DE60009926T2

DE60009926T2 - Stabilisierung von gefriergetrocknetem kuchen

Info

Publication number: DE60009926T2
Application number: DE60009926T
Authority: DE
Inventors: Lindgaard Lars HANSEN
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-16
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2020-08-17
Also published as: DE60009926D1; EP1210361B1; AU6558400A; JP2003507388A; ATE264340T1; EP1210361A1; WO2001012653A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Zusammensetzung von gefriergetrocknetem Kuchen oder "Klumpen" von stabiler Struktur durch die Verwendung von Glycylglycin als gefriergetrockneten Kuchenformer oder Formmasse. Die Erfindung betrifft weiterhin eine stabilisierte gefriergetrocknete Rezeptur, bestehend aus Proteinen und Glycylglycinen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteine sind im wässrigen Zustand relativ instabil und durchlaufen eine chemische und physikalische Degradation, welche einen Verlust der biologischen Aktivität während der Verarbeitung und Lagerung zur Folge hat. Lyophylisierung oder Gefriertrocknung ist ein gut etabliertes Verfahren zur Konservierung von Proteinen für die Aufbewahrung.
Ein Gefriertrocknungszyklus besteht gewöhnlich aus drei Schritten: dem Einfrieren, dem ersten Trocknen und dem zweiten Trocknen. Im Gefrierschritt wird die Proteinlösung solange gekühlt, bis sie gleichmäßig gefroren ist. Der Großteil an Wasser in der Proteinlösung bildet in diesem Stadium Eis aus. Dieses Eis sublimiert im ersten Trockenstadium, was dadurch erreicht wird, dass der Kammerdruck unter den Dampfdruck des Eises mittels Vakuum gesenkt wird. Zum Schluss wird das freie oder ungebundene Wasser im zweiten Trocknungsschritt unter reduziertem Kammerdruck und erhöhter Innentemperatur entfernt. Dieser Prozess erzeugt ein Material, welches als gefriergetrockneter Kuchen bekannt ist. Vor Gebrauch ist der Kuchen aufzubacken. Die Standardpraxis besteht darin, ein Volumen an reinem Wasser zuzufügen.
Um die Proteinkonformation, -aktivität und -stabilität zu bewahren, enthält die Proteinlösung, die gefriergetrocknet werden soll, normalerweise Reagentien, die diesen Vorgang erleichtern, so genannte Lyoprotektoren und Cryoprotektoren. Cryoprotektoren sind Agenzien, die die Stabilität der Proteine vor dem durch die Trocknung induzierten Stress bewahren; jedoch beinhaltet der Begriff ebenso Agenzien, die für eine Stabilität sorgen, z.B. für einen Großteil an Arzneimittelzubereitungen während der Lagerung vor nicht durch den Frierungsprozess induziertem Stress. Lyoprotektoren sind Agenzien, die eine Stabilität der Proteine während des Wasserentzugs von Systemen während des Trocknungsprozesses gewährleisten, vorzugsweise, um die geeignete Konformation des Proteins durch die Wasserstoffbindung aufrechtzuerhalten. Cryoprotektoren können ebenso lyoprotektorische Eigenschaften besitzen.
Nach Wasserentzug befinden sich die Proteine und Agenzien in Form eines getrockneten "Kuchens". Dieser Kuchen muss in Bezug auf Form und Struktur gute Eigenschaften besitzen, d.h. er darf nicht zusammenfallen, denn solche kollabierten Kuchen werden hart oder sind sogar vor Gebrauch nicht wieder zu lösen (wiederaufzubacken). Eine oder mehrere der so genannten Formmassen werden zur Lösung vor Gefriertrocknung hinzugegeben. Formmassen sind Agenzien, die dem Kuchen gute gefriergetrocknete Eigenschaften verleihen und dem Protein helfen, durch verschiedene Stressprozesse zu gehen, die mit der Gefriertrocknung einhergehen (zum Beispiel Schneiden/Frieren). Formmassen tragen ebenfalls zur Bildung eines pharmazeutisch geeigneten Produkts und zur Aufrechterhaltung der Proteinaktivität während des Gefriertrocknungsprozesses und der darauffolgenden Lagerung bei. Beispiele für häufig benutzte Formmassen sind Mannit, Glycin, Saccharose, Lactose usw. Diese Agenzien tragen ebenso zur Tonizität der Rezeptoren bei.
Therapeutisch anwendbare Proteine für Injektionen oder Infusionen werden oft als gefriergetrocknete Produkte hergestellt und gelagert. Die gefriergetrockneten Proben können langfristig gelagert werden und zu einem späteren Zeitpunkt wieder hergestellt werden, indem eine entsprechende Zugabe an Lösungsmittel vor Anwendung am Patienten erfolgt.
Hohe Konzentrationen an Salz in einer Probe machen den Wasserentzug normalerweise zeitaufwendig und schwierig, und es wird problematisch sein, einen geeigneten gefriergetrockneten Kuchen zu erhalten.
Somit existiert eine Nachfrage an Verfahren zur Verbesserung des Gefriertrocknungsprozesses und von Produkten, wie Formmassen, die die Eigenschaften von gefriergetrocknetem Kuchen oder "Klumpen" verbessern.
Es konnte gezeigt werden, dass Glycylglycin als Formmasse in der Gefriertrocknung zur Erzeugung der strukturellen Stabilität von gefriergetrocknetem "Klumpens" oder Kuchen eingesetzt werden kann, und gleichzeitig als Stabilisator in erster Linie gegen die Aggregation von Proteinen wirkt. Des weiteren will man die Wirkung als Puffersubstanz (in Lösung vor Gefriertrocknung) und als Formmasse in einer Verbindung kombinieren, wodurch die Anzahl an Bindemittel in der gefriergetrockneten Rezeptur reduziert wird.
Glycylglycin kann allein oder in Kombination mit Zuckern, z.B. Saccharose, und/oder in Kombination mit Zuckeralkoholen, z.B. Mannit, und/oder in Kombination mit Cyclodextrinen, und/oder Aminosäuren, wie Glycin oder Arginin, angewendet werden. Es konnte gezeigt werden, dass Glycylglycin bei der Herstellung von gefriergetrocknetem Kuchen vorteilhaft ist, wenn es in gefriergetrockneten Rezepturen verwendet wird, die hohe Konzentrationen an Salz aufweisen (> 5mg/ml an Salz).
STAND DER TECHNIK
Flandrois, C. et al., Annales de Biologie Clinique, Band 47, Seiten 252–270 (1989) bezieht sich auf den Gebrauch von Glycylglycin als Puffersubstanz.
Davis, G. J. et al., Archives Biochem. Biophys., Band 311, Seiten 307–312 (1994) bezieht sich auf den Gebrauch von Glycylglycin als ein diagnostisches Reagenz in der Studie von spezifischen enzymatischen Reaktionen.
Europäisches Patent Nr. EP 359 201 B bezieht sich auf den Gebrauch von Glycylglycin oder Glycylglycylglycin als ein Stabilisator von Blut oder Plasma.
Patent Nr. 5 917 021 bezieht sich auf eine stabilisierte Proteinzusammensetzung, bestehend aus einem monomeren Protein und einer bei Lagerung stabilisierenden Menge an Saccharose, Histidin oder Glycin.
US Patent Nr. US 4 777 043 bezieht sich auf Zusammensetzungen, die einen menschlichem Gewebe Plasminogen-Aktivator enthalten, der z.B. ein Argininumion als eine im Puffer enthaltende Komponente besitzt.
US Patent Nr. US 3 773 626 beschreibt eine Zusammensetzung, bestehend aus r-Glutamyl-p-nitroranilin, Glycylglycin, einem Puffer, einem oberflächenaktiven Agens und Polyvinylpyrrolidon als ein stabiles Agens zur Unterscheidung von r-Glutamyltranspeptidase.
T- Morichi (International conference on culture collections. Culture collections of microorganisms xx, xx (1970), Seiten 351–361) bezieht sich auf protektive Komponenten in der Gefriertrocknung von Bakterien.
LISTE DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Menge an Degradationsprodukten von drei verschiedenen gefriergetrockneten Rezepturen von FFR-FVIIa.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue gefriergetrocknete Rezeptur dar, die Glycylglycin als Formmasse beinhaltet.
Einerseits betrifft die Erfindung eine gefriergetrocknete Zubereitung in Form eines "Klumpens" oder Kuchens, bestehend aus Glycylglycin als Formmasse.
In einer der Ausführungen besteht die Zubereitung des weiteren aus einer oder mehreren zusätzlichen Formmassen. In einer Ausführungsform besteht die Zubereitung des weiteren aus mindestens einem Zucker und/oder mindestens einem Zuckeralkohol und/oder mindestens einer Aminosäure.
In einer Ausführungsform ist die Formmasse Mannit oder Saccharose oder Histidin oder eine Mischung von einer oder mehreren von diesen in Verbindung mit Glycylglycin.
In einer Ausführungsform ist die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Mannit. In einer anderen Ausführungsform ist die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Saccharose. In einer anderen Ausführungsform ist die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Histidin.
In einer Ausführungsform ist die Menge an Glycylglycin zur Gesamtmenge zusätzlicher(en) Formmasse(n) von 1:2 bis 2:1 (Gew./Gew.).
In einer anderen Ausführungsform enthält die Zubereitung des weiteren einen nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff.
In einer Ausführungsform ist der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff ein Polysorbat oder ein Poloxamer.
In einer Ausführungsform wirkt Glycylglycin als ein Stabilisator des "Klumpens" oder Kuchens.
In einer Ausführungsform ist die gefriergetrocknete Zubereitung eine gefriergetrocknete Proteinzubereitung.
In einer Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 10 mg/ml der zu gefriertrocknenden Lösung. In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 1% (Gew./Gew.) (der zu gefriertrocknenden Lösung); in noch einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt mindestens 2%; in einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt mindestens 3% (Gew./Gew.); in einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt mindestens 4% (Gew./Gew.).
In einer Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 10 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse beträgt mindestens 2% (Gew./Gew.) (der zu gefriertrocknenden Lösung). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 13 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 2% (Gew./Gew.). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 10 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 3% (Gew./Gew.). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 10 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 4% (Gew./Gew.). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 13 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 3% (Gew./Gew.). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 13 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 4% (Gew./Gew.). In einer anderen Ausführungsform ist der Gehalt an Glycylglycin mindestens 13 mg/ml, und die Gesamtmenge der Formmasse ist mindestens 4% (Gew./Gew.).
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung den Gebrauch von Glycylglycin als einen gefriergetrockneten Kuchenformer oder als eine Formmasse.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung den Gebrauch von Glycylglycin als einen gefriergetrockneten Kuchenformer oder als eine Formmasse in der Gefriertrocknung einer Proteinlösung.
In einer Ausführungsform besteht die zu gefriertrocknende Lösung aus mindestens 5 mg/ml Salz.
In einer Ausführungsform ist das Salz ein Alkalimetallsalz oder ein Calciumsalz wie NaCl oder CaCl₂.
In einer anderen Ausführungsform wird Glycylglycin in Kombination mit mindestens einem Zucker und/oder mindestens einem Zuckeralkohol und/oder neutralem Salz und/oder einem nicht-ionischen Detergenz verwendet.
Unter einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Zubereitung eines Proteins, bestehend aus folgenden Schritten:

a) Auflösung des Proteins in Wasser oder einem geeigneten wässrigen Puffer, optional in Gegenwart von einem oder mehreren Salzen; und
b) Zugabe von Glycylglycin zur Proteinlösung; und
c) optionale Zugabe von mindestens einem Zucker und/oder mindestens einem Zuckeralkohol und/oder einem nicht-ionischen Detergenz und/oder einem neutralen Salz zur Lösung; und
d) Gefriertrocknung der erhaltenen Lösung;

a) Auflösung von Glycylglycin in Wasser oder einem geeigneten Puffer; und
b) Zugabe von Protein zur Lösung; und
c) optionale Zugabe von mindestens einem Zucker und/oder mindestens einem Zuckeralkohol und/oder einem nicht-ionischen Detergenz und/oder einem neutralen Salz zur Lösung; und
d) Gefriertrocknung der erhaltenen Lösung;

a) Auflösung von Glycylglycin in Wasser oder einem geeigneten Puffer, optional in Gegenwart von einem oder mehreren Salzen; und
b) optionale Zugabe von mindestens einem Zucker und/oder mindestnes einem Zuckeralkohol und/oder einem nicht-ionischen Detergenz und/oder einem neutralen Salz zur Lösung; und
c) Zugabe von Protein zur Lösung; und
d) Gefriertrocknung der erhaltenen Lösung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Glycylglycin wurde früher in geringer Konzentration (typischerweise 10 mM – 50 mM, entsprechend weniger als 7 mg/ml) als eine Puffersubstanz in Proteinrezepturen verwendet. Jedoch wurde jetzt festgestellt, dass Glycylglycin als Formmasse verwendet werden kann, wodurch dem gefriergetrockneten "Klumpen" oder Kuchen strukturelle Stabilität verliehen wird, und gleichzeitig als ein Stabilisator von Proteinen wirkt. Glycylglycin kann allein oder in Kombination mit Zuckern, z.B. Saccharose, und/oder in Kombination mit Zuckeralkoholen, z.B. Mannit, und/oder in Kombination mit Cyclodextrinen, und/oder Aminosäuren wie Glycin oder Arginin verwendet werden.
Glycylglycin sollte in einer Menge von mindestens 10 mg/ml, vorzugsweise mindestens 13 mg/ml, vorliegen.
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Glycylglycin als Formmasse oder als gefriergetrockneter Kuchenformer verwendet werden kann, wenn hohe Salzkonzentrationen vorhanden sind (> 5 mg/ml Salzen).
Bei Kombination der Funktionen als Puffersubstanz (in Lösung vor Gefriertrocknung) und als Formmasse in einer Verbindung wird die Anzahl von Inhaltsstoffen in den gefriergetrockneten Zubereitungen reduziert. Jedoch können andere geeignete Puffer zur Rezepturlösung vor Gefriertrocknung verwendet werden.
In der vorliegenden Beschreibung haben die unten angegebenen Begriffe folgende Bedeutung:
"Stabilisierung" bedeutet Minimierung der Bildung von Aggregationen (unlöslich und/oder löslich) und/oder chemische Degradation sowie Gewährleistung von Lyoprotektion und Cryoprotektion des Proteins, Aufrechterhaltung des pH-Wertes und eigentliche Konformation des Proteins während der Lagerung, so dass das substanzielle Vorhandensein der biologischen Aktivität und Proteinstabilität bewahrt werden. Bei "struktureller Stabilisierung" und "struktureller Stabilität" wird die Fähigkeit zur Bildung eines gefriergetrockneten "Klumpens" oder Kuchens mit guten Eigenschaften und Aussehen verstanden, z.B. dass der Kuchen nicht kollabiert und vor Gebrauch zum Ablösen fertig ist.
Proteinstabilität an sich kann von solchen Faktoren wie ionischer Stärke, pH-Wert, Temperatur, wiederholte Zyklen von Einfrieren/Auftauen und Aussetzung gegenüber Scherenkräften beeinflusst werden. Die Aktivität eines Proteins kann als Folge von physikalischer Instabilität, einschließlich beispielsweise einer Hydrolyse, Deamidation, Oxidation, um nur ein paar zu nennen, verloren gehen. Für einen allgemeinen Überblick zur Stabilität von Proteinarzneimitteln siehe z.B. Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989).
"Lagerungsstabil" bedeutet, dass das Produkt für die Lagerung bei einer Temperatur zwischen 5°C–25°C stabilisiert wird und dies innerhalb der Produktangaben für eine geeignete Zeitspanne – oft mehrere Monate – bleibt.
"Formmasse" schließt im Allgemeinen Agenzien ein, die gute gefriergetrocknete Kucheneigenschaften zur Bildung eines pharmazeutisch geeigneten Produkts haben, um dem Protein bei der Überwindung unterschiedlicher Stressarten zu helfen (zum Beispiel Scheren/Frieren), verbunden mit dem Gefriertrocknungsprozess, und um den Level an Proteinaktivität während des Gefriertrocknungsprozesses und nachfolgender Lagerung aufrechtzuerhalten. Beispiele von oft gebrauchten Formmassen schließen Mannit, Glycin, Saccharose, Lactose usw.. Die Agenzien tragen zur Konsistenz der Zubereitungen ein.
"Cryoprotektoren" schließen normalerweise Agenzien ein, die die Proteinstabilität vor gefrier-induzierten Stresssituationen aufrechterhalten; auch schließt der Begriff Agenzien ein, die die Stabilität bewerkstelligen, z.B. um Arzneizubereitungen während der Lagerung vor nicht-gefrier-induziertem Stress zu bewahren. Beispiele für Cryprotektoren schließen Polyole wie z.B. Mannit, und Saccharide wie z.B. Saccharose, ein sowie solche wie z.B. Polysorbat, Poloxamer oder Polyethylenglycol und dergleichen. Cryoprotektoren tragen ebenfalls zur Konsistenz der Zubereitungen bei.
Der Begriff "Lyoprotektor" schließt Agenzien ein, die für die Stabilität während des Wasserentzugs aus dem System während des Trocknungsprozesses sorgen, vermutlich durch Aufrechterhaltung der richtigen Konformation des Proteins durch Wasserstoffbindung. Beispiele für Lyoprotektoren schließen Saccharide und Di- oder Trisaccharide ein. Cryoprotektoren können auch lyoprotektierende Eigenschaften haben. Während sich bevorzugte Konzentrationen zwischen 0,5 und 2% bewegen, sind relativ hohe Konzentrationen (zum Beispiel 5%) in Bereichen geeignet, die nur bei solchen in der klinischen Praxis verwendeten limitierten Bereichen Anwendung finden.
Der Begriff "Surfaktante" schließt im Allgemeinen solche Agenzien ein, die das Protein vor Luft-/Lösungsschnittstelle-induziertem Stress und Lösung-/Oberfläche-induziertem Stress schützen (z.B. Proteinaggregation zur Folge) und können Detergenzen wie Polysorbat, Poloxamer oder Polyethylenglycol und dergleichen einschließen. Optional sind Konzentrationen von etwa 0,01% bis etwa 1% (Gew./Gew.) für die Aufrechterhaltung der Proteinstabilität geeignet, jedoch sind die in der aktuellen Praxis verwendeten Mengen üblicherweise in der klinischen Praxis eingeschränkt.
Der Begriff "Pufferagens" oder "Puffer" umfasst solche Agenzien, die den pH-Wert der Lösung im zulässigen Bereich vor Gefriertrocknung aufrechterhalten, und können Histidin, Phosphat, Citrat, Tris, Diethanolamin und dergleichen einschließen. Die oberen Konzentrationsgrenzen sind im Allgemeinen für Formmasseproteine höher als für Dosierungsproteinformen, wie bereits freundlicherweise von einem Fachmann vermerkt. Während zum Beispiel die Pufferkonzentrationen von mehreren Millimolar bis zur oberen Grenze derer Löslichkeit (z.B. Histidin könnte an die 200 mM hoch sein) reichen können, würde ein Fachmann auch das Erreichen/Aufrechterhalten einer angemessenen physiologisch geeigneten Konzentration in Betracht ziehen. Prozentsätze sind Gewicht/Gewicht in Bezug auf Feststoffe und Gewicht/Volumen in Bezug auf Flüssigkeiten.
Der Begriff "isotonisch", 300 ± 50 mOsM, ist als ein Maß für Osmolalität der Proteinlösung vor Gefriertrocknung gedacht; Wiederherstellung findet üblicherweise mit Wasser für Injektion (WFI) statt. Die Aufrechterhaltung physiologischer Osmolalität ist für die Dosierung von Zubereitungen wichtig. Jedoch können für Volumenzubereitungen viel höhere Konzentrationen effektiv verwertet werden, solange die Lösung vor Gebrauch isotonisch gemacht wird.
Der Begriff "Inhaltsstoffe" schließt pharmazeutisch zulässige Reagenzien ein, die für gute Eigenschaften gefriergetrockneter Kuchen (Formmassen) sowie für Lyo protektion und Cryoprotektion von Proteinen, für Aufrechterhaltung des pH-Wertes und richtige Konformation des Proteins während der Lagerung sorgen, so dass die biologische Aktivität und Proteinstabilität substantiell aufrechterhalten werden.
"Proteine" schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Blutkoagulationsfaktoren, z.B. Faktor IX, Faktor VIII, Faktor VII, aktivierter Faktor VII (FVIIa), Protein C, Wachstumshormone, z.B. menschliche Wachstumshormone (hGH), Wachstumshormone vom Rind, Wachstumshormone vom Schwein, GLP-1, Heparinbindendes Protein (HBP), Insulin oder Insulinvarianten, modifizierter Faktor VII und nahe liegende Varianten davon, ein.
"Modifizierter Faktor VII oder VIIa" ist ein Koagulationsfaktor VII (in gärungsfördernder oder aktivierter Form) mit mindestens einer Modifizierung in seinem katalytischen Zentrum, dessen Modifizierung substanziell die Fähigkeit des modifizierten Faktors VII zur Aktivierung des Plasma-Faktors X oder IX besitzt (siehe WO 92/15686, WO 94/27631, WO 96/12800 und WO 97/47651 (Novo Nordisk/ZymoGenetics).
In dieser Anwendung wird die FFR-FVIIa-Konzentration zweckmäßigerweise in mg/ml oder in U/ml mit 1 mg/ml ungefähr gleich zu 20 U/ml angegeben.
Abkürzungen

FVII Koagulationsfaktor VII in seiner Einzelkettenform
FVIIa Koagulationsfaktor VII in seiner gespaltenen, aktivierten Zweikettenform
rFVII (rFVIIa) rekombinanter Faktor VII (rekombinanter Faktor VIIa)
FVIIai modifizierter Faktor VII, der Koagulationsfaktor VII mit mindestens einer Modifizierung in seinem katalytischen Zentrum ist, wobei diese Modifizierung substantiell für die Fähigkeit des modifizierten Faktors VII ist, den Plasma-Faktor X oder IX zu aktivieren
RFVIIai rekombinanter modifizierter Faktor VIIa (rekombinanter FVIIai)
TF Gewebefaktor
DEGR-FVIIa
(DEGR-FVII) Koagulationsfaktor FVIIa (FVII), bei dem das katalytische Zentrum durch chemische Reaktion von FVIIa (FVII) mit Dansyl-GlyGly-Arg-Chlormethylketon (DEGR-cmk) inaktiviert wurde
FFR-FVIIa
(FFR-FVII) Koagulationsfaktor FVIIa (FVII), bei dem das katalytische Zentrum durch chemische Reaktion von FVIIa (FVII) mit Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (FFR-cmk) inaktiviert wurde
PPA-FVIIa
(PPA-FVII) FVIIa (FVII) reagiert mit D-Phe-Pro-Arg-Chlomethylketon (PPA-cmk)
DEGR-cmk Dansyl-Glu-Gly-Arg-Chlormethylketon
FFR-cmk D-Phe-Phe-Arg oder Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon
PPACK D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPA-cmk)
DFFR-cmk Dansyl-D-Phe-Phe-Arg oder Dansyl-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon
Ser344-FVIIa
(Ser344-FVII) Koagulationsfaktor FVIIa (FVII), bei dem das katalytische Zentrum durch Ersetzen der nativen Aminosäure in Position 344 mit Serin inaktiviert wurde
Gly-gly Glycylglycin

Die für den Gebrauch bevorzugten Puffer (zur Zubereitung einer Lösung für Gefriertrocknung) sind Glycin, Histidin, Arginin, Glycylglycin, Citrat, Carbonat und Phosphat, bevorzugter sind Glycin, Histidin, Arginin und Glycylglycin, am mei sten bevorzugt sind Glycylglycine. Die bevorzugte Konzentration bewegt sich für den Puffereffekt allein zwischen 0,66 mg/ml und 1,32 mg/ml.
Eine weitere Stabilisierung des gefriergetrockneten Proteins kann durch die Zugabe von oberflächlich aktiven Stoffen erreicht werden, z.B. Polysorbat oder Poloxamer wie Tween 20^TM, Tween 80^TM oder Poloxamer 188. Bevorzugte Detergenzien sind Poloxamere, z.B. Poloxamer 188, Poloxamer 407, Alkylether, z.B. Cremophor A25^TM, Sympatens ALM/230^TM und Polysorbate/Tweens, z.B. Polysorbat 20, Polysrobate 80. Mehr bevorzugt sind Poloxamere, z.B. Poloxamer 188 und Tweens, z.B. Tween 20^TM und Tween 80^TM. Üblicherweise werden die Detergenzien in einer Menge zwischen 0,005 bis 5 mg/ml zugegeben. Bevorzugte Mengen bewegen sich zwischen 0,01 bis 3 mg/ml, bevorzugter zwischen 0,01 bis 0,3 mg/ml für Tween 20^TM und/oder Tween 80^TM und von 0,05 bis 3 mg/ml für Poloxamer 188.
Bevorzugte Zucker, Zuckeralkohole und Aminosäuren, die in Kombination mit Glycylglycin verwendet werden, sind Saccharose, Dextrose, Lactose, Maltose, Cyclodextrine, Maltodextrine und Dextrane, Mannit und Polyethylenglycole, Glycine, Arginin und Histidin. Stärker bevorzugt sind Saccharose, Cyclodextrine, Maltose und Lactose, Mannit, Glycin, Histidin und Arginin. Noch bevorzugter sind Saccharose, Mannit und Histidin, allein oder in Kombination. Zusammensetzungen aus Mannit mit Glycylglycin und Saccharose mit Glycylglycin sind am meisten bevorzugt.
Eine Formmasse ist normalerweise in einer Menge zwischen 20 mg/ml bis ca. 250 mg/ml vertreten. Entsprechend der vorliegenden Erfindung sollte die Formmasse in einer Menge von ca. 15 mg/ml bis ca. 250 mg/ml vorhanden sein (in der zur Lyophylisierung fertigen Proteinlösung), bevorzugt in einer Menge von mindestens 20 mg/ml. Wenn Glycylglycin die alleinige Formmasse ist, dann beträgt die Menge an Glycylglycin vorzugsweise ca. 15 bis ca. 250 mg/ml, bevorzugter ca. 20 bis ca. 250 mg/ml, bevorzugter ca. 25 bis ca. 350 mg/ml, bevorzugter ca. 25 bis ca. 100 mg/ml, bevorzugter ca. 25 bis ca. 40 mg/ml.
Wenn Glycylglycin als Formmasse in Kombination mit einem Zucker, einem Zuckeralkohol oder einer Aminosäure oder einer Mixtur von allem verwendet wird, sollte die gesamte Menge an Agenzien von ca. 15 mg/ml bis ca. 250 mg/ml betragen, bevorzugter von ca. 20 bis ca. 250 mg/ml, bevorzugter von ca. 25 bis ca. 250 mg/ml, bevorzugter von ca. 25 bis ca. 100 mg/ml, bevorzugter von ca. 25 bis ca. 40 mg/ml. Die Menge an Glycylglycin sollte mindestens 10 mg/ml sein.
Vorzugsweise soll das Verhältnis zwischen Glycylglycin und der Gesamtmenge an zugegebenen Agenzien (Zucker, Zuckeralkohol und/oder Aminosäure) von 4:1 zu 1:4 betragen, bevorzugter von 3:1 zu 1:3, sogar noch bevorzugter von 1:2 zu 2:1 (Glycylglycin : anderer (Gew./Gew.).
Bevorzugt ist eine Kombination aus Glycylglycin mit Mannit, bestehend aus mindestens 27 mg/ml an Mannit und aus 13 mg/ml an Glycylglycin mit insgesamt mindestens 40 mg/ml an Formmasse. Bevorzugt ist ebenfalls eine Kombination an Glycylglycin mit Saccharose, bestehend aus mindestens 27 mg/ml an Saccharose und aus 13 mg/ml an Glycylglycin mit insgesamt mindestens 40 mg/ml an Formmasse. Bevorzugt ist ebenso eine Kombination aus Glycylglycin mit Histidin, bestehend aus mindestens 27 mg/ml an Histidin und aus 13 mg/ml an Glycylglycin mit insgesamt mindestens 40 mg/ml an Formmasse.
Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Glycylglycin allein oder eine Mixtur davon, die Glycylglycin enthält, in der Anwendung von einem gefriergetrockneten Kuchenformer von Vorteil ist, wenn die gefriergetrockneten Rezepturen hohe Salzkonzentrationen enthalten (> 5 mg/ml an Salzen).
Proteine, die für die Gefriertrocknung in Kombination mit Glycylglycin geeignet sind, sind z.B. die Blutkoagulationsfaktoren (FIX, FVIII, FVII, FVIIa), Wachs tumshormone (z.B. menschliches GH), GLP-1, Heparin-bindendes Protein (HBP), Insulin oder Insulinvarianten, modifizierte FVII/FVIIa. Bevorzugt sind hGH, FIX, FVIII, FVII/FVIIa und modifiziertes FVII/FVIIa, wobei FVIIa und modifiziertes FVII/FVIIa die am meisten bevorzugt sind.
Eine lagerungsstabile Zusammensetzung nach dieser Erfindung besteht essentiell aus Protein, Glycylglycin und wahlweise aus mindestens einem neutralen Salz und/oder aus mindestens einem Zucker und/oder aus mindestens einem Zuckeralkohol und/oder aus mindestens einer Aminosäure und/oder einem nicht-ionischen Detergent.
Zubereitung von gefriergetrocknetem Protein/Herstellung
Der aktive Inhaltsstoff z.B. in Form eines getrockneten Feststoffes oder einer gefrorenen Flüssigkeit wird für die Zubereitung einer formulierten Formmasse für die Gefriertrocknung hergestellt. Wenn der aktive Inhaltsstoff, hier genannt die Formmasse, eine gefrorene Flüssigkeit ist, muss die Flüssigkeit aufgetaut werden. Die Formulierungszusatzstoffe sind entweder direkt in der Flüssigkeit gelöst oder in einem konzentrierten Verdünnungspuffer, der – die Rezepturzusatzstoffe enthaltend – mit der Formmasse gemischt wird. Die Formmasse liegt verdünnt vor, um die gewünschte Proteinkonzentration zu erhalten.
Wenn die Formsubstanz eine Trockensubstanz ist, muss sie direkt in einer Lösung mit den Rezepturzugaben gelöst werden, um die gewünschte Proteinkonzentration zu erhalten. Die formulierte Formmasse wird steril filtriert und in lyophilisierte Gefäße gefüllt, die mit einem Verschluss, der halb geschlossen ist, versehen werden. Der Kühlvorgang findet nun im Kühlregal des Gefriertrockners statt, um die Gefäße zu frieren und das Produkt unter der kritischen Temperatur zu halten. Das Wasser wird durch Anlegen eines Vakuums entfernt und Wasserdampf kondensiert am Eiskondenser des Gefriertrockners. Wenn das Produkt trocken ist, beträgt der Restfeuchtigkeitsgehalt normalerweise 1%, während die Gefäße geschlossen und gedeckelt sind. Der Herstellungsprozess ist beendet.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Lyophilisierte Rezepturen nach vorliegender Erfindung können, wenn sie mit pharmazeutischen Proteinen formuliert sind, wiederhergestellt und dem Patienten verabreicht werden. Sie können aber ebenso in anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen konstituiert und reformuliert werden, z.B. indem sie zusätzlich pharmazeutisch zulässige Hilfssubstanzen, wie weiter unten beschrieben, enthalten, deren Zusammensetzung, abwechselnd flüssig oder gefriergetrocknet sein kann und vor Gebrauch wieder hergestellt werden kann.
Die wiederhergestellten Rezepturen werden für eine parentale Verabreichung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung verwendet. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parental verabreicht, z.B. intravenös, subkutan oder intramuskulär, oder sie werden in einer Art von kontinuierlichen oder einer pulsierenden Infusion verabreicht.
Die Zusammensetzungen werden wiederhergestellt, indem ein zulässiges (steriles) Verdünnungsmittel oder eine Trägersubstanz verwendet wird, vorzugsweise eine wässrige Trägersubstanz. Eine Mehrzahl von wässrigen Trägersubstanzen kann verwendet werden, z.B. Wasser (z.B. Wasser für Injektion(WFI)), gepuffertes Wasser, Salz (z.B. 0,4% Salzgehalt), Glycin (z.B. 0,3% Glycin) und dergleichen. Das Wiederherstellungs-Verdünnungsmittel kann ebenso ein oder mehrere Salze enthalten, z.B. ein Calciumsalz (z.B. CaCl₂) oder eine Kombination von einem Natrium- und einem Calciumsalz (z.B. NaCl und CaCl₂).
Wenn das Protein FVIIa oder modifiziertes FVIIa ist, sind bevorzugte Salze CaCl₂ und NaCl, eine bevorzugte Menge bewegt sich um 1,47 mg/ml für CaCl₂ und um 1,75 bis 2,92 mg/ml für NaCl.
Die Zusammensetzungen können des weiteren pharmazeutisch zulässige Hilfssubstanzen enthalten, um bestimmte physiologische Bedingungen zu erreichen, die z.B. den pH-Wert einstellen und puffernde Agenzien, die Konsistenz justierende Agenzien und der gleichen, zum Beispiel Natriumazetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid etc.. Die Proteinkonzentration solcher Rezepturen kann weit variieren, z.B. von weniger als ca. 0,5% normalerweise oder mindestens ca. 1 % bis maximal 15 oder 20 Gewichts-%. In erster Linie werden Flüssigkeitsvolumen, Viskosität etc. in Übereinstimmung mit der ausgewählten Verabreichungsgabe die Proteinkonzentration bestimmen.
Folglich könnte eine Wiederherstellung einer Zusammensetzung entsprechend der Erfindung in steriler Ringer-Lösung eine typische pharmazeutische Zusammensetzung darstellen. Aktuelle Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen parentaler Verabreichung sind bekannt oder erscheinen im Stand der Technik und werden mehr detaillierter in beispielsweise Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA (1995) beschrieben.
Der pH-Wert der wiederhergestellten Zusammensetzungen sollte sich im Bereich von pharmazeutisch zulässigen Werten bewegen, normalerweise zwischen 5–8. Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen 5,5–7,5.
Die folgenden Beispiele werden anhand von Illustrationen dargestellt, nicht anhand von Einschränkungen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Screening von Formmassen
In diesem Beispiel hatten ALLE Rezepturen die gleiche Zusammensetzung, bevor die Formmassen hinzugegeben wurden: 1 mg/ml modifiziertes rFFVIIa, 1,75–2,95 mg/ml NaCl, 1,47 mg/ml CaCl₂, Glycylglycin 1,32 mg/ml (Pufferlösung).
Die Tabelle zeig des Effekt von Glycylglycin allein und in Kombination mit anderen Zusatzstoffen. Es zeigt sich, dass sich die Zugabe von Glycylglycin gegenüber einigen Aminosäuren wie Arginin und Histidin positiv auf die Kuchenstrukturstabilität auswirkt und weiterhin zeigt sich, dass die Zugabe von Glycylglycin zu Saccharose eine strukturelle Stabilität bei einem zusammengefallenen Kuchen bewirkt, der durch die Gefriertrocknung mit Saccharose allein entstanden ist.
Beispiel 2
Physikalische und chemische Stabilität von Rezepturen, die mit Glycylglycin stabilisiert wurden
In diesem Beispiel haben ALLE Rezepturen die gleiche Zusammensetzung, bevor sie zu der Formmasse hinzugegeben werden: 1mg/ml modifiziertes rFVIIa, 1,75-2,95 mg/ml NaCl, 1,47 mg/ml CaCl₂, Glycylglycin 1,32 mg/ml (Pufferagens). Sowohl Tween 80^TM als auch Poloxamer 188 wurden als oberflächenaktive Stoffe hinzugegeben. Die Rezepturen wurden unter beschleunigten Bedingungen für bis zu 4 Wochen gelagert.
1) Daten für 0,1 mg/ml Gehalt an Poloxamer 188.
Beispiel 3
Weitere Stabilisierung von Rezepturen mit oberflächenaktiven Stoffen
Die Auswirkung der oberflächenaktiven Stoffe auf die Proteinstabilität wurde anfänglich mit den Referenzzusammensetzungen durchgeführt, die in ihrer Rezeptur Mannit allein als Basisformmasse enthalten haben.
Die Auswirkung von Tween 20^TM und Tween 80^TM auf diese Zusammensetzung was fast gleich, wobei der gleiche Effekt auch mit Poloxamer 188 bei etwas höherer Konzentration an oberflächenaktivem Stoff erreicht werden konnte. Die Auswirkungen der oberflächenaktiven Stoffe scheinen ziemlich gleich auf alle getesteten Zusammensetzungen zu sein, und der optimale Konzentrationsbereich ist definiert als von 0,01–0,3 mg/ml für Tween 20^TM und/oder Tween 80^TM und von 0,05–3,0 mg/ml für Poloxamer 188.
pH-Wert=6,5 und oberflächenaktiver Stoff=0,05 mg/ml von Tween 80^TM
Beispiel 4
In diesem Beispiel sind alle PLACEBO-Rezepturen in der gleichen Zusammensetzung, bevor die Formmassen hinzugegeben werden: 2,95 mg/ml NaCl, 1,47 mg/ml CaCl₂, Glycylglycin 1,32 mg/ml (Pufferagens). In diesem Fall wurde KEIN PROTEIN zu den Rezepturen hinzugegeben.
Beispiel 5
Vier Rezepturen, die Mannit, Mannit/Glycin (2:1), Mannit/Glycylglycin (2:1) beziehungsweise Saccharose/Glycylglycin (2:1) als Formmassen enthalten, wurden zubereitet, und die Mengen an Degradationsprodukten in Rezepturen, die Glycylglycin enthalten, wurden mit Rezepturen ohne Glycylglycin verglichen. ALLE Rezepturen hatten die gleiche Zusammensetzung, bevor Formmassen hinzugegeben wurden: 1 mg/ml modifiziertes rFVIIa, 1,75–2,95 mg/ml NaCl, 1,47 mg/ml CaCl₂, Glycylglycin 1,32 mg/ml (Pufferagens). Sowohl Tween 80^TM als auch Poloxamer 188 wurden als oberflächenaktiver Stoff hinzugegeben.
Die Rezepturen wurden unter beschleunigten Bedingungen für bis zu 4 Wochen gelagert, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle nach 4 Wochen Lagerungszeit zusammengefasst.
Dies ist in 1 illustriert.

Claims

Gefriergetrocknete Zubereitung, umfassend ein Protein und Glycylglycin als Formmasse, wobei die Zubereitung durch Gefriertrocknung einer das Protein und mindestens 10 mg/ml Glycylglycin enthaltenden Lösung erhältlich ist.
Zubereitung nach Anspruch 1, umfassend eine oder mehrere zusätzliche(n) Formmasse(n).
Zubereitung nach Anspruch 2, umfassend mindestens einen Zucker und/oder mindestens einen Zuckeralkohol und/oder mindestens eine Aminosäure.
Zubereitung nach Anspruch 3, wobei die Formmasse Mannit, Saccharose, Histidin oder eine Mischung von einem oder mehreren von diesen in Kombination mit Glycylglycin ist.
Zubereitung nach Anspruch 4, wobei die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Mannit ist.
Zubereitung nach Anspruch 4, wobei die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Saccharose ist.
Zubereitung nach einem der Ansprüche 2–6, wobei die Menge von Glycylglycin zu der Gesamtmenge der zusätzlichen Formmasse(n) von 1:2 bis 2:1 (w/w) beträgt.
Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Protein aktivierter Faktor VII ist.
Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Protein modifizierter Faktor VII ist.
Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Zubereitung, wobei das Verfahren den Schritt der Gefriertrocknung einer ein Protein und mindestens 10 mg/ml Glycylglycin als Formmasse enthaltenden Lösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, umfassend eine oder mehrere zusätzliche(n) Formmasse(n).
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend mindestens einen Zucker und/oder mindestens einen Zuckeralkohol und/oder mindestens eine Aminosäure.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Formmasse Mannit, Saccharose, Histidin oder eine Mischung von einem oder mehreren von diesen in Kombination mit Glycylglycin ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Mannit ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Formmasse Glycylglycin in Kombination mit Saccharose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–15, wobei die Menge von Glycylglycin zu der Gesamtmenge der zusätzlichen Formmasse(n) von 1:2 bis 2:1 (w/w) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–16, wobei die zu gefriergetrocknete Lösung mindestens 5 mg/ml eines Alkalimetallsalzes oder eines Calciumsalzes, wie NaCl oder CaCl₂, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–17, wobei das Protein aktivierter Faktor VII ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–17, wobei das Protein modifizierter Faktor VII ist.