MXPA04011405A - Muteinas del factor de crecimiento placentario tipo 1, metodo de preparacion y aplicacion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la muteina quimicamente estable del tipo 1 del Factor de Crecimiento Placentario (PLGF-1) mediante la sustitucion o eliminacion de un residuo de cisteina en la secuencia de aminoacidos de la proteina de tipo silvestre, su preparacion, sus usos terapeuticos y cosmeticos y las composiciones farmaceuticas y cosmeticas que contienen dichos derivados. La invencion tambien se refiere a la produccion de anticuerpos para dichos derivados y su uso en el diagnostico y tratamiento de patologias tumorosas o no tumorosas.

Description

Mu teínas del factor de crecimiento placentario tipo 1 , método de preparación y aplicación Campo de la invención. La presente invención se refiere a muteínas estables del factor de crecimiento placentario tipo 1 (PLGF-1 ), su preparación, su uso terapéutico y cosmético así como sus compuestos farmacéuticos y cosméticos que contienen dichos derivados. La invención se refiere a la producción de anticuerpos ante dichos derivados y a su uso en el diagnóstico y tratamiento de patologías tumorales y no tumorales.

Antecedentes de la invención. El factor de crecimiento placentario tipo 1 (PLGF-1 ) es una glicoproteína homodimérica angiogénica. La actividad angiogénica se refiere a la forma dimérica cuando la forma monomérica está inactiva. La secuencia polinucleotídica completa que codifica la proteína PLFG-1 , junto con su secuencia polipeptídica fueron descritas por Maglione y Pérsico en la Pat. EP-B-0 550 519 (WO-A-92/06194).

Dicha patente describe un método de producción de PLFG-1 en bacteria modificada usando un sistema de expresión inducible, dicho método involucra, después de la inducción, la lisis bacteriana y la extracción directa de la proteína pura de la solución de lisis. La proteína así obtenida muestra bajos niveles de actividad biológica.

Un método de extracción y purificación del factor placentario primario, obtenido mediante expresión en bacteria, es descrito por Maglione et al. en la solicitud de patente PCT/IT02/00065. El método involucra series de pases de extracción, renaturalización y purificación que en conjunto hacen posible obtener la proteína pura en forma dimérica esencial, o sea, en su forma más activa. Es, de hecho, sabido que la forma monomérica de la proteína es biológicamente inactiva y que sólo adquiere funciones angiogénicas después de la renaturalización a su forma dimérica.

Sin embargo, los actuales inventores han observado que la proteína dimérica es parcialmente inestable, y da a lugar, en una solución acuosa, durante el almacenaje o el procesamiento, a formas multiméricas que presentan menos actividad biológica y por esa razól es menos atractiva para uso terapéutico, debido a'la incertidúmbré sobré dosis" y actividad biológica.

El propósito de la presente invención es por lo tanto, resolver el problema de una pobre estabilidad químico-biológica de PLGF-1 tal como se observa principalmente cuando ésta última se conserva en soluciones acuosas.

Objetivos de la invención. Un primer objetivo de esta solicitud está representado por una muteína de la forma monomérica del factor de crecimiento placentario animal o humano tipo 1 (PLGF-1 ) que comprende la sustitución o eliminación en la secuencia polipeptídica de la proteína de tipo silvestre de por lo menos uno de los nueve residuos de cisteína (Cys) que contiene. Dicha sustitución o eliminación no afecta el proceso de dimerización esencial para obtener la proteína en su forma biológicamente activa, aunque previene la multimerizáción de la forma monomérica.

Un segundo objetivo de la invención está representado por una muteína del factor PLGF-1 en su forma dimérica, preferentemente purificada de manera tal que comprenda sólo al dímero. Dicha muteína puede igualmente ser la proteína madura o una pre-proteína que comprenda un péptido señal en la porción N-terminal.

Otro objetivo de la invención es la secuencia nucleotídica que comprende el DNA codificante de la muteína en cuestión. La secuencia está caracterizada porque el codón TGC o TGT que codifica el aminoácido cisteína en la secuencia natural del PLGF-1 es eliminado o modificado.

Otro objetivo de la invención es un sistema de expresión que comprende la ' secuencia nucleotídica vista mas arriba, acompañada de secuencias" no transcritas que controlan y regulan la expresión. Este sistema puede ser inducido en células procariontes, preferentemente en células bacterianas.

Otro objeto de la invención es un proceso para la producción y extracción de la muteína en la que las células huésped, preferentemente bacterianas, modificadas utilizando el sistema de expresión acorde a la invención, son cultivadas en un medio de cultivo adecuado, la expresión de las proteínas es inducida por un inductor determinado, las células son aisladas y lisadas y la muteína es extraída de la mezcla de lisis.

Breve descripción de las figuras. Figura 1. La figura muestra el perfil electroforético SDS-PAGE del PLGF-1 CG después de la re-suspensión en solución fisiológica a 20 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C por 40 días. El perfil se compara con el perfil para la muteína inmediatamente después de solubilización. (M) indica las referencias de peso molecular; (1 ) indica el PLGF-1 CG (3 microgramos) solubilizados en la solución fisiológica a una concentración de 20 mg/ml y congelada (control); (2) indica el PLGF-1 CG (3 microgramos) solubilizados en la solución fisiológica en una concentración de 20 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C durante 40 días. Figura 2. La figura muestra los datos de la tabla 2 expresada gráficamente.

Figura 3. La figura muestra el perfil electroforético SDS-PAGE de la muteína PLGF-1 CG solubilizada en gel de Carbopol a 0.2 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C durante 170 días. (M) indica las referencias de peso molecular; (1 ) indica el PLGF-1 CG (2 microgramos) solubilizados en gel de Carbopol a una concentración de 0.2 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C durante 170 días. (2) indica el PLGF-1 CG (2 microgramos) solubilizados en gel de'Carbopol a una- concentración de 0.2 mg/ml y congelada (control). Figura 4. La figura muestra el perfil electroforético SDS-PAGE de la forma nativa de PLGF-1 solubilizada en gel de Carbopol a 0.2 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C durante 150 días.(M) indica las referencias de peso molecular; (1 ) indica el PLGF-1 (2 microgramos) solubilizadas en gel de Carbopol a una concentración de 0.2 mg/ml y almacenada entre 4-8 °C durante 150 días. (2) indica el PLGF- 1 (2 microgramos) solubilizado en gel de Carbopol a una concentración de 0.2 mg/ml y congelado (control). Figura 5. La figura es una ilustración esquemática del proceso para la construcción del plásmido pET3PLGF1CG que codifica la muteína PLGF-1 denominada PLGF- 1 CG. Figura 6. La figura muestra la actividad angiogénica del PLGF-1 de tipo silvestre y de la muteína PLGF-1 CG en concentraciones crecientes de sustancia. La actividad del factor de crecimiento de fibroblastos bFGF se muestra como referencia.

Figura 7. La figura muestra el efecto de la muteína PLFG-1 CG sobre daño isquémico inducido por isopronalina en tejido cardiaco de conejo. El eje x muestra los días de tratamiento y el valor AUC representando el área total incluida en la curva identificada por los registros diarios de ECG.

Lista de secuencias. SEQ ID N0:1 secuencia nucleotídica para el PLGF-1 de tipo silvestre sin péptido- señal. SEQ ID NO:2 secuencia nucleotídica para el PLGF-1 natural. SEQ ID NO:3 secuencia para el oligonucleótido usado como iniciador delantero en el PCR. SEQ ID NO:4 secuencia para el oligonucleótido usado como iniciador reverso en el PCR.

Descripción detallada de la invención. . . . L La invención se basa en el descubrimiento inesperado de que los derivados de la proteína natural PLGF-1 con modificaciones en su secuencia polipeptídica, específicamente en lo referente a la sustitución o eliminación de por lo menos un residuo de cisteína, muestra un fuerte incremento de la estabilidad química, mientras que al mismo tiempo mantiene su actividad biológica original sin variación sustancial.

' Entre los diversos residuos de cisteína, se ha visto que la sustitución o eliminación de un residuo presente en la porción C-terminal, y específicamente en la posición 142 de la secuencia polipeptídica completa, lo que quiere decir que se comprenden tanto la proteína PLGF-1 madura y su correspondiente señal peptídica, es particularmente efectiva. En la forma preferida de la invención el residuo Cys 142 es reemplazado por un residuo de glicina (Gly). Dicha sustitución produce una muteína de la forma monomérica de PLGF-1 que no modifica la capacidad de dimerización y es incapaz de producir productos de multimerización. Así como las modificaciones descritas más arriba, las muteínas de acuerdo a la invención pueden contener eliminaciones mayores, sustituciones o adiciones de uno o más aminoácidos de proteínas silvestres comprobándose que dichas modificaciones no alteran las características funcionales de la muteína propiamente dicha.

En la . forma preferida de la invención el codón correspondiente a la cisteína es sustituido por un codón GGC, GGT, GGA o GGG, todos codificando el aminoácido glicina (Gly). Es preferible la base timidina (T) en la posición 382 (Codón TGC) de la secuencia SEQ ID NO: 1 que es reemplazada por la base guanidina (G) para generar el codón GGC.

La invención incluye un sistema de expresión que comprende la secuencia nucleotídica codificante de la muteína, acompañada de secuencias no transcritas que controlan y regulan la expresión. Este sistema puede ser inducido en células procariontes, ~ preferentemente en células-bacterianas. - - . - La expresión es controlada por un promotor inducible y puede ser inducida por medio de compuestos adecuados. Las células huésped modificadas usando el sistema de expresión visto antes, son también objeto de la invención. Estas células procariontes son preferiblemente células bacterianas tales como E. coli. La invención también cubre procesos para la producción de la secuencia nucleotídica en la que el DNA que codifica la muteína es producida por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando como iniciadores oligonucleótidos que han sido modificados a propósito con respecto de la secuencia proteínica silvestre. Preferentemente el oligonucleótido de la SEQ ID NO:3 es usado iniciador delantero 5'-3' y'el oligonucleótido de la secuencia SEQ ID NO:4 es usado como iniciador reverso 5'-3'. > Las células huésped modificadas mencionadas anteriormente son cultivadas en un medio de cultivo adecuado. Durante el paso de fermentación y antes del paso de la inducción de la expresión, las células , son cultivadas hasta que se alcance una alta densidad óptica (O.D.) del medio de cultivo.

La expresión de la proteína 'es inducida subsecuentemente mediante la adición de agentes de inducción apropiados. Durante los siguientes pasos las células son lisadas para liberar los materiales endocelulares en el medio de cultivo, específicamente el material nucleico y los cuerpos de inclusión, estos últimos son solubilizados y la proteína así obtenida es renaturalizada a la forma dimérica. Los procesos de extracción y purificación pueden comprender pasos opcionales adicionales para la purificación de la proteína dimérica. En una forma preferida el proceso comprende por lo menos un paso adicional de purificación de intercambio iónico o cromatografía de fase reversa. En otra aplicación el proceso comprende una purificación inicial por cromatografía de intercambio añióñico seguida de una cromatografía de fase reversa.. .

La muteína obtenida usando el proceso de producción, extracción y purificación de acuerdo a la invención contiene no menos de un 98.5% de proteína activa y no más de 1 .5% de la forma monomérica. La forma activa se compone esencialmente de la forma dimérica y contiene sólo trazas de la forma multimérica. Pruebas de estabilidad subrayan ' la alta estabilidad durante el almacenaje y durante el procesamiento típico de la muteína en su forma dimérica.

La secuencia polipeptídica completa del factor PLGF-1 humano de 149 aminoácidos, junto con un fragmento de cDNA de 1645 nucleótidos que comprende la secuencia que codifica el factor PLGF-1 , se indican en la patente EP-B-0 550 519. Un plásmido accesible libremente que contiene la secuencia nucleotídica de 1645 bases ha sido solicitado al ATCC con el número de solicitud ATCC 40892.

La secuencia que codifica la pre-proteína está comprendida entre las posiciones 322 y 768 y se indica en esta solicitud como SEQ ID NO: 1 .

PLGF-1 de tipo silvestre en forma de pre-proteína es un polipéptido con 149 aminoácidos que incluye un péptido señal de 18 aminoácidos en la porción N-terminal. La secuencia para la proteína madura, delimitada por las posiciones 19 y 149, se indica en esta solicitud como SEQ ID NO:2. Dicha secuencia comprende 9 residuos de cisteína (Cys) localizados en las posiciones 35, 60, 66, 69, 70, 77, 1 1 1 , 1 13 y 125.

En las muteínas de acuerdo a la invención, por lo menos uno de dichos residuos de cisteína es eliminado o sustituido por otro residuo, siendo la única condición el que la mutación no afecte significativamente o elimine la capacidad de la muteína en su forma morioméricá para generar la actividad biológica y la utilidad .terapéutica de la forma dimérica. Datos experimentales han mostrado que el residuo eliminado o sustituido debe localizarse preferentemente en la porción C-terminal de la proteína y que el residuo óptimo para el propósito de la invención es el de la posición 125.

Las muteínas del factor de crecimiento placentario de tipo silvestre pueden producirse por síntesis utilizando técnicas de síntesis polimérica conocidas en la literatura. Sin embargo el método preferido es la expresión de la proteína en células huésped genéticamente modificadas. Para este propósito las células huésped son transformadas mediante la introducción de un vector de clonación y/o un vector de expresión que comprenda un inserto que corresponda al gen PLGF-1 después de la modificación deseada.

La preparación del DNA que codifica las muteínas de acuerdo a la invención se produce mediante mutagénesis sitio específica e implica puntos de mutación en los codones que corresponden a la cisteína, es decir TGC o TGT. Estas mutaciones pueden ser deleciones o sustituciones de una o más bases, sin causar cambios del marco de lectura por debajo de la mutación. En el caso de deleción un codón completo debe, por tanto, ser removido. De preferencia, la mutación sitio específica es una sustitución puntual de una base en un codón de cisteína con la formación consecuente de un nuevo codón. En este sentido la mutación resultará en la sustitución de un residuo de cisteína por otro ' residuo aminoácido.

Varias técnicas conocidas de mutagénesis sitio específica pueden usarse para preparar el cDNA que codifique la muteína requerida.

Algunos métodos que pueden utilizarse son, por ejemplo, mutagénesis obtenida "con"bl¡goñücleótidos (Adelrhan et al. "DNA" 2:183, ^ 983), mutagénesis por PCR (Leung et al. Technique 1 : 1 1 -15, 1 989) o mutagénesis de cassette (Wells et al. Gene 34:315, 1985).

En una modalidad preferida de la invención, la síntesis del DNA mutante es llevada a cabo utilizando la técnica de mutación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El cDNA que codifica el factor PLFG-1 tipo silvestre descrito en la literatura o cualquier equivalente producido por la degeneración del código genético fue utilizado como templado para el PCR. De preferencia, sólo la porción que contiene la proteína metionilizada en la posición N-terminal con o sin péptido señal será utilizada; por ejemplo, la secuencia reportada en la presente solicitud como SEQ ID NO:1 o sus equivalentes, comprendidas en el vector de expresión pET3P1 GF-1 que corresponde a la proteína sin péptido señal. El oligonucleótido 5'-3'(delantero) complementario a la región que codifica la porción N-terminal de la proteína, y el oligonucleótido 5'-3' (reverso) complementario a la región de la secuencia que comprende el codón de cisteína a ser mutado fueron usados como iniciadores para el PCR. Este último oligonucleótido contendrá la base de sustitución o sustituciones necesarias para introducir la mutación requerida. Los iniciadores usados pueden contener bases adicionales en las regiones terminales 5' y/o 3' para introducir sitios de restricción necesarias para aislar y purificar la secuencia mutada.

El codón correspondiente al residuo de cisteína puede ser sustituido por un codón que codifique cualquier aminoácido neutral ya sea polar como Ser, Thr, Gln, o Asn, o no polar como Gly, Ala, lie o Leu. Los aminoácidos preferidos, son Gly y Ala.

En una modalidad preferida el iniciador delantero está representado por la secuencia identificada como SEQ ID NO: 3, mientras que el iniciador reverso está representado por la secuencia SEQ ID NO:4. Ésta última comprende una sustitución T -> G en la posición 382 de la secuencia SEQ ID NO.1 , una sustitución que transforma el codór TGC de' la cisteína en- la*posición 125 de Ja . SEQ ID NO: 4 en un codón GGC correspondiente a la glicina.

La modificación deseada de cDNA es subsecuentemente cortada e insertada en un vector de expresión bajo el control de un sistema inducible deseado compatible con la célula huésped.

De preferencia se utilizan sistemas de expresión inducibles compatibles con células procariontes. Algunos ejemplos de estos sistemas son: El sistema de expresión pBAD (In Vitrogen BV) en el que la síntesis de proteína se coloca bajo el control del promotor araBAD y puede ser inducido en varias cepas de E. coli usando arabinosa; - - .. * . El sistema de expresión T7 (In Vitrogen BV o Promega) en el que la síntesis de proteína está controlada por el promotor de RNA polimerasa del fago T7 y puede ser inducida utilizando lactosa, isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG) o derivados o análogos equivalentes de éste. En este caso es necesario utilizar derivados de E. coli tipo DE3 (BI21(DE3) o JM109(DE3)), es decir, uno que contenga una copia del gen RNA polimerasa del fago T7 colocado bajo el control de un promotor inducible a lactosa; El sistema de expresión Trc (In Vitrogen BV) en el que la síntesis de proteína es colocada bajo el control del promotor híbrido trc. Este promotor ha sido obtenido mediante fusión del promotor trp con promotores lac y puede ser inducido en varias cepas de E. coli por medio de lactosa o equivalentes similares del mismo(IPTG); El sistema de expresión Tac (Amersham biosciences) en el que la síntesis de proteína está colocada bajo el control del promotor tac. En este sistema, la síntesis de proteína se induce en cepas de E. coli laclq (tipo JM105) por medio de lactosa o equivalentes similares del mismo(IPTG); El sistema de expresión PL en el que la síntesis de proteína es colocada bajo el control del promotor PL y puede ser inducido mediante la adición de triptófano: En este caso, se requiere el uso de cepas de E. coli(GI724) conteniendo una copia del gen que codifica el represor el del fago lambda, bajo el control de un promotor inducible a triptófano.

Obviamente es posible expresar el cDNA modificado que codifica la muteína en células huésped eucariontes derivadas de levadura o de organismos multicelulares. En este caso se seleccionará un sistema de expresión compatible con dichas células.

En una modalidad preferida de la invención la expresión se realiza bajo el control del sistema de RNA polimerasa del fago 17 e inducido con isopropil-B-D-tiogalactopiranosido.

El vector de expresión también comprende secuencias adicionales que codifican las funciones normales necesarias para la clonación, selección y expresión tales como marcadores selectivos y/o sitios de poliadenilación y/o secuencias reguladoras de la transcripción.

Las células huésped son, por lo tanto, transformadas utilizando técnicas estándar bien conocidas por una persona calificada en el arte, con el vector de expresión que contiene el cDNA que codifica la muteína requerida. Estas células pueden ser procariontes, eucariontes, animales, humanas o de plantas, en particular células bacterianas, tales como E. coli, o Bacillus, células de levadura tales como Saccharomyces, o células animales tales como Vero, HeLa, CHO, COS.

El microorganismo preferido es obtenido mediante integración en la cepa disponible comercialmente [B12 (DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) del gen de la muteína humana PLGF-1 .

Las células modificadas utilizadas para producir las muteínas de acuerdo a la invención son almacenadas antes de su uso en forma liofilizada para preservar su capacidad de expresión. Al momento de su uso, el material liofilizado es resolubilizado con un buffer conveniente.

Las células huésped modificadas son entonces cultivadas en un medio de cultivo líquido. Aunque un amplio rango de medios de cultivo es accesible comercialmente y puede ser usado eficazmente, el paso de fermentación de acuerdo a la invención se realiza preferentemente en un medio de cultivo libre de cualquier material de origen humano o animal, para evitar cualquier riesgo de infección. Extractos de levadura (Difco) adicionados con uno o más antibióticos seleccionados son el mejor medio para el proceso. El paso de fermentación puede ser precedido de un paso de pre-inoculación en el que el microorganismo liofilizado es suspendido en el medio de cultivo y sometido a pasos consecutivos de dilución e incubación para obtener una cantidad óptima de células de microorganismos en el cultivo.

La fermentación se realiza en el medio de cultivo visto antes a una temperatura adecuada para el microorganismo, normalmente aproximada a los 37°C en presencia de un porcentaje de 02 disuelto, con respecto a la saturación del aire, entre 20 y 40%, preferiblemente 30%. El pH durante el cultivo se mantiene en valores óptimos para el microorganismo que está siendo utilizado y que normalmente será neutro o ligeramente ácido o alcalino (6.4 o 7.4). Más aun, dado que el proceso de fermentación se realiza bajo agitación, es conveniente el uso de anti-surfactantes.

Conforme progresa la fermentación ésta se acompaña de un incremento en la densidad óptica del medio de cultivo. Por lo tanto, la densidad óptica a 600 nm es el parámetro utilizado de acuerdo a la invención para monitorear el progreso del proceso. La densidad celular y por lo tanto, la densidad óptica alcanzada en el cultivo en el momento en que la expresión es inducida, debe ser lo suficientemente alta para garantizar un alto rendimiento de proteína expresada. Aunque las densidades ópticas de 600nm (OD600)) mayores a 0.2 pueden utilizarse, densidades ópticas mayores a 50 pueden obtenerse gracias a los medios de cultivo empleados. Densidades por arriba de 18 son preferibles para obtener mayores niveles de producción de muteína. Densidades de entre 16 y 20 han dado óptimos resultados. La fermentación es entonces mantenida en las condiciones indicadas arriba hasta que estos valores de densidad óptica son alcanzados, entonces se induce la expresión de la proteína.

Puede emplearse cualquier agente o condición físico-química capaz de inducir los mecanismos de expresión de la muteína heteróloga en las células de los microorganismos que se utilizan. En el caso específico de que se use la cepa bacteriana BL21 (DE3)pLysS modificada con un plásmido de expresión que contenga el promotor del fago T7, la expresión es inducida con lactosa o sus derivados tales como isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG) en una concentración adecuada, esto es aproximadamente 1 mM. La duración de la inducción puede variar de acuerdo a los requerimientos. Pueden obtenerse buenos resultados para períodos de varias horas, de preferencia de 3 a 4 horas; en el proceso óptimo la inducción se mantiene por 3 horas y 20 minutos utilizando un porcentaje de O2 disuelto aproximadamente del 10%.

Se toman muestras de células antes y después de la inducción que son sometidas a técnicas de control analítico tales como electroforesis SDS-PAGE para determinar los resultados de la inducción. 5 Cuando se han alcanzado los niveles requeridos de la expresión de la proteína, se separan las células del medio de cultivo, mediante centrifugación por ejemplo y sometidas ' ~ "a un proceso de extracción. ¦ ¦ ¦ - - - , r .

El proceso de extracción prevé un paso de lisis celular inicial. En efecto, cuando la 0 muteína es expresada en la bacteria, esta permanece segregada dentro de la célula huésped, en la forma de cuerpos de inclusión. El proceso de lisis puede realizarse usando congelación/descongelación, prensa francesa, ultrasonido (sonicación) u otra técnica similar conocida, en soluciones de lisis que contienen concentraciones adecuadas de surfactantes, preferentemente que contengan Tritón X100 en concentraciones entre 0.5% 5 y 1 %. La técnica preferida cuando se utiliza la cepa bacteriana BL21 (DE3)pLysS es la de congelación/descongelación, que en una modalidad óptima es repetida por lo menos en dos ciclos consecutivos.

Dado que la muteína PLGF-1 es liberada en el medio de lisis como fue expresada 0 por la célula huésped, es decir, en la forma monomérica biológicamente inactiva, la lisis es seguida por una renaturalización, que al menos en parte consiste en la dimerización del monómero. La renaturalización de la muteína se obtiene adicionando concentraciones adecuadas de pares óxido-reducción a la solución diluida, seguido por un período de incubación que va de 10 a 30 horas, preferentemente de 18 a 20 horas a una temperatura 5 de entre 10°C y 30°C, preferentemente a 20°C bajo agitación. Ejemplos de estos pares son: cistina/cisteína, cistamina/cisteamina, 2-hidroxietildisulfuro/2-mercaptoetanol o glutatión en forma oxidada y reducida. Esta última representa el agente preferido y es usado, en su forma oxidada en concentraciones que van de 0.1 a 2.5 mM, preferentemente a 0.5 mM y en forma reducida de 0.25 a 6.25 mM, preferentemente a 1 .25 mM.

En el caso en el que la muteína PLGF-1 expresada es liberada en la lisis en la forma de cuerpos de inclusión, el paso de renaturalización es eliminado mediante un pasaje "de solubilización. La fracción-que contiene los.cuerpos de inclusión es solubilizada en un buffer de desnaturalización que contenga agentes conocidos de desnaturalización tales como urea, isotiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina. De preferencia, la solución de desnaturalización es una solución de urea en concentración desnaturalizante, por ejemplo 8M. Para acelerar el proceso de desnaturalización puede ser ventajoso que la fracción que contiene los cuerpos de inclusión se someta a homogeneización o ultrasonido (sonicación). La solución que contiene la proteína es posteriormente diluida con el propio buffer de desnaturalización y/o con una solución diluyente hasta alcanzar una densidad a 280 nm de aproximadamente 0.5 OD280. Las soluciones de dilución adecuadas contienen sales y polietilenglicol (PEG) y tienen un pH alcalino (pH aproximadamente de 8).

La liberación de la muteína PLGF-1 en la lisis se acompaña normalmente por la liberación de varios componentes y sustancias endocelulares del microorganismo por sobre todos los materiales nucleicos que pueden afectar o interferir con el proceso de purificación. Para evitar este problema, la suspensión/solución obtenida directamente de la lisis celular puede someterse a un paso de proceso preliminar opcional adicional que consiste en la fragmentación de dicho material. Este resultado es obtenido por medio de agentes enzimáticos tales como DNAsas (naturales o recombinantes tales como Benzonasa), agentes químicos tales como el ácido deoxicólico o agentes físico-mecánicos como el ultrasonido(son¡cación), agitación rápida con navajas, por ejemplo en una licuadora. La fragmentación física del DNA se produce en volúmenes adecuados de soluciones de lavado que contienen agentes quelantes y detergentes por ejemplo EDTA y Tritón X100 y es preferentemente repetido por un número de ciclos, alternados con la dilución, centrifugación y eliminación del sobrenadante para remover cualquier componente celular o sustancia de la fracción que contiene los cuerpos de inclusión.

Aunque la muteína PLGF-1 después de la renaturalización puede ya ser utilizada " *comó~ tal, es mejor someterla*por lo menos a un paso de purificación usando una de las técnicas conocidas para la purificación de material proteico. Para este propósito, la muteína puede someterse a filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, HPLC, cromatografía de fase reversa y/o electroforesis en gel. Las técnicas preferidas son las cromatografías de fase reversa y la de intercambio iónico. Cuando es necesario obtener un alto nivel de purificación como por ejemplo para uso terapéutico, al menos dos de las técnicas arriba mencionadas son combinadas en secuencia.

La solución que contiene la muteína parcialmente renaturalizada, es decir, por lo menos en parte en forma dimérica, puede cargarse en una resina de intercambio aniónico para enriquecer la mezcla con la forma dimérica y liberarla de contaminantes bacterianos. Puede utilizarse cualquier matriz disponible comercialmente, ya que sus características de capacidad, carga y flujo son compatibles con el proceso industrial. En una forma preferida, una resina de alto flujo por ejemplo la Q-sefarosa Fast Flow (Amersham biosciences) o un equivalente es usada. Las resinas utilizadas permiten cargar amplios volúmenes de solución proteica con proporciones de volumen de carga / volumen de columna que varían de 1 :1 a 10:1. Vol./Vol. Se prefieren proporciones cercanas a 10:1 ya que permiten usar la columna para ser optimizada. El proceso cromatográfico completo puede realizarse ventajosamente de manera automática mediante un sistema controlado por un programa adecuado como el sistema de software director FCPL (Amersham biosciences).

En una variante del proceso descrito arriba, la muteína parcialmente renaturalizada puede ser purificada mediante cromatografía de fase reversa.

En este caso, la solución diluida adecuada que contiene la muteína renaturalizada parcialmente, lo que quiere decir parcialmente en forma dimérica y parcialmente en forma monomérica, puede cargarse en cualquier matriz cromatográfica disponible comercialmente y adecuada para el uso indicado. Preferentemente, una resinares utilizada porque tiene una granulometría tal que garantiza la explotación de la capacidad de absorción de la matriz junto con un fácil empacado de la misma columna. Ejémplos de estas matrices son las resinas RP Source 15 o RP Source 30 (Amersham biosciences). Todas las soluciones de carga, balance, lavado de resina y soluciones de elución son soluciones hidro-orgánicas que contienen diferentes porcentajes de solventes orgánicos. Ejemplos de estas soluciones son las que contienen etanol, metanol, o acetonitrilo. De preferencia se utilizan las soluciones hidroalcohólicas que contienen porcentajes crecientes de etanol. Con mayor ventaja, el proceso de cromatografía de fase reversa se realiza automáticamente mediante un sistema computarizado que opera bajo el control de un programa adecuado, e.g. el sistema Software Director FPCL (Amersham biosciences).

Cuando es utilizada una técnica de purificación o más, una tras otra, la muteína puede obtenerse en una forma activa altamente pura, esto es, con la proteína en forma dimérica esencialmente y sin ninguna contaminación por la forma monomérica. El producto así obtenido contiene no menos del 98.5% de la forma activa y preferentemente no menos del 99.5%. La forma monomérica residual no excede el 1 .5%. Dado que la muteína es químicamente estable, todos los productos de multimerización se limitan a trazas. La proteína pura obtenida de acuerdo al método arriba descrito puede someterse a otras etapas de procesamiento, como por ejemplo la ultrafiltración de membrana. En este caso el producto es filtrado en una membrana con un límite de filtración (corte) más bajo o igual a 30kD y sometido a diafiltración contra agua acidulada con TFA hasta alcanzar un factor de dilución de 1 : 106. El producto final obtenido de esta manera puede ser formulado adecuadamente con aditivos de liofilización y liofilizado para preservar la actividad biológica en niveles óptimos. En una modalidad práctica de la invención, la muteína puede ser adecuadamente extraída, aislada y purificada de acuerdo con el proceso de purificación descrito en la solicitud de patente PCT/IT02/00065 (Geymonat) para purificar la^ próteína PLGF-1 de tipo ^silvestre adaptando las, condiciones de. operación si es necesario.

La estabilidad química de las muteínas PLGF-1 de acuerdo a la invención ha sido evaluada en pruebas en las que la muteína liofilizada y la proteína PLGF-1 de tipo silvestre fueron solubilizadas en solución salina o formulada en un gel y almacenada a una temperatura entre 4 y 8°C por períodos de 40, 170 y 210 días. Los resultados reportados abajo indican claramente que la muteína en su forma dimérica activa es estable en todas las concentraciones analizadas (20, 5 y 1 mg/ml) y no tiende a precipitarse o multimerizarse, se encuentra, por lo tanto, que la concentración permanece en los valores iniciales. Por el contrario, la concentración de la forma dimérica de la proteína de tipo silvestre decae drásticamente después de unos pocos días.

Las muteínas, de acuerdo a la invención, muestran junto con una estabilidad químico-biológica mejorada, una actividad angiogénica comparable con la de la proteína PLGF-1 de tipo silvestre. Esta actividad hace a la muteína PLFG-1 , de acuerdo a la invención, adecuada para todas las aplicaciones cosméticas y terapéuticas de la PLFG-1 natural usualmente conocidas en el estado del arte previo.

La acción angiogénica de las muteínas PLGF-1 de acuerdo a la invención ha sido determinada usando técnicas conocidas realizadas in vivo o in vitro. En particular fueron utilizadas la prueba de vascularización de la córnea de conejo o la prueba de vascularización de membrana corioalantoidea de pollo (CAM), como es descrito por Maglione et al. "II Fármaco", 55, 165-167 (2000).

Un segundo método utilizado para evaluar la vascularización cutánea es el análisis morfométrico computarizado de muestras de piel animal como se describe por Streit et al. (ProcT'Natl. 'Acad: Sci. USA 1999, Diciembre- 2 , 96(26), . 14888-14893). Secciones cutáneas aisladas de animales de laboratorio tratadas o no de acuerdo a la presente invención fueron coloreadas inmuno-histoquímicamente usando anticuerpos monoclonales anti-CD31 para uso animal. Las secciones tratadas de esta manera fueron analizadas bajo un microscopio electrónico para evaluar el número de vasos sanguíneos por mm2, los promedios relativos y el área relativa que ocupaban. El efecto angiogénico de las muteínas en el tejido del miocardio y en particular en el caso de isquemia o infarto al miocardio fue evaluado en un modelo animal de isquemia cardiaca como se describe en Maglione et. al. (supra).

La actividad de las muteínas en el tratamiento de escleroderma de acuerdo a la invención, fue evaluada en un modelo animal como está descrito en Yamamoto T. Et al. In Arch. Dermatol. Res. Nov. 2000, 292 (1 1 ), páginas 535 a 541. Un estado de escleroderma es inducido en ratones C3H con bleomicina (100 mcg/ml) inyectada subcutáneamente a diario durante 3 semanas. Después de 3 semanas, los animales son sacrificados y las muestras de piel de las áreas tratadas se someten a análisis histológico. El efecto del tratamiento muestra eventos histológicos que pueden atribuirse a esclerotización cutánea inducida por la bleomicina y, en particular, adelgazamiento cutáneo y altos niveles de hidroxiprolina.

Los resultados que se reportan más abajo enfatizan la efectividad de las muteínas PLGF-1 de acuerdo a la invención en el tratamiento de todos los estados degenerativos naturales o patológicos que son sujetos a mejora siguiendo un incremento en la vascularización de las áreas involucradas. Una primera aplicación es el tratamiento curativo o preventivo de isquemia y de eventos subsecuentes al daño isquémico. Condiciones consideradas adecuadas para el tratamiento son la isquemia del tejido del miocardio, infarto al miocardio, ictus isquémico y enfermedades crónicas del miocardio, isquemia cerebral e ictus isquémico, isquemia intestinal, isquemia periférica de los limbos. Una segunda aplicación terapéutica es el tratamiento de escleroderma. Esta es una enfermedad que involucra el sistema microvascular, los tejidos conectivos cutáneo y subcutáneo y el tejido conectivo de los órganos internos. La enfermedad induce la activación de los fibroblastos y una producción excesiva de depósito de colágeno perivasal y de tejidos que contribuye fuertemente en la formación de fibrosis y áreas de calcificación y por tanto a la aparición de síntomas inducidos por la enfermedad, en particular puede verse bajo el capilaroscopio una gran cantidad de colágeno esclerotizado que rodea los vasos de la piel, causando restricción al lumen de los vasos. Un escleroderma circunscrito con participación cutánea puede ser distinguido, caracterizada mediante el endurecimiento y adelgazamiento de la piel debida a depósitos inadecuados y excesivos de colágeno, y un escleroderma sistémico progresivo en el que los vasos sanguíneos son asociados a la fibrosis cutánea, junto con una esclerosis sistémica con lesiones a la viscera. La piel, sobre todo, la de dedos y manos se ve endurecida, adelgazada y con edemas. La enfermedad también está presente a nivel del miocardio, con insuficiencia cardiaca, a nivel pulmonar, gastrointestinal, renal y a nivel del sistema osteo-muscular. Algunos paciente también desarrollan artropatías erosivas inducidas por la fibrosis cutánea mismas que se complican fuertemente por la movilidad de las articulaciones. Magione et al reportaron (Solicitud de patente italiana RM2002A0001 19) en relación con el factor PLGF-1 de tipo silvestre, que la promoción de angiogénesis, en particular en piel como resultado del tratamiento con compuestos que contienen PLGF-1 tiene un efecto benéfico en el estado general de la esclerosis inducida por neomicina en ratones. Los mismos resultados se observaron en animales a los que se había inducido previamente escleroderma y se habían tratado con muteínas de acuerdo a la invención.

Una tercera aplicación terapéutica es el tratamiento de apoyo a la curación de quemaduras, úlceras y heridas cutáneas o internas, particularmente en etapas postoperatorias. ¦ * - ·¦ Otra aplicación de acuerdo a la invención se relaciona al fenómeno típico de envejecimiento de la piel. Este tratamiento aunque se considera esencialmente cosmético tiene implicaciones terapéuticas cuando toma en consideración el deterioro precoz del tejido cutáneo debido a la prolongada exposición a la luz solar (fotoenvejecimiento), la radiación u otro tipo de agentes agresivos ambientales/atmosféricos.

El examen de muestras de piel fotodañada bajo un microscopio electrónico muestra una morfología microvascular típica que es caracterizada, entre otras cosas, por la presencia de capilares patológicamente dilatados y arrugados con elastina o rodeados por un material amorfo y denso. Se ha observado que la estimulación de una nueva vascularidad cutánea genera tanto en la piel envejecida naturalmente como en la que envejece precozmente un efecto modulador de la matriz extracelular responsable de la tonicidad y el grueso de la piel. La vascularización capilar incrementada se acompaña por un incremento en los fibroblastos y en la producción de nuevo colágeno que es seguido por un mejoramiento general de la apariencia de la piel.

Otra aplicación de los compuestos de la invención se relaciona con la caída del cabello.

En efecto la vascularización mejorada de la piel, específicamente en el área perifolicular, se acompaña de una modulación del crecimiento de la fijación cutánea (cabello en cabeza, cuerpo, etc.) en el sentido de la prevención de la pérdida de cabello y la promoción de su regeneración. La fase anagénica que corresponde a la fase de crecimiento del cabello. se acompaña de un incremento natural en la vascularización del folículo del cabello. La acción angiogénica local promueve este incremento vascular y el consecuente crecimiento del cabello.-EI análisis tmorfométrico computerizado de secciones de piel próximas a los folículos piliferous de animales tratados con las composiciones de la invención han mostrado no sólo un incremento en las dimensiones del lumen del cabello y en la densidad capilar y por lo tanto un incremento en la vascularidad perifolicular sino también un incremento de las dimensiones del bulbo capilar y del grosor del cabello mismo.

El efecto de la prevención de la pérdida de cabello, por la "promoción de recrecimiento, puede aplicarse no sólo en el caso de la pérdida natural, sino también en el caso de pérdida posterior a estados clínicos significativos tales como alopecia, desórdenes hormonales, quimioterapia, radioterapia o suministro de medicamentos.

Las indicaciones terapéuticas identificadas mas arriba se relacionan a la administración local, sistémica o directa de una muteína del factor PLGF-1. Sin embargo las muteínas de la invención pueden ser usadas también para producir anticuerpos, policlonales, monoclonales, policlonales o fragmentos funcionalmente activos capaces de reconocer el factor PLGF-1 endógeno, específicamente aquellas regiones de la secuencia de aminoácidos que contienen el sitio de enlace para PLGF-1 y el receptor. Los anticuerpos de este tipo son capaces de neutralizar la actividad angiogénica del PLGF-1 y encontrar aplicación en el tratamiento de todas aquellas condiciones caracterizadas por angiogénesis patológica. Algunos ejemplos de estas condiciones son los desórdenes inflamatorios tales como artritis reumatoide, asma, edema, hipertensión pulmonar y la formación y desarrollo de tejidos tumorosos. Los mismos anticuerpos pueden usarse como agentes de inmuno-diagnóstico en métodos para la determinación cualitativa y cuantitativa de la producción de PLGF-1 endógeno. Estos reactivos encuentran su aplicación en el diagnóstico de todos los estados patológicos acompañados de producción anormal de PLGF-1 tales como la formación y el desarrollo de tejido tumorosos.

Los anticuerpos o sus fragmentos capaces de reconocer las muteínas PLGF-1 son preparados siguiendo técnicas bien conocidas, e.g. siguiendo las técnicas descritas en la solicitud WO-A-01/85796 para la producción de anticuerpos específicos para la proteína PLGF-1 de tipo silvestre.

La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen las muteínas descritas antes o los anticuerpos neutralizantes correspondientes como agentes activos o como reactivos de diagnóstico.

Cualquier formulación adecuada para la administración local o sistémica puede ser usada de acuerdo a la invención. En particular, el factor PLGF-1 puede ser administrado parenteralmente con un efecto local o sistémico, o tópicamente en piel o mucosa con efectos principalmente locales. Un efecto sistémico es obtenido principalmente por administración intravenosa aunque la administración intramuscular o intraperitoneal es posible también. Un efecto local se obtiene mediante la administración tópica, o intramuscular, subcutánea, o parenteral interarticular. Las muteínas PLGF-1 pueden también ser administradas a nivel local por electrotransporte de ionoforesis. Los implantes subcutáneos pueden también ser usados cuando el suministro retardado es requerido durante un período de tiempo. La administración oral del factor también es posible aunque es menos fuertemente recomendado en vista de la delicada naturaleza del producto activo.

Las composiciones para el uso parenteral local o sistémico incluyen soluciones, suspensiones, suspensiones de liposoma, emulsiones W/O o O/W. Las composiciones para uso tópico incluyen soluciones, lociones, soluciones de liposoma, emulsiones W/O, O/W, W/O/W, O/W/O, geles, ungüentos, cremas, pomadas y pastas. En una modalidad preferida la sustancia activa es formulada en forma liofilizada, mezcladapcon aditivos de liofilización adecuados y listos para ser resolubilizados utilizando diluyentes terapéuticamente aceptados. Los aditivos de liofilización que pueden usarse son: búffers, polisacáridos, sacarosa, manitol, inositol, polipéptidos, aminoácidos y cualquier otro aditivo compatible con la sustancia activa. En una modalidad preferida de la invención la sustancia activa se disuelve en un buffer de fosfato (NaH2PO4/H2O - Na2HPO4/2H2O) en cantidad tal que la proporción muteína/fosfato después de la liofilización quede comprendida entre 1 :1 y 1 :2. Los diluyentes adecuados para uso parenteral son: agua, solución salina, soluciones de azúcar, soluciones hidroalcohólicas, diluyentes aceitosos, poliaceites tales como glicerol, etileno o polipropilenglicol o cualquier otro aditivo compatible con el método de administración en términos de esterilidad, pH, tensión iónica y viscosidad.

En el caso de emulsiones o suspensiones la composición puede contener agentes surfactantes adecuados de tipo no-iónico, zwiteriónicos, aniónicos o catiónicos comúnmente usados en la formulación de medicamentos. Las emulsiones O/W o W/O/W hidrofílicas son preferentemente de uso parenteral/sistémico mientras que se prefieren ias emulsiones W/O o O/W/O lipofílicas para uso tópico o local.

Más aún, las composiciones de la invención pueden contener aditivos tales como agentes isotónicos, tales como azúcares o polialcoholes, buffers, agentes quelantes, antioxidantes, o agentes antibacterianos.

Las composiciones para uso tópico incluyen formas líquidas o semisólidas. Las primeras comprenden soluciones o lociones. Estas pueden ser acuosas, hidroalcohólicas como etanol/agua, o alcohólicas y son obtenidas mediante solubilizacion de la sustancia liofilizada.

Alternativamente, las soluciones de la sustancia activa pueden formularse como geles mediante adición de agentes de gelificantes tales como: melaza, glicerina, polietilen o polipropilen glicol, poli(met)acrilato, alcohol isopropílico, hidroxiestearato, CARBOPOL®.

Otros tipos de composiciones para uso tópico son emulsiones o suspensiones en forma de pomadas, pastas y cremas. Son preferidas las emulsiones W/O porque proporcionan una absorción mas acelerada. Ejemplos de excipientes lipof Micos son: parafina líquida, lanolina anhidra, vaselina blanca, alcohol cetílico, alcohol estearílico, aceites vegetales, aceites minerales. Agentes que incrementan la permeabilidad de la piel y facilitan por tanto la absorción pueden ser usados ventajosamente. Ejemplos de estos agentes son aditivos fisiológicamente aceptables tales como alcohol polivinílico, polietilenglicol o dimetilsulfóxido (DMSO).

Otros aditivos usados en composiciones tópicas son agentes isotónicos tales como azúcares o polialcoholes, buffers, agentes quelantes, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes adelgazantes, agentes dispersantes.

Las composiciones para uso local o sistémico con suministro retardado durante un período de tiempo pueden ser igualmente usadas, y éstas incluyen polímeros tales como polilactato, poli(met)acrilato, polivinil-pirrolidona, metilcelulosa, carbometilcelulosa y otras sustancias en el arte. Las composiciones de suministro lento en forma de implantes subcutáneos, también pueden ser usados, por ejemplo un polilactato u otro polímero biodegradable.

Aunque la sustancia activa es ya estable en sí misma y está empacada preferiblemente en forma liofilizada, las composiciones farmacéuticas pueden ventajosamente contener'sustancias estabilizadoras adicionales. para las uteínas PLGF-1 en forma dimérica. Ejemplos de estas sustancias son la cisteína, la cisteamina o el glutatión.

La dosificación de muteína depende de la vía de administración y de la formulación seleccionada. Para la administración parenteral las cantidades varían desde 1 mcg/Kg/día hasta 200 mcg/Kg/día. Estas administraciones se obtienen con composiciones farmacéuticas que comprenden de 50 mcg a 30 mg por dosis, preferiblemente de aproximadamente 500 mcg a 10 mcg por dosis. Para aplicaciones terapéuticas tópicas las cantidades varían desde 0.1 mg a 10 mg por gramo de composición han probado ser efectivas. Composiciones locales cosméticas para tratamiento de envejecimiento de la piel o pérdida del cabello comprende preferiblemente de 0.01 mg hasta 0.09 mg de sustancia activa por gramo de composición.

La duración del tratamiento varía de acuerdo a la patología o al efecto requerido. En el caso de tratamiento de escleroderma el período de aplicación varía de 1 día a 12 meses, de acuerdo a la severidad de la patología. En el caso del tratamiento del envejecimiento precoz o natural de la piel el período de aplicación varía de 1 a 400 días, preferentemente por lo menos 30 días. En el caso del tratamiento para prevenir la caída del cabello o para promover el renacimiento del cabello el período de aplicación varía también entre 1 y 400 días.

La invención se describe a continuación a manera de ejemplo con propósitos exclusivamente ilustrativos y no es limitante.

Ejemplo 1. Síntesis del cDNA que codifica la mu teína. La muteína PLGF-1 , que hemos llamado PLGF-1 CG, fue generada por mutación de la timidina (T) número 382 (SEQ ID NO:1 ) a guanidina (G). De esta manera el codón TGC, nucleótidbs 382-384" de la secuencia arriba indicada, que codifica una cisteína se transformó en GGC que codifica una glicina.

Desde el punto de vista del aminoácido la cisteína mutada en glicina en la muteína PLGF-1 CG está en la posición 125 de la secuencia SEQ ID NO:2.

Para la síntesis del DNA que codifica la muteína, la técnica de PCR (reacción en cadena de polimerasa) fue utilizada. Se utilizó el vector de expresión pET3PLGF-1 que codifica la proteína metionil PLGF-1 sin péptido señal (EP-A-0 550 519), como templado para la PCR. En la práctica esta es la proteína PLGF-1 de tipo silvestre sin los primeros 18 aminoácidos (péptido señal) y con una metionina en posición 1 (N-terminal) (SEQ ID NO:2). Los oligonucleótidos usados como iniciadores son los siguientes: Oligol (iniciador delantero) con la secuencia 5'-CTGGC GCATATGCTGCCTGCTGTGCCC-3'. Este contiene un sitio Ndel (subrayado) y el codón de inicio (en negritas); Oligo2 (iniciador reverso) con la secuencia 5'- GGTTACCTCCGGGGAACAGCATCGCCGCCCC-3'. Contiene una mutación T->G (nucleótido subrayado y en negritas) que transforma el codón TGC que codifica una cisteína en el codón GGC (en negritas) que codifica una glicina.

La cadena nucleotídica obtenida después de realizar la PCR con un Gene Cycler BioRad se somete a una reacción complementaria (llenado)y posteriormente es digerida con la enzima de restricción Ndel. El fragmento obtenido con las terminaciones rasuradas Ndel fue clonado en correspondencia con las terminaciones rasuradas Ndel del vector de expresión procarionte pET3 de acuerdo a protocolos estándares. De esta manera fue creado el plásmido PLGF1 CG que codifica la muteína conocida como PLGF-1 CG. Éste plásmido fue usado de acuerdo a-técnicas. conocidas de transformación de la cepa de E. coli [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) y produce la cepa huésped [B12(DE3)pl_ysS PLGF-1 CG]. La técnica de construcción usada para este plásmido está presentada en la figura 5.

Ejemplo 2. Producción, extracción y purificación de la muteína PLGF-1 CG. El microorganismo [BI21 (DE3)pl_ysS PLGF-1 CG] ha sido cultivado en un termentador usando como medio de cultivo la solución SBM que contiene: Solución A (por 1 litro) Extracto de levadura Bacto (Difco) 34 g Sulfato de amonio 2.5 g Glicerol 100 mi H2O q.s. para: 900 mi Solución B (10 X) (por 100 mi) KH2PO4 1 ,7 g K2HPO4 -3H2O 20 g o K2HPO4 15.26 g H2O q.s. para: 100 mi Se mezclan las soluciones A y B en forma estéril al momento de usarse.

La expresión es inducida por medio de IPTG (isopropil-B-D-tiogalactopiranosido) 1 mM.

La fermentación es precedida por un paso de pre-inoculación. Se toma un tubo de microorganismo liofilizado y se suspende en 1 ml de SBM + 100 pg/ml ampicilina + 34 pg/ml cloranfenicol, la suspensión es nuevamente diluida e incubada a 37°C por una noche. Después de la dilución en la misma- solución -SBM -adicionada con ampicilina y cloranfenicol, el pre-inoculado es dividido en cuatro matraces Erlenmeyer. El contenido de cada matraz Erlenmeyer es incubado a 37°C por 24 horas. El contenido de los 4 matraces Erlenmeyer se mezclan y se leen a OD600, diluyendo 1/20 en agua (50 µ? + 950 µ? agua).

Se centrifuga un volumen establecido de pre-inoculación durante 10 min. a 7,500 x g a 4°C en tubos estériles. Entonces sé resuspende la bacteria en 20 mi SBM + 200 µg/ml ampicilina + 10 pg/ml cloranfenicol por litro de fermentación, mediante agitación a 420 rpm a T.A. durante 20 minutos.

La fermentación se realiza en la solución SBM que contiene 200ug/ml de ampicilina, 10 pg/ml de cloranfenicol y una cantidad adecuada de agente anti-espumante, a una temperatura de 37°C en presencia de (30%) O2 disuelto y un valor de pH de entre 6.4 y 7.4.

La inducción comienza cuando el medio de cultivo alcanza una densidad óptica de 600 nm (OD600) de entre 16 y 20 unidades.

El agente de inducción usado es IPTG 1 mM en presencia de 10% de O2 disuelto (con respecto a la saturación del aire). La duración de la inducción es aproximadamente de 3 horas. La inducción es controlada mediante la realización de electroforesis SDS-PAGE, cargando 20 µ? de la solución de antes y después de la inducción previamente hervida.

El medio de cultivo que contiene la bacteria inducida es entonces centrifugada a 7,500 x g por 10 min. ó a 3000 x g por 25 min. a 4°C y se descarta el sobrenadante.

Las células bacterianas son posteriormente sometidas a lisis seguida de extracción y purificación de los cuerpos de inclusión. La lisis bacteriana se realiza mediante 2 ciclos de congelación/descongelación a -80/37°C en una solución de lisis conteniendo 1 mM Mg2S04 + 20mM Tris-HCI pH8 + 1 % Tritón X100.

La mezcla de lisis se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos bajo agitación (250 RPM) y luego se vacía en un mezclador de capacidad adecuada, diluyendo con una cantidad de solución de lavado que contenga 0.5% tritón X100 + 10 mM EDTA pH 8, equivalente a 3 mi por 450 OD600 de bacteria.

Si es necesario se agregan 0.4 µ? de agente anti-espumante sin diluir por cada mililitro de muestra.

La solución se mezcla a máxima velocidad por un minuto o hasta que la muestra sea homogénea. El contenido del mezclador se transfiere a un contenedor de capacidad adecuadá, diluyéndolo adecuadamente con 6.5 mi de solución de lavado por cada 450 OD600 de bacteria, la suspensión obtenida así se centrifuga a 13,000 x g por 45 min. a 25°C y se descarta el sobrenadante.

El proceso de lavado completo se repite por número de ciclos hasta obtener una pastilla final que contenga los cuerpos de inclusión de la proteína expresada.

Enseguida, la pastilla que contiene los cuerpos de inclusión se solubiliza en 7 mi del buffer desnaturalizante BD (8M urea, 50 mM Tris pH 8, Etilendiamina 20mM), entonces se diluye la solución para dar la concentración final de urea a 5M. La renaturalización de la proteína se realiza en la solución obtenida de esta manera por la adición de glutatión reducido (concentración final 'equivalente a- 1 .25 mM) .y glutatión oxidado (concentración final equivalente a 0.5 mM) e incubación a 20°C por 18 a 20 horas bajo agitación.

Al final del período de incubación se centrifuga por 10 min. a 20°C, 10,000 x g, y se filtra a través de filtros de 0.45 o 0.8 µ??.

La muteína en su forma renaturalizada, i.e. en forma dimérica, es sometida a purificación por cromatografía de intercambio aniónico.

La solución de muteína se carga en una resina Q-Sefarosa Fast Flow (Amersham-biosciences) equilibrada con buffer A (20 mM Etanolamina-HCI pH 8.5) y eluida, después de lavada, con 20% buffer B (buffer A + 1 M NaCI), correspondiente a una concentración de NaCI de 200mM.

La muteína parcialmente purificada se somete a un grado más alto de purificación mediante cromatografía de fase reversa. Para este propósito el pico de elución de la cromatografía de intercambio iónico es diluido 1.5 veces y contiene 15% de etanol y 0.3% TFA. La adición de estas sustancias incrementa la unión de la muteína a la resina de fase reversa.

La solución es cargada en una resina Source RP (Amersham-Biosciences) con un diámetro promedio de 15 o 30 micrones balanceada con una solución que contenga 40% de etanol y 0.1 % TFA. La solución de lavado remueve la forma monomérica de la muteína mientras que la forma dimérica es eluida en un gradiente de etanol creciente hasta alcanzar un porcentaje de 70% de etanol.

El proceso de purificación de cromatografía es monitoreado controlando la absorción a 280 nm de las fracciones eluidas. La solución dimérica obtenida de esta manera se almacena a -20°C y posteriormente es ultradiafiltrada y liofilizada de acuerdo a técnicas conocidas.

Ejemplo 3. I. Estudio de estabilidad en la muteína PLGF-1CG produciendo la sustitución de Cys 125 por Gly. La muteína PLGF-1 CG se solubilizó en solución salina a concentraciones teóricas de 20, 5 y 1 mg/ml. Simultáneamente la proteína PLGF-1 (sin mutación) fue también solubilizada en solución salina a una concentración de 20 mg/ml. Todas las muestras fueron almacenadas en el refrigerador (4-8°C) por mas de 40 días.

La concentración real fue determinada calculando el promedio de los valores obtenidos de 3 diluciones independientes. El método usado fue el de espectrofotometría utilizando una longitud de onda de 280nm y conociendo que una absorbencia de 1 OD (densidad óptica) medía una celda con una vía óptica estándar de 1 cm, corresponde a una concentración de PLGF-1 y PLGF-1 CG equivalente a 1 mg/ml. Durante los días siguientes al inicio del experimento (tiempo 0 en la tabla 1 ) antes de realizar las diluciones para determinar concentración, una alícuota de cada muestra se centrifugó a 13 000 rpm in una microcentrífuga ALC 4212 por 10 minutos y el sobrenadante fue utilizado para posteriores análisis. De este modo se eliminaron posibles precipitados y, consecuentemente, los resultados se refieren sólo a la proteína remanente en la solución.

Los resultados de este estudio se ilustran en la tabla 1 y muestran claramente que la muteína, en todas las concentraciones analizadas (20, 5, y 1 mg/ml) y por lo menos después de 40 días, es estable en cuanto a que no tiende a precipitarse, mientras que la concentración permanece en los valores iniciales.

De manera contraria, después de 4 jdías de almacenamiento sólo el 7.8% de la proteína sin mutación, almacenada en una concentración de 20 mg/ml en las mismas condiciones que la muteína, permanece en la solución. Este valor baja aún más (5.5%) después de 12 días. Es importante notar que aún después de 24 horas de almacenamiento a 4-8°C ya se ha visto abundante precipitación de proteína PLGF-1.

Tabla 1.

S.D. = Desviación estándar N.A. = No Analizado El perfil de electroforesis (composición monómero-dímero-polímero) para la muteína PIGF-1 CG (Figura 1 ) es también sustancialmente estable a las condiciones arriba señaladas. En efecto, la electroforesis SDS-PAGE en condiciones no reductoras de la proteína PIGF-1 CG solubilizada en solución salina a 20 mg/ml y congelada (control, línea 1 de la figura 1 )>o almacenada a 4-8°C por 40 días (muestra, línea 2 de la figura 1 ), revela "sustancialmente solo alteraciones mínimas, representadas por la desaparición de la pequeña porción monomérica y por la formación de una cantidad extremadamente bajá de trímero (<0.5% del dímero).

Ejemplo 4. II. Estudio de estabilidad en la muteína PLGF-1CG formulada en gel. La muteína PIGF-1 CG y la proteína PIGF-1 sin mutación fueron solubilizadas a una concentración de 0.2 mg/ml en un gel compuesto como sigue: CARBOPOL 940 = 1 % P/V Acetato de Sodio pH 4.4 = 15 mM Sal disódica de EDTA no pHatada = 0.04% P/V Metil parabeno = 0.05% P/V Ajusfando a un pH de entre 5.5 y 6 usando NaOH/ácido acético.

Los 2 geles fueron almacenados a 4-8°C. En varias ocasiones se tomaron y pesaron, por duplicado, porciones de los 2 geles (aproximadamente 0.2ml) en balanzas analíticas.

Las muestras pesadas fueron adicionadas con un volumen expresado en microlitros de un buffer de muestra 2x no reductor, equivalente al peso expresado en miligramos de la porción de gel.

Después de agitación con vortex por 10 minutos y de un centrifugado a 13,000 rpm (ALC 4214 microcentrífuga) por otros 10 minutos, sé eliminó el sobrenadante. Esto fue centrifugado nuevamente y se removió el nuevo sobrenadante. Una porción de este último, junto con estándares de cantidad fue analizada mediante electroforesis SDS-PAGE no reductora. Después de la coloración los geles de electroforesis fueron analizados üsáñdo ;un*densiómetro .para. encontrar la concentración de la forma dimérica de las muestras analizadas.

Los resultados obtenidos en varias ocasiones y expresados como porcentaje del dímero con respecto a ese presente a tiempo cero, se indican en la tabla 2 y se representan gráficamente en" la Figura 2. A partir de estos datos puede observarse que mientras que la cantidad de dímero PIGF-1 CG permanece constante hasta el final de los 170 días analizados, la PIGF-1 baja a 71 % después de 150 días, y a 55% después de 210 días.

El perfil electroforético (composición monómero-dímero-polímero) también muestra que la muteína PLGF-1 CG es sustancialmente estable en las condiciones arriba mostradas (Figura 3). En efecto, la electroforesis SSD-PAGE en condiciones no reductoras de la proteína PLGF-1 CG solubilizada en gel carbopol a 0.20 mg/ml y congelada (control línea 2 de la figura 3) o almacenada entre 4 y 8°C durante 170 días (muestra, línea 1 de la figura 3) no revela ningún fenómeno de polimerización. De manera contraria, estos fenómenos de multimerización son claramente evidentes para la muteína PLGF-1 no mutada como se ilustra en la figura 4 (comparar línea 1 - proteína almacenada entre 4-8°C por 150 días, con la línea 2 - proteína congelada).

Tabla 2.

N.A.= no analizado Ejemplo 5. Evaluación de la actividad angiogénica de la muteína PLGF-1CG. La actividad angiogénica de la muteína PLGF-1 CG del factor PLGF-1 tipo silvestre y, como referencia positiva, del factor de crecimiento del fibroblasto (bFGF) fueron comparados usando la prueba de vascularización de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) ya descrita por Maglione et al ("II Fármaco" supra). Varias cantidades de la muteína y del factor de tipo silvestre (entre 0 y 3 mcg/esponja) fueron absorbidas en 1 mm3 de esponja gelatina y después implantadas en la superficie de CAM. Después de 12 días, fueron seccionadas y coloreadas las regiones CAM en contacto con las muestras y el efecto angiogénico fue cuaptificado usando la técnica morfométrica conocida como "conteo de puntos" ("point counting").

Específicamente, las secciones CAM fueron analizadas al microscopio en un soporte con 144 puntos de intersección y los puntos de intersección ocupados por capilares en una sección transversal (porcentaje del área que es vascularizada). Los resultados, ilustrados en la figura 6, muestran esencialmente, actividad angiogénica equivalente para la muteína y para el factor de tipo silvestre.

Ejemplo 6. Evaluación del efecto de la muteína PLGF-1CG en* isquemia cardíaca inducida por isoprenalina. El efecto de la muteína PLGF-1 CG en isquemia cardiaca e infarto fue evaluado en isquemia inducida en un modelo animal por medio de isoprenalina como fue descrito por Maglione et al (supra) con relación al factor de tipo silvestre. El experimento se realizó en conejos que fueron tratados con una única dosis diaria de 160 mcg/Kg de muteína o solo con volúmenes equivalentes de excipiente administrados por vía intravenosa en los días 1 a 5. la isoprenalina se administró subcutáneamente en los días 1 y 2. Las características típicas del electrocardiograma (ECG) que indican el daño isquémico principal tal como la inversión de la onda T, ampliación de la onda S, y prominencia de la onda Q, fueron decididamente más marcadas en animales tratados únicamente con el excipiente que en los animales tratados con la muteína bajo estudio.

Las variaciones en el EGC de los animales tratados y no tratados fueron evaluados en un rango de escala de cero a seis como se reporta más abajo: 0, sin lesión; 1 prominencia de la onda S; 2 prominencia de la onda T; 4, ampliación de la onda S; 5, inversión de la onda T; 6, prominencia de la onda Q. El área total bajo la curva definida por los puntos del ECG durante los 5 días de la prueba fue igualmente calculada para animales tratados o no tratados. Los resultados se ilustran en la figura 7 y muestran una significativa reducción del daño isquémico en los animales tratados con la muteína PLGF-1 CG. Los resultados mostrados en el perfil electrocardiográfico se confirmaron mediante observación micro y macroscópica de los tejidos isquémicos. Dicha observación muestra la observación de lesiones isquémicas y alteraciones histológicas de severidad moderada comparadas con las observadas en el tejido cardiaco de los animales tratados únicamente con el excipiente. 5 — - Ejemplo 7. Evaluación del efecto de la muteína PLGF-1CG en escleroderma por neomicina-inducida. En este estudio se utilizó el modelo de escleroderma animal descrito por Yamamoto et al (supra). 10 Un primer grupo de ratones C3H fue tratado con bleomicina (100 mg/ml) inyectada diariamente vía subcutánea por 3 semanas. Otros tres grupos de ratones C3H fueron igualmente tratados como se indica, pero 0.1 , y 1 a 10 mcg/ml de muteína PLGF-1 CG fue adicionada a la inyección diaria, respectivamente. Después de 3 semanas de tratamientos „ 15 los animales fueron sacrificados, se tomaron muestras de piel de las áreas tratadas y se sometieron a análisis histológico. El efecto del tratamiento con PLGF-1 CG a 1 y 10 mcg/ml y no el de 0.1 mcg/ml produjo una significativa reducción de los eventos histológicos atribuidos a la esclerotización cutánea inducida por la bleomicina. En particular el .endurecimiento de la piel y los niveles de hidroxiprolina disminuyeron significativamente en 20 relación con los ratones que fueron tratados sólo con bleomicina.

Ejemplo 8. Composiciones farmacéuticas. i) Solución para uso parenteral. 58 miligramos de muteína liofilizada conteniendo 25 mg de PLGF-1 CG pura y 33 25 mg de buffer fosfato (10 mg de NaH2PO4/H2O y 23 mg Na2HPO4/2H2O),y aproximadamente 125 mi de solución salina para uso parenteral son empacadas separadamente en recipientes que permitan mezclar el producto liofilizado con el diluyente de forma previa inmediata a su uso. La concentración de la sustancia activa que resulta de la solubilización es de aproximadamente 0.2 mg/ml. ii) Composición tópica tipo qel. Una cantidad de sustancia liofilizada conteniendo 10 mg de sustancia activa se agrega a 20 -mi de solución hidroalcohólica de etanol al 10% que contenga 20% DMSO. Entonces se adiciona un excipiente de gel adecuado conteniendo los siguientes -ingredientes: 1 % carbopol 940, acetato de sodio 15 mM (pH 4.4), 0.04% p/v EDTA disódico, 0,05% p/v metll parabeno con un pH final comprendido entre 5.5 y 6.

Listado de secuencias. No. de secuencias: 4 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1. (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 418 pares de bases. ., (B) TIPO: ADN. (vi) FUENTE ORIGINAL: " " ' ¦ ¦ (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Muteína PLGF-1 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: (10)....(408) (D) OTRA INFORMACIÓN: El DNA codificante para el péptido señal está ausente. Los nucleótidos 10-408 codifican para los aminoácidos 19-149 de la proteína descrita en la reivindicación no. 1 de la solicitud EP 0550519. SEQ ID NO: 1 . CTGGCGCAT ATG CTG CCT GCT GTG CCC CCC CAG CAG TGG GCC TTG TCT GCT 51 Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala 1 . 5 10 GGG AAC GGC TCG TCA GAG GTG GAA GTG GTA CCC TTC CAG GAA GTG TGG 99 Gly Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp 15 ¦ 20 25 30 GGC CGC AGC TAC TGC CGG GCG CTG GAG AGG CTG GTG GAC GTC GTG TCC 147 Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser 35 40 45 GAG TAC CCC AGC GAG GTG 'GAG CAC ATG TTC AGC CCA TCC TGT GTC TCC 195 Glu Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser 50 55 60 CTG CTG CGC TGC ACC GGC TGC TGC GGC GAT GAG AAT CTG CAC TGT GTG 243 Leu Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val 65 70 75 CCG GTG GAG ACG GCC AAT GTC ACC ATG CAG CTC CTA AAG ATC CGT TCT 291 Pro Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys lie Arg Ser 80 85 90 GGG GAC CGG CCC TCC TAC GTG GAG CTG ACG TTC TCT CAG CAC GTT CGC 339 Gly Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg 95 100 105 110 TGC GAA TGC CGG CCT CTG CGG GAG AAG ATG AAG CCG GAA AGG TGC GGC 387 Cys Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly 115 120 125 GAT GCT GTT CCC CGG AGG TAA CCCAGGATCC 418 Asp Ala Val Pro Arg Arg 130 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 2. (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 aminoácidos. (B) TIPO: aminoácidos (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens SEQ ID NO: 2. Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn 1 5 10 15 Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg 20 25 30 Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr 35 40 . 45 Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu 50 55 60 Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val 65 70 75 80 Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys lie Arg Ser Gly Asp 85 90. 95 Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu 100 105 110 Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala 115 120 125 Val Pro Arg Arg 130 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3. (i) ... CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 bases. * ' ' - ¦ ... (B) TIPO: ADN. (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Secuencia Artificial (ix) CARACTERÍSTICAS: (D) OTRA INFORMACIÓN: Iniciador delantero para la amplificación por PCR de PLGF-1 humano. Los nucleótidos 7-10 codifican para el sitio de restricción Ndel. Híbrida con la cadena antisentido. SEQ ID NO: 3. CTGGCGCATA TGCTGCCTGC TGTGCCC . 27 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4. (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 bases. (B) TIPO: ADN. (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Secuencia Artificial (ix) CARACTERÍSTICAS: (D) OTRA INFORMACIÓN: Iniciador reverso para la amplificación por PCR de PLGF-1 . El nucleótido 29 es C en lugar de T presente en la posición 382 de la SEQ ID No: 1 . La sustitución de T por C conduce a una mutación de Cys a . Gly en la proteína codificada. SEQ ID NO: 4. GGTTACCTCC GGGGAACAGC ATCGCCGCCC C 31

Claims (1)

1. Reivindicaciones 1. Una muteína de forma monomérica del factor de crecimiento placentario tipo 1 ya sea humano o animal (PLGF-1 ) caracterizada porque involucra la sustitución o eliminación . en la secuencia polipeptídica de la proteína silvestre de por lo menos un residuo de cisteína (Cys) y donde dicha sustitución o eliminación no afecta la formación del ^ dimero biológicamente activo^ y sí previene la multimerización de dicha forma monomenca. 2. La muteína, de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque el residuo Cys reemplazado o eliminado está localizado en la porción C-terminal de la secuencia polipeptídica de la proteína. 3. La muteína de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque involucra la sustitución o la eliminación del residuo Cys en la posición 142 de la secuencia polipeptídica de la pre-proteína, correspondiente a la cisteína en la posición 125 de la SEQ ID NO: 2. 4. La muteína de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque el residuo Cys en la posición 142 es reemplazado por un residuo de glicina (Gly). 5. La muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la forma de una pre-proteína o proteína madura. 6. La muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que es eliminado, reemplazado o adicionado uno o más aminoácidos de la proteína de tipo silvestre sin alterar las características funcionales de la muteína. 7. La muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma dimérica. 8. La muteína de acuerdo a la reivindicación 7, comprendiendo al menos 98.5% de la forma dimérica. 9. Una secuencia nucleotídica que comprende el DNA que codifica la muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 10. La secuencia nucleotídica de acuerdo a la reivindicación 9 caracterizada porque el codón TGC o TGT en la secuencia que codifica el PLGF-1 tipo silvestre es eliminado o modificado. 1 1 . La secuencia nucleotídica de acuerdo a la reivindicación 10 en la que el codón TGC o TGT se sustituye por el codón GGC, GGT, GGA, o GGG. 12. La secuencia nucleotídica de acuerdo a la reivindicación 1 1 en la que la base timidina ~~ en i la-posicióa 382 de la secuencia SEQ ID NO:1 , o sus derivados causados por degeneración del DNA es sustituida por la base guanidina. 13. Un sistema de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, flanqueada por secuencias no traducidas para el control y regulación de la expresión. 14. El sistema de expresión de acuerdo a la reivindicación 13 caracterizada porque es un sistema de expresión inducible en células bacterianas. 15. El sistema de expresión de acuerdo a las reivindicaciones 12 a 14 caracterizada porque la expresión está bajo el control de un promotor inducible. 16. El sistema de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque es el sistema de expresión de la RNA polimerasa del fago T7 y porque es inducido por medio de lactosa, isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG) o un equivalente funcional análogo. 17. Una célula huésped transformada mediante el sistema de expresión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16. 18. La célula de acuerdo a la reivindicación 17, caracterizada porque es una célula bacteriana. 19. La célula bacteriana de acuerdo a la reivindicación 18 caracterizada porque se deriva de una cepa de E. coli. 20. Un proceso para la producción de .la secuencia nucleotídica acorde a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizada porque el DNA que codifica la muteína es producido por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando como iniciadores oligonucleótidos que han sido modificados adecuadamente con respecto a la secuencia nucleotídica de tipo silvestre. 21 . El proceso de acuerdo a la reivindicación 20 en la que el oligonucleótido con la secuencia SEQ ID NO: 3 es usado como iniciador delantero 5'-3' y el oligonucleótido con la secuencia SEQ ID NO:4 es usado como iniciador reverso 5'-3'. ~-22. El -proceso de acuerdo a la reivindicación 21 en la que la secuencia de DNA que codifica la proteína PLGF-1 sin el péptido señal es usada como ün* templado en la reacción en cadena de polimerasa. 23. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 en la que la secuencia de DNA obtenida en la reacción en cadena de polimerasa se somete a una reacción complementaria, digerida con enzimas de restricción adecuadas y clonada en un vector adecuado. 24. Un proceso para la producción y extracción de una muteína del factor PLGF-1 caracterizado porque las células huésped de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 son cultivadas en un medio de cultivo adecuado, la expresión de la proteína es inducida usando un inductor conveniente, las células son aisladas y lisadas y la muteína es extraída de la mezcla de lisis. 25. El proceso de acuerdo a la reivindicación 24 en el que el medio de cultivo comprende uno o más agentes de selección, extracto de levadura, glicerol y sales de amonio y se encuentra libre de materia de origen animal o humana. 26. El proceso de acuerdo a la reivindicación 24 o 25 en el que las células son cultivadas antes del paso de inducción de la expresión hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) del medio de cultivo de entre 0.2 y 50 unidades a 600 nm. 27. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 en el que se induce la expresión usando lactosa, isopropil- -D-tiogalactopiranoside (IPTG) o cualquier equivalente análogo. 28. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 en el que la lisis celular se realiza mediante congelación/descongelación, prensa francesa o técnicas equivalentes. 29. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 en el que los cuerpos de inclusión producidos durante la lisis son aislados mediante, por lo menos, 5 dos ciclos de centrifugado y lavado en un buffer adecuado. ~ "30. -El proceso desacuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29 en el que los cuerpos de inclusión son solubilizados en un buffer desnaturalizado^ que contiene urea, isotiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina u otro agente desnaturalizante, y son, opcionalmente, homogeneizados o sonicados. 0 31 . El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en el que después de que los cuerpos de inclusión fueron solubilizados, se diluye la solución y se renaturaliza el material proteico en forma dimérica mediante la adición de agentes óxido-reductores a la solución e incubación por un periodo de entre 10 y 30 horas de preferencia a una temperatura entre 10°C a 30°C, preferentemente a 20°C bajo 5 agitación. 32. El proceso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31 que comprende por lo menos un paso de purificación de proteína dimérica. 33. El proceso de acuerdo a la reivindicación 32, en el que el paso de purificación consiste en una cromatografía de intercambio iónico. 0 34. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 32 o 33, en el que la solución producida por el paso de renaturalización es puesta en una columna de intercambio aniónico con una proporción de volumen de carga / Volumen de Columna de 1 :1 a 10:1 , preferentemente 10:1 . 35. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33 que comprende 5 un paso de purificación de columna mediante cromatografía de fase reversa. 36. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24 a 35 que comprende un pasaje de ultrafiltración adicional seguido por liofilización en presencia o en ausencia de aditivos adecuados. 37. La muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para usarse en un método de tratamiento terapéutico. 38. La muteína de acuerdo a la reivindicación 37 para el tratamiento de enfermedades isquémicas. 39— La muteína de acuerdo a la reivindicación 38 para el tratamiento de isquemia del tejido del miocardio, el infarto al miocardio, ictus isquémico y enfermedades crónicas de isquemia de miocardio, isquemia cerebral e ictus isquémico, isquemia intestinal, isquemia periférica de los limbos. 40. La muteína de acuerdo a la reivindicación 37 para el tratamiento de escleroderma. 41 . La muteína de acuerdo a la reivindicación 37 para el tratamiento de úlceras cutáneas, heridas, quemaduras, tratamiento post-operatorio. 42. La muteína de acuerdo a la reivindicación 37 para el tratamiento de envejecimiento natural o prematuro de los tejidos cutáneos. 43. La muteína de acuerdo a la reivindicación 37 para el tratamiento de la caída natural o patológica, de cabello. 44. Un anticuerpo policlonal, monoclonal, o un fragmento funcionalmente activo del mismo, capaz de reconocer la muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, capaz de reaccionar de manera cruzada con el PLGF-1 de tipo silvestre y de neutralizar su actividad angiogénica. 45. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 44 como un medicamento para neutralizar la actividad angiogénica del PLGF-1 en el tratamiento de formas patológicas acompañadas de producción aberrante de PLGF-1 . 46. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 44 para el tratamiento de formas de tumor. 47. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 44 como reactivo en un método para el diagnóstico de formas patológicas acompañadas de producción aberrante de PLGF-1 endógena. 48. Una composición farmacéutica que contiene la muteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 o el anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 44 y un excipiente farmacológicamente aceptable. 49. La; composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 48 adecuada para uso - parenteral, tópico^qral, nasal o de implante. 50. Una composición cosmética que contiene la muteína de acuerdo a cualquiera de las · reivindicaciones 7 u 8 y un excipiente cosméticamente aceptable. 51 . Un método para la preparación de la composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 48 o de la composición cosmética de acuerdo a la reivindicación 50, en el que la muteína PLGF-1 se asocia con un excipiente farmacológica o cosméticamente aceptable y con otros aditivos usuales.