DE19748734A1 - Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie sowie Verwendung der gewonnenen Dimere - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie sowie Verwendung der gewonnenen DimereInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von biologisch
aktiven Dimeren von rekombianten humanen Wachstumsfaktoren. Bei
der aktiven Form der Wachstumsfaktoren der Cystein-Knoten-Fami
lie handelt es sich um Homo- oder Heterodimere, die durch zwei
Disulfidbrücken kovalent verbunden sind.
Die meisten Gene der in Rede stehenden Wachstumsfaktoren beste
hen aus mehreren Exons. Bekannt ist, daß das Expressionsprodukt
eines Gens verschiedene Proteine umfassen kann, was möglicher
weise auf unterschiedliches Herausschneiden von Intron-RNA-Se
quenzen beziehungsweise unterschiedliche Spleißformen zurückzu
führen ist. So wurden beispielsweise für VEGF-A die Formen
VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 und VEGF206 beschrieben, die
homogenisch bzw. aus einem Gen abgeleitet sind, vgl. Charnock-
Jones et al. 1993. Im folgenden sollen unter Homodimeren nur ho
mogenische Homodimere aus zwei identischen Peptidketten verstan
den werden. Alle aus unterschiedlichen Peptiden zusammengesetz
ten Proteine, und zwar sowohl aus homogenischen als auch aus he
terogenischen Peptiden, sollen als Heterodimere verstanden wer
den.
Die Herstellung von biologisch aktiven dimeren Wachstumsfaktoren
ist bisher ein sehr aufwendiger Prozeß mit geringer Ausbeute,
wozu beispielsweise auf die Gewinnung von PDGF (Platelet-derived
growth factor) verwiesen werden kann; Hoppe et al. 1989. So
sieht die bekannte PDGF-Gewinnung im wesentlichen folgende Maß
nahmen vor:
- (i) Solubilisierung aus den Zelleinschlußkörpern mit 8 M Harn stoff oder 6 M Guanidinium-HCI in Gegenwart eines Reduktionsmit tels,
- (ii) Schützen der freien Thiolgrupen durch Sulfonierung,
- (iii) 4-stufiges Reinigen und Rückfalten der (biologisch inakti ven) Monomeren.
- (iv) Schließlich Dimerisierung der Monomeren in Gegenwart von Glutathion mit Reinigung der Dimeren und Abtrennung von nicht umgesetzten Monomeren.
Die Ausbeute des Dimerisierungsschrittes allein beträgt nur etwa
10%; Hoppe et al. 1989.
Das für PDGF bekannte Verfahren läßt sich bekanntlich auch auf
die Wachstumsfaktoren VEGF-A (Vascular endothelial growth
factor) und PlGF-1 (Placenta growth factor) als Beispiel für
weitere Vertreter aus der Familie der Cystein-Knoten-Proteine
übertragen; Birkenhäger et al. 1996. Abgesehen von der wiederum
geringen Ausbeute dieses bekannten Verfahrens befriedigt nicht,
daß erst im letzten Schritt biologisch aktives Dimer neben inak
tivem Dimer gebildet wird, so daß eine weitere Reinigung erfor
derlich ist und die Aktivität während der Reinigung nicht kon
trolliert werden kann.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung von biolo
gisch aktiven Dimeren von rekombinaten humanen Wachstumsfaktoren
aus der Cystein-Knoten-Familie vorgeschlagen, bei dem man von
Zelleinschlußkörpern ausgeht, wobei das Verfahren dadurch ge
kennzeichnet ist, daß man
- (A) entweder
- (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen alkalischen und harn stoff-haltigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Re duktionsmittels solubilisiert,
- (ii) das Solubilisat auf eine Ionenaustauschersäule aufträgt,
- (iii) durch Rückfaltung, Dimerisierung und aerobe Re-oxidation renaturiert, indem man mit einem absteigenden Harnstoffgradien ten wäscht, und
- (iv) mit einem Mineralsalzgradienten eluiert
- (B) oder
- (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Solubilisierungsmittels und eines an sich bekannten Reduktionsmittels solubilisiert,
- (ii) gegebenenfalls das Solubilisat unter denaturierenden Bedin gungen einer Gelfiltration unterwirft,
- (iii) in fakultativer Gegenwart eines an sich bekannten Solubi lisierungsmittels und in Gegenwart eines an sich bekannten Re dox-Mittels zu assoziationskompetenten Monomeren rückfaltet, in dem man das Solubilisat einer Gelfiltration unterwirft,
- (iv) die Wachstumsfaktoren im Eluat der Gelfiltration zu biolo gisch aktiven Dimeren mit Hilfe eines Redox-Mittels dimerisiert und
- (C) die gemäß (A) oder (B) dimerisierten Wachstumsfaktoren fein reinigt, indem man sie weiteren für die Reinigung von rekom binanten Proteinen an sich bekannten Reinigungsschritten unter wirft.
- (i) Einschlußkörper werden also alkalisch in Gegenwart von Harn stoff und vorzugsweise bei geringer Harnstoffkonzentration solu bilisiert.
- (ii) Die solubilisierten Proteine werden an einen Ionenaustau scher gebunden.
- (iii) bis (iv) Der Harnstoff wird in Analogie zu einer Dialyse allmählich graduell entfernt, die Monomeren werden rückgefaltet und unter Rückbildung von Disulfidbrücken dimerisiert und die Disulfidbrücken der gebildeten Dimeren werden durch Luft oder Sauerstoff, insbesondere durch gelösten Sauerstoff, reoxidiert, so daß man durch Rückfaltung, Dimerisierung und Reoxidation re naturiert.
Bei der Gewinnung eines speziellen Dimeren kann man dem spezifi
schen Verhalten dieses Dimeren dadurch Rechnung tragen, daß man
- (a) während der Solubilisierung und der Chromatographie die Harnstoff- und Reduktionsmittelkonzentration,
- (b) während des Waschens die Flußrate sowie
- (c) beim Auftragen auf die Säule das Verhältnis der aufgetragenen Proteinmenge zur Säulenkapazität optimiert.
Für rhplGF-1 kann man beispielsweise an eine Harnstoffkonzen
tration von etwa 1 M und einen Tris-Puffer mit einem PH von etwa
8,0 denken und für PDGF-BB beispielsweise an eine Harnstoffkon
zentration von etwa 1,5 M und einen Puffer mit einem pH von etwa
8,5.
Durch eine Ko-Solubilisierung und Ko-Chromatographie lassen sich
vergleichsweise einfach heterodimere Liganden gewinnen, etwa von
PlGF-1 und VEGF121. Eine stöchiometrische Koexpression ist bei
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendig.
Wenn man gemäß Variante A arbeitet, kann man die Feinreinigung
mit Hilfe von Heparin-Affinitätschromatographie, Kationenaustau
scher-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration
und/oder Elutions-Elektrophorese durchführen.
Jederzeit sind Aktivitätstests möglich. Der Nachweis der biolo
gischen Aktivität kann beispielsweise durch spezifische ELISAs
oder durch Kompetitionsassays für die Rezeptorbindung, bei
spielsweise mit sFlt-1 und 125I-VEGF165, und 3[H]-Thymidin-Ein
bau für die Stimulierung der Mitose erfolgen. Für die Mitose-
Stimulierung beispielsweise in Balb 3T3-Zellen vergleiche man
Klagsbrunn et al. 1985 und Weich et al. 1990.
Wenn man bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens
die Bedingungen für die Gewinnung von speziellen Homo- oder
Heterodimeren optimieren will, so kann man folgende Faktoren in
Betracht ziehen.
- (a) Konzentration chaotroper Reagenzien,
- (b) Flußrate.
- (c) Redoxverhältnis zur Generierung der Disulfidverbrückungen während der Renaturierungen,
- (d) Beladung.
- (e) Proteinkonzentration.
Die Dimerisierungsreaktion läuft also in einem Red-Ox-System ab,
wobei die Disulfidverbrückungen oxidativ gebildet wären, während
falsch gebildete intra- und intermolekulare Brücken durch das
Red-Ox-System wieder aufgelöst werden können. Für die Dimerisie
rungsreaktion kann man andere Umgebungsparameter einstellen als
für die Rückfaltung auf der Säule, beispielsweise durch spe
zielle Einstellung der Temperatur.
Wenn man nach der Variante B arbeitet, kann man die
Feinreinigung mit Hilfe von Gelfiltration und/oder Heparin-
Affinitätschromatographie durchführen.
Biologische Aktivität kann man beispielsweise durch 3[H]-Thymi
din-Einbau bei Stimulierung der DNA-Synthese und die daraus ab
geleiteten Mitose-Stimulierung beispielsweise in Balb 3T3-Zellen
nachweisen; vergleiche Klagsbrunn et al. 1985 und Weich
et al. 1990.
Als Reduktionsmittel kann man Mercaptoethansulfonsäure (MESNA)
verwenden.
Für die aerobe Re-Oxidation kann man ein lufthaltiges oder sau
erstoffhaltiges wäßriges Medium verwenden, insbesondere ein ge
puffertes Medium.
Als Mineralsalzgradienten kann man einen NaCl-Gradienten verwen
den.
Als Solubilisierungsmittel kann man Guanidinium-Hydrochlorid
verwenden.
Als Redox-Mittel kann man Glutathion verwenden.
Die Feinreinigung kann durch Aktivitätstests überwacht werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann man von Zelleinschluß
körpern reifer Formen der Wachstumsfaktoren ohne Leader-Sequenz
ausgehen.
Dabei kann man von Zelleinschlußkörpern eines Wachstumsfaktors
ausgehen, dessen Moleküle, die die Zelleinschlußkörper bilden,
sich aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homogenisch sind und
(im vorstehend angegebenen Sinn) Homodimere oder Heterodimere
bilden. Natürlich kann man auch Zelleinschlußkörper eines
Wachstumsfaktors dem erfindungsgemäßen Verfahren unterwerfen,
dessen Moleküle heterogenisch sind.
Man kann auch von Zelleinschlußkörpern zweier verschiedener
Wachstumsfaktoren ausgehen, deren Moleküle, die die Zellein
schlußkörper bilden, sich aus verschiedenen Genen bzw. aus Genen
ableiten, die für jeden Wachstumskörper spezifisch sind.
Dabei können sich die Moleküle der Einschlußkörper eines oder
beider Wachstumsfaktoren aus einem einzigen Gen ableiten bzw.
homogenisch sein, oder die Moleküle der Einschlußkörper eines
oder beider Wachstumsfaktoren können heterogenisch sein.
Erfindungsgemäß kann man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs
tumsfaktors einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1,
SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID
NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10,
SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ
ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID
NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23
und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe ausgehen.
Ferner kann man erfindungsgemäß ein Dimer aus zwei gleichen Ket
ten einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID
NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6,
SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID
NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15,
SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19,
SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und
SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe gewinnen.
Ferner kann man erfindungsgemäß ein Dimer aus zwei verschiedenen
Ketten mit Aminosäuresequenzen gewinnen, die man aus einer der
folgenden Zusammenstellungen von Aminosäuresequenzen ausgewählt
hat: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4;
SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID
NO. 5 und SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3,
SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 1,
SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 und SEQ
ID NO. 10; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID
NO. 8; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10;
SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10; SEQ
ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID
NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13
und SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17,
SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 und SEQ ID NO. 21;
SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24.
Schließlich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung die Ver
wendung eines erfindungsgemäß gewonnenen biologisch aktiven Di
meren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren zur Herstel
lung von pharmazeutischen Präparaten.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
Man solubilisiert die Zelleinschlußkörper bei pH 12,5 gemäß
Suttnar et al. 1994 in 50 mM Glycinpuffer unter Zusatz von 10 mM
Mercaptoethansulfonsäure (MESNA) und 1 M Harnstoff. Hierfür wer
den pro Gramm Zelleinschlußkörper 5 ml des vorstehend angeführ
ten Solubilisierungspuffers zugegeben. Man rührt bei Raumtempe
ratur unter Stickstoff 16 h lang.
Die Lösung wird danach 60 min lang bei 35266* g und 4°C zentri
fugiert. Der klare Überstand, das Solubilisat, wird auf eine mit
50 mM Glycinpuffer (pH 9, 0) und 1 M Harnstoff equilibrierte
Anionenaustauschersäule aufgetragen (pharmacia XK 26/40, 60 ml
Bettvolumen, Q-Sepharose, 2 ml/min bei 4°C; 24 ml mit 687 mg
Protein aus 4 g Zelleinschlußkörpern).
Die Säule wird zuerst mit Startpuffer und dann mit einem linear
absteigenden Harnstoffgradienten (1 M auf 0 M) bei einer Fluß
rate von 0,25 ml/min (entspricht 0,047 cm/min) gewaschen. Bei
diesem Schritt bleiben entstehende Dimere gebunden, eventuell
noch vorhandene Monomere werden eluiert, so daß sie nach Opti
mierung der Bedingungen überhaupt nicht mehr nachweisbar sind.
Nach einem Waschschritt mit 50 mM Glycinpuffer (pH 9,0) werden
dann die aktiven Dimeren mit einem NaCl-Gradienten eluiert.
Die VEGF-haltigen Fraktionen werden gesammelt, verdünnt (1 : 3)
und auf eine 10 ml-Heparin-Säule (Toyopearl AF-Heparin-650-M)
aufgetragen, die mit 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,2) equilibriert
ist. Die Säule wird mit Puffer gewaschen und das VEGF mit einem
linearen NaCl-Gradienten eluiert. Die VEGF-haltigen Fraktionen
werden gesammelt, wiederum verdünnt (1 : 3) und auf eine mit 50
mM Tris-HCl equilibrierte Kationenaustauschersäule (S-Sepharose)
aufgetragen und mit einem Stufengradienten (0,2 M; 0,4 M und 1,0
M NaCl) eluiert. Für weitere Einzelheiten vergleiche man die
folgende Tabelle 1.
Für VEGF165, das außer an Flt-A auch an den mitogenen Rezeptor
KDR bindet, kann man durch Messung der Stimulierung der DNA-Syn
theserate zeigen, daß die Aktivität von rekombinantem unglykosi
lierten Protein aus E. coli mit der von im Baculovirus-System
hergestellen VEGF nahezu identisch ist.
Die aus einer Hochzelldichtekultivierung gewonnenen Zeilen
werden durch Hochdruckhomogenisation aufgeschlossen und die
Einschlußkörper durch Zentrifugieren von der löslichen Fraktion
abgetrennt. Dieses Konzentrat wird dreimal mit 20 mM Tris-HCl
(pH 8,5), 0,5 mN EDTA und 2% Brij 35 gewaschen, anschließend
mit 6 M Gnd-HCl, 100 mM DTT, 0,5 mM EDTA mit
Ultraschallunterstützung solubilisiert und über Nacht
stehengelassen. Nach Zentrifugieren (40 min bei 26 000 g und 4°C)
wird eine Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen
durchgeführt (2 M Gnd-HCl und Glycin-Phosphat (pH 3,0)), die das
Protein zu über 90% rein liefert.
Dazu wird eine Säule (XK 26/60-Säule, Superdex 75 pg, Pharmacia)
mit einem Bettvolumen von 348 ml und folgender Spezifizierung
verwendet; Beladung 10 ml (2,9%); Flußrate: 4 ml × min1;
PDGF-Konzentration: 5 mg × ml1.
Zur Rückfaltung wird die PDGF-Stammlösung (4,5 mg × ml-1) auf
dieselbe Gelfiltrationssäule gegeben, die mit 100 mM Tris-HCl
(pH 7,8) und 0,5 M Gnd-HCl und Glutathion (reduziert/oxidiert;
40 : 1) equilibriert ist, wobei man bei einer Flußrate von 2 ml
×min-1 eluiert. Der Verlauf der UV-Absorption zeigt dabei im
wesentlichen einen Peak bei dem Elutionsvolumen VE = 161 ml, der
lediglich PDGF-A/B-Monomere enthält.
Die Dimerisierung dieser Monomere mit Hilfe des Red-Ox-Systems
findet im Eluat statt und ist eine im Stundenbereich verlaufende
Reaktion.
Erzielter Reinheitsgrad und Ausbeute sind der folgenden Tabelle 2
zu entnehmen.
Die biologische Aktivität kann durch 3[H]-Thymidin-Einbau für
die Stimulierung der DNA-Synthese bzw. für die Mitose-Stimulie
rung in Balb 3T3-Zellen gemäß Klagsbrunn et al. 1985 und Weich
et al. 1990 erfolgen. Mit einer PDGF-AB-Konzentration von 3 bis
5 ng × ml-1 läßt sich eine halbmaximale Stimulierung erreichen,
die der von anderen Autoren berichteten Stimulierung entspricht;
vgl. Scheppe et al. 1994.
Mit kommerziellen pDGF-AB aus E. coli [SIGMA] läßt sich dasselbe
Ergebnis erreichen
R. Birkenhäger, B. Schneppe, W. Röckl, J. Wilting, H. A. Weich, J. E. G. McCarthy. Biochem.
J. 316 (1996) 703-707.
D. S. Chamock-Jones, A. M. Sharkey J. Rajput-Williams, D. Burch, J. P. Schofield, S. A. Fountain, C. A. Boocock, S. K. Smith. Biology of Reproduction 48 (1993)) S. 1120-1128.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner. Biochemistry 28 (1989), 2956-2960.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner, D. Tatje. Eur. J. Biochem. 187 (1990), 207-214.
M. Klagsbrun, Y. Shing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 805-809.
B. Schneppe, W. Eichner, J.E.G. McCarthy. Gene 143 (1994), 201-209.
J. Suttnar, J.E. Dyr, E. Hamsikova, J. Novák, V. Vonka. J. Chromatogr. B, 656 (1994) 123-126.
H.A, Weich, N. Iberg, M. Klagsbrun, J. Folkman. Growth Factors 2 (1990), 313-320.
D. S. Chamock-Jones, A. M. Sharkey J. Rajput-Williams, D. Burch, J. P. Schofield, S. A. Fountain, C. A. Boocock, S. K. Smith. Biology of Reproduction 48 (1993)) S. 1120-1128.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner. Biochemistry 28 (1989), 2956-2960.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner, D. Tatje. Eur. J. Biochem. 187 (1990), 207-214.
M. Klagsbrun, Y. Shing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 805-809.
B. Schneppe, W. Eichner, J.E.G. McCarthy. Gene 143 (1994), 201-209.
J. Suttnar, J.E. Dyr, E. Hamsikova, J. Novák, V. Vonka. J. Chromatogr. B, 656 (1994) 123-126.
H.A, Weich, N. Iberg, M. Klagsbrun, J. Folkman. Growth Factors 2 (1990), 313-320.
Claims (17)
1. Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von
rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-
Familie, bei dem man von Zelleinschlußkörpern ausgeht, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- (A) entweder
- (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen alkalischen und harn stoff-haltigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Re duktionsmittels solubilisiert,
- (ii) das Solubilisat auf eine Ionenaustauschersäule aufträgt,
- (iii) durch Rückfaltung, Dimerisierung und aerobe Reoxidation renaturiert, indem man mit einem absteigenden Harnstoffgradien ten wäscht, und
- (iv) mit einem Mineralsalzgradienten eluiert
- (B) oder
- (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Solubilisierungsmittels und eines an sich bekannten Reduktionsmittels solubilisiert,
- (ii) gegebenenfalls das Solubilisat unter denaturierenden Bedin gungen einer Gelfiltration unterwirft,
- (iii) in fakultativer Gegenwart eines an sich bekannten Solubi lisierungsmittels und in Gegenwart eines an sich bekannten Re dox-Mittels zu assoziationskompetenten Monomeren rückfaltet, in dem man das Solubilisat einer Gelfiltration unterwirft, (iv) die Wachstumsfaktoren im Eluat der Gelfiltration zu biolo gisch aktiven Dimeren mit Hilfe eines Redox-Mittels dimerisiert und
- (C) die gemäß (A) oder (B) diinerisierten Wachstumsfaktoren fein reinigt, indem man sie weiteren für die Reinigung von rekom binanten Proteinen an sich bekannten Reinigungsschritten unter wirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
als Reduktionsmittel Mercaptoethansulfonsäure (MESNA) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man für die aerobe Re-oxidation ein lufthaltiges oder sauer
stoffhaltiges wäßriges Medium verwendet, insbesondere ein ge
puffertes Medium.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Mineralsalzgradienten einen
NaCl-Gradienten verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Solubilisierungsmittel Guanidinium-
Hydrochlorid verwendet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Redox-Mittel Glutathion verwendet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man gemäß Anspruch 1(A) arbeitet und die
Feinreinigung mit Hilfe von Heparin-Affinitätschromatographie,
Kationenaustauscher-Chromatographie, Affinitätschromatographie,
Gelfiltration und/oder Elutions-Elektrophorese durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß man gemäß Anspruch 1(B) arbeitet und die Feinrei
nigung mit Hilfe von Gelfiltration und/oder Heparin-Affinitäts
chromatographie durchführt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Feinreinigung durch Aktivitätstests
überwacht.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern reifer Formen
der Wachstumsfaktoren ohne Leader-Sequenz ausgeht.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs
tumsfaktors ausgeht, dessen Moleküle, die die Zelleinschlußkör
per bilden, sich aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homoge
nisch sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern zweier verschiedener
Wachstumsfaktoren ausgeht, deren Moleküle, die die Zellein
schlußkörper bilden, sich aus verschiedenen Genen bzw. aus Genen
ableiten, die für jeden Wachstumskörper spezifisch sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich
die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachstumsfak
toren aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homogenisch sind oder
daß die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachs
tumsfaktoren heterogenisch sind.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs
tumsfaktors einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1,
SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID
NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10,
SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ
ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID
NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23
und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe ausgeht.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daß man
ein Dimer aus zwei gleichen Ketten einer Aminosäuresequenz aus
der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4,
SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ
ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID
NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17,
SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21,
SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe
gewinnt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn
zeichnet, daß man ein Dimer aus zwei verschiedenen Ketten mit
Aminosäuresequenzen gewinnt, die man aus einer der folgenden Zu
sammenstellungen von Aminosäuresequenzen ausgewählt hat: SEQ ID
NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 1,
SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 und
SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID
NO. 4, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2,
SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10;
SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ
ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10; SEQ ID
NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11
und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ
ID NO. 4, SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13 und SEQ
ID NO. 14; SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID
NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 und SEQ ID NO. 21; SEQ ID
NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24.
17. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 gewon
nenen biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen
Wachstumsfaktoren zur Herstellung von pharmazeutischen Präpara
ten.
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