MXPA04010851A

MXPA04010851A - Proteinas de fusion de trombomodulina dirigidas al factor tisular novedoso como anticoagulantes.

Info

Publication number: MXPA04010851A
Application number: MXPA04010851A
Authority: MX
Inventors: Mclean Kirk
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2005-02-14
Also published as: WO2003093422A3; RS104504A; KR101013697B1; WO2003092602A2; HK1080372A1; ES2354419T3; EP1549341A4; UA85996C2; PE20040597A1; JP4567437B2; PL373945A1; RU2320366C2; CR7584A; CN1665526A; EP1503785B1; CN100563709C; CA2483909A1; RU2004135308A; KR20050045944A; DK1549341T3

Abstract

Esta invencion se relaciona con proteinas de fusion novedosas las cuales estan comprendidas de una proteina directora que se une al factor tisular (TF), el cual esta ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (TM) solo o en combinacion con al menos otro dominio de TM seleccionado del grupo que consiste de los dominios de la region hidrofobica N-terminal, el dominio EGF123, el lazo interdominio entre el EGF3 y EGF4, y el dominio rico en Ser/Thr glicosilado en 0, o analogos, fragmentos, derivados o variantes de los mismos. La proteina de fusion se une en el sitio del dano y evita el inicio de la trombosis. La proteina de fusion puede ser usada para tratar una variedad de condiciones tromboticas incluyendo pero sin limitarse a la trombosis venosa profunda, coagulacion intravascular diseminada, y sindrome coronario agudo.

Description

har iwo-lcih'r coiivs aiuJ utlwr abbrevtalioiv, rcjcr lc tln' "(iutJ-ance Notes on Codcs anii Abbrcvtations" appcanng oi Ihc bcgin-ninfi ofeach regular issue of the PC1' Gotelle.

PROTEINAS DE FUSION DE TROMBOMODULINA DIRIGIDAS AL FACTOR TISULAR NOVEDOSO COMO ANTICOAGULANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCION Mantener el equilibrio apropiado entre las "acTTlvacíades procoagulante y anticoagulante dentro de los vasos sanguíneos es esencial para la hemóstasis normal (Davie, E.W. et al. (1991) Biochemistry, 30 ( 43) : 10363- 10370). Perturbar el equilibrio hacia la coagulación conduce a trombosis, la cual puede ser causa de ataques cardiacos, apoplejía, embolismo pulmonar y trombosis venosa. Existe la necesidad de anticoagulantes más efectivos y seguros para tratamientos de trastornos trombóticos específicos. El factor tisular ("TF") es una glicoproteína transmembranal que es el iniciador principal de la cascada de coagulación (Nemerson,_ .._.(.19?5)r- · hromb.--- . - Haemost 74.( 1 ) :.180.-184 ) . Bajo condiciones fisiológicas normales el TF activo no está en contacto con la sangre. Durante un daño o lesión vascular, la exposición a la sangre del TF subendotelial y el colágeno conduce a la activación de los factores de la coagulación y plaquetas y posteriormente a la formación de un tapón hemostático. La inducción inapropiada de la expresión del TF en una variedad de escenarios clínicos puede conducir a una trombosis que amenace la vida y/o contribuir a complicaciones patológicas. Se cree que la exposición del TF después de la ruptura de la placa es responsable de la oclusión trombótica, que conduce al infarto al miocardio agudo y apoplejia. En esos escenarios, las vías de señalización proinflamatorias activadas por los factores de ' la coagulación también contribuyen a la formación de edema e incrementar el tamaño del . infarto. El daño vascular asociado con la angioplastia conduce a la sobrerregulación del TF sobre SMC lo cual se cree induce las vías de señalización celular asociadas con la restenosis. La sobreexpresión del TF en el cáncer y sepsis gram negativa conduce a una trombosis que amenaza la vida y activación de las vías inflamatorias. El complejo de factor Vlla ("FVIIa") /TF esté implicado en le mecanismo patógeno en una variedad de enfermedades trombóticas y el nivel de .circulacion_-.de..-TF- es-un factor de riesgo para ciertos pacientes. El FVIIa y el TF juegan papeles únicos en el daño vascular manteniendo la hemostasis e iniciando la trombosis. El TF es expresado en la adventicia normalmente, pero es sobrerregulado y expresado inapropiadamente en los medios y neointima en enfermedades vasculares. La expresión del TF en placas ateroescl'eróticas se incrementa y es protegida de la sangre por una tapa fibrosa delgada y puede romperse para exponer el TF. Las intervenciones quirúrgicas como la angioplastia con globo, uso de dispositivos de stent, o endarterectomia dañan la pared del bazo y exponen el TF subyacente. En la placa ateroesclerótica , de paredes delgadas, ricas en líquidos, la ruptura espontánea o erosión endotelial conduce a la exposición del TF y trombosis, dando como resultado una angina inestable e infarto al miocardio. El TF puede circular en micropartículas derivadas de células y los niveles de TF en circulación se elevan en la angina inestable sugiriendo que este TF en circulación pueda contribuir a la formación de trombos (Soejima, H. et al. (1999) Circulation 99 (22) : 2908-2913) . Con frecuencia el cáncer se asocia con un estado hipercoagulable atribuido a la sobreexpresión de TF en las células tumorales . Esto predispone ~ al paciente a trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar y coagulación intravascular diseminada de grado bajo ( "DIC") ._ La DIC da, como-, resultado .-deposició de - fibrina microvascular que contribuye a la insuficiencia multiórganos . El resultado de los modelos de daño arterial agudo de trombosis indican que inhibidores de FVIIa/TF basados en proteína, como factor Vlla inhibido en el sitio activo ("FVIIai") y el inhibidor de la vía del factor tisular ("FPI") son antitrombóticos efectivos con menos hemorragia en comparación de los inhibidores de la trombina y el factor Xa ("FXa") . Además, la inhibición de FVIIa/TF es superior a los otros anticoagulantes (por ejemplo, heparina, inhibidores de FXa) en la prevención del engrosamiento neointimal y estenosis vascular después de una lesión por globo (Jang, Y. et al. (1995) Circulation 92 (10) : 3041-3050) . La trombomodulina ("TM") es una glicoproteina transmembranal que tiene propiedades anticoagulantes y es expresada perdominantemente sobre la superficie lumenal de las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos (Esmon, N.L. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257 (2) : 859-864; Salem, H.H.¦ · et al. (1983) J. Biol. Chem. 259 (19) : 12246-12251). La TM de longitud completa, madura, es una proteína modular de 557 aminoácidos residuales compuesta de 5 dominios estructurales: una región hidrofóbica, N-terminal (residuos 1-226) ; una región rica en cisteína (residuos 226-462); una región rica en Ser/Thr glicosilada en O (residuos 463-497); una región transmembranal _hidrofóbica» (residuos 498-521); y una cola citoplásmica C-terminal (residuos 522-557) . Esta región rica en cisteína incluye seis estructuras repetidas homologas precursoras del factor de crecimiento epidérmico ( "EGF" ) , llamado EGF similar, dominios homólogos de EGF o de EGF. La región rica en cisteína puede ser dividida además en 3 dominios: las repeticiones 1, 2 y 3 de EGF similar ("EGF123", residuos 226-344), el lazo interdominio entre EGF3 y EGF4 (residuos 345-349), y los dominios 4, 5 y 6 del EGF similar ("EGF456", residuos 350-462) . La función del EGF456 es mediar la unión de trombina y activación de la proteina C. Un estudio ha sugerido que la quinta y sexta repeticiones del EGF similar ( "EGF5" , residuos 390-407, y "EGF6" , residuos 427-462, respectivamente) tienen la capacidad de unirse a la trombina ( urosa a, S. et al. (1988) J. Biol . Chem . 263 (13) : 5993-5996) ; otros sugieren que el dominio del EGF 456 es suficiente para actuar como cofactor para la actividad activadora de la proteina C mediada con trombina (Zushi, M. et al. (1989) J. Biol. Chem. 26 ( 18 ): 10351-10353) . El dominio rico en Ser/Thr mejora la unión de la trombina mediada por EGF456. La tercera repetición del EGF similar ("EGF", residuos 311-344) es requerida para la activación del inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina ("TAFI") . Se ha descrito que vario_s__jnutarites. puntuales en el EGF3 que interfieren - con -la activación del TAFI (Wang W. et al. (2000) J. Biol. Chem .275 ( 30 ): 22942-22947). El complejo de trombina/TM convierte la proteina C a proteina c activada ("APC") , la cual a su vez degrada los factores Va y Vlla, previniendo por lo tanto la generación adicional de trombina. Por lo tanto, TM funciona como un conmutador molecular convirtiendo la trombina de procoagulante a anticoagulante. La Km de la proteina C para el complejo de trombina/TM se reduce 10 veces, cuando la TM se localiza en una superficie membranal (Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9 (10) : 946-955) . La concentración de proteina C en sangre (0.065 µ?) se encuentra significativamente por debajo de la Km reportada (5µ?) para el complejo de TM/trombina soluble, estableciendo por lo tanto que la TM sobre la superficie de la membrana procoagulante dará como resultado una mejora local notable en la velocidad de generación de proteina C. La TM inhibe la trombosis por un mecanismo diferente al de la heparina o sus derivados. La heparina es un cofactor para la antitrdmbina II e inhibe FXa y la trombina a través de un mecanismo dependiente de la antitrombina III. La trombina unida a un trombo es protegida contra la acción de la antitrombina III, lo cual inhibe la eficacia antitrombótica de la heparina o heparina de bajo peso preexistentes . Esto explica el ¦ fracaso de la heparina o LMWH para inhibir el crecimiento de trombos activado por la trombina o protrombinasa unida al coágulo en estudios con primates no humanos. En contraste, la TM recombinante atenúa los coágulos inducidos por la generación de trombina y formación de fibrina en una forma dependiente de la dosis (Mohri, M. et al. (1998) Thromb. Haemost 80 (6) : 925-929) . El efecto inhibidor de la TM es abolido por el anticuerpo anti-proteina C. La inhibición de la actividad procoagulante unida al coágulo es clínicamente relevante debido a que la actividad procoagulante unida al coágulo da como resultado un crecimiento del trombo más rápido y finalmente oclusión vascular o complicaciones tromboembólicas . La inhibición del crecimiento del trombo permite que los sistemas fibrinolíticos endógenos remuevan coágulos más rápido y completamente. Además, se espera que la TM también sea más efectiva que la heparina en condiciones patológicas donde la antitrombina en plasma esté empobrecida, como la DIC. Aunque ambas de la TM y la heparina inhiben el consumo de plaquetas y fibrinógeno en la DIC experimental, únicamente la TM fue efectiva cuando los niveles de antitrombina III empobrecieron.

LA INVENCION La presente invención proporciona proteínas ..'.de., fusión novedosas, las cuales actúan como anticoagulantes, y comprende una proteína directora, que interactúa con el factor tisular ("TF") o complejo de factor Vlla/factor tisular ("FVIIa/TF") , el cual está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina ("TM") solo o en combinación con al menos otro dominio de TM seleccionado del grupo que consiste del dominio de la región hidrofóbica N-terminal, el dominio EGF123, el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, y el dominio rico en Ser/Thr glicosilado en O, o análogos, fragmentos, derivados o variantes de los mismos . La proteína de fusión anticoagulante de esta invención hace blanco sobre y se une al TF o el complejo de FVIIa/TF en el sitio del daño, localizando la TM en el sitio del daño, y previniendo de este modo la formación de trombos y funcionando por lo tanto más efectivamente como un anticoagulante en comparación con un anticuerpo anti-TF soluble o TM soluble o fragmentos de TM. La proteína de fusión es más efectiva que la heparina de bajo peso molecular ("LMWH") en el tratamiento de ciertas enfermedades incluyendo, pero sin limitarse a la sepsis, coagulación intravascular diseminada, apoplejía isquémica, trombosis venosa profunda, síndromes coronarios agudos, complicaciones trombóticas después de la angioplastia, y coagulopatía en cáncer avanzado. Además, la proteína __de fusión tiene ,uso en al cirugía, microvascular, injertos de piel y venas y transplante de órganos. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen las proteínas de fusión objetivo. En otro aspecto, la invención proporciona un método para proteger a un paciente contra la formación de trombos que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión al paciente, y por lo tanto inhibir la generación de trombina sin afectar directamente otros parámetros de coagulación como la activación y agregación de plaquetas. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para prevenir y tratar la trombosis venosa profunda ("DVT") o coagulación intravascular diseminada ("DIC") o síndrome coronario agudo o cáncer, con evidencia de coagulopatía en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión al paciente. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para regular la respuesta inflamatoria en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión al paciente. En otro aspecto más, la proteína de fusión de la invención puede ser usada para formar -un recubrimiento no tormbogénico sobre la superficie de dispositivos médicos que entran en contacto con la sangre. En otro aspecto, la invención se relaciona con un equipo que comprende una proteína de fusión que comprende una proteína directora, que se une al TF o el complejo de FVIIA/TF, y dominios de TM. De manera alternativa, el equipo puede comprender secuencias de ADN que codifiquen para los componentes de la proteína de fusión.

También se describen métodos para elaborar las proteínas de fusión de la invención, tanto recombinantes como sintéticas.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. La unión de scFv(TF)3elO a sTF incrementa la afinidad aparente de sTF al FVIIa. El ensayo de activación de sTF/FVIIa fue efectuado como se describe bajo el Ejemplo 5 titulado "ensayo de activación de sTF/FVIIa" usando FVIIa 2 nM en presencia y ausencia de scFv(TF)3elO 800 nM. El sTF fue titulado en el ensayo y se determinó la velocidad de escisión del sustrato cromogénico (S-2266) . La KD aparente del sTF fue calculada usando un ajuste de 4 parámetros estándar. Figura 2. Medición de la afinidad de unión de scFv(TF)3elO para sTF. El ensayo de sTF/FVIIa fue como se describe bajo el -Ejemplo 5 titulado "ensayo de activación de sTF/FVIIa" usando sTF 3 nM y FVIIa 2nM. La concentración de sTF usada fue inferior a la KD para la unión de FVIIa. La unión del anticuerpo scFv(TF)3elO redujo la KD de sTF para la unión a FVIIa, conduciendo al incremento en la formación de complejo de sTF/FVIIa y, por lo tanto, la velocidad de escisión del sustrato cromogénico S2266. El ScFv(TF)3elO fue agregado a concentraciones crecientes y la velocidad de reacción creciente fue usada para determinar la KD aparente del anticuerpo para sTF usando un ajuste de 4 parámetros estándar. Figura 3. El análisis por microcalorimetria muestra que el scFv(TF)3elO tiene una afinidad 20 veces mayor por el complejo de sTF/FVIIa que el sTF solo. La calorimetría por titulación isotérmica se. efectuó usando un instrumento MicroCal VP-ITC. El complejo de sTF/FVIIa fue preformado agregando un exceso molar de 2.3 veces de FVIIai a sTF. Se usó cromatografía de exclusión por tamaño para verificar que el sTF estuviera completamente complejado. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo por el complejo, se agregó complejo de sTF/VIIa 1.2 µ? a la celda del microcalorímetro y se agregó anticuerpo scFv(TF)3elO 65 µ? a la jeringa. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo por sTF solo, se agregó sTF 10 µ? a la celda y se agregó scFv(TF)3elO 141 µ? a la jeringa. El análisis de datos se efectúo usando programas y sistemas " de programación MicroCal Origin. Los datos fueron ajustados a un solo sitio de unión. Figura 4. La dosis de scFv(TF)3elO inhibe de manera dependiente el ensayo de activación de FX. Los detalles de este ensayo son descritos bajo el Ejemplo 5 titulado "ensayo de activación del Factor X". La CI5o representa la dosis requerida para alcanzar una inhibición máxima del 50%.

Figura 5. La proteína de fusión inhibe de manera más potente la coagulación que el anticuerpo del TF o TMÍ456 solo. El ensayo del tiempo de protrombina (PT) fue efectuado para comparar la proteína de fusión con el anticuerpo de TF o TMÍ456 solo. Se agregó volumen apropiado de inhibidor concentrado, ya sea anticuerpo de TF (scFv(TF) 3el0) , TMÍ456, o fusión (scFv(TF) 3elO-TMi456) , a 100 µ? de tromboplastina humana recombinante (Ortho Recombiplastin) . Aproximadamente 2 minutos después se agregaron 100 µ? de plasma humano reconstituido. El tiempo de coagulación fue determinado en un Coagulometro Haemoliance. Se generaron curvas de respuesta a la dosis por cada inhibidor y entonces se usó el análisis de regresión para calcular la concentración (en nM) necesaria para prolongar dos veces el tiempo de coagulación. Figura 6. La proteína de fusión retiene la actividad coaguladora completa para la activación' 'de la proteína C. El ensayo descrito bajo el Ejemplo 5 titulado "Ensayo de activación de proteína C (cromogénico) " contenía 20 mi de muestra de TM, ya sea TMÍ456, el cual contiene los dominios de EGF 4-6 y el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, o fusión (scFv(TF) 3elO-TMi456) , 20 µ? de proteína C 1.5 µ?, y 20 µ? de alfa trombina 3 nM. La activación se dejó proceder durante una hora. La fase de activación fue detenida agregando 20 µ? de hirudina 0.16 u/ml. Entonces se agregaron 100 µ? de S2266 1 mM y se determinó la A405 cada 10 segundos durante 30 minutos. La velocidad de reacción depende de la cantidad de proteina C activada generada. Los datos se expresaron en mOD/min. Figura 7. La velocidad de activación de la proteina C por la proteina de fusión es ' mejorada sobre superficies fosfolipidicas que contienen TF. La velocidad de activación de la proteina C por Tmi456 no es afectada por la adición de vesículas de TF. El ensayo descrito bajo el Ejemplo 5 titulado "Ensayo de Activación de Proteina C (sobre superficies ricas en TF) " contenía 20 µ? de muestra de TM, ya sea Tmi456 o fusión (scFv(TF) 3elO-Tmi456) , 20 µ? de proteína C 1.5 µ?, 20 µ? de alfa trombina 3 nM, y 20 µ? de amortiguador o vesículas de TF (Innovina, TF recombinante humano, 4X la concentración normal para PT) . Se dejó que la activación procediera durante 1 hora. La fase de activación ._. fue detenida _- . agregando 20 µ? de hirudina 0.16 u/ml. Entonces se agregaron 100 µ? de S2266 1 mM y se determinó la A405 cada 10 segundos durante 30 minutos. La velocidad de reacción depende de la cantidad de proteína C activada generada. Los datos se expresaron en mOD/min . Figura 8. La proteína de fusión muestra mayor especificidad por la coagulación inducida por TF que TMÍ456. El ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) es sensible a inhibidores de las vías intrínseca y central de la coagulación. La coagulación que ocurre en este ensayo depende del TF. Los inhibidores, ya sea el anticuerpo de TF. ( scFv (TF) 3el0 ) , TMÍ456, o fusión (scFv(TF) 3elO-Tmi456) fueron diluidos en 50 µ? de plasma humano reconstituido a una concentración final que dio una extensión de dos veces en el ensayo de PT. Se .agregaron entonces al coagulometro 50 µ? del reactivo de APTT (Alexin HS) y 50 µ? de reactivo de CaCl2 (0.02 mol/L) y se determinó el tiempo de coagulación en segundos. Figura 9. La proteína de fusión inhibe de manera más potente la coagulación de sangre completa inducida por TF que cualquiera de sus componentes solos. La coagulación de sangre completa fue analizada usando un analizador Haemoscope Thromboelastogragh (TEG) . A sangre completa citrada, se agregaron 120 nM de anticuerpo de TF (scFv (TF) 3el0) , Tmi456 o fusión- (scFv (TF) 3elO-Tmi456) junto con 10 µ? de un reactivo de tromboplastina (dilución de 1:64) y 20 µ? de CaCl2 0.2M. Se obtuvo el valor de R (tiempo para la formación de fibrina inicial) para cada muestra. Este valor fue entonces convertido a un valor de R de % de control no inhibido. Figura 10. La proteína de fusión muestra una respuesta a la dosis más predecible que la LM H en un ensayo de coagulación de sangre completa (TEG) . A la sangre completa citrada, se agregaron concentraciones crecientes (comenzando con 15 nM e incrementando en incrementos de 2X) de fusión (scF (TF) 3elO-TMi456) o concentraciones crecientes (comenzando con 0.15 u/ml y aumentando en 2X) de enoxaparina (LMWH) , junto con 10 µ? de un reactivo de tromboplastina (dilución de 1:64) y 20 µ? de CaCl2 0.2M. Se obtuvo el valor de R (tiempo para la formación de fibrina inicial) para cada muestra y se gráfico contra la concent ación relativa (fijando la concentración más baja como 1 para cada una (valor de R. similar) , incrementando posteriormente las concentraciones en 2X) . Figura 11. La proteina de fusión scFV (TF) 3el0-TMÍ456 es eficaz en un modelo in vivo de coagulación intravascular diseminada ("DIC"). El anticuerpo de TF (scFV(TF) 3elO) y la fusión (scFV (TF) 3elO-TMi456) fueron evaluados en el modelo de tromboembolismo en rata descrito en el Ejemplo .8 para.-(A) por ciento de mortalidad y (B) puntaje de morbilidad-mortalidad. (A) En el grupo tratado con vehículo, la dosis de TF usada dio como resultado una letalidad del 60% (DL60) · scFV (TF) 3elO-Tmi456 a 0.7 nmol/kg previno completamente la muerta. En contraste, el scFV(TF)3elO a 0.7 nmol/kg no tuvo impacto sobre la muerte. La scFV (TF) 3elO-TMi456 fue más eficaz que una dosis 10 veces mayor de scFV (TF) 3el0. (B) En el grupo tratado con vehículo, la dosis in vivo de TF dio como resultado un puntaje de morbilidad-mortalidad promedio de 2.6, sobre la base del siguiente sistema de puntaje 0= no afectado; 1= distención respiratoria media (recuperación dentro de 30 min) ; 2= distención respiratoria severa (moribundo, la recuperación requiere más de 60 min); y 3= muerte. La scFV (TF) 3elO-Tmi456 previno dependiendo de la dosis la muerte inducida y distención respiratoria inducidas por TF con un valor de ED50 de 0.46 nmol/kg (0.019 mg/kg) . La scFV (TF) 3elO-TMi456 a 7.0 nmol/kg previno completamente la muerte y la distención respiratoria, y a 0.7 nmol/kg previno completamente la muerte y redujo significativamente la distención respiratoria. En contraste, la .scFV (TF) 3el0 a 0.7 nmol/kg no tuvo impacto sobre la muerte o poco o ningún efecto sobre la distención respiratoria. La scFV (TF) 3el0-TMÍ456 fue más eficaz que una dosis 10 veces mayor de scFV (TF) 3el0.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La proteina de fusión anticoagulante de la presente está comprendida de una proteina directora que interactúa con el factor tisular ("TF") o el complejo de factor Vlla/factor tisular ("FVIIa/TF") , el cual está ligado operativamente al dominio EGF456 de trombomodulina ("TM") solo o en combinación con al menos otro dominio de TM seleccionado del grupo que consiste del dominio de la región hidrofóbica N-terminal, el dominio EGF123, el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, y el dominio rico en Ser/Thr glicosilado en 0, o análogos, fragmentos, derivados o variantes del mismo.

Definiciones : Para describir la presente invención, se definen los siguientes términos como se indica a continuación. "Proteína o polipéptidos recombinantes" se refiere a proteínas o polipéptidos producidos por técnicas de ADN recombinante, es decir producidos a partir de células, microbios o mamíferos, transformados por un plásmido recombinante de ADN exógeno que codifica para el polipéptido deseado. Las proteínas o polipéptidos expresados en la mayoría de los cultivos bacterianos estarán libres de glicano. Las proteínas o polipéptidos expresados en levaduras pueden .tener -un patrón .de glicosilación diferente al de las expresadas en células de mamífero. Proteínas o polipéptidos "nativos" se refiere a proteínas o polipéptidos recuperados de una fuente natural. El término "TM nativa" incluirá a la TM natural y fragmentos de la misma. Una "secuencia codificadora" de ADN es una secuencia de ADN la cual es transcrita a ¦ ARNm y traducida en un polipéptido en una célula anfitriona cuando es colocada bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora son determinados por un codón de inicio en el N-terminal 5' y un codón de interrupción de la traducción en el C-terminal 3' . Una secuencia codificadora puede incluir secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico, y secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción usualmente se localizará 3' a la secuencia codificadora. "Proteína de fusión" es una proteína resultante de la expresión de al menos dos secuencias codificadoras heterólogas ligadas operativamente. La proteína de fusión de esta invención está comprendida de una proteína directora que interactúa con el TF o el complejo de FVIIa/TF, el cual está ligado operativamente al dominio de EGF456 de trombomodulina ("TM") solo o en combinación con al menos otros dominios de TM seleccionados del grupo que consiste del dominio de la región hidrofóbica N-terminal, el dominio EGF123, el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, y el dominio rico en Ser/Thr glicosilado en 0, o análogos, fragmentos, de ivados o variantes del mismo. La "Proteína directora" es una proteína que se une o interactúa con otra proteína o un complejo de proteína. La proteína directora de esta invención es una proteína que se une a o interactúa con el TF o complejo de FVIIa/TF. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TF o anticomplejo de FVIIa/TF, es una proteína directora de esta invención. Otros dos ejemplos de proteínas directoras es el factor inhibido en el sitio activo Vlla ("FVIIai") , el cual puede unirse al TF para formar un complejo de FVIIai/TF inactivo, y el inhibidor de la vía del factor tisular ("TFPI"), el cual puede unirse a e inactivar el complejo de FVIIa/TF. "Secuencia nucleotídica" es un heteropolímero de desoxirribonucleót idos (de bases de adenina, guanina, timina o citosina) . Las secuencias de ADN que codifican para' las proteínas de fusión de esta invención pueden ser montadas a partir de fragmentos de ADN derivados de ADNc sintético, y enlazantes oligonucleotídicos cortos para proporcionar un gel sintético que es capaz de ser expresado en un . vector de expresión recombinante . En la discusión de la estructura de molécula de ADN de doble hebra particulares, las secuencias pueden ser descritas aquí de acuerdo a la convención normal dando únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADNc. "Vector de expresión recombinante" es un plásmido recombinante de ADN replicable usado para amplificar o expresar el ADN que codifica para la proteína de fusión de la presente invención. Un vector de expresión contiene secuencias de control de ADN y una secuencia codificadora. Las secuencias de control de ADN incluyen secuencias promotoras, sitios de unión ribosomal, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominio regulador corriente arriba y mejoradores. Los sistemas de expresión recombinante como se define aquí expresarán la proteina de fusión tras la inducción de los elementos reguladores. "Células anfitrionas transformadas" se refiere a células que han sido transformadas y transíectadas con ADN exógeno . El ADN exógeno puede o no estar integrado (ligado covalentemente al ADN cromosomal que constituye el genoma de la célula. En procariotes y levadura, por ejemplo, el ADN exógeno puede ser mantenido sobre un elemento episomal, como un plásmido o integrado establemente en el ADN cromosomal. Con respecto a las -células eucarióticas, una célula transformada de manera estable es una en la cual el ADN exógeno ha quedado integrado a la replicación del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de las lineas o clonas celulares eucarióticas para producir una población de células hijas que contienen el ADN exógeno . "Trombomodulina (TM) " se refiere a una glicoproteina de la superficie celular endotelial que forma un complejo de alta afinidad con la trombina. Los genes que codifican para la TM nativa (tanto en su forma genómica como el ADNc) han sido aislados y secuenciados de bovinos y humanos (Jackman, R.W. et al .( 1986) Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 83 (23) : 8834-8838 y Jackman, R.W: et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 84 (18 ): 6425-6429, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Las secuencias para la TM bovina, humana y de ratón exhiben un alto grado de homología entre sí. El ADNc de la TM humana codifica para una proteína de 60.3 kDa de 575 aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de aproximadamente 18 aminoácidos, véase por ejemplo, la Patente Estadounidense 5,827,824. Cuando la trombina se une a la TM puede existir un incremento de mil veces o más en la velocidad de activación de -la proteína C que forma la enzima anticoagulante proteína C activada. Además, cuando la trombina se une a la TM, la trombina no funciona ya como una enzima procoagulante. Específicamente, la formación de fibrina catalizada por trombina, la activación del factor V, y la activación de las plaquetas, son inhibidas en presencia de TM. De este modo, la TM convierte la trombina en un anticoagulante fisiológico. "Dominio de trombomodulina (TM)" se refiere a una secuencia de aminoácidos discreta que puede ser asociada' con una función o característica particular de la TM, como la unidad estructural terciaria característica. El gen de TM de longitud completa que codifica para un precursor o propolipéptido que contiene los siguientes dominios: aminoácidos -18—1 es la secuencia señal; los aminoácidos 1-226 es la región hidrofóbica N-terminal; los aminoácidos 227-462 es la región rica en cisteína, que consiste de 6 repeticiones EGF similar en serie unidas por péptidos o lazos interdominio pequeños; los aminoácidos 463-497 es la región rica en Ser/Thr glicosilada en 0; los aminoácidos 498-521 es una región transmenbranal hidrofóbica; y los aminoácidos 522-557 es la cola citoplásmica C-terminal. La región rica en cisteina puede ser dividida además en tres dominios: los aminoácidos 226-344 es el EGF123, que consiste de 1, 2 y 3 repeticiones de EGF similar (residuo 226-344); los aminoácidos 345-349 es el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4; y los aminoácidos 350-462 es el EGF456,_ que consiste de.4, 5 'y 6 dominios de EGF similar. Véase por ejemplo, Yost, C.S. et al. (1983) Cell 34(3):759-766; en, D.Z. et al. (1987) Biochemistry 26 (14 ): 4350-4357; y Wang, . et al. (2000), supra, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Los términos "análogo", "fragmento", "derivado" y "variante", cuando se refieren a las proteína de fusión de esta invención, así como las proteínas directoras y los dominios de TM, significan análogos, fragmentos, derivados y variantes . de las proteínas de fusión, proteínas directoras y dominios de TM que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica, como se describe mejor más adelante. Un "análogo" incluye un propolipéptido el cual incluye dentro de este, la secuencia de aminoácido de la proteína de fusión de esta invención. La proteína de fusión activa de esta invención puede ser escindida de los aminoácidos adicionales que completan la molécula de proteína de profusión por procesos naturales in vivo o por procedimientos bien conocidos en la técnica como por escisión enzimática o química. Por ejemplo, la TM nativa es expresada naturalmente como un propilipéptido de 575 aminoácidos el cual es entonces procesado in vivo para liberar el polipeptido maduro activo de 557 aminoácidos. Un "fragmento" es una porción de la proteína _de fusión, la proteína directora o dominios de TM que retiene su actividad funcional sustancialmente similar, como se muestra en los ensayos in vitro descritos aquí como se describe más adelante. Un "derivado" incluye todas las modificaciones a la proteína de fusión que preserve sustancialmente las funciones descritas aquí e incluyen una estructura adicional y la función inherente, por ejemplo proteínas de fusión PEGiladas las cuales tienen una vida media mayor, proteínas de fusión glicosiladas en 0 modificadas por la adición de sulfato de condroitina y proteínas de fusión biotiniladas , como se describe más adelante. "Actividad funcional sustancialmente similar" y "sustancialmente la misma función o actividad biológica" significan cada una que el grado de actividad biológica está dentro de aproximadamente 30% a 100% o más de la actividad biológica demostrada por el polipéptido que está siendo comparado cuando la actividad biológica de cada polipéptido es determinada por el mismo procedimiento o ensayo. Por ejemplo, una proteína de fusión o dominios de TM que tiene una actividad funcional sustancialmente similar a la de la proteína de fusión del Ejemplo 2 (SEQ ID NO: 2) es uno que, cuando se prueba en el ensayo de activación de proteína C ( cromogénico) descrito en el Ejemplo 5, demuestra acumulación de proteína C activada_. Una proteína , directora que tiene una actividad funcional sustancialmente similar a la del anticuerpo anti-TF del Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 1) es una que, cuando se prueba en el ensayo de sTF/FVIIa o ensayos de activación de FX descritas en el Ejemplo 5, demuestra la capacidad de unirse a o neutralizar el TF o el complejo de FVIIa/TF. La "similitud" entre dos polipéptidos es determinada comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos conservados sustitutos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Esas sustituciones conservativas incluyen agüellas descritas anteriormente en The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 por Dayhoff (1978) y por Argos (1989) EMBO J. 8:779-785. Por ejemplo, los aminoácidos pertenecientes a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos: - Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr: - Cys, Ser, Tyr, Thr; - Val, lie, Leu, Met, Ala, Phe; - Lys, Arg, His; - Phe, Tyr, Trp, His; y - Asp, Glu. Otros términos técnicos usados aquí tienen los mismos significados que son usados comúnmente por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención.

Proteina Directora : La proteina . directora de esta invención es una proteina que tiene la capacidad de unirse específicamente a una molécula objetivo preseleccionada particular, por ejemplo, TF o el complejo de FVIIa/TF, y sirve entonces para dirigir la proteína de fusión a una célula o tejido que contenga la molécula preseleccionada. En una modalidad de esta invención, la proteína directora es un anticuerpo que puede unirse a y neutralizar TF o el complejo de FVIIa/TF. "Anticuerpo" como se usa aquí incluye moléculas de inmunoglobulina ("Ig") intactas, así como fragmentos de las mismas, como Fab, F(ab' )2, y Fv, los cuales son capaces de unirse a un epítope de TF o el complejo de FVIIa/TF. Típicamente, se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítope. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos. Típicamente, un anticuerpo que se une específicamente al TF o el complejo de FVIIa/TF proporciona una señal de detección al menos 5- 10- ó 20- veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se use con un ensayo inmunoquímico . Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente al TF o el complejo de FVIIa/TF no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar al TF o el complejo del FVIIa/TF de la solución. El TF o el complejo de FVIIa/TF puede ser usado para inmunizar un mamífero, como un ratón, rata, conejo, cerdo, mono, o humano para producir anticuerpos policlonales . Si se desea, el TF o el complejo de FVIIa/TF puede ser conjugado con una proteína portadora, como seroalbúmina bovina, tiroglobulina, y hemocianina de cangrejo bayoneta. Dependiendo de las especies anfitrionas, pueden ser usados varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica . Esos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensoactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de cangrejo bayoneta, y dinitrofenol ) . Entre los adyuvantes usados en humanos, BCG (bacillus de Calmette-Guerin) y Cornybacterium parvum son especialmente útiles. Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al TF o el complejo de FVIIa/TF pueden ser preparados usando cualquier técnica que proporcione a la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares en cultivo continuo. Esas técnicas incluyen, pero no se limitan, a la técnica del hibridoma, la técnica -del hibridoma de células B humanas, y la técnica del hibridoma de EBV (Kohler et al (1985) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc. Nati. Ácad. Sci . EUA 80:2026-2030; y Cote et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120). Además, pueden ser usadas las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de genes de anticuerpo de ratón a genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad antigénica y actividad biológica apropiada (Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851- 6855; Neuberger et al. (1984) Nature Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) 314:452-454). Los anticuerpos monoclonales y otros también pueden ser "humanizados" para evitar que un paciente monte una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando este sea usado terapéuticamente. Esos estudios pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos a ser usados directamente a la proteina de fusión o pueden requerir la alteración de unos cuantos residuos clave. Las diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedor y secuencias humanas pueden ser minimizadas reemplazando los residuos que difieren de aquellos en las secuencias humanas por mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales o injertando todas las regiones que determinan la.- -Gomplementariedad. De manera alternativa, los anticuerpos humanizados pueden ser producidos usando métodos recombinantes, como se describe en la GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a TF el complejo de FVIIa/TF pueden contener sitios de unión de antígeno los cuales están parcialmente o completamente humanizados, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,565,332. De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena pueden ser adaptadas usando métodos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de una sola cadena que se unan específicamente al TF o el al complejo de FVIIa/TF. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica distinta, pueden ser generados arrastrando la cadena de bibliotecas de Ig combinadas aleatoreamente (Burton (1991) Proc . Nati. Acad. Sci. 88: 11120-11123) . Los anticuerpos de una sola cadena tamben pueden ser construidos usando un método de amplificación de ADN, como la PCR, usando ADNc de hibridoma como patrón o molde (Thirion et al. (1996) Eur. J. Cáncer Prev. 5:507-511). Los anticuerpos de una sola cadena pueden ser mono- o biespecí fieos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de una sola cadena tetravalentes, biespecificos es ensañada, por ejemplo, ß?· Coloma y Morrison (1997) Nati. Biotechnol. 15:159-163. La construcción de anticuerpos de una sola cadena bivalentes, biespecificos es ensañada en Mallendar y Voss (1994) J. Biol. Chem. 269:199-216. Una secuencia nucleotídica que codifique para un anticuerpo de una sola cadena puede ser construida usando síntesis nucleotídica manual o automatizada, clonada en un plásmido recombinante de expresión usando métodos de ADN recombinante estándar, e introducido en una célula para expresar la secuencia codificadora. De manera alternativa, los anticuerpos de una sola cadena pueden ser producidos, directamente usando, por ejemplo, la tecnología de presentación- de fagos filamentosos (Verhaar et al. (1995) Int. J. Cáncer 61:497.-501; y Nicholls et al. (1993) J. Immunol. Meth. 165:81-91). Los anticuerpos que se unen específicamente al TF o el complejo de FVIIa/TF también pueden ser producidos induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o seleccionando bibliotecas de Ig o paneles de reactivos de unión de alta especificidad como se describe en la literatura (Orlandi et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:3833-3837; Winter 'et al. (1991) Nature 349:293-299) . En otra modalidad de. esta invención, la proteína directora es una entidad directora diferente a un anticuerpo que puede unirse a y neutralizar el TF. Dos de esos ejemplos son el factor inhibido en el sitio activo FVIIa (FVIIai) y el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) . Ambos del FVIIa y el FVIIai forman un complejo de alta afinidad con TF (Sorenson, B.B. y Rao, L.V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (Suppl 1):S67-71). El FVIIai es el anticoagulante neutralizante de TF que actúa compitiendo con el FVIIa endógeno por la unión al TF expuesto. El FVIIai inhibe la capacidad del FVIIa proteoliticamente activo para formar un complejo de FVIIa-TF competente y de esta forma inhibe el inicio de la coagulación. Mediante la fusión genética de los dominios de TM al FVIIai, La TM podría ser dirigida a superficies protrombóticas ricas en TF. El ADNc que codifica para el FVII humano ha sido aislado y secuenciado (Hagen, H.S. et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 83 ( 8 ): 2412-246, la cual se incorpora aquí como referencia) . El ADNc de FVII humano puede ser producido por las técnicas de ADN recombinante estándar partiendo de ARNm aislado de hígado humano. El FVIIai puede ser producido haciendo mutar la serina del sitio activo por las técnicas de ADN recombinante estándar o tratando químicamente el' FVIIa catalíticamente activo con peptidil clorometilcetona , la cual modifica de manera reversible e inhibe el sitio de acción. El TFPI dirige e inhibe el complejo de FVIIa/TF en una forma dependiente del FXa (Salemink, I. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 ( 0 ): 28225-28232 ) . El TFPI se une primero al FXa y entonces el complejo de TFPI-FXa se une a e inhibe el complejo de FVIIa/TF. Mediante la fusión genética de dominios de TM a TFPI, la TM podría ser dirigida a superficies protrombóticas ricas en TF.

El ADNc que codifica para el TFPI humano ha sido aislado y secuenciado (Wun, T.C. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263(13)6001-6004, el cual es incorporado aqui como referencia) . El ADNc de TFPI humano puede ser producido por técnicas de ADN recombinante estándar partiendo de ARNm aislado de hígado humano. La proteína directora de esta invención (es decir, los anticuerpos u otras proteínas relevantes) puede ser expresada y purificada por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos y proteínas pueden se purificados por afinidad haciéndolos pasar sobre una columna a la cual se una el TF. Los anticuerpos o proteína unidas pueden entonces ser eluídos de la columna usando un amortiguador con una concentración alta en sal. En una modalidad preferida de esta invención, la proteína directora es un anticuerpo de scFv que se une a TF que inhibe la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF y no compite con la unión con el FVIIa. Para producir el anticuerpo de scFV que se une al TF, la biblioteca de anticuerpo humano HuPLaBL3, la cual fue presentada sobre fago filamentoso, fue seleccionada contra TF soluble inmovilizado. Los anticuerpos del fago que se une a TF fueron sobreexpresados en E.coli y purificados por afinidad usando una columna e-marca. Los anticuerpos purificados fueron caracterizados además usando BIAcore, un ensayo del factor Vlla dependiente de sTF (ensayo de sTF/FVIIa) , un ensayo de activación de FX, y el ensayo de PT. La secuencia del anticuerpo de scFV que se une a TF, designada como scFV (TF) 3el0 , como se muestra en el Ejemplo 1 y corresponde a la SEQ ID NO: 1. El aislamiento, producción y caracterización del anticuerpo de scFV que se une al TF son descritos con mayor detalle más adelante.

Trombomodulina : La porción del (los) dominio (s) de TM de la proteina de fusión actúa como un cofactor de la activación de proteina C catalizada por trombina, lo cual a su vez degrada los factores Va y VIla previniendo por lo tanto además la formación de trombos. Los dominios de TM incluyen por ejemplo el dominio de la región hidrofóbica N-terminal, el dominio EGF123, el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4 , el dominio EGF456, y el dominio de- la región rica en Ser/Thr glicosilada en 0. El dominio EGF456, en particular, media la unión de la trombina y la activación de la proteina C (Kurosawa, S. et al (1988), supra y Zushi, M et al. (1989) supra). En modalidades preferidas de esta invención, la porción de los dominios de' TM de la proteina de fusión comprende el dominio EGF456 solo o en combinación con uno o^ más de otros dominios de TM. En modalidades aún más preferidas de esta invención, el dominio EGF456 contiene mutaciones puntuales que vuelven la proteina más resistente al daño oxidativo y proteasas y/o incrementan su eficiencia catalítica. La secuencia de ADN de longitud completa que codifica para la TM humana facilita la preparación de genes y es usada como un punto inicial para construir secuencias de ADN que codifiquen para péptidos de TM y proteínas de fusión que contengan TM y fragmentos/péptidos de TM. El gen de longitud completa para la TM puede ser preparado por varios métodos. Las bibliotecas genómicas humanas se encuentran comercialmente disponibles. Las sondas oligonucleotídicas , específicas para esos genes, pueden ser sintetizadas usando la secuencia del gen modificada. Los métodos para seleccionar bibliotecas genómicas con sondas oligonucleotídicas son conocidos.' La publicación de la secuencia del gen para TM demuestra que no existen intrones dentro de la región codificadora. De este modo, una clona genómica proporciona el material inicial necesario para construir un plásmido de expresión para TM usando métodos conocidos. Un fragmento de ADN que codifique para TM puede ser recuperado tomando ventaja de los sitios de endonucleasa de restricción que han sido identificados en regiones que flanquean o están internas al gen. (Jackman, R. . et al. (1987), supra) . De manera alternativa, los genes de longitud completa también pueden ser obtenidos de un banco de ADNc. Por ejemplo, el ARN mensajero preparado a partir de células endoteliales proporciona material inicial adecuado a partir de la preparación de ADNc. Los métodos para producir bancos de ADNc son bien conocidos (véase por ejemplo, Sambrook, J.F. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), la cual se incorpora aquí como referencia) .

Proteína de Fusión: La proteina de fusión anticoagulante de esta invención comprende una proteina directora que se une a cualquiera del TF o el complejo de FVIIa/TF, y que está ligado operativamente al dominio de EGF456 de TM solo o en combinación con al menos otro dominio dé TM seleccionado del grupo que consiste del dominio de la región hidrofóbica N-terminal, el dominio de EGF123, del- lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, y el dominio rico en Ser/Thr glicosilado en 0, o análogos, fragmentos, derivados o variantes del mismo. La proteina de fusión puede comprender la proteina directora ligada con los dominios de TM en cualquier combinación. En una modalidad particularmente preferida, la proteina de fusión comprende un anticuerpo que se une a TF, ligado operativamente al dominio EGF456 de TM y enlace interdominio entre el EGF3 y el EGF4 ("TMÍ456") , o análogos, 'fragmentos, derivados o variantes del mismo. La proteina de fusión de la presente invención incluye, pero no se limita a, plásmidos recombinantes en los cuales la porción C-terminal de un anticuerpo de una sola cadena está fusionada a la porción N-terminal de un análogo, fragmento, un derivado o variante, de un dominio de TM, la porción C-terminal de un anticuerpo de IgG está fusionada a la porción N-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, la porción C-terminal de un anticuerpo de Fab está fusionada a la porción N-terminal de un análogo, fragmento, derivado o variante de un dominio de TM, la porción N-terminal de un anticuerpo de una sola cadena está fusionada a la porción C-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, la porción N-terminal de un anticuerpo de IgG está fusionada a la porción C-terminal.de un análogo, fragmento, derivado o una variante . de un dominio de TM, la porción N-terminal de un anticuerpo de Fab está fusionada a la porción C-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, más de un anticuerpo de una sola cadena está fusionado a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, más de un anticuerpo de IgG está fusionado a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, más de un anticuerpo de Fab está fusionada a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM, más de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM está fusionado a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un anticuerpo de una sola cadena, más de un análogo, fragmento, derivado o una variante dé un dominio de -TM está fusionada a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un anticuerpo de IgG, más de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM está fusionada a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un anticuerpo de Fab, uno o más de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un dominio de TM está fusionada a ambas de las porciones N-terminal y C-terminal de un anticuerpo .dimérico de una sola cadena. . - - -¦ Las proteínas de fusión de la presente invención incluyen las proteínas de fusión de los Ejemplos 2 (SEQ ID NO: 2) y 3 (SEQ ID NO: 3), así como aquellas proteínas de fusión que tienen variaciones no sustanciales en las secuencias de ellas. Una "variación no sustancial" incluiría cualquier variante de secuencia, sustitución o supresión que mantenga sustancialmente al menos una función biológica de los polipéptidos de esta invención, preferiblemente actividad de cofactor para la activación de la proteina C mediada por trombina. Esos equivalentes funcionales pueden incluir preferiblemente proteínas de fusión que tengan al menos una identidad de aproximadamente el 90% con las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3, y de manera más preferible al menos una identidad del 95% con las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3, y de manera aún más preferible al menos una identidad del 97% con las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3 , y también incluyen porciones de esas proteínas de fusión que tienen sustancialmente la misma actividad biológica. Sin embargo, cualquier proteína de fusión que tenga una variación insustancial en una secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 y 3 que demuestre equivalencia funcional como se describe mejor aquí está incluida en la descripción de la presente invención. .. ¦ . . En otra modalidad, la proteína de fusión comprende un anticuerpo que se une al TF ligado operativamente al dominio EGF3 de TM, lo cual es requerido para activar el activador de la fibrinólisis activable por trombina (TAFI) .

Análogos , Fragmentos , Derivados y Variantes : Un análogo, fragmento, derivado o variante de las proteínas de fusión, así como las proteínas directoras o dominios de TM, de la presente invención puede ser: (i) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales estén sustituidos con un aminoácido residual conservado o no conservado (preferiblemente un aminoácidos residual conservado) y ese aminoácido residual sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético; o (ii) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual la proteína de fusión madura está fusionada con otro compuesto, como un compuesto para incrementar la vida media de la protéína de fusión (por ejemplo, polietilenglicol) , o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales están fusionados a la proteína de fusión madura, como una secuencia líder o secretora o una secuencia que es empleada para la purificación de la proteína de fusión madura, o (v) uno en el cual la secuencia polipeptídica . está .fusionada con un polipéptido más grande, es decir, albúmina humana, un anticuerpo o Fe, para incrementar la duración del efecto. Se considera que esos análogos, fragmentos, derivados y variantes están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Preferiblemente, los derivados de la presente invención contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas (definidas mejor más adelante) producidas en uno o más aminoácidos residuales preferiblemente no esenciales, predichos. Un aminoácido residual "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia natural de una proteina sin alterar la actividad biológica, mientras que un aminoácido residual "esencial" es requerido para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la cual el aminoácido residual es reemplazado con un aminoácido residual que tiene una cadena lateral similar. Las familias de aminoácidos residuales que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Esas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, ser-ina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina,. isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales ramificadas en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Las sustituciones no conservativas no serian producidas por aminoácidos residuales conservados o por aminoácidos residuales que residan dentro de un dominio de proteina conservado, a menos que las sustituciones no conservativas se produzcan para hacer la proteina de fusión resultante más resistente al daño oxidativo y proteasas y/o incrementar su eficiencia catalítica. Los fragmentos o porciones biológicamente activas incluyen fragmentos polipeptídicos adecuados para usarse como medicamento, como un reactivo de investigación, y similares. Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácido suficientemente similares a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de una proteína de fusión de. esta invención y que exhiben al menos una actividad de ese polipéptido, pero que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos de longitud completa descritos aquí. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido. Una porción biológicamente activa del polipéptido puede ser un péptido que sea, por ejemplo de 5 o más aminoácidos de "longitud. Esas porciones biológicamente activas pueden . ser preparadas sintéticamente o por técnicas recombinantes y pueden ser evaluadas por una o más de las actividades funcionales de un polipéptido de esta invención por los medios descritos aquí y/o bien conocidos en la técnica. Además, los derivados preferidos de la invención incluyen proteínas de. fusión maduras que han sido fusionadas con otros compuestos, como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido y/o para reducir la inmunogenicidad potencial del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol, "PEG") . El PEG puede ser usado para impartir solubilidad en agua, tamaño disminuir la velocidad de eliminación renal, y reducir la inmunogenicidad a la proteina de fusión. Véase por ejemplo, la Patente Estadounidense 6,214,966. En el caso de las PEGilaciones , la fusión de la proteina de fusión a PEG puede ser efectuada por cualesquier métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, la PEGilación puede ser efectuada introduciendo primero una mutación de cisteina en la proteina de fusión, seguida por derivación especifica del sitio con PEG-maleimida . La cisteina puede ser agregada al C-terminal de los péptidos. Véase, por ejemplo, Tsutsumi et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 97 ( 15) : 8548-8553. Otra modificación que puede ser efectuada en la proteina de fusión implica la biotinilación . En ciertos casos, puede ser útil tener la proteina de. fusión biotinilada _de modo que pueda reaccionar fácilmente con estreptavidina . Los métodos para la biotinilación de proteínas son bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, el sulfato de condroitina puede ser ligado con proteína de fusión. Las variantes de las proteínas de fusión, proteínas directoras y dominios de T de esta invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión, proteínas directoras y dominios de TM originales. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de aminoácidos residuales idénticos o equivalentes en relación a una segunda secuencia de aminoácidos, de modo que la primera y segunda secuencia de aminoácidos tengan un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que es al menos aproximadamente 45%, de manera preferible aproximadamente 75% hasta 98%, idénticos son definidas aquí como suficientemente similares. Preferiblemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión preferidas de esta invención. Las variantes incluyen variantes de proteínas de fusión codificadas por un polinucleótido que se híbrida a un polinucleótido de esta invención o un complemento del mismo bajo condiciones rigurosas. Esas variantes generalmente retienen la actividad funcional de las proteínas de fusión de esta invención. Pueden ser usadas bibliotecas de fragmentos de los polinucleótidos para generar una población variada de fragmentos para la separación y selección subsecuente. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos puede ser generada tratando un fragmento de un polinucleótido de PCR de doble hebra con una nucleasa bajo condiciones donde ocurra únicamente solo un corte por molécula, desnaturalizando el ADN de doble hebra, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble hebra, el cual puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos cortados, remover porciones de una sola hebra de dúplex reformados con tratamiento con nucleasa SI, y ligando la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifique para fragmentos N-terminales e internos de varios tamaños de las proteínas de fusión de esta invención. Las variantes incluyen proteínas de fusión, así como proteínas directoras y dominios de TM, que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las variantes que tienen actividad de cofactor para la activación de proteína C mediada por trombina pueden- ser identificadas seleccionando bibliotecas combinadas de mutantes, por ejemplo mutantes de truncación o puntuales, de las proteínas de fusión o dominios de TM de esta invención, usando el ensayo de activación de proteína C descrito en el Ejemplo 5. Las variantes que tienen actividad de unión de TF o complejo de VIla/TF pueden ser identificadas seleccionando bibliotecas combinadas de mutantes, por ejemplo mutantes de truncación o puntuales, de las proteínas de fusión o proteínas directoras de la invención usando el ensayo de sTF/FVIIa o ensayo de activación de FX del Ejemplo 5 descritos en el Ejemplo 5. Además, los análogos bioequivalentes de las proteínas de fusión también pueden ser construidos produciendo varias sustituciones sobre residuos o secuencias en la porción de los dominios de TM de la proteínas de fusión el cual puede hacer la proteína de fusión más resistente al daño por oxidación o proteasa, véase por ejemplo, la Patente Estadounidense 5,827,824, o incrementar la eficiencia catalítica de la proteína de fusión, véase, por ejemplo Adler, M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 ( 40) : 23366-23372 y la solicitud de patente PCT WO01/98352, publicada en Diciembre 27, 2001, todas las cuales se incorporan completamente aquí como referencia. En una modalidad, es generada una biblioteca de variantes variable por mutagénesis combinada al nivel del ácido nucleico y es codificada por una biblioteca genética variable. Una biblioteca de variantes variable puede ser producida, por ejemplo, enzimáticamente ligando una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias genéticas de modo que un conjunto degenerado de secuencias de aminoácidos variantes potenciales sea expresable como polipéptidos individuales, o, de manera alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para presentar fagos) que contenga el conjunto de secuencias en él. Existen una variedad de métodos que pueden ser usados para producir bibliotecas de variantes potenciales a partir de una secuencia oligonucleotidica degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada puede ser efectuada en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético ligado entonces en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifiquen para el conjunto deseado de secuencias variantes potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984a) Annu.. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984b) Science 198: 1056; Ike. et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Se conocen varios métodos, en la técnica para seleccionar productos genéticos de bibliotecas recombinantes producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para seleccionar bibliotecas de ADNc para productos genéticos que tengan una propiedad seleccionada. Esas técnicas son adaptables para la selección rápida de las bibliotecas genéticas generadas por la mutagénesis combinada de proteínas de fusión, así como proteínas directoras y dominios de TM, por la actividad del cofactor para la activación de proteina C mediada por trombina o actividad de unión de TF o complejo de FVIIa/TF. Las técnicas más ampliamente usadas, las cuales son adecuadas para el análisis de alto rendimiento para seleccionar bibliotecas genéticas grandes incluyen típicamente la clonación de la biblioteca genética en vectores de expresión replicables, transformación de las células apropiadas con la biblioteca resultante de los vectores y expresión de los genes combinados bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica para gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis montable recursiva (REM) , una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en la biblioteca, puede ser usada en combinación con los ensayos de selección para identificar las variantes deseadas.

Producción de proteínas de fusión : La proteína de fusión de esta invención es producida fusionando la proteina directora, o uniendo de otro modo esta a, los dominios de TM o análogos, fragmentos, derivados o variantes de la misma por cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. Los dos componentes pueden ser unidos químicamente con cualquiera de una variedad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo, el enlace puede ser por medio de reticuladores heterobifuncionales , por ejemplo, SPDP, carbodiimida, glutaraldehído y similares. En una modalidad más preferida, la proteína directora de esta invención puede ser fusionada a los dominios de TM por medios recombinantes como a través del uso de técnicas de ADN recombinante para producir un ácido nucleico que codifique para ambas de la proteína directora y el polipéptido que codifique para el dominio de TM y expresando la secuencia de ADN en una célula anfitriona como E. coli o una célula de mamífero. El ADN que codifica para la proteína de fusión puede ser clonado en ADNc o en forma genómica por cualquier procedimiento de clonación conocido por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook, J.F. et al. (1989) supra. En el caso donde la proteína directora es el anticuerpo, una vez que ha sido, identificada., una - secuencia-de ADN que codifica para una región Fv la cual cuando es expresada muestra actividad de unión específica, las proteínas de fusión que comprenden la región Fv pueden ser preparadas por los métodos conocidos por un experto en la técnica. De este modo, por ejemplo, Chaudhary, V.K. et al. (1989) Nature 339(6223): 394-397; Batra, J.K. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265 (25) : 15198-15202; Batra, J.K. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86 (21) : 8545-8549; Chaudhary, V.K. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87 (3) : 1066-1070, todas incorporadas aquí como referencia, describen la preparación de varias proteínas de fusión de anticuerpo de una sola cadena. La región Fv puede ser fusionada directamente a los dominios de TM o puede ser unida vía una secuencia enlazante. La secuencia enlazante puede estar presente simplemente para proporcionar espacio entre la porción directora y los dominios de TM o para facilitar la movilidad entre esas regiones para permitirles a cada una alcanzar su conformación óptima. La secuencia de ADN que comprende el conector también puede proporcionar secuencias (como un cebador o sitios de restricción) para facilitar la clonación o puede preservar el marco de lectura entre la. secuencia que codifica para la porción directora y la secuencia que codifica para los dominios de TM. El diseño de esos péptidos conectores será bien conocido por aquellos expertos en la técnica.. En la presente invención, pueden ser usadas secuencias enlazantes para enlazar la proteína directora con los dominios de TM. En una modalidad preferida de la presente invención, son usadas dos secuencias enlazantes para construir una proteína de fusión comprendida de un anticuerpo de una sola cadena y el dominio EGF546 de TM y el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4 (TMÍ456) . La primera enlaza los dominios pesado y ligero del anticuerpo de una sola cadena. La primera secuencia enlazante es de 5 aminoácidos -de longitud. Será evidente que pueden ser usadas otras secuencias enlazantes más cortas, de 0 a 10 aminoácidos. El segundo enlazante en la presente invención es un enlazante de 15 aminoácidos que liga el anticuerpo a los dominios de T . Será evidente a aquellos expertos en la técnica que pueden ser usadas muchas secuencias enlazantes diferentes y aún tener como resultado una proteína de fusión que retenga la actividad anticoagulante y la activación de la proteina C. Las modificaciones del enlazante existente tendrán como propósito maximizar la mejora de la activación de la proteína C sobre superficies fotolipídicas que contengan TF. En un método preferido, el anticuerpo de una sola cadena fue preparado usando una biblioteca presentadora de fagos. En el primer paso de construcción de una biblioteca presentadora de fagos, los genes variables (VH(de IgM)V7 y VL) fueron clonados por PCR a partir del ARNm reunido de medula ósea, nodos linfáticos y bazos humanos usando un conjunto de cebadores específicos de la familia. Las bibliotecas de pCITE-VH (3.8xl09 miembros), pZ604-V/e (1.6xl07) y pZ604-VL (3.2xl07) resultantes representan genes de V permanentes y de alta diversidad. Los genes de VH fueron amplificados a partir de la biblioteca de pCITE-VH. Los genes de V y VL fueron amplificados por PCR a partir de las. bibliotecas de pZ604-V7c y pZ604-VL con JH inversa y la secuencia enlazante en el extremo 5' . Los productos de PCR que contienen VH, Vc, y VL purificados por gel fueron entonces empalmados juntos para producir el repertorio de genes de scFV. El repertorio de genes de scFV fue clonado a un vector fagémido pZ603, y el producto., de la ligación fue sometido a electroporación en células E. coli TG1 competentes para generar la biblioteca presentadora de fago scFV, HuPhabL3, con 5.2xl09 individuos transformantes (Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3 ): 581-597 ; Sheets, .D. et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95(11) :6157-6162) . En una modalidad preferida de la presente invención, se preparó un anticuerpo de una sola cadena (scFv (TF) 3e*10) el cual tiene un solo sitio de unión de VH/VL, para TF. La secuencia de aminoácidos de scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 1), se describe en el Ejemplo 1. En una modalidad preferida de la presente invención, un fragmento de PCR que contiene la secuencia de TMÍ456 (con las mutaciones 388L y H381G) flanqueada por sitios de Notl fue subclonada en el sitio de Notl del pZ612/3elO (un vector de expresión bacteriano para scFv(TF)3elO basado en pCANTAB5 de Pharmacia). Aquí, las mutaciones puntuales en las porciones de TM de las proteínas de fusión de la invención son especificadas con la designación de una sola letra del aminoácido residual de la TM nativa, seguida por el número de posición del aminoácido en la TM madura y la designación de una sola letra de la mutación de aminoácido. Por ejemplo, M388L indica que la metionina en la posición del aminoácido 388 de la TM madura ha cambiado a leucina. El sitio de Notl se encuentra entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de e-marca. Esto generó un plásmido recombinante de expresión bacteriano (pKMIOl) por una proteína de fusión comprendida de scFv (TF) 3el0 - un enlazante de 15 aminoácidos - TMÍ456, seguido por la secuencia de e-marca. Para generar un vector de expresión de mamífero primero se generó un fragmento de PCR a partir del patrón o molde de pKMIOl. Este fragmento fue diseñado para ligarse en los sitios de StuI/MscI del vector de expresión . pTHR525- de TM.-Esto generó un vector (pKM113) que tuvo la secuencia señal de Solulina seguida por la secuencia de la proteína de fusión madura seguida por la secuencia de e-marca. El vector contiene el gen de resistencia a la ampicilina e hidromicina marcadores de selección de DHFR. La expresión es dirigida por el promotor MPSV LTR. La mutagénesis dirigida al sitio fue efectuada sobre ese vector para incluir las mutaciones R456G y H457Q las cuales confieren resistencia a la proteasa a la porción de TM. El vector resultante es referido como pKM115. El vector pMK115 tuvo un enlazante de 15 aminoácidos que separa los dominios de VH y VL y otro enlazante de 15 aminoácidos que separa el dominio de VL del TMÍ456. El enlazante que separa VH y VL disminuyó a 5 aminoácidos para dirigir la formación de un dimero de mayor avidez, referido como pHM115.5. La proteína de fusión codificada por el pHM115.5, scFv(TF) 3elO-TMi456 (SEQ ID NO: 2), se describe en el Ejemplo 2. Se generó un vector adicional, pKM125, usando la tecnología del ADN recombinante estándar suprimiendo tres aminoácidos (GAP) entre el enlazante de 5 aminoácidos que separa los dominios de VH y VL y suprimiendo la e-marca en el C-terminal de la proteína de fusión. La proteína de fusión resultante, scFv(TF) 3elO-TMi456A (SEQ ID NO: 3), es descrita en el Ejemplo 3.

Expresión y Purificación de Proteínas de Fusión: Existen varias formas de expresar las proteínas de fusión recombinantes in vitro, incluyendo células de E. coli, baculovirus, levadura, mamífero u otros sistemas de expresión. Los métodos para la expresión de genes clonados en bacterias son bien conocidos. Para obtener un nivel de expresión alto de un gen clonado en un sistema de procariótico, es esencial construir vectores de expresión que contengan, al menos, un promotor fuerte para dirigir la terminación de la transcripción del ARNm. Los ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este propósito son la región promotora y operadora del gen de la beta-glicosidasa de E. coli, la vía biosintética del triptofano de E. coli, 0 -el promotor hacia la izquierda del fago Lambda. La inclusión o selección de marcadores en vectores de ADN transformados en E. coli es útil. Los ejemplos de esos marcadores incluyen los genes que especifican la resistencia a la ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol . De los sistemas celulares eucarióticos superiores útiles para la expresión de las proteínas de fusión y análogos de los mismos, existen numerosos sistemas celulares a seleccionar. Los ejemplos ilustrativos de líneas celulares de mamífero incluyen, pero no se limitan a células RPMI 7932, VERO y HeLa, líneas celulares de ovario ~de~ "hámster "chino (CHO) , líneas celulares I38, BHK, COS-7,, C127 o MDCK. Una línea celular de mamífero preferida es CHL-1. Cuando es usada CHL-1 se incluye higromicina como un marcador de selección eucariótico. Las células son derivadas de células de melanoma RPMI 7032, una línea celular humana fácilmente disponible. La línea celular CHL- 1 ha sido depositada con la ATCC de acuerdo con las condiciones del tratado de Budapest y se le ha asignado el #CRL 9446, depositado en Junio 18, 1987. Las células adecuadas para usarse en esta invención pueden estar comercialmente disponibles de la ATCC. Las lineas celulares ilustrativas incluyen Spodoptera frugiperda y Bombyx morí. El sistema procariótico, E. coli, no es susceptible a la modificación postraslacional , como la glicosilación . Además, las proteínas con patrones disulfuro complejo son con frecuencia mal plegadas cuando son expresadas en E. coli. Para la proteína de fusión descrita aquí hubo una reducción marcada en la actividad de cofactor de trombomodulina cuando se expresó en E. coli aunque ambas actividades . estuvieron aún presentes.. Con el sistema procariótico, la proteína expresada está presente en el citoplasma celular en una forma insoluble llamada cuerpo de inclusión, encontrada en la fracción soluble después de que la célula ha sido lisada, o es dirigida al periplasma por la adición de la secuencias de señal de secreción apropiadas . ai la proteína expresada está en cuerpos de inclusión insolubles, usualmente se requiere al solubilización y repliegue posterior de los cuerpos de inclusión. Muchos vectores, de expresión procarióticos son conocidos por aquellos expertos en la técnica' como las pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suiza), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, EUA) y pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI, EUA), los cuales se encuentran comercialmente disponibles. Los promotores comúnmente usados en los sistemas de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang, A.C. et al. (1978) Nature 275 ( 5681 ): 617-624 ; Goeddel, D.V. et al. (1979) Nature 281 (5732 ): 544-548 ) , el sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, D.V. et.al. (1980), Nucí. Acids Res. 8 (18) : 4057-4074) y el promotor de tac (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ) . Otro sistema de expresión bacteriano útil emplea el promotor del fago lamba pL y el represor termoinducible clts857 (Bernard, H.U. et al. (1979) Gene 5(l):59-76; Love, C.A. et al. (1996) Gene 176 ( 1-2 ) : 49-53) . Las proteínas de fusión recombinantes también pueden ser expresadas en levaduras anfitrionas como Saccharomyces cerevisiae. Esto usualmente da "la capacidad de efectuar varias modificaciones postraslacionales . La proteína de fusión expresada puede ser secretada hacia el sobrenadante del cultivo donde no pueden recibir otras proteínas, haciendo la purificación más fácil. Los vectores de levadura para la expresión de proteínas de fusión en esta invención contienen ciertas características requisito. Los elementos del vector son derivados generalmente de levaduras y bacterias para permitir la propagación del plásmido en ambos. Los elementos bacterianos incluyen un origen de replicacion y un marcador seleccionable. Los elementos de levadura incluyen un origen de la secuencia de . replicacion (ARS) , un marcador seleccionable, un promotor, y un terminador transcripcional . Los promotores adecuados en vectores de levadura para la expresión incluyen los promotores del gen de TRPl, el gen ADH1 o ADHII, el gen de fosfatasa ácida (PH03 o PH05) , el gen de isocitocromo, o los promotores implicados en la vía glicolitica, como el promotor de enolasa, el gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) , 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), hexocinasa, piruvato cinasa, triosfosfato isomerasa y fosfoglucosa isomerasa (Hitzeman, R.A. et al. (1980) J. Biol. Chem. 255 (24 ) : 12073-12080 ; Hess, B . et al. (1968) J. Adv. Anzyme Reg. 7:149-167; y Holland, M.J. y Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17~(23) : 4900-4907) . ' ~ ' Los vectores de levadura comercialmente disponibles incluyen pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA) , Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA) , pBC102-K22 (ATCC # 67255), y YpGX265GAL4 (ATCC# 67233) . Las líneas celulares de mamífero incluyendo, pero sin limitarse a COS-7, células L, C127, 3T3, Ovario de Hámster Chino (CHO) , HeLa, BH , CHL-1, NSO, y HEK293 pueden ser empleadas para expresar las proteínas de fusión recombinante de esta invención. Las proteínas recombinantes producidas en células de mamífero normalmente son solubles y está glicosiladas y tienen N-terminales auténticos. Los vectores de expresión de mamífero pueden contener elementos no transcritos como un. origen de replicación, promotor o mej orador, y secuencias no traducidas 5' o 3' como sitio de unión ribosomal, un sitio de poliadenilación, sitio receptor y donador, y secuencias terminadores de la transcripción. Los promotores para usarse en vectores de expresión de mamífero usualmente son por ejemplo promotores virales como, Polioma, Adenovirus, HTLV, Virus de Simio 40 (SV 40) , y citomegalovirus humano (C V) . Dependiendo del sistema de expresión y del anfitrión seleccionado, una proteína de fusión recombinante homogénea puede ser obtenida usando varias combinaciones de cromatografía convencional usadas para la purificación de proteínas. Esas incluyen: cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía en fase inversa, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración por gel, y CLAP · si el sistema de expresión secreta la proteína de fusión hacia los medios de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente de los medios. Si la proteína de fusión no es secretada, es aislada de los lisados celulares. La disrupción celular puede ser efectuada por cualquier método convencional, incluyendo un ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, disrupción mecánica o el uso de agentes de lisis celular. En una modalidad preferida dé esta invención, los plásmidos recombinantes de expresión de mamífero fueron transfectados en células CHO DXB11. Se seleccionaron poblaciones estables usando 400 µg/ml de higromicina B en medio HAMS/F12. Los niveles de expresión fueron de aproximadamente 500 («g/L. Para incrementar los niveles de expresión se seleccionó una población usando metotrexato 100 nM en medio MEM alfa. El nivel de expresión aproximado de esta población fue de 5 mg/L. El plásmido recombinante de fusión contiene la secuencia e-marca en el C-terminal de la proteína. Las columnas de afinidad e-marca fueron compradas de American/Pharmacia Biotech. Los medios de cultivo- celular fueron filtrados a través de un filtro de 0.22 µt? y cargados en una columna e-marca de 5 mi a 2 ml/min. La columna fue lavada con NaN3 al 0.05% en amortiguador de fosfato 0.2 M, pH 7.0, y entonces recolectada en tubos que contenían 0.1 volumen de amortiguador de Tris 1M, pH 8.2 para neutralizar el amortiguador de elusión. Alternativamente, el medio de cultivo filtrado fue cargado sobre una columna de proteína A. En este caso, la columna fue lavada con ácido cítrico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 6.5 y eluida con el mismo amortiguador a pH 3.0. En ambos casos, las muestras purificadas fueron cargadas posteriormente sobre una columna Sephadex 200 para separar las formas monoméricas de las diméricas de la proteina de fusión.

Composiciones Farmacéuticas : La invención también proporciona composiciones farmacéuticas las cuales pueden ser administradas a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser preparadas para administrarse combinando proteínas de fusión que tengan un grado deseado de pureza y la cantidad farmacéuticamente efectiva con vehículos o portadores fisiológicamente aceptables. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser usadas en composiciones farmacéuticas, para administración intravenosa o administración subcutánea o administración intratecal. De este modo, las proteínas de fusión descritas anteriormente preferiblemente serán combinadas con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, como dextrosa al cinco por ciento, solución de Ringer lactada, solución salina normal, agua estéril o cualquier otra solución amortiguadora fisiológica preparada comercialmente diseñada para infusión intravenosa. Deberá comprenderse que la selección de la solución portadora y la dosis y administración de la composición variarán con el sujeto y el escenario clínico particular, y serán gobernadas por procedimientos médicos estándar. De acuerdo con los métodos de la presente invención, esas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en cantidades efectivas para inhibir las consecuencias patológicas asociadas con el exceso de generación de trombina en el sujeto. La administración de la proteína de fusión puede ser por inyección intravenosa vía un bolo, por una infusión intravenosa constante o por una combinación ,de ambas rutas. De manera alternativa, o además, la proteína de infusión mezclada con los excipientes apropiados puede ser llevada a la circulación desde un sitio intramuscular. El tratamiento sistémico con proteína de fusión puede ser verificada determinando el tiempo de tromboplastina parcial activada (PT) sobre muestras en serie de sangre tomada del paciente. El tiempo de coagulación observado en este ensayo es prolongado cuando se logra un nivel suficiente de proteína de fusión en la circulación. Las proteínas de fusión recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son útiles para administración parenteral, tópica, intravenosa, oral o local. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una variedad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitarias pueden ser administradas en formas que incluyen pero no se limitan a tabletas, cápsulas, polvos, soluciones y emulsiones. Las proteínas de fusión recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración intravenosa. Las composiciones para la administración comúnmente comprenden una solución del anticuerpo de una sola cadena o una proteína de fusión que comprende el anticuerpo de una sola cadena disuelto en un portador o vehículo farmacéuticamente . aceptable, preferiblemente en un portador o vehículo acuoso. Puede ser usada una variedad de portadores o vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina y similares amortiguada. Esas soluciones son estériles y generalmente, están libres de . material indeseable. Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Una composición farmacéutica típica ' para administración intravenosa puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Las cantidades administradas son claramente proteínas específicas y dependen de su potencia y perfil farmacocinético . Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos o evidentes a aquellos expertos en la técnica y son descritos con mayor detalle en publicaciones como Remington' s Pharmaceutical Science, 15ava ed. , ack Publishing Company, Easton, PA (1980) . Las composiciones que contienen las proteínas de fusión de la presente o un cóctel de las mismas (es decir, con otras proteínas) pueden ser administradas como tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente que padezca de un trastorno, o enfermedad hemorrágica en una cantidad suficiente para curar o contrarrestar al menos parcialmente la hemorragia. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y el estado general de salud del paciente. La administración sola o múltiple de las composiciones puede ser efectuada dependiendo de la dosis y frecuencia con que se requiera y sea tolerada por el paciente. En cualquier caso, la composición deberá proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar efectivamente al paciente. Las proteínas de fusión de la invención, o sus composiciones farmacéuticamente aceptables, son administradas en una cantidad terapéuticamente efectiva, la cual variará dependiendo de la variedad de factores incluyendo la actividad de la proteina de fusión especifica empleada; al estabilidad metabólica y el tiempo de acción de la proteina de fusión; la edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del paciente; y modo y hora de administración; la velocidad de excreción; la combinación de fármacos; la severidad de los estados de enfermedad particulares; y la terapia experimentada por el anfitrión. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva diaria es de aproximadamente 0.14 mg hasta aproximadamente 14.3 mg/kg de peso corporal por dia de una proteina de fusión de la invención, o una composición farmacéuticamente aceptable de la misma; preferiblemente, de aproximadamente 0.7 mg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dia; de manera más preferible, de aproximadamente 1.4 mg hasta aproximadamente 7.2 mg/kg de peso corporal por dia. Por ejemplo, para al administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosis seria de aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 1.0 gramos por dia de una proteina de fusión de la invención, o una composición farmacéuticamente aceptable de la misma, de manera preferible de aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 700 mg por dia, de manera más preferible de aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 500 mg por dia.

Terapia Genética : Puede ser empleada una proteína de fusión de la presente invención de acuerdo con la presente invención para la expresión de esa proteína de fusión in vivo, lo cual con frecuencia es llamado "terapia genética". De este modo, por ejemplo, las células pueden ser modificadas con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifique para la proteína de fusión ex vivo, las células modificadas son entonces proporcionadas a un paciente a ser tratado con la proteína de fusión. Esos . métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser modificadas por procedimientos conocidos en el campo mediante el uso de una partícula retroviral que contenga ADN que codifique para la proteína de fusión de la présente invención. La liberación local de la proteína de fusión anticoagulante de la presente invención usando terapia "genética puede proporcionar el agente terapéutico al área objetivo, las células endolteliales que revisten los vasos sanguíneos. Ambas metodologías de la terapia genética in vitro e in vivo son comtempladas . Se conocen varios métodos - para transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones de células definidas. Véase, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-931. Esos métodos incluyen: 1) Transferencia genética directa. Veáse, por ejemplo Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468; 2) Transferencia de ADN mediada por liposoma. Véase, por ejemplo, Caplen et al. (1995) Nature Med. 3:39- 46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao y Huang (1991) Biochem, Biophys. Res. Comm.179; 280-285; 3) Transferencia de ADN mediada por retrovirus. Véase, por ejemplo Kay et al: (1993) Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813. 4) Transferencia de ADN mediada por ADN virus. Esos ADN virus incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad2 o Ad5) , herpes virus (preferiblemente vectores basados en el virus de la herpes simple) , y el parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus "defectuoso" o no autónomo, de manera más preferible vectores basados en adenovirus asociados, de manera más preferible, vectores basados en AAV-2). Véase, por ejemplo Ali "et" al. (1994) Gene Therapy 1:367-384; Patente Estadounidense 4,797,368, incorporada aquí como referencia, y Patente Estadounidense 5,139,941, incorporada aquí como referencia. La elección del sistema de vector particular para transferir el gen de interés dependerá de una variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población celular objetivo. Aunque los vectores retrovirales han sido estudiados exhaustivamente y usados en un número de aplicaciones de terapia genética, esos vectores generalmente no son adecuados para células infecciosas que no se dividen. Además, los retrovirus tienen el potencial de oncogenicidad . Sin embargo, desarrollos recientes en el campo de los vectores lentivirales pueden obviar alguna de esas limitaciones. Véase Naldini et al. (1996) Science 272:263-267. Los retrovirus de los cuales pueden ser derivados los vectores plasmídicos retrovirales mencionados aquí anteriormente incluyen, pero no se limitan a, virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo, retrovirus como el virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviaria, virus de' la leucemia del gibbon, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor mamario. En una modalidad, el vector piasmidico retroviral es .derivado del virus de la Leucemia Murina de Moloney. Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen una amplia gama de anfitriones, pueden infectar células inactivas o diferenciadas terminalmente, como neuronas o hapatocitos, y parecer esencialmente no oncogénicas. Véase, por ejemplo Ali et al. (1994), supra, p. 367. Los adenovirus no parecen integrarse al genoma del anfitrión. Debido a que existen extracromosomalmente, el riesgo de mutagénesis por inserción se reduce en gran medida. Ali et al. (1994) , supra, p. 373. Los virus adenoasociados exhiben ventajas similares a los vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV exhiben integración especifica del sitio sobre el cromosoma humano 19 (Ali et al. (1994) supra. p. 377) . En una modalidad preferida, el ADN que codifica para las proteínas de fusión de esta invención es usada en terapia genética para trastornos incluyendo, pero sin limitarse a la trombosis venosa profunda, coagulación intravascular diseminada, síndrome coronario agudo o cáncer con evidencias de coagulopatía . De acuerdo a esta modalidad, la terapia genética con ADN que codifica para las proteínas de fusión de esta invención es proporcionada a un paciente que necesite _del mismo, concurrentemente con, .o inmediatamente después" del diagnóstico. El experto en la técnica apreciará que puede ser usado cualquier vector para terapia genética adecuado que contenga el ADN que codifique para la proteína de fusión de la invención o ADN que codifique para análogos, fragmentos, derivados o variantes de la proteína de fusión de la invención de acuerdo con esta modalidad. Las técnicas para construir ese vector son conocidas. Véase, por ejemplo, Anderson, .F. (1998) Nature 392:25-30; Yerma I.M. y Somia, N. (1998) Nature 389:239-242. La introducción del vector que contiene el ADN de la proteína de fusión al sitio blanco puede ser lograda usando técnicas conocidas. El vector para terapia genética incluye uno o más promotores . Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (CVM) descrito en Miller et al. (1989) Biotechniques 7 (9) : 980-990, o cualquier ' otro promotor (por ejemplo, promotores celulares como promotores celulares eucarióticos incluyendo, pero sin limitarse a, los promotores de histona, pol III, y ß-actina) . Otros promotores virales que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan, a promotores de adenovirus, promotores de timidina cinasa (T ) , y promotores de parvovirus B19. La selección de un. promotor adecuado será evidente a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas aquí. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan, a, promotores adenovirales , como el promotor tardío adenoviral mayor; o promotores heterólogos, como el promotor de citomegalovirus (CMV) ; el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, como el promotor de MT, promotor de metalotioneina; promotores de choque térmico; promotor de albúmina; promotor de _ ApoAl; promotores de globina humana; promotrores de timidina cinasa viral, como el promotor de timidina cinasa.de Herpes Simple; LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos aquí anteriormente) ; el promotor de ß-actina; y el promotor de la hormona del crecimiento humana. El vector plasmidico retroviral es empleado para transducir lineas celulares empaquetadas para formar lineas celulares productoras. Los ejemplos de células empaquetadas que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las lineas celulares PE501, PA317, ?-2, ?-??, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ' *FCRE, CRIP, GP+#-86, GP-envAml2, y DAN como se describe en iller (1990) Human_jSene^.Therapy-1:5-14, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células empaquetadas a través de cualesquier medios conocidos en la técnica. Esos medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector plasmidico retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplarse a un lipido, y entonces administrarse a un anfitrión. La linea celular productora genera partículas de vector retroviral infecciosa las cuales incluyen las secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido. Esas partículas de vector retroviral pueden ser empleadas entonces para transducir células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán las secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero, no se limitan a, células no diferenciadas embriónicas , células de carcinoma embriónico, así como células no diferenciadas hematopoyéticas , hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales. Otro método diferente de terapia genética es la "terapia transcariotica" donde las. células del paciente son tratadas ex vivo para inducir los genes cromosomales inactivos a producir la proteína desinterés, después-^de- su reintroducción al paciente; La terapia transcariotica asume que el individuo tiene un complemento normal de genes necesarios para la activación. La terapia transcariotica implica introducir un promotor u otra secuencia reguladora exógena capaz de activar genes recientes o incipientes, en el ADN cromosomal de las células del paciente ex vivo, cultivando y seleccionando las células productoras de proteínas activas, y reintroduciendo entonces las células activadas en el paciente con el propósito de que queden completamente establecidas. Las. células "genéticamente activadas" producen entonces la proteina de interés durante un periodo de tiempo significativo, quizá tan prolongado como la vida del paciente. Las Patentes Estadounidenses Nos. 5,641,670 y 5,733,761 describen con detalle este concepto, y se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Equipos : Esta invención se relaciona además con equipos para propósitos de investigación y diagnóstico. Los equipos típicamente incluyen uno o más recipientes que contienen los anticuerpos de una sola cadena de la presente invención. En una modalidad preferida, los equipos comprenden recipientes que contienen anticuerpos de una sola cadena en una forma adecuada para derivarse ..con..-una-segunda molécula, por ejemplo- dominios de TM o fragmentos de los mismos. En una modalidad más preferida los equipos comprenden recipientes que contienen las proteínas de fusión de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, los equipos pueden contener secuencias de AD que codifiquen para las proteínas de fusión. Preferiblemente las secuencias de ADN que codifican para esas proteínas de fusión son proporcionadas en un plásmido adecuado para la transfección en y expresión por una célula anfitriona. Los plásmidos pueden contener un promotor (con frecuencia un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido primario puede contener sitios de restricción apropiados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido para producir varias proteínas de fusión. Los plásmidos también pueden contener numerosos otros elementos para facilitar la clonación y expresión de las proteínas codificadas. Esos elementos son también conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores seleccionables , codones de inicio, codones de terminación, y similares.

Indicaciones Terapéuticas : Las enfermedades en las cuales la formación de trombos juega un papel etiológico significativo. incluyen- el infarto al miocardio, coagulación i travascular diseminada, trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar, apoplejía isquémica, choque séptico, síndrome de distención respiratoria aguda, angina inestable y otras condiciones oclusivas arteriales y venosas. Las proteínas de fusión de esta invención son útiles en todas esas, así como en otras enfermedades en las cuales la formación de trombos es patológica. Otras condiciones patológicas donde la proteína de fusión de esta invención puede ser útil incluyen al cáncer con coagulopatia e inflamación. Los compuestos también pueden encontrar uso en injertos de piel y venas y en el transplante de órganos. Esto significa que los compuestos son útiles para el tratamiento, ya sea para prevenir una enfermedad o para prevenir su progreso a un estado más severo. Los compuestos de esta invención también proporcionan un anticoagulante seguro y efectivo, por ejemplo, en pacientes que reciben bioprótesis como válvulas cardiacas. Esos compuestos pueden reemplazar a la heparina y warfarina en el tratamiento de, por ejemplo, el embolismo pulmonar o infarto al miocardio agudo. Las proteínas de fusión de esta invención también pueden encontrar uso en el recubrimiento del dispositivos médicos donde la coagulación es un problema de preocupación.

Ensayos: _„._ : · -—·- Se. encuentran. ¦ disponibles numerosos ensayos de laboratorio para medir la actividad de TM de una proteína de fusión de la invención. La actividad de la proteína C puede ser medida en el ensayo descrito por Salem, H.H. et al. (1984), supra y Galvin, J.B. et al. (1987) J. Biol. Chem 262 (5) : 2199-2205. De manera breve, el ensayo consiste de dos pasos. El primer paso es la incubación de la proteína de fusión de prueba con trombina y proteína C bajo condiciones definidas. En el segundo paso, la trombina es. inactivada con hirudina o antitrombina III y heparina, y la actividad de la proteina C recién activada es determinada mediante el uso de un sustrato cromogénico, por lo que el cromóforo es liberado por la actividad proteolitica de la proteina C activada . Este ensayo es llevado a cabo con los reactivos purificados. De manera alternativa, el efecto de una proteina de fusión puede ser medido usando ensayos de tiempo de coagulación en plasma como el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) , tiempo de coagulación de trombina (TCT) y/o tiempo de protrombina (PT) . Esos ensayos distinguen entre diferentes mecanismos de inhibición de la coagulación, e implican la activación de la proteina C. La prolongación del tiempo de coagulación en cualquiera de esos ensayos demuestra que la molécula puede inhibir la coagulación en plasma. „. ..-.x- - Los ensayos anteriores son usados para identificar proteínas de fusión con actividad de TM que son capaces de unirse a la trombina y activar la proteína C en sistemas purificados y en medio con plasma. Entonces se usan ensayos adicionales para evaluar otras actividades de la TM nativa como la inhibición de la formación de fibrina catalizada por trombina a partir del fibrinógeno (Jakubowski, H.V. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261(8) :3876-3882), inhibición de la activación del factor V por trombina (Esmon, C.T. et al. (1982). J. Biol. Chem. 257 (14) : 7944-7947) , inhibición acelerada de trombina por antitrombina III y cofactor de heparina II (Esmon, N.L. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258 (20) : 12238-12242 ) , inhibición de la activación del factor XIII por trombina (Polgar, J. et al. (1987) Thromb. Haemost. 58(1): 140), inhibición de la inactivación de la proteina S mediada por trombina (Thompson, E.A. y Salem, H.H. (1986), J. Clin. Inv. 78 ( 1 ): 13-17 ) , e inhibición de la activación y agregación plaquetaria mediada por trombina (Esmon, N.L. et al. (1983) , supra) . Los siguientes ensayos, descritos con detalle más adelante en el Ejemplo 5, son usados para medir la potencia in vitro de las proteínas de fusión de la invención: 1) ensayo de activación de proteína C (cromogénico) ; 2) ensayo de activación de sTF/FVIIa 3) ensayq__de_ activación - del-Factor X; y 4) ensayo de activación de proteína C (sobre una superficie rica en TF) . Para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención por supuesto debe comprenderse que la referencia amortiguadores, medios, reactivos, células, condiciones de cultivo y similares particulares no pretende ser limitante, sino que debe leerse como si incluyera todos los materiales relacionados que el experto en la técnica reconocería como de interés o valor en el contexto particular en el cual es presentada esa discusión. Por ejemplo, con frecuencia es posible sustituir un sistema amortiguador o medio de' cultivo por otro y lograr aún resultados similares y no idénticos. Aquellos expertos en la técnica tendrán suficiente conocimiento de aquellos sistemas y metodologías debido a que tienen, sin experimentación indebida, producir esas sustituciones que sirven de manera óptima a sus propósitos usando los métodos y procedimientos descritos aquí. La presente invención será ahora descrita mejor por medio de los siguientes ejemplos no limitantes. Para aplicar la descripción del ejemplo, deberá tenerse claramente en mente que otras y diferentes modalidades de los métodos descritos de acuerdo a la presente invención no sugerirán dudas a aquellos expertos en la técnica. Sin mayor elaboración, se_ cree que un experro- -en · la técnica puede usando la descripción anterior, utilizar la presente invención en toda su extensión. Las siguientes modalidades específicas preferidas por lo tanto, deben ser consideradas únicamente ilustrativas, no limitantes del resto de la descripción de ninguna otra manera. En los ejemplos anteriores y siguientes, todas las temperaturas se exponen no corregidas en grados Celsius, y todas las partes y porcentajes están en peso, a menos que se indique otra cosa.

Todas las descripciones de las solicitudes, patentes y publicaciones, citadas anteriormente se incorporan por lo tanto aquí como referencia. * * * * * Los siguientes ejemplos se proporcionan como guia para ayudar a la práctica de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Plásmidos Recombinantes scFv(TF)3elO del Anticuerpo Anti-TF de una Sola Cadena (- 18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L s C A A s G F S F T D A M S V R Q A P G K E L E W V s S I S G s G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E_ D T. V- -Y^Y- C- .-•A - R V L S L T D Y Y W Y ¦G M D V w ¦ G Q G T L V T V S A G G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A s P G T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G s S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S G S I D T s s N s A S L T I S G L K T E D E A D Y Y c Q s Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264) El anticuerpo anti-TF de una sola cadena scFv(TF)3elO (SEQ ID NO: 1) consiste de un péptido señal (- ), dominio de VH (1 a 126) , enlazante de VH-VL (127 a ominio de VL (132 a 246), y secuencia e-marca (247 a EJEMPLO 2 o Recombinante de Proteina de Fusión 1-scF (TF) 3el0 TMÍ456 L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q V N R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F T D A M S V R Q A P G K E L E W V S S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D N S K N. T L Y L Q N- S L R A E D T A V Y Y C A R V L S L T D Y Y W Y G M D _ V... . _G... Q.-.G - : V - -V— s A 'G G G -G S G A P N F M L T Q P H S V S A S P G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T Y I Y E D N H R P S G V P D R F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E A D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G G G G S G G G G S G G G G S V E P V D P C F R A N C E Y Q C Q P L N Q T S Y L C V C A E G F A P I P H E P H R C Q M F C N Q T A C P A D C D P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F I C T D I D E C E N G G F C S G V C H N L P G T F E C I C G P D S A L A G Q I G T D C A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (400) La proteina de fusión scFv (TF) 3elO-TMI456 (SEQ ID NO: 2) consiste de un péptido señal (-18 a -1), dominio VH (1 a 126), enlazante VH-VL (127 a 131), dominio VL (132 a 246), enlazante VL-TM (247 a 264), dominio de TMÍ456 (265 a 382) y la secuencia e-marca (383 a 400) . Las mutaciones H381G, M388L, R456G y H457Q en TMÍ456 están subrayadas.

EJEMPLO 3 Plásmido Recombinante de Proteina de Fusión 2-scF (TF) 3el0- ???456? (-18)M L G V L V L G A L A L A G L V F P E A Q V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S G F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V S S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V S A G G G G S N F L T Q P H S V S A S P G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P G s s P T- T V I Y E D N H R P S G V P D R F S G S I D T s s N S A S L T I S G L K T E D E A D Y Y c Q s Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A A A G G G G S G G G G S G G G G S V E P ' V D P C F R A N C E Y Q ¦c Q- P L N Q T S Y L C V C A E G F A P I P H E P H R c Q M F C N Q T A C P A- D C D P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F I C T D I D E c E N G G F C s G V C H N L P G T F E c I C G P D S A L A G Q I G T D C (379) proteina de fusión scFv (TF) 3elO-TMI456? (SEQ ID NO: 3) consiste de un péptido señal (-18 a -1) , dominio VH (1 a 126), enlazante VH-VL (127 a 131), dominio VL (132 a 243), enlazante VL-TM (244 a 261), y dominio de. TMÍ456 (262 a 379). Las mutaciones H381G, M388L, R456G y H457Q en TMÍ456 están subrayadas. _ - Las enmiendas, a las Especificaciones y al listado de Secuencia, tanto escrita como legible por computadora, son para corregir un error obvio. No se agrega ninguna materia por estas enmiendas.

EJEMPLO 4 Expresión de la Proteina de Fusión en Células de Bacteria/Mamífero La expresión bacteriana fue posible, pero produjo una proteina que tuvo una actividad de . cofactor de TM muy reducida. La proteina de fusión fue expresada en células CHO. El plásraido de expresión contiene marcadores de selección de higromicina B y DHFR. La selección original se efectuó en higromicina 400 µg/ml para seleccionar una población. La población resultante fue entonces sometida a selección con metotrexato 100 nM. Durante esta selección, las células que tienen copias amplificadas de la región de ADN que contiene el marcador de selección, y el gen blanco, son seleccionadas de entre la población. Los niveles de expresión se incrementaron de aproximadamente 0.3 mg/L hasta aproximadamente 6 mg/L como resultado de esta selección.

EJEMPLO 5 Ensayos xn vi tro — .1. Ensayo de Activación dé Proteina C (cromogénico) Este ensayo se efectuó mezclando 20 µ? de cada una de las siguientes proteínas en una placa microtituladora : muestra de TM (desconocida o estándar), trombina (3nM), y proteínas C (1.5 µ?) . El diluente de ensayo para cada proteína fue Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.1 M, CaCl2 2.5 mM, BSA 2.5 mg/ml, pH 7.4. Los pozos fueron incubados durante 2 horas a 37 °C después de lo cual terminó la activación de la proteina C por la adición de 20 µ? de hirudina (0.16 unidades/µ? 370 nM) en diluente de ensayo e incubación durante 10 minutos adicionales. La cantidad de proteina C activada formada fue detectada agregando 100 µ? de S2266 1 mM (diluente de ensayo), y continuando la incubación de la placa a 37°C. La absorbancia a 405 nm en cada pozo fue leída cada 10 segundos durante 30 minutos, usando un lector de placas Molecular Devices. Los datos de absorbancia fueron almacenados, y se calculó el cambio en la absorbancia por segundo (pendiente) en cada pozo. El cambio de la absorbancia por segundo es proporcional a pmol/ml de proteína C activada. Esta relación fue determinada empíricamente usando varias concentraciones de proteína C totalmente activada. Las muestras que contienen _proteína ~ C~~ 100%--activada fueron generadas mezclando proteína C de 0 a 1.5 µ? con TM de conejo 60 nM y trombina 30 nM, incubando durante 0 a 4 horas, agregando hirudina y midiendo la actividad de S2266 como se hizo anteriormente. Las condiciones bajo las cuales 100% de la proteína C fue activada fueron definidas como aquellas en la cual la actividad de S2266 (A405/seg) alcanzó una meseta. Una unidad de actividad se define como 1 pmol de proteína C ' activada generada por ml/min bajo las condiciones de reacción definidas anteriormente. De manera alternativa, los valores de actividad son reportados en comparación con TM de conejo solubilizada con detergente. 2. Ensayo de Activación de sTF/FVIIa El principio de este ensayo se describe más adelante. El enlace amida a p-nitroanilida del tripéptido de un sustrato es hidrolizado por el complejo de sTF/FVIIa. El producto cromóforo liberado, la p-nitroanilida, es verificada a 405 nm y la concentración del producto formado por unidad de tiempo es calculada usando el coeficiente de extensión molar de 9920 ¦M~1cm~1. Los valores de CI50 (C) son determinados ajustando las velocidades iniciales a la ecuación de 4 parámetros: Y = (A-D) / (x/C) ~B) +D H-D-Val-Leu-Arg-p-NA ? H-D-Val-Leu-Arg +„p-NA... . .. - · · Sustrato de .S2266 . Tripéptido Cromóforo Reactivos y soluciones: 1. Amortiguador de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1%, pH 7.5 2. FVIIa humano (HCVIIA-0060 , Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 10 x - preparar solución 20 nM en amortiguador de ensayo antes de usar. 3. TF soluble (Berlex) : 10 x solución de trabajo - preparar solución 30 nM en amortiguador de ensayo antes de usar. 4. Sustrato cromogénico S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): solución patrón: 10 mM en H20, almacenar a 4°C. 2.5 x solución de trabajo - preparar solución 2.5 mM en amortiguador de ensayo antes de usar. 5. Anticuerpo: preparar dilución 2.5 x en amortiguador de ensayo antes de usar. Condiciones de ensayo: Los ensayos se efectuaron en una placa microtituladora de 96 pozos a temperatura ambiente. La concentración final de los componentes son las siguientes: sTF 3 nM Anticuerpo varia de 1000 a 0.625 nM FVIIa 2 nM S2266 1 mM Procedimiento de Ensayo: r' - ™.-r — 1.. Pipetear a 0.1 mi de 2.5x AB (o control con amortiguador) en cada pozo. 2. Agregar 0.025 mi de lOx sTF e incubar 10 min a temperatura ambiente con agitación moderada. 3. Agregar 0.025 mi de lOx FVIIA, e incubar 10 min a temperatura ambiente con agitación moderada. 4. Agregar 0.01 mi de 2.5x de sustrato S2266, inmediatamente transferir la placa a un lector de placas y medir la cinética enzimática a 405 nm a intervalos de 10 segundos durante 15 min. 3. Ensayo de Activación del Factor X: El principio de este ensayo se describe más adelante. El factor FVIIa es incubado con vesículas de TF humano recombinante para formar un complejo de proteasa capaz de activar el sustrato, FX. Este complejo es formado en presencia de (o ausencia) de diferentes concentraciones de anticuerpo, entonces el sustrato FX es introducido y la reacción se deja proceder para formar el producto, la proteasa activa FXa, la cual es capaz de hidrolizar un enlace amida de la p-nitroanilida del sustrato cromogénico S2222. El producto cromóforo liberado, p-nitroanilida, es monitoreado en 405 nm y la concentración del producto formado por unidad de tiempo es calculada usando un coeficiente de extinción molar de 9920_ j^cm"1.. Los-: valores-de CI50 -(C) son .determinados ajusfando las velocidades iniciales a la ecuación de 4 parámetros: Y = (A-D) / (1+ (x/C) ~B) +D Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA ? Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA Sustrato de S2222 Cromóforo Reactivos y soluciones: 1. Amortiguador de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1%, pH 7.5 2. FVIIa humano (HCVIIA-0031 Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 4 x - preparar solución 100 p en amortiguador de ensayo antes de usar. 3. TF- Humano Recombinante (Reconstituido en nuestro laboratorio de Innovin, Dade) : 'Solución de trabajo Preparar una dilución 1:480 en amortiguador de ensayo antes de usar . 4. Factor X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): solución patrón: 4 x Solución de trabajo - preparar solución 1000 nM en amortiguador de ensayo antes de usar. 5. Sustrato cromogénico S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): Solución patrón: 6mM en H20, almacenado a 4°C. Solución de trabajo- preparar una solución 0.78mM en 3.57 mM de EDTA (para detener la reacción) , 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7.5 antes de usa_r._ _. ----- 5. Anticuerpo: preparar dilución 4 x en amortiguador de ensayo antes de usar.

Condiciones de Ensayo : Los ensayos se efectúan en una placa microtituladora de 96 pozos a temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los componentes son las siguientes : Vesículas de rTF ¼ de dilución 1:480.

Anticuerpo varia de 100 a 0.625 nM. FVIIa 25 pM FX 250 nM S2222 0.546 mM Procedimiento de ensayo: 1. Pipetear 0.015 mi de 4xAB (o control de amortiguador) en cada pozo. 2. Agregar 0.015 mi de 4x vesículas de rTF 3. Agregar 0.015 mi de 4x Fila, incubar 10 minutos a temperatura ambiente con agitación moderada. 4. Agregar 0.015 mi de 4x FX, incubar 5 min a temperatura ambiente con agitación moderada. 5. Agregar 0.14 mi S2222 de sustrato, transferir inmediatamente la placa a un lector de placa y medir la cinética enzimática a 405 nra a intervalos de 10 nm durante 15 minutos. _ _ j - - - - . · - - 4. Ensayo de Activación de Proteina C (sobre una Superficie rica en TF) . Este ensayo se efectúa como un ensayo de activación de proteína C cromogénico listado anteriormente con la excepción de que en este ensayo las vesículas de PC/PS que contienen TF son agregadas a la proteína de fusión, o TM control, antes de agregar la trombina y proteína C.

EJEMPLO 6 Características de los Anticuerpos Anti-TF Se aislaron siete diferentes anticuerpos que se unen a TF de una biblioteca presentadora de fagos de una sola cadena humana. Las afinidades de los anticuerpos que se unen a sTF, medidas usando el BIAcore, fueron de entre 35 y 470 nM. El ensayo de sTF/FVIIa se usó para determinar si los anticuerpos bloquearían la formación de un complejo de VIIa/TF activo. En el ensayo de sTF/VIIa, la unión de Vlla a sTF acelera la velocidad de escisión contra el sustrato peptídico cromogénico S2266 > 20 veces. Los anticuerpos que inhiben la unión de FVIIa al bloque TF es la aceleración. Entre los siete diferentes anticuerpos aislados, únicamente uno de ellos, scFV(TF)3elO no inhibió en ensayo de sTF/VIIa. Este anticuerpo incrementó la afinidad de FVIIa por sTF, haciendo disminuir. J.a-KD.,5· veces -(Figura. 1). La KD del- anticuerpo scFv(TF)3el0 para sTF, medida usando el ensayo de sTF/FVIIa, fue de 65.4 nM (figura 2) . Se usó microcalorimetría para comparar la afinidad de scFv(TF)3elO por TF en comparación con el complejo de FVIIa/TF. Esos experimentos revelaron que el anticuerpo tiene una afinidad 20 veces mayor por un complejo de TF/FVIIa en comparación con sTF libre (33 nM contra 600 nM, Figura 3) . Los anticuerpos son comparados usando el ensayo de activación FX, el cual consiste de TF de longitud completa, en vesículas fosfolipídicas , FVIIa y. FX. La cantidad de FXa generada se determinó usando el sustrato cromogénico S2765. Aunque el anticuerpo scFv(TF)3elO no tiene la afinidad más alta de acuerdo a lo medio por BIAcore e incrementa la afinidad del FVIIa por el sTF, fue el único anticuerpo en el grupo que inhibió la activación de FX y prolongó el tiempo de coagulación en el ensayo de PT . La CI50 del anticuerpo (dimérico) scFV(TF)3e!0 para la inhibición en el ensayo de activación de FX fue de 0.44 nM (Figura 4) y ocurrió una prolongación de dos veces del PT a 417 nM (Figura 5) . El anticuerpo scFv(TF)3elO fue identificado' sobre la base de la unión del TF soluble humano recombinante . La homología de la secuencia del TF entre el humano y el murino o humano y el conejo es del 58% y el 71%, respectivamente. El anticuerpo^ se_ une. a-: .un.-.epitope"úni'co' sobre el TF humano que interfiere con la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF. Fisiológicamente, el anticuerpo tiene una ventaja sobre los anticuerpos que compiten con el FVII o el FVIIa que se unen al TF. La KD de ambos del FVII y FVIIa en plasma humano es de 10 nM, o de entre 100 y 1000 veces mayor que la KD. La velocidad de formación del complejo de afinidad será más lenta (70 hasta 700 segundos, asumiendo kon= 108M_1sec_1) . En contraste, la Km de FX por el complejo de FX para el complejo VIIa/TF es de entre 0.200 a 4 µ? y la concentración de FX en plasma humano es de 130 nM (entre 0.03- y 0.065 veces KD) . La función principal del complejo de FVIIa/TF en la coagulación es convertir FX a Fxa.

EJEMPLO 7 Características In Vi tro de la Proteína de Fusión scFv (TF) 3elO-TMi456 Las características de una proteína de fusión de la invención, scFv (TF) 3el0-TMi456, fueron evaluadas en una variedad de ensayos in vitro. La proteína de fusión, scFv (TF) 3elO-T i456, retuvo la capacidad de inhibir la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF (CI50=0.5 nM, no se muestran los datos) y actúo como un cofactor para la activación de proteína C catalizada por trombina (ensayo cromogénico, Figura 6). No se observó... una . diferencia -significativa en - la actividad' del cofactor de TM entre la proteína de fusión y Tmi456 solo en ausencia de vesículas fosfolipídicas que contienen TF. En contraste, la actividad del cofactor de TM de la proteína de fusión, pero no Tmi456, aumentó >5 en presencia de vesículas fosfolipídicas que contienen TF (Figura 7). La potencia in vitro de la proteína de fusión, scFv (TF) 3el0-Tmi456, contra la coagulación inducida por TF (ensayo de PT, vía de coagulación extrínseca) fue 6 veces mejor que la del anticuerpo scFv(TF)3elO y 17 veces mejor que TMÍ456 solo (Figura 5) . En contraste, la potencia in vitro de la proteína de fusión contra las vías de coagulación intrínseca y común no fue afectada significativamente (ensayos de APTT y TCT, no se muestran los datos) . Por lo tanto, la dosis de proteínas de fusión que produjo una prolongación de dos veces en la PT únicamente tuvo un efecto modesto sobre el APTT, mientras que TMÍ456, a una dosis equivalente en el PT, produjo un aumento de 4 veces en el APTT (Figura 8). Este perfil in vitro es consistente con lo que se esperaba para los anticoagulantes dirigidos con TF/FVIIa que se sabe tienen eficacia superior a relaciones de hemorragia en modelos de trombosis en animales. De acuerdo con los ensayos de coagulación basados en plasma, la proteína de fusión scF (TF) 3elO-TMi456 fue más potente en el ensayo de coagulación, je sangre—completa ~-inducida por TF (Thromboelastograph, TEG) que cualquiera de scFv(TF)3elO o Tmi456 solo (Figura 9). Además, la proteína de fusión scFv (TF) 3elO-Tmi456 tuvo una respuesta a la dosis más predecible en el ensayo de coagulación de sangre completa inducida por TF que la heparina de bajo peso molecular (LMWH, Figura 10). En resumen, los datos anteriores demuestran que las proteínas de fusión de la invención son anticoagulantes potentes y selectivos in vi tro .

EJEMPLO 8 Modelo de Tromboembolismo de Rata In Vivo La porción del anticuerpo de TF de la proteina de fusión scFv(TF) 3elO-TMi456, es especifica para el TF de primate. Se desarrolló un modelo de tromboembolismo dirigido por TF humano (reactivo de tromboplastina que contiene TF recombinante humano, Ortho) en ratas Sprague-Dawley macho conscientes (350-400 g, n>7/grupo) . En este modelo de coagulación intravascular diseminada (DIC) , TF, vía inyección de tromboplastina, induce deposición de fibrina pulmonar, insuficiencia respiratoria y muerte. Se inyectaron dosis equimolares de scFv (TF) 3elO-T i456 o scFv (TF) 3el0 , o vehículo en la vena de la cola seguidas, 15 minutos después, por una inyección de bolo de tromboplastina (0.5 ml/kg) . En el grupo tratado con vehículos, esta dosis de TF _dio como resultado- una letalidad del 60% (DL6o) , usualmente dentro de 5 minutos después de la inyección de tromboplastina. Las ratas fueron calificadas de acuerdo al siguiente sistema de puntaje de morbilidad-mortalidad: 0= sin afectar; 1= distensión respiratoria media (recuperación dentro de 30 minutos) ; 2= distensión respiratoria severa (moribundo, la recuperación requirió más de 60 minutos); y 3= muerte. El puntaje promedio se usó para comparar la eficacia de 4 grupos de tratamiento diferentes. Los resultados en este ensayo in vivo son descritos en la Figura 11. La proteina de fusión de la invención fue capaz de inhibir la muerte y distensión respiratoria en este ensayo. Los ejemplos anteriores pueden ser repetidos con éxito similar sustituyendo los reactivos descritos de manera genérica ó especifica y/o las condiciones de operación de esta invención por aquellas usadas en los ejemplos precedentes. Aunque la invención ha sido ilustrada con respecto a la producción de ciertos plásmidos recombinantes de proteina de fusión, es evidente que pueden hacerse variaciones y modificaciones a la invención sin apartarse del espíritu, o alcance de la invención.

Claims

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REIVINDICACIONES 1. Una proteina de fusión anticoagulante, caracterizada porque comprende una proteina directora que interactúa con el factor tisular (TF) o el complejo de factor VIIa/TF, el cual está ligado de manera operativa al dominio EGF456 de trombomodulina (TM) o análogos, fragmentos, derivados o variantes de la misma, sola o en combinación con al menos un dominio de- TM adicional seleccionado del grupo que consiste del lazo entre dominio entre el EGF3 y el EGF4, el dominio EGF123, el dominio de glicosilación ligado en 0, y el dominio de la región hidrofóbica N-terminal, o análogos, fragmentos, derivados o variantes de la misma.. 2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde el dominio de TM comprende el lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF . _ _ - - .
3.. La proteína de fusión -según la reivindicación 2, donde el dominio EGF456 contiene mutaciones puntuales que hacen la proteína de fusión más resistente al daño oxidativo o actividad de proteasa o incremento de la eficiencia catalítica de la proteína de fusión.
4. La proteína de fusión según la reivindicación 3, donde el dominio EGF456 contiene al menos una mutación puntual seleccionada del grupo que consiste de H381G, M388L, R456G y H457Q.
5. La proteína de fusión según la reivindicación 4, donde el dominio EGF456 consiste de mutaciones puntuales en H381G, M388L, R456G y H457Q.
6. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína directora es un anticuerpo que se une a TF.
7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. La proteína de fusión según la reivindicación 7, donde el anticuerpo monoclonal se une al complejo de FVIIa/TF con mayor afinidad que el TF solo.
9. La proteína de fusión según la reivindicación 8, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de una sola cadena, un anticuerpo dimérico de Fab o un anticuerpo de IgG.
10. La proteína de fusión se_gún la ._reivindicación- 9, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de una sola cadena.
11. La proteína de fusión según la reivindicación 7, donde el anticuerpo monoclonal está ligado operativamente a más de un dominio de. T .
12. La proteína de fusión según la reivindicación 7, donde el anticuerpo monoclonal neutraliza a TF.
13. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión está glicosilada. 97
14. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión es modificada por la adición de polietilen glicol.
15. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión es biotinilada por la unión en estreptavidina .
16. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína directora es FVIIai.
17. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína directora es TFPI .
18. Una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión.
19. Un método para proteger. ,. contrar-la—formación" de trombos, -que -comprende administrar" una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión inhibe la generación de trombina sin afectar directamente otros parámetros de coagulación como la activación y agregación de las plaquetas.
20. El método según la reivindicación 19, donde el método sirve para proteger contra la formación de trombos la apoplejía isquémica, complicaciones trombóticas después de la angioplastia o cirugía microvascular .
21. Un método para prevenir y tratar la trombosis venosa profunda (DVT) , coagulación intravascular diseminada (DIC) , síndrome coronario agudo, o cáncer con evidencia de coagulopatía en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión según la reivindicación 1 al paciente.
22. Un método para regular la respuesta inflamatoria en un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión según la reivindicación 1 al paciente.
23. El método de según la reivindicación 22 donde la respuesta inflamatoria es seleccionada del grupo que consiste de sepsis, injertos de piel y venas, y trasplante de órganos.
24. La proteína de fusión^según la_reivindicación~ 1, donde la proteína de fusión puede ser usada para formar un recubrimiento no trombogénico sobre la superficie de un dispositivo médico, donde el dispositivo médico entra en contacto con la sangre.
25. El equipo, que comprende la proteína de fusión según la reivindicación 1.
26. Un equipo, que comprende secuencias de ADN que codifican para los componentes de la proteína de fusión según la reivindicación 1. 99
27. Una composición para terapia genética, que comprende el ADN que codifica para la proteina de fusión que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, en combinación, con una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de terapia genética.
28. Una proteina de fusión anticoagulante, que comprende una proteina directora que interactúa con el TF o el complejo de FVIIa/TF, donde la proteina directora es un anticuerpo de una sola cadena que se une a TF, la cual está ligada operativamente al dominio de EGF456 de TM y al lazo interdominio entre el EGF3 y el EGF4, donde el dominio EGF456 consiste de mutaciones puntuales en H381G, 388L, R456G y H457Q.
29. La proteina de fusión según la reivindicación 28, donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: o la SEQ _ID NO : .....3 ._ .-. - - - - -