse
Figure 112012069207843-pct00003
프로브[나노겐(Nanogen)], ScorpionsTM(DXS Ltd) 프로브, LUXTM 프라이머-프로브[인비트로겐(Invitrogen)], SunriseTM 프로브[온코(Oncor)], MGB-Pleiades(나노겐) 등과 같은 개재 프로브를 포함한다. 프로브 기술의 최근의 진보는 예를 들어 루크타노프 이에이(Lukhtanov EA) 등, 2007년, Novel DNA probes with low background and high hybridization-triggered fluorescene, Nucl Acids Res 35:e30에 의해 리뷰되어 있다. 역전사효소가 RNA 타겟을 분석하는데 사용되고 cDNA를 형성하기 위한 개별 단계를 필요로 한다. 최근의 진보는 크라스노페로프 엘엔(Krasnoperov LN) 등[2010년, Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids, Bioconjug Chem 2010년 1월 19일 epub]을 포함한다.
화학 염료에 추가하여, 프로브는 녹색 형광성 단백질, 양자점 및 나노점을 포함하고, 이들 모두는 형광성이다. 핵산 및 항체와 같은 분자 및 분석 타겟을 위한 친화도를 갖는 다른 분자가 본 발명의 형광 분석에 유용한 프로브를 형성하기 위해 형광소로 태그 부착된다.
"FRET"(형광 공진 에너지 전달)-은 분자 상호 작용의 조사를 가능하게 하는 형광 기술이다. 이는 혼성체화될 때와 같이 2개의 분자가 매우 근접할 때 하나의 형광소로부터 다른 형광소(즉, 공여자 및 켄처)로 에너지의 전달에 의존한다. 최근의 진보는 카모나 에이케이(Carmona AK) 등, 2009년, The use of fluorescene resonance energy transfer(FRET) peptides for measurement of clinically important proteolytic enzymes, Ann Acad Bras Clenc 81(3):381-92를 포함한다.
문맥상 달리 요구되지 않으면, 이어지는 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "포함한다" 및 "포함함" 및 "포함하는"과 같은 그 변형은 "포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌"과 같은 개방형 포함 개념으로 해석되어야 한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 "일 실시예", "실시예", "일 양태" 또는 "양태"의 언급은 실시예 또는 양태와 연계하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 반드시 본 발명의 모든 실시예가 아니라 일 실시예에 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 더욱이, 여기에 개시된 본 발명의 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. "통상의"는 본 발명이 관련되는 종래 기술에 공지되어 있는 것을 지시하는 용어이다. "약" 및 "일반적으로"는 "단지 약"의 개념에서 "더 많거나 적은", "대략적으로" 또는 "거의"인 조건을 설명하고, 변형이 사소하고, 명백하고 등가적인 실용성 또는 기능을 가질 수 있는 경우에 규범, 규칙 또는 한계로의 명백한 소수의 예외의 존재를 더 지시하는 부정확성의 확장 표현이다.
도면의 설명
도면을 참조하면, 도 1a 및 도 1b는 본 발명의 1회용 단일 사용 샘플-투-앤서 마이크로유체 카트리지의 2개의 사시도를 도시하고, 카트리지는 분석을 위한 모든 시약을 수납하고 생물학적 샘플의 도입만을 필요로 한다. 이 대표적인 실시예에서, 카트리지(100)는 취급의 편의를 위해 커버플레이트(103)를 갖는 보호 섀시 또는 본체(102)를 포함한다. 커버플레이트는 샘플의 첨가를 위한 입구 포트(104)를 포함하고 수납한다. 카트리지의 돌출 노즈(105)가 호스트 기구의 도킹 베이 내에 삽입된다(도 2). 카트리지 본체의 돌출 노즈는 이에 한정되는 것은 아니지만, 호스트 기구 내에 삽입될 때 타겟 분석물의 반사성 투광 및 형광 검출을 위해 도킹 베이의 이면 미러와 정렬하는 광학 윈도우 절결부(101)를 포함한다. 또한, 카트리지의 하부면에는 마이크로유체 카트리지의 구역을 가열하기 위한 열적 인터페이스(110) 및 도킹 베이 내의 호스트 기구의 공압 제어 인터페이스에 카트리지를 밀봉식으로 안착하기 위한 1회용 가스켓(111)이 있다. 카트리지 본체는 도 16에 도시된 바와 같이 마이크로유체 카드를 포함할 수 있지만, 마이크로유체 작업부는 선택적으로 카트리지 본체에 일체일 수 있다.
도 2는 호스트 기구(200)의 도킹 베이(201) 내의 분석 카트리지(100)의 가역성 삽입(이중 화살표)을 나타낸다. 분석의 수행은 도시된 바와 같이 일반적으로 조작자 인터페이스로 제어된다. 광학 윈도우(101)는 호스트 기구의 섀시(202) 내부의 검출 장치와 정렬된다.
도 3a는 호스트 기구의 메커니즘 내에 삽입된 상태의 카트리지의 상세도이다. 경사진 장착 플레이트(300)가 고정 각도 세타(도 7b 참조)로 메커니즘(및 카트리지)을 기울어지게 하는데 사용되고, 이는 초기 습윤 중에 공기의 통기 및 기포의 혼입을 보조한다. 호스트 기구는 트랙 장착된 스캐닝 검출기 헤드(303) 및 카트리지의 광학 윈도우(101)와 인터페이스하기 위한 모터화 클램핑 메커니즘(304)을 갖는 광학 조립체를 포함한다. 광학 조립체 및 도킹 베이는 경사진 장착 플레이트에 볼트 조임된 부유 스테이지의 부분으로서 장착되지만, 카트리지가 도 3b에 도시된 열적 제어 모듈(310) 및 공압 인터페이스 포트(330)에 대해 클램핑될 수 있도록 서스펜션 장착된다. 호스트 기구, 도킹 베이 및 광학 패키지의 추가의 설명은 본 명세서에 완전히 참조로서 포함되어 있는 발명의 명칭이 "휴대형 고이득 형광 검출 시스템(PORTABLE HIGH GAIN FLUORESENCE DETECTION SYSTEM)"인 계류중인 국제 특허 출원 공개 제 2010/088514호에 제공되어 있다.
열적 제어 모듈(310) 및 10개의 공압 포트를 갖는 공압 제어 인터페이스(330)가 도 3b에 더 상세히 도시되어 있고, 이 도 3b는 경사진 장착 플레이트(300)의 부분도를 포함한다. 카트리지의 하부면(열적 인터페이스로서 열 전도성 폴리머의 얇은층으로 밀봉됨)은 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 "구역" 가열 요소(311, 312, 313, 314)의 상부면에 접촉한다. 팬(315)이 냉각을 위해 제공된다. 제 1 가열 요소의 상부면은 미러면(320)을 구비하고, 도킹 베이 내에 정렬될 때 카트리지의 광학 윈도우(101)를 통해 반사광 및/또는 형광성 배출물을 투광하고 캡처하기 위한 호스트 기구의 광학 기기와 함께 작동한다.
도 4는 취약한 액체 저장조 내에 온-보드 액체 시약을 갖는 1회용 마이크로유체 카트리지(100)의 분해도이다. 각각의 시약 저장조는 액체 시약을 운반하는 2층 듀플렉스 다이어프램 피크 팩이다. 카트리지 섀시는 하우징 내의 개별 우물(426) 내에 시약 저장조(421, 422, 423, 424)를 지지한다. 여기에 예시된 바와 같은 카트리지는 PCR을 위해 설계된 카트리지이고, 4개의 액체 시약을 포함한다. 카트리지 섀시(102)의 전방 노즈(105) 상의 광학 윈도우 절결부(101)가 재차 도시되어 있다. 또한 커버플레이트(103) 하부의 섀시 내부에는 분석시에 발생된 액체 폐기물을 격리하기 위한 흡착 패드(430)가 있다. 카트리지(100)는 1회용이고, 생물학적 위험 폐기물의 유실을 방지하기 위해 밀봉된다. 디바이스의 커버덮개(103) 상의 샘플 입구(104)는 디바이스 내의 단지 외부 액세스 가능한 유체 포트이다. 모든 시약(임의의 건조 시약 및 임의의 액체 시약 또는 재수화 유체를 포함함)이 디바이스의 구조체 내에 제공된다.
카트리지 섀시의 하부면 상에는, 마이크로유체 작업부를 수납하는 2개의 "카드", 즉 "외향 카드"(410) 및 "내향 카드"(400)가 제공된다. 이들 카드는 적층된 및/또는 성형된 층으로 구성되고 PCR 분석을 위해 설계된 유압 및 공압 네트워크를 포함한다. 이들은 일반적으로 가요성이고 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리카보네이트와 같은 플라스틱으로 제조되지만, 이들에 한정되지는 않는다. 디스크(409)는 샘플로부터의 핵산의 추출에 사용되는 글래스 고체 상태 흡착제이다. 밀봉 패치(425)가 고체 상태 디스크(409)의 설치 후에 외향 카드의 유압 작업부를 밀봉하기 위해 요구된다.
외향 카드(410)는 도 5b에 개략 도시된 프로토콜에 의해 핵산을 추출하기 위해 액체 시약 저장조(421, 422, 423, 424) 및 고체 상태 흡착제 디스크(409)와 함께 동작하는 유동 회로를 포함한다. 내향 카드(400)는 2개의 카드(400, 410) 사이의 유체 계면[카드 접합부를 형성하기 위한 중첩 텅부(411a/411b)]을 경유하여 정화된 핵산을 수용하고, 카드 내에 매립된 마이크로유체 채널의 유압 네트워크 내의 증폭 및 검출을 수행한다. 내향 카드는 카드 본체 내에 포위된 검출 챔버의 상부 및 저부를 밀봉하는 검출 윈도우(101a)를 형성하는 얇은 표면 필름을 포함한다. 이들 챔버는 50 uL 미만의 유체를 수납하고 도 3b의 가열 블록과 접촉에 의해 가열된다. 가스켓(111)은 카드 텅부(411b)에서 내향 카드의 하부면에 공압 제어 인터페이스를 밀봉하기 위해 제공되는데, 이 카드 텅부는 마이크로유체 디바이스 내에 호스트 기구의 공압 분배 매니폴드에 접속하여 이를 연장시킨다.
도 5a는 바이오샘플로부터 핵산 타겟의 추출을 위해 카트리지 섀시 및 액체 시약 저장조와 인터페이스하는 외향 카드(411)의 사시도이고, 도 5b는 추출 프로세스의 개략도이다. 붐 방법(Boom method)(미국 특허 제 5,234,809호)에 기초하는 추출 프로세스에서, 샘플은 카오트로픽제(chaotraopic agent)와 세제의 혼합물로 이루어진 용해 버퍼와 혼합되고, 고체 상태 흡착제(409)와 접촉된다. 폐기물로 이송되는 세척 버퍼의 다수의 부분표본으로의 세척 후에, 흡착된 핵산(501)은 희석 버퍼 용액으로 용출되고 텅부(411a) 아래의 유체 연통 포트 시스템을 통해 내향 카드(400) 상의 스테이징 매니폴드로 전달된다(개방 화살표, 도 7a). 이 스테이징 매니폴드의 액체 내용물은 이하에 설명되는 바와 같이 핵산 증폭을 위해 사용된다. 추출의 각각의 단계에서, 액체 시약이 요구된다. 각각의 액체 시약은 액체 중심을 갖는 2층 포일 다이어프램에 저장되고, 액체는 다이어프램의 하부층을 (단지) 파열시키고 카드의 유압 작업부 내에 유체를 강제 이동하는 첨예부에 대해 2층 다이어프램을 추진하는 공압 액추에이터의 제어 하에서 배출된다. 이 프로세스는 도 6a 내지 도 6g에 도시되어 있다.
도 6a 내지 도 6g는 액체 시약 중심(601) 및 저장조 아래에 배치된 "첨예부"(610) 또는 "미늘"을 갖는 이중층(즉, 2층) 다이어프램[층(602, 603)]으로 형성된 시약 저장조 파우치(600)의 다양한 도면을 제공하고, 첨예한 팁은 우물(426)을 갖고 형성된 밀봉된 내부 챔버(615) 내에 2개의 다이어프램층(603a/603b)의 하부에 대해 상향으로 지향한다. 첨예한 부재(610)는 마이크로유체 카트리지 또는 카드의 유압 작업부 내에 액체 내용물을 천공하고 배출하기 위해 성형된다.
도 6a는 액체 중심을 둘러싸는 2개의 다이어프램층으로 이루어진 유체 충전 파우치 또는 저장조를 도시한다. 2개의 층은 도 6b 및 도 6c의 파우치를 통한 단면도로 도시된다. 층(602, 603)은 액체 중심(601)을 에워싼다. 2개의 층이 에지(604)에서 밀봉된다. 폴리에스테르 및 다른 플라스틱의 포일 코팅층이 다이어프램층(602, 603)을 형성하는데 사용되었다. 상부층(602)은 일반적으로 강인하고 가요성이며, 천공에 저항한다. 대조적으로, 저부층(603)은 첨예부(610)에 의해 천공되고 여기에 실제 축적대로 도시되어 있지 않은 시약 출구 채널(611)(도 6d)을 경유하여 카트리지의 마이크로유체 작업부 내로 그 내용물을 배출하도록 설계된다. 도 6b는 밀봉된 에지(604a)를 갖는 액체 중심(601a)을 둘러싸는 다이어프램층(602a, 603a)을 갖는 양면 볼록형 저장조를 설명하고, 도 6c는 조립 및 사용시에 특정 장점을 각각 갖는 밀봉된 에지(604b)를 갖는 액체 중심(601b)을 둘러싸는 다이어프램층(602b, 603b)을 갖는 평철형(planoconvex) 저장조를 설명한다.
도 6d에서, 시약 저장조는 카트리지 하우징의 시약 챔버(615) 내에 액체 중심(601)을 에워싸는 듀플렉스 다이어프램으로서 장착된 것으로 도시되어 있다. 립 밀봉부(605)가 유압 작업부(612)로부터 공압 작업부(606)를 격리한다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 립 밀봉부(605)는 당 기술 분야에 공지된 UV-작동식 접착제로의 접착 또는 다른 밀봉 방법에 의해 형성될 수 있다. 공압 제어 포트(607)를 통해 공기에 의해 가압될 때, 듀플렉스 다이어프램 조립체(600)의 하부면은 첨예부(610)에 대해 가압되어 상부 필름층(602)이 아니라 저부 필름층(603)이 파열되게 된다(도 6b 내지 도 6c). 이 방식으로, 메커니즘은 마이크로 치수 공압 다이어프램-작동식 액체 분배기가 된다. 놀랍게도, 일단 액체 중심이 관통되면, 직렬 공압 펄스가 출구 채널(611)을 통해 유압 작업부 내로 연속적인 마이크로리터의 체적의 액체를 강제 이동시키는데 사용될 수 있다. 시약 출구 채널(611)은 습윤, 혼합, 용출 등에 의존하여 분석 반응에 수반된 유압 작업부의 채널 및 챔버와 유체 연통한다. 플라스틱 커버층(616, 617)은 챔버(615)를 밀봉한다.
도 6e 내지 도 6g는 하부 필름층(602)의 천공이 첨예부의 윤곽 주위에 자체 밀봉하지 않도록 설계되는 첨예 부재(610)의 상세도를 제공한다. 도 6e는 면 입면도이고, 도 6f는 측면 입면도이고, 도 6g는 CAD-생성 등각도이다. 도시된 정밀한 형태 및 상세한 치수에 한정되지 않고, 첨예부는 미늘 팁(621), 돌출형 볼록 제 2 파셋면(623)의 성형된 추가에 의해 개질된 평면형 제 1 면(622) 및 출구 채널(611)의 마우스를 형성하는 리세스 형성된 오목형 3d 파셋면(624)을 갖는 양분된 원추(620) 또는 원추의 절두체로서 형성된다. 첨예부의 돌출 팁 내의 섬세하게 성형된 오목부[오목형 3d 파셋면(624)]는 특히 제 2 파셋면(623)의 수형 볼록부와 조합하여 다이어프램(603)의 파열에 근접하는 필름층의 경향을 좌절시켜, 따라서 액체 중심이 있는 다이어프램을 관통하고 배수하기 위해 형성된 본질적으로 공압 작동식 "스피곳(spigot)"인 것으로서 작동을 보장한다. 스피곳은 개방 유지되고, 유체는 포트(607)를 경유하여 인가된 제어된 공압 압력에 응답하여 자유롭게 유동한다. 팬(625)은 출구 채널(611) 내로의 저장조의 유체의 배수를 보조한다.
광대한 실험 후에, 첨예부의 관통 작용은 절두 원추의 미늘 팁(621)이 0.004 내지 0.0045 인치의 반경이 될 때 가장 유리하게 효율적인 것으로 판명되었고, 이 특징을 위한 바람직한 반경은 0.004 인치(천분의 4인치)인 것으로 판정되었다. 발견되지 않은 범위 외의 첨예부는 비교에 의해 효과적이지 않다. 본 발명의 마이크로유체 카트리지는 선택적으로 첨예부가 원추의 절두체 섹션인 시약 저장조를 관통하기 위한 첨예부를 갖는 것으로서 특징화될 수 있고, 원추는 듀플렉스 다이어프램의 천공 민감층을 선택적으로 관통하기 위한 팁을 갖고 형성되고, 팁은 0.0040 내지 0.0045 인치의 반경을 갖는 절단점을 갖는다.
원추의 절두체 섹션은 평면형 제 1 파셋면, 평면형 제 1 파셋면 상에 형성된 볼록형 제 2 파셋면 및 오목형 제 2 파셋면 상에 형성된 오목형 제 3 파셋면을 구비하고, 오목형 제 3 파셋면은 유압 작업부 내로 배출된 유체를 배수하기 위해 그로부터 하강하는 유체 출구의 마우스를 형성한다.
액체 중심을 갖는 시약 저장조의 바람직한 실시예에서, 이중 적층형 다이어프램의 제 1 층은 파열 저항성이 있고, 첨예부에 근접한 제 2 층은 파열 민감성이 있다. 제 1 층은 천공 저항성이 있도록 구성된 외부 나일론 필름을 갖는 적층된 폴리머일 수 있고, 제 2 층은 천공 민감성이 있도록 구성된 외부 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필름으로 갖는 적층된 폴리머일 수 있다. 적합한 폴리머층은 또한 개재된 금속화층을 포함할 수 있고, 예를 들어 테크니백 인크(Technipaq Inc)(미국 일리노이주 크리스탈 레이크 소재)로부터 입수 가능하고, 적층된 폴리에틸렌/금속/폴리머 백킹 샌드위치 3층 구조체를 갖는다. 유체 파우치의 2개의 다이어프램 부재 사이에 대향 가능한 폴리에틸렌 필름이 열적 밀봉을 허용하는데 유용하다. UV-활성화 접착제가 카트리지 하우징 내의 다이어프램을 조립하기 위해 밀봉부 또는 가스켓을 형성하는데 사용될 수 있다.
도 7a 및 도 7b는 호스트 기구에 장착된 상태의 기울기를 갖고 기울어진 내향 마이크로유체 카드(400)를 도시한다. 카드는 카드 내에 포위된 3개의 검출 챔버를 통한 단면도인 도 7b에 상세히 도시된 바와 같이 그 측면에 약 15도(θ)로 경사진다. 카드의 기울기는 카드 내의 공기가 습윤 및 충전 중에 하나 이상의 통기 포트에 부력으로 유도되고, 상승하는 임의의 기포가 상류측 채널 내에 포집되고 카드의 가열된 구역 및 검출 챔버 내로의 진입이 제한되도록 구성된다. 도 5b의 핵산 용출 작업으로부터의 유체(501)는 도시된 바와 같이 내향 카드에 진입하고 이하의 도면에 설명된 마이크로유체 채널 및 챔버의 네트워크 내로 안내된다. 10 내지 35도의 기울기가 기포 혼입에 의한 간섭을 감소시키는데 유용한 것으로 판명되었고 마이크로유체 카드 또는 카트리지가 분석 중에 지지되는 기울어진 스테이지를 수용하도록 호스트 기구를 구성함으로써 자동화된 분석 시스템을 위해 구현될 수 있다. 진동 보조부가 또한 임계 경로로부터 기포를 더 격리하도록 제공될 수 있다. 이들 특징부는 또한 초기 습윤 중에 공기를 제거하는 것을 보조하고, 따라서 기포 형성을 위해 이용 가능한 전체 공기를 감소시킨다.
도 8a 및 도 8b는 마이크로유체 카드(400) 내에서와 같이 PCR을 수행하기 위한 채널 및 챔버의 네트워크(800)의 "앙시"도를 도시한다. 도면은 마이크로유체 서브회로를 형성하는 내부 습윤 가능 표면의 외관을 도시하지만, 채널 및 챔버의 깊이는 명료화를 위해 과장되어 있다. 3개의 채널 a, b 및 c가 도시되어 있는 도 8a에 도시된 바와 같이, 용출액(501)(샘플의 임의의 핵산을 함유함)은 비아(via;801)를 통해 카드 내로 인도되고 3개의 챔버가 있는 스테이징 매니폴드(802')에 진입하고, 이 매니폴드의 용도는 내부 플라스틱 표면의 초기 습윤 중에 기포의 혼입을 회피하면서 3개의 하류측 채널 내로 균등하게 유체를 분할하고 하류측 챔버(804, 805) 내로 유체를 균등하게 압박하는 것이다. 밸브(811)는 초기에 폐쇄된다. 도 8b의 메커니즘은 단일 채널을 도시한다.
다수의 채널 사이의 액체 체적(501)의 분할은 초기에 불균일한 습윤에 기인하여 문제가 있는 것으로 판명되었지만, 다수의 증폭 또는 분석이 병렬로 수행될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 실시를 위해 감소된 바와 같이, 충전 프로세스의 제 1 스테이지 중에, 액체(501)는 3개의 챔버가 있는 매니폴드(802')에 압력 하에서 진입한다. 각각의 챔버(802a, 802b, 802c)는 인터페이스하는 공압 챔버(즉, 다이어프램에 의해 분리된 2개의 캐비티의 스택 내의 통기된 상부 캐비티)로부터 유체 내용물을 분리하고 충전 중에 수동으로 연신하는 탄성 다이어프램(도 9i 내지 도 9L 참조, 900)에 의해 수평으로 양분되고 충전 중에 수동으로 연신한다. 이 단계 중에, 압력은 다수의 채널 사이에서 평형화된다. 충전 중에, 다이어프램 아래의 공기는 습윤될 때 밀봉하는 가스 투과성 액체 불투과성 필터 멤브레인을 위생 특징부로서 포함하는 통기구(803)를 통해 나온다. 계속된 가압은 챔버(802) 내의 다이어프램을 팽창시켜, 밸브(811)(및 그로의 모든 하류측 밸브)를 개방함으로써 배출될 때, 챔버(802)의 충전 중에 팽창되는 탄성 다이어프램(900)에 의해 인가된 복원 스프링력 또는 압력에 의해 압박되는 바와 같이 가압된 액체가 3개(또는 그 이상)의 병렬 채널 내로 균등하게 유동하게 된다. 복원 압력이 정밀하게 제어되고 제한될 수 있고 다이어프램의 스프링 상수의 함수이기 때문에, 그리고 탄성 다이어프램의 변위 체적이 정밀하게 제어될 수 있기 때문에, 하류측 채널의 습윤 또는 "프라이밍"의 정도는 당 기술 분야의 명백한 진보인 피펫을 체적식으로 충전하는 방식으로 정밀하게 캘리브레이션될 수 있다. 탄성중합 다이어프램은 다이어프램 재료로서 폴리우레탄, 폴리비닐리덴 클로라이드 및/또는 폴리에스테르로 성취되었다. 일 이러한 재료는 복합 박막으로서 폴리올레핀 층들 사이에 개재된 폴리비닐리덴 클로라이드 압출 시트인 SararnexTM(다우 케미컬)이다. 다른 재료가 사용될 수 있다.
유리하게는, 각각의 챔버(802)의 수동 연신 다이어프램(900)(도 9a 내지 도 9l)은 따라서 기포의 혼입 없이 하나 이상의 병렬 하류측 채널 내로 유체를 분배하기 위한 에너지 저장 디바이스가 된다. 하류측 체적을 인지함으로써, 연신된 다이어프램 내의 에너지는 각각의 병렬 채널이 체적 피펫(volumetric pipet)에서와 같이 마크까지 충전되도록 조정될 수 있고, 충전 체적은 일반적으로 각각의 분기 내에서 검출 챔버(806) 및 최종 밸브 구조체(812)를 부족하게 하지만, 챔버(804, 805)를 완전히 습윤한다. 습윤 중에, 모든 하류측 구조체는 원한다면 통기구(803)를 위해 예시된 방식으로 소수성 액체 불투과성 가스 투과성 멤브레인으로 캡핑함으로써 위생 조건 하에서 작동될 수 있는 말단 통기구(807)를 경유하여 안정하게 전진하는 메니스커스 전방의 공기가 소거된다. 다이어프램의 이완 중에 액체의 유동은 공압 과압에 의해 강제되지 않고, 모세관 유동에 의존하지 않고, 유한하기 때문에, 메니스커스의 전진은 점진적이고 순서적이어서, 그 결과로 공기 포켓의 혼입을 제한한다. 이는 당 기술 분야의 기술적 진보이고, 기포의 혼입 없이 병렬 하류측 네트워크의 정밀한 충전을 허용한다. 이 방법은 채널 및 챔버의 접합부로부터 코너 반경을 제거함으로써(때때로 습윤을 방해할 수 있는 표면 장력의 국부적인 증가와 연관됨) 카드의 기울기에 의해 용이하게 된다.
이 방법의 추가의 개량예에서, 챔버(804, 805)는 또한 내부 다이어프램으로 설치된다. 챔버(802)의 수동식 굽힘 다이어프램과는 다른, 챔버(804, 805)의 다이어프램의 공압면은 대기와 통기되지 않고 압력 매니폴드로부터 공급되는 포지티브 공압 압력 또는 네거티브 공압 압력에 의해서 추진될 수 있고, 따라서 펌프로서 작용한다. 충전 사이클 동안, 다이어프램은 챔버의 임의의 사체적을 감소시키거나 또는 제거하기 위하여 낮은 유압 챔버의 체적을 점유하도록 하향으로 "텐트" 또는 "팽창"된다. 챔버의 외측 하단 에지들 상의 이들 다이어프램을 지나는 액체는 챔버들을 완전히 적시고 임의의 잔여 공기를 이동시킨다. 밸브(812)를 폐쇄한 후에 다이어프램을 방출할 때, 액체는 챔버의 체적을 충전하고 보충하도록 상류로부터 인출된다.
이 방법의 추가의 개량예에서, 건조 시약은 챔버(804, 805) 내에 배치되고, 건조 시약의 성질은 수행될 분석의 성질에 관련된다. 시약은 일반적으로 챔버의 중심 부근에 스폿된다. 초기 습윤 중에, 다이어프램은 그 내부의 사체적을 감소시키기 위해 하부 유압 챔버의 체적을 점유하도록 하향으로 완전히 텐팅되고 챔버 잔류 사체적이 습윤됨에 따라 용해 및 세척으로부터 건조 시약 스폿을 보호적으로 커버하고 보호한다. 밸브(812)가 폐쇄되고 챔버가 다이어프램을 가로질러 압력차를 반전함으로써 액체로 플러딩된 후에, 시약은 급속하게 최대 강도로 용해된다.
건조 시약의 위치가 도 8b에 마킹되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 특정 기능을 갖는 건조 시약은 지정된 챔버 내에 배치된다. 건조 시약 스폿(821)은 예를 들어 타겟 템플레이트의 존재 하에서 유리하게 혼합되고 변성되는 마스터 혼합물 및 프라이머를 포함한다. 이 챔버(804)는 바람직하게는 템플레이트 핵산의 변성을 위해 충분한 온도에서 가열된다. 챔버(805)는 예를 들어 건조된 폴리메라아제(822)를 포함하고, 프라이머 및 타겟의 어닐링을 위해 그리고 중합화의 개시를 위해 적합한 온도에 있다. 검출 챔버(806)에서, 건조 시약 스폿(820)은 예를 들어 증폭시에 생성된 앰플리콘을 검출하는데 사용된 "분자 비콘" 또는 개재 염료와 같은 프로브를 포함한다. 검출 챔버(806)는 박막 광학 윈도우에 의해 "상부" 및 "저부"에서 경계가 정해지고 증폭된 타겟의 형광 검출을 위해 반사적으로 투광된다. 공동 작용으로, 저부 박막층은 또한 도 3b에 도시된 미러면 가열 요소로부터 열전달에 효과적이고, 이에 의해 카드는 분석 중에 인터페이스하고, 따라서 이하에 설명되는 바와 같이 열적 용융 곡선에 의해 앰플리콘 식별을 분석하거나 확인하는데 유용한 바와 같이, "열-광학 윈도우"라 명명될 수 있다.
도 8c 및 도 8d는 PCR을 위한 대안적인 카트리지(830)를 설명한다. 이 카트리지에서, 샘플 입구(831)에서 압력 하에서 카트리지에 진입하는 샘플(501)은 3등분부(833)에서 분할되고, 소수성 통기구(834)에서 독립적으로 통기된 3개의 챔버(832a, 832b, 832c)의 각각을 충전한다. 각각의 챔버(832)는 충전 중에 연신될 때 챔버 내에 포함된 액체 체적 상에 압력을 인가하는 탄성 공압유압식 다이어프램을 포함한다. 챔버는 상류측 펌프로부터 일련의 가압된 체적을 주입함으로써 충전될 수 있다. 분배 매니폴드의 3개의 분기 내로의 유체 유동은 반드시 균등하게 분할될 필요는 없지만, 각각의 챔버(832a, 832b, 832c) 내의 체적 및 압력은 스테이징 매니폴드가 평형을 이룸에 따라 등압이고 평형화되게 된다. 충전 프로세스 중에, 하류측 밸브(835)가 폐쇄된다.
스테이징 매니폴드(836)의 가압이 완료되고 평형화된 후에, 밸브(835)는 개방되어 챔버(832)의 탄성 다이어프램이 증폭 챔버(837, 838) 내로 액체 내용물을 수동으로 압박하는 동안 이완될 수 있다. 이 프로세스 중에, 챔버(837, 838)의 다이어프램 요소는 하부 유압 챔버를 점유하기 위해 팽창되어 헤드공간이 제거되고 챔버 내의 임의의 건조된 시약이 전진하는 메니스커스에 의해 세척되는 것으로부터 보호된다. PCR 증폭은 도 8a 및 도 8b에 대해 설명된 바와 같이 수행된다. 하류측 밸브(839)는 밸브(835)가 폐쇄되어 있는 동안 양 챔버(837, 838) 내의 다이어프램을 가압함으로써 전방챔버(840)를 통해 검출 챔버(846)에 임의의 증폭 생성물을 이송하도록 개방된다. 임의의 공기가 시스템으로부터 말단 통기구(847)를 통해 플러싱된다. 유리하게는, 전방챔버 내에 인쇄되거나 스폿된 건조된 프로브(841)는 용해되어 검출 챔버 내로의 주입에 앞서 앰플리콘과 혼합되고, 이는 검출 챔버를 경계 형성하는 열-광학 윈도우의 투명성을 향상시키고 분자 비콘 또는 FRET 프로브로서 유용한 특정 염료의 자동형광을 감소시키거나 방지한다. 도 7에 설명된 바와 같이 경사각(θ)에서 카드를 작동함으로써, 공기는 유리하게는 검출 챔버 상에 위에서 배치된 통기된 포트로 퍼지된다.
도 8d에서 볼 수 있는 바와 같이, 검출 챔버(846) 및 증폭 챔버(837, 838)의 입구, 출구 및 통기 포트는 비대칭적으로 배치된다. 카트리지 또는 카드가 호스트 기구의 기울어진 스테이지 상에서 경사될 때(도 3a 및 도 7b 참조), 증폭 챔버들 사이 및 검출 챔버와 연관된 말단 통기 포트(848)에서의 연통 포트(842, 843)가 챔버 자체들에 대해 상승되고 기하학적 형상의 임의의 표면 장력 효과를 극복하기 위해 윤곽 형성된다. 시스템 내의 공기는 따라서 바람직하게는 습윤 중에 전진하는 액체에 의해 시스템으로부터 플러싱되고, 이는 챔버의 하부 양태를 먼저 충전하고, PCR 중에 액체의 가열 연관 탈가스에 의해 생성된 임의의 기포는 바람직하게는 열전달과 간섭하지 않기 위해 증폭 챔버들 사이에 포집되고, 검출 챔버에 진입하지 않는다.
더 방법론적 상세에서, 도 9a 내지 도 9l은 스테이징 매니폴드를 갖는 수동 초기 습윤의 단계 또는 스테이지의 개략도 및 개략된 연표를 제시한다. 단면도 및 평면도가 도시되어 전진하는 메니스커스의 진보가 보여질 수 있다. 제 1 도면, 도 9a에서, 스테이징 매니폴드 챔버(802) 내의 다이어프램(900)은 상향으로 팽창되어 좌측으로부터 개방 밸브(910)를 통해 진입하는 액체 시약으로 부풀어오른 것으로 도시되어 있고, 다이어프램의 공압면은 905에서 대기와 통기된다. 하류측 챔버(903)는 건조되고, 밸브(911)는 폐쇄된다. 시약 스폿(905)의 초기 건조 상태는 우측에서 도 9b에 평면도로 모니터링된다.
도 9c에서, 밸브(910)와 밸브(911) 양자는 폐쇄되고, 밸브(912)는 통기를 위해 개방된다. 다이어프램(900)은 가압되고 시약 스폿(905) 위에 텐팅되고, 챔버(903)의 베이스와 접촉하는 다이어프램의 푸트프린트는 도 9d에 점선(902a)에 의해 도시되어 있다.
도 9e에서, 밸브(910)는 폐쇄 유지되고 밸브(911, 912)는 개방된다. 도 9f에 평면도로 도시된 바와 같이, 전진하는 메니스커스는 챔버(903)에 진입하기 시작한다.
도 9g에서, 액체는 습윤 챔버(903)로 계속되고, 다이어프램에 의해 형성된 붕괴된 루프 주위에 챔버의 주연부 상에 임의의 사체적을 충전한다. 이 프로세스는 도 9i의 스냅샷에 의해 도시된 바와 같이 계속된다. 챔버(802) 내의 수동으로 연신된 다이어프램(900)의 점진적인 수축은 도 9g 및 도 9i의 시간경과 스냅샷에서 좌측에 도시되어 있다. 다이어프램(902)을 가로질러 인가된 압력은 밸브(910, 912)가 폐쇄될 때 반전될 수 있어 액체가 스테이징 매니폴드 챔버(901)로부터 흡입되고 챔버(903)를 충전하여 건조된 시약(905)을 용해한다. 완전한 용해가 도 9l에 도식적으로 도시되어 있다. 이 프로세스 중에, 공기가 먼저 챔버(903) 내의 사공간의 제거에 의해, 이어서 다이어프램(900)의 이완에 의한 잔류 공기의 점진적인 제거에 의해, 마지막으로 시약 용액으로서 정량적으로 혼합되고 용해되기 위해 챔버(903) 내로 챔버(802)의 내용물을 흡입하고 퍼지된 시스템을 밀봉함으로써 습윤된 영역으로부터 효과적으로 변위되어 있다. 하류측 챔버를 충전하는 액체의 체적은 탄성 다이어프램(900) 및 챔버(802)의 변위 체적을 구성함으로써 정밀하게 제어될 수 있고, 수동 하류측 유체 습윤의 비율은 탄성 다이어프램(900)을 위한 스프링 상수를 선택함으로써 제어된다.
도 10a 내지 도 10c는 PCR 반응을 프라이밍하기 위한 상기 본 발명의 메커니즘의 더 유리한 사용을 나타내고 있고, 여기서 핵산 기판 및 폴리메라아제의 열적 순환을 위한 2개의 구역을 갖는 시스템이 설명되어 있다. 모든 유동 시스템은 카드 또는 카트리지 본체(1000) 내에 포함된다. 스테이징 매니폴드 챔버(1001)는 대기와 통기되고 좌측으로부터 밸브(1003)를 통해 진입하는 가압된 액체를 저장하는 것이 가능한 수동 탄성 다이어프램(1002)을 포함한다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 이 다이어프램(1002)은 유체 진입 중에 팽창되게 되고 밸브(1003)가 이어서 폐쇄된다. 챔버(1010, 1020) 내의 다이어프램(1011, 1021)은 각각 가압되어 건조된 시약 스폿(1012, 1022) 위에 보호성 텐트를 형성하고 도 10b에 도시된 바와 같이 챔버로부터 사공간 공기를 변위시킨다. 하류측 밸브(1023, 1033)는 이 스테이지에 개방되어 변위된 공기가 시스템으로부터 말단 통기구(1034)를 경유하여 통기된다. 도 10c에서, 밸브(1004)는 개방되고 액체는 PCR이 먼저 챔버를 프라이밍하기 위해 충분한 양으로 발생하는 2개의 챔버에 진입한다. 이 시퀀스는 도 10d 내지 도 10g에서 계속된다. 유체는 변성 고온 챔버(1010)를 충전하는데 충분한 양으로 도입되지만, 더 이상 도입되지는 않고, 다이어프램(1011)으로의 진공의 인가는 이 프로세스를 보조한다. 도 10d는 "고온" 또는 "변성" 챔버(1010)가 진공 하에 있고 액체가 챔버를 충전하기 위해 흡입되어 있는 것을 도시한다. 임의의 건조 시약(1012)이 정량적으로 용해되고 핵산 변성이 충분한 후에, 챔버(1010) 내의 액체 내용물은 프라이머의 어닐링을 위해 적합한 온도에서 제 2 챔버(1020)로 전달되어 폴리메라아제 매개 확장이 시약 스폿(1022)의 용해시에 시작될 수 있게 된다. 도 10e는 2개의 다이어프램을 가로지르는 압력차를 역전시킴으로써 고온 챔버로부터 "어닐링" 챔버로 펌핑되는 액체를 도시한다. 이 프로세스는 도 10f에서 재차 역전되어, 1010에서 고온 구역[가열 블록(313)과 접촉됨, 도 3b)과 1020에서 어닐링 구역[가열 블록(312)과 접촉됨] 사이에서 액체를 전후방으로 강제 이동시키는데 있어서 2개의 다이어프램의 상호 펌핑 작용을 설명한다. 이 상호 공압유압 작용은 장치 내에서의 열순환에 의해 핵산 증폭에 기초한다. 마지막으로, 임의의 앰플리콘을 갖는 유체는 도 10g에 도시된 바와 같이 검출 챔버 내로 토출된다. 검출 챔버는 여기에 도시된 바와 같이 한 쌍의 광학 윈도우(1035)를 구비한다.
더 복잡한 구성에서, 부가의 온도 스테이션 및 열적 블록(314)(도 3b)과의 연관된 열적 인터페이스가 예를 들어 PCR형 증폭 프로세스에 앞서 cDNA의 역전사제 매개 합성을 위해 사용된다. 따라서, 부가의 챔버가 유용하고, 기하학적 형상 및 구성이 필요한 변경을 가하여 본 발명의 교시의 논리적 확장에 의해 변경될 수 있다. 습윤 중에, 각각의 챔버 내의 다이어프램은 초기 사공간 체적을 감소시키는데 사용된다. 이후에, 다이어프램을 가로지르는 압력차의 인가는 디바이스의 유압 작업부를 통한 유체 체적의 유압식 이동을 위해 펌프 및 혼합 요소로서 직렬 다이어프램 조립체 및 밸브 요소를 장착하는데 사용된다. 역전사제 디바이스의 제 1 실시예가 도 14a 내지 도 14c에 도시되어 있고, 이하에 더 상세히 설명될 것이다.
도 11 내지 도 13은 전술된 방법의 단계들을 요약한다. 도 11은 액체 중심을 갖는 2층 듀플렉스 다이어프램이 시약을 분배하는데 사용되는 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 방법의 단계들을 설명한다. 호스트 기구를 시동한 후에, 액체 샘플이 마이크로유체 카트리지 내에 배치되고 카트리지는 기구의 도킹 베이 내에 삽입된다. 호스트 기구는 실행될 분석의 유형을 지시하는 마이크로유체 카트리지 상의 바코드를 판독한다. 액체 샘플은 혼합 챔버 내로 흡입되고, 세포 용해 버퍼가 분배되어 액체 샘플과 혼합된다. 용해 버퍼를 분배하기 위해, "액체 중심이 있는 다이어프램"은 첨예부에 대해 공압 작동에 의해 압박되어, 다이어프램의 하부층을 파열시켜 액체를 카드 내로 펌핑한다. 샘플 용해물이 이어서 카드 내의 챔버 내에 위치된 고체 상태 핵산 흡착제와 접촉되고 고갈된 샘플 용해물이 온-보드 폐기물로 유도된다. 에탄올 용액이 제 2 액체 중심이 있는 다이어프램 부재로부터 분배되고 고체 상태 흡착제로부터 오염물을 세척하는데 사용된다. 세척 단계는 반복될 수 있다. 세척물은 온-보드 폐기물로 격리된다. 고체 상태 매트릭스가 공기의 스트림 아래에서 간단히 건조되어 잔류 용제를 제거한다. 용출 버퍼는 이어서 최종 액체 중심이 있는 다이어프램 저장조로부터 분배되고 고체 상태 매트릭스와 접촉된다. 용출된 핵산(501)을 갖는 용출액이 이어서 검출 서브회로 내로의 진입을 위해 스테이징 매니폴드로 전달된다. 여기에 제공된 예에서, PCR 증폭에 의한 핵산 분석이 용출액에 수행된다. 다른 핵산 증폭법이 당 기술 분야에 알려져 있고, 본 명세서의 교시 및 도면으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 디바이스의 다양한 구성 요소의 재구성에 의해 실시될 수 있다.
도 12는 도 6c에 도시된 바와 같이 액체 중심(601)을 갖는 2층 듀플렉스 다이어프램으로부터 분배된 액체를 갖는 유압 작업부의 채널 및 챔버를 "프라이밍"(즉, 습윤적으로 로딩)하기 위한 방법의 단계들을 설명한다. 버퍼를 포함하는 시약 저장조를 파열함으로써 해제된 용출 버퍼로 핵산 추출부(501)를 용출한 후에, 유체는 흡착된 핵산을 효율적으로 취하기 위해 고체 상태 흡수제(409)(도 4)에 접촉할 때 발진될 수 있다. 용출액은 이어서 마이크로유체 카드의 스테이징 챔버 내로 압력 하에서 펌핑되어 챔버를 커버하는 탄성 다이어프램이 팽창되게 되고 위치 에너지를 저장하게 된다. 스테이징 챔버 입구는 밀봉되고 스테이징 매니폴드 전체를 통한 압력이 급속하게 평형화된다. 각각의 채널로의 하류측 밸브가 이어서 개방된다. 모든 하류측 유체 채널 및 챔버는 이 작동 중에 통기되는데, 이는 하류측 습윤 가능 표면을 습윤하거나 프라이밍하는데 유용하다. 유리하게는, 탄성 다이어프램이 이완되어 그 저장된 에너지를 해제함에 따라, 다이어프램의 탄성은 하류측 채널 및 챔버 내로 병렬로 균등하게 액체 체적을 단단히 강제로 이동시켜, 메니스커스를 전진시켜 당 기술 분야의 진보인 기포 혼입 없이 임의의 잔류 공기를 변위시킨다. 액체 체적은 이 방식으로 분기 병렬 유체 경로 내로 분할된다.
도 13은 기포 혼입 또는 시약 세척 없이 건조 시약을 재수화하기 위한 방법의 단계를 설명한다. 본 발명의 카트리지의 제조 중에, 건조된 시약 스폿이 반응 챔버의 중심에 인쇄된다. 시약 챔버는 하위에 있는 가압 가능한 다이어프램을 갖고 구성된다. 액체 샘플이 첨가되고, 카트리지는 호스트 기구의 도킹 베이 내에 삽입되는데, 이 호스트 기구는 카트리지의 작동을 위한 압력 및 밸브 명령을 공급한다. 샘플은 스테이징 챔버 내의 액체를 커버하는 탄성 에너지 저장 다이어프램을 팽창한다. 전술된 하류측 시약 챔버는 통기되고, 그 내부의 가압 가능한 다이어프램은 건조된 시약 스폿 주위 및 위에 보호성 일시적 밀봉부를 형성하기 위해 가압된다. 스테이징 챔버의 하류측 밸브는 이어서 개방되고, 탄성 다이어프램은 이완되고 다이어프램의 회수의 탄성 에너지는 하류측 시약 챔버 내로 샘플 유체를 완만히 강제 이동시켜, 보호 일시적 밀봉부 주위에 임의의 잔류 공기를 변위시킨다. 마지막으로, 가압성 다이어프램을 가로지르는 압력차는 반전되거나 이완되어, 시약 스폿을 언커버하고 시약 챔버 내로 액체의 전체 체적을 흡입하여 시약 스폿이 유리하게는 당 기술 분야의 진보인 기포 혼입 없이 샘플 유체 내에 최대 강도로 용해되게 된다.
도 14a 및 도 14c는 역전사제 매개 PCR을 위한 마이크로유체 채널 및 챔버의 네트워크의 앙시도이다. 3개의 병렬 채널 a, b 및 c를 갖는 디바이스가 도시되어 있다. 샘플(501)은 채널 사이에서 분할되어 3개(또는 그 이상)의 개별 멀티플렉스 분석이 예를 들어 병렬로 수행될 수 있다. 이전에 도시된 실시예와는 달리, 여기서 시약(1220)은 다이어프램 작동식 챔버에서보다는 채널(1205) 내에 인쇄된다. 그러나, 도 9에 표현된 수동 습윤 원리가 보유되는데, 액체는 상류측 펌프에 의해 프라이밍되어 있는 에너지 저장 다이어프램의 수동 이완에 의해 채널 내에 축출된다. 이 원리는 각각의 채널이 개별 수동 다이어프램을 구비하는 공통 스테이징 매니폴드로부터 분기하는 병렬 채널 내의 유체 유동을 균형화하고 혼입된 공기를 제한하는데 효과적이다. 본 명세서에서 실현되는 바와 같은, 이 수동 구동 습윤 원리를 이용하는 디바이스는 당 기술 분야에서 진보이고, 종래 기술의 모세관 습윤된 및 능동 습윤된 디바이스와 연관된 결점을 극복한다.
일 실시예에서, 도 14a 및 도 14c는 본 발명의 다른 마이크로유체 카드 내의 rtPCR을 수행하기 위한 채널 및 챔버의 네트워크(1200)를 도시한다. 이 "앙시"도의 채널 및 챔버의 깊이는 명료화를 위해 과장되어 있다. 용출액(501)(샘플의 임의의 핵산을 함유함)은 비아(1201)를 통해 카드 내로 인도되고 유동적으로 상호 접속된 3개의 챔버가 있는 스테이징 매니폴드(1202)에 진입하고, 이 매니폴드의 용도는 내부 플라스틱 표면의 초기 습윤 중에 기포의 혼입을 회피하면서 3개의 하류측 유동 경로 내로 균등하게 유체를 분할하고 하류측 밸브(1204), 시약 채널(1205), 밸브(1206)를 통해 챔버(1207) 내로 유체를 균등하게 압박하는 것이다. 밸브(1204)는 초기에 폐쇄된다.
충전 프로세스의 제 1 스테이지 중에, 액체(501)는 압력 하에서 다중 챔버가 있는 매니폴드(1202)에 진입한다. 각각의 챔버(1202)는 챔버 내의 통기된 상부 공압 캐비티로부터 유체 내용물을 분리하고 충전 중에 수동으로 연신하는 탄성 다이어프램(도 9 참조, 900)에 의해 수평으로 양분된다. 충전 중에, 다이어프램 아래의 공기는 통기구(1203)를 통해 나오고, 이는 습윤될 때 밀봉하고 압력의 증가를 허용하여 다이어프램이 팽창하게 하는 가스 투과성 액체 불투과성 필터 멤브레인을 위생 특징부로서 포함한다. 연속적인 가압은 액체로 챔버(1202) 내의 다이어프램을 팽창하여, 밸브(1204)(및 그로의 모든 하류측 밸브)를 개방함으로써 해제될 때, 가압된 액체가 탄성 다이어프램에 의해 인가된 복원력에 의해 압박된 바와 같이 3개(또는 그 이상)의 병렬 하류측 채널로 균등하게 유동한다. 복원 압력은 제어되고 제한되고, 다이어프램의 스프링 상수의 함수이다. 탄성 다이어프램의 체적 변위가 제어될 수 있어, 하류측 채널의 습윤(또는 "프라이밍")의 정도가 마크까지 피펫을 체적식으로 충전하는 방식으로 캘리브레이션된다. 샘플을 균등하게 분할하는 능력은 마이크로유체 디바이스 내에서 병렬로 분석을 수행하는데 있어 유리하고 각각의 채널 각각 내의 유동이 동일한 유량으로 진행하는 것이 보장되지 않기 때문에 모세관 유동에 의해 또는 포지티브 변위법(주사기 펌프와 같은)에 의해 시도될 때 문제가 있었다. 놀랍게도, 스테이징 매니폴드 내의 정합된 다이어프램의 수동 이완에 의해 구동된 습윤의 원리를 사용하여, 이 문제점은 다수의 병렬 채널에 대해 유리하게 해결된다.
챔버(1207, 1208)는 유압 챔버와 공압 챔버 사이에서 인터페이스하는 내부 다이어프램을 구비한다. 그러나, 챔버(1202)의 수동 굴곡 다이어프램과는 달리, 챔버(1207, 1208)의 다이어프램의 공압면은 대기와 통기되지 않고 외부 소스로부터 공급된 포지티브 공압 압력 또는 네거티브 공압 압력에 의해 능동적으로 구동될 수 있어, 따라서 펌프로서 기능한다. 충전 사이클 중에, 다이어프램은 챔버의 임의의 사체적을 감소시키거나 제거하는 것에 대해 유압 캐비티 내로 아래로 완전히 팽창된다. 챔버의 외부 저부 에지 상에서 이들 다이어프램을 지나 스며나오는 액체는 챔버를 완전히 습윤하고 임의의 잔류 공기를 변위시킨다. 다음에, 밸브(1209)를 폐쇄한 후에 다이어프램을 해제할 때, 액체는 상류측으로부터 흡인 압력 하에서 흡입되고 유압 챔버(1207)의 전체 체적을 충전하고, 공기는 시스템으로부터 완전히 플러싱되어 있다.
변형예에서, 공압 챔버들 중 하나는 대기와 통기되고 통기되지 않은 다이어프램의 작용에 종속된다. 2개의 챔버가 밸브에 의해 잔여 회로 요소로부터 격리된다. 활성 다이어프램이 포지티브 압력으로 펄스화될 때, 액체는 인접 챔버로 강제 이동되고, 활성 다이어프램이 네거티브 압력으로 펄스화될 때, 액체는 인접 챔버로부터 흡입된다. 선택적으로, 수동 다이어프램은 탄성 다이어프램일 수 있다.
이 방법의 추가의 개량예에서, 건조 시약은 채널(1205) 내의 챔버(1207, 1208) 내에 배치된다. 시약은 일반적으로 통로의 폭이 인쇄 헤드에 의한 액세스를 허용하는 유압 챔버 또는 채널의 바닥 상에 스폿된다. 채널(1205) 내에 스폿된 시약(1220)은 적합한 버퍼 내의 역전사제 및 뉴클레오티드 기판을 포함한다. 통상적으로, PCR 마스터 혼합물 및 적합한 프라이머가 챔버(1207) 내의 시약 스폿(1221)으로서 제공된다. 스폿(1222)은 탈수된 Taq 시약 스폿이다. 스폿(1223)은 형광 프로브와 같은 광학 검출 시약을 포함한다. 다수의 개별 스폿이 각각의 챔버 또는 채널 내에 롤형 또는 시트형 프로세스를 사용하여 인쇄될 수 있다.
용출액(501) 내의 RNA 타겟은 일반적으로 20 내지 45℃의 온도에서 역전사제의 작용에 의해 cDNA로 변환된다. 이 작용은 용출 버퍼 내의 채널(1205) 내에서 실행되고, 도 14b에 더 상세히 도시되어 있고, 여기서 밸브(1204, 1206)는 건조된 시약 스폿(1220)을 포함하는 개질된 채널 세그먼트(1205)에 의해 분리된다. 시약, 예를 들어 역전사제는 특정하게 개질된 채널 세그먼트를 전이하는 샘플 내에서 용해된다. 전체 효소 활성도를 위한 기판 및 임의의 공동 인자가 또한 제공된다.
초기 습윤 중에, 챔버(1207, 1208) 내의 다이어프램은 그 내부에 사체적을 감소시키기 위해 유압 챔버 내로 아래로 완전히 팽창되고, 다이어프램에 의해 제공된 커버링은 습윤 중에 조기 용해 및 세척으로부터 하위에 있는 건조 시약 스폿 또는 스폿들을 보호적으로 밀봉한다. 통기구(1211)는 일반적으로 평활하게 전진하는 메니스커스로서 유체의 진입에 의해 변위되는 공기를 배기하도록 개방된다. 밸브(1209)가 폐쇄되고 챔버(1207)가 다이어프램을 가로질러 압력을 역전시킴으로써 액체로 충전될 때(즉, 챔버 내로 액체를 흡입함), 밸브(1206)가 또한 폐쇄된다. 임의의 스폿된 시약은 RNA 타겟으로부터 cDNA를 형성할 필요가 없는 경우에, 직접 PCR 프로세스에 대해 본질적으로 도 8에 대해 설명된 바와 같이, 희석 없이 급속하게 최대 강도로 용해된다. 따라서, 디바이스의 재구성이 탄력적이고 다양한 분자 분석 프로세스에 적응될 수 있다.
챔버(1207)는 바람직하게는 템플레이트 핵산의 변성을 위해 충분한 온도에서 가열된다. 챔버(1208)는 예를 들어 건조된 폴리메라아제(1222)를 포함하고, 프라이머 및 타겟의 어닐링을 위해 그리고 중합화의 개시를 위해 적합한 온도에 있다. PCR의 고온 시작이 예를 들어 챔버(1208) 내의 Taq 폴리메라아제 시약 스폿(1222)의 용해에 의해 개시된다. 다음에, 2개의 챔버(1207, 1208)의 다이어프램에 인가된 교번 압력에 의해, 유체는 다이어프램의 상호 공압유압식 작용에 의해 변성으로부터 어닐링 조건으로 전후방으로 이동될 수 있고, 체인 연신 및 증폭이 이 프로세스 중에 앰플리콘을 생성하는데 성공적인 것으로 발견되었다. 검출 챔버(1210)에서, 건조 시약 스폿(1223)은 예를 들어 증폭시에 생성된 임의의 앰플리콘을 검출하는데 사용된 "분자 비콘"과 같은 프로브를 포함한다. 이전과 같이, 검출 챔버(1210)는 박막 광학 윈도우에 의해 상부 및 저부에서 경계가 정해지고 증폭된 타겟의 형광 검출을 위해 반사적으로 투광된다. 공동 작용으로, 저부 박막층은 또한 도 3b에 도시된 미러면 가열 요소로부터 열전달에 효과적이고, 이에 의해 카드는 분석 중에 인터페이스하고, 따라서 이하에 설명되는 바와 같이(도 17, 도 18a 및 도 18b) 열적 용융 곡선에 의해 앰플리콘 식별을 분석하거나 확인하는데 유용한 바와 같이, "열-광학 윈도우"라 명명될 수 있다.
도 14d 및 도 14e는 PCR을 위한 대안적인 카트리지(1230)를 설명한다. 이 카트리지에서, 샘플 입력(1231)에서 압력 하에서 카트리지에 진입하는 용출액(501)은 3등분부(1233)에서 분할되고, 소수성 통기구(1234)에서 독립적으로 통기된 3개의 챔버(1232a, 1232b, 1232c)의 각각을 충전한다. 각각의 챔버(1232)는 연신되거나 확장될 때 챔버 내에 포함된 액체 체적 상에 압력을 인가하는 탄성 공압유압식 다이어프램을 포함한다. 요구되면, 챔버는 상류측 펌프로부터 일련의 가압된 체적을 주입함으로써 충전될 수 있고, 분배 매니폴드의 3개의 분기 내로의 유체 유동은 반드시 균등하게 분할될 필요는 없지만, 각각의 챔버(1232a, 1232b, 1232c) 내의 체적 및 압력은 스테이징 매니폴드가 평형을 이룸에 따라 평형화되게 된다. 충전 프로세스 중에, 하류측 밸브(1235)가 폐쇄된다.
스테이징 매니폴드(1236)의 가압이 완료된 후에, 밸브(1235, 1237)는 개방되어 액체 내용물을 역전사 채널(1238) 내로 수동으로 압박하면서 챔버(1232)의 탄성 다이어프램이 이완될 수 있게 된다. 역전사는 역전사제를 위해 적응된 버퍼, 기판 및 온도 조건 하에서 수행되고, 버퍼 및 임의의 향상제가 일반적으로 챔버(1238) 내의 건조된 시약 스폿(1257)으로서 공급된다. 샘플은 이어서 증폭 챔버(1247, 1248) 내로 압박된다. 각각의 증폭 챔버는 공압유압식 다이어프램을 구비한다. 이 프로세스 중에, 챔버(1247, 1248)의 다이어프램 요소는 공압 압력 하에서 팽창되어 헤드공간이 제거되고 챔버 내의 임의의 건조된 시약이 시약 스폿을 커버하기 위해 유압 챔버 내로 텐팅되는 팽창된 다이어프램에 의해 전진하는 메니스커스에 의해 세척되는 것으로부터 보호된다. PCR 증폭은 도 14a 및 도 14c에 대해 설명된 바와 같이 역전사에 의해 형성된 cDNA에서 수행된다. 하류측 밸브(1249)가 개방되어 밸브(1237)가 폐쇄되는 동안 양 챔버(1247, 1248)에서 다이어프램을 가압함으로써 전방챔버(1250)를 통해 검출 챔버(1251)로 임의의 증폭 생성물을 이송한다. 각각의 스테이지에서, 시스템 내의 임의의 공기는 말단 통기구(1252)를 통해 플러싱된다. 유리하게는, 전방챔버(1250) 내에 인쇄되거나 스폿된 건조된 프로브(1253)는 검출 챔버 내로의 주입에 앞서 용해되어 앰플리콘과 혼합되는데, 이는 검출 챔버를 경계 형성하는 열-광학 윈도우의 투명성을 향상시키고 분자 비콘 또는 FRET 프로브로서 유용한 특정 염료의 자동 형광을 감소하거나 방지한다.
도 14e에서 알 수 있는 바와 같이, 검출 챔버(1251) 및 증폭 챔버(1247, 1248)의 입구, 출구 및 통기 포트가 비대칭적으로 배치된다. 디바이스가 호스트 기구의 기울어진 스테이지 상에서 경사질 때(도 3a 및 도 7b 참조), 증폭 챔버들 사이 및 검출 챔버와 연관된 말단 통기 포트(1256)에서의 연통 포트(1254, 1255)가 챔버 자체들에 대해 상승되고 기하학적 형상의 임의의 표면 장력 효과를 극복하기 위해 윤곽 형성된다. 시스템 내의 공기는 따라서 바람직하게는 습윤 중에 전진하는 액체에 의해 시스템으로부터 플러싱되고, 이는 챔버의 하부 양태를 먼저 충전하고, PCR을 위한 상호 펌핑 중에 액체의 가열 연관 탈가스에 의해 생성된 임의의 기포는 바람직하게는 열전달과 간섭하지 않기 위해 증폭 챔버들 사이에 포집되고, 검출 챔버에 진입하지 않는다.
대안적으로, 역전사제 cDNA 및 증폭은 도 8의 카트리지 중 하나에 수행될 수 있다. 이는 제 1 증폭 챔버(804) 내의 역전사제(MMLV-RT, AMV-RT) 및 기판을 스폿함으로써 그리고 40 내지 50℃에서 먼저 배양함으로써 성취된다. 핵산은 RNAase 억제제의 존재하에서 추출된다. 1-포트 rtPCR을 위한 적합한 버퍼는 문헌에 설명되어 있고 본질적으로 RNA 타겟의 전치 증폭을 생성하여, 따라서 검출 가능한 분자 타겟의 감도 및 범위를 향상시킨다. 1-포트 rtPCR을 위한 버퍼 시스템은 예를 들어 영(Young)[영 등, 1993년, Detection of Hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay, J Clin Microbial 31:882-86] 및 다른 사람들에 의해 설명되어 있다. 일반적으로, RNAase 억제제가 첨가된다.
도 15는 형광성 종점을 모니터링하기 위한 본 발명의 다바이스의 검출 챔버의 광학 윈도우의 사용을 도시한다. 대물 렌즈(1520)가 액체 샘플(1501)을 보유하는 검출 챔버(1500)를 투광하는데 사용된다. 검출 챔버는 상부 광학 윈도우(1502) 및 하부 광학 윈도우(1503)에 의해 경계가 정해진다. 챔버는 가열 블록(311)의 미러면(320) 상에 위치되고, 가열 블록은 따라서 챔버 내의 색소포 또는 형광소에 의해 흡수되거나 방출된 반사된 광선을 위한 광학 경로를 재반사하고 유체 내의 검출 화학물의 온도를 조절하기 위한 이중 기능을 충족한다. 이 구성은 예를 들어 FRET 검출 및 핵산 타겟의 검출의 확인을 위한 값을 갖는다.
타겟 분자(1510)에 의해 방출된 광자는 대물 렌즈에 의해 캡처된 원추 내에 방출될 수 있고 또는 미러면(320)으로부터 반사될 수 있어, 따라서 타겟 분자의 가상 이미지(1511)를 형성하고, 재차 대물 렌즈에 의해 캡처되어 감도를 증가시킨다. 검출 챔버는 따라서 가열 블록(311)의 본체 내의 "가상 검출 챔버"(점선)에 의해 거울반사된다. 유리하게, 검출 챔버 내에 형성된 기포(1505)는 디바이스가 호스트 기구(도 7b 참조) 내에서 도킹 베이에 배치되는 경사각 세타에 의해 챔버의 중심으로부터 이격되어 중력에 의해 압박된다. 공동 작용으로, 미러-평활면(320)은 또한 열전달을 향상시키고, 하부 광학 윈도우(1503)는 또한 열전달 필름으로서 기능한다. 열전달 필름은 유리하게는 매우 얇고, 가열 블록(311)과 열 접촉하도록 강요된다. 바람직한 열전달 필름이 공동 양도된 미국 특허 제 7,544,506호 및 제 7,648,835호에 설명되어 있지만, 예를 들어 유사한 치수의 고리형 폴리올레핀 필름을 또한 포함할 수 있다. 조립체는 따라서 열광학 윈도우로서 기능하여, 존재하는 임의의 앰플리콘 또는 다른 검출 가능한 종의 향상된 가열 및 광학 인터로게이션을 성취한다.
도 16은 PCR을 수행하기 위한 마이크로유체 작업부 및 호스트 기구와 마이크로유체 작업부를 인터페이스하기 위한 가스켓을 갖는 공압 인터페이스의 복잡성의 표현 레벨을 도시한다. 예시의 목적으로 마이크로유체 서브회로를 갖는 유압 작업부 및 분자 검출 분석을 동작시키기 위한 공압 작업부를 포함하는 유동 채널 및 챔버가 도시되어 있고, 그 예시적인 상세가 여기에 설명되어 있다. 외향 카드(410) 및 내향 카드(400)는 카드의 유압 작업부를 공압식으로 제어하고 구동하기 위해 공압 제어 인터페이스에 작동 중에 1회용 가스켓(405)을 사용하여 밀봉되는 공통 공압 접합부에서 연결된다. 이 서브조립체(1600)는 일반적으로 도 4를 참조하여 설명된 바와 같이 시약 저장조를 수납하는 카트리지 섀시 내에 장착된다. 카드의 마이크로유체 작업부는 분석 도중에 습윤되는 내부 채널 및 챔버의 네트워크 또는 네트워크들로 형성된 유압 작업부 및 호스트 기구 상의 포지티브 및 네거티브 가스 압력 소스에 의해 전력 공급되는 펌프 구동 회로 및 밸브 제어부로 형성된 공압 작업부를 포함한다. 다이어프램 밸브는 분석의 단계를 제어하기 위해 공압식으로 개방되고 폐쇄된다. 유압 작업부와 공압 작업부 사이의 인터페이스에 배치된 더 대형의 다이어프램이 또한 유체를 이동시키고 또한 예를 들어 증폭 챔버 내의 스테이징 매니폴드 및/또는 수동 구동된 펌프의 탄성적으로 팽창된 다이어프램 요소의 형태의 위치 에너지로 유체의 운동 에너지를 변환하기 위해 공압유압식 디바이스로서 또한 기능한다. 이 도면에서, 외향 카드(410)는 생물학적 샘플로부터 핵산 추출을 담당하고, 내향 카드(400)는 증폭 및 검출을 위해 사용된다. 다른 조합이 제공된 예시적인 예에 의해 한정되지 않는 본 발명의 범주 및 사상 내에서 즉시 고려된다.
도 17, 도 18a 및 도 18b는 본 발명의 마이크로유체 카트리지로 얻어진 분석 결과의 유형을 표현하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 도 17은 앰플리콘에 혼성체화된 분자 비콘에 대해 수집된 스캐닝 데이터를 도시한다. 스캐닝축(플롯의 x-축)은 각각 포지티브 및 네거티브 테스트 조건을 표현하는 검출 우물을 횡단하고, 이는 신호가 검출 우물에 제한되는 것을 알 수 있다. 도면에서, 샘플은 검출 챔버 내의 온도가 계통적으로 변경됨에 따라 반복적으로 스캐닝된다. 스캔은 광학 스캐닝 장치의 공간적 충실도를 예시하기 위해 플롯에서 오버레이된다. 35℃, 65℃, 70℃, 75℃ 및 80℃ 테스트 조건에 대한 형광 스캔이 마킹된다. 40, 45, 50, 66 및 60℃에서의 테스트 스캔 및 85 및 90℃ 플롯이 양호하게 구별되지 않았고, 예측될 수 있는 바와 같이 개별적으로 마킹되지 않는다. 형광성 신호는 온도의 함수라는 것을 알 수 있다. 이 예에서 형광 켄칭은 이중 가닥 프로브-타겟이 용융됨에 따라 증가하는 것으로 관찰되는데, 즉 신호는 35℃에 최고이고 본질적으로 80℃에서 존재하지 않는다. 도 18a에서, 데이터는 포지티브(2301, 실선) 및 네거티브(타겟 없음, 2302, 점선) 테스트 조건에 대해 신호 대 온도에 대해 재플롯된다. 도 18b에서, 제 1 도함수가 플롯되어, 약 70℃의 FRET 용융 온도를 지시한다.
예 I
예로서, 본 발명의 장치는 대변과 같은 인간 샘플 내의 병원균의 핵산의 검출에 의해 감염 질병의 진단에 유용한 것으로 나타났다. 예시로서 관심이 있는 것은 장내세균형 O-항원 혈청청 및 stx1 및 stx2 유전자(시가독소를 위한)를 유전적으로 검출하는데 유용한 rfb 유전자이다. 이들 유전자는 설사병에 관심이 있는 예를 들어, 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 캠필로박터(Campylobacter) 및 대장균(Escherichia coli) 혈청청에서 발견되었다.
네거티브 대변 스왑이 2.5 mL의 PBS 내에서 희석되어 O157:H7 박테리아 배양으로 스파이크되었다. 희석된 샘플 250 uL이 본 발명의 카트리지 상에 분석을 위해 로딩되었다. 이들 카트리지는 PCR 및 분자 비콘 앰플리콘 검출을 위한 모든 요구된 건조된 및 액체 시약을 수납하였다. DNA 추출 후에, 타겟 및 프라이머는 2분 동안 94℃에서 변성되었고 이어서 열적 사이클당 약 12초에 PCR 증폭에 대해 순환되었다. 로딩 후에, 카트리지와 호환성이 있도록 설계된 열적, 공압 및 광학 인터페이스를 갖는 기구가 샘플 상에 멀티플렉스 핵산 분석을 실행하는데 사용되었다. 박테로이드 DNA가 증폭에 대한 내부 포지티브 제어로서 사용되었고, 네거티브 제어가 또한 실행되어 오류 포지티브를 생성하지 않았다.
박테로이드를 위한 FAM-라벨 부착된 프로브가 제 1 형광체(여기 485 nm, 방출 535 nm)에 의해 검출된다. CAL 플루오르 Red 610-라벨 부착된 프로브(여기 590 nm, 방출 610 nm)가 이 분석에서 타겟 분석물을 검출하는데 사용된다. 바이플렉스 증폭 생성물이 400,000 카피에서 추정된 내부 제어 배경에 대해 추출물당 최소 80개의 타겟 카피 또는 그 부근에서 검출되어, 고레벨의 감도 및 특이성을 지시한다. 광학 기기의 상세는 계류중이고 모든 목적으로 본 명세서에 참조로서 완전히 포함되어 있는 발명의 명칭이 휴대형 고이득 형광 검출 시스템(PORTABLE HIGH GAIN FLUORESENCE DETECTION SYSTEM)인 국제 특허 출원 공개 PCT/US10/22581호에 설명되어 있다.
본 발명의 디바이스의 대변 샘플 내의 stx2(2411), stx1(2412) 및 rfb(2413) 유전자에 대해 검출된 앰플리콘에 대한 FET 곡선이 도 19에 도시되어 있다. 제어 데이터는 도시되어 있지 않다.
예 II
온-보드 건조 및 액체 시약을 사용하여, 혈액 샘플이 처리되었고 홍역 바이러스와 연관된 RNA가 30분 이하로 검출되었다. 제 1 단계에서, cDNA가 도 14에 도시된 디바이스들 중 하나에서 약 50℃의 배양 온도에서 샘플로부터 형성되고, 역전사제 생성물이 이어서 공동 양도된 미국 특허 제 7,544,506호, 제 7,648,835호, 제 7,763,453호 및 제 7,763,453호 및 모든 목적으로 본 명세서에 참조로서 완전히 포함되어 있고 공동 양도된 발명의 명칭이 "통합형 핵산 분석(Integrated Nucleic Acid Assays)"인 계류중인 출원에 설명된 바와 같이 일반적으로 듀얼 온도 구역 제어를 갖는 2개의 마이크로유체 챔버(1221, 1222)를 사용하여 PCR을 받게 된다. 앰플리콘이 이어서 증폭된 타겟에서 지향되는 FAM 형광-태그 부착된 분자 비콘을 사용하여 검출된다. 선택적으로, 1-포트 반응 혼합물 내의 멀티플렉스 증폭을 갖는 캘리포니아 레드-태그된 RNAase P 류코사이트 엑손 배열(일반적으로 임의의 진성 인간 혈액 샘플임)로 이루어진 제어가 분석을 유효화하는데 사용된다.
본 발명의 요소 및 특징의 다양한 조합을 예시하는 다른 예가 즉시 증명된다. 본 발명의 교시에 따라 구성된 디바이스는 예를 들어 관심 있거나 유용할 수 있는 바와 같은 박테리아[아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 악티노바실루스 에쿠울리(Actinobacillus equuli), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 보르다텔라 페르투시스(Bordatella pertussis), 보르다텔라 브론치오셉티카(Bordatella bronchioseptica), 부르크홀더리아 수도말레이(Burkholderia pseudomallei), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diptheriae), 콕시엘라 브루네티(Coxiella burnetii), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 푸소박테리움 네크로포럼(Fusobacterium necrophorum), 하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 누모니아(Klebsiella pneumoniae), 킹겔라 데니트리피칸(Kingella denitrificans), 레지오넬라 누모필라(Legionella pneumophila), 리슈만편모충(Leishmania ssp), 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogenes), 모라셀라 카타할리스(Moraxella catarrhalis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라즈마 누모니아(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노호에아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티드(Neisseria meningitides), 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 수도모나스 푸트레파세인스(Pseudomonas putrefaciens), 수도노마스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 시겔라 다이센테라이(Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 피오젠스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 누모니아(Streptococcus pneumoniae), 트로포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 또는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)를 포함함], 리케치아제(Rickettsial agent)[클라미디아 누모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 또는 리케치아 타이피(Rickettsia typhi)를 포함함], 바이러스제[홍역 바이러스(Measles virus), HIV 바이러스, C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Virus), 서부 말 뇌염 바이러스(Western Equine Encephalitis virus), 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(Venezuelan Equine Encephalitis virus), 엔테로바이러스(Enteroviruses), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 조류 독감(bird flu), 코로나바이러스(Coronavirus), 사스 코로나바이러스(SARS Coronavirus), 폴리오 바이러스(Polio virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 한타 바이러스(Hanta virus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 아르헨티나 출열성 열 바이러스(Argentine Hemorrhagic Fever virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 콩고-크리미아 출혈열바이러스(Congo-Crimean Hemorrhagic Fever virus), 라사 출혈성 열 바이러스(Lassa Hemorrhagic Fever virus), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 리프트 계곡 열 바이러스(Rift Valley Fever virus), 키야사나 삼림 질환 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 옴스크 출혈열(Omsk Hemorrhagic Fever), 황열 바이러스(Yellow Fever virus), 천연두 바이러스(Smallpox virus), RNA 종양 바이러스(retrovirus), 원두증 바이러스(Monkeypox virus), 및 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus)를 포함함], 진균제[콕시디오이데스 이미티스균(Coccidiodes immitis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슬라툼(Histoplasma capsulatum), 블라스토미스진균증(Blastomyces dermatitidis), 스포로트릭스 첸키아이(Sporotrhix schenki), 또는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigates)를 포함함], 기생충제[열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(Plasmodium vivax), 난형열원충(Plasmodium ovale), 사일열원충(Plasmodium malariae), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 플라스모듐 버게리(Plasmodium bergeri), 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni), 방광주혈흡충(Schistosoma hematobium), 일본주혈흡충(Schistosoma japonicum), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 바베스열원충(Babesia), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 크루지 파동편모충(Trypanosoma cruzi), 리슈만편모충(Leishmania ssp), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 선모충(Trichinella spiralis), 개회충(Toxocara canis), 아메리카 구충(Necator americanus), 편충(Trichuris trichura), 요충(Enterobius vermicularis), 개조충(Dipylidium caninum), 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 메디나충(Dracunculus medinensis), 반크로프트사상충(Wuchereria bancrofti), 말디 사상충(Brugia maldi), 티모르 사상충(Brugia timori), 분선충(Strongyloides stercoralis), 회충(Ascaris lumbricoides), 회선사상충(Onchocerca volvulus), 네글레리아 파울러리 아메바(Naegleria fowleri), 간흡충(Clonorchis sinensis), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 리슈만 편모충(Leishmania spp)을 포함함], 또는 또한 항생 저항 유전자, 병독성 또는 독소 생산능과 연관된 유전자, 분자 마커, 단일 뉴클레오티드 다형성, 곤충 유전자, 벌 질병제 유전자, 식물 유전자, 식물 질병 유전자, 병원균 또는 발암성 조건을 갖는 세포와 연관된 분자 마커, 미토콘드리아 뉴클레오티드 배열, 플라스미드 배열, 메신저 RNA, 리보솜 RNA 또는 타겟 핵산의 패널 등을 포함하는 유전자 또는 배열로부터 선택된 감염제와 연관된 타겟 핵산(DNA 또는 RNA)을 위한 분자 분석에 사용될 수 있다. 그리고 가축, 수의 및 수중 생물 배양 용례를 광범위하게 포함하는 포유류 또는 척추 동물 내의 감염제의 분자 진단에 사용될 수 있다. 또한 예를 들어 감염 또는 다른 방식의 병원균 조건으로부터 더 일반적으로 고통을 받는 식물, 동물 또는 곤충에서의 진단 용례가 있다. 본 발명의 특징을 갖는 카트리지 디바이스를 이용하는 면역 감시 및 생화학 분석이 또한 고려되고 진단 사용을 위해 청구된다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예의 설명이지만, 다양한 대안, 수정, 조합 및 등가물을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명을 참조하지 않고 결정될 수 있지만, 대신에 등가물의 이들의 전체 범주와 함께 첨부된 청구범위를 참조하여 결정될 수 있다. 첨부된 청구범위는 이러한 한정이 구문 "~을 위한 수단"을 사용하여 소정의 청구범위에 명시적으로 인용되어 있지 않으면, 기능식(means-plus-function) 한정을 포함하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 언급되고 및/또는 첨부 제출물에 인용되어 있는 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 문헌 및 공보는 그대로 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다. 실시예의 양태는 필요하다면 또 다른 실시예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 이용하도록 수정될 수 있다. 이들 및 다른 변경은 전술된 설명의 관점에서 실시예에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이하의 청구범위에서, 사용된 용어는 상세한 설명 및 청구범위에 개시된 특정 실시예에 청구범위를 한정하도록 해석되어서는 안되고, 이러한 청구범위가 자격을 부여하는 등가물의 전체 범주와 함께 모든 가능한 실시예를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 명세서의 상세에 의해 한정되지 않는다.

Claims (28)

  1. 생물학적 샘플 내의 타겟 분석물 또는 분석물들의 분석을 위한 마이크로유체 카트리지로서,
    a) 플라스틱 단열성 카트리지 본체로서,
    ⅰ) 상류측 샘플 입구, 분석을 위한 하나 이상의 온-보드(on-board) 액체 또는 건조 시약 및 상기 상류측 샘플 입구에 유동적으로 접속되고 하류측 통기구에서 통기되는 채널들 및 챔버들을 갖는 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 서브회로를 포함하는 유압 작업부;
    ⅱ) 공압 압력을 수용하기 위한 입구 또는 입구들 및 상기 공압 압력을 상기 입구 또는 입구들로부터 이송하기 위한 채널들 및 챔버들을 갖는 공압 서브회로를 포함하는 공압 작업부;
    ⅲ) 복수의 챔버들을 갖는 스테이징 매니폴드로서, 상기 복수의 챔버들의 각각의 상기 챔버는 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램에 의해 유압 챔버와 공압 챔버로 분리되되 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램은 상기 유압 챔버와 공압 챔버 사이에 밀봉식으로 장착되어, 직렬로 또는 병렬로 각각의 상기 유압 챔버 내로 입구를 통해 유입된 액체 체적이 그 변위 체적에 비례하는 등압 압력에 따라 각각의 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램을 팽창시키게 되고, 상기 입구는 충전이 완료된 후에 상기 스테이징 매니폴드 전체에 걸쳐서 상기 유압 압력을 평형화하기 위해 밸브식으로 폐쇄 가능한, 상기 스테이징 매니폴드; 및
    ⅳ) 병렬의 복수의 통기된 하류측 채널들로서, 상기 복수의 채널들 중 하나의 상기 채널은 상기 스테이징 매니폴드의 상기 유압 챔버들 중 적어도 하나와 유체 연통하고, 각각의 상기 통기된 하류측 채널은 충전 및 가압(pressurization) 중에 폐쇄를 위한 그리고 배수 및 가압 해제 중에 개방을 위한 밸브를 갖고, 팽창된 상태에서 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램의 상기 유압 압력은 병렬의 상기 복수의 통기된 하류측 채널들의 초기 습윤(wetout) 중에 메니스커스를 전진시키는 작업으로 수동으로 변환되는, 상기 복수의 통기된 하류측 채널들;을 포위하는, 상기 플라스틱 단열성 카트리지 본체를 포함하고,
    상기 유압 챔버들 및 다이어프램들은 분석의 습윤, 충전, 펌핑 또는 재수화 단계들 중에 기포 혼입 또는 시약 세척을 방지하거나 감소시키도록 구성되며,
    상기 공압 챔버는 대기와 통기되는 마이크로유체 카트리지.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유압 작업부는 호스트 기구의 기울어진 스테이지 상에 접지 평면에 대해 10 내지 35도의 경사각 세타(theta)로 장착될 때 작동을 위해 구성되고, 적어도 하나의 유압 챔버는 가스를 통기하거나 상기 챔버로부터 기포를 배출하기 위해 상기 챔버에 대해 위에 위치된 출구 및 상호 연통 채널로 구성되는 마이크로유체 카트리지.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유압 작업부는 상기 상류측 샘플 입구에 유동적으로 접속되고 하나 이상의 하류측 통기구에서 통기된 채널들 및 챔버들을 갖는 복수의 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 서브회로들을 포함하고, 상기 복수의 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 서브회로들은 병렬로 각각의 분석을 수행하도록 구성되고, 각각의 상기 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 서브회로는 개별 검출 챔버를 구비하는 마이크로유체 카트리지.
  4. 제 1 항에 있어서, 팽창된 상태에서 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램의 유압 압력 및 액체 체적은, 그에 유동적으로 접속된 습윤 가능한 하류측 마이크로유체 서브회로 내에서 메니스커스를 전진하는 작업으로 하류측 밸브를 개방함으로써 수동으로 변환되고 이에 의해 상기 하류측 통기구로 임의의 가스를 변위시키는 마이크로유체 카트리지.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램의 상기 액체 체적 및 유압 압력은 상기 하류측 마이크로유체 서브회로를 마크(mark)까지 충전하도록 캘리브레이션되는 마이크로유체 카트리지.
  6. 제 5 항에 있어서, 하류측 습윤 가능한 마이크로유체 서브회로들의 복수의 챔버들은 하류측 습윤 가능한 마이크로유체 서브회로를 마크까지 균등하게 충전하기 위해 탄성 수동 작동식 공압유압 다이어프램으로 각각 구성되고, 각각의 상기 서브회로는 병렬로 각각의 분석을 수행하도록 구성되고, 각각의 상기 서브회로는 개별 검출 챔버를 구비하는 마이크로유체 카트리지.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 공압유압 다이어프램은 폴리우레탄 다이어프램, 폴리비닐리덴 클로라이드 다이어프램, 폴리올레핀 다이어프램, 폴리에스테르 다이어프램, 폴리에틸렌 다이어프램, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 다이어프램, 나일론 다이어프램, 또는 이들의 적층된 또는 공압출된 조합이고, 선택적으로 금속화된 필름층을 포함하는 마이크로유체 카트리지.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 각각의 상기 하류측 통기된 채널은 마이크로유체 서브회로로의 입구로서 유동적으로 구성되고, 각각의 상기 탄성 에너지 저장 공압유압 다이어프램은 각각의 상기 하류측 마이크로유체 서브회로 사이에서 액체 체적을 균등하게 분할하기 위해 적응되는 마이크로유체 카트리지.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 각각의 마이크로유체 서브회로는 액체 시약, 건조 시약 또는 이들의 조합을 액체 샘플과 혼합을 제공하기 위한 적어도 하나의 반응 챔버와, 타겟 분석물 또는 분석물들을 검출하기 위한 검출 수단과 인터페이스하도록 구성된 적어도 하나의 검출 챔버를 포함하는 마이크로유체 카트리지.
  11. 삭제
  12. 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유압 작업부의 마이크로유체 서브회로 내로 액체 체적을 분배하기 위한 온-보드 시약 저장조를 포함하고, 상기 시약 저장조는
    a) 상기 공압 작업부의 공압 챔버와 상기 유압 작업부의 유압 챔버를 밀봉적으로 분리하는 이중 적층형 다이어프램으로서, 상기 공압 작업부에 대면하는 제 1 측면 및 상기 유압 작업부에 대면하는 제 2 측면, 상기 제 1 측면을 형성하는 제 1 층, 및 상기 제 2 측면을 형성하는 제 2 층을 갖고, 상기 제 1 층 및 제 2 층은 그 사이에 액체 중심으로서 상기 액체 체적을 포위하는, 상기 이중 적층형 다이어프램;
    b) 상기 액체 체적을 수용하여 상기 하류측 마이크로유체 서브회로로 이송하기 위한 유체 출구; 및
    c) 상기 유압 챔버 내에 배치되는 첨예부(sharp)로서, 상기 이중 적층형 다이어프램이 상기 다이어프램을 가로지르는 압력차의 인가에 의해 첨예부와 접촉하도록 관통적으로 압박될 때 상기 제 2 층을 파열하고 상기 유압 작업부 내로 상기 액체 체적을 배출하는, 상기 첨예부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 카트리지.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 이중 적층형 다이어프램의 상기 제 1 층은 파열 저항성이 있고, 상기 제 2 층은 파열 민감성이 있는 마이크로유체 카트리지.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제 1 층은 천공 저항성이 있도록 구성되는 외부 나일론 베이스층을 갖는 적층된 폴리머이고, 상기 제 2 층은 천공 민감성이 있도록 구성되는 외부 폴리에틸렌 테레프탈레이트 부재를 갖는 적층된 폴리머인 마이크로유체 카트리지.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 온-보드 시약 저장조는 그에 인가된 공압 압력의 직렬 펄스들의 작용에 의해 액체 체적들을 연속적으로 배출하도록 구성되는 마이크로유체 카트리지.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 액체 체적은 액체 반응제, 버퍼, 재수화 유체, 또는 희석제를 포함하고, 상기 액체 체적은 하류측 챔버 또는 채널 내에 배치되는 건조 시약을 재수화하는 것으로부터 선택되는 분석 단계를 위해, 고체 상태를 헹굼하기 위해, 고체 상태 기판으로부터 타겟 분석물 또는 분석물들을 용출하기 위해, 희석물을 제조하기 위해, 색층 분석 분리를 수행하기 위해, 반응을 작동하거나 정지하기 위해, 또는 상기 타겟 분석물 또는 분석물들을 검출하기 위한 것이고, 선택적으로 상기 액체 체적은 탈가스되고 상기 이중 적층형 다이어프램은 가스 불투과성인 마이크로유체 카트리지.
  17. 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상류측 샘플 입구 및 하류측 통기구를 갖는 하류측 반응 챔버로서 형성된 유압 챔버를 갖는 적어도 하나의 마이크로유체 서브회로를 포함하고, 상기 하류측 반응 챔버는 건조된 시약 스폿 또는 스폿들을 포함하고,
    상기 공압유압 다이어프램은 상기 다이어프램이 헤드공간 공기를 변위시키고 습윤 중에 시약 스폿 또는 스폿들 주위 및 위에 일시적 보호 텐트를 형성하기 위해 챔버의 바닥에 대해 팽창되는 제 1 위치와, 다이어프램이 챔버를 액체 체적으로 충전하고 기포 혼입 또는 시약 세척 없이 최대 강도에서 시약 스폿을 언커버하고 용해하기 위해 상기 챔버의 루프(roof)에 대해 이완되어 위치되거나 흡입되는 제 2 위치를 갖고 작동하도록 구성되는 것을 또한 특징으로 하는 마이크로유체 카트리지.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 건조된 시약 스폿은 버퍼, 효소, 보효소, 공동 인자, 폴리메라아제, 프라이머, 분자 비콘, 프로브, 형광소, 탈수소 효소, 산화제, 반응제, 색소포, 기판, 항체, 항원, 또는 대조(control)인 마이크로유체 카트리지.
  19. 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로유체 카트리지는 PCR을 수행하기 위한 것이고,
    상기 마이크로유체 카트리지는
    제 1 유압 챔버 상위에 있는 제 1 공압유압 다이어프램 및 제 2 유압 챔버 상위에 있는 제 2 공압유압 다이어프램으로서, 상기 제 1 유압 챔버 및 제 2 유압 챔버는 유동적으로 상호 접속하는 채널을 갖는, 상기 제 1 공압유압 다이어프램 및 제 2 공압유압 다이어프램; 및
    제 1 가열 요소를 병치하도록 구성되는 상기 제 1 유압 챔버의 제 1 열적 인터페이스 및 제 2 가열 요소를 병치하도록 구성되는 상기 제 2 유압 챔버의 제 2 열적 인터페이스를 갖는 2-구역 PCR 열순환을 위한 열적 인터페이스;를 추가로 포함하고,
    상기 제 1 공압유압 다이어프램은 PCR 증폭 중에 상기 제 1 및 제 2 유압 챔버들 사이에서 상호 유체 유동을 구동하기 위한 공압 수단으로 구성되고,
    상기 상호 접속 채널은 기포들로부터 간섭을 감소시키기 위해 10 내지 35도의 경사각 세타로 작동되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 카트리지.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 공압유압 다이어프램은 탄성중합 다이어프램이고, 상기 제 1 공압유압 다이어프램의 압박에 의해 수동으로 동작되는 마이크로유체 카트리지.
  21. 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 윈도우에 의해 제 1 반대 측면에 그리고 열-광학 윈도우에 의해 제 2 반대 측면에서 포위된 검출 챔버를 추가로 포함하고,
    상기 검출 챔버는 그 위에 위에서 배치되는 통기 포트로 공기 및 기포들을 플러싱하기 위해 10 내지 35도의 경사각 세타로 작동되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 마이크로유체 카트리지.
  22. 호스트 기구에서 소모품으로서 사용하기 위해 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 1회용 마이크로유체 카트리지를 포함하는 키트로서,
    상기 마이크로유체 카트리지는 핵산, 단백질, 항원, 항체, 대사물, 또는 효소를 위한 적어도 하나의 분석을 수행하기 위한 온-보드 반응제들을 갖고, 선택적으로 기밀 패키지 내에서 그 내부의 불활성 분위기를 갖는 키트.
  23. 호스트 기구에서 소모품으로서 사용하기 위해 제 1 항 내지 제 7 항, 제 9 항, 및 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 하나 이상의 마이크로유체 카트리지를 포함하는 키트로서,
    상기 마이크로유체 카트리지는 적어도 하나의 핵산 분석을 수행하기 위한 온-보드 시약을 갖고, 각각의 카트리지는 사용을 위한 지시들을 갖는 기밀 밀봉된 파우치 내에 패키징되고, 사용자는 샘플 입구 포트 내에 분석될 생물학적 액체 샘플만을 배치하고 상기 호스트 기구 내로 상기 마이크로유체 카트리지를 삽입하기만 하면 되고, 상기 카트리지는 모든 프라이머, 효소-공동 인자, 염, 버퍼, 폴리메라아제, 및 박테리아[아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 악티노바실루스 에쿠울리(Actinobacillus equuli), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 보르다텔라 페르투시스(Bordatella pertussis), 보르다텔라 브론치오셉티카(Bordatella bronchioseptica), 부르크홀더리아 수도말레이(Burkholderia pseudomallei), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diptheriae), 콕시엘라 브루네티(Coxiella burnetii), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 푸소박테리움 네크로포럼(Fusobacterium necrophorum), 하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 누모니아(Klebsiella pneumoniae), 킹겔라 데니트리피칸(Kingella denitrificans), 레지오넬라 누모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogenes), 모라셀라 카타할리스(Moraxella catarrhalis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라즈마 누모니아(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노호에아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티드(Neisseria meningitides), 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 수도모나스 푸트레파세인스(Pseudomonas putrefaciens), 수도노마스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 시겔라 다이센테라이(Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 피오젠스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 누모니아(Streptococcus pneumoniae), 트로포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 또는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)를 포함함], 리케치아(Rickettsia)[클라미디아 누모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 또는 리케치아 타이피(Rickettsia typhi)를 포함함], 바이러스[홍역 바이러스(Measles virus), HIV 바이러스, C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Virus), 서부 말 뇌염 바이러스(Western Equine Encephalitis virus), 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(Venezuelan Equine Encephalitis virus), 엔테로바이러스(Enteroviruses), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 조류 독감(bird flu), 코로나바이러스(Coronavirus), 사스 코로나바이러스(SARS Coronavirus), 폴리오 바이러스(Polio virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 한타 바이러스(Hanta virus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 아르헨티나 출열성 열 바이러스(Argentine Hemorrhagic Fever virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 콩고-크리미아 출혈열바이러스(Congo-Crimean Hemorrhagic Fever virus), 라사 출혈성 열 바이러스(Lassa Hemorrhagic Fever virus), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 리프트 계곡 열 바이러스(Rift Valley Fever virus), 키야사나 삼림 질환 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 옴스크 출혈열(Omsk Hemorrhagic Fever), 황열 바이러스(Yellow Fever virus), 천연두 바이러스(Smallpox virus), RNA 종양 바이러스(retrovirus), 원두증 바이러스(Monkeypox virus), 및 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus)를 포함함], 진균제[콕시디오이데스 이미티스균(Coccidiodes immitis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슬라툼(Histoplasma capsulatum), 블라스토미스진균증(Blastomyces dermatitidis), 스포로트릭스 첸키아이(Sporotrhix schenki), 또는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigates)를 포함함], 기생충제[열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(Plasmodium vivax), 난형열원충(Plasmodium ovale), 사일열원충(Plasmodium malariae), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 플라스모듐 버게리(Plasmodium bergeri), 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni), 방광주혈흡충(Schistosoma hematobium), 일본주혈흡충(Schistosoma japonicum), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 바베스열원충(Babesia), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 크루지 파동편모충(Trypanosoma cruzi), 리슈만편모충(Leishmania ssp), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 선모충(Trichinella spiralis), 개회충(Toxocara canis), 아메리카 구충(Necator americanus), 편충(Trichuris trichura), 요충(Enterobius vermicularis), 개조충(Dipylidium caninum), 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 메디나충(Dracunculus medinensis), 반크로프트사상충(Wuchereria bancrofti), 말디 사상충(Brugia maldi), 티모르 사상충(Brugia timori), 분선충(Strongyloides stercoralis), 회충(Ascaris lumbricoides), 회선사상충(Onchocerca volvulus), 네글레리아 파울러리 아메바(Naegleria fowleri), 간흡충(Clonorchis sinensis), 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 리슈만 편모충(Leishmania spp)을 포함함], 항생 저항 유전자, 병독성 또는 독소 생산능과 연관된 유전자, 분자 마커, 단일 뉴클레오티드 다형성, 곤충 유전자, 벌 질병제 유전자, 식물 유전자, 식물 질병 유전자, 병원균 또는 발암성 조건을 갖는 세포와 연관된 분자 마커, 미토콘드리아 뉴클레오티드 배열, 플라스미드 배열, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 또는 타겟 핵산의 패널과 연관된 타겟 핵산(DNA 또는 RNA)을 위해 상기 액체 샘플을 테스트하기 위한 검출 화학물을 갖는 키트.
  24. 삭제
  25. 마이크로유체 카트리지 내부로의 기포 혼입을 제한하면서 건조된 시약 스폿들을 포함하는 마이크로유체 카트리지를 습윤하는 방법으로서,
    a) 각각의 유압 챔버 내의 액체 체적 상위에 있는 탄성 공압유압 다이어프램이 팽창되어, 상기 액체 체적을 등압식으로 가압하도록 마이크로유체 카드의 복수의 유압 챔버 내로 입구를 통해 상기 액체 체적으로 펌핑하는 단계;
    b) 복수의 하류측 반응 챔버들 내의 제 2 다이어프램을 가압하는 단계로서, 각각의 상기 하류측 반응 챔버는 건조된 시약 스폿을 포함하고, 상기 제 2 다이어프램은 상기 시약 스폿 주위 및 위를 밀봉하기 위해 그리고 상기 하류측 반응 챔버로부터 헤드공간 공기를 변위시키기 위해 일시적 보호 텐트를 형성하는, 상기 가압 단계;
    c) 각각의 상기 유압 챔버로부터 출구를 밸브식으로 개방하는 단계로서, 각각의 상기 출구가 상기 복수의 하류측 반응 챔버들 중 하나로의 유동 접속되는 단계;
    d) 상기 일시적 보호 텐트 주위에 상기 하류측 반응 챔버를 습윤하고 팽창된 상기 탄성 공압유압 다이어프램이 이완되게 함으로써 상기 반응 챔버로부터 임의의 잔류 공기를 변위시키는 단계로서, 상기 액체 체적은 전진하는 메니스커스를 형성하는 단계;
    e) 상기 하류측 반응 챔버로부터 하류측의 밸브를 선택적으로 폐쇄하는 단계; 및
    f) 상기 일시적 보호 텐트를 상승시키고 각각의 반응 챔버 내로 상기 액체 체적의 잔여부를 이송하여, 이에 의해 기포 혼입 또는 시약 세척 없이 최대 강도로 시약 스폿을 용해하는 단계;를 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 건조된 시약 스폿은 버퍼, 효소, 보효소, 공동 인자, 폴리메라아제, 프라이머, 분자 비콘, 프로브, 형광소, 탈수소 효소, 반응제, 색소포, 기판, 항체, 항원, 또는 대조인 방법.
  27. 삭제
  28. 삭제
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