MXPA05009770A

MXPA05009770A - Metodo para la produccion de serina proteasas que contienen residuos de gla.

Info

Publication number: MXPA05009770A
Application number: MXPA05009770A
Authority: MX
Inventors: Krarup Janus
Original assignee: Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date: 2003-03-18
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2005-11-17
Also published as: AU2004221758B2; BRPI0408417A; WO2004083421A1; EP3103869A1; RU2005132170A; EP1611236A1; AU2004221758A1; CN1780637A; CN101818137A; RU2364626C2; CN101818138A; JP4885707B2; KR101204712B1; CN1761747A; KR20050110016A; JP2006520200A; CA2519020A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la purificacion de una proteasa.

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE SERINA PROTEASAS QUE CONTIENEN RESIDUOS DE GLA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos para la producción, purificación y formulación de proteínas de proteasas . ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se están proporcionando muchas proteínas involucradas en la cascada de coagulación que incluyen, por ejemplo, el Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y Factor XIII, que son agentes terapéuticos útiles para tratar una variedad de condiciones patológicas. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en lo que se ha referido como la "cascada" de coagulación son proenzimas o zimógenos, proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten a enzimas proteolíticas mediante la acción de un activador, por si mismo un factor de coagulación activado. Los factores de coagulación se han sometido a esta conversión y son referidos generalmente como wfactores activos" y son designados por la adición de un sufijo ¾a" (por ejemplo, el factor activado VII (FVIIa) ) . Debido a las muchas desventajas del uso de plasma humano como una fuente de productos farmacéuticos, se prefiere producir estas proteínas en sistemas recombinantes . Sin REF: 166630 embargo, las proteínas coagulantes están sujetas a una variedad de modificaciones de co- y post-traducción que incluyen, por ejemplo, la glicosilacion unida a asparagina (unida a N) ; glicosilacion unida a 0; y ?-carboxilación de los residuos de glu. Por esta razón, es preferible producirlas en células de mamífero, las cuales son capaces de modificar de manera apropiada las proteínas recombinantes. En la producción de las proteínas coagulantes de cultivos de microorganismos o líneas celulares, el paso de producción final es la recuperación y, opcionalmente, la concentración del producto de interés . Los medios de cultivo en los cuales se han desarrollado las células y los cuales contienen proteínas secretadas y, en particular, los lisados de células que contienen proteínas intracelulares de interés también contienen, a un grado mayor o menor, otras proteínas producidas por las células, además de otros contaminantes, tales como componentes de los medios, ácidos nucleicos y similares. Por lo tanto, a fin de obtener un producto proteínico, purificado es necesario separar la proteína de interés de las otras proteínas y polipéptidos y otras impurezas en el material crudo que contiene la proteína de interés . La patente norteamericana No. 5,700,914 se refiere a un método para la purificación del FVII, en donde el zinc está presente en al menos uno de los pasos de purificación.

Durante los pasos de traducción de la cultivación, purificación y en las formulaciones tradicionales, las proteínas coagulantes, activadas tienen una tendencia a autodegradarse debido a la función proteolítica de las proteínas. De esta manera, existe la necesidad en el campo de métodos mejorados para la cultivación, purificación y formulación de proteínas coagulantes, activadas para reducir la autodegradación durante la producción de proteínas coagulantes, particularmente el Factor Vil humano, recoiabinante o polipéptidos relacionados con el Factor VII. BREVE DESCRIPCION ?? LA INVENCION La presente invención se refiere en un aspecto amplio a la purificación de proteasas . El procedimiento descrito en este texto puede ser aplicable a la purificación de alguna proteasa que incluye los factores de coagulación FXii/FXiia, FXi/FZia, FX/FXa, Fix/Fixa, FVii/FViia, trombina y proteína anticoagulante C. Preferiblemente, el procedimiento se utiliza para la purificación de proteasas recombinantes producidas bajo condiciones de cultivo de células. Preferiblemente, el procedimiento se utiliza para la purificación de serina proteasas que contienen residuos de GLA (ácido gamma-carboxiglutámico) , los factores de coagulación dependientes de la vitamina K Vlla, iXa, Xa, proteína C activada y trombina. Más preferiblemente, las serina proteasas que contienen un dominio con los residuos de GLA (gamma-carboxiglutamato) son un polipéptido del Factor IX, tal como FlXa. Aún más preferiblemente, las serina proteasas que contienen un dominio con los residuos de GLA (gamma-carboxiglutamato) son un polipéptido del Factor VII, tal como FVI a. En- un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una serina proteasa que contiene residuos de GLA purificada, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa la serina proteasa que contiene residuos de GLA en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión de la serina proteasa que contiene residuos de GLA; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (iii) purificar la serina proteasa que contiene residuos de GLA del medio de cultivo; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido purificado del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa el polipéptido del Factor VII en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido del Factor VII; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende el polipéptido del Factor VII; y (iii) purificar el polipéptido del Factor VII del medio de cultivo; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una serina proteasa que contiene residuos de GLA purificada, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa la serina proteasa que contiene residuos de GLA en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión de la serina proteasa que contiene residuos de GLA; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (iii) purificar la serina proteasa que contiene residuos de GLA del medio de cultivo; en donde la relación molar de los iones de calcio y la serina proteasa que contiene residuos de GLA (Ca2+: serina proteasa que contiene residuos de GLA) conforme al paso (iii) es mayor que 20 o menor que 0.50; /o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 rtiM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido purificado del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa el polipeptido del Factor VII en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido del Factor vil; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende el polipéptido del Factor VII; Y (iii) purificar el polipéptido del Factor VII del medio de cultivo; en donde la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) conforme al paso (iii) es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor. que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA, el método comprende los pasos que consisten en: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (ii) purificar la serina proteasa que contiene residuos de GLA de la solución; en donde la relación molar de los iones de calcio y la serina proteasa que contiene residuos de GLA (Ca2+: serina proteasa que contiene residuos de GLA) conforme al paso (ii) es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 0.025 m ; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de un polipéptido del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende el polipéptido del Factor VII; y (ii) purificar el polipéptido del Factor VII de la solución; en donde la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) conforme al paso (ii) es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA, el método comprende: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (ii) purificar la serina proteasa que contiene residuos de GLA de la solución; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 1.2 iü o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de un polipéptido del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende el polipéptido del Factor VII; y (ii) purificar el polipéptido del Factor VII de la solución; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor gue 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA con lo cual una solución de una serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un polipéptido del Factor VII, con lo cual una solución de un polipéptido del Factor VII se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA con lo cual una solución de una serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la relación molar de los iones de calcio y la serina proteasa que contiene residuos de GLA (Ca2+: serina proteasa que contiene residuos de GLA) en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un polipéptido del Factor Vil, con lo cual una solución de un polipéptido del Factor VII se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la relación molar de los iones de calcio ? el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para estabilizar una serina proteasa que contiene residuos de GLA en una solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA con lo cual la solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a los pasos que consisten en adicionar calcio para obtener una concentración libre de iones de calcio mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o adicionar un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio para obtener una concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio mayor que 0.025 mM; y/o ajustar el pH de la solución que comprende una serina proteasa que contiene residuos de GLA a un pH menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para estabilizar un polipéptido del Factor VII en una solución que comprende el polipéptido del Factor VII con lo cual la solución que comprende el polipéptido del Factor VII se sujeta a los pasos que consisten en adicionar calcio para obtener una concentración libre de iones de calcio mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o adicionar un catión de metal divalente diferente de un ion de zinc y un ion de calcio para obtener una concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio mayor que 0.025 mM; y/o ajustar el pH de la solución que comprende un polipéptido del Factor VII a un pH menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende (i) una serina proteasa que contiene residuos de GLA, (ii) iones libres de calcio en una concentración mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o un catión libre de metal divalente diferente de iones de zinc y iones de calcio en una concentración mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH de la composición tiene un pH menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende (i) un polipéptido del Factor VII, (ii) iones libres de calcio en una concentración mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o un catión libre de metal divalente diferente de iones zinc y iones de calcio en una concentración mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH de la composición tiene un pH menor que 7.5 o mayor que 8.6. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A fin de reducir la autodegradación de los análogos iperactivos del FVII (a) , por ejemplo variantes de los polipéptidos del FVII con una actividad proteolítica mayor que el FVHa humano de tipo silvestre, la actividad y riesgo se reducen mediante el procesamiento a) en presencia de >25 micromolar de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio, por ejemplo Cu2+ durante la purificación, y/o b) en presencia de >1.2 mM de Ca2+ durante la purificación y/o c) en presencia de <0.1 mM de Ca2+ durante la purificación y/o d) a un pH menor que 7.5 durante la purificación y/o e) a un pH mayor que 8.6 durante la purificación. La autodegradación de los análogos hiperactivos del FVIIa es grave a pH neutro (pH=7.5) y causa una reducción considerable del rendimiento por todo el procedimiento de purificación. Las soluciones conocidas incluyen la introducción de cualquier inhibidor de proteasa altamente tóxico en el procedimiento de purificación o inhibidores "adaptados", costosos o péptidos/proteínas depuradores. Se ha mostrado por los inventores de la presente invención que la estabilización del sobrenadante de cultivo, la captura por inmunoafinidad y la purificación mediante el intercambio aniónico llevados a cabo a pH 6 tienen una enorme ventaja sobre los procedimientos de purificación del FVII conocidos . Un aspecto de la presente invención está relacionado con un método para la producción de un polipéptido purificado del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa el polipéptido del Factor VII en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido del Factor VII; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende el polipéptido del Factor VII; y (iii) purificar el polipéptido del Factor VII del medio de cultivo; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido purificado del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa el polipéptido del Factor VII en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido del Factor VII; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende el polipéptido del Factor VII; y (iii) purificar el polipéptido del Factor VII del medio de cultivo; en donde la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca+ :polipéptido del FVI ) conforme al paso (iii) es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (iii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la purificación de un polipéptido del Factor VII, el método comprende los pasos que consisten en: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende el polipéptido del Factor VII; y (ii) purificar el polipéptido del Factor VII de la solución; en donde la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) conforme al paso (ii) es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de un polipéptido del Factor vil, el método comprende los pasos que consisten en: (i) recuperar la totalidad o parte de una solución que comprende el polipéptido del Factor VII; y (ii) purificar el polipéptido del Factor VII de la solución; en donde la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (ii) es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH conforme al paso (ii) es menor que 7.5 o mayor que 8.6.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un polipéptido del Factor VII con lo cual una solución de un polipéptido del Factor VII se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un polipéptido del Factor VII con lo cual una solución de un polipéptido del Factor VII se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+ ¡polipéptido del FVII) en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 20 o menor que 0.50; y/o en donde la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM; y/o e donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para estabilizar un polipéptido del Factor VII en una solución que comprende el polipéptido del Factor VII con lo cual la solución que comprende el polipéptido del Factor VII se sujeta a los pasos que consisten en adicionar calcio para obtener una concentración libre de iones de calcio mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o adicionar un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio para obtener una concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio mayor que 0.025 mM; y/o ajustar el pH de la solución que comprende un polipéptido del Factor VII a un pH menor que 7.5 o mayor que 8.6. En un aspecto adicional , la presente invención se refiere a un método para la producción de una serina proteasa que contiene residuos de GLA purificada, el método comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa la serina proteasa que contiene residuos de GLA en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión de la serina proteasa que contiene residuos de GLA; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (iii) purificar la serina proteasa gue contiene residuos de GLA del medio de cultivo; en donde el pH conforme al paso (iii) tiene un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA con lo cual una solución de una serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a una variedad de pasos de purificación, en donde el pH en al menos uno de los pasos de purificación tiene un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para estabilizar una serina proteasa que contiene residuos de GLA en una solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA con lo cual la solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a los pasos que consisten en adicionar calcio para obtener una concentración libre de iones de calcio mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o adicionar un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio para obtener la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio mayor que 0.025 mM; y/o ajustar el pH de la solución que comprende una serina proteasa que contiene residuos de GLA a un valor entre 4.5 y 6.9 o a un valor entre 8.6 y 10. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende una serina proteasa que contiene residuos de GLA en una solución con un pH en un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. El término ¾serina proteasa que contiene residuos de GLA", utilizado en este texto, significa una proteína seleccionada del grupo que consiste de los polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor IX, Factor X y variantes y derivados de los mismos, proteina C y variantes y derivados de la misma, y protroiribina/trombina y variantes y derivados de las mismas, en donde la proteína contiene uno o más residuos del aminoácido de ácido gamma-carboxiglutámico (GLA) . En una modalidad, la serina proteasa que contiene residuos de GLA es la forma activa de la proteína, tal como el Factor Vlla, Factor IXa, Factor Xa, proteína C activada y trombina. En una modalidad, · la serina proteasa que contiene residuos de GLA es humana . Por "estabilizar" una serina proteasa que contiene residuos de GLA, tal como un polipéptido del Factor VII o un polipéptido del Factor IX en una composición que comprende la serina proteasa se propone disminuir el grado de degradación, es decir la cantidad de productos de degradación por unidad de tiempo, de la serina proteasa en la composición, por ejemplo la degradación proteolítica o química. Preferiblemente, la degradación medida en el ensayo de velocidad de formación de GD-FVIIa descrito en este texto es menor que 60% de la formación máxima de GD-FVIIa, tal como 50% de la formación máxima de GD-FVIIa, tal como 40% de la formación máxima de GD-FVIIa, tal como 30% de la formación máxima de GD-FVIIa, tal como 20% de la formación máxima de GD-FVIIa, tal como 10% de la formación máxima de GD-FVIIa. Se debe entender que por "estabilizar" una serina proteasa que contiene residuos de GLA en una composición se propone un incremento en la estabilidad durante cualquier paso en el procedimiento de producción de proteínas recombinantes, el paso se selecciona del grupo que consiste de recolección, captura, almacenamiento, manipulación, procesamiento, purificación, pre-formulación a granel, formulación a granel, ultra- /diafiltración, intercambio iónico, captura por intercambio aniónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, precipitación y purificación por afinidad. El término "serina proteasa que contiene residuos de GLA purificada", utilizado en este texto, significa una serina proteasa que contiene residuos de GLA que ha sido separada de al menos aproximadamente 50 por ciento en peso de los polinucleótidos , lípidos, carbohidratos y cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en el medio de cultivo después de la expresión en células hospederas, eucarióticas, los cuales -interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación. La serina proteasa que contiene residuos de GLA se puede purificar para estar sustancialmente libre de contaminantes naturales del medio de cultivo a través del uso de cualquiera de una variedad de metodologías . La tecnología de separación cromatográfica estándar para la purificación de la serina proteasa que contiene residuos de GLA también se puede utilizar en algunos de los pasos de purificación. El término "polipéptido purificado del Factor VII" utilizado en este texto, significa un polipéptido del Factor VII que ha sido separado de al menos aproximadamente 50 por ciento en peso de los polinucléotidos , lípidos, carbohidratos y cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentren en el medio de cultivo después de la expresión en células hospederas, eucarióticas, los cuales interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación. El polipéptido del Factor VII se puede purificar para estar sustancialmente libre de contaminantes naturales del medio de cultivo a través del uso de cualquiera de una variedad de metodologías . La tecnología de separación cromatográfica estándar para la purificación del polipéptido del Factor VII también se puede utilizar en algunos de los pasos de purificación. Por "purificar" un polipeptido de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes se propone incrementar el grado de pureza del polipéptido en la composición al remover (completa o parcialmente) al menos un contaminante de la composición. Un "paso de purificación" puede ser parte de un procedimiento de purificación total que da por resultado una composición "homogénea", . la cual se utiliza en este texto para referirse a una composición que comprende al menos aproximadamente 70% en peso del polipéptido de interés, basado en el peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente 80% en peso. El término "concentración libre de iones de calcio", utilizado en este texto, significa la concentración de iones de calcio positivos, di alentes (Ca2÷) circundados por moléculas de agua. El término no incluye calcio en forma sólida, es decir en una estructura cristalina o calcio enlazado en proteínas, tales como FVII . El término "concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio", utilizado en este texto, significa la concentración de un ión positivo, divalente circundando por moléculas de agua, el cual no es un ión de calcio ni un ión de zinc. El término no incluye un ión positivo, divalente en forma sólida, es decir en una estructura cristalina o iones enlazados en proteínas . En una modalidad de la invención, los pasos de purificación son pasos de purificación cromatográfica. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es la cromatografía de interacción hidrófoba. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es la cromatografía de exclusión de tamaño. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es una cromatografía de intercambio aniónico. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es la ultrafiltración. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es la purificación por inmunoafinidad. En una modalidad de la invención, al menos un paso de purificación es la diafiltración. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.2 niM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 m , tal como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 M, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. El término Bconcentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada", utilizado en este texto, significa la concentración libre de iones de calcio, cuando los iones libres de calcio, disueltos existen en equilibrio con un ión de calcio no disuelto en la forma sólida. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es menor que 0.10 mM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona del grupo que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Sm2+, Ni2+, Cd2+, Hg2+, Sm2+ y Uo2+. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y Mri2+. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 M, tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) en presencia de un formador de quelatos adicional de iones de metales divalentes . En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es purificado conforme al paso (iii) en presencia de un formador de quelatos adicional de iones de metales divalentes . El término ¾formador de quelatos de iones de metales divalentes", utilizado en este texto, significa cualquier agente o compuesto que remueva o se una a iones de metales divalentes, tales como iones de calcio o iones de zinc. El formador de quelatos de iones de metales divalentes puede ser un quelante de ácido policarboxílico, citrato, batocuproína, batofenantrolina, DTPA, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , EGTA, penicilamina, TETA, TPE y derivados de los mismos . En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH menor que 7.5. En una modalidad de la invención, el pH es menor que 7.4, tal como menor que 7.3, tal como menor que 7.2, tal como menor que 7.1, tal como menor que 7.0, tal como menor que 6.8, tal como menor que 6.6, tal como menor que 6.4, tal como menor que 6.2, tal como menor que 6.0, tal como 5.5. En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH mayor que 8.6. En una modalidad de la invención, el pH es mayor que 8.7, tal como mayor que 8.8, tal como mayor que 8.9, tal como mayor que 9.0, tal como mayor que 9.1, tal como mayor que 9.2, tal como mayor que 9.4, tal como mayor que 9.6, tal como mayor que 9.8, tal como mayor que 10.0, tal como mayor que 10.2, tal como mayor que 10.4, tal como mayor que 10.8, tal como 11.0. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica conforme al paso (iii) a un pH menor que 7.5. En una modalidad de la invención, el pH es menor que 7.4, tal como menor que 7.3, tal como menor que 7.2, tal como menor que 7.1, tal como menor que 7.0, tal como menor que 6.8, tal como menor que 6.6, tal como menor que 6.4, tal como menor que 6.2, tal como menor que 6.0, tal como 5.5. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica conforme al paso (iii) a un pH mayor que 8.6. En una modalidad de la invención, el pH es mayor que 8.7, tal como mayor que 8.8, tal como mayor que 8.9, tal como mayor que 9.0, tal como mayor que 9.1, tal como mayor que 9.2, tal como mayor que 9.4, tal como mayor que 9.6, tal como mayor que 9.8, tal como mayor que 10.0, tal como mayor que 10.2, tal como mayor que 10.4, tal como mayor que 10.8, tal como 11.0. En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica a un pH entre 4.5 y 6.9. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica a un pH entre 4.5 y 6.9. En una modalidad de la invención, el pH está entre 4.7 y 6.8, tal como entre 4.9 y 6.7, tal como entre 5.1 y 6.6, tal como entre 5.3 y 6.5, tal como entre 5.5 y 6.4, tal como entre 5.7 y 6.3, tal como entre 5.8 y 6.2, tal como entre 5.9 y 6.1, tal como aproximadamente 6.0. En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica a un pH entre 8.6 y 10. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica a un pH entre 8.6 y 10. En una modalidad de la invención, el pH está entre 8.7 y 9.9, tal como entre 8.8 y 9.8, tal como entre 8.9 y 9.7, tal como entre 9.0 y 9.6, tal como entre 9.1 y 9.5, tal como entre 8.7 y 9.8, tal como entre 8.7 y 9.7, tal como entre 8.7 y 9.6, tal como entre 8.8 y 9.5, tal como entre 8.9 y 9.4,' tal como entre 9.0 y 9.2 , tal como aproximadamente 9.2. En una modalidad de la invención, la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica en presencia de histidina. Se debe entender que la histidina puede servir para amortiguar el pH en un rango de 5-7 u 8-10. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica en presencia de histidina. Se debe entender que la histidina puede servir para amortiguar el pH en un rango de 5-7 u 8-10. En una modalidad de la invención, la célula hospedera es una célula hospedera, eucariótica. En una modalidad de la invención, la célula hospedera, eucariótica es una célula de mamífero. En una modalidad de la invención, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células HEK, células BHK, células CHO, células COS y células de mieloma, tales como SP2-0. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es el factor VII humano de tipo silvestre. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII tiene una actividad proteolítica mayor que el FVIIa humano de tipo silvestre. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido relacionado con el factor VII que se selecciona del grupo que consiste de: L305V-FVII, L305V/ 306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII , V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298 -FVII y S336G-FVII, L305V/K337 -FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII , L305V/ 337A/V158T-FVII , L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/ 337A/E296V-FVII , L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII , L305V/V158T/E2 6V-FVII , L305V/E296V/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/ I58T/K337A/M298Q-FVII , L305 / I58T/E296V/ 337A-FV I , L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/VI58D/E296V/ 298Q/K337A-FVII , L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII , S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII , S314E/K337A-FVII , S314E/VI58D-FVII, S314E/E296V-FVII , S314E/M298Q-FVII , S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, 316H/E296V-FVII , K316H/M298Q-FVII, 316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII , K316Q/ 337A-FVII , K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII , K316Q/ 298Q-FVII, 316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/ 337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ 298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L3O5V/V158 / 337?/?298Q-FVII , S314?/L305V/VI58 /?296V/ 337A-FVII , S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L3O5V/V158D/E296V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L.305V/K337A-FVII, 316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, 316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, 316H/L305V/ 337A/V158T-FVII, 316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158T/ 337A/M298Q-FVII, K316H/L3O5V/VI58 /?296V/K337A-FVII , K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337 /V158T-FVII, 316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII , 316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, 316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/ 337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII , K316Q/L305V/V158D/ 337A/M298Q-FVII, 316Q/L3O5V/Vl58D/E296V/ 337A-FVII , K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, 316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/ 298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D-FVII , F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/ 337A/V158T-FVII , F374Y/K337A/ 298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII , F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII , F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/ 337A/V158D-FVII , F374Y/L3O5V/ 337?/?296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/ 337A/S314E-FVII , F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII , F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII , F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/ 337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E2 6V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/?337A/S314E-FVII , F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII , F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII , F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ 298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158?/?296V/M298Q/S314E-FVII , F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII , F374Y/V158T/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374?/L305V/VI58?/?296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158?/?298Q/S314E-FVII , F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374?/?296V/M298Q/?337A/V158?7S314E-FVII , F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ 298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ 337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; Rl52E-Factor VII, S344A~Factor VII, Factor Vlla que carece del domino Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII , G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FBI que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys. En una modalidad de la invención, , la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) conforme al paso (iii) es mayor que 20. En una modalidad de la invención, la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+:polipéptido del FVII) conforme al paso (iii) es mayor que 20, tal como mayor que 22, tal como mayor que 24, tal como mayor que 26, tal como mayor que 28, tal como mayor que 30, tal como mayor que 34, tal como mayor que 38, tal como mayor que 42, tal como mayor que 45, tal como mayor que 50, tal como mayor que 55, tal como mayor que 60, tal como mayor que 65, tal como mayor que 70 , tal como mayor que 76 , tal como mayor que 82, tal como mayor que 90, tal como mayor que 95, tal como mayor que 100. En una modalidad de la invención, la relación molar de los iones de calcio y el polipeptido del Factor Vil (Ca2+:polipeptido del FVII) conforme al paso (iii) es menor que 0.50. En una modalidad de la invención, la relación molar de los iones de calcio y el polipéptido del Factor VII (Ca2+¡polipeptido del FVII) conforme al paso (iii) es menor que 0.50, tal como menor que 0.45, tal como menor que 0.40, tal como menor que 0.35, tal como menor que 0.30, tal como menor que 0.25, tal como menor que 0.20, tal como menor que 0.15, tal como menor que 0.10, tal como menor que 0.05, tal como 0.00. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 1.2 mM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor gue 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor q e 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que .0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 0.10 mM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe21, Sm2+, Ni2+, Cd2+, Hg2+, Sm2+ y Uo2+. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y Mn2+. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio en al menos uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 m , tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mM, tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica en al menos uno de los pasos de purificación en presencia de un formador de quelatos adicional de iones de metales divalentes . En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica en al menos uno de los pasos de purificación a un pH menor que 7.5. En una modalidad de la invención, el pH es menor que 7.4, tal como menor que 7.3, tal como menor que 7.2, tal como menor que 7.1, tal como menor que 7.0, tal como menor que 6.8, tal como menor que 6.6, tal como menor que 6. , tal como menor que 6.2, tal como menor que 6.0, tal como 5.5. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica en al menos uno de los pasos de purificación a un pH mayor que 8.6. En una modalidad de la invención, el pH es mayor que 8.7, tal como mayor que 8.8, tal como mayor que 8.9, tal como mayor que 9.0, tal como mayor que 9.1, tal como mayor que 9.2, tal como mayor que 9.4, tal como mayor que 9.6, tal como mayor que 9.8, tal como mayor que 10.0, tal como mayor que 10.2, tal como mayor que 10.4, tal como mayor que 10.8, tal como 11.0. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII se purifica en al menos uno de los pasos de purificación en presencia de histidina. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor que 1.2 mM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.10 mM. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02 , tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, re2+, Sm2+, Ni2+, Cd2+, Hg+, Sm2+ y Uo2+. En una modalidad de la invención, el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y Mn2+. En una modalidad de la invención, la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mMf tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es estabilizado en presencia de un formador de quelatos adicional de iones de metales divalentes. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es estabilizado a un pH menor que 7.5. En una modalidad de la invención, el pH es menor que 7.4, tal como menor que 7.3, tal como menor que 7.2, tal como menor que 7.1, tal como menor que 7.0, tal como menor que 6.8, tal como menor que 6.6, tal como menor que 6.4, tal como menor que 6.2, tal como menor que 6.0, tal como 5.5. En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor VII es estabilizado a un pH mayor que 8.6. En una modalidad de la invención, el pH es mayor que 8.7, tal como mayor que 8.8, tal como mayor que 8.9, tal como mayor que 9.0, tal como mayor que 9.1, tal como mayor que 9.2, tal como mayor que 9.4, tal como mayor que 9.6, tal como mayor que 9.8, tal como mayor que 10.0, tal como mayor que 10.2, tal como mayor que 10.4, tal como mayor que 10.8, tal como 11.0.

En una modalidad de la invención, el polipéptido del Factor Vil es estabilizado en presencia de histidina. El término "polipéptido del Factor IX", utilizado en este texto, significa el Factor IX humano de tipo silvestre así como también variantes del Factor IX que exhiben sustancialmente una actividad biológica igual o mejorada con relación al Factor IX de tipo silvestre, polipéptidos relacionados con el Factor IX así como también derivados del Factor IX y conjugados del Factor IX. Se propone que el término "Factor IX" incluya polipéptidos del Factor IX en su forma no escindida (zimógeno) así como también aquellos que han sido procesados proteolíticamente para producir sus formas bioactivas, respectivas, las cuales se pueden designar como el Factor IXa. Estas variantes del Factor IX pueden exhibir diferentes propiedades con relación al Factor IX humano, inclusive estabilidad, unión a fosfolípidos, actividad específica alterada y similares. El término "polipéptido del Factor VII", utilizado en este texto, significa el Factor vil de tipo silvestre (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente norteamericana No. 4,784,950), así como también variantes del Factor VII que exhiben una- actividad biológica sustancialmente igual o mejorada con relación al Factor VII de tipo silvestre, polipéptidos relacionados con el Factor VII, así como también derivados del Factor VII y conjugados del Factor VII. Se propone que el término "Factor VII" incluya polipéptidos del Factor VII en su forma no escindida (zimógeno) , así como también aquellos que han sido procesados proteolíticamente para producir sus formas bioacti as, respectivas, las cuales se pueden designar como el Factor Vlla. Típicamente, el Factor VII es escindido entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor Vlla. Estas variantes del Factor VII pueden exhibir diferentes propiedades con relación al Factor VII humano, inclusive estabilidad, unión a fosfolípidos , actividad específica alterada y similares . Como se utiliza en este texto, los "polipéptidos relacionados con el Factor VII" incluyen polipéptidos, inclusive variantes, en los cuales la actividad biológica del Factor Vlla ha sido modificada sustancialmente o reducida con relación a la actividad del Factor Vlla de tipo silvestre. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el Factor VII o el Factor Vlla en el cual se han introducido alteraciones específicas de la secuencia de aminoácidos que modifican o interrumpen la bioactividad del polipéptido. El término "derivado del Factor VII", utilizado en este texto, se propone para designar el Factor VII de tipo silvestre, variantes del Factor VII que exhiben una actividad biológica sustancialmente igual o mejorada con relación al Factor VII de tipo silvestre y los polipéptidos relacionados con el Factor VII, en los cuales uno o más de los aminoácidos del péptido precursor han sido modificados químicamente, por ejemplo mediante la alquilación, pegilación, acilación, formación de éster o formación de amida o similares . Esto incluye, pro no está limitado a, el Factor Vlla humano pegilado, Factor Vlla humano pegilado en la cisteína y variantes de los mismos . El término "Factor Vlla humano, pegilado" significa el Factor Vlla humano que tiene una molécula de PEG conjugada con el polipeptido del Factor Vlla humano. Se debe entender que la molécula de PEG se puede unir a cualquier parte del polipéptido del Factor Vlla que incluye cualquier residuo de aminoácido o porción de carbohidrato del polipéptido del Factor Vlla. El término "Factor Vlla humano pegilado en la cisteína" significa el Factor Vlla que tiene una molécula de PEG conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en el Factor Vlla humano . La actividad biológica del Factor Vlla en la coagulación de la sangre se deriva de su capacidad para (i) unirse al factor del tejido (TF, por sus siglas en inglés) e (ii) catalizar la escisión proteolítica del Factor IX o el Factor X para producir el Factor IX o X activado (Factor ixa o Xa, respectivamente) . Para propósitos de la invención, la actividad biológica del Factor Vlla puede cuantificarse al medir la capacidad de una preparación para promover la coagulación de la sangre utilizando plasma o tromboplastina deficiente en cuanto al Factor Vlla, como se describe en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,997,864. En este ensayo, la actividad biológica es expresada como la reducción en el tiempo de coagulación con relación a una muestra de control y se convierte a "unidades del Factor VII" mediante la comparación con un estándar de suero humano acumulado que contiene 1 unidad/ml de actividad del Factor VII . Alternativamente, la actividad biológica del Factor Vlla se puede cuantificar al (i) medir la capacidad del Factor Vl a para producir el Factor Xa en un sistema que comprende el TF incrustado en una membrana de lipidos y el Factor X. (Persson y colaboradores., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) medir la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso; (iii) medir su unión física al TF utilizando un instrumento basado en la resonancia del plasmón superficial (Persson, FEBS Letts . 413:359-363, 1997) y (iv) medir la hidrólisis de un substrato sintético . Las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente igual o mejorada con relación al Factor Vlla de tipo silvestre incluyen aquellas que exhiben al menos aproximadamente 25%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, más · preferiblemente al menos aproximadamente 75% y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de la actividad específica del Factor Vlla que se ha producido en el mismo tipo de célula, cuando se somete a prueba en uno o más ensayos de coagulación, ensayos de proteólisis o ensayos de unión de TF como se describiera anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente reducida con relación al Factor Vlla de tipo silvestre son aquellas que exhiben menos de aproximadamente 25%, preferiblemente menos de aproximadamente 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente 5% y mucho más preferiblemente menos .de aproximadamente 1% de la actividad específica del Factor Vlla de tipo silvestre que se ha producido en el mismo tipo de célula cuando se somete a prueba en uno o más ensayos de coagulación, ensayos de proteólisis o ensayos de unión de TF como se describiera anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen, una actividad biológica sustancialmente modificada con relación al Factor VII de tipo silvestre incluyen, sin limitación, variantes del Factor VII que exhiben actividad proteolítica del Factor X independiente de TF y aquellas que se unen a TF pero que no escinden el Factor X. Las variantes del Factor VII, ya sea que exhiben una bioactividad sustancialmente igual o mejor que el Factor VII de tipo silvestre o, alternativamente, que exhiben una bioactividad sustancialmente modificada o reducida con relación al Factor VII de tipo silvestre incluyen, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VII de tipo silvestre mediante la inserción, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos . Los ejemplos no limitantes de las variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente igual como el Factor VII de tipo silvestre incluyen S52A-FVI a, S60A-FVIIa (Lino y colaboradores, Aren. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); Las variantes del FVIIa que exhiben estabilidad proteolítica incrementada que se describen en la patente norteamericana No. 5,580,560; el Factor Vlla que ha sido escindido proteolíticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup y colaboradores, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); las formas oxidadas del Factor Vlla (Komfelt y colaboradores, Aren. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); las variantes del FVII descritas en PCT/DK02/00189 ; y las variantes del FVII que exhiben estabilidad proteolítica incrementada como se describe en WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; las variantes del FVII que tienen un dominio G modificado y que exhiben una unión mejorada a la membrana como se describe en WO 99/20767 (University of Minnesota) ; las variantes del FVII que se describen en WO 01/58935 (Maxygen ApS) . Los ejemplos no limitantes de variantes del FVII que tienen una actividad biológica incrementada en comparación con el FVIIa de tipo silvestre incluyen las variantes del FVII descritas en WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635, solicitud de patente danesa PA 2002 01423, solicitud de patente danesa PA 2001 01627; WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; y las variantes del FVIIa con actividad mejorada como se describe en JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.). Los ejemplos .no limitantes de variantes del Factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente reducida o modificada con relación al Factor VII de tipo silvestre incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose y colaboradores, Bioche 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama y colaboradores, J. Biol . Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst y colaboradores, Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y el Factor Vlla que carece del dominio Gla (Nicolaisen y colaboradores, FEBS Letts . 317:245-249, 1993). Los ejemplos del Factor VII o polipeptidos relacionados con el Factor VII incluyen, sin limitación, el Factor VII de tipo silvestre, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, 337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII , V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII , V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII , L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/ 337A/E296V-FVII , L305V/ 337A/V158D-FVII , L305V/V158D/ 2 8Q-FVII , L305V/V158D/E296V-FVII , L305V/V158T/M298Q-FVII , L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E2 6V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, L305V/V158D/ 337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/ 337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII , S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII , K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVTI, K316H/E296V-FVII , K316H/M298Q-FVII , K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, 316Q/K337A-FVII , K316Q/V158D-FVII, 316Q/E296V-FVII , K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/V158T-FVII , S314E/L305V/ 337?/?298Q-FVII , S314E/L305V/K337?/?296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII , S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVTI, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, 316H/L305V/ 337A- FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII , K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ 298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, 316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, 316H/L305V/V158T/M298Q-FVII , K316H/L305 /V158T/E2 6V-FVII , K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V/M298Q- FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, ?316H/L305V/V158D/K337?/?298Q-FVII , K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/ 337A-FVII, 316Q/L305V/V158D-FVII, 316Q/L305V/E296V-FVII , 316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII , K316Q/L305V/ 337A/V158T-FVII, 316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, 316Q/L305V/K337?/?296V-FVII , ?316Q/L305V/K337A/V158D-FVII , K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, 316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, 316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, 316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII , F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII , F374Y/K33 A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII , F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII , F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII , F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E2 6V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII , F374?/?296V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII , F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F37 Y/L305V/V158D/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII , F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII , F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E2 6V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E- FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F37 Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/ 337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII , F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ 337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; l52E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor Vlla que carece de dominio Gla; y P11Q/ 33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII , V253N-FVII, R290N/A292T-FVII , G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, 143N/N145T/R315N/V317T-FVII; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys. La terminología utilizada para las sustituciones de aminoácidos es como sigue. La primera letra representa al aminoácido presente naturalmente en una posición del FVII humano de tipo silvestre. El siguiente número representa la posición en el FVII humano de tipo silvestre. La segunda letra representa el aminoácido diferente que es sustituido (reemplazo) por el aminoácido natural. Un ejemplo es M298Q, donde una metionina en la posición 298 del FVII humano de tipo silvestre es reemplazada por una glutamina. En otro ejemplo, V158T/M298Q, la valina en la posición 158 del FVII humano de tipo silvestre es reemplaza por una treonina y la metionina en la posición 298 del FVII humano de tipo silvestre es reemplaza por una glutamina en el mismo polipéptido del Factor VII . En una modalidad adicional de la invención, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido, en donde la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 1.25. En una modalidad, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 2.0. En una modalidad adicional, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor Vil y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 4.0. En una modalidad adicional de la invención, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido, en donde la relación entre la actividad de polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 1.25 cuando se somete a prueba en un ensayo de actividad del Factor Vlla. En una modalidad, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 2.0 cuando se somete a prueba en un ensayo de actividad del Factor Vlla. En una modalidad adicional, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 4.0 cuando se somete a prueba en un ensayo de actividad del Factor Vlla. La actividad del Factor Vlla se puede medir mediante los ensayos descritos conforme a "ensayos". En una modalidad adicional de la invención, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido, en donde la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 1.25 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Hidrólisis In Vitro" . En una modalidad, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 2.0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Hidrólisis In Vitro" . En una modalidad adicional, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente .0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Hidrólisis In Vitro" . En una modalidad adicional de la invención, el polipéptido del Factor VII es un polipéptido, en donde la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 1.25 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Proteólisis In Vitro". En una modalidad, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 2.0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Proteólisis In Vitro". En una modalidad adicional, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 4.0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Proteólisis In Vitro". En una modalidad adicional, la relación entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor Vlla humano de tipo silvestre es al menos aproximadamente 8.0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Proteólisis In Vi tro" . - La presente invención es adecuada para las variantes del Factor VlI/VIIa con actividad incrementada en ' comparación con el tipo silvestre. Las variantes del Factor VlI/VIIa con actividad incrementada se pueden encontrar mediante la prueba en ensayos adecuados descritos posteriormente. Estos ensayos se pueden realizar como una prueba preliminar, simple in vi tro. De esta manera, la sección de "ensayos" describe una prueba simple (titulada "Ensayo de Hidrólisis In Vitro") para la actividad de las variantes del Factor Vlla de la invención. En base a lo mismo, las variantes del Factor Vlla que son de interés particular son estas variantes donde la relación entre la actividad de la variante y la actividad del Factor VII de tipo silvestre se sobre 1.0, por ejemplo al menos aproximadamente 1.25, preferiblemente al menos aproximadamente 2.0, tal como al menos aproximadamente 3.0 o, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 4.0 cuando se somete a prueba en el "Ensayo de Hidrólisis In Vitro" . La actividad de las variantes también se puede medir utilizando un substrato fisiológico, tal como el factor X ("Ensayo de Proteólisis In Vitro") (véase conforme a los "ensayos"), de manera adecuada a una concentración de 100-1000 nM, donde el factor Xa generado es medido después de la adición de un substrato cromogénico, adecuado (por ejemplo S-2765) . Además, el ensayo de actividad se puede conducir a una temperatura fisiológica. La capacidad de las variantes del Factor VIla para generar trombina también se puede medir en un ensayo que comprende todos los factores e inhibidores de coagulación relevantes en concentraciones fisiológicas (menos el Factor VII cuando se imitan las condiciones de hemofilia A) y plaquetas activadas (como se describe en la página 543 en Monroe y colaboradores, (1997) Brit. J. Haematol . 99, 542-547, la cual se incorpora por este acto a manera de referencia) . Los polipéptidos del Factor VII descritos en este texto se pueden producir por medio de técnicas de ácido nucleico recombinante. En general, una secuencia de ácido nucleico del Factor Vil de tipo silvestre, clonada se modifica para codificar la proteína deseada. Esta secuencia modificada entonces se inserta en un vector de expresión, el cual es transformado a su vez o transfectado dentro células hospederas. Las células eucarióticas, superiores, en particular las células de mamífero cultivadas se prefieren como células hospederas. El nucleótido completo y las secuencias de aminoácidos para el Factor Vil humano son conocidos (véase la patente norteamericana No. 4,784,950, donde se describe la clonación y expresión del Factor VII humano, recombinante) . La secuencia del Factor VII bovino se describe en Takeya y colaboradores, J. Biol . Chem. 263:14868-14872 (1988)). Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos se pueden realizar por medio de una variedad de técnicas . La modificación de la secuencia de ácido nucleico puede ser mediante la mutagénesis de sitio específico. La técnicas para la mutagénesis de sitio específico son conocidas en el campo y se describen en, por ejemplo, Zoller y Smith (DNA 3:479-488, 1984) o "Splicing by extensión overlap", Horton y colaboradores, Gene 77, 1989, páginas 61-68. De esta manera, mediante el uso de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del Factor VII, uno puede introducir la(s) alteración (es) de la selección. De igual manera, los procedimientos para preparar una construcción de ADN utilizando una reacción en cadena de polimerasa que utiliza cebadores específicos son bien conocidos para las personas expertas en el campo (véase PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EUA) . La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido del Factor VII de la invención puede ser apropiadamente de origen genómico o de ADNc, por ejemplo obtenido mediante la preparación de una biblioteca genómica o de ADNc y la selección para las secuencias de ADN que codifican la totalidad o parte del polipéptido mediante la hibridización utilizando sondas de oligonucleotidos sintéticos de acuerdo con técnicas estándar (véase Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-edición Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) . La construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido del Factor VII también se puede preparar sintéticamente por medio de métodos estándar, establecidos, por ejemplo el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el método descrito por Matthes y colaboradores, EMBO Journal 3 (1984), 801-805. De acuerdo con el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo en un sintetizador automático de ADN, purificados, hibridizados , ligados y clonados en vectores adecuados . Además, la construcción de ácido nucleico puede ser de una combinación de origen sintético y genómico, una combinación de origen sintético y de ADNc o una combinación de origen genómico y de ADNc preparada al ligar fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (como sea apropiado) , con los fragmentos que corresponden a diversas partes de la construcción completa de ácido nucleico, de acuerdo con técnicas estándar. La construcción de ácido nucleico es preferiblemente es una construcción de ADN. Las secuencias de ADN para el uso en la producción de polipéptidos del Factor VII de acuerdo con la presente invención codificarán típicamente un polipéptido pre-pro en la terminación amino del Factor VII para obtener el procesamiento post-traducción, apropiado (por ejemplo, la gamma-carboxilación de los residuos de ácido glutámico) y la secreción de la célula hospedera. El polipéptido pre-pro puede ser aquel del Factor VII u otra proteína de plasma dependiente de la vitamina K, tal como el Factor IX, Factor X, protrombina, proteína C o proteína S. Como será apreciado por aquellas personas expertas en el campo, las modificaciones adicionales se pueden hacer en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos del Factor VII donde esas modificaciones no proporcionan significantemente la capacidad de la proteína para actuar como un coagulante. Por ejemplo, los polipéptidos del Factor VII también se pueden modificar en el sitio de escisión de activación para inhibir la conversión del Factor VII del zimógeno en su forma activada de doble cadena, como se describe generalmente en la patente norteamericana No. 5,288,629. Los vectores de expresión para el uso en la expresión de las variantes del Factor V la comprenderán un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen clonado o ADNc. Los promotores preferidos para el uso en las células de mamífero cultivadas incluyen promotores virales y promotores celulares. Los promotores virales incluyen el promotor SV40 (Subramani y colaboradores, Mol. Cell . Biol . 1:854-864, 1981) y el promotor CMV (Boshart y colaboradores, Cell 41:521-530, 1985) . Un promotor viral particularmente preferido es el promotor tardío, principal del adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). Los promotores celulares incluyen el promotor del gen kappa de ratón (Bergman y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 81:7041-7045, 1983) y el promotor VH de ratón (Loh y colaboradores, Cell 33:85-93, 1983) . Un promotor celular particularmente preferido es el promotor de metalotioneina-I de ratón (Palmiter y colaboradores, Science 222:809-814, 1983). Los vectores de expresión también pueden contener un conjunto de sitios de empalme de ARN localizados corriente abajo del promotor y corriente arriba del sitio de inserción de la secuencia misma del Factor VII. Los sitios de empalme de ARN preferidos se pueden obtener a partir de genes de adenovirus y/o inmunoglobulina. Una señal de poliadenilacion localizada corriente abajo del sitio de inserción también está contenida en los vectores de expresión. Las señales de poliadenilacion particularmente preferidas incluyen la señal de poliadenilacion temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilacion de la región 5 Elb de adenovirus , el terminador del gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto y colaboradores, Nucí. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) o la señal de poliadenilacion del gen humano del Factor VII o el gen bovino del Factor VII. Los vectores de expresión también pueden incluir una secuencia líder, viral, no codificante, tal como el líder tripartita del adenovirus 2, localizado entre el promotor y los sitios de empalme de ARN; y las secuencias intensificadoras, tales como el intensificador SV40. Las secuencias de ADN clonadas son introducidas en células cultivadas de mamífero mediante, por ejemplo, la transfección medida por fosfato de calcio (Wigler y colaboradores, Cell 14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Gra am y Van der Eb, Virology 52d: 456-467, 1973) o la electroporación (Neumann y colaboradores, EMBO J. 1:841-845, 1982). Para identificar y seleccionar células que expresan el ADN exógeno, un gen que confiere un fenotipo seleccionable (un marcador seleccionable) es introducido generalmente en las células junto con el gen o ADNc de interés. Los marcadores seleccionables, preferidos incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, gromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable, amplificable. Un marcador seleccionable, amplificable, preferido es una secuencia de dihidrofolato-reductasa (DHFR) . Los marcadores seleccionables son revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporado en este texto a manera de referencia) . La persona experta en el campo será capaz de seleccionar fácilmente los marcadores seleccionables, adecuados.

Los marcadores seleccionables se pueden introducir en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o se pueden introducir en el mismo plásmido. Si, en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el gen de interés pueden estar bajo control de diferentes promotores o el mismo promotor, esta última disposición produce un mensaje dicistrónico . Las construcciones de este tipo son conocidas en el campo (por ejemplo, Levinson y Simonsen, patente norteamericana No. 4,713,339). También puede ser ventajoso agregar ADN adicional, conocido como "ADN portador", a la mezcla que es introducida en las células . Después de que las células han tomado el ADN, estas son desarrolladas en un medio de desarrollo apropiado, típicamente durante 1-2 días, para comenzar a expresar el gen de interés. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional que sea adecuado para el desarrollo de las células hospederas, tal como medios mínimos o complejos que contienen complementos apropiados . Los medios adecuados con disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo en catálogos de the American Type Culture Collection) . Los medios se preparan utilizando procedimientos conocidos en el campo (véase, por ejemplo, las referencias para bacterias y levadura; Bennett, J. W. y LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991) . Los medios de desarrollo incluyen generalmente una fuente de carbonoi, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azucares esenciales, vitaminas, sales, fosfolípidos, proteínas y factores de crecimiento. Para la producción de polipéptidos del Factor VII gamma-carboxilados, el medio contendrá la vitamina K, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml . La selección de fármacos entonces se aplica para seleccionar el desarrollo de las células que están expresando el marcador seleccionable en una forma estable. Para las células que han sido transfectadas con un marcador seleccionable, amplificable, la concentración de fármacos se puede incrementar para seleccionar un número de copias incrementado de las secuencias clonadas, incrementando con lo cual los niveles de expresión. Los clones de las células transfectadas de manera estable entonces se seleccionan para la expresión del polipéptido deseado del Factor VII . Las líneas de células de mamífero preferidas incluyen las líneas de células CHO (ATCC CCL 61) , COS-1 (ATCC CRL 1650), riñon de hámster bebe (BHK) y 293 (ATCC CRL 1573; Graham y colaboradores, J. Gen. Virol . 36:59-72, 1977). Una línea de células de BHK preferida es la línea de células de BHK tk-tsl3 (Waechter y Baserga, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 79:1106-1110, 1982), posteriormente referida como las células BHK 570. La línea de células BHK 570 es disponible de the American Type Culture Collection, 12301 Parkla n Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso de ATCC CRL 10314. Una linea de células de BHK tk-tsl3 también es disponible de ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, se puede utilizar una variedad de otras líneas de células, que incluyen Rat Hep I (hematoma de rata; ATCC CRL 1600) , Rat Hep II (hepatomade rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 77:4216-4220, 1980) . La tecnología de animales transgénicos se puede emplear para producir los polipéptidos del Factor VII de la invención. Se prefiere producir las proteínas dentro de las glándulas mamarias de un mamífero hembra, hospedera. La expresión en la glándula mamaria y la secreción subsecuente de la proteína de interés en la leche supera muchas dificultades encontradas en el aislamiento de proteínas de otras fuentes . La leche es colectada fácilmente, es disponible en grandes cantidades y está bien caracterizada bioquímicamente. Además, las proteínas principales de la leche están presentes en la leche en altas concentraciones (típicamente de aproximadamente 1 a 15 g/1) . Desde un punto de vista comercial, es claramente preferible utilizar como el hospedera una especie que tenga una gran producción de leche. Mientras que se pueden utilizar animales más pequeños, tales como ratones y ratas (y se prefieren en la prueba de la etapa en principio) , se prefiere utilizar mamíferos de ganado que incluyen, pero no están limitados a, cerdos, cabras, ovejas y ganado bovino. Las ovejas son particularmente preferidas debido a factores tales como la historia previa de transgénesis en esta especie, producción de leche, costo y fácil disponibilidad del equipo para colectar la leche de oveja (véase, por ejemplo, WO 88/00239 para una comparación de los factores que incluyen en la selección de las especies hospederas) . Es generalmente deseable seleccionar una raza de animal hospedera que haya sido criada para el uso lácteo, tal como las ovejas East Friesland, o para introducir la provisión de leche mediante la crianza de la línea transgénica en una fecha posterior. En cualquier caso, se deben utilizar animales con un buen estatus de salud conocido. Para obtener la expresión en la glándula mamaria, se utiliza un promotor de transcripción de un gen de proteína de la leche. Los genes de proteínas de la leche incluyen aquellos genes que codifican caseínas (véase la patente norteamericana No. 5,304,489), beta-lactoglobulina, una lactalbúmina y proteína ácida del suero de la leche. Se prefiere el promotor de la beta-lactoglobulina (BLG) . En el caso del gen de beta-lactoglobulina ovejuna, se utilizará generalmente una región de al menos los 406 pb próximos de la secuencia flanqueadora 5' del gen, aunque se prefieren porciones más grandes de la secuencia flangueadora 5', de hasta aproximadamente 5 kpb, tal como una secuencia de ADN de -4.25 kpb que comprende la secuencia flanqueadora 5' y una porción no codificante del gen de la beta-lactoglobulina (véase Whitelaw y colaboradores, Biochem. J. 286:3139 (1992)). También son adecuados los fragmentos similares del ADN promotor de otras especies. Otras regiones del gen de bet -lactoglobulina también se pueden incorporar en las construcciones, como pueden ser las regiones genómicas del gen a expresarse. Se acepta generalmente en el campo que las construcciones que carecen de intrones, por ejemplo, se expresan pobremente en comparación con aquellas que contienen estas secuencias de ADN (véase Brinster y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:836 840 (1988); Palmiter y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:478 482 (1991); Whitelaw y colaboradores, Transgenic Res. 1:3 13 (1991); WO 89/01343; y O 91/02318, cada una de las cuales se incorporan en este texto a manera de referencia) . En este respecto, se prefiere generalmente, donde sea posible, utilizar secuencias genómicas que contienen la totalidad o algunos de los intrones nativos de un gen que codifica la proteína o el polipéptido de interés, de esta manera, se prefiere la inclusión adicional de al menos algunos intrones del, por ejemplo, gen de beta-lactoglobulina. Una de estas regiones es un segmento de ADN que proporciona el empalme de intrones y la poliadenilación de ARN de la región no codificante 3' del gen de beta-lactoglobulina ovejuna. Cuando se sustituye por las secuencias no codificantes 3' naturales de un gen, este segmento de beta-lactoglobulina ovejuna puede tanto intensificar como estabilizar los niveles de expresión de la proteína o polipéptido de interés . Dentro de otras modalidades, la región que circunda la ATG de iniciación de la secuencia del Factor VII variante es reemplazada por secuencias correspondientes de un gen de proteína de la leche específico. Este reemplazo proporciona un ambiente de iniciación, putativo específico para el tejido para intensificar la expresión. Es conveniente reemplazar las secuencias pre-pro y no codificantes 5' del Factor VII variante, completo por aquellas de, por ejemplo, el gen de BLG, aunque se pueden reemplazar regiones más pequeñas. Para la expresión de los polipéptidos del Factor VII en animales transgénicos , un segmento de ADN que codifica el Factor VII variante es unido preferiblemente a segmentos de ADN adicionales que son requeridos por su expresión para producir unidades de expresión. Estos segmentos adicionales incluyen el promotor mencionado anteriormente, así como también secuencias que proporcionan la terminación de la transcripción y la poliadenilación del AENm. Las unidades de expresión incluirán adicionalmente un segmento de ADN que codifica una secuencia de señales secretorias unida de manera operable al segmento que codifica el Factor VII modificado. La secuencia de señales secretorias puede ser una secuencia de señales secretorias, nativa del Factor VII o puede ser aquella de otra proteína, tal como una proteína de la leche (véase, por ejemplo, von Heijne, Nucí. Acids Res. 14:4683 4690 (1986); y Meade y colaboradores, patente norteamericana No. 4,873,316, las cuales son incorporadas en este texto a manera de referencia) . La construcción de unidades de expresión para el uso en animales transgénicos se lleva a cabo convenientemente al insertar una secuencia del Factor VII variante en un vector de plásmidos o fagos que contiene los segmentos de ADN adicionales, aunque la unidad de expresión se puede construir por medio de esencialmente cualquier secuencia de ligaduras. Es particularmente conveniente proporcionar un vector que contiene un segmento de ADN que codifica una proteína de la leche y reemplazar la secuencia de codificación para la proteína de la leche por aquella de un polipéptido del Factor VII variante; creando con lo cual una fusión de genes que incluye las secuencias de control de expresión del gen de proteína de la leche. En cualquier caso, la clonación de las unidades de expresión en plásmidos u otros vectores facilita la amplificación de la secuencia del Factor VII variante. La amplificación se lleva a cabo convenientemente en células hospederas, bacterianas (por ejemplo E. coli) , de esta manera, los vectores incluirán típicamente un origen de replicación y un marcador seleccionable que es funcional en las células hospederas, bacterianas. La unidad de expresión entonces se introduce en huevos fertilizados (inclusive embriones en la primera etapa) de la especie hospedera, seleccionada. La introducción del ADN heterólogo se puede realizar por una de varias rutas, que incluyen la microinyección (por ejemplo la patente norteamericana No. 4,873,191), infección retroviral (Jaenisch, Science 240:1468 1474 (1988)) o la integración dirigida a un sitio utilizando células madre, embriónicas (ES, por sus siglas en inglés) (revisado por Bradley y colaboradores, Bio/Technology 10:534 539 (1992)). Los huevos entonces se implantan en los oviductos o úteros de hembras pseudopreñadas y se dejan desarrollar hasta la terminación. La descendencia que lleva el ADN introducido en su línea germinal puede pasar el ADN a su progenie en la forma Mendeliana normal, permitiendo el desarrollo de manadas transgénicas . Los procedimientos generales para producir animales transgénicos son conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Hogan y colaboradores, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons y colaboradores, Bio/Technology 6:179 183 (1988); Wall y colaboradores, Biol . Reprod. 32:645 651 (1985); Buhler y colaboradores, Bio/Technology 8:140 143 (1990) ; Ebert y colaboradores, Bio/Technology 9:835 838 (1991); Krimpenfort y colaboradores, Bio/Technology 9:844 847 (1991); Wall y colaboradores, J. Cell. Biochem. 49:113 120 (1992); patente norteamericana No. 4,873,191; patente norteamericana No. 4,873,316; WO 88/00239, O 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458) . Las técnicas para introducir secuencias de ADN extraño en mamíferos y sus células germen se desarrollaron originalmente en los ratones (véase, por ejemplo, Gordon y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:7380 7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science 214:1244 1246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell 41:343 345 (1985); Brinster y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:4438 4442 (1985); y Hogan y colaboradores, (ibid.)). Estas técnicas se adaptaron subsecuentemente para el uso con animales más grandes, inclusive especies de ganado (véase, por ejemplo, WO 88/00239, WO 90/05188, y WO 92/11757; y Simons y colaboradores, Bio/Technology 6:179 183 (1988)). En resumen, en la ruta más eficiente utilizada hasta la fecha en la generación de ratones o ganado transgénico, varios cientos de moléculas lineales del ADN de interés se inyectan dentro de uno de los núcleos pro de un huevo fertilizado de acuerdo con técnicas establecidas. La inyección de ADN en el citoplasma de un cigoto también se puede emplear. La producción en plantas transgénicas también se puede emplear. La expresión se puede generalizar o dirigir a un órgano particular, tal como un tubérculo (véase, Hiatt, Nature 344:469 479 (1990); Edelbaum y colaboradores, J.

Interferon Res. 12:449 453 (1992); Sijmons y colaboradores, Bio/Technology 8:217 221 (1990); y EP 0 255 378). Los polipéptidos del Factor VII de la invención se recuperan del medio de cultivo de células o la leche. Los polipéptidos del Factor VII de la presente invención se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en el campo que incluyen, pero no están limitados a, la cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfogue isoeléctrico, preparativo (IEF, por sus siglas en inglés) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio) , o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) . Preferiblemente, estos se pueden purificar mediante la cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos anti-Factor VI . El uso de anticuerpos monoclonales dependientes de calcio es descrito por Wakabayashi y colaboradores, J. Biol . Chem. 261: 11097-11108, (1986) y Thim y colaboradores, Biochemistry 27:7785-7793, (1988) . La purificación adicional se puede lograr por medios convencionales de purificación química, tales como la cromatografía líquida de alto desempeño. Otros métodos de purificación, que incluyen la precipitación de citrato de bario, son conocidos en el campo y se pueden aplicar a la purificación de los polipéptidos novedosos del Factor VII que se describen en este texto (véase, por ejemplo, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y., 1982) . Para propósitos terapéuticos, se prefiere que los polipéptidos del Factor VII de la invención estén sustancialmente puros. De esta manera, en una modalidad preferida de la invención, los polipéptidos del Factor VII de la invención se purifican a al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad, preferiblemente a al menos aproximadamente 98% de homogeneidad. La pureza se puede valorar mediante, por ejemplo, la electroforesis de gel y la secuenciación de aminoácidos amino-terminales . El polipéptido del Factor VII es escindido en su sitio de activación a fin de convertirlo a su forma de dos cadenas. La activación se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos conocidos en el campo, tales como aquellos descritos por Osterud, y colaboradores, Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, patente norteamericana No. 4,456,591; Hedner y isiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); o Kisiel y Fujikawa, Behring Inst. itt. 73:29-42 (1983). Alternativamente, como se describe por Bjoern y colaboradores, (Research Disclosure, 269 Septiembre de 1986, páginas 564-565) , el Factor VII se puede activar al pasarlo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q (Pharmacia fine Chemicals) o similares. El polipéptido del Factor VII activado, resultante entonces se puede formular y administrar como se describe posteriormente. Ensayos Ensayo de Hidrólisis In Vi tro El Factor Vlla de tipo silvestre (nativo) y la variante del Factor Vlla (ambos referidos posteriormente como el "Factor Vl a") se someten a ensayo en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas . El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtítulo (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) . El substrato cromogénico D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia) , concentración final 1 mM, se adiciona al Factor Vlla (concentración final 100 nM) en Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 , CaCl2 5 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbancia a 405 nm se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax*0 340 (Molecular Devices, EUA) . La absorbancia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la substracción de la absorbancia en un pocilio blanco que no contiene enzima, se utiliza para calcular la relación entre las actividades del Factor Vlla variante y de tipo silvestre: Relación = (Factor Vlla variante A405 nm) / (Factor Vlla de tipo silvestre A405 nm) . Ensayo de Proteólisis In Vitxo El Factor Vlla de tipo silvestre (nativo) y una variante del Factor Vlla (ambos referidos posteriormente como el "Factor Vlla") se someten a ensayo en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtítulo (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) . El Factor Vlla (10 nM) y el Factor X (0.8 microM) en 100 microL de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 M, CaCl2 5 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, se incuban durante 15 minutos. La escisión del Factor x entonces se detiene mediante la adición de 50 microL de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 M, EDTA 20 M y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad del Factor Xa generado se mide por medio de la adición del substrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia) , concentración final de 0.5 M. La absorbancia a 405 nm se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax" 340 (Molecular Devices, EUA) . La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la substracción de la absorbancia en un pocilio blanco que no contiene el FVIIa, se utiliza para calcular la relación entre las actividades proteolíticas del Factor Vlla variante y de tipo silvestre: Relación = (Factor Vlla variante A405 nm) / (Factor Vlla no tipo silvestre A405 nm) . Ensayo de velocidad de formación de GD-FVIIa La velocidad de formación de GD-FVIIa (FVIIa sin el dominio GLA, fragmento 39-406) se determina como el incremento en el contenido relativo de GD-FVIIa durante un periodo de tiempo dado. Se toman muestras dos veces de una solución del FVIIa de la cual se debe determinar la velocidad de formación de GD-FVIIa. Una muestra inicial y una después de la incubación en las circunstancias a investigarse (pH, concentración, temperatura, etcétera) . Inmediatamente después de que se toman las muestras, estas son hervidas con amortiguador de la muestra a fin de detener alguna degradación adicional durante el análisis . Las dos muestras se analizan mediante SDS-PAGE no reductora y el área de la banda de GD-FVIIa se mide con relación a FVIIa. El incremento en el contenido de GD-FVIIa durante la incubación en el tiempo entre las muestras iniciales y finales entonces se puede dividir por el tiempo de incubación para proporcionar la velocidad de formación de GD-FVIIa. La SDS-PAGE se realizó sobre muestras con una concentración aproximada del FVIIa de 1 mg/ml, las cuales se mezclaron con una cantidad igual de amortiguador de carga y se hirvieron durante cinco minutos . La muestra se transfirió a un pocilio de muestra en Bis-Tris NuPAGE al 12% en un amortiguador de conducción MOPS. Se aplicó un campo eléctrico hasta que el frente de la muestra había migrado al fondo del gel . El cásete de gel se separó, el gel se movió y se transfirió para la fijación, solución de coloración de coomassie y finalmente solución de decoloración antes de que el gel se secara. Una solución de 1.3 mg/ml del FVIIa en un amortiguador que consistía de CaCl2 125 micromolar, NaCl 75 mM, glicilclicina 10 mM, pH 8.6, tuvo un contenido inicial de GD-FVIIa de 10% después de la incubación durante 24 horas, el contenido de GD-FVIIa había incrementado a 70%. Por lo tanto, la velocidad de formación se determinó como 60% de GD-FVIIa/24 horas. Una muestra similar con una concentración de CaCl2 de 2.5 mM, exhibió un incremento en el contenido de GD-FVIIa de 6.6% a 8.2% durante 24 horas, produciendo una velocidad de formación de GD-FVIIa de 1.6% de GD-FVIIa/24 horas. La invención descrita y reivindicada en este texto no debe limitarse en su alcance por las modalidades específicas que se describen en este texto, puesto que estas modalidades se proponen como ilustraciones de los diversos aspectos de la invención. Se propone que cualquier modalidad equivalente se encuentre dentro del alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en este texto llegaran a ser aparentes para aquellas personas expertas en el campo a partir de la descripción anterior. También se propone que estas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, dominará la presente descripción que incluye las definiciones. La presente invención es descrita adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Formación del FVIla sin el dominio de GLA (GD-FV Ia) . La figura muestra la velocidad de formación de GD-FVIIa contra la relación molar del FVIla con Ca2+ (equivalentes de calcio = FVIla : Ca2+) . Las condiciones fueron: 1.3 mg/ml del FVIla, NaCl 75 inM, glicilglicina 10 mM, pH 8.5. EJEMPLOS En los siguientes ejemplos, se debe entender que el procedimiento se puede utilizar para cualquier polipéptido del FVII de acuerdo con la presente invención. Se entiende además que los pasos realizados en el ejemplo 2 al ejemplo 19 se pueden combinar en un orden arbitrario para obtener cierta pureza del polipéptido del FVII . Ejemplo 1 Estabilización de una recolección de cultivo de células mediante el ajuste a 200 micromolar de Cu2+ Una porción de 500 mi del sobrenadante del cultivo de células BH -21 con una concentración del análogo del FVIla de 20 mg/1 se pasó a través de un filtro de 0.45 mieras de extremo cerrado. La recolección que contenía una concentración de Ca2+ libre de 2 mM se esterilizó adicionalmente por la adición de una solución de nitrato de cobre (II) a una concentración de 200 micromolar de Cu+. El sobrenadante de cultivo estabilizado se almacenó a 5 grados Celsius antes del procesamiento adicional.

Ejemplo 2 Purificación del polipéptido del FVII mediante CIH en presencia de Cu2+ y elución bajo condiciones de pH bajo La cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) se realizó en una columna (1 cm de diámetro interior x 7 cm de longitud = 5.5 mi) empacada con resina Toyopearl MD-G Butyl^. La columna se equilibró con 10 VC's de CaCl2 35 mM, Cu(N03)2*3 ¾0 0.1 mM, NaCl 1.5 M, Tris 10 mM, pH 7.5. Después del equilibrio, se cargaron 42 mi de una solución que contenía 0.1 mg/ml del FVIIa sobre la columna. Después de la carga, la columna se lavó con 10 VC's del amortiguador de equilibrio. El FVII (a) unido se eluyó utilizando EDTA 20 mM, histidina 50 mM, pH 6.0. Ejemplo 3 Realización de la cromatografía de exclusión dé tamaño en presencia de Cu2+ La cromatografía de exclusión de tamaño se realizó en una muestra de 3 mi (1 mg/ml) de un análogo hiperactivo del FVIIa en una solución amortiguada con histidina a pH 6.0. La muestra se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 1 miera antes de que se aplicara sobre una columna Toyopearl HW-SSF101 (1 cm de diámetro interior x 100 cm de longitud = 79 mi de VC) equilibrada en un amortiguador compuesto de NaCl 50 mM, nitrato de cobre (II) 0.1 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. El amortiguador de conducción fue idéntico al amortiguador de equilibrio. Todos los segmentos de la purificación se llevaron a cabo a una velocidad de flujo de 12 cm/hora y una temperatura de 5 grados Celsius . Ejemplo 4 Estabilización de una recolección de cultivo de células mediante el ajuste a pH 6 Una porción de 500 mi del sobrenadante de cultivo de células CHO Kl con una concentración del análogo del FVlla de 50 mg/1 se estabilizó al adicionar histidina a una concentración de 20 M seguido por el ajuste del pH a 6.0. El sobrenadante de cultivo estabilizado se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras y se almacenó a 5 grados Celsius antes del procesamiento adicional . Ejemplo 5 Realización de la cromatografía de intercambio aniónico a pH 6 La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (1 cm de diámetro interior x 10 cm de longitud = 7.85 mi de volumen de la columna (VC) ) empacada con Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow1®, equilibrada con 5 VC's de una solución que contenía EDTA 5 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. La carga fue de 40 VC's de una solución filtrada que contenía 1 mg/ml de análogo del FVlla, seguido por un lavado de 5 VC's utilizando NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. La elución se realizó utilizando un gradiente de 40 VC's de NaCl a partir de NaCl 50 mM a NaCl 750 mM, amortiguado a pH 6.0 por histidina 10 mM. La purificación completa se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 20 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius . Ejemplo 6 Realización de la cromatografía de intercambio aniónico a pH 9 La cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna (1 cm de diámetro interior x 10 cm de longitud = 7.85 mi de volumen de la columna (VC) ) empacada con Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow, equilibrada con 5 VC's de una solución que contenía EDTA 5 mM, histidina 10 mM, pH 9.0. La carga fue de 40 VC's de una solución filtrada que contenía 1 mg/ml de análogo del FVIIa, seguido por un lavado de 5 VC's utilizando NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 9.0. La elución se realizó utilizando un gradiente de 40 VC's de NaCl a partir de NaCl 50 mM a NaCl 750 mM, amortiguado a pH 9.0 por histidina 10 mM. La purificación completa se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 20 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius . Ejemplo 7 Realización de la cromatografía de exclusión de tamaño a pH 6 La cromatografía de exclusión de tamaño se realizó en una muestra de 1.5 mi (1 mg/ml) de un análogo hiperactivo del FVIIa en una solución amortiguada por histidina a pH 6.0. La muestra se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras antes de que se aplicara sobre una columna Pharmacia superdex 200 (1 cm de diámetro interior x 60 cm de longitud = 47 mi de VC) equilibrada en un amortiguador compuesto de NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. El amortiguador de conducción fue idéntico al amortiguador de equilibrio. Todos los segmentos de la purificación se llevaron a cabo a una velocidad de flujo de 0.3 VC/hr y una temperatura de 5 grados Celsius . Ejemplo 8 Realización de la cromatografía de exclusión de tamaño a pH 9 La cromatografía de exclusión de tamaño se realizó en una muestra de 1.5 mi (1 mg/ml) de un análogo hiperactivo del FVIIa en una solución amortiguada por histidina a pH 9.0. La muestra se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras antes de que se aplicara sobre una columna Pharmacia superdex 200MR (1 cm de diámetro interior x 60 cm de longitud = 47 mi de VC) equilibrada en un amortiguador compuesto de NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 9.0. El amortiguador de conducción fue idéntico al amortiguador de equilibrio. Todos los segmentos de la purificación se llevaron a cabo a una velocidad de flujo de 0.3 VC/hr y una temperatura de 5 grados Celsius . Ejemplo 9 Realización de la ultrafiltración a pH 6 La ultrafiltración del sobrenadante de cultivo HE 293 que contenía un análogo hiperactivo del FVIIa se llevó a cabo en un sistema de Filtración de Flujo Tangencial a escala de laboratorio Millipore11 (TFF, por sus siglas inglés) utilizando un cásete de filtración Biomax de 30kDa de 50 cm2. La recolección filtrada en extremo cerrado se estabilizó al adicionar histidina a una concentración de 20 mM y mediante el ajuste del pH a 6.0. 500 gramo de la recolección filtrada con extremo cerrado y estabilizada se ultrafiltraron a una presión trans-membrana (TMP, por sus siglas en inglés) de 2 bares hasta que se logró una masa retenida, final de aproximadamente 25 g, la cual es igual a 20 veces la concentración del análogo hiperactivo del FVIIa. El procedimiento completo tomó lugar a temperatura ambiente (20 grados Celsius) . Ejemplo 10 Realización de la purificación por inmunoafinidad a pH 6 Una porción de 1500 mi del sobrenadante de cultivo HE 293 se estabilizó mediante la adición de calcio a una concentración de 10 mM de Ca2+ y mediante la adición de amortiguador de histidina a una concentración de 10 mM, ajustado con HC1 a pH 6.0 y pasado a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras. El sobrenadante de cultivo estabilizado se cargó sobre una columna (1.6 cm de diámetro interior x 10 cm de longitud = 20 mi de VC) empacada con un anticuerpo monoclonal anti-FVIIa dependiente de Ca2+, inmovilizado en Pharmacia Sepharose 4BMR. Antes de la carga, la columna se equilibró con 5 VC's de CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, H 6.0. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 2 M, CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 6.0 para 10 VC's. El FVII (a) unido se eluyó con 10 VC's de EDTA 30 mM, histidina 50 mM, pH 6.0. Una velocidad de flujo de 12 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius se utilizaron por toda la purificación. Ejemplo 11 Realización de la purificación por inmunoafinidad a pH 9. Una porción de 1500 mi del sobrenadante de cultivo HEK293 se estabilizó mediante la adición de calcio a una concentración de 10 mM de Ca2+ y mediante la adición de amortiguador de histidina a una concentración de 10 mM, ajustado con HC1 a pH 9.0 y pasado a través de un filtro de extremo cerrado de 0. 5 mieras . El sobrenadante de cultivo estabilizado se cargó sobre una columna (1.6 cm de diámetro interior x 10 cm de longitud ¦ = 20 mi de VC) empacada con un anticuerpo monoclonal anti-FVIIa dependiente de Ca2+, inmovilizado en Pharmacia Sepharose 4BMR. Antes de la carga, la columna se equilibró con 5 VC's de CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 9.0. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 2 M, CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 9.0 para 10 VC's. El FVII (a) unido se eluyó con 10 VC's de EDTA 30 M, histidina 50 mM, pH 9.0. Una velocidad de flujo de 12 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius se utilizaron por toda la purificación.

Ejemplo 12 Estabilización de una recolección de cultivo de células mediante el ajuste de la concentración de Ca2+ a 10 mM Una porción de 450 mi del sobrenadante de cultivo de células HEK293 que contenía una concentración del análogo del FVIla de 50 mg/ml y una concentración de iones de calcio de aproximadamente 2 mM se estabilizó por la adición de una solución de CaCl2 a una concentración final de 10 mM de Ca2+. La solución se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras y se almacenó a 5 grados Celsius antes del procesamiento adicional. Ejemplo 13 Realización de la ultra- y diafiltración en presencia de Ca2+ 20 mM La ultrafiltración de un análogo hiperactivo del FVIla se llevó a cabo en un sistema de Filtración de Flujo Tangencial a escala de laboratorio Millipore™1 (TFF) utilizando un cásete de filtración Biomax1"1 de 30 kDa de 50 cm2. El eluato del análogo del FVIla se estabilizó al adicionar una solución de calcio a una concentración de 20 mM de Ca2+, histidina a una concentración de 10 mM y el ajuste del pH a 6.0. 400 gramos del análogo estabilizado del FVIla se ultra-filtraron a una presión trans-membrana (TMP) de 2 bares hasta que se logró una masa retenida, final de aproximadamente 25 g, la cual es igual a 16 veces la concentración. La ultrafiltración fue seguida por una diafiltración por rotación de tres volúmenes con un amortiguador de CaCl220 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. La misma TMP se utilizó para ambas operaciones. El procedimiento completo tomó lugar a temperatura ambiente (20 grados Celsius) . Ejemplo 14 Realización de la purificación por inmunoafinidad en presencia de Ca2+ 20 mM Una porción de 1000 mi del sobrenadante de cultivo de BHK-21, estabilizado por la adición de calcio a una concentración de 10 mM de Ca2+ y por la adición de amortiguador de Tris a una concentración de 10 mM y el ajuste subsecuente con HC1 a pH 8 se filtró a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras. El sobrenadante de cultivo estabilizado se cargó sobre una columna (1.6 cm de diámetro interior x 10 cm de longitud = 20 mi de VC) empacada con un anticuerpo monoclonal anti-FVIIa dependiente de Ca2+, inmovilizado en Pharmacia Sepharose é m. Antes de la carga, la columna se equilibró con 5 VC's de CaCl2 10 mM, Tris 10 mM, pH 8. Después de la carga, la columna se lavó con NaCl 2M, CaCl2 10 mM, Tris 10 mM, pH 8 para 10 VC's. El FVII(a) unido se eluyó con 10 VC's de EDTA 30 mM, Tris 50 mM, pH 8. Una velocidad de flujo de 12 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius se utilizaron por toda la purificación. El eluato se estabilizó inmediatamente por la adición de cloruro de calcio a una concentración final de 50 mM. Ejemplo 15 Realización de la purificación por initiunoafinidad con carga y lavado en presencia de Ca2+ 20 mM seguido por la elución a pH 6 Una porción de 800 mi de sobrenadante de cultivo CHO Kl se estabilizó por la adición de calcio a una concentración de Ca2+ 10 mM. Posteriormente, se adicionó amortiguador de Tris a una concentración de 10 mM, se ajustó con HCl a pH 7.5 y se filtró a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras. El sobrenadante de cultivo estabilizado se cargó sobre una columna (1.6 cm de diámetro interior x 2 cm de longitud = 4 mi de VC) empacada con un anticuerpo monoclonal anti-FVIIa dependiente de Ca2+, inmovilizado en Pharmacia Sepharose 4BMR. Antes de la carga, la columna se equilibró con 5 VC's de C Cl2 10 mM, Tris 10 mM, pH 7.5. Después de la carga, la columna se lavó' con NaCl 2M, CaCl2 10 mM, Tris 10 mM, pH 7.5 para 10 VC's, seguido por un segundo lavado que contenía NaCl 2 M, CaCl2 10 mM, histidina 10 mM, pH 6.0 para 10 VC's. El FVII(a) unido se eluyó con 10 VC's de EDTA 30 mM, histidina 50 mM, pH 6.0. Una velocidad de flujo de 12 VC/h y una temperatura de 5 grados Celsius se utilizaron por toda la purificación. E emplo 16 Realización de la cromatografía de exclusión de tamaño en presencia de Ca2+ La cromatografía de exclusión de tamaño se realizó en una muestra de 5 mi (1 mg/ml) de un análogo hiperactivo del FVlla en una solución amortiguada con histidina, pH 6.0. La muestra se filtró a través de un filtro de extremo cerrado de 1 miera antes de que se aplicara sobre una columna Pharmacia Superdex 200m (1 cm de diámetro interior x 80 cm de longitud = 63 mi de VC) equilibrada en un amortiguador compuesto de NaCl 50 mM, CaCl2 35 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. El amortiguador de conducción fue idéntico al amortiguador de equilibrio. Todos los segmentos de la purificación se llevaron a cabo a una velocidad de flujo de 15 cm/hr y una temperatura de 5 grados Celsius. Ejemplo 17 Realización de la ultrafiltración y la diafiltración a pH 6 con una alta concentración de Ca2+ La ultrafiltración del sobrenadante del cultivo HEK2.93 que contenía un análogo hiperactivo del FVIIa se llevó a cabo en un sistema de Filtración de Flujo Tangencial a escala de laboratorio Millipore101 (TFF) utilizando un c sete de filtración Biomax*111 de 30 kDa de 50 cm2. La recolección filtrada con extremo cerrado se estabilizó por la adición de histidina a una concentración de 20 mM y el ajuste del pH a 6.0. 500 gramos de la recolección filtrada con extremo cerrado y estabilizada, se adicionó calcio a una concentración de 35 mM y se ultrafiltraron a una presión trans-membrana (TMP) de 2 bares hasta que se logró una masa retenida, final de aproximadamente 25 g, la cual es igual a 20 veces la concentración del análogo hiperactivo del FVlla. La ultrafiltración fue seguida por una diafiltración por rotación de tres volúmenes con un amortiguador de CaCl2 35 mM, histidina 10 mM, pH 6.0. La misma TMP se utilizó para ambas operaciones . El procedimiento completo tomó lugar a temperatura ambiente (20 grados Celsius) . E emplo 18 Estabilización de recolecciones utilizando tanto ajuste a pH 6 como adición de Cu2+ Una porción de 500 mi de sobrenadante de cultivo de células CHO-Kl con una concentración del análogo del FVlla de 50 mg/1 se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras. A la recolección que contenía Ca+2 2 mM se adicionó histidina a una concentración de 10 mM seguido por ajuste del pH con HCl a pH 6.0. La recolección se estabilizó adicionalmente por la adición de una solución de nitrato de cobre (II) a una concentración de 200 micromolar de Cu2+. El sobrenadante de cultivo estabilizado se almacenó a 5 grados Celsius antes del procesamiento adicional. Ejemplo 19 Estabilización de recolecciones utilizando tanto ajuste a pH 6 como adición de Ca2+ Una porción de 1000 mi de sobrenadante de cultivo de células HEK293 que contenía una concentración del análogo del FVIIa de 50 irtg/ml y una concentración de iones de calcio de aproximadamente 2 M se estabilizó por la adición de una solución de CaCl2 a una concentración final de 10 iriM de Ca2+. Se adicionó histidina a una concentración de 10 mM seguido por ajuste del pH con HCl a pH 6.0. La solución se pasó a través de un filtro de extremo cerrado de 0.45 mieras y se almacenó a 5 grados Celsius antes del procesamiento adicional. Ejemplo 20 El efecto de Cu2+ sobre la estabilidad del polipéptido del FVII se sometió a prueba en un experimento en el cual el polipéptido purificado del FVII es adsorbido en una matriz de Q-Sepharose FFm en presencia de concentraciones variantes de Cu2+. 500 g del polipéptido del FVII se incuban con 50 µ? de Q-Sepharose FFm en 800 µ? de amortiguador: Tris 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 2 mM y concentraciones variantes de nitrato de cobre (II) en tubos de ensayo de 1.5 mi. Después de 1 hora y 2 horas, la matriz se asienta por centrifugación y el sobrenadante se remueve. Se adicionan 800 µ? de amortiguador de Tris 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 25 M pH 8.0 y, después del mezclado y la centrifugación, las muestras del sobrenadante se retiran y se analizan mediante la SDS-PAGE. Ejemplo 21 La purificación y la activación del polipéptido del FVII se realizaron a través de los siguientes cuatro pasos cromatográficos : Paso 1: El polipéptido del FVII que contiene el medio de cultivo de células se ajusta a una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm mediante la dilución y se aplica a una columna Q-Sepharose^ equilibrada previamente con el amortiguador A: trihidroximetilaminometano 10 M (Tris); NaCl 50 mM, pH 8. Después de un paso de lavado con NaCl 175 mM en el mismo amortiguador, el polipéptido del FVII es eluido por el amortiguador B: Tris 10 mM; NaCl 150 mM; CaCl2 25 mM, pH 8. Paso 2: La solución del eluato que contiene 104 mg/1 de polipéptido del FVII se ajusta a una composición final: Tris 10 mM; NaCl 1 M; CaCl2 25 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5 y se aplica a una columna Sepharóse1™* con un anticuerpo monoclonal anti-FVII inmovilizado. La columna del anticuerpo es equilibrada previamente con el amortiguador C: Tris 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. La columna entonces se lava con Tris 10 mM; NaCl 2 M; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5, seguido por el amortiguador C. Después, el polipéptido del FVII es eluido por la aplicación de un amortiguador: Tris 75 mM; citrato trisódico 30 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. Paso 3 : El eluato se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose equilibrada previamente con el amortiguador: Tris 10 mM; NaCl 50 mM; "nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. La columna se lava con el mismo amortiguador y el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal del amortiguador A al amortiguador D: Tris 10 mM; NaCl 500 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. Paso 4: La fracción que contiene el polipéptido del FVII se ajusta a una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm por la dilución y se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose^ equilibrada previamente con amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 150 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. Después del lavado con amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 175 mM; nitrato de cobre (II) 70 UM, pH 8.6; y el amortiguador E: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM; nitrato de cobre (II) 70 UM, pH 8.6 , el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal del amortiguador E al amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 15 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. La velocidad de flujo es 1 volume /hr . Ejemplo 22 La purificación y la activación del polipéptido del FVII se realizan a través de los siguientes cuatro pasos cromatográficos : Paso 1 : El polipeptido del FVII que contiene el medio de cultivo de células se ajusta a una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm mediante la dilución y se aplica a una columna Q-Sepharose1^ equilibrada previamente con el amortiguador A: trihidroximetilaminometano 10 mM (Tris); NaCl 150 niM, pH 8. Después de un paso de lavado con NaCl 175 mM en el mismo amortiguador, el polipéptido del FVII es eluido por el amortiguador B: Tris 10 mM; NaCl 150 mM; CaCl2 25 mM, pH 8. Paso 2: La solución del eluato que contiene 104 mg/1 de polipéptido del FVII se ajusta a una concentración final: Tris 10 mM; NaCl 1 M; CaCl2 25 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5 y se aplica a una columna Sepharose™ con un anticuerpo monoclonal anti-FVII inmovilizado. La columna del anticuerpo es equilibrada previamente con el amortiguador C: Tris 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. La columna entonces se lava con Tris 10 mM; NaCl 2 M; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5, seguido por el amortiguador C. Después, el polipéptido del FVII es eluido por la aplicación de un amortiguador: Tris 75 mM; citrato trisódico 30 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. Paso 3 : El eluato se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose equilibrada previamente con el amortiguador: Tris 10 inM; NaCl 50 m ; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. La columna se lava con el mismo amortiguador y el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal de amortiguador A al amortiguador D: Tris 10 mM; NaCl 500 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 8.6. Paso 4: La fracción que contenía el polipéptido del FVII se ajusta con ácido etilendiaminotetraacético 2 mM (EDTA) y una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm por la dilución y se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose1111 equilibrada previamente con el amortiguador: glicilglicina 10 M; NaCl 150 mM, pH 8.6. Después del lavado con amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 175 mM, pH 8.6 y el amortiguador E: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM, pH 8.6, el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal del amortiguador E al amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 15 mM, pH 8.6. La velocidad de flujo es 1 volumen/hr. Ejemplo 23 La purificación y la activación del polipéptido del FVII se realizan a través de los siguientes cuatro pasos cromatográficos : Paso 1: El polipéptido del FVII que contiene el medio de cultivo de células se ajusta a una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm mediante la dilución y se aplica a una columna Q-Sepharose™1 equilibrada previamente con el amortiguador A: trihidroximetilaminometano 10 mM (Tris); NaCl 150 mM, pH 8. Después de un paso de lavado con NaCl 175 mM en el mismo amortiguador, el polipéptido del FVII es eluido por el amortiguador B: Tris 10 mM; NaCl 150 mM; CaCl2 25 mM, pH 8. Paso 2 : La solución del eluato que contiene 104 mg/1 de polipéptido del FVII se ajusta a una concentración final: Tris 10 mM; NaCl 1 M; CaCl2 25 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5 y se aplica a una columna Sepharose1"1 con un anticuerpo monoclonal anti-FVII inmovilizado. La columna del anticuerpo es equilibrada previamente con el amortiguador C: Tris 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. La columna entonces se lava con Tris 10 mM; NaCl 2 M; CaCl2 20 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5, seguido por el amortiguador C. Después, el polipéptido del FVII es eluido por la aplicación de un amortiguador: Tris 75 mM; citrato trisódico 30 mM; nitrato de cobre (II) 70 µ?, pH 7.5. Paso 3 : El eluato se ajusta con EDTA 2 mM y se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose1111 equilibrada previamente con el amortiguador: Tris 10 mM; NaCl 150 mM, pH 8.6. La columna se lava con el mismo amortiguador y el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal del amortiguador A al amortiguador D: Tris 10 mM; NaCl 500 M, pH 8.6. Paso 4: La fracción que contiene el polipéptido del FVII se ajusta a una intensidad iónica inferior a 10 mS/cm por la dilución y se aplica inmediatamente a una columna Q-Sepharose"11 equilibrada previamente con amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 50 mM, pH 8.6. Después del lavado con amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 175 mM, pH 8.6. y el amortiguador E: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM, pH 8.6, el polipéptido del FVII es eluido en un gradiente lineal del amortiguador E al amortiguador: glicilglicina 10 mM; NaCl 100 mM; CaCl2 15 mM, pH 8.6. La velocidad de flujo es 1 volumen/hr. Ejemplo 24 Ultra- y diafiltración de los polipéptidos del Factor VII. 130 litros del sobrenadante de cultivo de células CHO que contenía el polipéptido del Factor VII se recolectaron. La recolección se estabilizó por la adición de histidina a 10 mM, se ajustó a pH 6.0 y se adicionó CaCl2 1 mM. El sobrenadante se filtró en un tren de filtro que comprendía filtros Millipore clarigard141 de 3.0 µp?, 1.0 µ?a y 0.3 µ??. El sobrenadante clarificado se ultrafiltró a través de 0.2 m2 de una membrana Millipore Biomax 50m hasta una reducción de volumen lOx. La ultrafiltración se llevó a cabo utilizando un punto de regulación de TMP de 2.245 kg/cm2 (32 psi) y un punto de regulación de flujo transversal de 600 mi/minuto. Después de alcanzar el volumen retenido, deseado, se hicieron 3 rotaciones de volumen de la diafiltración. El amortiguador de la diafiltración consistió de histidina 5 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 1 mM, 0.07 g/1 de Tween 80^, H 6.0. Ultra- y diafiltración de wt-FVIIa 100 litros del sobrenadante de cultivo de células CHO que contenía el FVHa humano de tipo silvestre se recolectan y se estabilizan por la adición de histidina a una concentración de 10 mM, se ajusta a pH 6.0 y se adiciona CaCl2 1 mM. El sobrenadante se filtra y se ultrafiltra a través de 0.2 m2 de una membrana Millipore Biomax 50" hasta una reducción de volumen lOx. Cuando se alcanza el volumen retenido, deseado, se realizan 3 rotaciones de volumen de la diafiltración. El amortiguador de la diafiltración consiste de histidina 5 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 1 mM, 0.07 g/1 de Tween 80m, pH 6.0. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para la producción de una serina proteasa que contiene residuos de GLA purificada, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: (i) cultivar una célula hospedera que expresa la serina proteasa que contiene residuos de GLA en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas para la expresión de la serina proteasa que contiene residuos de GLA; (ii) recuperar la totalidad o parte del medio de cultivo que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA; y (iii) purificar la serina proteasa que contiene residuos de GLA del medio de cultivo; en donde el pH conforme al paso (iii) tiene un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.2 m . 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal. como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es menor que 0.10 mM. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio conforme al paso (iii) es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iíi) es mayor que 0.025 mM. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Sm2+, Ni2+, Cd2+, Hg2+, Sm2+ y Uo2+. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y n2+. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio conforme al paso (iii) es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mM, tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) en presencia de un quelante adicional de iones de metales di alentes . 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 4.5 y 6.9. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el pH está entre 4.7 y 6.8, tal como entre 4.9 y 6.7, tal como entre 5.1 y 6.6, tal como entre 5.3 y 6.5, tal como entre 5.5 y 6.4, tal como entre 5.7 y 6.3, tal como entre 5.8 y 6.2, tal como entre 5.9 y 6.1, tal como aproximadamente 6.0. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 8.6 y 10. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el pH está entre 8.7 y 9.9, tal como entre 8.8 y 9.8, tal como entre 8.9 y 9.7, tal como entre 9.0 y 9.6, tal como entre 9.1 y 9.5, tal como entre 8.7 y 9.8, tal como entre 8.7 y 9.7, tal como entre 8.7 y 9.6, tal como entre 8.8 y 9.5, tal como entre 8.9 y 9.4, tal como entre 9.0 y 9.2, tal como aproximadamente 9.2. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica en presencia de histidina. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque la célula hospedera es una célula hospedera eucariótica. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula hospedera eucariótica es una célula de mamífero. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17 , caracterizado porque la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células HEK, células BHK, células CHO, células COS y células de mieloma, tales como SP2-0. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipeptido del Factor IX. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor VII. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano de tipo silvestre. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII tiene una actividad proteolítica mayor que el FVIIa humano de tipo silvestre. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII es un polipéptido relacionado con el Factor VII seleccionado del grupo que consiste de: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/ 298Q-FVII , V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVI , L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, V158D/E296V/ 298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII , V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337 -FVII , L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/ 298Q-FVII , L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII , L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII , L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII , L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII , L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/ 298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, L305V/V158D/ 337A/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M2 8Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII , S314E/ 316Q-FVII, S314E/L305V-FVII , S314E/K337A-FVII , S314E/VI58D-FVII, S314E/E296V-FVII , S314E/M298Q-FVII , S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII , K316H/K337A-FVII , K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII , 316H/ 298Q-FVII , K316H/V158T-FVII, 316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII , K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/ 337A/E296V-FVII, S314E/L305V/ 337A/V158D-FVII , S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V-FVII , S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/ 337A/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII , K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, 316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII , K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, 316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, 316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, 316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, 316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, 316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII , ?316Q/L305V/V158?/?296V/M298Q-FVII , K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII , F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII , F374Y/L305V/ 298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII , F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII , F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII , F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII , F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/ 337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII , F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII , F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/ 337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F37 Y/V158 /M298Q/E296V-FVII , F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII , F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII , F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/ 298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158 /M298Q/?337A-FVII , F374Y/L305V/V158?/?296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII , F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/ 337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; Rl52E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor Vlla que carece del domino Gla; y P11Q/ 33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII , G291N-FVII, R315N/V317T-FVII , K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys. 24. Un método para la purificación de una serina proteasa que contiene residuos de GLA, caracterizado porque una solución de una serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a una variedad de pasos de purificación, caracterizado porque el pH en al menos uno de los pasos de purificación tiene un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es mayor que 1.2 mM. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal como mayor que 1.6 mM, ' tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que .0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es menor que 0.10 mM. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de g2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Sm2+, Ni2+, Cd+, Hg2+, Sm2+ y Uo +. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y Mn2+. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-31, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio al menos en uno de los pasos de purificación es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mM, tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 niM, tal como mayor que 0.1. mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-32, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica al menos en uno de los pasos de purificación en presencia de un quelante adicional de iones de metales di alentes . 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-33, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 4.5 y 6.9. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el pH está entre 4.7 y 6.8, tal como entre 4.9 y 6.7, tal como entre 5.1 y 6.6, tal como entre 5.3 y 6.5, tal como entre 5.5 y 6.4, tal como entre 5.7 y 6.3, tal como entre 5.8 y 6.2, tal como entre 5.9 y 6.1, tal como aproximadamente 6.0. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-33, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 8.6 y 10. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el pH está entre 8.7 y 9.9, tal como entre 8.8 y 9.8, tal como entre 8.9 y 9.7, tal como entre 9.0 y 9.6, tal como entre 9.1 y 9.5, tal como entre 8.7 y 9.8, tal como entre 8.7 y 9.7, tal como entre 8.7 y 9.6, tal como entre 8.8 y 9.5, tal como entre 8.9 y 9.4, tal como entré 9.0 y 9.2, tal como aproximadamente 9.2. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica al menos en uno de los pasos de purificación en presencia de histidina. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-38, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor IX. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-38, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor VII. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano de tipo silvestre. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII tiene una actividad proteolítica mayor que el FVIIa humano de tipo silvestre . 43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII es un polipéptido relacionado con el Factor VII seleccionado del grupo que consiste de: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVI , V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ 337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, 157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII , V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII , L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII , L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/ 298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII , L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/ 298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII , L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/ 298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVI , L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII , S314E/K316Q-FVTI, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/VI58D-FVII, S314E/E296V-FVII , S314E/ 2 8Q-FVII , S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII , K316H/K337A-FVII , K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII , K316H/M298Q-FVII , K316H/V158T-FVII, 316Q/L305V-FVII , K316Q/K337A-FVII , 316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII , 316Q/ 2 8Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FV1I, S314E/L305V/V158D FVII , S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T-FVII , S314E/L305V/ 337A/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII , S314E/L305V/K337?/?296V-FVII , S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314É/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158 /?296V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D/ 337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/ 337A FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, 316H/L305V/E296V-FVII , ?316H/L305V/M298Q-FVII , ?316H/L305V/V158T-FVII , ?316H/L305V/K337A/VI58T-FVII , 316H/L305V/?337?/?298Q-FVII , 316H/L305V/K337A/E296V-FVII, 316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, ?316H/L305V/V158?/?337?/?298Q-FVII , K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, 316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII , 316H/L3 O5V/V158D/E296V/ 337A-FVII , 316H/L3 O5V/V158D/?296V/M298Q/?337A-FVII , ?316H/L3 O5V/V158 /?296V/M298Q/?337A-FVII , ?316Q/L3O5V/K337A FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII , K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, ?316Q/L305V/K337A/V158T-FVII , ?316Q/L305V/K337?/?298Q-FVII , ?316Q/L305V/K337?/?296V-FVII , ?316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, 316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q FVII, K316Q/L305V/V158T/E295V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, ?316Q/L305V/VI58D/?337?/?298Q-FVII , ?316Q/L305V/V158D/E296V/ 337A-FVII , K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F3 Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII , F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII , F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII , F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/VI58T-FVII , F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII , F374Y/V158D/S314E-FVII , F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII , F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII , F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/ 298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII , F374Y/L305V/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/ 298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M2 8Q-FVII , F374Y/K33 A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F37 Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/ 337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/ 298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/ 298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII , F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/ 298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/ 298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158?/?296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/ 298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ 298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor Vlla que carece del domino Gla; y P11Q/ 33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII , V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317 -FVII, 143N/N145T/R315N/V317T-FVII; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys. 44. Un método para estabilizar una serina proteasa que contiene residuos de GLA en una solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA, caracterizado porque la solución que comprende la serina proteasa que contiene residuos de GLA se sujeta a los pasos que consisten en adicionar calcio para obtener una concentración libre de iones de calcio mayor que 1.2 mM o menor que 0.10 mM; y/o adicionar un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio para obtener la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio mayor que 0.025 mM; y/o ajustar el pH de la solución que comprende una serina proteasa que contiene residuos de GLA a un valor entre 4.5 y 6.9 o a un valor entre 8.6 y 10. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor que 1.2 mM. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. 47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.10 mM. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. 49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-48, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49 , caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Sm2+, Ni2+, Cd+, Hg+, Sm2+ y Uo2+. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+ y Mn2+. 52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-51, caracterizado porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mM, tal como mayor que 0.04 M, tal como mayor que 0.045 mM, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor -que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. 53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-52, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es estabilizada en presencia de un quelante adicional de iones de metales di alentes . 54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-53 caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 4.5 y 6.9. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el pH está entre 4.7 y 6.8, tal como entre 4.9 y 6.7, tal como entre 5.1 y 6.6, tal como entre 5.3 y 6.5, tal como entre 5.5 y 6.4, tal como entre 5.7 y 6.3, tal como entre 5.8 y 6.2, tal como entre 5.9 y 6.1, tal como aproximadamente 6.0. 56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-53, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 8.6 y 10. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el pH está entre 8.7 y 9.9, tal como entre 8.8 y 9.8, tal como entre 8.9 y 9.7, tal como entre 9.0 y 9.6, tal como entre 9.1 y 9.5, tal como entre 8.7 y 9.8, tal como entre 8.7 y 9.7, tal como entre 8.7 y 9.6, tal como entre 8.8 y 9.5 , tal como entre 8.9 y 9.4, tal como entre 9.0 y 9.2, tal como aproximadamente 9.2. 58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es estabilizada en presencia de histidina. 59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-58, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor ix. 60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-58, caracterizado porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor VII . 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII es el Factor Vil humano de tipo silvestre. 62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el polipéptido del Factor VII tiene una actividad proteolítica mayor que el FVI a humano de tipo silvestre. 63. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el polipéptido del factor VII es un polipéptido relacionado con el factor VII seleccionado del grupo que consiste de: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/ 298Q-FVII , V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII , V158D/E296V-FV I, V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII , L305V/M298Q-FVII , L305V/V158T-FVII, L305V/ 337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII , L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII , L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII , L305V/E296V/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII , L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E2 6V/ 298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII , S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII , S314E/K337A-FVII , S314E/VI58D-FVII, S314E/E296V-FVII , S314E/M298Q-FVII , S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, 316H/K337A-FVII , K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII , K316H/M298Q-FVII , K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII , K316Q/K337A-FVII , K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII , K316Q/M298Q-FVII , K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/ 337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/ 298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A FVII, 316H/L305V/V158D-FVII, 316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, 316H/L305V/K337A/ 298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V~FVII, 316H/L305V/K337A/V158D-FVII , K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V/M298Q FVII , ?316H/L305V/V158?/?296V/M298Q-FVII , K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, K316Q/L305V/K337A FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII , K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, 316Q/L305V/K337?/?296V-FVII , ?316Q/L305V/K337A/V158D-FVII , K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E2 6V-FVII , K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/ 298Q-FVII, 316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, ?316Q/L305V/V158D/K337?/?298Q-FVII , K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, 316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII , K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII , F37 Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII , F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D-FVII , F374Y/L305V/E296V-FVII , F374Y/L305V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII , F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/ 337A/V158T-FVII , F374Y/K337?/?298Q-FVII , F37 ?/?337?/?296 -FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII , F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII , F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/ 298Q-FVII , F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/ 337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/ 337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII , F374Y/E296V/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, . F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor Vlla gue carece del domino Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; y FVII gue tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FVII gue tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys. 64. Una composición, caracterizada porgue comprende una serina proteasa gue contiene residuos de GLA en una solución con un pH en un valor entre 4.5 y 6.9 o tiene un valor entre 8.6 y 10. 65. La composición de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porgue la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor gue 1.2 mM. 66. La composición de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porgue la concentración libre de iones de calcio obtenida es mayor que 1.3 mM, tal como mayor que 1.4 mM, tal como mayor que 1.5 mM, tal como mayor que 1.6 mM, tal como mayor que 1.7 mM, tal como mayor que 1.8 mM, tal como mayor que 1.9 mM, tal como mayor que 2.0 mM, tal como mayor que 2.1 mM, tal como mayor que 2.2 mM, tal como mayor que 2.3 mM, tal como mayor que 2.4 mM, tal como mayor que 2.5 mM, tal como mayor que 2.6 mM, tal como mayor que 3.0 mM, tal como mayor que 4.0 mM, tal como mayor que 5.0 mM, tal como mayor que 6.0 mM, tal como mayor que 7.0 mM, tal como mayor que 8.0 mM, tal como mayor que 9.0 mM, tal como mayor que 10.0 mM, tal como mayor que 20 mM, tal como mayor que 40.0 mM, tal como mayor que 60.0 mM, tal como mayor que 80.0 mM, tal como mayor que 0.1 M, tal como mayor que 1 M, tal como una concentración libre de iones de calcio, donde la solución es saturada. 67. La composición de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.10 mM. 68. La composición de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la concentración libre de iones de calcio obtenida es menor que 0.09, tal como menor que 0.08, tal como menor que 0.07, tal como menor que 0.06, tal como menor que 0.05, tal como menor que 0.04, tal como menor que 0.03, tal como menor que 0.02, tal como menor que 0.01, tal como menor que 0.00. 69. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-68, caracterizada porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM. 70. La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Sm2+, Ni2+, Cd2+, Hg2+, Sm2+ y Uo2+. 71. La composición de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque el catión de metal divalente se selecciona de la lista que consiste de Mg2+, Cu+ y Mn2+. 72. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-71, caracterizada porque la concentración libre de iones de un catión de metal divalente diferente de un ión de zinc y un ión de calcio obtenida es mayor que 0.025 mM, tal como mayor que 0.03 mM, tal como mayor que 0.035 mM, tal como mayor que 0.04 mM, tal como mayor que 0.045 M, tal como mayor que 0.05 mM, tal como mayor que 0.055 mM, tal como mayor que 0.06 mM, tal como mayor que 0.1 mM, tal como mayor que 0.15 mM, tal como mayor que 0.2 mM, tal como mayor que 0.25 mM, tal como mayor que 0.3 mM, tal como mayor que 0.5 mM, tal como mayor que 1.0 mM. 73. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-72, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es estabilizada en presencia de un quelante adicional de iones de metales divalentes . 74. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-73, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 4.5 y 6.9. 75. La composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque el pH está entre 4.7 y 6.8, tal como entre 4.9 y 6.7, tal como entre 5.1 y 6.6, tal como entre 5.3 y 6.5, tal como entre 5.5 y 6.4, tal como entre 5.7 y 6.3, tal como entre 5.8 y 6.2, tal como entre 5.9 y 6.1, tal como aproximadamente 6.0. 76. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-73, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA se purifica conforme al paso (iii) a un pH entre 8.6 y 10. 77. La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque el pH está entre 8.7 y 9.9, tal como entre 8.8 y 9.8, tal como entre 8.9 y 9.7, tal como entre 9.0 y 9.6, tal como entre 9.1 y 9.5, tal como entre 8.7 y 9.8, tal como entre 8.7 y 9.7, tal como entre 8.7 y 9.6, tal como entre 8.8 y 9.5, tal como entre 8.9 y 9.4, tal como entre 9.0 y 9.2, tal como aproximadamente 9.2. 78. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-77, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es estabilizada en presencia de histidina. 79. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-78, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor IX. 80. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-78, caracterizada porque la serina proteasa que contiene residuos de GLA es un polipéptido del Factor VII. 81. La composición de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el polipéptido del Factor VII es el Factor VII humano de tipo silvestre. 82. La composición de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el polipéptido del Factor VII tiene una actividad proteolxtica mayor que el FVIIa humano de tipo silvestre. 83. La composición de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque el polipéptido del Factor VII es un polipéptido relacionado con el Factor VII seleccionado del grupo que consiste de: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M2 8Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ 337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII , L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII , L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII , L305V/K337A/V158D-FVII , L305V/V158D/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII , L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/ 337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII , S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII , S314E/VI58D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII , S314E/V158T-FVII, 316H/L305V-FVII , 316H/ 337 -FVII , K316H/V158D-FVII, K316H/E2 6V-FVII , K316H/M298Q-FVII , K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII , K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII , 316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/ 337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII , S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/ 337A FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII , K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII , K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII , 316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E2 6V-FVII, K316H/L305V/V158T/ 298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, 316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/ 298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/ 337A/M298Q-FVII, 316H/L305V/V158D/E296V/ 337A-FVII , K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII , K316Q/L305V/ 337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, 316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/ 298Q-FVII, 316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII , K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E29'6V/K337A-FVII, ?316Q/L305V/V158D/K337?/?298Q-FVII , ?316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , ?316Q/L305V/VI58D/?296V/M298Q/ 337A-FVII , K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII , F37 Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII , F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII , F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII , F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII , F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII , F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII , F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII , F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII F374Y/L305V/ 337?/?296V-FVII , F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII F374Y/L305V/V158D/E29'6V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/ 337A/S314E/V158T-FVII F374Y/ 337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII F374Y/ 337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158 /?298Q-FVII F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII , F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII F374?/?337?/?298Q/V158D-FVII , F374Y/ 337A/E296V/V158D-FVII F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F37 Y/ I58 /?298Q/E2 6 -FVII F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/ 337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII , F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L3 O5V/V158D/M298Q/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII , F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII , F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/ 337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/VI58?/?298Q/?337A-FVII , F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/ 337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/ 298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/ 337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ 337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII , F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; Rl52E-Factor VII, S344A-Factor VII, Factor Vlla que carece del domino Gla; y P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII , G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 233Thr a 240Asn, FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys.