[go: up one dir, main page]

MXPA04004467A - Anticuerpos para cd40. - Google Patents

Anticuerpos para cd40.

Info

Publication number
MXPA04004467A
MXPA04004467A MXPA04004467A MXPA04004467A MXPA04004467A MX PA04004467 A MXPA04004467 A MX PA04004467A MX PA04004467 A MXPA04004467 A MX PA04004467A MX PA04004467 A MXPA04004467 A MX PA04004467A MX PA04004467 A MXPA04004467 A MX PA04004467A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
sequence
antibody
Prior art date
Application number
MXPA04004467A
Other languages
English (en)
Inventor
Feng Xiao
Original Assignee
Pfizer Prod Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23370387&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MXPA04004467(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Prod Inc filed Critical Pfizer Prod Inc
Publication of MXPA04004467A publication Critical patent/MXPA04004467A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La presente invencion se relaciona con anticuerpos y porciones de enlace de antigeno de los mismos que se ligan de manera especifica a CD40, con preferencia, a CD40 humano, y que funcionan como agonistas de CD40. La invencion ademas se relaciona con anticuerpos anti-CD40 humanos y porciones de enlace de antigeno de los mismos. La invencion tambien se relaciona con anticuerpos que son quimericos, biespecificos, derivados, anticuerpos de cadena simple o porciones de proteinas de fusion. La invencion ademas se relaciona con inmunoglobulinas de cadena pesada y liviana aislada derivadas de anticuerpos anti-CD40 humanos y moleculas de acido nucleico que codifican dichas inmunoglobulinas. La presente invencion se relaciona tambien con metodos de elaboracion de anticuerpos anti-CD40 humanos, con composiciones que comprenden estos anticuerpos y con metodos de uso de los anticuerpos y de las composiciones para el diagnostico y tratamiento. La invencion ademas proporciona metodo de terapia genica mediante la utilizacion de moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de inmunoglobulina pesada y/o liviana que comprenden los anticuerpos anti-CD40 humanos. La invencion se relaciona ademas con animales transgenicos que comprenden las moleculas de acido nucleico de la presente invencion.

Description

ANTICUERPOS PARA CD40 Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos 60/348.980, presentada el 9 de noviembre de 2001.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El antígeno CD40 es una glucoproteína de la superficie celular de 50 kDa que pertenece a la familia de Receptores de Factor de Necrosis Tumoral (en inglés "TNF-R")(Stamenkovic y otros, EMBO J. 8: 1403-10 (1989)). CD40 es expresado en muchos tipos de células normales y tumorales, incluyendo en linfocitos B, células dendríticas, monocitos, m acrófagos, epitelio tímico, c élulas endoteliales, fibroblastos y c élulas d el músculo liso (Paulie S. y otros, Cáncer Immunol. Immunother. 20: 23-8 (1985); Banchereau J. y otros, Adv. Exp. Med. & Biol. 3 78: 79-83 ( 1995); A lderson M . R. y otros, J. of Exp. Med. 178: 669-74 (1993); Ruggiero G. y otros, J. of Immunol. 156: 3737-46 (1996); Hollenbaugh D. y otros, J. ofExp. Med. 182: 33-40 (1995); Yellin M. j. y otros, J. of Leukocyte Biol. 58: 209-16 (1995); y Lazaar A. L. y otros, J. of Immunol. 161 : 3120-7 (1998)). CD40 es expresado en todos los linfomas B y en 70 % de todos los tumores sólidos. Si bien es expresado de manera constitutiva, CD40 es regulado en forma ascendente en células que presentan antígeno por medio de señales de maduración, tales como LPS, IL-? ß, IFN-? y GM-CSF. La activación de CD40 cumple una importante función en la regulación de las respuestas inmunes humorales y celulares. La presentación de antígeno sin la activación de CD40 puede conducir a la tolerancia, mientras que la señalización de CD40 puede revertir dicha tolerancia, mejorar la presentación de antígeno por todas las células que P04/057-APf presentan antígeno (en inglés, "APC"), conducir a la secreción de quimioquinas y citoquinas auxiliares, incrementar la expresión de moléculas co-estimulantes y la señalización, y estimular la actividad citolítica de células inmunes. CD40 cumple una función decisiva en la proliferación de células B, en su maduración y cambio de clases (Foy T. M. y otros, Ann. Rev. of Immunol. 14: 591-617 ( 1996)). La interrupción del recorrido de señalización de CD40 conduce a una distribución anormal de isotipos de inmunoglobulina de suero, falta de priming (tratamiento que en sí mismo no produce una respuesta de un sistema, sino que induce una mayor capacidad para responder a un segundo estímulo) de células T CD4+ y defectos en las respuestas humorales secundarias. Por ejemplo, el síndrome de hiper-IgM ligado a X es una enfermedad asociada con una mutación en el gen CD40L humano, y se caracteriza por la incapacidad de los individuos afectados para producir anticuerpos diferentes de los del isotipo IgM, indicando que se requiere la interacción productiva entre CD40 y CD40L para una respuesta inmune eficaz. El engranaje de CD40 por CD40L conduce a la asociación del dominio citoplásmico de CD40 con TRAF (en inglés, "factores asociados con TNF-R) (Lee H. H. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1421 -6 (1999); Pullen S. S. y otros, Biochemistty 37: 1 1836-45 (1998); Grammar A. C. y otros, J. of Immunol. 161 : 1 183-93 (1998); Ishida T. K. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9437-42 (1996); Pullen S. S. y otros, J. of Biol. Chem. 274: 14246-54 (1999)). La interacción con TRAF puede culminar en la activación tanto del recorrido de NFKB como de Jun/APl (Tsukamoto N. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1234-9 (1999); Sutherland C. L. y otros, J. of Immunol. 162: 4720-30 ( 1999)). Según el tipo de célula, esta señalización conduce a la aumentada P04/057-APÍ secreción de citoquinas tales como IL-6 (Jeppson J. D. y otros, J. of Immunol. 161 : 1738-42 (1998); Uejima Y. y otros, Int. Arch. of Allergy & Immunol. 1 10: 225-32, (1996), IL-8 (Gruss H. j. y otros, Blood 84: 2305-14 (1994); von Leoprechting A. y otros, Cáncer Res. 59: 1287-94 (1999); Denfeld R. W. y otros, Europ. J. of Immunol. 26: 2329-34 (1996)), IL-2 (Celia M. y otros, J. ofExp. Med. 184: 747-52 (1996); Ferlin W. G. y otros, Europ. J. of Immunol. 28: 525-31 (1998); Armant M. y otros, Europ. J. of Immunol. 26: 1430-4 (1996); Koch F. y otros, J. ofExp. Med. 184: 741-6 (1996); Seguin R. y L. H. Kasper, J. of Infecí. Diseases 1 79: 467-74 ( 1999); C haussabel D . y o tros, Infection & Immunity 67: 1929-34 (1999)), IL-15 (Kunivoshi j. S. y otros, Cellular Immunol. 193: 48-58 (1999)) y quimioquinas (????a, ???? ß, RANTES y otras) (McDyer j. F. y otros, J. of Immunol. 162: 371 1-7 (1999); Schaniel C. y otros, J. of Exp. Med. 188: 451-63 (1998); Altenburg A. y otros, J. of Immunol. 162: 4140-7 (1999); Deckers j. G. y otros, J. of íhe Am. Society of Nephrology 9: 1 187-93 (1998)), incrementada expresión de MHC clase I y II (Santos-Argumedo L. y otros, Cellular Immunol. 156: 272-85 (1994)) e incrementada expresión de moléculas de adhesión (por ejemplo, ICAM) (Lee H. H. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1421 -6 (1999); Grousson j. y otros, Archives of Dermatol. Res. 290: 325-30 (1998); atada Y. y otros, Europ. J. of Immunol. 26: 192-200 (1996); Mayumi M. y otros, J. of Allergy & Clin. Immunol. 96: 1 136-44 (1995); Flores-Romo L. y otros, Immunol. 79: 445-51 (1993)) y moléculas co-estimulantes (por ejemplo, B7) (Roy M. y otros, Europ. J. of Immunol. 25: 596-603 (1995); Jones . W. y C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174: 42-53 (1996); Caux C. y otros, Journal ofExp. Med. 180: 1263-72 (1994); Kiener P. A. y otros, J. of P04/057-APÍ Immunol. 155: 4917-25 (1995)). Las citoquinas inducidas por el engranaje de CD40 aumentan la supervivencia y activación de células T. Además de aumentar la función celular e inmune, los efectos de la activación de CD40 incluyen: reclutamiento de células y diferenciación por quimioquinas y citoquinas; activación de monocitos; incrementada actividad citolítica de linfocitos T citolíticos (CTL) y células asesinas naturales (NK); inducción de apoptosis en tumores CD40 positivos; aumento de la inmunogenicidad de tumores CD40 positivos; y producción de anticuerpos específicos de tumores. La función de la activación de CD40 en las respuestas inmunes intermediadas por células también se encuentra bien establecida, y se reseña en: Grewal y otros, Ann. Rev. of Immunol. 16: 1 1 1-35 (1998); ackey y otros, J. of Leukocyte Biol. 63: 418-28 (1998); y Noelle R. j., Agents & Actions - Suppl. 49: 17-22 (1998). [0007 Los estudios que utilizaron una disposición modelo de priming cruzado (ver definición de "priming" anterior) mostraron que la activación de CD40 de APC puede reemplazar el requerimiento de células T auxiliares para la generación de linfocitos T citolíticos (CTL) (Bennett y otros, Nature 393: 478-480 (1998)). Las pruebas de los ratones que tenían una deficiencia de CD40L indican un claro reclutamiento para la señalización de CD40 en el priming (ver definición anterior) de células T auxiliares (Grewal I. S. y otros, Science 273: 1864-7 (1996); Grewal I. S. y otros, Nature 378: 617-20 (1995)). La activación de CD40 convierte células B que portan antígeno, que son de otra manera tolerogénicas, en APC competentes (Buhlmann j. E. y otros, Immunity 2: 645-53 ( 1995)). La activación de CD40 induce la maduración y diferenciación de progenitores sanguíneos de cordón en células dendríticas (Flores-Romo L. y otros, J. of P04/057-APf Exp. Med. 185: 341-9 (1997); Mackey M. F. y otros, J. of Immunol. 161 : 2094-8 (1998)). La activación de CD40 además induce la diferenciación de monocitos en células dendríticas funcionales (Brosart P. y otros, Blood 92: 4238-47 (1998)). Además, la activación de CD40 aumenta la actividad citolítica de células NK a través de las citoquinas inducidas por APC-CD40 (Carbone E. y otros, J. of Exp. Med. 185: 2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. y otros, J. of Immunol. 162: 5910-6 (1999). Estas observaciones indican que CD40 cumple una función esencial en la iniciación y aumento de las respuestas inmunes, induciendo la maduración de APC, secreción de citoquinas auxiliares, regulación ascendente de moléculas co-estimulantes y aumento de las funciones efectoras. La función decisiva de la señalización de CD40 en la iniciación y maduración de las respuestas i nmunes c itotóxicas y h umorales hace que este sistema sea un objetivo ideal para el aumento de la inmunidad. Dicho aumento puede ser particularmente importante para el montaje de respuestas inmunes eficaces para antígenos tumorales, que en general se presentan al sistema inmune a través del priming cruzado (ver definición anterior) de APC activadas (Huang A. Y. y otros, Ciba Foundation Symp. 187: 229 '-44 (1994); Toes R. E. M. y otros Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998); Albert M. L. y otros, Nature 392: 86-9 (1998); Bennett S. R. y otros, J. of Exp. Med. 186: 65-70 (1997)). Varios grupos han demostrado la eficacia de la activación de CD40 para respuestas antitumorales in vitro e in vivo (Toes R. E. M. y otros, Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998)). Dos grupos, usando un modelo metastático de pulmón de carcinoma de célula renal y tumores subcutáneos por células viralmente transformadas, han P04/057-APÍ demostrado en forma independiente que la activación de CD40 puede revertir la tolerancia a antígenos específicos de tumor, produciendo un eficaz priming (ver definición anterior) antitumoral de células T (Sotomayor E. M. y otros, Nature Medicine 5: 780-787 (1999); Diehl L. y otros, Nature Medicine 5 : 774-9 ( 1999)). L a actividad antitumoral en ausencia de células inmunes también fue informada por el tratamiento de anticuerpos anti-CD40 y CD40L en un modelo de línea de cáncer de mama humano en ratones SCID (Hirano A. y otros, Blood 93: 2999-3007 (1999)). La activación de CD40 por anticuerpo anti-CD40 recientemente demostró erradicar linfoma CD40- y CD40+ en modelos de ratones (French R. R. y otros, Nature Medicine 5: 548-53 (1999)). Además, los estudios previos de Glennie y colaboradores concluyen que la actividad de señalización por anticuerpos anti-CD40 es más eficaz para la inducción del aclaramiento tumoral in vivo que otros anticuerpos marcadores de anti-superficie capaces de reclutar efectores (Tutt A. L. y otros, J. of Immunol. 161: 3176-85 (1998)). De manera consistente con estas observaciones, cuando los anticuerpos anti-CD40 fueron ensayados para determinación de actividad contra células tumorales CD40+ in vivo, la mayoría, pero no toda la actividad tumoricida se asoció con la señalización de CD40, en lugar de ADCC (Funakoshi S. y otros, J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19: 93-101 (1996)). En otro estudio, se trataron células dendríticas de médula ósea, ex vivo, con una variedad de agentes, y se ensayaron para determinar la actividad antitumoral in vivo. Estos estudios demostraron que las DC estimuladas con CD40L fueron las células más maduras y más eficaces que montaron una respuesta antitumoral.
La función esencial de CD40 en la inmunidad antitumoral también ha sido demostrada comparando las respuestas de ratones de tipo silvestre y ratones CD40-/- a P04/057-AP vacunas tumorales. Estos estudios muestran que los ratones CD40-/- son incapaces de lograr la inmunidad tumoral observada en ratones normales (Mackey M. F. y otros, Cáncer Research 57: 2569-74 (1997)). En otro estudio, se estimularon esplenocitos de ratones que portaban tumores, con células tumorales, y se trataron con anticuerpos anti-CD40 activadores, ex vivo, y demostraron tener aumentada actividad CTL específica de tumor (Donepudi M. y otros, Cáncer Immunol. Immunother. 48: 153-164 (1999)). Estos estudios demuestran que CD40 ocupa una posición decisiva en la inmunidad antitumoral, tanto en tumores CD40 positivos como negativos. Debido a que CD40 es expresado en linfomas, leucemias, mieloma múltiple, una mayoría de carcinomas de nasofaringe, v ejiga, o vario e h ígado, y en algunos c ánceres de mama y colorrectal, la activación de CD40 puede tener una amplia gama de aplicaciones clínicas. Los anticuerpos monoclonales activadores anti-CD40 pueden contribuir a la erradicación tumoral por medio de varios mecanismos importantes. En primer lugar entre éstos se encuentra la activación de células dendríticas huéspedes para el aumentado procesamiento y presentación de antígeno tumoral, como así también para la aumentada presentación de antígeno o inmunogenicidad de células tumorales CD40 positivas en sí, conduciendo a la activación de linfocitos CD4+ y CD8+ específicos de tumor. La actividad antitumoral adicional puede ser intermediada por otros efectos mejoradores inmunes de la señalización de CD40 (producción de quimioquinas y citoquinas, reclutamiento y activación de monocitos y aumentada actividad citolítica de CTL y NK), como así también la muerte directa de tumores CD40+ mediante la inducción de apoptosis o mediante la estimulación de una respuesta humoral que conduce a ADCC. Las células tumorales apoptóticas y en proceso de muerte además pueden tornarse una P04/057-APÍ importante fuente de antígenos específicos de tumor que son procesados y presentados por APC activadas por CD40. Por lo tanto, existe una necesidad decisiva de contar con anticuerpos agonistas anti-CD40 terapéuticos, importantes desde el punto de vista clínico.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1 H son alineaciones de secuencias de secuencias de aminoácidos pronosticadas de los dominios variables de cadena liviana y pesada de anticuerpo monoclonal anti-CD40 aislado, con las secuencias de aminoácidos de línea germinal de los correspondientes genes de cadena liviana y pesada. Las diferencias entre los clones y la secuencia de línea germinal se indican mediante el sombreado. Las secuencias de línea germinal CDR1 , CDR2 y CDR3 están subrayadas. En las alineaciones de secuencias de cadena pesada, las inserciones evidentes a la región CDR3 se indican por medio de un guión (-) en la secuencia de línea germinal, y las deleciones evidentes en la región de CDR3 se indican por medio de un guión (-) en la secuencia del clon. Figura 1A: las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena liviana kappa pronosticadas de mAbs 3.1.1 y 7.1.2 con las secuencias de aminoácidos de línea germinal de genes VK=A3/A19 y J= JKI . Figura I B: las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena liviana kappa pronosticadas del clon 15.1.1 y la s ecuencia de a minoácidos de línea g erminal (VK=A3/A19 y J= JK2); P04/057-APf Figura 1 C: las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena liviana kappa p ronosticadas de mAbs 10.8.3 y 21.4.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VK=L5 (DP5) y J= J 4); Figura I D: la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada pronosticada de mAb 3.1.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30+ (DP-49), D=D4+DIR3 y J=JH6); Figura 1E: la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada pronosticada de mAb 7.1.2 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30+ (DP-49), D=DIR5+DI-26 y J=JH6); Figura 1F: las secuencias de aminoácidos de cadena pesada pronosticadas de mAb 10.8.3 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=4,35 (VIV-4), D=DIR3 y J=JH6); Figura 1G: las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada pronosticadas de mAb 15.1.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (V»=4-59 (DP-71 ), D=D4-23 y J=JH4); y Figura 1 H: las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada pronosticadas de mAb 21.4.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=1-02 (DP-75), D=DLR1 y J=JH4). Las Figuras 2A-2H son alineaciones de secuencias de secuencias de aminoácidos pronosticadas de los dominios variables de cadena liviana y pesada de anticuerpo monoclonal anti-CD40 aislado, con las secuencias de aminoácidos de línea germinal de los correspondientes genes de cadena liviana y pesada. Las diferencias entre los clones y la secuencia de línea germinal se indican en negritas. Las secuencias de línea germinal P04/057-APÍ CDRl , CDR2 y CDR3 están subrayadas. En las alineaciones de secuencias de cadena pesada, las inserciones evidentes a la región CDR3 se indican por medio de un guión (-) en la secuencia de línea germinal, y las deleciones evidentes en la región de CDR3 se indican por medio de un guión (-) en la secuencia del clon. Figura 2A: las secuencias de aminoácidos de cadena liviana kappa pronosticadas de mAbs 22.1.1 , 23.5.1 y 23.29.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VK=A3/A19 y J= JKL); Figura 2B: la secuencia de aminoácidos de cadena liviana kappa pronosticada mAb 21 .2.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VK=A3/A19 y J= JK3); Figura 2C: las secuencias de aminoácidos de cadena liviana kappa pronosticadas de mAbs 23.28.1 , 23.28.1 L-C92A y 24.2.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (??^?? y J= JK3); Figura 2D: la secuencia de aminoácidos de cadena pesada pronosticada de mAb 21.2.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30+, D=DIR3+D6-19 y J=JH4); Figura 2E: la secuencia de aminoácidos de cadena pesada pronosticada de mAbs 22.1.1 , 22.1.1 H-C109A y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30+ D=D1 -1 y J=JH6); Figura 2F: la secuencia de aminoácidos de cadena pesada pronosticada de mAb 23.5.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30+, D=D4-17 y J=JH6); Figura 2G: la secuencia de aminoácidos de cadena pesada pronosticada de mAb 23.29.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=3-30,3, D=D4-17 y J=JH6); y P04/057-APf Figura 2H: las secuencias de aminoácidos de cadena pesada pronosticadas de mAb 22.28.1 , 23.28.1 H-D16E y 24.2.1 y la secuencia de aminoácidos de línea germinal (VH=4-59, D=DIR1+D4-17 y J=JH5). La Figura 3 es una curva de dosis-respuesta que ilustra la capacidad de un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) para aumentar la producción de IL-12p40 por células dendríticas humanas. La Figura 4 es una curva de dosis-respuesta que ilustra la capacidad de un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 ) para aumentar la producción de IL-12p70 por células dendríticas humanas. La Figura 5 es un gráfico que ilustra la capacidad de un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) para incrementar la inmunogenicidad de células estimulantes Jy y aumentar la actividad de CTL contra células objetivo Jy. La Figura 6 es una curva de inhibición de crecimiento tumoral que ilustra el reducido crecimiento de tumores Daudi CD40 positivos en ratones SCID-beige, tratados con un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 ). La Figura 7 es una curva de inhibición de crecimiento tumoral que ilustra el reducido crecimiento de tumores K562 CD40 negativos en ratones SCID-beige, tratados con un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) y células T y células dendríticas humanas. La Figura 8 muestra la inhibición en el crecimiento de tumores 562 CD40 negativos en ratones SCID, por diferentes concentraciones de anticuerpo anti-CD40 mAb 23.29.1. La Figura 9 P04/057-AP( muestra 1 a i nhibición e n e 1 c recimiento de tumores K562 CD40 negativos en ratones SCID, por diferentes concentraciones de mAb agonista anti-CD40 3.1.1. La Figura 10 muestra la inhibición en el crecimiento de tumores Raji CD40 positivos en presencia y ausencia de células T y células dendríticas en ratones SCID, por mAb agonista anti-CD40. La Figura 1 1 muestra la inhibición en el crecimiento de tumores Raji CD40 positivos en ratones SCID, por anticuerpos agonistas anti-CD40. La Figura 12 muestra la inhibición en el crecimiento de células de cáncer de mama BT 474 en ratones SCID-beige, por anticuerpos agonistas anti-CD40. La Figura 13 muestra la inhibición en el crecimiento de tumores de próstata PC-3 en ratones SCID-beige, por anticuerpos agonistas anti-CD40. La Figura 14 es una curva de supervivencia para ratones SCID-beige a los que se les inyectó (iv) células tumorales Daudi, y a los que se trató con anticuerpos agonistas anti-CD40. La Figura 15 es un análisis Western blot de anticuerpos agonistas anti-CD40 para CD40 humano reducido (R) y no reducido (NR). La Figura 16 es una alineación de los dominios D 1-D4 de CD40 de ratón y humano. La F igura 1 7 es u na alineación de l as s ecuencias d e aminoácidos d e CD40 de ratón y humano que muestra la ubicación de los sitios de fusión de las quimeras. La Figura 18 es un grupo de diagramas esquemáticos de las construcciones de CD40 quiméricas.
P04/057-APÍ SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o porción de enlace de antígeno del mismo, que se liga a CD40 y actúa como un agonista de CD40. La invención proporciona una composición que comprende el anticuerpo anti-CD40, ó porción de enlace de antígeno del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición además puede comprender otro componente, tal como un agente antitumoral o un agente para imagen. La invención además proporciona métodos de diagnóstico y terapéuticos. La invención proporciona una línea de células aisladas, tal como un hibridoma, que produce un anticuerpo anti-CD40 o porción de enlace de antígeno del mismo. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y/o liviana, o porciones de enlace de antígeno de las mismas, de un anticuerpo anti-CD40. La invención proporciona vectores y células huéspedes que comprenden las moléculas de ácido nucleico, como así también métodos de producción recombinantes de los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico. Se proporcionan también animales transgénicos no humanos que expresan la cadena pesada y/o liviana, o porciones de enlace de antígeno de las mismas, de un anticuerpo anti-CD40. La invención además proporciona un método para el tratamiento de un individuo que lo necesita, con una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o liviana, o porciones de enlace de antígeno de las mismas, de un anticuerpo anti-CD40.
P04/057-APf DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones y Técnicas Generales A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente i nvención tendrán l os s ignificados q ue aquéllos expertos en el arte entienden comúnmente. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación que se describen en la presente son aquéllas bien conocidas y utilizadas comúnmente en el arte. Los métodos y técnicas de la presente invención se efectúan en general de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en el arte, y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten en toda la presente memoria d escriptiva, a menos que se indique lo contrario. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Clonin : A Laboratory Manual. 2da. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing Associates (1992) y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), las cuales se incorporan a la presente como referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se efectúan de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se lleva a cabo comúnmente en e 1 a rte o como se describe en la presente. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de química analítica, química orgánica sintética P04/057-APÍ y química medicinal y farmacéutica que se describen en la presente son aquéllas bien conocidas y utilizadas comúnmente en el arte. Se usan técnicas estándares para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes. Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados: El término "polipéptido" abarca proteínas naturales o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "proteína aislada", "polipéptido aislado" o "anticuerpo aislado" es una proteína, polipéptido o anticuerpo que, en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado natural, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que es químicamente sintetizado, o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína además puede tornarse sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante aislación, usando técnicas de purificación bien conocidas en el arte. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-CD40 que ha sido purificado por afinidad usando CD40, un anticuerpo anti-CD40 que ha sido sintetizado P04/057-APÍ por una línea de células de hibridoma, u otra línea, in vitro, y un anticuerpo anti-CD40 humano derivado de un ratón transgénico. Una proteína o polipéptido es "sustancialmente pura", "sustancialmente homogénea" o "sustancialmente purificada" cuando por lo menos aproximadamente 60 a 75 % de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Una proteína o polipéptido sustancialmente puro típicamente comprenderá aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ó 90 % p/p de una muestra de proteína, más habitualmente, aproximadamente 95 %, y con preferencia será más de 99 % puro. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse por medio de una cantidad de medios bien conocidos en el arte, tales como electroforesis de gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de la visualización de una sola banda de polipéptido al teñir el gel con una tinción bien conocida en el arte. Para ciertos propósitos, se puede proporcionar resolución superior usando HPLC u otros medios bien conocidos en el arte para la purificación. El término "fragmento de polipéptido", como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las correspondientes posiciones en la secuencia natural. En algunas realizaciones, los fragmentos son de por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo. En otras realizaciones, los fragmentos son de por lo menos 14, por lo menos 20, por lo menos 50, ó por lo menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de largo. El término "análogo de polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende un segmento que tiene identidad sustancial a una porción de P04/057-APÍ una secuencia de aminoácidos y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (1 ) enlace específico a CD40 bajo condiciones de enlace a decuadas, (2) capacidad para activar CD40, (3) la capacidad para regular en forma ascendente la expresión d e moléculas d e s uperficie celular tales como ICAM, MHC-II, B7-1 , B7-2, CD71, CD23 y CD83, ó (4) la capacidad para aumentar la secreción de citoquinas tales como IFN-ß? , IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-23. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácido conservadora (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia natural. Los análogos típicamente son de por lo menos 20 ó 25 aminoácidos de largo, con preferencia, de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de largo o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido natural de longitud completa. Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para la formación de complejos de proteínas y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dicho análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia de péptidos natural. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (con preferencia, sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia natural (con preferencia, en la porción del polipéptido fuera del o de los dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservadora no debería cambiar de manera sustancial las características estructurales de la secuencia madre (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tener una tendencia a romper una hélice que se produce en la secuencia madre, o interrumpir otros tipos de P04/057-APÍ estructura secundaria que caracteriza la secuencia madre). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en el arte se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, ed., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton y otros, Nature 354: 105 (1991), las cuales se incorporan cada una a la presente como referencia. Los análogos no péptidos s e u tilizan c omúnmente e n l a i ndustria farmacéutica como drogas con propiedades análogas a las del péptido patrón. Estos tipos de compuestos no péptidos se denominan "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger, TINS p. 392 (1985); y Evans y otros, J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), las cuales se incorporan a la presente como referencia. Dichos compuestos a menudo se desarrollan con la ayuda de modelos moleculares computerizados. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen una o más uniones de péptido reemplazadas de manera opcional por una unión seleccionada entre el grupo que consiste en: -CH2NH— , — CH2S--, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2-,--CH(OH)CH2-, y -CH2SO-,por métodos bien conocidos en el arte. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también se puede usar para generar péptidos más estables.
P04/057-APÍ Además, los péptidos artificiales que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica se pueden generar por métodos bien conocidos en el arte (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61 : 387 ( 1992), incorporada a la presente como referencia); por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido. Un "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo o a una porción de enlace de antígeno del mismo, que compite con el anticuerpo intacto para el enlace específico. Ver, en general, Fundamental Immunologv, Cap. 7 (Paul, W. ed., 2da. ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (incorporado a la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las porciones de enlace de antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinantes o por disociación enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de enlace de antígeno incluyen, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb y fragmentos de región determinante de complementaridad (en inglés, CDR), anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen por lo menos una porción de un anticuerpo que suficiente para conferir enlace de antígeno específico al polipéptido. Desde el término N al término C, t anto e l d ominio v ariable d e c adena l iviana como pesada comprenden las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological lnterest (National Institutes of Health, Bethsda, Md. (1987 y 1991 )), o Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 -917 (1987); Chothia y otros, Naíure 342: 878-883 (1989).
P04/057-APÍ Como se usa en la presente, un anticuerpo al que se hace referencia por número es un anticuerpo monoclonal que se obtiene del hibridoma del mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 3.1 .1 se obtiene del hibridoma 3. 1 .1 . Como se usa en la presente, un fragmento Fd significa un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios VH y CH; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward y otros, Nature 341 : 544-546 (1989)) consiste en un dominio VH. (n. del t.: H= pesado/a (del inglés "heavy") y L= liviano/a (del inglés "light")). En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple (scFv) en el cual los dominios VL y VH están emparejados para formar moléculas monovalentes por medio de un conector sintético que les permite formarse como una cadena de proteína simple (Bird y otros, Science 242: 423-426 ( 1988) y Huston y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 ( 1988)). En a lgunas realizaciones, l os a nticuerpos s on diacuerpos, es decir, son anticuerpos bivalentes en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipéptido, pero usando un conector que es demasiado c orto p ara p ermitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esa manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios d e o tra c adena, y c reando dos s itios de enlace de antígeno (ver, por ejemplo, Holliger P. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ( 1993) y Poljak R. J. y otros, Structure 2: 1 121-1 123 (1994)). En algunas realizaciones, uno o más CDR de un anticuerpo de la invención pueden incorporarse en una molécula ya sea en forma covalente o no covalente, para convertirla en una inmunoadhesina que se liga en forma específica a CD40. En dichas realizaciones, los CDR se pueden incorporar como parte P04/057-APf de una cadena de polipéptido más grande, se pueden ligar de manera covalente a otra cadena de polipéptido, o se pueden incorporar de manera no covalente. En realizaciones que tienen uno o más sitios de enlace, los sitios de enlace pueden ser idénticos entre sí, o pueden ser diferentes. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humano" significa cualquier anticuerpo en el cual todas las secuencias de dominios constantes y variables son secuencias humanas. Estos anticuerpos se pueden preparar de una variedad de maneras, como se describe más adelante. El término "anticuerpo quimérico" como se usa en la presente, significa un anticuerpo que comprende regiones de dos o más anticuerpos diferentes. En una realización, una o más de las CDR derivan de un anticuerpo anti-CD40 humano. En otra realización, todas las CDR derivan de un anticuerpo anti-CD40 humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-CD40 humano se combinan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDRl de la cadena liviana de un primer anticuerpo anti-CD40 humano, una CDR2 de la cadena liviana de un segundo anticuerpo anti-CD40 humano y una CDR3 y CDR3 de la cadena liviana de un tercer anticuerpo anti-CD40 humano, y las CDR de la cadena pesada pueden d erivar d e uno o más anticuerpos anti-CD40. Además, las regiones de marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos a nti-CD40, ó de uno o m ás humanos diferentes. Un "anticuerpo activador" (al que también se hace referencia en la presente como un "anticuerpo agonista"), como se usa en la presente, significa un anticuerpo que incrementa una o más actividades de CD40 por lo menos aproximadamente 20 % P04/057-APf cuando se agrega a una célula, tejido u organismo que expresa CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo activa la actividad de CD40 por lo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo activador se agrega en presencia de CD40L. En algunas realizaciones, la actividad del anticuerpo activador se mide usando un ensayo de regulación ascendente de molécula de superficie de sangre entera. Ver Ejemplo VII. En otra realización, l a actividad del anticuerpo a ctivador s e mide usando un ensayo de célula dendrítica para medir la liberación de IL-12. Ver Ejemplo VIII. En otra realización, la actividad del anticuerpo activador se mide usando un modelo de tumor in vivo. Ver Ejemplo X. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden ser preparados con facilidad por aquéllos expertos en el arte, siguiendo las descripciones de esta memoria descriptiva. Los términos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar por comparación de la información de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos públicas o registradas. Con preferencia, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencias o dominios de conformación de proteínas pronosticados que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Los métodos para la identificación de secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional son conocidos. Ver Bowie y otros, Science 253: 164 (1991). El término "resonancia de plasmotipo de superficie", como se usa en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las P04/057-APÍ concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N. J.). Para más descripciones, ver Jonsson U. y otros, Ann. Biol. Clin. 51 : 19-26 (1993); Jonsson U. y otros, Biotechniques ] 1 : 620-627 (1991); Jonsson B. y otros, J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); y Johnsson B. y otros, anal. Biochem. 198: 268-277 (1991). El término "KD" se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "epítope" incluye cualquier determinante de proteína capaz de enlace específico a un receptor de célula T o inmunoglobulina. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, como así también características de carga especifica. Se dice que un anticuerpo se liga en forma específica a un antígeno cuando la constante de disociación de equilibrio es < 1 µ?, con preferencia, < 100 nM, y con mayor preferencia, < 10 nM. Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunologv - A Synthesis (2da. ed., E. S. Golub y D. R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), la cual se incorpora a la presente como referencia. El término "polinucleótido" como se hace referencia en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de esos tipos de nucleótidos. El término incluye formas de filamento simple o doble.
P04/057-APf El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente, significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético, o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o con una porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" es encuentra en la naturaleza, (2)está funcionalmente ligado a un polinucleótido al cual no está ligado en la naturaleza, ó (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "oligonucleótido", como se usa en la presente, incluye nucleótidos naturales y modificados ligados por uniones de oligonucleótidos naturales y no naturales. Los oligonucleótidos son una subclase de polinucleótidos que en general comprenden una longitud de 200 bases o menos. Con preferencia, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud, y con mayor preferencia, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos habitualmente son de filamento simple, por ejemplo, para cebadores y sondas; si bien los oligonucleótidos pueden ser de filamento doble, por ejemplo, para el uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser o bien oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos naturales" como se usa en la presente incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" como se usa en la presente, incluye nucleótidos con grupos azúcares modificados o sustituidos y similares. El término "uniones de oligonucleótidos" al que se hace referencia en la presente incluye uniones de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, P04/057-APf fosforoamidato y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche y otros, Nucí. Acids Res. 14: 9081 ( 1986); Stec y otros, J. Am. Chem. Soc, 106: 6077 (1984); Stein y otros, Nucí. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon y otros, Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon y otros, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, páginas 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991 )); Patente de los Estados Unidos No. 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990)), cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia. Un oligonucleótido puede incluir un rótulo para detección, si se desea. Las secuencias "funcionalmente ligadas" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés, como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" como se usa en la presente, significa secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales se ligan. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de mejorador, promotor, terminación e iniciación de transcripción; señales de procesamiento de ARN eficaz tales como señales de empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan ARNm citoplásmico; secuencias que aumentan la eficacia de traducción (es decir, secuencia de consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de proteínas; y cuando se desea, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere según el organismo huésped; en procariotos, dichas secuencias de control en general incluyen secuencia de promotor, de sitio de enlace ribosomático y de terminación de transcripción; en eucariotos, en general, dichas P04/057-APf secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" tiene la intención de incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión. El término "vector", como se usa en la presente, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido, es decir, una anilla de ADN de doble filamento, circular, en la cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales). En otras realizaciones, los vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped con la introducción en la célula huésped, y de esa forma son replicados j unto c on e 1 genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están funcionalmente ligados. Se hace referencia a dichos vectores en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). El término "célula huésped recombinante" (o simplemente, "célula huésped"), como se usa en la presente, significa una célula dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debería entenderse que "célula huésped PQ4/057-APf recombinante" y "célula huésped" significan no sólo la célula sujeto particular, sino también la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesoras debido ya sea a la mutación o a influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula madre, pero aún se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. El término "híbrida de manera selectiva" al que se hace referencia en la presente significa enlazar de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan de manera selectiva a hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de enlace detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de "alta severidad" o "altamente severas" para lograr las condiciones de hibridación selectiva, como se conocen en el arte y se discuten en la presente. Un ejemplo de condiciones de "alta severidad" o "altamente severas" es la incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, en donde un polinucleótido puede ser fijado a una superficie sólida, tal como una membrana, en un buffer de hibridación de 6X SSPE o SSC, formamida 50 %, 5X reactivo de Dehardt, SDS 0,5 %, 100 µg/ml ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42°C, durante 12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55°C, usando u n b uffer d e 1 avado d e 1 X S SC, S DS 0 ,5 %. Ver además, Sambrook y otros, supra, páginas 9.50-9.55. El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico significa los residuos en dos secuencias que son iguales cuando son alineados para máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de P04/057-APf secuencia puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, más habitualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 n ucleótidos, más típicamente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, y con preferencia, por lo menos aproximadamente 36, 48 ó más nucleótidos. Hay una cantidad de diferentes algoritmos conocidos en el arte que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas del Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de interrogación y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71 -84 (1998); incorporadas a la presente como referencia). A menos que se especifique de otra manera, se usan los parámetros por default para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros de default (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de clasificación), o usando Gap con sus parámetros de default, como se proporcionan en GCG Versión 6.1, incorporada a la presente como referencia. Una referencia para una secuencia de nucleótidos abarca su complemento, a menos que se especifique lo contrario. Así, debería entenderse que una referencia para P04/057-APf un ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. En el arte de la biología molecular, los investigadores utilizan los términos "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia" y "porcentaje de homología de secuencia" en forma intercambiable. En esta solicitud, estos términos tendrán los mismos significados con respecto a secuencias de ácido nucleico solamente. El término "sustancial similitud" o "sustancial similitud de secuencia", con referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea de manera óptima con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay identidad de secuencia de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 85 %, con preferencia, por lo menos aproximadamente 90 %, y con más preferencia, por lo menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de las bases de nucleótidos, como es medida por cualquier algoritmo de identidad de secuencias bien conocido, tal como FASTA, BAST o Gap, como se discute anteriormente. Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando son alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de espacios por default, comparten por lo menos 70, 75 u 80 por ciento de identidad de secuencia, con preferencia, por lo menos 90 ó 95 por ciento de identidad de secuencia, y con más preferencia, por lo menos 97, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia. Con preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una P04/057-APf "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido con otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará de manera sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. L os m edios p ara h acer e ste ajuste s on b ien conocidos para aquéllos expertos en el arte. Ver, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 ( 1994). Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen l)cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. En forma alternativa, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad log PAM250 que se describe en Gonnet y otros, Science 256: 1443-45 (1992), incorporada a la presente como referencia. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad log PAM250.
P04/057-APÍ La similitud de secuencia para polipéptidos, a la que también se hace referencia como identidad de secuencia, típicamente se mide usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteína une secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se pueden utilizar con parámetros de default para determinar la homología de secuencias, o identidad de secuencias, entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también se pueden comparar usando FASTA, usando parámetros de default o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de interrogación y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos e s e 1 p rograma p ara computadora B LAST, e specialmente b lastp o tblastn, usando p arámetros p or d efault. V er, p or ejemplo, A ltschul y o tros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul y otros, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); incorporadas a la presente como referencia. La longitud de las secuencias de polipéptidos comparadas para homología en general será por lo menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, habitualmente P04/057-AR por lo menos aproximadamente 20 residuos, más habitualmente por lo menos aproximadamente 24 residuos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 residuos, y con preferencia, más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se hace una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias de una gran cantidad de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos. Como se usa en la presente, los términos "rótulo" o "rotulado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, el rótulo es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiorrotulado o unión a un polipéptido de porciones biotiniladas que pueden ser detectadas por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos). En otra realización, el rótulo o el marcador pueden ser terapéuticos, por ejemplo, un conjugado de drogas o toxina. Varios métodos de rotulación de polipéptidos y glucoproteínas son conocidos en el arte, y pueden usarse. Ejemplos de rótulos para polipéptidos incluyen, pero no se limitan, a los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, l 5N, 35S, 90Y, 99TC, " ??, 125I, 131I),rótulos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantanoides fosforescentes), rótulos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de zippers de leucina ( "zipper d e l eucina": u n tramo de aminoácidos de 4 a 7 residuos de leucina, cada uno separado por 6 aminoácidos, que se produce adyacente a un tramo de aminoácidos altamente básico en algunas proteínas de enlace de ADN), sitios de enlace P04/057-APÍ para anticuerpos secundarios, dominios de enlace metálico, etiquetas de epítopes), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, d ihidroxi a ntracina d iona, m itoxantrona, m itramicina, a ctinomicina D , 1 -dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, los rótulos se unen por medio de brazos espaciadores de varias longitudes, para reducir el potencial impedimento estérico. El término paciente incluye individuos humanos y del campo veterinario. En toda esta memoria descriptiva y reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", implican la inclusión de un entero o grupo de enteros establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.
Anticuerpos Anti-CD40 Humanos y Caracterización de los mismos Los anticuerpos humanos evitan ciertos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes no humanas (por ejemplo, de roedores). Dichos problemas incluyen el rápido aclaramiento de los anticuerpos o respuesta inmune contra el anticuerpo. Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona anticuerpos anti-CD40 humanizados. En otra realización, la invención proporciona anticuerpos anti-CD40 humanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 humanos son producidos por medio de la inmunización de un roedor cuyo P04/057-APf genoma comprende genes de inmunoglobulina humanos, de manera que el roedor produce anticuerpos humanos. Se espera que los anticuerpos anti-CD40 humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales no humanos o derivados de no humanos (Mab), y en consecuencia, incrementen la eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación y cáncer, que pueden requerir repetidas administraciones de anticuerpos. La invención proporciona once anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos activadores (mAb) y las líneas de células de hibridoma que los producen. La Tabla A cita los identificadores de secuencias (SEC ID NO:) de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y liviana de longitud completa (incluyendo secuencia líder), las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de longitud completa, y la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de las regiones variables de cadena pesada y liviana. Tabla A ANTICUERPOS ANTI-CD40 HUMANOS MAb IDENTIFICADOR DE SECUENCIA (SEC ID NO:) Región Variable Longitud Completa Pesada Liviana Pesada Liviana ADN Proteína AD Proteína AD Proteína AD Proteína N N N P04/057-APf células de hibridoma que lo produce. La invención también proporciona variantes de cadena pesada y/o liviana de ciertos de los mAb anti-CD40 humanos que se citan anteriormente, que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos. La invención proporciona dos cadenas pesadas variantes de mAb 3.1.1. En una, la alanina en el residuo 78 se cambia a treonina. En la segunda, la alanina en el residuo 78 se cambia a treonina, y las valinas en los residuos 88 y 97 se cambian a alaninas. La invención además proporciona una cadena liviana variante de mAb 3.1.1 en la cual la leucina en el residuo 4 y la leucina en el residuo 83 se cambian a metionina y valina, respectivamente. La combinación con una cadena pesada o liviana variante con una cadena liviana o pesada de tipo silvestre, respectivamente, e s d esignada p or 1 a c adena m utante. En c onsecuencia, un anticuerpo P04/057-APÍ que contiene una cadena liviana de tipo silvestre y una cadena pesada que comprende la mutación de alanina a treonina en el residuo 78 es designada como 3.1.1H-A78T. Sin embargo, en otras realizaciones de la invención, se incluyen los anticuerpos que contienen cualquier combinación de una cadena pesada variante y la cadena liviana variante de 3.1.1. Además, la invención proporciona una variante de la cadena pesada de mAb 22.1.1 , en la cual la cisteína en el residuo 109 se cambia a una alanina. Un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada variante y la cadena liviana 22.1.1 se designa mAb 22.1.1 H-C109A. La invención además proporciona dos cadenas pesadas variantes y una cadena liviana variante de mAb 23.28.1. En una variante de cadena pesada, el ácido aspártico en el residuo 16 se cambia a ácido glutámico. Un mAb que comprende la variante de cadena pesada variante y la cadena liviana de 23.28.1 se designa 23.28.1 H-D16E. La invención además incluye una variante de cadena liviana de 23.28.1 en la cual la cisteína en el residuo 92 se cambia a una alanina. Un mAb que comprende la cadena pesada de 23.28.1 y la cadena liviana variante se designa 23.28.1 L C92A. La invención también comprende mAb que comprenden cualquiera de las variantes de cadena pesada de 23.28.1 con la variante de cadena liviana de 23.28.1 . La cadena liviana producida por el hibridoma 23.29.1 contiene una mutación en la región constante en el residuo 174. La cadena liviana producida por el hibridoma tiene arginina en esta posición en lugar de la lisina canónica. En consecuencia, la invención además proporciona una cadena liviana de 23.29.1 con la lisina canónica en el residuo 174 y un mAb, designado 23.29.1 L-R174 que comprende la cadena pesada de 23.29.1 y la cadena liviana variante.
P04/057-APf En una realización preferida, el anticuerpo anti-CD40 es 3.1.1 , 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1, 22.1.1 , 22.1.1 H-C 109A, 23.5.1 , 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1 L-R174 y 24.2.1. En a lgunas r ealizaciones, e l a nticuerpo a nti-CD40 comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 ó 102 ó la región variable de la misma, o codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre SEC ID NO: 7, 15, 23, 31 , 39, 47, 55, 63, 71 , 79, 87, 93, 99 ó 101. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 comprende una cadena liviana que comprende por lo menos la CDR2 de uno de los anticuerpos citados, una de las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente (como se muestra en las Figuras 1A-1C y 2A-2C) o codificada por una de las secuencias de ácido nucleico identificadas anteriormente. En otra realización, la cadena liviana además comprende una CDRl y CDR3 seleccionadas en forma independiente entre una región variable de cadena liviana que comprende no más de diez aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de línea germinal A3/A19, L5 ó A27, ó comprende una CDRl y CDR3 seleccionadas en forma independiente entre una de una CDRl y CDR3 de (1) un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1 L-R174K Ó 24.2.1 ; (2) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102 ó (3) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 3, 1 1 , 19, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75, 83, 93, 99 ó 101.
P04/057-APÍ En otra realización preferida, el anticuerpo anti-CD40 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 u 86, ó la región variable de las mismas, o codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre SEC ID NO: 5, 13, 21 , 29, 37, 45, 53, 61 , 69, 77 u 85. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 comprende una cadena pesada que comprende por lo m enos 1 a C DR3 d e uno de los anticuerpos citados, una de las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente (como se muestra en las Fig. 1A-1 C y 2A-2C) o codificada por una de las secuencias de ácido nucleico identificadas anteriormente. En otra realización, la cadena pesada además comprende una CDR1 y CDR2 seleccionadas en forma independiente entre una región variable de cadena pesada que comprende no más de dieciocho aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de línea germinal VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 ó 3-30.3, ó comprende una CDR1 y CDR2 seleccionadas en forma independiente entre una de una CDR1 y CDR2 de (1) un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1, 21.2.1 , 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1 ; (2) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98; ó (3) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 , 9, 17, 25, 33, 41 , 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91 , 95 ó 97. En otra realización, el anticuerpo anti-CD40 comprende una cadena pesada y una cadena liviana como se definen anteriormente. Como se usa en la presente, el anticuerpo 3.1.1 H-A78T es idéntico al de 3.1.1 , excepto que el residuo 78 de la cadena pesada es treonina en lugar de alanina. Asimismo, en el anticuerpo 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, el residuo 78 se cambia a A, y P04/057-APf los residuos 88 y 97 se cambian de valina a alanina en la cadena pesada. El anticuerpo 3.1.1L-L4M-L83V es idéntico al de 3.1.1 , excepto que el residuo 4 es metionina en lugar de leucina, y el residuo 83 es valina en lugar de leucina en la cadena liviana. El anticuerpo 22.1.1H-C109A e s i déntico a l d e 22.1.1 , e xcepto q ue e l r esiduo 109 de la cadena pesada se cambia de una cisteína a una alanina. Los anticuerpos 23.28.1 H-D16E y 23.28.1 L-C92A son idénticos al de 23.28.1 , excepto que el residuo 16 de la cadena pesada se cambia de aspartato a glutamato y el residuo 92 de la cadena liviana se cambia de cisteína a alanina, respectivamente. El anticuerpo 23.29.1 L-R174K es idéntico al de 23.29.1, excepto que el residuo 174 de la cadena liviana se cambia de arginina a lisina.
Clase y Subclase de Anticuerpos Anti-CD40 La clase y subclase de anticuerpos anti-CD40 se pueden determinar por cualquier método conocido en el arte. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se puede determinar usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos se pueden obtener comercialmente. La clase y subclase se pueden determinar por ELISA, o Western Blot, como así también por otras técnicas. De manera alternativa, la clase y subclase se pueden determinar por secuenciamiento de todos o de una porción de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o livianas de los anticuerpos, comparando las secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo anti-CD40 puede ser una molécula de IgG, una de IgM, una de IgE, una de P04/057-APf IgA o una de IgD. En una realización preferida, el anticuerpo anti-CD40 es un IgG y es una subclase IgGl , IgG2, I gG3 ó IgG4. E n o tra realización preferida, l os a nticuerpos anti-CD40 son subclase IgG2.
Selectividad de Especie y de Molécula En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-CD40 demuestran tanto selectividad de molécula como de especie. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se liga a CD40 de primates y humano. En algunas r ealizaciones, e l a nticuerpo anti-CD40 se liga a CD40 humano, de cynomolgus o rhesus. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 no se liga a CD40 de ratón, rata, perro o conejo. Siguiendo las descripciones de la memoria descriptiva, se puede determinar la selectividad de especie para el anticuerpo anti-CD40, usando métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad de especie usando Western Blot, FACS, ELISA o RIA (ver, por ejemplo, Ejemplo IV). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 tiene una selectividad para CD40 que es más de 1 00 v eces m ayor q ue s u s electividad p ara RAN ( activador d e receptor de factor-kappa B nuclear), 4-lBB (CD137), TNFR-1 (Receptor-1 de Factor de Necrosis Tumoral) y TNFR-2 (Receptor-2 de Factor de Necrosis Tumoral). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 no exhibe enlace específico apreciable alguno a ninguna otra proteína que no sea CD40. Se puede determinar la selectividad del anticuerpo anti-CD40 para CD40 usando métodos bien conocidos en el arte, siguiendo las descripciones de la memoria descriptiva. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad usando Western Blot, FACS, ELISA o RIA (ver, por ejemplo, Ejemplo V).
P04/057-APÍ Identificación de Epítopes CD40 Reconocidos por Anticuerpo Anti-CD40 Además, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que se liga a CD40 y compite en forma cruzada con, y/o se liga, al mismo epítope y/o se liga a CD40 con la misma KD que un anticuerpo anti-CD40 humano seleccionado entre un anticuerpo 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1 L-R174K, ó 24.2.1 ; o un anticuerpo anti-CD40 humano que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó un anticuerpo anti-CD40 humano que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102. Se puede determinar si un anticuerpo se liga al mismo epítope que, o compite para e l enlace c on un anticuerpo anti-CD40, usando cualquier método conocido en el arte. En una realización, se puede permitir que el anticuerpo anti-CD40 de la invención se ligue a CD40 bajo condiciones de saturación, y luego medir la capacidad del anticuerpo de ensayo para ligarse a CD40. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de ligarse al CD40 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-CD40, entonces el anticuerpo de ensayo se liga a un epítope diferente que el anticuerpo anti-CD40. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de ligarse al CD40 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se liga al mismo epítope, a un epítope en superposición, o a un epítope que se encuentra en estrecha proximidad al epítope ligado por el anticuerpo anti-CD40 humano.
P04/057-APf Este experimento se puede efectuar usando ELISA, RIA, FACS o resonancia de plasmotipo de superficie (ver, por ejemplo, Ejemplo VI). En una realización preferida, el experimento se lleva a cabo usando resonancia de plasmotipo de superficie. En una realización más preferida, se usa BIAcore.
Afinidad de Enlace de Anticuerpos Anti-CD40 a CD4Q En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD40 se liga a CD40 con alta afinidad. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se liga a CD40 con g una D de 2 x 10' M o menos. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo se liga a CD40 con una KD de 2 x 10"9, 2 x 10"10, 4,0 x 10"" M o menos. En una realización aún más preferida, el anticuerpo se liga a CD40 con una KD de 2,5 x 10'12 M o menos. En algunas r ealizaciones, e l anticuerpo s e liga a CD40 sustancialmente con la misma KD que un a nticuerpo s eleccionado entre 3 .1.1 , 3 .1.1 H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1 L-R174K, ó 24.2.1. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma KD que un anticuerpo que comprende una CDR2 de una cadena liviana y/o una CDR3 de una cadena pesada, de un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1 , 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 , 21.2.1, 22.1.1 , 22.1.1 H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1 L-R174K y 24.2.1. En aún otra realización preferida, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma KD que un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que PQ4/057-APÍ tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó que comprende una cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma KD que un anticuerpo que comprende una CDR2 de una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102, ó una CDR3 de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 tiene un bajo índice de disociación. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 tiene una <j¡s. de 2,0 x 10"4 o inferior. En algunas realizaciones, la Kd¡s. es 2,0 x 10"7, ó inferior. En algunas realizaciones, la K<ijs. es sustancialmente la misma que un anticuerpo como se describe en la presente, incluyendo un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174 y 24.2.1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma K<j¡s. que un anticuerpo que comprende una CDR3 de una cadena pesada o una CDR2 de una cadena liviana, de un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174 y 24.2.1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma Kdis. que un anticuerpo que P04/057-APf comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102. En otra realización preferida, el anticuerpo se liga a CD40 sustancialmente con la misma KLdis. que un anticuerpo que comprende una CDR2 de una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102, ó una CD 3 de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 0 98. La afinidad de enlace y el índice de disociación de un anticuerpo anti-CD40 a CD40 se pueden determinar por cualquier método conocido en el arte. La afinidad de enlace se puede medir por ELISA, RIA o resonancia de plasmotipo de superficie competitivos, tales como BIAcore. El índice de disociación también se puede medir por resonancia de plasmotipo de superficie. Con preferencia, la afinidad de enlace y el índice de disociación se miden por resonancia de plasmotipo de superficie. Con más preferencia, la afinidad de enlace y el índice de disociación se miden usando BIAcore™. Ver, por ejemplo, Ejemplo XIV.
Uso de Genes de Cadena Liviana y Pesada Un anticuerpo anti-CD40 de la invención puede comprender una cadena liviana kappa humana o lambda humana, o una secuencia de aminoácidos derivada de las mismas. En algunas realizaciones que comprenden una cadena liviana kappa, el dominio P04/057-APÍ variable de cadena liviana (VL) es codificado en parte por un gen Wk humano A3/A1 (DP -15), L5 (DP5), o A27 (DPK-22). En algunas realizaciones, el VL del anticuerpo anti-CD40 contiene una o más sustituciones de aminoácidos en relación a la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunas realizaciones, el VL del anticuerpo anti-CD40 comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácidos en relación a la secuencia de aminoácidos de línea germinal. E n a lgunas realizaciones, u na o m ás d e e sas s ustituciones de 1 ínea germinal se encuentran en las regiones de CDR de la cadena liviana. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos en relación a la línea germinal se encuentran en una o más de las mismas posiciones que las sustituciones en relación a la línea germinal en cualquiera de uno o más de los VL de los anticuerpos 3.1 .1 , 3.1 .1 L-L4M-L83V, 7.1 .2, 10.8.3, 15.1.1 , 21 .4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1 L-R174 y 24.2.1. Por ejemplo, el VL del anticuerpo anti-CD40 puede contener una o más sustituciones de aminoácidos, comparado con la línea germinal que se encuentra en el anticuerpo 21.4. 1 , y otras sustituciones de aminoácidos comparado con la línea germinal que se encuentra en el anticuerpo 10.8.3, que utiliza el mismo gen V que el anticuerpo 21.4.1. En algunas realizaciones, los cambios de aminoácidos se encuentran en una o más de las mismas p osiciones, p ero involucran una mutación diferente que en el anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, los cambios de aminoácidos en relación a la línea germinal se producen en una o más de las mismas posiciones que en cualquiera de los V,. de los anticuerpos 3.1 .1 , 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 1 5.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1L-R174K y 24.2.1 , P04/057-APÍ pero los cambios pueden representar sustituciones de aminoácidos conservadoras en dicha o dichas posiciones en relación al aminoácido en el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, si una posición particular en uno de estos anticuerpos se cambia en relación a la línea germinal y es glutamato, se puede sustituir de manera conservadora con aspartato en esa posición. De manera similar, si una sustitución de aminoácido comparada con la línea germinal es serina, se puede sustituir de manera conservadora serina por treonina en esa posición. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se discuten supra. En algunas realizaciones, la cadena liviana del anticuerpo anti-CD40 humano comprende la secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos del VL del anticuerpo 3.1.1 (SEC ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEC ID NO: 94), 7.1.2 (SEC ID NO: 12), 10.8.3 (SEC ID NO: 20), 15.1.1 (SEC ID NO: 28), 21.4.1 (SEC ID NO:), 21.2.1 (SEC ID NO: 36), 21.4.1 (SEC ID NO: 44), 22.1.1 (SEC ID NO: 52), 23.5.1 (SEC ID NO: 60), 23.28.1 (SEC ID NO: 68), 23.28.1 L-C92A (SEC ID NO: 100), 23.29.1 (SEC ID NO: 76), 23.29.1 L-R174 (SEC ID NO: 102) ó 24.2.1 (SEC ID NO: 84),o dicha secuencia d e aminoácidos tiene hasta 1 , 2, 3 , 4 , 6 , 8 ó 1 0 sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o un total de hasta 3 sustituciones de aminoácidos no conservadoras. En algunas realizaciones, la cadena liviana del anticuerpo anti-CD40 comprende por lo menos la cadena liviana CDR2, y también puede comprender las regiones CDRl y CDR3 de una secuencia de línea germinal, como se describe en la presente. En otra realización, la cadena pesada puede comprender una CDRl y CDR2 de un anticuerpo que se selecciona de manera independiente entre 3.1.1 , 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1, 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , y P04/057-APÍ 24.2.1, 0 r egiones C DR q ue tienen c ada u na m enos d e 8, menos de 6, menos de 4 ó menos de 3 sustituciones de aminoácidos c onservadoras y/o u n t otal d e t res o m enos sustituciones de aminoácidos no conservadoras. En otras realizaciones, la cadena liviana del anticuerpo anti-CD40 comprende por lo menos la cadena liviana CDR2, y también puede comprender las regiones CDR1 y CDR3, cada una de las cuales se selecciona de manera independiente entre las regiones CDR1 y CDR3 de un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ó 100, ó codificada por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre SEC ID NO: 3, 11, 1 , 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 ó 99. Con respecto a la cadena pesada, en algunas realizaciones, la región variable de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada es codificada en parte por un gen humano VH 3-30+, VH 4-59, VH 1-02, VH 4.35 ó VH 3-30.3. En algunas realizaciones, el VH del anticuerpo anti-cD40 contiene una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones (adiciones) en relación a la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena pesada comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 mutaciones de la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunas realizaciones, la o las mutaciones son sustituciones no conservadoras, comparadas con la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunas realizaciones, las mutaciones se encuentran en las regiones CDR de la cadena pesada. En algunas realizaciones, los cambios de aminoácidos se hacen en una o más de las mismas posiciones que las mutaciones de la línea germinal en cualquiera de uno o más de los VH de los anticuerpos 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, P04/057-APf 10.8.3, 15.1.1, 21.4. 1 , 21.2.1, 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1. En otras realizaciones, los cambios de aminoácidos son en una o más de las mismas posiciones, pero involucran una mutación diferente que en el anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable (VH) del anticuerpo 3.1.1 (SEC ID NO: 2), 3.1.1H-A78T (SEC ID NO: 90),3.1 .1H-A78T-V88A-V97A (SEC ID NO: 92), 7.1.2 (SEC ID NO: 10), 10.8.3 (SEC ID NO: 18), 15.1.1 (SEC ID NO: 26),21.2.1 (SEC ID NO: 34), 21.4.1 (SEC ID NO: 42), 22.1.1 (SEC ID NO: 50), 22.1 .1 H-C 109A (SEC ID NO: 96), 23.5.1 (SEC ID NO: 58), 23.28.1 (SEC ID NO: 66), 23.28.1 H-D16E (SEC ID NO: 98), 23.29.1 (SEC ID NO: 74) y 24.2.1 (SEC ID NO: 82),o dicha secuencia de aminoácidos tiene hasta 1 , 2, 3, 4, 6, 8 ó 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o un total de hasta 3 sustituciones de aminoácidos no conservadoras. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende las regiones CDRl , CDR2 y CDR3 del anticuerpo 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21 .4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1 (como se muestra en las Figuras 1D-1 H ó 2D-2H), o dichas regiones CDR tienen cada una menos de 8, menos de 6, menos de 4 ó menos de 3 sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoácidos no conservadoras. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende una CDR3, y también puede comprender las regiones CDRl y CDR2 de una secuencia de línea germinal, como se describe anteriormente, o puede comprender una CDRl y CDR2 de un P04/057-APÍ anticuerpo, cada una de las cuales se selecciona en forma independiente entre un anticuerpo que comprende una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1 , 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 , 2 1.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1 H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1. En otra realización, la cadena pesada comprende una CDR3, y también puede comprender las regiones CDR1 y CDR2, cada una de las cuales se selecciona en forma independiente entre una región CDR1 y CDR2 de una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98 (como se muestra en las Figuras 1 D-1 H o en las Figuras 2D-2H), o codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre SEC ID NO: 1 , 9 , 1 7, 2 5, 3 3, 4 1, 49, 57, 65, 7 3, 8 1, 89, 9 1 , 95 ó 97. En otra realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada como se describe anteriormente y una cadena liviana como se describe anteriormente. Un tipo de sustitución de aminoácidos que puede hacerse es el cambio de una o más cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, por otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina. En una realización, la sustitución de cisteína se hace en una región de marco de un dominio variable, o en el dominio constante de un anticuerpo. En otra realización, la cisteína está en una región no canónica del anticuerpo. Otro tipo de sustitución de aminoácidos que puede hacerse es el cambio de cualquier sitio proteolítico potencial en el anticuerpo, en particular aquéllos que se encuentran en una región de marco de un dominio variable, en el dominio constante de un anticuerpo, o en una región no canónica del anticuerpo. La sustitución de residuos cisteína y la remoción de sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de cualquier heterogeneidad P04/057-APÍ en el producto del anticuerpo, y de esa manera incrementar su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácidos es la eliminación de pares de asparagina-glicina, que forman sitios de desamidación potenciales, mediante la alteración de uno o ambos residuos. Esto con preferencia se hace en regiones de marco, en el dominio constante o en regiones no canónicas del anticuerpo.
Activación de CD4Q por Anticuerpo Anti-CD40 Otro aspecto de la presente invención involucra un anticuerpo anti-CD40 que es un anticuerpo activador, es decir, un agonista de CD40. Un anticuerpo activador amplifica o sustituye los efectos de CD40L en CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo activador es esencialmente una mímica de CD40L, y compite con CD40L para el enlace a CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo no compite con CD40L para el enlace a CD40, sino que amplifica el efecto del enlace de CD40L a CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 activa CD40 en presencia o ausencia de CD40L.
Inhibición de Crecimiento Tumoral In Vivo por Anticuerpos Anti-CD40 De acuerdo con algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD40 que inhibe la proliferación de células tumorales in vitro, o el crecimiento tumoral in vivo. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral por lo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibe el crecimiento tumoral un 75 %. En una realización, la inhibición del crecimiento P04/057-APÍ tumoral es detectable 14 días después de tratamiento inicial con el anticuerpo. En otras realizaciones, la inhibición del crecimiento tumoral es detectable 7 días después del tratamiento inicial con el anticuerpo. En algunas realizaciones, se administra otro agente antineoplástico al animal, con el anticuerpo anti-CD40. En algunas realizaciones, el agente antineoplástico además inhibe el crecimiento tumoral. En algunas realizaciones, el agente antineoplástico es adriamicina o taxol. En algunas realizaciones, la administración conjunta de un agente antineoplástico y el anticuerpo anti-CD40 inhibe el crecimiento tumoral por lo menos 50 %, después de un período de 22-24 días desde la iniciación del tratamiento, comparado con el crecimiento tumoral en un animal no tratado.
Inducción de Apoptosis por Anticuerpos Anti-CD40 Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-CD40 que induce la muerte celular de células CD40 positivas. En algunas realizaciones, el anticuerpo causa apoptosis de células CD40 positivas, ya sea in vivo o in vitro.
Aumento de la Expresión de Moléculas de Superficie Celular En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 aumenta la expresión de moléculas de superficie celular B, incluyendo, pero no limitándose, a ICAM, MHC-II, B7-2, CD71 , CD23 y CD83. En algunas realizaciones, 1 µ¾/?t1 del anticuerpo aumenta la expresión de ICAM en un ensayo de regulación ascendente de molécula de superficie celular B de sangre entera, por lo menos 2 veces, o con más preferencia, por lo menos 4 veces. En algunas realizaciones, 1 µg/ml del anticuerpo aumenta la expresión de MHC- P04/057-APf II en un ensayo de regulación ascendente de molécula de superficie celular B de sangre entera, por lo menos 2 veces, o con más preferencia, por lo menos 3 veces. En algunas realizaciones, 1 g/ml del anticuerpo aumenta la expresión de CD23 en un ensayo de regulación ascendente de molécula de superficie celular B de sangre entera, por lo menos 2 veces, o con más preferencia, por lo menos 5 veces. Ver, por ejemplo, Ejemplo VII, Tabla 25. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 aumenta la expresión de moléculas de superficie celular dendrítica, incluyendo, pero no limitándose, a MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 y B7-1. En algunas realizaciones, el rango de regulación ascendente es similar al rango de regulación ascendente observado en células B. Ver, por ejemplo, Tablas 25 y 26, infra. En algunas realizaciones, el anticuerpo con preferencia regula en forma ascendente la expresión de moléculas de superficie celular dendrítica, tales como B7-2 y MHC-II, comparada con la expresión de células B de estas moléculas. Ver, por ejemplo, Tabla 27.
Aumento de la Secreción de Citoquinas Celulares En algunas realizaciones, el anticuerpo aumenta la secreción celular de citoquinas, incluyendo pero no limitándose, a IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-23. En a lgunas realizaciones, e l anticuerpo aumenta la secreción de citoquinas por células dendríticas y monocitos adherentes. En algunas realizaciones, la producción de citoquinas es aumentada adicionalmente por la estimulación conjunta con uno o más de LPS, IFN-? o IL-? ß. En aún otro aspecto de la invención, el anticuerpo con estimulación conjunta de LPS aumenta la producción de IL-12p70 en un ensayo de células dendríticas P04/057-APÍ con una EC50 de aproximadamente 0,48 ^???. En algunas realizaciones, el anticuerpo aumenta la producción de IL-12p40 en células dendrí ticas con una EC50 de aproximadamente 0,21 µg/ml (ver, por ejemplo, Ejemplo VIII). En algunas realizaciones, el anticuerpo aumenta la secreción de IFN-gamma por células T en un ensayo de células T/dendríticas alogénico, como se describe en el Ejemplo VIII. En algunas realizaciones, el anticuerpo aumenta la secreción de IFN-gamma en un ensayo de células T/dendríticas alogénico con una EC50 de aproximadamente 0,3 µg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aumenta la secreción de IFN-gamma en un ensayo de células T/dendríticas alogénico con una EC50 de aproximadamente 0,2 µg/ml. En una realización, el anticuerpo aumenta la secreción de IFN-gamma en un ensayo de células T/dendríticas alogénico con una EC50 de aproximadamente 0,03 µ§ ??.
Métodos de Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares Productoras de Anticuerpos Inmunización En a lgunas r ealizaciones, l os anticuerpos humanos son producidos mediante la inmunización de un animal no humano que comprende en su genoma algunos o todos los lugares de cadena pesada y de cadena liviana de inmunoglobulina humana, con un antígeno CD40. En una realización preferida, el animal no humano es un animal XenoMouse™ Los ratones XenoMouse™ son cepas de ratones diseñados que comprenden grandes fragmentos de lugares de cadena pesada y de cadena liviana de inmunoglobulina humana, y tienen una deficiencia en la producción de anticuerpos de ratón. Ver, por P04/057-APf ejemplo, Green y otros, Nature Genetics 7: 13-21 (1994) y Patentes de los Estados Unidos 5.916.771 , 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001 , 6.1 14.598, 6.130.364, 6.162.963 y 6.150.584. Ver, además, WO 91/10741 , WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031 , WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la elaboración de anticuerpos anti-CD40 a partir de animales no humanos, no ratones, mediante la inmunización de animales transgénicos no humanos que comprenden lugares de inmunoglobulina humana, con un antígeno CD40. Dichos animales se pueden producir usando los métodos que se describen en los documentos citados más arriba. Los métodos que se describen en estos documentos pueden modificarse como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En realizaciones preferidas, los animales no humanos son ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. Los ratones XenoMouseI M producen un repertorio humano del tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y generan anticuerpos humanos específicos de antígeno. En algunas realizaciones, los ratones XenoMouse™ contienen aproximadamente 80 % del repertorio de genes V de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de cromosomas artificiales de levadura (en inglés, YAC) de configuración de línea germinal, de tamaño de megabase, de los lugares de cadena pesada humana y de los lugares de cadena liviana kappa. Ver Méndez y otros, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998) y WO 98/24893, cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia.
P04/057-APÍ En algunas realizaciones, los animales no humanos que comprenden genes de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilugar" de inmunoglobulina humana. En el enfoque de minilugar, un lugar Ig exógeno es imitado mediante la inclusión de genes individuales del lugar Ig. Así, se forma una construcción de uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, un dominio constante mu y un segundo dominio constante (con preferencia, un dominio constante gamma), para inserción en un animal. Este enfoque se describe, inter alia, en las Patentes de los Estados Unidos No. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y 5.643.763, incorporadas a la presente como referencia. Una ventaja del enfoque de minilugar es la rapidez con la cual las construcciones que i ncluyen p orciones d el l ugar Ig p ueden s er generadas e introducidas en animales. Sin embargo, una potencial desventaja del enfoque de minilugar es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulina para sostener el desarrollo de células B completo, de manera que pueda haber menos producción de anticuerpos. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la elaboración de anticuerpos anti-CD40 humanizados. En algunas realizaciones, los animales no humanos son inmunizados con un antígeno CD40 como se describe a continuación, bajo condiciones que permiten la producción de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos son aisladas de los animales, fusionadas con mielomas para producir hibridomas, y los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y livianas de un anticuerpo anti-CD40 de interés son aislados. Estos ácidos nucleicos posteriormente son diseñados usando técnicas conocidas para aquéllos expertos en el arte, y como se P04/057-APÍ describe adicionalmente a continuación, para reducir la cantidad de secuencia no humana, es decir, para humanizar el anticuerpo para reducir la respuesta inmune en humanos. En algunas realizaciones, el antígeno CD40 es CD40 aislado y/o purificado. En una realización preferida, el antígeno CD40 es CD40 humano. En algunas realizaciones, el antígeno CD40 es un fragmento de CD40. En algunas realizaciones, el fragmento de CD40 e s e l d ominio e tracelular d e C D40. E n a lgunas realizaciones, el fragmento de CD40 comprende por lo menos un epítope de CD40. En otras realizaciones, el antígeno CD40 es una célula que expresa o sobreexpresa CD40 o un fragmento inmunogénico del mismo sobre su superficie. En algunas realizaciones, el antígeno CD40 es una proteína de fusión CD40. La inmunización de los animales puede ser por cualquier método conocido en el arte. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Los métodos para la inmunización de animales no humanos, tales c omo r atones, ratas, o vejas, c abras, c erdos, vacas y caballos, son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra, y Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una realización preferida, el antígeno CD40 se administra con un adyuvante, para estimular la respuesta inmune. Los adyuvantes ejemplares incluyen adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo), o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la rápida dispersión, secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped a secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Con preferencia, si se administra un polipéptido, P04/057-APÍ el esquema de inmunización involucrará dos o más administraciones del polipéptido, repartidas durante varias semanas. El Ejemplo 1 describe la producción de anticuerpos monoclonales anti-CD40.
Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares Productoras de Anticuerpos Después de la inmunización de un animal con un antígeno CD40, se pueden obtener d el animal los anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos. En algunas realizaciones, el suero que contiene anticuerpo anti-CD40 se obtiene del animal mediante el sangrado o sacrificio del animal. El suero se puede usar como es obtenido del animal, se puede obtener una fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-CD40 pueden purificarse del suero. Es bien sabido por una persona experta en el arte el hecho que el suero o las inmunoglobulinas obtenidas de esta manera serán policlonales. La desventaja de la utilización de anticuerpos policlonales preparados a partir de suero es que la cantidad de anticuerpos que se puede obtener es limitada, y el anticuerpo policlonal tiene una gama de propiedades heterogénea. En algunas realizaciones, las líneas celulares inmortalizadas productoras de anticuerpos se preparan a partir de células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización, él animal es sacrificado y se inmortaliza el nodo linfático y/o células B esplénicas. Los métodos de inmortalización de células incluyen, pero no se limitan, a la transferencia de las mismas con oncogenes, infección de las mismas con el virus oncogénico, cultivo de las mismas bajo condiciones que seleccionan células inmortalizadas, s ometimiento d e 1 as m ismas a compuestos carcinogénicos o mutantes, fusión de las mismas con una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula de mieloma, P04/057-APÍ e inactivación de un gen supresor de tumor. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. Si se usa la fusión con células de mieloma, las células de mieloma con preferencia no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretora). Las células inmortalizadas son rastreadas usando CD40, una porción del mismo, o una célula que expresa CD40. En una realización preferida, el rastreo inicial se efectúa usando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo. Un ejemplo de rastreo ELISA se proporciona en WO 00/37504, incorporada a la presente como referencia. Se seleccionan las células productoras de anticuerpos anti-CD40, p or ejemplo, hibridomas, se clonan y se rastrean adicionalmente para determinar características deseables, incluyendo crecimiento robusto, alta producción de anticuerpos y características deseables de los anticuerpos, como se discute adicionalmente más adelante. Los hibridomas pueden expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos (nude), o en cultivo celular in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos para aquéllos expertos en el arte. En una realización preferida, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B esplénicas se fusionan a una línea de células de mieloma de la misma especie que el animal no humano. En una realización más preferida, el animal inmunizado es u n a nimal X ENOMOUSE™, y l a línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretor. En una realización aún más preferida, la línea de células de mieloma es P3-X63-AG8.653. Ver, por ejemplo, Ejemplo I.
P04/057-APÍ En otro aspecto, la invención proporciona hibridomas que producen un anticuerpo anti-CD40 humano. En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describe anteriormente. En otras realizaciones, los hibridomas son producidos en una especie no humana, no ratón, tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realización, los hibridomas son hibridomas humanos.
Acidos Nucleicos. Vectores. Células Huéspedes y Métodos Recombinantes de Elaboración de Anticuerpos Acidos Nucleicos La presente invención además abarca moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CD40. En algunas realizaciones, diferentes moléculas de ácido nucleico codifican una cadena pesada y una cadena liviana de una inmunoglobulina anti-CD40. En otras realizaciones, la misma molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y una cadena liviana de una inmunoglobulina anti-CD40. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena liviana comprende una secuencia génica VA: humana A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5), o A27 (DPK-22), o una secuencia derivada de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Vk A3/A19 y un gen 3k\ , Jk2, o Jk3, ó secuencias derivadas de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Wk L5 y un gen Jk4. En algunas realizaciones, la P04/057-APÍ molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de un gen \k A27 y un gen Jk3. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana codifica una secuencia de aminoácidos que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 mutaciones de la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una s ecuencia d e n ucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de VL que comprende 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácidos no conservadoras y/o 1, 2 ó 3 sustituciones no conservadoras comparadas con la secuencia de línea germinal. Las sustituciones pueden estar en las regiones de COR, en las regiones de marco o en el dominio constante. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena liviana (VL) codifica una secuencia de aminoácidos de VL que comprende una o más mutaciones comparadas con la secuencia de línea germinal, que son idénticas a las mutaciones que se encuentran en elVLdeunodelos anticuerpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 y 24.2.1. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica por lo menos tres mutaciones de aminoácidos comparadas con la secuencia de línea germinal que se encuentra en el VL de uno de los anticuerpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 y 24.2.1. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo monoclonal 3.1.1 (SEC ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEC ID NO: 94), P04/057-APf 7.1.2 (SEC ID NO: 12), 10.8.3 (SEC ID NO: 20), 15.1.1 (SEC ID NO: 28), 21.2.1 (SEC ID NO: 36), 21.4.1 (SEC ID NO: 44), 22.1.1 (SEC ID NO: 52), 23.5.1 (SEC ID NO: 60), 23.28.1 (SEC ID NO: 68), 23.28.1L-C92A (SEC ID NO: 100), 23.29.1 (SEC ID NO: 76), ó 24.2.1 (SEC ID NO: 84),o una porción de las mismas. En algunas realizaciones, d icha p orción c omprende p or lo menos la región de CDR3. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de las CDR de cadena liviana de dicho anticuerpo. En algunas realizaciones, dicha porción es una porción contigua que comprende CDR1-CDR3. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ó 100, ó dicha secuencia que carece de la secuencia de señal. En algunas realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3, 1 1 , 19, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75, 83, 93 ó 99, ó una porción de las mismas; dichas secuencias opcionalmente carecen de la secuencia de señal. En algunas realizaciones, dicha porción codifica una región VL- En algunas realizaciones, dicha porción codifica por lo menos la región de CDR2. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de las CDR de cadena liviana de dicho anticuerpo. En algunas realizaciones, dicha porción codifica una región contigua de CDR1 -CDR3. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de VL que es por lo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de VL de cualquiera de los P04/057-APÍ anticuerpos 3.1.1, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1L-C92A, 23.29.1 ó 24.2.1 , ó a una secuencia de aminoácidos de VL de cualquiera de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ó 100. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones altamente severas, tales como aquéllas que se describen anteriormente, a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ó 102, ó que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 3, 1 1 , 19, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75, 83, 93 ó 99. En otra realización, el ácido nucleico codifica una cadena liviana de longitud completa seleccionada entre 3.1.1 , 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1L-R174K ó 24.2.1 , ó una cadena liviana q ue c omprende la secuencia d e aminoácidos d e SEC ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 ó 102, ó una cadena liviana que comprende una mutación, tal como una que se describe en la presente. Además, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 7, 15, 23, 31 , 39, 47, 55, 63, 71 , 79 u 87, ó una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena liviana que comprende una mutación, tal como una que se describe en la presente. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico codifica el dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia génica VH humana 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 ó 3-30.3, ó una secuencia derivada de las mismas. En varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende un gen VH 3-30+ humano, un gen D4 (DIR3) y un gen JH6 humano; un gen VH 3-30+ humano, un gen DI -26 humano P04/057-APf (DIR5) y un gen JH6 humano; un gen VH 4.35 humano, un gen DIR3 humano y un gen JH6 humano; un gen VH 4-59 humano, un gen D4-23 humano y un gen JH4 humano; un gen VH 1 -02 humano, un gen DLR1 humano y un gen JH4 humano; un gen VH 3-30+ humano, un gen D6-19 (DIR3) humano y un gen JH4 humano; un gen VH 3-30+ humano, un gen Dl -1 humano y un gen JH6 humano; un gen VH 3-30+ humano, un gen D4-17 humano y un gen JH6 humano; un gen VH 3-30+ humano, un gen D4-17 humano y un gen JH6 humano; un gen VH 4-59 humano, un gen D4-17 humano (DIR1) y un gen JH5 humano, o secuencia derivada de los genes humanos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 mutaciones, comparada con la secuencia de aminoácidos de línea germinal de los genes humanos V, D o J. En algunas realizaciones, dichas mutaciones se encuentran en la región VH. En algunas realizaciones dichas mutaciones se encuentran en las regiones de CDR. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una o más mutaciones de aminoácidos comparada con la secuencia de línea germinal, que son idénticas a las mutaciones de aminoácidos que se encuentran en el VH de los anticuerpos monoclonales 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1, 21.2.1 , 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.29.1 ó 24.2.1. En otras realizaciones, el ácido nucleico c odifica p or 1 o menos tres mutaciones de aminoácidos, comparado con las secuencia de línea germinal, que s on idénticas a por lo menos tres mutaciones de aminoácidos que se encuentran en uno de los anticuerpos monoclonales que se citan anteriormente.
P04/057-APf En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo 3.1.1 (SEC ID NO: 2), 3.1.1H-A78T (SEC ID NO: 90),3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEC ID NO: 92), 7.1.2 (SEC ID NO: 10), 10.8.3 (SEC ID NO: 18), 15.1.1 (SEC ID NO: 26),21.2.1 (SEC ID NO: 34), 21.4.1 (SEC ID NO: 42), 22.1.1 (SEC ID NO: 50), 22.1.1H-C109A (SEC ID NO: 96), 23.5.1 (SEC ID NO: 58), 23.28.1 (SEC ID NO: 66), 23.28.1H-D16E (SEC ID NO: 98), 23.29.1 (SEC ID NO: 74) ó 24.2.1 (SEC ID NO: 82),o dicha secuencia tiene mutaciones de aminoácidos conservadoras y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoáciodos no conservadoras. En varias realizaciones, la secuencia codifica una o más regiones de CDR, con preferencia, una región de CDR3, las tres regiones de CDR, una porción contigua que incluye CDR1-CDR3, ó la región VH entera, con o sin una secuencia de señal. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó dicha secuencia que carece de la secuencia de señal. En algunas realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende por lo menos una porción de la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 , 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91 , 95 ó 97, ó dicha secuencia que carece de la secuencia de señal. En algunas realizaciones, dicha porción codifica la región de VH (con o sin una secuencia de señal), una región de CDR3, todas las regiones de CDR, o una región contigua que incluye CDR1-CDR3.
PQ4/057-APÍ En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de VH que es por lo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ó 99 % idéntica a las secuencias de aminoácidos de VH que se muestran en las Figuras 1A-1 C ó 2A-2C, o a la secuencia de aminoácidos de VH de cualquiera de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98. Las molécula de ácido nucleico de la invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones altamente severas, tales como las que se describen anteriormente, a una s ecuencia d e ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 , 9, 17, 25, 33, 41 , 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91, 95 ó 97. La molécula de ácido nucleico de la invención incluye molécula de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones altamente severas, tales como las que se describen anteriormente, a una secuencia de ácido nucleico que codifica un VH descrito inmediatamente arriba. En otra realización, el ácido nucleico codifica una cadena pesada de longitud completa de un anticuerpo seleccionado entre 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1, ó una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 u 86, ó una cadena pesada que comprende una mutación, tal como una de las mutaciones que se discute en la presente. Además, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 5, 13, 21 , 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 u 89, ó una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende una mutación, tal como una de las mutaciones que se discuten anteriormente.
P04/057-APÍ Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o la liviana entera de un anticuerpo anti-CD40 o porciones de la misma se pueden aislar de cualquier fuente que produzca dicho anticuerpo. En varias realizaciones, las moléculas de ácido nucleico son aisladas de una célula B aislada de un animal inmunizado con CD40, ó de una célula inmortalizada derivada de dicha célula B que expresa un anticuerpo anti-CD40. Los métodos de aislación de AR m que codifica un anticuerpo son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros. El ARNm se puede usar para producir A DNc p ara e 1 u so e n 1 a r eacción en e adena d e 1 a p olimerasa ( PCR) o en la clonación de ADNc de genes de anticuerpos. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es aislada de un hibridoma que tiene como uno de sus compañeros de fusión, una célula productora de inmunoglobulina humana de un animal transgénico no humano. En aún una realización más preferida, la célula productora de inmunoglobulina humana es aislada de un animal XenoMouse™. En otra realización, la célula productora de inmunoglobulina humana es de un animal transgénico no humano, no ratón, como se describe anteriormente. En otra realización, el ácido nucleico es aislado de un animal no humano, no transgénico. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de un animal no humano, no transgénico se pueden usar, por ejemplo, para anticuerpos humanizados. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH de la invención unido en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena pesada de cualquier fuente. Asimismo, una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena liviana de un anticuerpo anti-CD40 de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos ?04/057·-??? que codifica un dominio VL de la invención unido en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena liviana de cualquier fuente. En otro aspecto de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio variable de las cadenas pesada (VH) y liviana (VL) son "convertidas" en genes de anticuerpos de longitud completa. En una realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH O VL son convertidas en genes de anticuerpos de longitud completa mediante la inserción en un vector de expresión que ya codifica dominios constante de cadena pesada o constante de cadena liviana, respectivamente, de manera que el segmento VH está funcionalmente ligado al o a los segmentos CH dentro del vector, y el segmento VL está funcionalmente ligado al segmento CL dentro del vector. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL son convertidas en genes de anticuerpos de longitud completa mediante la ligación, por ejemplo, ligando una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o VL a una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio CH y/o CL, usando técnicas estándares de biología molecular. Las secuencias de ácido nucleico de los genes de dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada y liviana humanas son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, abat, y otros, Sequences of Proteins of Immunolosical Interest. 5ta. ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o liviana de longitud completa entonces pueden ser expresadas desde una célula dentro de la cual han s ido introducidas, y el anticuerpo anti-CD40 puede asilarse. Las moléculas de ácido nucleico se pueden usar para expresar de manera recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-CD40. Las moléculas de ácido P04/057-APÍ nucleico también se pueden usar para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadena simple, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe más adelante. Si las moléculas de ácido nucleico derivan de un animal no humano, no transgénico, las moléculas de ácido nucleico se pueden usar para la humanización de anticuerpos, también como se describe más adelante. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención se usa como una sonda o cebador de PCR para una secuencia de anticuerpo específica. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede usar como una sonda en métodos de diagnóstico, o c omo cebador de PCR para amplificar regiones de ADN que se podrían usar, inter alia, para aislar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican dominios variables de anticuerpos anti-CD40. E n a lgunas r ealizaciones, l as m oléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos son de regiones altamente variables de las cadenas pesada y liviana del anticuerpo de interés. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos codifican toda o parte de una o más de las CDR del anticuerpo 3.1.1 , 3.1.1 H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 o 24.2.1.
Vectores La invención proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 de la invención, o una porción de enlace de antígeno del mismo. La invención además proporciona P04/057-APÍ vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena liviana de dichos anticuerpos o porción de enlace de antígeno de los mismos. La invención también proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos a nti-CD40, o porciones d e enlace d e antígeno de la invención se expresan mediante la inserción de ADN que codifica cadenas pesadas y livianas de longitud parcial o total, obtenido como se describe anteriormente, en vectores de expresión, de manera que los genes se ligan funcionalmente a secuencias de control de expresión necesarias tales como secuencias de control de transcripción y de traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus de plantas tales como virus mosaico del coliflor, virus mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. El gen de anticuerpo es ligado en un vector de manera que las secuencias de control de transcripción y de traducción dentro del vector cumplen su función propuesta de regulación de la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena liviana del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, ligación de sitios de restricción P04/057-APÍ complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligación despuntada si no hay sitios de restricción presentes). Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados de manera que cualquier secuencia VH o VL pueda ser insertada con facilidad y expresada, como se describe anteriormente. En dichos vectores, habitualmente se produce el empalme entre el sitio donante de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede al dominio C humano, y también en las regiones de empalme que se producen dentro de los exones CH humanos. La terminación de transcripción y poliadenilación se producen en sitios cromosómicos naturales corriente debajo de las regiones codificadoras. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector, de manera que el péptido de señal sea ligado en marco al término amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina). Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. Aquéllos expertos en el arte apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huéspedes de mamíferos incluyen elementos P04/057-APÍ virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o mej oradores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor de CMV/mej orador), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor de SV40/mejorador), adenovirus (por ejemplo, promotor posterior principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamíferos fuertes tales como promotores de actina e inmunoglobulina natural. Para mayor descripción de elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.168.062, Patente de los Estados Unidos No. 4.510.245 y Patente de los Estados Unidos No. 4.968.615. Los métodos para la expresión de anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de promotores y vectores, como así también transformación de plantas, son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6.517.529, incorporada a la presente como referencia. Los métodos de expresión de polipéptidos en células bacterianas o en células fúngales, por ejemplo, en células de levaduras, también son bien conocidos en el arte. Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huéspedes (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células huéspedes en las cuales el vector ha sido introducido (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos No. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a drogas, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped dentro de la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores P04/057-APf de selección preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en células huéspedes dhfr con selección de metotrexato/amplifícación), el gen neo (para selección de G418) y el gen de glutamato sintetasa.
Células Huéspedes no Hibridoma y Métodos de Producción Recombinante de Proteina Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CD40 y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden usar para la transfección de una célula huésped adecuada de mamífero, planta, bacteriana o de levadura. La transformación puede ser por cualquier método conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula huésped. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son bien conocidos en el arte, e incluyen transfección intermediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección intermediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los p olinulceótidos en l iposomas y m icroinyección d irecta del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamíferos por vectores virales. Los métodos de transformación de células son bien conocidos e n el arte. Ver, p or ejemplo, Patentes d e l os E stados U nidos N o. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455 (cuyas patentes se incorporan a la presente como referencia). Los métodos de transformación de células de plantas son bien conocidos en el arte, incluyendo, por ejemplo, transformación intermediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los métodos de transformación de células bacterianas y de levaduras también son bien conocidos en el arte.
P04/057-APf Las líneas de células de mamíferos disponibles como huéspedes para expresión son bien conocidas en el arte, e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivos de Tipo Norteamericano (ATCC). Estas incluye, inter alia, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, SP2, células HeLa, células de riñon de hámster cría (BHK), células de riñon de mono (COS), células hepatocelulares humanas (por ejemplo, Hep G2), células A549 y una cantidad de otras líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que se pueden usar son líneas de células de insectos tales como células Sf9. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células huéspedes de mamíferos, los anticuerpos son producidos cultivando las células huéspedes durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huéspedes, o con más preferencia, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual crecen las células huéspedes. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína estándares. Las células huéspedes de plantas incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentejas de agua, maíz, trigo, papa, etc. Las células huéspedes bacterianas incluyen especies de E. coli y Streptomyces. Las células huéspedes bacterianas incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) a partir de líneas de células de producción puede aumentarse usando una cantidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de genes de glutamina sintetasa (el sistema G S) e s u n e nfoque c omún p ara a umentar 1 a e xpresión P04/057-APf bajo ciertas condiciones. El sistema GS se discute en su totalidad o en parte en relación con las Patentes Europeas No. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997,y la Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4. Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas de células o en animales transgénicos tendrán diferente glicosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico que se proporcionan en la presente, o que comprenden las secuencias de aminoácidos que se proporcionan en la presente, son parte de la presente invención, sin consideración de la glicosilación de los anticuerpos.
Plantas y Animales Transgénicos Los anticuerpos anti-CD40 de la invención también se pueden producir de manera transgénica a través de la generación de un mamífero o planta que sea transgénico para las secuencias de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina de interés, y producción del anticuerpo en una forma recuperable de los mismos. Con relación a la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos anti-CD40 se pueden producir en la leche de cabras, vacas u otros mamíferos, y recuperar de la misma. Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos No. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. En algunas realizaciones, los animales transgénicos no humanos que comprenden lugares de inmunoglobulina humana son inmunizados con CD40 o con una porción inmunogénica del mismo, como se describe anteriormente. Los métodos para la elaboración de anticuerpos en plantas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 6.046.037 y US 5.959.177.
P04/057-APÍ En algunas realizaciones, las plantas o animales no h umanos transgénicos s on producidos mediante la introducción en el animal o planta, de una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-CD40 de la invención, por técnicas transgénicas estándares, ver Hogan y Patentes de los Estados Unidos 6.417.429, supra. Las células transgénicas utilizadas para la elaboración del animal transgénico pueden ser células somáticas o células troncales embriónicas. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser quiméricos, heterocigotos no quiméricos y homocigotos no quiméricos. Ver, por ejemplo, Hogan y otros, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2da. Ed. Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson y otros, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handboo Academic Press (1999). En algunas realizaciones, los animales no humanos transgénicos tienen una interrupción apuntada y reemplazo por una construcción de targetting que codifica una cadena pesada y/o una cadena liviana de interés. En una realización preferida, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas que se ligan de manera específica a CD40, con preferencia, a CD40 humano. En algunas realizaciones, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo m odificado, t al como un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-CD40 se pueden producir en cualquier animal transgénico. En una realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. El animal transgénico no humano expresa P04/057-APÍ dichos polipéptidos codificados en la sangre, en la leche, la orina, la saliva, las lágrimas, el moco y en otros fluidos corporales.
Genotecas de Exhibición de Fagos La invención proporciona un método para la producción de un anticuerpo anti- CD40 o porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende las etapas de sintetizar una genoteca de anticuerpos humanos en fagos, rastrear la genoteca con CD40 o con una porción de mismo, aislar fagos que se ligan a CD40 y obtener el anticuerpo del fago. A modo de ejemplo, un método para la preparación de la genoteca de anticuerpos para el uso en las técnicas de exhibición de fagos comprende las etapas de inmunizar un animal no humano que comprende lugares de inmunoglobulina humana, con CD40 o con una porción antigénica del mismo para crear una respuesta inmune, extraer células productoras de anticuerpos del animal inmunizado; aislar ARN de las células extraídas, transcribir de manera inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando un cebador e insertar el ADNc en un vector de exhibición de fagos, de manera que los anticuerpos son expresados en el fago. Los anticuerpos anti-CD40 recombinantes de la invención se pueden obtener de esta manera. Los anticuerpos h umanos anti-CD40 r ecombinantes de la invención se p ueden aislar mediante el rastreo de una genoteca de anticuerpos de combinación recombinantes. Con preferencia, la genoteca es una genoteca de exhibición de fagos scFv, generada usando ADNc de VL y H humano preparado a partir de ARNm aislado de c élulas B . Las m etodologías p ara 1 a p reparación y rastreo de dichas genotecas son conocidas en el arte. Existen equipos que se encuentran comercialmente disponibles para P04/057-APÍ la generación de genotecas de exhibición de fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody Sistem, catálogo no. 27-9400-01 ; y el equipo de exhibición de fagos Stratagene SurfZAP™, catálogo no. 240612). Además existen métodos y reactivos que se pueden usar en la generación y rastreo de genotecas de exhibición de anticuerpos (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.223.409; Publicaciones PCT NO. WO 92/18619, WO 91/17271 , WO 92/20791 , WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs y otros, Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991 ); Hay y otros, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992);Huse y otros, Science 246: 1275-1281 (1989); McCafferty y otros, Nature 348: 552-554 (1990); Griffíths y otros, EMBO J. 12: 725-734 (1993); Hawkins y otros, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson y otros, Nature 352: 624-628 (1991 ); Gram y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad y otros, Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom y otros, Nucí. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991); y Barbas y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991). En una realización, para aislar un anticuerpo anti-CD40 humano con las características deseadas, primero se usa un anticuerpo anti-CD40 humano como se describe en la presente, para seleccionar secuencias de cadena pesada y liviana humanas que tienen actividad de enlace similar hacia CD40, usando los métodos de impresión de epítope que se describen en la Publicación PCT No. WO 93/06213. Las genotecas de anticuerpos en este método son con preferencia genotecas scFv preparadas y rastreadas como se describe en la Publicación PCT No. WO 92/01047, McCafferty y otros, Nature 348: 552-554 (1990); y Griffíths y otros, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Las genotecas de anticuerpos scFv con preferencia se rastrean usando CD40 humano como el antígeno.
P04/057-A Una vez que se seleccionan los dominios VL y VH humanos iniciales, se efectúan experimentos de "mezcla y unión", en los cuales diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados son rastreados para determinación de enlace de CD40 a combinaciones de pares V L VH preferidos selectos. Adicionalmente, para perfeccionar aún más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del o de los pares VI/VH preferidos se pueden mutar de manera aleatoria, con preferencia, dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de afinidad in vitro se puede efectuar mediante la amplificación de los dominios VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la CDR3 d e VH o CDR3 de VL, respectivamente, cuyos cebadores han sido "espigados" con una mezcla aleatoria de l as c uatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones, de manera que los productos de PCR resultantes codifican segmentos de VH y VL dentro de los cuales se han introducido mutaciones de azar en las regiones CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos VH y VL mutados aleatoriamente se pueden rastrear nuevamente para determinación de enlace a CD40. Después del rastreo y de la aislación de un anticuerpo anti-CD40 de la invención, de una genoteca de exhibición de inmunoglobulina recombinante, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del paquete de exhibición (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión por técnicas estándares de ADN recombinantes. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente para crear otras formas de anticuerpos de la invención, como se describe a continuación. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado P04/057-APÍ por rastreo de una genoteca de combinación, el ADN que codifica el anticuerpo es clonado en un vector de expresión recombinante e introducido en una célula huésped de mamífero, como se describe anteriormente.
Cambio de Clase Otro aspecto de la invención proporciona un método para la conversión de la clase o subclase de un anticuerpo anti-CD40 en otra clase o subclase. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un VL O VH que no incluye secuencia de ácido nucleico alguna q ue c odifíca C L o C H, e s a islada u sando m étodos bien conocidos en el arte. La molécula de ácido nucleico luego es funcionalmente ligada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CL O CH de una clase o subclase de inmunoglobulina deseada. Esto se puede lograr usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL O CH, como se describe anteriormente. Por ejemplo, se puede cambiar la clase de un anticuerpo anti-CD40 que originalmente era IgM, a un IgG. Además, el cambio de clase se puede usar para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgGl a IgG2. Otro método para la producción de un anticuerpo de la invención que comprende un isotipo deseado comprende las etapas de aislar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 y un ácido nucleico que codifica una cadena liviana de un anticuerpo anti-CD40, aislar la secuencia que codifica la región V», ligar la secuencia VH a una secuencia que codifica un dominio constante de cadena pesada del isotipo deseado, expresar el gen de cadena liviana y la construcción de cadena pesada en una célula, y recolectar el anticuerpo anti-CD40 con el isotipo deseado.
P04/057-APÍ Anticuerpos Des inmunizados Otra manera de producir anticuerpos con reducida inmunogenicidad es la desinmunización de anticuerpos. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo se puede desinmunizar usando técnicas que se describen, por ejemplo, en las Publicaciones PCT No. WO 98/52976 y WO 00/34317 (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad).
Anticuerpos Mutados En otra realización, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y células huéspedes s e p ueden usar p ara l a producción d e anticuerpos anti-CD40 mutados. Los anticuerpos se pueden mutar en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o livianas, por ejemplo, para alterar una propiedad de enlace del anticuerpo. Por ejemplo, se p uede h acer u na m utación e n u na o m ás d e 1 as r egiones C DR., p ara incrementar o disminuir la KD del anticuerpo para CD40, para incrementar o disminuir la <Üs. o para alterar la especificidad de enlace del anticuerpo. Las técnicas para la mutagénesis dirigida a sitio son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros y Ausubel y otros, supra. En una realización preferida, las mutaciones se hacen en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado, comparado con la línea germinal, en un dominio variable de un anticuerpo anti-CD40. En otra realización, se hacen una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado, comparado con la línea germinal, en una región de CDR o región de marco de un dominio variable, o en un dominio constante de un anticuerpo monoclonal 3.1.1 , 3.1.1 H-A78T, 3.1.1 H- P04/057-APf A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C 109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1L-R174K y 24.2.1. E n otra realización, s e h acen u na o m ás mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado, comparado con la línea germinal, en una región de CDR o región de marco de un dominio variable de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ó 98, ó cuya secuencia de ácido nucleico se presenta en SEC ID NO: 3, 1 1 , 19, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101 , 1 , 9, 17, 25, 33, 41 , 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91 , 95 ó 97. En una realización, la región de marco está mutada de manera que la o las regiones de marco resultantes tengan la secuencia de aminoácidos del correspondiente gen de línea germinal. Se puede hacer una mutación en una región de marco o dominio constante para incrementar la vida media del anticuerpo anti-CD40. Ver, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 00/09560, incorporada a la presente como referencia. Además se puede hacer una mutación en una región de marco o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para enlace covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como fijación de complemento, enlace de FcR y ADCC. De acuerdo con la invención, un anticuerpo individual puede tener mutaciones en cualquiera de una o más de las regiones de marco, el dominio constante y en las regiones variables. En algunas realizaciones, hay desde 1 a 18, incluyendo cualquier número en el medio, mutaciones de aminoácidos ya sea en el dominio VH o VL del anticuerpo anti-CD40 mutado, comparado con el anticuerpo anti-CD40 antes de la mutación. En P04/057-APf cualquiera de los casos anteriores, las mutaciones se pueden producir en una o más regiones CDR. Además, cualquiera de las mutaciones puede ser una sustitución de aminoácido conservadora. En algunas realizaciones, no hay más de 5, 4, 3, 2 ó 1 cambio de aminoácidos en los dominios constantes.
Anticuerpos Modificados En o tra r ealización, s e p uede h acer un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo anti-CD40 de la invención ligado a otro polipéptido. En una realización preferida, sólo los dominios variables del anticuerpo anti-CD40 se ligan al polipéptido. En otra realización preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-CD40 es ligado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-CD40 es ligado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de manera tal que el dominio VH y el dominio VL pueden interactuar entre si, para formar un sitio de enlace de anticuerpo. En otra realización preferida, el dominio VH se separa del dominio Vi, mediante un conector, de manera tal que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí (ver a continuación, debajo de "Anticuerpos de Cadena Simple"). Luego se liga el anticuerpo VH-conector-VL al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresa CD40. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que puede ser fácilmente visualizada, tal como peroxidasa de rábano rusticano. Además, se pueden hacer reaccionar anticuerpos de fusión, en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena simple se ligan entre sí. Esto resulta útil si se quiere crear P04/057-APÍ un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptido simple, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífíco. Para crear un anticuerpo de cadena simple (scFv), los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se ligan funcionalmente a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera tal que las secuencias de VH y VL se puedan expresar como una proteína de cadena simple contigua, con los dominios VL y VH unidos p or e 1 c onector flexible. V er, p or ejemplo, Bird y otros, Science, 242: 423.426 (1988); Huston y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 ( 1988); McCafferty y o tros, N ature 348: 5 52-554 (1990). El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si solamente se usa un solo VH y VL, bivalente, si se usan dos V» y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y Vi.. Se pueden generar anticuerpos polivalentes o biespecíficos que se ligan de manera específica a CD40 y a otra molécula. En otras realizaciones, se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpo anti-CD40. Por ejemplo, se pueden preparar "cuerpos appa" (III y otros, Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin y otros, EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Janus) (Traunecker y otros, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker y otros, Int. J. Cáncer (Supl.) 7: 51 -52 (1992)), usando técnicas de biología molecular estándares, siguiendo las descripciones de la memoria descriptiva. Los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de enlace de antígeno se pueden producir por una variedad de métodos, incluyendo fusión de hibridomas o ligación de P04/057-AR fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny y otros, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Además, los anticuerpos biespecíficos se pueden formar como "diacuerpos" o "Janusinas" (Janus). En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecifíco se liga a dos epítopes diferentes de CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecifíco tiene una primera cadena pesada y una primera cadena liviana del anticuerpo monoclonal 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1, 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1, 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K y 24.2.1, y una cadena pesada y cadena liviana de anticuerpo adicional. En algunas realizaciones, la cadena pesada y la cadena liviana adicionales también son de uno de los anticuerpos monoclonales identificados anteriormente, pero son diferentes de la primera cadena pesada y liviana. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados que se describen anteriormente se preparan usando uno o más de los dominios variables o regiones CDR de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano proporcionado en la presente, de una secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo monoclonal, o de una cadena pesada o cadena liviana codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo monoclonal.
Anticuerpos Derivados y Rotulados Un anticuerpo anti-CD40 o porción de enlace de antígeno de la invención puede ser derivado o ligado a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o porción de los mismos son derivados de manera tal que el enlace de P04/057-APf CD40 no sea afectado en forma adversa por la derivación o rotulación. En consecuencia, los anticuerpos y porciones de anticuerpos de la invención tienen la intención de incluir tanto las formas intactas como las modificadas de los anticuerpos anti-CD40 humanos que se describen en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede s er f uncionalmente l igado ( por acoplamiento químico, fusión g énica, asociación no covalente o de otra manera) a una o más otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede hacer de intermediario en la asociación del anticuerpo o porción del anticuerpo c on o tra m olécula ( tal c orno u na r egión d e n úcleo d e e streptavidina o u na etiqueta de polihistidina). Un tipo de anticuerpo derivado se produce mediante el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los entrecruzadores adecuados incluyen aquéllos que son heterobifuncionales, q ue t ienen dos grupos distintivamente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster), u homobifuncionales (por ejemplo, disuccinimidil suberato). Dichos conectores se encuentran disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III. Otro tipo de anticuerpo derivado es un anticuerpo rotulado. Los agentes de detección útiles con los cuales se puede derivar un anticuerpo o porción de enlace de antígeno de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-l -naftalenosulfonilo, ficoeritrina, lantanoides fosforescentes y similares. Un anticuerpo también se puede P04/057-APÍ rotular con enzimas que son útiles para detección, tales como peroxidasa de rábano rusticano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando el anticuerpo es rotulado con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano rusticano, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo también se puede rotular con biotina, y detectar a través de la medición indirecta de enlace de estreptavidina o avidina. Un anticuerpo también se puede rotular con un epítope de polipéptido predeterminado reconocido por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de zippers de leucina (ver definición anterior), sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace metálico, etiquetas de epítopes). En algunas realizaciones, los rótulos se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes, para reducir potencial impedimento estérico. Un anticuerpo anti-CD40 también puede ser rotulado con un aminoácido radiorrotulado. El radiorrotulo se puede usar tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. Por ejemplo, el radiorrotulo se puede usar para detectar tumores que expresan CD40 por rayos x u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiorrotulo se puede usar de manera terapéutica como una toxina para células cancerosas o tumores. Ejemplos de rótulos para polipéptidos incluyen, pero no se limitan, a los siguientes radioisótopos o radionúclidos -- 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, " ??, 125I, 131 I. Un anticuerpo anti-CD40 también puede ser derivado con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos P04/057-APf grupos son útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para incrementar la vida media de suero o para incrementar el enlace de tejido.
Composiciones Farmacéuticas y Equipos La invención además se relaciona con composiciones que comprenden un anticuerpo agonista anti-CD40 humano para el tratamiento de individuos que necesitan la inmunoestimulación. Dichas composiciones son útiles para tratar, prevenir, reducir la frecuencia o gravedad de infección, incluyendo infección viral y bacteriana, para tratar un trastorno hiperproliferativo, incluyendo condiciones cancerosas y precancerosas, para tratar condiciones de inmunodeficiencia genética, tal como síndrome de hiper-lgM y para tratar condiciones de inmunodeficiencia primaria o combinada, incluyendo condiciones caracterizadas por neutropenia, en un mamífero, incluyendo seres humanos. Los individuos para tratamiento con terapia de anticuerpo anti-CD40 agonista incluyen cualquier individuo que necesita un aumento de la inmunidad, incluyendo, pero no limitándose, a los ancianos e individuos que tienen supresión de la inmunidad, por ejemplo, debido a la quimioterapia. Los trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar con un anticuerpo anti-CD40 agonista de la invención pueden involucrar cualquier tejido u órgano, e incluyen, pero no se limitan, a cánceres del c erebro, p ulmón, c élula e scamosa, v ejiga, gástrico, pancreático, mama, cabeza, cuello, hígado, renal, oválico, ovario, próstata, colorrectal, esofágico, ginecológico, nasofaringe o tiroides, melanomas, linfomas, leucemias o mielomas múltiples. En particular, los anticuerpos anti-CD40 agonistas humanos de la invención son útiles para tratar carcinomas de la mama, próstata, colon y pulmón.
P04/057-APÍ El tratamiento puede involucrar la administración de uno o más anticuerpos monoclonales anti-CD40 agonistas de la invención, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, solos o con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y de demora de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente a ceptables s on a gua, solución salina, salina con buffer de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, como así también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio, en la composición. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares, t ales como agentes humectantes o emulsionantes, preservantes o buffers, que mejoran la vida útil o la eficacia del anticuerpo. Los anticuerpos anti-CD40 agonistas de la invención y las composiciones que los comprenden se pueden administrar en combinación con uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen otros agentes a ntineoplásticos, antitumorales, antiangiogénicos o quimioterapéuticos. Dichos agentes adicionales se pueden incluir en la misma composición o se pueden administrar en forma separada. En algunas realizaciones, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-CD40 agonistas de la invención como una vacuna o como adyuvantes para una vacuna.
Las composiciones de esta invención pueden encontrarse en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como P04/057-APÍ soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo propuesto de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas son en forma de soluciones inyectables o para infusión, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de humanos. El modo preferido de administración es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección o infusión intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de droga. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el anticuerpo anti-CD40 en la cantidad requerida, en un solvente apropiado con uno o con una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como fuera requerido, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones s e preparan i ncorporando e l c ompuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y s ecado p or c ongelamiento, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por P04/057-APf ejemplo, mediante la utilización de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede producirse mediante la inclusión en la composición, de un agente que demore la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en el arte, si bien para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo preferido de administración es la subcutánea, intramuscular o infusión intravenosa. Como será apreciado por los expertos en el arte, la ruta y/o modo de administración variará según los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo de las composiciones de anticuerpos se puede preparar con un portador que protegerá el anticuerpo contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulado. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones se encuentran patentados o son generalmente conocidos para los expertos en el arte. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled R elease D rué D elivery Systems ( J. R . Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD40 de la invención se puede administrar en forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también puede encerrarse en P04/057-APf una cápsula de gelatina de caparazón duro o blando, se puede comprimir para formar tabletas, o incorporar directamente en la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, los anticuerpos anti-CD40 se pueden incorporar con excipientes y usar en forma de tabletas, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares, todas ingeribles. Para suministrar un compuesto de la invención por otra vía de administración diferente de la parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o administrar en forma conjunta el compuesto, con un material para prevenir su inactivación. Se pueden incorporar además compuestos activos adicionales en las composiciones. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-CD40 de la invención se formula en forma conjunta con y/o se administra en forma conjunta con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se ligan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se ligan a uno o más factores de crecimiento o citoquinas o a sus receptores de superficie celular, tales como anticuerpo anti-CTL4), agentes antineoplásticos, agentes antitumorales, agentes quimioterapéuticos, análogos peptídicos que activan CD40, CD40L soluble, uno o más agentes químicos que activan CD40 y/u otros agentes conocidos en el arte que mejoran una respuesta inmune contra células tumorales, por ejemplo, IFN-ß? , IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-? y GM-CSF. Dichas terapias de combinación pueden requerir dosificaciones menores del anticuerpo anti-CD40, como así también de los agentes administrados en forma conjunta, evitando así posibles toxicidades o c omplicaciones asociadas con las varias monoterapias.
P04/057-APf Los anticuerpos anti-CD40 agonistas de la invención y composiciones que 1 os comprenden también se pueden administrar en combinación con otros regímenes terapéuticos, en particular, en combinación con tratamiento de radiación. Las composiciones de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de enlace de antígeno de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y con la capacidad del anticuerpo o de la porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad en la cual cualquier efecto tóxico o nocivo del anticuerpo o de la porción del anticuerpo sea superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a q ue s e u sa u na dosis profiláctica en individuos antes o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior que la cantidad terapéuticamente eficaz. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar l a respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo simple, se pueden administrar varias dosis divididas con el transcurso del tiempo, o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada, P04/057-APf como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los individuos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, junto con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención es dictada por, y depende directamente de (a) las características de carácter único del anticuerpo anti-CD40 o porción, y del efecto terapéutico o profiláctico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en el arte de la composición de dicho anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Un rango ejemplar, no limitativo, para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,025 a 50 mg/kg, con más preferencia, 0, 1 a 50 mg kg, con más preferencia, 0,1-25, 0,1 a 10 ó 0, 1 a 3 mg/kg. Se observa que los valores de la dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la condición a ser aliviada. Además debe entenderse que para cualquier individuo particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse con el transcurso del tiempo, de acuerdo con la necesidad individual y con el juicio profesional de la persona que administra o supervisa el suministro de las composiciones, y que los rangos de dosificación que se exponen en la presente son sólo ejemplares, y no tienen la intención de limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.
P04/057-APÍ Otro aspecto de la presente invención proporciona equipos que comprenden un anticuerpo anti-CD40 o porción de anticuerpo de la invención, o una composición que comprende dicho anticuerpo. Un equipo puede incluir, además del anticuerpo o composición, agentes de diagnóstico o terapéuticos. El equipo además puede incluir instrucciones para el uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una realización preferida, el equipo i ncluye e l a nticuerpo o una composición que lo comprende, y un agente de diagnóstico que se puede usar en un método que se describe a continuación. En otra realización preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende, y uno o más agentes terapéuticos que se pueden usar en un método que se describe a continuación. Esta invención también se relaciona con composiciones para la inhibición del crecimiento anormal d e c élulas e n un m amífero, q ue c omprenden u na c antidad d e un anticuerpo de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en donde las cantidades del compuesto, sal, solvato o profármaco y del agente quimioterapéutico son en su conjunto eficaces para la inhibición del crecimiento anormal de células. Actualmente se conocen muchos agentes quimioterapéuticos en el arte. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es seleccionado entre el grupo que consiste en inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo, antiandrógenos, y agentes antiangiogénicos.
P04/057-APÍ Los agentes antiangiogénicos, tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II) se pueden usar en conjunto con un anticuerpo anti-CD40 de la invención. Ejemplos de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREX1 M (alecoxib), valdecoxib y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de matriz útiles se describen en la WO 96/33172 (publicada el 24 de octubre de 1996), WO 96/27583 (publicada el 7 de marzo de 1996), Solicitud de Patente Europea No. 97304971.1 (presentada el 8 de julio de 1997), Solicitud de Patente Europea No. 99308617.2 (presentada el 29 de octubre de 1999), WO 98/07697 (publicada el 26 de febrero de 1998), WO 98/03516 (publicada el 29 de enero de 1998), WO 98/34918 (publicada el 13 de agosto de 1998), WO 98/34915 (publicada el 13 de agosto de 1998), WO 98/33768 (publicada el 6 de agosto de 1998), WO 98/30566 (publicada el 16 de julio de 1998), Publicación de Patente Europea 606.046 (publicada el 13 de julio de 1994), Publicación de Patente Europea 931.788 (publicada el 28 de julio de 1999), WO 90/05719 (publicada el 31 de mayo de 1990), WO 99/52910 (publicada el 21 de octubre de 1999), WO 99/52889 (publicada el 21 de octubre de 1999), WO 99/29667 (publicada el 17 de junio de 1999), Solicitud Internacional PCT No. PCT/IB98/01 1 13 (presentada el 21 de julio de 1998), Solicitud de Patente Europea No. 99302232.1 (presentada el 25 de marzo de 1999), Solicitud de Patente de Gran Bretaña número 9912961.1 (presentada el 3 de junio de 1999), Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No. 60/148.464 (presentada el 1 2 de a gosto d e 1 999), P atente d e l os Estados Unidos 5.863.949 (publicada el 26 de enero de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.861.510 (publicada el 19 de enero de 1999) y Publicación de Patente Europea P04/057-APf 780.386 (publicada el 25 de enero de 1997), todas las cuales se incorporan a la presente en su totalidad como referencia. Los inhibidores de MMP preferidos son aquéllos que no demuestran artralgia. Son más preferidos aquéllos que inhiben de manera selectiva MMP-2 y/o MMP-9 en relación a las otras metaloproteinasas de matriz (es decir, MMP-1 , MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-1 1 , MMP-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 y los compuestos que se citan en la siguiente lista: ácido 3-[[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonil-(l-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonilamino-8-oxa-biciclo[3.2.1octano-3-carboxílico, hidroxiamida; ácido (2R, 3R) l-[4-(2-cloro-4-fluo-benciloxi)-bencenosulfonil-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico, hidroxiamida; ácido 4-[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonilarnino-tetrahidro-piran-4-carboxílico, hidroxiamida; ácido 3-[[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonil-( 1 -hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino-propiónico; ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino-tetrahidro-piran-4-carboxílico, hidroxiamida; ácido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino-tetrahidro-piran-3-carboxílico, hidroxiamida; ácido (2R, 3R) 1 -[4-(4-fluo-2-metil-benciloxi)-bencenosulfonil-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico, hidroxiamida; ácido 3-[[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonil-(l -hidroxicarbamoil-l-metil-etil)-amino-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonil-(4-hidroxicarbamoil-tetrahiaro-piran-4-il)-amino-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino-8-oxa-biciclo[3.2.1octano-3-carboxílico, hidroxiamida; ácido 3-endo-3-[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonilamino-8- P04/057-APf oxa-biciclo[3.2.1octano-3-carboxílico, hidroxiamida; y ácido (R) 3-[4-(4-fluo-fenoxi)-bencenosulfonilamino-tetrahidro-furan-3-carboxílico, hidroxiamida; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. Un compuesto de la invención también se puede usar con inhibidores de transducción de señal, tales como agentes que pueden inhibir las respuestas de EGR-R (receptor de factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos de EGR-R, anticuerpos de EGF y moléculas que son inhibidores de EGF-R; inhibidores de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores de VEGF y moléculas que pueden inhibir VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se ligan al receptor de erbB2, por ejemplo, HERCEPTINTM (Genentech, Inc.). Los inhibidores de EGF-R se describen, por ejemplo, en WO 95/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), WO 98/14451 (publicada el 9 de abril de 1 98), WO 98/02434 (publicada el 22 de enero de 1998) y Patente de los Estados Unidos 5.747.498 (publicada el 5 de mayo de 1998), y dichas sustancias se pueden usar en la presente invención como se describe en la presente. Los agentes inhibidores de EGFR incluyen, pero no se limitan, a los anticuerpos monoclonales C225 y 22Mab anti-EGFR (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck gaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. y Merck KgaA) y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD-1839 (As raZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI- 1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183.805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387.785 (Wyeth-Ayerst), BBR-161 1 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina P04/057-APÍ A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusión de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cáncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cáncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cáncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y Vacuna EGF-R (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Estos y otros agentes inhibidores de EGF-R se pueden usar en la presente invención. Los inhibidores de VEGF, por ejemplo, SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) y NX-1838 (NeXstar) también se pueden combinar con el compuesto de la presente invención. Los inhibidores de VEGF se describen, por ejemplo, en WO 99/24440 (publicada el 20 de mayo de 1999), Solicitud Internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), en WO 95/21613 (publicada el 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicada el 2 de diciembre de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.834.504 (publicada el 10 de noviembre de 1998), WO 98/50356 (publicada el 12 de noviembre de 1998), Patente de los Estados Unidos 5.883.113 (publicada el 16 de marzo de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.886.020 (publicada el 23 de marzo de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.792.783 (publicada el 1 1 de agosto de 1998), WO 99/10349 (publicada el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicada e l 12 d e s eptiembre de 1 997), W O 97/22596 ( publicada e l 26 d e j unio d e 1997), WO 98/54093 (publicada el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 99/16755 (publicada el 8 de abril de 1999) y WO 98/02437 (publicada el 22 de enero de 1998), todas las cuales se incorporan a la presente en su P04/057-APf totalidad como referencia. Otros ejemplos de algunos inhibidores de VEGF específicos útiles en la presente invención son IM862 (Cytran Inc.); anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme and Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF se pueden usar en la presente invención, como se describe en la presente. Los inhibidores del receptor de ErbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome pie) y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-1 (Chiron) se pueden combinar adicionalmente con el compuesto de la invención, por ejemplo, aquéllos indicados en WO 98/02434 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicada el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), Patente de los Estados Unidos 5.587.458 (publicada el 24 de diciembre de 1996) y Patente de los Estados Unidos 5.877.305 (publicada el 2 de marzo de 1999), todas las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Los inhibidores del receptor de ErbB2 útiles en la presente invención también se describen en la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No. 60/1 17.341 , presentada el 27 de enero de 1999, y en la Solicitud Provisoria de los Estados Unidos No. 60/1 17.346, presentada el 27 de enero de 1999, ambas incorporadas a la presente en su totalidad como referencia. Los compuestos inhibidores del receptor erbB2 y sustancias que se describen en las solicitudes PCT, patentes de los Estados Unidos y solicitudes provisorias de los Estados Unidos mencionadas anteriormente, como así también otros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2, se pueden usar con el compuesto de la presente invención de acuerdo con la presente invención.
P04/057-APÍ Los agentes a ntisupervivencia i ncluyen anticuerpos anti-IGF-IR y agentes a nti-integrina, tales como anticuerpos anti-integrina.
Métodos de Uso de Diagnóstico En otro aspecto, la invención proporciona métodos de diagnóstico. Los anticuerpos anti-CD40 se pueden usar para detectar CD40 en una muestra biológica in vitro o in vivo. En una realización, la invención proporciona un método para el diagnóstico de la presencia o ubicación de un tumor que expresa CD40 en un individuo que lo necesita, que comprende las etapas de inyectar el anticuerpo en el individuo, determinar la expresión de CD40 en el individuo mediante la ubicación de dónde se ha ligado el anticuerpo, la comparación de la expresión en el individuo con la de un individuo de referencia normal o estándar, y el diagnóstico de la presencia o ubicación del tumor. Los anticuerpos anti-CD40 se pueden usar en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitación, u n ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica de t ejido, Western blot o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-CD40 de la invención se pueden usar para detectar CD40 de humanos. En otra realización, los anticuerpos anti-CD40 se pueden usar para detectar CD40 de primates del Viejo Mundo, tales como monos cynomolgus y rhesus, chimpancés y simios. La invención proporciona un método para la detección de CD40 en una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-CD40 de la invención, y detectar el anticuerpo ligado. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 es rotulado directamente con un rótulo detectable. En otra realización, el anticuerpo anti-CD40 (el primer P04/057-APf anticuerpo) no es rotulado, y se rotula un segundo anticuerpo u otra molécula que pueda ligarse al anticuerpo anti-CD40. Como es bien sabido por una persona experta en el arte, se selecciona un segundo anticuerpo que sea capaz de ligarse de manera específica a la especie y clase particulares del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-CD40 es un IgG humano, entonces el anticuerpo secundario podría ser un IgG antihumano. Otras moléculas que pueden ligarse a anticuerpos incluyen, sin limitación, Proteína A y Proteína G, ambas comercialmente disponibles, por ejemplo, de Pierce Chemical Co. Los rótulos adecuados para el anticuerpo o para el anticuerpo secundario se han descrito anteriormente, e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinaesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansil cloruro o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125L mI, 35S o 3H. En otra realización, CD40 puede ensayarse en una muestra biológica por medio de un inmunoensayo de competición, utilizando estándares de CD40 rotulados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-CD40 no rotulado. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares CD40 rotulados y el anticuerpo anti-CD40 se combinan, y se determina la cantidad de estándar CD40 rotulado ligado al anticuerpo no rotulado. La P04/057-APÍ cantidad de CD40 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de estándar CD40 rotulado ligado al anticuerpo anti-CD40. Los inmunoensayos que se describen anteriormente se pueden utilizar para una cantidad de propósitos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD40 se pueden usar para detectar CD40 en células en cultivo celular. En una realización preferida, los anticuerpos anti-CD40 se usan para determinar la cantidad de CD40 sobre la superficie de células que han sido tratadas con varios compuestos. Este método se puede usar para identificar compuestos que son útiles para activar o inhibir CD40. De acuerdo con este método, una muestra de células se trata con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo, mientras que otra muestra se deja sin tratar. Si se debe medir el nivel total de CD40, las células son lisadas y se mide el nivel de CD40 total usando uno de los inmunoensayos que se describen anteriormente. El nivel total de CD40 en las células tratadas contra las no tratadas se compara, para determinar el efecto del compuesto de ensayo. Un inmunoensayo preferido para la medición de los niveles totales de CD40 es un ELISA o Western blot. Si debe medirse el nivel de superficie celular de CD40, las células no son lisadas, y se miden los niveles de superficie celular de CD40 usando uno de los inmunoensayos que se describen anteriormente. Un inmunoensayo preferido para la determinación de los niveles de superficie celular de CD40 incluye las etapas de rotular las proteínas de superficie celular con un rótulo detectable, tal como una biotina o l25I, inmunoprecipitar el CD40 con un anticuerpo anti-CD40, y luego detectar el CD40 rotulado. Otro inmunoensayo preferido para la determinación de la ubicación de CD40, por ejemplo, niveles de superficie celular, es mediante la utilización de inmunohistoquímica. Los métodos tales como ELISA, RIA, Western blot, P04/057-APf inmunohistoquímica, rotulación de superficie celular de proteínas de membrana integral e inmunoprecipitación son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. Además, los inmunoensayos pueden ser ampliados para un rastreo de alto rendimiento, c on el objetivo de ensayar una gran cantidad de compuestos ya sea para determinación de activación o inhibición de CD40. Los anticuerpos anti-CD40 de la invención también se pueden usar para determinar los niveles de CD40 en un tejido o en células derivadas del tejido. En algunas realizaciones, el t ejido e s un tejido enfermo. En algunas realizaciones, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En algunas realizaciones del método, se extrae de un paciente un tejido o una biopsia del mismo. El tejido o biopsia luego se usa en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles totales de CD40, los niveles de superficie c elular d e C D40 ó l a ubicación de CD40, por los métodos que se discuten anteriormente. El método de diagnóstico que se describe anteriormente se puede usar para determinar si un tumor expresa altos niveles de CD40, lo que podría ser indicativo de que el tumor es un objetivo para el tratamiento con anticuerpo anti-CD40. Además, el mismo método también se puede usar para controlar el efecto del tratamiento con anticuerpo anti-CD40 mediante la detección de la muerte celular en el tumor. El método de diagnóstico además se puede usar para determinar si un tejido o una célula expresa niveles insuficientes de CD40 ó CD40 activado, y en consecuencia, es un candidato para el tratamiento con anticuerpos anti-CD40 activadores, CD40L y/u otros agentes terapéuticos para el incremento de los niveles o actividad de CD40.
P04/057-APf Los anticuerpos de la presente invención además se pueden usar in vivo para la identificación de tejidos u órganos que expresan CD40. En algunas r ealizaciones, los anticuerpos a ti-CD40 se usan para la identificación de t umores q ue e xpresan C D40. Una ventaja de la utilización de anticuerpos anti-CD40 humanos de la presente invención es que pueden utilizarse de manera segura in vivo sin producir una respuesta inmune al anticuerpo al ser administrado, a diferencia de los anticuerpos de origen no humano, o con anticuerpos humanizados. El método comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-CD40 rotulado de manera detectable, o una composición que lo comprende, a un paciente que necesita dicho ensayo de diagnóstico, y someter el paciente a análisis de imágenes para determinar la ubicación de los tejidos que expresan CD40. El análisis de imágenes es bien conocido en el arte médico, e incluye, sin limitación, análisis de rayos x, imagen de resonancia magnética (MRI) o tomograíía computada (CE). El anticuerpo puede ser rotulado con cualquier agente adecuado para imagen in vivo, por ejemplo, un agente de contraste tal como bario, que puede usarse para análisis de rayos x, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, que se puede usar para MRI o CE. Otros agentes de rotulación incluyen, sin limitación, radioisótopos, tales como 99Tc. En otra realización, el anticuerpo anti-CD40 no será rotulado, y será visualizado en la imagen mediante la administración de un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que pueda ligarse al anticuerpo anti-CD40. En una realización, se obtiene una biopsia del paciente, para determinar si el tejido de interés expresa CD40.
Métodos de Uso Terapéuticos P04/057-APf En otro aspecto, la invención proporciona métodos terapéuticos de utilización de un anticuerpo anti-CD40 de la invención. Un anticuerpo anti-CD40 agonista humano de la invención se puede administrar a un humano o a un mamífero no humano que expresa un CD40 de reacción cruzada. El anticuerpo se puede administrar a dicho mamífero no humano (es decir, primate, mono cynomolgus o rhesus) para propósitos veterinarios, o como un modelo animal de enfermedad humana. Dichos modelos animales son útiles para la evaluación de la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra a un individuo que sufre de inmunodeficiencias primarias y/o combinadas, incluyendo inmunodeficiencia dependiente de CD40 con síndrome de Hiper-IgM, Inmunodeficiencia Variable Común, Agammaglobulinemia de Bruton, deficiencias de subclase IgG y SCID ligado a X (mutaciones de cadenas gamma comunes). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra para tratar un individuo que padece de inmunosupresion, por ejemplo, debido a la quimioterapia, o que tiene una enfermedad inmunodebilitante, incluyendo cualquier enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, tal como por HIV. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra para aumentar la inmunidad de un individuo anciano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra para tratar un individuo que tiene una infección bacteriana, viral, fungal o parasitaria. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD40 agonista humano de la invención se puede administrar de manera profiláctica a un individuo que, debido a la edad, a la enfermedad o pobre salud general, es susceptible de padecer infecciones, para prevenir o reducir el número o la gravedad de infecciones.
P04/057-APÍ En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra a un individuo que tiene un trastorno hiperproliferativo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra para tratar un individuo que tiene un tumor. En algunas realizaciones, el tumor es CD40 positivo. En algunas realizaciones, el tumor es CD40 negativo. El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no sólido, tal como linfoma. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD40 se administra a un paciente que tiene un tumor que es canceroso. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibe la proliferación celular cancerosa, inhibe o previene un incremento en el peso o en el volumen del tumor y/o causa una disminución en el peso o volumen del tumor. Los pacientes que se pueden tratar con anticuerpos anti-CD40 o porciones de anticuerpo de la invención incluyen, pero no se limitan, a pacientes que han sido diagnosticados con cáncer cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de mama, tumores ginecológicos (por ejemplo, sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cérvix, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer de la tiroides, paratiroides, o glándulas adrenales), sarcomas de los tejidos blandos, leucemia, mieloma, mieloma múltiple, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos de la niñez, enfermedad de Hodgkin, linfomas linfocíticos, linfoma no P04/057-APf Hodgkin, cáncer de la vejiga, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer del riñon o uréter (por ejemplo, carcinoma de célula renal, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasmas del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma del SNC primario, tumores del eje espinal, gliomas del tallo cerebral o adenomas pituitarios), glioma o fibrosarcoma. El anticuerpo se puede administrar desde tres veces por día a una vez cada seis meses, y con preferencia, se puede administrar por medio de una vía oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral, transdérmica o tópica. El anticuerpo también se puede administrar de manera continua por medio de una minibomba. El anticuerpo en general será administrado durante tanto tiempo como esté presente el tumor, siempre y cuando que el anticuerpo haga que el tumor o cáncer detenga su crecimiento, o disminuya el peso o el volumen. La dosificación de anticuerpo en general será en el rango de 0,025 a 50 mg/kg, con más preferencia, 0, 1 a 50 mg/kg, con más preferencia, 0,1-20 mg kg, 0, 1-10 mg/kg, 0, 1 -5 mg/kg o aún con más preferencia, 0 , 1-2 mg/kg. E l anticuerpo a demás s e p uede administrar de manera profiláctica. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra como parte de un régimen terapéutico que incluye una o más drogas o moléculas antineoplásticas adicionales, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor. Ejemplos de agentes antitumorales incluyen, pero no se limitan, a inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteasas de matriz, agentes terapéuticos génicos y P04/057-APf antiandrogenos. En realizaciones más preferidas, el anticuerpo anti-CD40 se administra con u n a gente a ntineoplástico, tal como adriamicina o taxol. En algunas realizaciones preferidas, la terapia anti-CD40 se efectúa junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra con uno o más anticuerpos adicionales. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD40 se puede administrar con anticuerpos que se sabe que inhiben la proliferación de células cancerosas o tumorales. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan, a un anticuerpo que inhibe CTLA4, receptor erbB2, EGF-R, IGF-1 R, CD20 ó VEGF. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 es rotulado con un radiorrótulo, con una inmunotoxina o con una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico. El anticuerpo anti-CD40 o proteína de fusión de anticuerpo anti-CD40 dirige el radiorrótulo, inmunotoxina, toxina o p éptido tóxico al tumor o célula cancerosa. En una realización preferida, el radiorrótulo, inmunotoxina, toxina o péptido tóxico es internalizado por el tumor o célula cancerosa después de que el anticuerpo anti-CD40 se liga al CD40 sobre la superficie de la célula. En otro a specto, el anticuerpo anti-CD40 se puede usar de m añera t erapéutica para inducir l a apoptosis de células específicas e n un paciente. E n m uchos c asos, l as células apuntadas para apoptosis son células tumorales o cancerosas. En consecuencia, la invención proporciona un método de inducción de apoptosis mediante la administración de un anticuerpo anti-CD40 a un paciente que lo necesita. En otro aspecto, la invención proporciona un método d e a dministración de un anticuerpo anti-CD40 activador a un paciente, para incrementar la actividad de CD40. Un anticuerpo anti-CD40 se administra con uno o más otros factores que incrementan la P04/057-APf actividad de CD40. Dichos factores incluyen CD40L y/o análogos de CD40L que activan CD40. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 se administra con uno o más agentes mejoradores de la inmunidad adicionales, incluyendo, sin limitación, IFN-ß?, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-? y GM-CSF. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD40 agonista humano de la invención se usa como un adyuvante para mejorar la eficacia de una vacuna. Cuando se usa de esta manera, el anticuerpo anti-CD40 activa CD40 en células que presentan antígeno, incluyendo células B, células dendríticas y monocitos, como así también mejora la producción de moléculas inmunomoduladoras, tales como citoquinas y quimioquinas. El efecto inmunoestimulante del anticuerpo aumenta la respuesta inmune del individuo vacunado al antígeno de vacuna. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la generación de una vacuna de células dendríticas para el cáncer o para inmunoterapia de células dendríticas. De a cuerdo c on e 1 m étodo, s e c ultivan c élulas d endríticas d e u n p aciente c on c áncer, durante 1-5 días con lisado u homogenado tumoral, las células tumorales se matan por irradiación u otro medio, o antígenos específicos tumorales (por ejemplo, péptidos, idiotipos) y 1 -10 µg ml de un anticuerpo anti-CD40. Las células dendríticas pulsadas-antígeno tumoral se inyectan nuevamente en el paciente para estimular las respuestas inmunes antitumorales, en particular las respuestas CTL antitumorales. Las células dendríticas derivadas de monocitos para el uso en el método se pueden obtener de una muestra de sangre periférica por cultivo en IL-4 y GM-CSF. Las células dendríticas P04/057-APf también pueden derivar de la médula ósea de un paciente, por purificación magnética o clasificación de células CD34 positivas, seguido de cultivo en IL-4 y GM-CSF.
Terapia Génica Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden administrar a un paciente que lo necesita mediante la terapia génica. La terapia puede ser o bien in vivo o ex vivo. En una realización preferida, se administran a un paciente las moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena liviana. En una realización más preferida, se administran las moléculas de ácido nucleico de manera que son integradas de manera estable en los cromosomas de células B, debido a que estas células se especializan en la producción de metabolitos. En una realización preferida, las células B precursoras son transfectadas o infectadas ex vivo y transplantadas nuevamente a un paciente que lo necesita. En otra realización, las células B precursoras u otras células son infectadas in vivo, usando un virus que se sabe que infecta el tipo celular de interés. Los vectores típicos utilizados para la terapia génica incluyen liposomas, plásmidos y vectores virales. Ejemplos de vectores virales son retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Después de la infección ya sea in vivo o ex vivo, se pueden controlar los niveles de la expresión de anticuerpo, tomando una muestra del paciente tratado y usando un inmunoensayo conocido en el arte, o discutido en la presente. En una realización preferida, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción de enlace de antígeno de la misma de un anticuerpo anti-CD40, y expresar P04/057-APf la molécula de ácido nucleico. En otra realización, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena liviana o una porción de enlace de antígeno de la misma de un anticuerpo anti-CD40, y expresar la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, el método de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción de enlace de antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena liviana o la porción de enlace de antígeno de la misma de un anticuerpo anti-CD40 de la invención, y expresar las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia génica además puede comprender la etapa de administrar otro agente anticancerígeno, tal como taxol o adriamicina. Con el objetivo de poder comprender mejor esta invención, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se presentan sólo para los propósitos de ilustración, y no deben interpretarse como un límite al alcance de la invención de manera alguna.
EJEMPLO I Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpo Anti-CD40 Se prepararon anticuerpos de la invención, se seleccionaron y se ensayaron de siguiente manera: Inmunización y generación de hibridomas Inmunizamos XenoMice™ de ocho a diez semanas de edad, en forma intraperitoneal o en sus patas traseras, ya sea con una proteína de fusión CD40-IgG (10 µg/dosis/ratón)) o con células 300.19-CD40, que es una línea celular transfectada que P04/057-APf expresa CD40 humano en su membrana plasmática (10 x 106 células/dosis/ratón). Repetimos esta dosis cinco a siete veces, durante un período de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, proporcionamos a los ratones una inyección final del dominio extracelular de CD40 humano en PBS. Fusionamos los linfocitos de los nodos linfátitos y bazo de ratones inmunizados, con la línea celular P3-X63-Ag8.653 de mieloma no secretor, y sometimos las células fusionadas a selección HAT, como se describe anteriormente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Recuperamos un panel de hibridomas, todos secretores de anticuerpos IgG2x humanos específicos de CD40. Seleccionamos once hibridomas para estudio posterior, y los designamos 3.1.1 , 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1, 23.5.1 , 23.25.1, 23.29.1 y 24.2.1 . Depositamos los hibridomas 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1 .1 y 21.4.1 en la Colección de Cultivos de Tipo Norteamericano (ATCC) de acuerdo con el Tratado de Budapest, 10801 Universidad de Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209, el 6 de agosto de 2001. Depositamos los hibridomas 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.29.1 y 24.2.1. en la ATCC el 16 de julio de 2002. Se asignó a los hibridomas los siguientes números de depósito: Hibridoma Depósito No. 3.1.1 (LN 15848) PTA-3600 7.1.2 (LN 15849) PTA-3601 10.8.3 (LN 15850) PTA-3602 15.1.1 (LN 15851 ) PTA-3603 21.4.1 (LN 15853) PTA-3605 P04/057-APÍ 21.2.1 (LN 15874) PTA-4549 22.1.1 (LN 15875) PTA-4550 23.5.1 (LN 15855) PTA-4548 23.25.1 (LN 15876) PTA-4551 23.28.1 (LN 15877) PTA-4552 23.29.1 (LN 15878) PTA-4553 24.2.1 (LN 15879) PTA-4554 EJEMPLO II Secuencias de Anticuerpos Anti-CD4Q Preparadas de Acuerdo con la Invención Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos de acuerdo con la invención, clonamos ácidos nucleicos que codifican fragmentos d e c adenas p esadas y livianas de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-CD40. La clonación y el secuenciamiento se efectuaron de la siguiente manera. Aislamos ARNm Poly(A)+ de aproximadamente 2 X 105 células de hibridomas derivadas de ratones XenoMouse™ inmunizados con CD40 humano, como se describe en el Ejemplo I, usando un equipo Fast-Track (Invitrogen). Seguimos por PCR la generación de ADNc cebado de manera aleatoria. Usamos cebadores de región variable específicos de la familia humana o VH humano (Marks y otros, "Cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa de genes variables de inmunoglobulina humana, y diseño de sondas de oligonucleótidos específicas de familia", Eur. J. Immunol. 21 : 985-991 (1991 )), o un cebador de Vü humano u niversal, M G-30, C AGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (SEC ID NO: 1 18), P04/057-APf en conjunto con cebadores específicos para la región constante Cj2 humana, MG-40d, 5 ' -GCTGAGGGAGTAG AGTCCTG AGG A-3 ' (SEC ID NO: 1 19), o r egión c onstante CK (? ?2; como se describe previamente en Green y otros, 1994). Obtuvimos moléculas de ácido nucleico que codifican transcripciones de cadena liviana kappa y pesada humanas, de los hibridomas productores de anti-CD40, por secuenciamiento directo de productos d e P CR g enerados a p artir d e A RN p oly(A+), u sando 1 os cebadores q ue s e describen anteriormente. Además clonamos los productos de PCR en pCRII, usando un equipo de clonación TA (Invitrogen) y secuenciamos ambas hebras, usando equipos de secuenciamiento de colorante-terminador Prism y una máquina de secuenciamiento ABI 377. Analizamos todas las secuencias por alineaciones al "directorio de secuencias de V BASE" (Tomlinson y otros, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido), usando programas de sofware McVector y Geneworks. Además, sometimos los anticuerpos monoclonales 3.1.1 , 7.1.2, 10.8.3, 15.1 .1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.28.1 , 23.29.1 y 24.2.1 a clonación de ADN de longitud completa y secuenciamiento. Para dicho secuenciamiento, aislamos ARN de aproximadamente 4 X 106 células de hibridomas usando el equipo de aislación de ARN QIAGEN RNeasy (QIAGEN). Transcribimos de manera inversa el ARNm usando oligo-dT( 18) y el equipo Advantage RT/PCR (Clonetech). Usamos V Base para diseñar cebadores de amplificación delanteros que incluyeron sitios de restricción, secuencia Kozak óptima, el sitio de inicio ATG y parte de la secuencia de señal de la cadena pesada. La Tabla 1 enumera los cebadores de amplificación delanteros utilizados para secuenciar los clones de anticuerpos.
P04/057-APf P04/057-APÍ TABLA 1 P04/057-APÍ 23.29.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3'(SEC ID NO: 132) 24.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAA ACATCTGTGGTTCTTCC-3'(SEC ID NO: 133) Usamos el mismo método para diseñar un cebador para incluir las secuencias codificadoras 3', el codón de detención de la región constante IgG2 (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3') (SEC ID NO: 125) y sitios de restricción. Además usamos el mismo método para diseñar un cebador alrededor del sitio de inicio ATG de la cadena kappa: (5'- CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3') (SEC ID NO. 126). Una secuencia Kozak óptima (CCGCCACC) se agregó 5' al sitio de inicio ATG. Este cebador se usó para clonar por PCR las cadenas livianas de los siguientes clones de anticuerpos: 3.1.1 , 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 y 23.29.1. Usamos un segundo cebador delantero 5'- TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3 ' (SEC ID NO: 134) para clonar las cadenas livianas de los clones 23.28.1 y 24.2.1. Además usamos el mismo método para diseñar un cebador alrededor del codón de detención de la región constante kappa (5'- TTCTTTG ATC AGAATTCTCACTAAC ACTCTCCCCTGTTG AAGC-3 ' ) (SEC ID P04/057-APf NO: 127). Usamos los pares de cebadores para amplificar los ADNc usando el Advantage High Fidelity PCR it (Clonetech). Obtuvimos la secuencia del producto de PCR por secuenciamiento directo, usando técnicas estándares (por ejemplo, recorrido de cebadores) usando equipos de secuenciamiento de colorante-terminador y una máquina de secuenciamiento ABI. Clonamos el producto de PCR en un vector de expresión mamífero y secuenciamos clones para confirmar mutaciones somáticas. Para cada clon, verificamos la secuencia en ambas hebras en por lo menos tres reacciones.
Análisis de Utilización de Genes La Tabla 2 expone la utilización de genes demostrada por clones de hibridomas seleccionados de anticuerpos de acuerdo con la invención: TABLA 2 Utilización de Genes de Cadenas Pesadas y Livianas P04/057-APÍ VIV-4 (DP5) 15.1.1 (4-59) D4-23 JH4 A3/A19 JK2 DP-71 (DP -15) 21.4.1 (1 -02) DLR1 JH4 L5 JK4 DP-75 (DP5) 21.2.1 (3-30+) DIR3+ JH4 A3/A19 JK3 DP-49 D6-19 (DP -15) 22.1.1 (3-30+) Dl -1 JH6 A3/A19 JK1 DP-49 (DPK-15) 23.5.1 (3-30+) D4-17 JH6 A3/A19 J 1 DP-49 (DPK-15) 23.28.1 (4-59) DIR1+ JH5 A27 JK3 DP-71 D4-17 (DPK-22) 23.29.1 (3-30.3) D4-17 JH6 A3/A19 JK1 DP-46 (DPK-15) 24.2.1 (4-59) DIR1+ JH5 A27 JK3 DP-71 D4-17 (DP -22) Análisis de Secuencia y Mutación Como se apreciará, el análisis de utilización de genes proporciona sólo una limitada reseña de la estructura de los anticuerpos. Como las células B en animales XenoMouse™ generan de manera estocástica transcripciones de cadena pesada V-D-J o de cadena liviana kappa V-J, hay una cantidad de procesos secundarios que se producen, P04/057-APÍ incluyendo, sin limitación, hipermutación somática, deleciones, N-adiciones y extensiones de CDR3. Ver, por ejemplo, Méndez y otros, Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Publicación de Patente Internacional WO 98/24893. En consecuencia, para examinar adicionalmente la estructura del anticuerpo, generamos secuencias de aminoácidos pronosticadas de los anticuerpos a partir de los ADNc obtenidos de los clones. La Tabla A proporciona los identificadores de secuencias para cada una de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos pronosticadas de los anticuerpos secuenciados. Las Tablas 3-7 proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos pronosticadas de las cadenas pesadas y livianas kappa de los anticuerpos 3.1.1 (Tabla 3), 7.1.2 (Tabla 4), 10.8.3 (Tabla 5), 15.1.1 (Tabla 6) y 21.4.1 (Tabla 7). Las Tablas 8-13 proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos pronosticadas del dominio variable de la cadena pesada y la cadena liviana kappa de los anticuerpos 2 1.2.1 (Tabla 8), 22.1.1 ( Tabla 9 ), 23.5.1 ( Tabla 1 0), 23.28.1 ( Tabla 1 1), 23.29.1 (Tabla 12) y 24.2.1 (Tabla 13). La secuencia de ADN del secuenciamiento de longitud completa del anticuerpo monoclonal 23.28.1 difiere de las secuencias de ADN obtenidas del secuenciamiento de la región VH del producto de PCR inicial por u n par de bases (C a G), dando como resultado un cambio de residuo 16 de la cadena pesada natural de D a E. Las Tablas 14-19 proporcionan secuencias de nucleótidos y de aminoácidos pronosticadas de la cadena pesada y liviana kappa de los anticuerpos 21.2.1 (Tabla 14), 22.1.1 (Tabla 1 5), 23.5.1 ( Tabla 1 6), 23.28.1 (Tabla 1 7), 23.29.1 (Tabla 1 8) y 24.2.1 P04/057-APf (Tabla 19). En las Tablas, la secuencia de péptido de señal (o las bases que codifican la misma) está subrayada. Generamos dos anticuerpos mutados, 22.1.1 y 23.28.1. La cadena pesada del anticuerpo 22.1.1 fue mutada para cambiar un residuo cisteína en la posición 109 a un residuo alanina. Designamos el clon mutado 22.1.1H-C109A. La cadena liviana del anticuerpo 23.28.1 en la posición 92 fue mutada también para cambiar un residuo cisteína a un residuo alanina. Designamos el clon mutado 23.28.1L-C92A. La mutagénesis de residuos específicos se llevó a cabo mediante el diseño de cebadores y mediante la utilización del QuickChange Site Directed Mutagénesis it, de Stratagene, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mutaciones fueron confirmadas por secuenciamiento automatizado, y las inserciones mutagenizadas fueron subclonadas en vectores de expresión. La Tabla 20 proporciona las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la cadena pesada mutada del anticuerpo 22.1.1H-C109A. La Tabla 21 proporciona las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la cadena liviana mutada del anticuerpo 23.28.1. Los codones de ADN mutados se muestran en letra itálica. El residuo de aminoácido mutado se muestra en negritas.
P04/057-APf Tabla 3 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 3.1.1 P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) GTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACA CCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTC GAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG proteína de RSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA cadena pesada VISKDGGN YHADSVKGRFTISRDNS NALYLQMN SLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC VS NKGLPAPIE TIS T GQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYS LTVD SRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQ SLSLSPGK P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia AND ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA de cadena liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTT TGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCC ACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCT CCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGATTG GAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGC AAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGG GACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVLTOSPLSLPVTPG proteína de EPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQ PGQSPQLLI cadena liviana YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTL ISRLEAEDVG VYYCMQALQTPRTFGQGTKVEI RTVAAPSVFIFPP SDEQL SGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYE H VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Dominio variable CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG maduro de la GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG secuencia ADN CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCAT de cadena pesada GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGT AATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCT GTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATC AGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC TCCTCA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Dominio variable QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH maduro de WVRQAPGKGLEWVAV1SKDGGN YHADSV GRFT secuencia de ISRDNS NALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQL proteína de VLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS cadena pesada Dominio variable GATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC maduro de CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC secuencia de AGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGAT cadena liviana ACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGATTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Dominio variable DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFL maduro de DWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGT secuencia de DFTL ISRLEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGT V proteína de EI cadena liviana ADN de cadena CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG pesada (dominio GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG variable) CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCAT GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG (3.1.1H-A78T) GAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGT SEC ID NO: 89 AATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCT GTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATC AGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC TCCTCA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH cadena pesada WVRQAPGKGLEWVAVIS DGGNKYHADSV GRFT (dominio ISRDNSKN7LYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLV variable) LGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS (3.1.1 H-A78T) SEC ID NO: 90 ADN de cadena CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG pesada (dominio GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG variable) CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCAT GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG (3.1.1H-A78T- GAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGT V88A-V97A) AATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT SEC ID NO: 91 TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCT GTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGcTGAAGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGcGAGAAGAGGGCATC AGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC TCCTCA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH cadena pesada WVRQAPGKGLEWVAVIS DGGNKYHADSVKGRFT ISRDNSKN 7LYLQMNSLR Í EDTA V YYG4 RRGHQLV (dominio LGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS variable) (3.1.1 H- A78T- V88A-V97A) SEC ID NO: 92 ADN de cadena GATATTGTGaTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC liviana (dominio CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC variable) AGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGAT ACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA (3.1.1L-L4M- ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG L83V) CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC SEC ID NO: 93 AGCAGAgTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de DIVA TQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNF cadena liviana LDWYLQ PGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG (dominio TDFTLKISR VE AEDVG VYYCMQ ALQTPRTFGQGTK variable) VEIK (3.1 .1 L-L4M-L83V) SEC ID NO: 94 Tabla 4 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 7.1 .2 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia ADN ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC de cadena pesada TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCAT GCAGACTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAGGAGCACGCTTTATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATAT TACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGG AGCCGTGGGGATTACTACTACTACTACGGTTTGG ACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC CTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACC CAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCA AATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACC P04/057-APf ACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia de EFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG proteína de RSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA cadena pesada VISNDGDNKYHADSVWGRFT1SRDNSRSTLYLQMN SLRAEDTAVYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDV WGQGTTVTVSSAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH PSNTKVD KTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG EYKC VSN GLPAPIE TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM T NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY T TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia ADN ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA de cadena liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTT TGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCC ACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCT CCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTG GAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGC AAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGG GACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP proteína de GEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQL cadena liviana LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTL ISRVEAEDV GVYYCMQALQTPRTFGQGT VEI RTVAAPSVFIFP PSDEQL SGTASVVCLLN FYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYE H VYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC Dominio variable CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG maduro de GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG secuencia ADN CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCAT de cadena pesada GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAGATA ATAAATACCATGCAGACTCCGTGTGGGGCCGATT CACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAGCACGCTT TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACA CGGCTGTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGG GTCTAGTGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTAC TACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGTCTCCTCA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Dominio variable QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH maduro de la WVRQAPGKGLEWVAVISNDGDNKYHADSVWGRF secuencia de TISRDNSRSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGMGS proteína de SGSRGDYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS cadena pesada Dominio variable GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC maduro de la CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC secuencia ADN AGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGAT de cadena liviana ACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Dominio variable DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNF maduro de la LDWYLQ PGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG secuencia de TDFTLK1SRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGT proteína de VEIK cadena liviana Tabla 5 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 10.8.3 DESCRIPCION: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Secuencia ADN ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGC de cadena pesada AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTG CAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGTAGTTACTACTGGATCTGGATCCGGC AGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGC GTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAACCC CTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCT CTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTG TGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATG GACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCT CCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCAC CCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCAC CACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC P04/057-APf CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Secuencia de MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLV PSE proteína de TLSLTCTVSGGSISSYYWIWIRQPAGKGLEWIGRVY cadena pesada TSGSTNYNPSL SRVTMSVDTSKNQFSL LSSVTAA DTAVYYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSSAS T GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS NFGTQTYTCNVDH PSNTKVD TVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEY CKVSN GLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNY TTPPMLDSDGSFFLY SKLTVD SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Secuencia ADN ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGC de cadena liviana TGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCA GATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTG TAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAG TCAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAG CAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTT ATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATT TTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTGACAGTTTC CCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGA TCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCAT CTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG P04/057-APt DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Secuencia de MRLPAOLLGLLLLWFPGSRCDIOMTOSPSSVSASVG proteína de DRVTITCRASQPISSWLAWYQQKPG APKLLIYSAS cadena liviana GLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QTDSFPLTFGGGT VEI RTVAAPSVFIFPPSDEQL SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDS DSTYSLSSTLTLS ADYE H VYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC Dominio variable CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG maduro de la GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA secuencia ADN CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGG de cadena pesada ATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTG GAATGGATTGGGCGTGTCTATACCAGTGGGAGCA CCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCAC CATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCC CTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGG CCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAG GGGGTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGAC CACGGTCACCGTCTCCTCA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Dominio variable QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWIWI maduro de la RQPAG GLEVVIGRVYTSGSTNYNPSLKSRVTMSVD secuencia de TSK QFSL LSSVTAADTAVYYCARDGLYRGYGM proteína de DVWGQGTTVTVSS cadena pesada Dominio variable GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGT maduro de la CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG secuencia ADN TCGGGCGAGTCAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCC de cadena liviana TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAA CTCCTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGG ACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGAC TGACAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACC AAGGTGGAGATCAAA P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada): Dominio variable DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQPISSWLAWY maduro de la QQ PGKAPKLLIYSASGLQSGVPSR SGSGSGTDFT secuencia de LTISSLQPEDFATYYCQQTDSFPLTFGGGT VEI proteína de cadena liviana Tabla 6 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 15.1.1 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Secuencia ADN ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGC de cadena pesada AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTG CAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAAGTTACTACTGGACCTGGATCCGGC AGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGAT ATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCC CTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAC ATGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTT CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTG TGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGGTAATTTTAAC TACTTTCACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA CCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGT CTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCC GAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCC CAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT P04/057-APÍ CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Secuencia de MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSE proteína de TLSLTCTVSGGSIRSYYWTWIRQPPGKGLEWIGYIY cadena pesada YSGSTNYNPSLKSRVTISVDMS NQFSL LSSVTAA DTAVYYCARKGDYGGNFNYFHQWGQGTLVTVSS AST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNT VDKTVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPP P DTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEK TIS TKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Secuencia ADN ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA de cadena liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCCTACATACTAATGGATACAACTAT TTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATG CAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGGCCAGG GGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Secuencia de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP proteína de GEPASISCRSSQSLLHTNGYNYFDWYLQKPGQSPQL cadena liviana LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTL ISRVEAEDV GVYYCMQALQTPYSFGQGT LEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQL SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE H VYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC Dominio variable CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG maduro de la GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA secuencia ADN CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAAGTTACTACTG de cadena pesada GACCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACT GGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGC ACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA CCATATCAGTAGACATGTCCAAGAACCAGTTCTC CCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACG GCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACG GTGGTAATTTTAACTACTTTCACCAGTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Dominio variable QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSYYWTW maduro de la IRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVD secuencia de MSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGDYGGNFN proteína de YFHQWGQGTLVTVSS cadena pesada Dominio variable GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC maduro de la CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC secuencia ADN AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATACTAATGGAT de cadena liviana ACAACTATTTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTT TGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) : Dominio variable DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNY maduro de la FDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG secuencia de TDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYSFGQGT proteína de LEIK cadena liviana Tabla 7 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 21.4.1 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia ADN ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGG de cadena pesada CAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCT GGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGG GGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGA TACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGG GATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCACAAACTA TGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACC AGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGC TGAACAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTA TTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGT ACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTGACTACTGGG GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCC TGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTAC ACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGT CGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCA P04/057-APÍ GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia de MDWTWRILFLVAAATGAHSOVOLVOSGAEV KPG proteína de ASVKVSC ASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWM cadena pesada GWINPDSGGTNYAQ FQGRVTMTRDTSISTAYMEL NRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWG QGTLVTVSSAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH PSNT VDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP DTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEY CKVS NKGLPAPIE TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYS LTVD SRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQ SLSLSPGK P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia ADN ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGC de cadena liviana TGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCA GATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTG TAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAG TCAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCCTGGTATCAG CAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCT ATACTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATC AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATT TTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACATTTTC CCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGA TCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCAT CTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Secuencia de M LPAOLLGLLLLWFPGSRCDIOMTOSPSSVSASVG proteína de DRVTITCRASQGIYSWLAWYQQ PGKAPNLLIYTA cadena liviana STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANIFPLTFGGGT VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Dominio variable CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA maduro de la AGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAA secuencia ADN GGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATG de cadena pesada CACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG AGTGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGG CACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTC ACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCT ACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCTGACGACA CGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCT AGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTG ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCA P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Dominio variable QVQLVQSGAEV KPGASV VSCKASGYTFTGYYM maduro de la HWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQ FQGR secuencia de VTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPL proteína de GYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS cadena pesada Dominio variable GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGT maduro de la CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG secuencia ADN TCGGGCGAGTCAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCC de cadena liviana TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAC CTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTACAAAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGG ACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAAC CTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGC TAACATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACC AAGGTGGAGATCAAA Dominio variable DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWY maduro de la QQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT secuencia de LTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK proteína de cadena liviana P04/057-APf Tabla 8 Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 21.2.1 P04/057-APÍ DESCRIPCION: SECUENCIA: ADN de cadena GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC liviana CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGAT ACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTTC GGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC Proteína de DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNY cadena liviana LDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG TDFTL ISRVEAEDVGVYYCMQVLQTPFTFGPGT VDIK Tabla 9 Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 22.1.1 DESCRIPCION: SECUENCIA: P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: ADN de cadena CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG pesada GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGCTATGGCAT GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTA ATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATT CACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACA CGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGG AAAGACTTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTC TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG Proteína de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMH cadena pesada WVRQAPGKGLEWVAVISSDGGNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRGTG T YYHYCGMDVWGQGTTVTVSS P04/057-APf DESCRIPCION: SECUENCIA: ADN de cadena GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC liviana CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGAT ATAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGTTCAGGCACTGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC Proteína de DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNY cadena liviana LDWYLQ PGQSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIK Tabla 10 Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 23.5.1 DESCRIPCION: SECUENCIA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: ADN de cadena CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG pesada GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG TAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCAT GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTA ATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATT CACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGAC ACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACT ACGGGAGGGATTACTACTCCTACTACGGTTTGGA CGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCAG Proteína de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSNYGMH cadena pesada WVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTI SRDNS NTLYVQ NSLRAEDTAVYYCARRGHYGR DYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: ADN de cadena GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC liviana CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGAT ACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC Proteína de DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLPGNGYNY cadena liviana LDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG TDFTLK1SRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIK Tabla 1 1 P04/057-APÍ Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 23.28.1 P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: ADN de cadena GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGT liviana CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTA GCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCA CTGTCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCA AAGTGGATATCAAAC Proteína de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSDLAWH cadena liviana QQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGT VDIK P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: ADN de cadena CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG pesada (dominio GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA variable) CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTG GAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACT (23.28.1H-D16E) GGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGC (SEQ ID NO: 97) ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA CCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC CCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACACG GCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCT ACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG Proteína de QVQLQESGPGLVKPS TLSLTCTVSGGSIRGYYWS cadena pesada WIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISV (dominio DTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDY variable) GWFAPWGQGTLVTVSS (23.28.1 H-D16E) (SEC ID NO: 98) P04/057-APf Tabla 12 Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 23.29.1 P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA: Proteína de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMH cadena pesada WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSN YYADSV GRFT IYRDNSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYG NNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS ADN de cadena GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC liviana CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGAT ACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC Proteína de DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLPGNGYNY cadena liviana LDWYLQ PGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG TDFTLKJSRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIK Tabla 13 Secuencias de ADN y de proteínas de los dominios variables maduros del anticuerpo 24.2.1 P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA ADN de cadena CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG pesada GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTG GAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACT GGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGC ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA CCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC CCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACG GCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCT ACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG Proteína de QVQLQESGPGLV PSETLSLTCTVSGGSIRGYYWS cadena pesada WIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNY PSL SRVTISV DTSKNQFSL LSSVTAADTAVYYCARRGGLYGDY GWFAPWGQGTLVTVSS P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA ADN de cadena GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGT liviana CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTA GCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCA GTATAGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACC AAAGTGGATATCAAAC Proteína de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWY cadena liviana QQ PGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGT VDI Tabla 14 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 21.2.1 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC pesada TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAAATACTAT GCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT AAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTAT TACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTG GTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCAC CGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC TTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCG AGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTG AGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCC AGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTC P04/057-APÍ TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG cadena pesada RSLRLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAPG GLEWVA VMSYDGSSKYYANSV GRFTISRDNSKNTLYLQINS LRAEDTAVYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVS SAST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT PREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNG EY C VSN GLPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ S LSLSPG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA pesada TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGATACAACTAT TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATG CAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGG GACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCA GTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGC TGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG TTAG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDiVMTOSPLSLPVTP cadena liviana GEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQ PGQSPQL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCMQVLQTPFTFGPGTKVDI RTVAAPSVFIFP PSDEQL SGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC P04/057-APÍ Tabla 15 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 22.1.1 DESCRIPCION: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC pesada TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTAT TACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACT ACCACTACTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGG GACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGC AACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACC P04/057-APf GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG cadena liviana RSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVA VISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT VDKTVERK CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPRE f EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIE TIS TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQ SLSLSPG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTAT TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTT CAGGCACTGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATG CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCYTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-AP1 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGD1VMTOSPLSLPVTP cadena liviana GEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQ PGQSPHL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCMQALQTPRTFGQGT VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE H VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC P04/O57-APÍ Tabla 16 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 23.5.1 DESCRIPCION: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC pesada TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGC CAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA ATTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATG CAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAATTCCAAGAACACGCTGTATGTGCAAATG AACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATT ACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAGGGATTA CTACTCCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAA GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTC CAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCT GCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGA GTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA P04/057-APf CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG cadena pesada RSLRLSCVASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVA IISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVQMNS LRAEDTAVYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPP PKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA T PRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKT GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK PCM/O57-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTAT TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATG CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTSTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCYTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAA P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP cadena liviana GEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCMQALQTPRTFGQGT VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTAXVVCLLNNFYPREAKVQW VDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC P04/057-APf Tabla 17 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 23.28.1 DESCRIPCION: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGC pesada AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTG CAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGC AGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGT ATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCC CTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACT CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTG TGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGG CTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCC GAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCC CAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT P04/057-APf CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSE cadena pesada TLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIY YSGSTNY PSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAA DTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT PREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK P04/057-AP! DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCT liviana ACTCTGGCTCCCAGAATCCACCGGAGAAATTGTG TTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT CAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACC AGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCAT CTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGA TTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCT TATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATAT CAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTAT CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de N ETPAOLLFLLLLWLPESTGEIVLTOSPGTLSLSPGE cadena liviana RATLSCRASQSVSSSDLAWHQQKPGQAPRLLIYGA SSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QHCRSLFTFGPGT VDI RTVAAPSVFIFPPSDEQL SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC Tabla 18 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 23.29.1 DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC pesada TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACA GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTAT TACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATT ACTACTCCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCA AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCT CCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCG AGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGG ,, ? i rilli ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPG cadena pesada RSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSV GRFTIYRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQ GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP DTLMISRTPE VTCVYVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT PR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC VSNK GLPAPIEKTIS TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPM LDSDGSFFLYS LTVD SRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPG P04/057-fiPf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTAT TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATG CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTT CAGTGGAGGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP cadena liviana GEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GIYYCMQALQTPRTFGQGT VEI RTVAAPSVFIFP PSDEQL SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWRVDNA LQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE H KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA liviana TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC (23.29.1LR174 ) CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG (SEC ID NO: 101) TCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTAT TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATG CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTT CAGTGGA^GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GTTAG P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP cadena liviana GEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTL 1SRVEAEDV (23.29.1LR174K) GIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP (SEC ID NO: 101) PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWATVDNA LQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC Nótese que sabemos que con este cambio, " 101" es el SEC I D NO. para el ADN de cadena liviana y las secuencias de la proteína de cadena liviana para el anticuerpo 23.29.1L-R174K. Sin embargo, este fue el número presentado en la solicitud PCT. Después de su ingreso a la fase nacional, corregiremos el error que no advertimos a tiempo.
P04/057-APÍ Tabla 19 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 24.2.1 DESCRIPCION: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGC pesada AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTG CAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGC AGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGT ATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCC CTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTT CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTG TGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGG CTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCC GAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCC TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCC CAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT P04/057-APf CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSE cadena pesada TLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIY YSGSTNYNPSL SRVTISVDTSKNQFSL LSSVTAA DTAVYYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNT VD TVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA TKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEY CKVSNKGLPAPIEK TISKT GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ S LSLSPGK P04/057-APÍ DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) ADN de cadena ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCT liviana ACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTG TTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT CAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACC AGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCAT CTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGA TTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGCT TATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATAT CAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTAT CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG P04/057-APf DESCRIPCIÓN: SECUENCIA (secuencia de señal subrayada) Proteína de METPAOLLFLLLLWLPDTTGEIVLTOSPGTLSLSPGE cadena liviana RATLSCRASQSVSSTYLAWYQQ PGQAPRLLIYGA SSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYSSLFTFGPGT VDI RTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVT SFNRGEC P04/057-APf Tabla 20 Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 22.1.1H-C109A Tabla 21 P04/057-APÍ Secuencias de ADN y de proteínas del anticuerpo 23.28.1L-C92A EJEMPLO III Análisis de Sustituciones de Aminoácidos de Cadena Pesada y Liviana Las Figuras 1 D-1H y 2D-2H proporcionan alineaciones de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada pronosticadas de los P04/057-APf anticuerpos monoclonales 3.1.1 , 7 .1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 2 1.4.1, 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1 H-C109A, 23.5.1 , 23.28.1 , 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1 y las secuencias de aminoácidos de línea germinal de sus respectivos genes. La mayoría de las regiones CDR3 de cadena pesada contienen inserciones de aminoácidos. El gen DLR1 utilizado en el dominio VH del anticuerpo 21.4.1 codifica para dos residuos cisteína (Cys). El análisis de espectrometría de masa y modelo de homología demostraron que los dos residuos Cys son ligados por disulfuro, y que este enlace de disulfuro no interrumpe la estructura del anticuerpo. Las Figuras 1A-1C y 2A-2C proporcionan alineaciones de secuencias entre las secuencias de aminoácidos variables de cadena liviana pronosticadas de clones de anticuerpos monoclonales 3.1 .1 , 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.28.1 , 23.28.1L-C92A, 23.29.1 y 24.2.1 y las secuencias de aminoácidos de línea germinal de sus respectivos genes. Las cadenas livianas de estos anticuerpos derivan de tres genes V* diferentes. Siete de los once anticuerpos utilizan el gen A3/A19 Vi, seis de los cuales tienen dos mutaciones en la región CDR1. Además, cinco de los siete anticuerpos que utilizan el gen A3/A19 V* también utilizan el gen J^l ; en todos estos anticuerpos, el primer aminoácido derivado del gen Jkl es cambiado de manera consistente de un W a un R. Se apreciará que muchas de las inserciones o sustituciones de aminoácidos identificadas anteriormente existen en estrecha proximidad a una CDR, o dentro de la misma. Parecería que dichas sustituciones tuvieran algún efecto sobre el enlace del anticuerpo a la molécula CD40. Además, dichas sustituciones podrían tener un efecto significativo sobre la afinidad de los anticuerpos.
P04/057-APÍ EJEMPLO IV Reactividad Cruzada de Especies, de los Anticuerpos de la Invención Efectuamos análisis FACS para determinar el enlace y la afinidad de los anticuerpos de la invención para CD40 de varias especies, en particular, ciertos monos europeos. Incubamos alícuotas de sangre entera humana y de mono durante 1 hora sobre hielo, con concentraciones en incremento de anticuerpos anti-CD40 de la invención ejemplificados en la presente, o con un anticuerpo de hemocianina anti-lapa (KLH)como un control negativo. Luego incubamos las muestras durante 30 minutos en hielo con RPE (ficoeritrina) conjugada con IgG2 antihumano. Medimos el enlace por citometría de flujo de células B CD19/CD20 positivas y analizamos los histogramas de intensidad fluorescente (F12-H) contra el número de células (Cuentas), usando software CellQuest. Estimamos el enlace ( D) para cada anticuerpo a partir de gráficos de intensidad de fluorescencia media contra la concentración de anticuerpo. Controlamos la depleción del anticuerpo midiendo el enlace sobre un rango de concentraciones celulares. Ensayamos los anticuerpos 3.1.1 , 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 y 21.4.1 para determinación de enlace a células B humanas, de rhesus y de cynomolgus. Además ensayamos los anticuerpos 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.29.1 y 24.2.1 para determinación de enlace a células B humanas y de cynomolgus. Observamos que la señal máxima y la concentración para el enlace de media máxima a células de monos se encontró dentro de un factor de dos, a los correspondientes parámetros para células B humanas. No se observó enlace en experimentos similares con sangre de ratón, rata, conejo y perro.
P04/057-APf EJEMPLO 5 Selectividad de Anticuerpos para CD40 Condujimos otro ensayo in vitro para determinar la selectividad de anticuerpos de la invención con respecto a CD40.
Selectividad para CD40 ELISA: Materiales y Métodos Revestimos una placa FluroNUNC de 96 receptáculos (Nunc Cat. No. 475515) con cuatro antigenos: CD40/Ig, CD44/Ig, RANK/Ig, 4-l BB/Ig, TNFR-l/lg y TNFR-2/Ig (antígenos generados en el lugar), durante la noche a +4°C, a 1 µg/ml de 100 µ?/receptáculo en buffer de bicarbonato de sodio 0, 1 M, pH 9,6. Luego lavamos la placa con PBST (PBS + Tween-20 al 0,1 %) tres veces y bloqueamos la placa con PBST + BSA 0,5 %, a 150 µ?/receptáculo. Incubamos la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego lavamos con PBST tres veces. Luego, diluimos los anticuerpos anti-CD40 generados en el Ejemplo I en bloque, a 1 µg/ml) y agregamos los anticuerpos diluidos a la placa. Incubamos la placa a temperatura ambiente durante 1 hora, luego lavamos con PBST tres veces. Entonces tratamos las células que contenían los anticuerpos generados en el Ejemplo I con 100 mi/ receptáculo de IgG2-HRP antihumano (Southern Biotech Cat. No. 9070-05) a una dilución de 1 :4000 en bloque. Además, tratamos una fila con IgG antihumano (Jackson Cat. No. 209-035-088) diluido a 1 :5000 en blque, y agregamos a 100 µ?/receptáculo para normalizar para el revestimiento de placa. Además tratamos una fila con CD40-HRP antihumano (Pharmingen Cat. No. 345815/Custom P04/057-APf HRP conjugado) a 0,05 µ^?t? diluido en bloque como un control positivo. Incubamos la placa a temperatura ambiente durante 1 hora y luego lavamos con PBST tres veces. Agregamos sustrato TMB ( & P Labs) a 100 µ?/receptáculo e incubamos la placa durante 5 a 10 minutos. Luego leímos la placa usando un lector de placa Spectra-Max™. Los resultados mostraron que los anticuerpos tienen una selectividad para CD40 que es por lo menos 100 veces mayor que su selectividad para RANK, 4-l BB TNFR-1 y TNFR-2, en cuanto a que la señal específica de CD4 (señal de CD40 menos el fondo) es por lo menos 100 X mayor que la señal correspondiente para las otras moléculas.
EJEMPLO VI Estudios de Clasificación de Epítopes Habiendo demostrado que los anticuerpos de la invención son selectivos para CD40, efectuamos análisis de enlace de competición usando BLAcore y FACS.
Estudios de Competición BI Acore Condujimos estudios de competición BIAcore para determinar si los anticuerpos anti-CD40 h umanos de la invención se ligan a los mismos o a diferentes s itios en l a molécula CD40. En estos experimentos, usamos un instrumento BIAcore 2000, siguiendo los protocolos del fabricante. La Proteína A fue inmovilizada sobre las superficies del chip sensor del BIAcore. Una concentración saturadora de CD40-Ig que comprendía el dominio extracelular de CD40 fue ligada al chip sensor. Luego ligamos un primer anticuerpo anti-CD40 agonista humano de la invención, un anticuerpo anti-CD40 P04/057-APf comercial o CD40L al CD40 ligado al chip sensor bajo condiciones de saturación. Luego medimos la capacidad de un segundo anticuerpo anti-CD40 agonista humano de la invención para competir con el primer anticuerpo, con el anticuerpo comercial o CD40L, para el enlace a CD40. Esta técnica nos permitió asignar los anticuerpos a diferentes grupos de enlace. El enlace a CD40 indicó el reconocimiento de un epítope independiente. La falta de enlace puede indicar el reconocimiento del mismo epítope o superposición de epítopes.
Estudios FACS Condujimos estudios FACS para determinar si los anticuerpos anti-CD40 humanos de la invención se ligan a los mismos o a diferentes epítopes en la molécula CD40, y para determinar si se ligan al mismo sitio o diferente en la molécula CD40 que los anticuerpos anti-CD40 comercialmente disponibles EA5 (Alexis Cat. No. ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) y 5C3 (Pharmingen # 555458 (no rotulado) y 555460 (rotulación PE para FACS). Efectuamos contratinción de células dendríticas tratadas con anticuerpos anti-CD40 de la invención, con EA5 rotulado con PE, o con anticuerpo LOB7/6 rotulado con PE sobre hielo, durante 30 minutos. Después de un lavado, la tinción de las células se analizó en un citómetro de calibre B-D. El reducido enlace de los anticuerpos comerciales se interpretó como una indicación de que el anticuerpo de ensayo se ligó al mismo epítope o que hubo superposición. El análisis de enlace de competición por BIAcore y FACS demostró que los epítopes reconocidos por anticuerpos mAb 21.4.1 se superponen con el epítope P04/057-APÍ reconocido por el anticuerpo EA5, no se superponen con el epítope reconocido por el anticuerpo LOB7/6 comercialmente disponible, y no se superponen con el sito de enlace para C D40L. Los epítopes r econocidos p or l os anticuerpos restantes s i se superponen con el sitio de enlace para CD40L. La Tabla 22 resume los resultados de estos estudios de clasificación de epítopes.
TABLA 22 Clasificación de Epítopes de Competición BIAcore de Ciertos Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención P04/057-APf 21.4.1 X X X 23.25.1 , X X X X 23.28.1 , 24.2.1 CD40L X X X X X X EJEMPLO VII Re ülación Ascendente de Moléculas de Superficie por Anticuerpos Anti-CD40 Condujimos un ensayo de sangre entera para determinar si los anticuerpos anti-CD40 humanos de la invención regulan en forma ascendente la expresión de moléculas de superficie en células B. Se diluyó sangre entera humana o de primate 1 : 1 con medio RPMI y se incubó 24 horas con varias concentraciones de anticuerpos agonistas de CD40 ó de controles. Las células se tiñeron durante 30 minutos (en hielo, en la oscuridad) para HLA-DR, ICAM, B7- 1 , B7-2, CD 19/CD20, CD40, CD23 y CD71 , usando reactivos de anticuerpos rotulados con fluocromo comercialmente disponibles. Las células luego se analizaron en un FACS-Caliber (Becton-Dickinson). Las células B fueron identificadas mediante la abertura en células CD19 ó CD20 positivas, y se determinaron los marcadores de activación para esta puerta. El incremento máximo de partes de fluorescencia media (a < 1 µ§/p? de anticuerpo) y EC50 medio obtenido usando uno de los anticuerpos anti-CD40 de la invención reivindicada (21.4.1 ) se muestran en la Tabla 23. TABLA 23 P04/057-APf Regulación Ascendente de Moléculas de Superficie de Células B por un Anticuerpo Anti-CD40 de la Invención Además condujimos experimentos para determinar si los anticuerpos anti-CD40 humanos de la invención regulan en forma ascendente la expresión de moléculas de superficie de células dendríticas derivadas de monocitos.
Preparación de las células dendríticas derivadas de monocitos Se recolectó sangre periférica de voluntarios humanos normales. Las células mononucleares se aislaron usando t ubos S igma A ccuspin (St. Louis, M O), s e l avaron con medio RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) y se colocaron en recipientes de cultivo de tejido a 5 X 106/ml en medio RPMI completo (que contenía 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, buffer HEPES 10 mM, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0, 1 mM; todos de Gibco BRL); y suero de ternero fetal al 10 % (Hyclone, Logan, Utah). Después de 3 horas de incubación a 37°C (5 % C02), las células no adherentes se removieron y las células T se aislaron usando columnas de selección (R&D systems, Minneapolis, MN). Las células adherentes se lavaron con medio RPMI y P04/057-APf se incubaron durante 7 días en medio RPMI completo suplementado con 10 ng/ml de IL-4 (R&D systems) y 100 ng/ml de GM-CSF (R&D systems). Las células no adherentes luego se aislaron, se lavaron y se utilizaron como células dendríticas derivadas de monocitos (en inglés, mDC) para todos los experimentos. Las células adherentes restantes se removieron usando tripsina/EDTA y se utilizaron en experimentos que empleaban monocitos adherentes. Para determinar si los anticuerpos anti-CD40 de la invención regulan en forma ascendente la expresión de marcadores de superficie celular, las células dendríticas derivadas de monocitos se cultivaron con varias concentraciones de anticuerpos agonistas durante 48-72 horas, seguido de tinción (30 minutos, en hielo, en la oscuridad) para HLA-DR, ICAM, B7-1 , B7-2, CD40 y CD83, usando reactivos de anticuerpos rotulados con fluocromo comercialmente disponibles. Las células luego se analizaron en un FACS-Caliber (Becton-Dickinson). El incremento máximo de partes de fluorescencia media (a < 1 µg/ml de anticuerpo) y EC50 medio obtenido usando uno de los anticuerpos anti-CD40 de la invención reivindicada (21.4.1) se muestran en la Tabla 24. TABLA 24 Regulación Ascendente de Moléculas de Superficie de Células Dendríticas por un Anticuerpo Anti-CD40 de la Invención P04/057-APÍ CD83 36,3 +/- 42,2 233 +/- 262 ICAM 10,4 +/- 4,8 241 +/- 140 B7-2 21 ,9 +/- 9,4 71 ,4 +/- 44,4 Condujimos experimentos similares con células B y mDC usando varios anticuerpos anti-CD40 de la invención y marcadores adicionales. Medimos la expresión de moléculas de superficie de células B (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 y CD23) como se describe anteriormente, pero usando 1 µe/??? del anticuerpo anti-CD40. Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 25. Medimos la expresión de moléculas de superficie de células dendríticas (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 y CD83) después de 72 horas como se indica anteriormente, pero usando 1 µ^?t? del anticuerpo anti-CD40. Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 26. Las Tablas 25-26 muestran el incremento de partes en la intensidad media +/- desviación estándar.
TABLA 25 Regulación Ascendente de Moléculas de Superficie de Células B por Anticuerpos Anti- CD40 de la Invención P04/057-APÍ MHC Clase II ICAM B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) CD23 (CD54) Célula B Célula B Célula B Célula B Célula B .1.1 3,2 +/- 2,6 1,3 +/- 0,2 1,7 +/- 0,2 1,2 +/- 0,4 5,6 +/- 4,8 1.2.1 1,2+/- 0,2 1,3+/- 0,9 0,9 +/- 0,5 1,0+/- 0,04 1,0+/- 0,1 1.4.1 3,6 +/- 3,0 5,0 +/- 3,0 1,9 +/-0,8 1,8+/- 0,7 21,5 +/- 34,8 2.1.1 1,4+/- 0,5 1,1 +/-0,2 1,2+/- 0,3 1,0+/- 0,1 1,3 +/- 0,2 3.5.1 1,4+/- 0,5 1,1 +/- 0,2 1,4+/- 0,6 1,0+/- 0,1 1,1 +/- 0,2 3.25.1 2,5+/- 1,1 2,5 +/- 0,9 1,6 +/- 0,4 1,3 +/-0.2 4,3 +/- 2,3 3.28.1 1,1 +/- 0,2 1,1 +/- 0,2 1,8+/- 0,6 1,0+/- 0,1 1,1 +/- 0,4 3.29.1 1,2+/- 0,2 1,0+/- 0,2 1,3+/- 0,6 0,9 +/- 0,2 1,1 +/- 0,1 4.2.1 1,8+/- 1,0 1,6+/- 0,8 1,1 +/- 0,4 1,1 +/- 0,2 0,9 +/- 0,6 P04/057-APÍ TABLA 26 Regulación Ascendente de Moléculas de Superficie de Células Dendríticas por Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención (N del T.: DC = célula dendrítica) La Tabla 27 compara la regulación ascendente de moléculas de superficie celular en células dendríticas sobre células B, en términos de la relación del incremento de partes medio en células dendríticas sobre el incremento de partes medio en células B. TABLA 27 Regulación Ascendente de Moléculas de Superficie Celular en Células Dendríticas Sobre Células B P04/057-APf B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) MHC Clase II ICAM (CD54) .1.1 1 ,08 19,40 1 ,38 1 , 15 1.2.1 1 ,01 7,37 1 ,49 1,12 1.4.1 0,77 7,04 1 ,37 0,74 2.1.1 1 ,18 16,36 1 ,61 1 ,44 23.5.1 0,83 10,54 1 ,59 1 ,06 23.25.1 0,66 2,57 0,85 0,98 23.28.1 0,71 10,81 2,16 2,57 23.29.1 0,73 9,07 1 ,66 1 ,23 24.2.1 3,48 52,30 2,64 1 ,35 EJEMPLO VIII Aumento de la Secreción de Citoquinas Condujimos un ensayo de células dendríticas derivadas de monocitos para determinar si los anticuerpos anti-CD40 humanos de la invención aumentan la secreción de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8. Las células dendríticas derivadas de monocitos y los monocitos adherentes se prepararon como se describe anteriormente. Las células se cultivaron en presencia de un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 ) o con un anticuerpo de hemocianina anti-lapa (KLH) como un control negativo. Se midieron las citoquinas en los sobrenadantes a 24 horas por ELISA (R&D systems). En algunos estudios (ver Tabla 28), las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el anticuerpo también fueron P04/057-APÍ estimuladas junto con ya sea 100 ng ml LPS (Sigma), 1.000 U/ml IFN-? (R&D systems) ó 25 ng/ml IL-? ß R&D systems. El anticuerpo anti-CD40 aumentó la producción de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8 tanto en células dendríticas derivadas de monocitos como en monocitos adherentes. La presencia de LPS aumentó aún más la producción de IL-12p40 y de IL-12p70. Sólo se detectaron niveles mínimos de citoquinas en los sobrenadantes de células dendríticas incubadas con el isotipo anticuerpo de control, anti-KLH. Los resultados representativos se presentan en la Tabla 28 y en las Figuras 3 y 4. La Tabla 28 resume las principales citoquinas producidas por células dendríticas o monocitos a dherentes por medio de 1 µg ml de un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) +/- 100 ng/ml LPS. Como se muestra en la Figura 3, el anticuerpo anti-CD40 aumentó la producción de IL-12p40 por células dendríticas humanas. La Figura 4 ilustra la aumentada producción de IL-12p70 por células dendríticas humanas en presencia de anticuerpo y de 100 ng/ml LPS.
P04/057-APÍ TABLA 28 Aumento de la Secreción de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8 por un Anticuerpo Anti-CD40 de la Invención ND = no determinado Se efectuaron experimentos similares usando anticuerpos anti-CD40 múltiples de la invención. Las células dendríticas derivadas de monocitos se prepararon como se describe anteriormente, y se cultivaron en presencia de varias concentraciones de los anticuerpos anti-CD40, y se estimularon junto con 100 ng/ml LPS (Sigma). Se midió la IL-12p70 en el sobrenadante a 24 horas por ELISA (R&D systems), y se determinó la P04/057-APÍ EC5o para cada anticuerpo. Los resultados de los experimentos se presentan en la Tabla 29. P04/057-APf TABLA 29 Aumento de la Secreción de IL- 12p70 en Células Dendríticas Además ensayamos la capacidad de los anticuerpos anti-CD40 de la invención para aumentar la secreción de IFN-gamma de células T en un ensayo alogénico de células T/células dendríticas. Para efectuar este ensayo, se aislaron células T y monocitos de la sangre periférica de voluntarios sanos. Los monocitos se diferenciaron en células dendríticas usando los métodos que se describen anteriormente. 1 x 105 células T obtenidas de un individuo se cultivaron con 1 x 105 células dendríticas obtenidas de un individuo diferente, en presencia de un anticuerpo anti-CD40 de la invención o de un anticuerpo de control. Después de 4 días de cultivo, los sobrenadantes se ensayaron para determinación de secreción de IFN-gamma por ELISA. Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 30.
P04/057-APf P04/057-APf TABLA 30 Aumento de la Secreción de IFN-gamma por Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención Los anticuerpos 10.8.3, 15.1.1 , 21.4.1 y 3.1.1 se ensayaron en un ensayo de liberación de citoquinas de sangre entera de Wing y otros, Therapeutic Immunol. 2: 183- 90 (1995) para determinar si los anticuerpos inducen citoquinas inflamatorias a una concentración de 1 , 10 y 100 µg/ml. No se observó liberación significativa de TNF-a, IL-? ß, TFN-? o IL-6 con estos anticuerpos a las concentraciones indicadas en sangre de 10 donantes normales.
P04/057-APf EJEMPLO X Aumento de la Inmunogenicidad de la Línea Celular Jy por Anticuerpos Anti-CD40 Se cultivaron células JIYOYE CD40 positivas (ATCC CCL 87) ("células Jy") y se mantuvieron en medio RPMI. Las células JIYOYE se incubaron durante 24 horas con un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 ), o con un anticuerpo de isotipo coincidente (anti-KLH), en medio RPMI completo. Las células luego se lavaron y se trataron con 25 mg de mitomicina C (Sigma)/7 mi de medio durante 60 minutos. Estas células luego se incubaron con células T humanas aisladas a una relación de 1 : 100 durante 6 días a 37°C (5 % C02). Las células T luego se recolectaron, se lavaron y se determinó el nivel de actividad CTL contra células JIYOYE rotuladas con cromo 51 fresco (New England Nuclear, Boston, MA) La actividad CTL específica se calculó como % de citolisis específica = (citolisis Jy (cpm) - citolisis espontánea (cpm)) / (citolisis total (cpm) - citolisis espontánea (cpm)). Como ilustra la Figura 5, un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 ) aumentó de manera significativa 1 a i nmunogenicidad c ontra c élulas J y t ratadas c on e 1 anticuerpo.
EJEMPLO XI Modelo de Tumor Animal P04/057-APÍ Para investigar adicionalmente la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-CD40 e laborados d e acuerdo c on la invención, diseñamos un modelo de ratón SCID-beige para ensayar el efecto in vivo del anticuerpo sobre el crecimiento tumoral. Obtuvimos ratones S CID-beige d e C harles Ri er y dejamos que los ratones se aclimataran una semana antes del uso. Inyectamos células tumorales (células Daudi (ATCC CCL 213), células CD40(-) 562 (ATCC CCL 243) y células CD40(+) Raji (ATCC CCL 86), células de cáncer de mama BT474 (ATCC HTB 20) o células de próstata PC-3 (ATCC CRL 1435)), en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. En algunos casos, inyectamos células T (5 x 105) y células dendnticas (1 x l05) del mismo donante humano, junto con las células tumorales. Además inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención, o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de 1 a i nyección de tumor ( sólo una inyección). Luego medimos el crecimiento tumoral. Los experimentos específicos se describen a continuación. En un experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) o un control de isotipo coincidente (anti- LH), en forma intraperitoneal, a una dosis de 10 mg/kg inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Se inyectaron las células tumorales (células Daudi) en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. Medimos el crecimiento tumoral con un compás de brazos curvos los días 17, 19, 20, 21 , 25, 26, 27 y 28 después de la implantación en presencia de células dendnticas y células T humanas. Como se muestra en la Figura 6, el anticuerpo anti-CD40 inhibió el crecimiento tumoral aproximadamente [60 %.
P04/057-APf En otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, a una dosis de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg ó 10 mg/kg, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Las células tumorales (células K562) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. En este experimento, inyectamos células T (5 x 105) y células dendríticas (1 x 105) del mismo donante humano, junto con las células tumorales. Medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos los días 17, 19, 20, 21 , 25, 26, 27 y 28 después de la implantación. Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo anti-CD40 inhibió el crecimiento tumoral un 60-85 %. En otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 , 23.29.1 ó 3.1.1) o un control de isotipo coincidentc (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). El anticuerpo de control de isotipo coincidente y el anticuerpo 21.4.1 se inyectaron a una dosis de 1 mg/ml. Los anticuerpos 23.29.1 y 3.1.1 se inyectaron a una dosis de 1, 0, 1 , 0,01 , 0,001 ó 0,0001 mg/kg. Las células tumorales (células K562) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. En este experimento, inyectamos células T (5 x 105) y células dendríticas (1 x 105) del mismo donante humano, junto con las células tumorales. Luego medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos el día 28 después de la implantación. Los resultados de este experimento se muestran en las Figuras 8 y 9. Cada punto en las Figuras representa una medición de un animal individual.
P04/057-APÍ En otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1) o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Los anticuerpos se inyectaron a una dosis de 1 , 0,1 , 0,01 , 0,001 ó 0,0001 mg/kg. Las células tumorales (células Raji) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. En este experimento, inyectamos células T (5 x 105) y células dendríticas (1 x 105) del mismo donante humano, junto con las células tumorales. Luego medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos el día 28 después de la implantación. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 10. Cada punto en la Figura representa una medición de un animal individual. En aún otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 , 23.28.1 , 3.1.1 ó 23.5.1) o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Los anticuerpos se inyectaron a una dosis de 1 ó 0,1 mg/kg. Las células tumorales (células Raji) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. Luego medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos el día 28 después de la implantación. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 11. Cada punto en la Figura representa una medición de un animal individual. En aún otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (21.4.1 , 23.29.1 ó 3.1.1 ) o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Los anticuerpos se inyectaron a una dosis de 1 mg/kg. Las células tumorales (células de ???/057-APf cáncer de mama BT474) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 c élulas/animal. I nyectamos c élulas T ( 5 x 105) y células dendríticas (1 x 105) del mismo donante humano, junto con las células tumorales. Luego medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos el día 39 después de la implantación. Como se muestra en la Figura 12, todos los anticuerpos inhibieron el crecimiento del tumor de cáncer de mama. Cada punto en la Figura representa una medición de un animal individual. En aún otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención (3.1.1 ) o un control de isotipo coincidente (anti-KLH), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes de la inyección de tumor (sólo una inyección). Los anticuerpos se inyectaron a una dosis de 1 mg/kg. Las células tumorales (células de tumor de próstata PC -3) se inyectaron en forma subcutánea a una concentración de 1 x 107 células/animal. Luego medimos el crecimiento del tumor con un compás de brazos curvos el día 41 después de la implantación. Como se muestra en la Figura 13, el anticuerpo anti-CD40 inhibió el crecimiento del tumor de próstata aproximadamente un 60 %. Cada punto en la Figura representa una medición de un animal individual.
EJEMPLO XII Supervivencia de Ratones SCID-Beige Inyectados con Células Tumorales Daudi y Tratados con los Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención En otro experimento, inyectamos un anticuerpo anti-CD40 de la invención, o un control de isotipo coincidente (una inyección), en forma intraperitoneal, inmediatamente antes d e 1 a i nyección d e t umor. L os anticuerpos se inyectaron a una dosis de 1 ó 0,1 P04/057-APf mg kg. Las células tumorales (células Daudi) se inyectaron en forma intravenosa a una dosis de 5 x 106 células/animal. Luego controlamos la supervivencia de los animales. Como se muestra en la Figura 14, todos los anticuerpos anti-CD40 ensayados prolongaron la supervivencia de los ratones a los que se les inyectó tumores, por lo menos seis días. La Tabla 31 enumera la ED50 de los anticuerpos anti-CD40 en los diferentes modelos de tumores sólidos que se describen en el Ejemplo XI. La Tabla 31 resume la actividad in vivo antitumoral de algunos de los anticuerpos anti-CD40 de la invención en ratones SCID. Además, la tabla enumera la ED50 de los anticuerpos anti-CD40 en el modelo de tumor sistémico de Daudi que se describe anteriormente en el Ejemplo XII.
TABLA 31 ED n de los Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención Usando Diferentes Modelos de Tumores In Vivo en ratones SCID P04/057-APÍ Anticuerpo CD40(-) K562 CD40(+) Raji & CD40(+) Raji CD40(+) Daudi & T/DC T/DC subcutánea intravenosa subcutánea subcutánea (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) 21.4.1 0,005 0,0008 0,016 0,1 22.1.1 0,01 ND >1 ,0 0, 1 23.25.1 >1,0 ND >1 ,0 ND 23.5.1 >i,o ND >i ,o ND 24.2.1 > 1,0 ND >1 ,0 ND 3.1.1 0,02 ND >0,1 <o,i 23.28.1 >i,o ND > ,o 0, 1 23.29.1 0,009 ND >1 ,0 <o,i 21.2.1 <1 ,0 ND ND ND ND = no hecho EJEMPLO XIII Determinación de Constantes de Afinidad (Kn) de Anticuerpos Anti-CD40 Completamente Humanos por BIAcore Efectuamos medidas de afinidad de anticuerpos purificados por resonancia de plasmotipo de superficie usando el instrumento BIAcore 3000, siguiendo los protocolos del fabricante. El instrumento de análisis de interacción bioespecífica de Biosensor (BIAcore) utiliza resonancia de plasmotipo de superficie para medir las interacciones moleculares P04/057-APÍ en un chip sensor CM5. Los cambios en los índices de refracción entre dos medios, vidrio y dextrano carboximetilado, causados por la interacción de moléculas al lateral de dextrano del chip sensor, se miden y se informan como cambios en las unidades de reflexión arbitraria (RU), como se describe en detalle en las observaciones de aplicación del fabricante. La superficie de dextrano carboximetilado de una celda de flujo en un chip sensor se activó por derivación con N-hidroxisuccinimida 0,05 M intermediada por N-etil-N'-(dimetilarninopropil)carbodiimida, 0,2 M, durante 7 minutos. Se inyectó en forma manual proteína de fusión CD40-Ig (descrita en el Ejemplo I) a una concentración de 5 µ ml, en Na acetato, 10 mM, pH 3,5, en la celda de flujo a un índice de 5 µ?/min., y se inmovilizó covalentemente a la superficie de la celda de flujo con la cantidad deseada de RU. L a desactivación d e N -hidroxisuccinimida é steres no r eaccionados s e efectuó usando clorhidrato de etanolamina, 1 M, pH 8,5. Después de la inmovilización, las celdas de flujo se limpiaron para eliminar cualquier material no reaccionado o pobremente ligado, con 5 inyecciones de regeneración de 5 µ? de NaOH, 50 mM, hasta que se logró una línea de base estable. La celda de flujo 2, una superficie de alta densidad, midió aproximadamente 300 RU luego de la preparación de la superficie, y la celda de flujo 3, una superficie de baja densidad, midió aproximadamente 150 RU. Para la celda de flujo 1 , la superficie blanco activada, se inyectaron 35 µ? de buffer de acetato de Na, 10 mM, durante la inmovilización en lugar de antígeno. La celda de flujo 4 contenía aproximadamente 450 RU de CTLA4-Ig inmovilizado, un control de antígeno no pertinente.
P04/057-APÍ Se preparó una serie de dilución de cada anticuerpo en el rango de concentración de 100 µg/ml a 0,1 µg/ml) por medio logs. El índice de flujo se estableció a 5 µ?/min., y se inyectaron 25 µ? de cada muestra de punto de concentración sobre el chip sensor con una inyección de regeneración de 5 µ? de NaOH, 50 mM, entre cada concentración de anticuerpo inyectado. La información se analizó usando software BIAevaluation 3.0. En experimentos cinéticos de orientación inversa, el anticuerpo 21.4.1 se inmovilizó a la superficie del chip sensor usando el protocolo que se describe anteriormente. Se usó anti- LH como una superficie de anticuerpo de control. El antígeno, proteína de fusión CD40-Ig, se inyectó en el rango de concentración de 100 µg/ml a 0, 1 µß/?t?. La Tabla 32 enumera mediciones de afinidad para anticuerpos anti-CD40 representativos de la presente invención. TABLA 32 Mediciones de Afinidad Para Anticuerpos Anti-CD40 de la Invención P04/057-APf 23.29.1 3,54 x 105 3,90 x 10"5 7,04 x 10"" EJEMPLO XIV Mapeo de Epitopes de Anticuerpos Anti-CD40 Los ensayos de enlace se hicieron usando antígeno de fusión de CD40 purificada con Proteía A - IgGl humano. La proteína de fusión CD40-lgGl humana se clonó en Pfizer. La proteína de fusión CD40 IgGl humana fue expresada en una línea celular de mamífero y purificada sobre columna de Proteína A. La pureza del antígeno de fusión se ensayó por SDS/PAGE. CD40 t iene una estructura de una proteína de transmembrana tipo 1 1 ípica. La molécula madura está compuesta de 277 aminoácidos. El dominio extracelular de CD40 consiste en cuatro dominios ricos en cisteína del tipo TNFR. Ver, por ejemplo, Neismith y Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten y Brancherau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic y otros, EMBO J. 8: 1403-1410 (1989).
Enlace de Anticuerpos Anti-CD40 a CD40 Humano Reducido y No Reducido Debido a que el dominio extracelular de CD40 consiste en cuatro dominios ricos en cisteína, la interrupción de los enlaces intramoleculares, por agente reductor, puede cambiar la reactividad del anticuerpo. Para determinar si la interrupción de los enlaces intramoleculares por parte de agente reductor cambió la reactividad de anticuerpos anti-CD40 seleccionados de la invención, se cargó CD40-hIgG purificado en SDS/PAGE (gel 4-20 %) bajo condiciones no reductoras (NR) o reductoras (R). Se efectuó SDS/PAGE por el método de Laemmli, usando un sistema de minigel. Las p roteínas separadas fueron transferidas a la membrana de nitrocelulosa. Las membranas se P04/057-APÍ bloquearon usando PBS que contenía 5 % (p/v) de leche deshidratada no grasa durante por lo menos 1 hora antes del desarrollo, y se sondearon durante 1 hora con cada anticuerpo. Los anticuerpos anti-CD40 se detectaron usando inmunoglobulinas antihumanas de cabra conjugadas con HRP (dilución 1 :8.000, Catálogo No. A-8667 de Sigma). Las membranas se desarrollaron usando Quimiluminiscencia aumentada (ECL®; Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se sondeó el Western Blot con cuatro anticuerpos anti-CD40 de la invención: 21.4.1 , 23.25.1, 23.29.1 y 24.2.1 (1 µg/ml), seguido de IgG antihumano de cabra conjugado con HRP (dilución 1 :8.000). Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 1 5. Los resultados i ndican q ue l os a nticuerpos 2 1.4.1 , 23.25.1 , 23.29.1 y 24.2.1 se ligan a CD40 no reducido, pero no se ligan a CD40 reducido; los anticuerpos, en consecuencia, reconocen un epítope de conformación.
Enlace de Anticuerpos Anti-CD40 a Proteínas Deleteadas de Dominio CD40 Humano La región extracelular de CD40 incluye cuatro dominios de repetición del tipo TNFR (a los que se hace referencia como D1-D4). Ver, por ejemplo, Neismith y Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten y Branchereau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic y otros, EMBO J. 8: 1403-1410 (1989). La Figura 16 muestra las secuencias de aminoácidos de los dominios CD40 de ratón y humano D1-D4. Para investigar la contribución de diferentes regiones de la molécula CD40 en la presentación del epítope, se construyeron una cantidad de imitantes deleteadas de dominios. Para hacer las construcciones de deleción de CD40 humanas, se amplificó el dominio extracelular entero de CD40 humano (aminoácidos 1 -193) de ADNc de células P04/057-APf B humanas (CD19+) (paneles de ADNc de tejidos múltiples, Catálogo No. K1428-1, de Clontech) por PCR, usando cebadores específicos de secuencia, y se agregó una etiqueta 6XHis en el terminal C. Un cebador CD40 5' humano, 5'-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (SEC ID NO: 135) se usó con combinación diferente de cebadores 3' para clonación de moléculas CD40 de longitud completa y truncadas. El cebador 3' para clonación del dominio extracelular de longitud completa de CD40 humano fue: 5'- TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3' (SEC ID NO: 1 36). El cebador 3' utilizado para clonar los dominios D1-D3 de CD40 humano fue: 5 ' -TCAGTG ATGGTG ATGGTG ATGTGGGC AGGGCTCGCG ATGGTAT-3 ' (SEC ID NO: 137). El cebador 3' utilizado para clonar los dominios D1-D2 de CD40 fue: 5 ' -TC AGTGATGGTG ATGGTGATG AC AGGTGCAG ATGGTGTCTGTT-3 ' (SEC ID NO: 138). Después de generar estas construcciones de ADNc de CD40 truncado, éstas fueron expresadas en la línea celular 293 F usando el vector pCR3.1 (Invitrogen). Las proteínas de fusión CD40-6XHis se purificaron por elución de una columna de níquel. Las secuencias de aminoácidos de estas cuatro mutantes de deleción se muestran en la Tabla 33.
P04/057-APf TABLA 33 Proteínas de Fusión CD40 de Etiqueta His P04/057-APf Para expresar estas construcciones de deleción de CD40 humanas, las construcciones se clonaron en el vector pCR3.1 (Invitrogen), y se evaluó la expresión en varias líneas celulares 293F transfectadas de manera transiente y estables. Los sobrenadantes de células 293F transfectadas de manera transiente se analizaron para determinación d e enlace a anticuerpos 21.4.1 , 23.25.1 , 23.29.1 y 24.2.1 p or ELISA y Western Blot. Los ensayos ELISA se efectuaron usando sobrenadante de células 293F transfectadas con diferentes construcciones CD40. Las placas ELISA fueron revestidas con anticuerpos policlonales CD40 antihumanos de cabra (R&D Catálogo No. AF 632) o con anticuerpos policlonales CD40 anti -ratón de cabra (R&D Catálogo NO. AF 440) diluidos a 1 µ§/?? en buffer de revestimiento de placa ELISA. La expresión de construcciones CD40 en células 293F fue confirmada por medio de la detección con CD40 antihumano de cabra biotinilado (R&D Catálogo No. BAF 632), CD40 anti-ratón de cabra (R&D Catálogo No. BAF 440) o anticuerpo anti-His HRP-conjugado (C-terminal) ( Invitrogen, C atálogo No. 46-0707). El enlace de anticuerpos humanos anti-CD40 se detectó con IgG antihumano de cabra conjugado con HRP (FC específico Catálogo H 10507), diluido 1 :2.000. Los resultados, como se muestran en la Tabla 34, indican que la mayoría, sino todo el epítope reconocido por mAb 21.4.1 , 23.28.1 y 23.29.1 se ubica en la región D1 -D2 de CD40, mientras que el epítope para mAb 24.2.1 se ubica por lo menos en parte en el dominio D3-D4. Se usó una proteína de fusión de CD40 humano-conejo Fe como un control, para confirmar la especificidad del enlace de anticuerpo.
P04/057-APÍ TABLA 34 ELISA: Enlace de Anticuerpos a Mutantes de Deleción de CD40 Las construcciones de deleción de CD40 también se analizaron por análisis Western Blot. Los resultados se muestran en la Tabla 35. Los resultados de ELISA muestran que el sitio de enlace de los anticuerpos 21.4.1, 23.25.1 , 23.29.1 y 24.2.1 involucra los dominios D1-D3. Los resultados además muestran que el sitio de enlace para los anticuerpos 21.4.1 , 23.25.1 y 23.29.1 involucran los dominios D1-D2, y que el sitio de enlace del anticuerpo 24.2.1 involucra el dominio D3. TABLA 35 Western Blot: Enlace de Anticuerpo a Mutante de Deleción de CD40 CD40(Dl-D3)Humano- CD40 Humano-6XHis P04/057-APÍ 6XHis 21.4.1 + + 23.25.1 + + 23.29.1 + + 24.2.1 + + anti-His + + Anti-Rblg ND ND Enlace de Anticuerpos Anti-CD40 a CD40 de Ratón Nos propusimos determinar la capacidad de los anticuerpos 21.4.1 , 23.25.1, 23.29.1 y 24.2.1 para ligarse a CD40 de ratón. Para este experimento, se amplificó CD40 de ratón de A DNc d e c élulas B d e ratón. Se clonó proteína de fusión CD40(Dl-D3)-6xHis de ratón en pCR3.1 , que utiliza el promotor CMV, para conducir la transcripción. El cebador 5' utilizado para clonar el dominio extracelular del CD40 de ratón fue: 5'-TGC AAGCTTC ACC ATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3 ' . El cebador 3 ' utilizado para clonar los dominios D1-D3 de CD40 de ratón fue: 5'-GTCCTCGAGTCAGTGATGGTG ATGGTGATGTGGGCAGGG ATGACAGAC-3 ' . Las construcciones de ADNc de ratón y humano fueron transfectadas en células 293F de manera transiente. La expresión de CD40 recombinante fue detectada por ELISA usando anticuerpos policlonales contra CD40 de ratón y humano, anticuerpos anti-His y anticuerpos anti-CD40 21.4.1, 23.25.1 , 23.29.1 y 24.2.1. Los resultados de estos P04/057-APf experimentos se muestran en la Tabla 36. Este experimento muestra que todos los anticuerpos son específicos para CD40 humano y no reaccionan de manera cruzada con CD40 de ratón.
P04/057-APf TABLA 36 Reactividad Cruzada de CD40 de Ratón y Humano Enlace de Anticuerpos Anti-CD40 a CD4Q Quimérico Humano/Ratón Debido a que los anticuerpos 21.4.1, 23.25.1 , 23.29.1 y 24.2.1 no se ligan a CD40 de ratón, construimos proteínas CD40 quiméricas humano/ratón para mapear en forma más definitiva los epítopes de esos anticuerpos. Para la construcción de fusiones en marco de las proteínas quiméricas de CD40 humano y de murino, usamos sitios de restricción únicos en los bordes de dominios CD40 en posiciones idénticas en el ADNc tanto de CD40 humano como de ratón. Se generaron varias construcciones de ADNc de CD40 usando el sitio de restricción EcoRI al final de dominio 1 (nucleótido 244, aminoácido 64) y el sitio de restricción BanI al final de dominio 2 (nucleótido 330, aminoácido 94) (Figura 17). Varios dominios CD40 se amplificaron por PCR y se ligaron. Este enfoque permitió el reemplazo de varios dominios del CD40 de ratón con los dominios P04/057-APÍ homólogos del CD40 humano. Las construcciones obtenidas se muestran en la Figura 18. Luego determinamos si los anticuerpos 21.4.1 , 23.25.1, 23.29.1 y 24.2.1 eran capaces de ligarse a las proteínas CD40 quiméricas de ratón/humano por ELISA. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 37. Como se muestra en la Tabla 37, los mAb 21.4.1 y 23.25.1 reconocen un epítope que se ubica en parte en DI y en parte en D2; mAb 23.29.1 reconoce un epítope ubicado en su mayoría, sino completamente en D2; y mAb 24.2.1 reconoce un epítope ubicado en D2 y D3. TABLA 37 Enlace de Anticuerpos a Proteínas CD40 Quiméricas Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente como referencia, como si se indicara que cada publicación o solicitud de patente individual fuera específica e individualmente incorporada como referencia. Si bien la solicitud precedente se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será evidente sin dificultad para aquéllos expertos en el arte, en vista de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin alejarse del espíritu o del alcance de la invención.
P04/057-APÍ

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal o porción de enlace de antígeno del mismo, que se liga de manera específica a CD40 humano y lo activa, en donde dicho anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende: a) una cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos de una CDRl de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada, en donde dichas secuencias de aminoácidos de la CDRl de cadena pesada y de la CDR2 de cadena pesada se seleccionan de manera independiente entre una CDRl y una CDR2 de una región variable de cadena pesada, respectivamente, en donde la secuencia de dicha región variable de cadena pesada comprende no más de 18 cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de línea germinal VH 3-30+, 4-59, 1 -02, 4.35 ó 3-30.3 , en donde dicha secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada es de una CDR3 de una región variable de cadena pesada, en donde dicha región variable de cadena pesada se selecciona entre el grupo que consiste en i) una región variable de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en 3.1.1 , 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 1 5.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 22.1.1H-C109A, 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1H-D16E, 23.29.1 y 24.2.1 ; ii) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 y 98 y P0 /057-APf iii) una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótido seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41 , 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91 , 95 y 97; y en donde la secuencia de aminoácidos de dicha CDR3 de cadena pesada puede tener hasta dos sustitutos de aminoácidos conservadores y/o dos inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos no conservadoras de la misma; o b) una cadena liviana que comprende secuencias de aminoácidos de una CDRl de cadena liviana, una CDR2 de cadena liviana y una CDR3 de cadena liviana, de una región variable de cadena liviana; en donde dichas secuencias de aminoácidos de la CDRl de cadena liviana y de la CDR3 de cadena liviana se seleccionan de manera independiente entre una CDRl y una CDR3 de una región variable de cadena liviana, respectivamente, en donde la región variable de cadena liviana comprende no más de diez cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de línea germinal Vk A3/A19, L5 ó A27; y en donde dicha secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena liviana es de una región variable de cadena liviana, en donde dicha región variable de cadena liviana se selecciona entre el grupo que consiste en i) una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en 3.1.1 , 3.1 .1L-L4M-L83V, 7.1 .2, 10.8.3, 1 5.1 .1 , 21.4.1, 21 .2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1L-C92A, 23.29.1 y 24.2.1 ; P0 /057-APf en donde dicha secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena liviana es de una región variable de cadena liviana, en donde dicha región variable de cadena liviana se selecciona entre el grupo que consiste en i) una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en 3.1.1 , 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1 .2, 10.8.3, 15.1.1 , 2 1.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1 , 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 y 24.2.1 ; ii) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76 y 84, ó una región variable de cadena liviana q ue c omprende u na secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cadena liviana seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 94 y 100, ó dicha secuencia de aminoácidos que carece de una secuencia de señal; y iii) una región variable de cadena liviana codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 3, 1 1 , 19, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75 y 83, ó una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de cadena liviana seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 93 y 99, ó dicha región variable de cadena liviana codificada que carece de una secuencia de señal; en donde la secuencia de aminoácidos de dicha CDR2 de cadena liviana puede tener hasta dos sustitutos de aminoácidos conservadores y/o dos inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos no conservadoras de la misma. 2. El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde P04/057-APf iii) una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo formado por SEC ID NO: 1 , 9, 17, 25, 33, 41 , 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 91 , 95 y 97; o (b) las secuencias de aminoácidos de dicha CDRl de cadena liviana y de dicha CDR3 de cadena liviana se seleccionan, de manera independiente, de CDRl y CDR3 de una región variable de cadena liviana, donde dicha región variable de cadena liviana se selecciona del grupo formado por: i) una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo formado por: 3.1.1. 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1 .2, 10.8.3, 1 5.1.1 , 21.4.1 , 21.2.1 , 22.1.1 , 23.5.1 , 23.25.1 , 23.28.1 , 23.28.1.1L-C92A, 23.29. 1 y 24.2.1 ; ii) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEC ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 y 100; y iii) una región variable de cadena liviana codificada por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo formado por SEC ID NO. 3, 1 1 , 1 9, 27, 35, 43, 51 , 59, 67, 75, 83, 93 y 99. 3. El anticuerpo o porción de enlace de antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, y donde las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 de dicha cadena pesada y la CDRl , CDR2 y CDR3 de dicha cadena liviana se seleccionan del grupo formado por: (a) las secuencias de aminoácidos CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 2 y las secuencias de aminoácido CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 4, P0 O57-APf (b) las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 2 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 94; (c) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 90 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 4; (d) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC E) NO: 90 y las secuencias de aminoácido del CDR27 CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 94; (e) las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 92 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 4; (f) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 92 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 94; (g) las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 10 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 12; (h) las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 18 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO 20, (i) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 26 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 28, Ü) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 34 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 36; (k) las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 42 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 44; (I) las secuencias de aminoácido de CDRl , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 50 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 52; PO 057-APÍ (m) las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 96 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO. 52; (n) las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 58 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 60; (o) las secuencias de aminoácido de CDR1 , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 66 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO. 68, (p) las secuencias de aminoácido de CDR1 , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 66 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 100; (q) las secuencias de aminoácido de CDR1 , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 98 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 68, (r) las secuencias de aminoácido de CDR1 , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 98 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 100; (s) las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO. 74 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 78; y (t) las secuencias de aminoácido de CDR1 , CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 82 y las secuencias de aminoácido del CDR2, CDR2 y CDR3 del SEC ID NO: 84. 4. El anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, y donde las secuencias de aminoácido de la cadena pesada y la cadena liviana se seleccionan del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 3.1.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; P0 057-APf (b) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 7.1.2, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (c) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 10.8.3, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (d) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 15.1.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (e) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 21.4.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (f) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 21.2.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (g) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 22.2.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (h) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 22.1.1H-C109A, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; P04057-APÍ (i) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.5.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (j) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.25.1 , ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (k) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.28.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (1) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.28.1 L-C92A, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (m) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.28.1H-D16E, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (n) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.29.1, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (o) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 24.2.1 , ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; P04O57-APÍ (p) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 3.1.1H-A78T, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal, (q) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 3.1.1 H-A78T-V88 A-V97A, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (r) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 3.1.1L-L4M-L83V, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (s) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (t) la secuencia de aminoácido de la cadena pesada y la secuencia de aminoácido de la cadena liviana de 23.29.1L-R174K, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal. 5. El anticuerpo o porción de enlace de antígeno de acuerdo con la Reivindicación 1 , donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, y donde las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena pesada de dicha región de cadena pesada y cadena liviana de dicha cadena liviana se seleccionan del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 2 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 4; PO4057-AR (b) la secuencia de aminoácido del SEC ED NO: 2 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 94; (c) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 90 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 4; (d) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 90 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 94; (e) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 92 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 4; (f) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 92 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 94, (g) la secuencia de aminoácido del SEC ED NO: 10 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO. 12, (h) la secuencia de aminoácido del SEC ) NO: 18 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 20; (i) la secuencia de aminoácido del SEC ED NO: 26 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 28; 0) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 34 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 36, (k) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 42 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 44; (1) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 50 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 52; P0 057-APf (m) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 96 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 52; (n) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 58 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 60; (o) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO. 66 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 68, (p) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 66 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 100; (q) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 98 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 68; (r) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 98 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 100; (s) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 74 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 78, (t) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 82 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 84. 6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o porción del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, y 5 o el anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4 y un portador farmacéuticamente aceptable. 7. El uso de un anticuerpo y una porción de enlace de antígeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 y 5 o el anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4 para la fabricación de un medicamento. PCW057-APf 8. El uso de un anticuerpo o porción de enlace de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 y 5, o el anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4 para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en humanos que necesitan dicho tratamiento, o para aumentar la respuesta inmunológica en un humano que lo necesita. 9. Una línea celular aislada que produce el anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 y 5, o el anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4 o la cadena pesada o la cadena liviana de dicho anticuerpo o de dicha porción del mismo. 10. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la cadena pesada o la porción de enlace de antígeno del mismo del anticuerpo o la porción de enlace de antígeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 y 5 o el anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 4. 1 1 . La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la Reivindicación 10, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido de cadena pesada o una porción de enlace de antígeno de la misma del anticuerpo seleccionado del grupo formado por: 3.1.1, 3.1 .1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1 2, 10.8.3, 15. 1 .1 , 21.4.1. 21.2.1. 22.1.1 , 22.1.1 H-Cl 09 A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1 , 23.28.1 L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1L-Rl 74K y 24.2.1 , ó dicha secuencia de aminoácido sin la secuencia de señal, P04¿O57-APf (b) una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido de cadena liviana o una porción de enlace de antígeno de la misma del anticuerpo seleccionado del grupo formado por: 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109 A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1 , 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 , 23.29.1L-R174K y 24.2.1, ó dicha secuencia de aminoácido sin la secuencia de señal; (c) una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo formado por SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 46, 48, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 92, 94, 96, 98, 100 y 102, o dicha secuencia de aminoácido sin una secuencia de señal si es que está presente; y (d) una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo formado por SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99 y 101 o dicha secuencia si una secuencia de señal si es que está presente. 12. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 , en donde el vector opcionalmente comprende una secuencia de control de expresión funcionalmente ligada a la molécula de ácido nucleico. 13. Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 12, ó la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1. P04/057-APf 14. Un método de elaboración de un anticuerpo anti-CD40 o porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 13 ó la línea celular de acuerdo con la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas, y recuperar dicho anticuerpo o porción de enlace de antígeno. 15. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a y activa la CD40 humana, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, y donde las secuencias de aminoácido de la cadena pesada y la cadena liviana se seleccionan del grupo formado por: (a) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 6 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 8, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (b) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 14 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 16, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (c) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 22 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 24, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (d) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 30 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 32, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (e) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 38 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO. 40, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (í) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 46 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 48, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (g) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 54 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 56, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; P04/057-APf (h) la secuencia de aminoácido del SEC ED NO: 62 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 64, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (i) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 70 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 72, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (j) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO. 78 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 80, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal; (k) la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 86 y la secuencia de aminoácido del SEC ID NO: 88, ambas secuencias de aminoácido sin una secuencia de señal. 16. El uso de un anticuerpo que se enlaza específicamente a y activa la CD40 humana para la fabricación de un medicamento para tratar un tumor CD40 negativo. 17. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a y activa CD40 humana, donde dicho anticuerpo comprende: (a) una secuencia de aminoácido como se determina en SEC ID NO: 6 sin la secuencia de señal, donde el residuo 78 de la secuencia madura fue cambiado de alanina a treonina, el residuo 88 de la secuencia madura fue cambiado de valina a alanina y el residuo 97 de la secuencia madura fue cambiando de valina a alanina; y (b) la secuencia de aminoácido como se determina en SEC ID NO: 8 sin la secuencia de señal, donde el residuo 4 de la secuencia madura fue cambiando de leucina a metionina y el residuo 83 de la secuencia madura fue cambiado de leucina a valina. 18. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a y activa CD40 humana, donde dicho anticuerpo comprende: (a) la secuencia de aminoácido como se determina en SEC ID NO: 46 sin la secuencia de señal, y P04/057-APf (b) la secuencia de aminoácido como se determina en SEC ED NO; 48 sin la secuencia de señal. P04057-APf
MXPA04004467A 2001-11-09 2002-11-08 Anticuerpos para cd40. MXPA04004467A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34898001P 2001-11-09 2001-11-09
PCT/US2002/036107 WO2003040170A2 (en) 2001-11-09 2002-11-08 Antibodies to cd40

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA04004467A true MXPA04004467A (es) 2005-05-16

Family

ID=23370387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA04004467A MXPA04004467A (es) 2001-11-09 2002-11-08 Anticuerpos para cd40.

Country Status (46)

Country Link
US (9) US7288251B2 (es)
EP (2) EP1476185B1 (es)
JP (3) JP4616555B2 (es)
KR (1) KR100830086B1 (es)
CN (2) CN1582165B (es)
AP (1) AP1918A (es)
AR (1) AR039067A1 (es)
AU (1) AU2002356926B2 (es)
BR (1) BRPI0214137B8 (es)
CA (1) CA2466128C (es)
CL (1) CL2009001779A1 (es)
CR (2) CR7343A (es)
CU (1) CU23745A3 (es)
CY (1) CY1115675T1 (es)
DK (1) DK1476185T3 (es)
DO (1) DOP2002000507A (es)
EA (1) EA011449B1 (es)
EC (1) ECSP045093A (es)
EG (1) EG25801A (es)
ES (1) ES2432968T3 (es)
GE (1) GEP20074222B (es)
GT (1) GT200200228A (es)
HN (1) HN2002000318A (es)
HR (1) HRP20040525B1 (es)
HU (1) HU229829B1 (es)
IL (2) IL161823A0 (es)
IS (1) IS2940B (es)
MA (1) MA27139A1 (es)
ME (1) ME00503B (es)
MX (1) MXPA04004467A (es)
MY (1) MY137641A (es)
NI (1) NI200200128A (es)
NO (1) NO334339B1 (es)
NZ (1) NZ533180A (es)
OA (1) OA12725A (es)
PA (1) PA8557701A1 (es)
PE (1) PE20030846A1 (es)
PL (2) PL214634B1 (es)
PT (1) PT1476185E (es)
RS (1) RS52484B (es)
SI (1) SI1476185T1 (es)
TN (1) TNSN04078A1 (es)
TW (2) TWI331040B (es)
UY (1) UY27537A1 (es)
WO (1) WO2003040170A2 (es)
ZA (1) ZA200404207B (es)

Families Citing this family (267)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US7244827B2 (en) * 2000-04-12 2007-07-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer
US20050255106A1 (en) * 1999-05-22 2005-11-17 Linda Diehl Induction of anti-tumor ctl immunity through in vivo triggering of 4-1bb and/or cd40
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
AU8886601A (en) 2000-09-07 2002-03-22 John R Schreiber Human antibodies against pseudomonas aeruginosa lps derived from transgenic xenomouse
EP2009027B1 (en) 2001-04-27 2014-05-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-CD40 monoclonal antibody
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2003045318A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 Celltech R & D, Inc. Manipulation of cytokine levels using cd83 gene products
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
EP2380633A1 (en) * 2002-06-07 2011-10-26 ZymoGenetics, Inc. Use of IL-21 in cancer
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
CA2762955A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-28 Imclone Llc Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof
US8277810B2 (en) * 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
EP1694360B1 (en) * 2003-11-04 2010-08-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection
US20090041659A1 (en) 2003-12-05 2009-02-12 Schreiber John R Human anti-pseudomonas-aeruginosa antibodies derived from transgenic xenomouse
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
PL1707627T3 (pl) 2003-12-25 2013-04-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Mutant antagonistycznego przeciwciała anty-CD40
DE602005026779D1 (de) 2004-01-09 2011-04-21 Pfizer ANTIKÖRPER GEGEN MAdCAM
JP2007530588A (ja) 2004-03-23 2007-11-01 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド レセプターカップリング剤およびその治療用途
US20060099203A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Pease Larry R B7-DC binding antibody
EP1768999B1 (en) * 2004-06-30 2013-06-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research sHIgM12 antibody useful to treat multiple sclerosis
EP2287195B1 (en) 2004-07-01 2019-05-15 Novo Nordisk A/S Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
WO2006017574A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
PT1836225E (pt) 2005-01-06 2012-01-10 Novo Nordisk As Agentes de ligação a kir e métodos de utilização dos mesmos
JP4986633B2 (ja) 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
JP5225069B2 (ja) * 2005-03-23 2013-07-03 ゲンマブ エー／エス 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
EP2444421A1 (en) 2005-04-26 2012-04-25 Pfizer Inc. P-Cadherin antibodies
EP1894012A2 (en) * 2005-05-18 2008-03-05 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling
CA2608750A1 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
GB0512225D0 (en) * 2005-06-16 2005-07-27 Univ Sheffield Immunoglobulin molecules
WO2007011968A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
CN101517068B (zh) 2005-09-07 2017-02-08 安进弗里蒙特公司 活化素受体样激酶‑1的人单克隆抗体
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
WO2007130493A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Regents Of The University Of Colorado Cd40 agonist antibody/type1 interferon synergistic adjuvant combination, conjugates containing and use thereof as a therapeutic to enhance cellular immunity
MX2008013990A (es) 2006-05-09 2009-01-29 Pfizer Prod Inc Derivados de cicloalquilamino acidos.
EP1854810A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
US9234174B2 (en) * 2006-05-12 2016-01-12 Ospedale San Raffaele S.R.L. Tolerogenic dendritic cells, method for their production and uses therof
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
CA2672581A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
DK2426144T3 (en) * 2007-02-23 2019-01-07 Merck Sharp & Dohme Manipulated Anti-IL-23P19 Antibodies
CA2678863A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Schering Corporation Engineered anti-il-23p19 antibodies
EP2708557A1 (en) 2007-05-30 2014-03-19 Xencor, Inc. Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8039597B2 (en) * 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
CA2704499C (en) 2007-11-07 2020-03-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for assessing responsiveness of b-cell lymphoma to treatment with anti-cd40 antibodies
PT2594590E (pt) 2007-12-14 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
ATE542813T1 (de) 2008-08-06 2012-02-15 Pfizer 6-substituierte 2- heterocyclylaminopyrazinverbindungen als chk-1- inhibitoren
CA2735421A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Delivery of a cd40 agonist to a tumor draining lymph node of a subject
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
WO2010111018A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-30 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to 24p4c12 proteins
ES2622228T3 (es) 2009-03-10 2017-07-06 Baylor Research Institute Vacunas antivíricas dirigidas a células presentadoras de antígenos
EP3219732A1 (en) * 2009-03-10 2017-09-20 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted cancer vaccines
CA2754862C (en) 2009-03-10 2019-04-02 Baylor Research Institute Anti-cd40 antibodies and uses thereof
CN102459639A (zh) 2009-04-18 2012-05-16 健泰科生物技术公司 用于评估b细胞淋巴瘤对抗cd40抗体治疗的响应性的方法
HUE028537T2 (en) 2009-04-20 2016-12-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Built-in amino acid mutation IgG2 antibody
TW201138843A (en) 2009-12-18 2011-11-16 Colgate Palmolive Co Biguanide preservation of precipitated calcium carbonate
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
EP2552965A2 (en) 2010-03-31 2013-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-cd40 antibodies
GB201006096D0 (en) * 2010-04-13 2010-05-26 Alligator Bioscience Ab Novel compositions and uses thereof
FR2959994B1 (fr) * 2010-05-12 2012-08-24 Lfb Biotechnologies Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii
MY177065A (en) 2010-09-09 2020-09-03 Pfizer 4-1bb binding molecules
AU2011310887A1 (en) * 2010-09-29 2013-05-02 Universite De Liege Combination of an agonistic anti-CD40 monoclonal antibody or a CD40 ligand and inactivated or attenuated bacteria for use in the treatment and/or prevention of mastitis
AR083847A1 (es) * 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
JP2014500879A (ja) * 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
PL2663580T3 (pl) * 2011-01-10 2017-08-31 Ct Atlantic Ltd. Terapia skojarzona obejmująca przeciwciała wiążące antygen związany z nowotworem
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
FI3556774T3 (fi) 2011-03-11 2024-03-15 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anti-cd40-vasta-aineita ja niiden käyttötapoja
ES2724801T3 (es) 2011-04-19 2019-09-16 Pfizer Combinaciones de anticuerpos anti-4-1BB y anticuerpos inductores de ADCC para el tratamiento del cáncer
CA2833785C (en) * 2011-04-21 2022-06-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
ES2664619T3 (es) 2011-04-21 2018-04-20 Bristol-Myers Squibb Company Polipéptidos de anticuerpos que antagonizan CD40
US8778345B2 (en) * 2011-04-29 2014-07-15 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies
JP6400470B2 (ja) 2011-05-16 2018-10-03 ジェネロン（シャンハイ）コーポレイション リミテッド 多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質および使用法
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
MY173865A (en) 2011-09-22 2020-02-25 Amgen Inc Cd27l antigen binding proteins
SG10201603411WA (en) 2011-10-28 2016-07-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013091661A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Aarhus Universitet Proteolytic resistant protein affinity tag
WO2013116296A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-asic1 antibodies and uses thereof
AR090263A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
US20150064203A1 (en) 2012-03-08 2015-03-05 Japan Science And Technology Agency Anticancer agent
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
KR102125658B1 (ko) 2012-05-04 2020-06-22 화이자 인코포레이티드 전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법
EP3882337A1 (en) 2012-06-18 2021-09-22 Ospedale San Raffaele S.r.l. Compositions and methods for diminishing an immune response
WO2014070934A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
DK2951208T3 (da) * 2013-02-01 2020-01-13 Kira Biotech Pty Ltd Anti-cd83 antistoffer og anvendelse deraf
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
EP2976361B1 (en) 2013-03-18 2018-07-18 BiocerOX Products B.V. Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
BR112015027313A2 (pt) 2013-04-29 2017-09-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd anticorpos anti-cd38 e fusões ao interferon alfa-2b atenuado
EP3777870A1 (en) 2013-06-14 2021-02-17 Psioxus Therapeutics Limited A dosing regime and formulations for type b adenoviruses
CN105308471B (zh) 2013-06-17 2018-12-18 皇家飞利浦有限公司 磁共振成像对象支撑物
GB201311487D0 (en) * 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
HUE057598T2 (hu) 2013-08-08 2022-05-28 Cytune Pharma IL-15 és IL-15R-alfa sushi domén alapú modulokinek
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
PL3021859T3 (pl) 2013-10-25 2018-06-29 Psioxus Therapeutics Limited Adenowirusy onkolityczne wyposażone w geny heterolityczne
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
AU2014368695A1 (en) * 2013-12-20 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with an anti-ANG2 antibody and a CD40 agonist
US10286058B2 (en) 2014-01-13 2019-05-14 Baylor Research Institute Vaccines against HPV and HPV-related diseases
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
MX375800B (es) * 2014-04-30 2025-03-06 Max Delbrueck Centrum Fuer Molekulare Medizin Helmholtz Gemeinschaft Anticuerpos humanizados contra cd269 (bcma).
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EP3143404B1 (en) 2014-05-16 2018-08-29 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
GB201413665D0 (en) 2014-07-03 2014-09-17 Transimmune Ag And Yale University Method for obtaining globally activated monocytes
EP3180087B1 (en) 2014-08-12 2019-03-13 Alligator Bioscience AB Combination therapies with anti cd40 antibodies
EP3070102A1 (en) 2015-03-18 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of antibodies human cd40 activating antibodies and anti human pld-1 antibodies
AU2015303239A1 (en) * 2014-08-14 2016-12-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of antibodies activating human CD40 and antibodies against human PD-L1
TW201620938A (zh) 2014-09-15 2016-06-16 安美基公司 雙特異性抗cgrp受體/pac1受體抗原結合蛋白質及其用途
NZ731491A (en) 2014-10-23 2021-12-24 Kira Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
KR102639037B1 (ko) 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
SG10201913099YA (en) * 2014-10-29 2020-02-27 Seattle Genetics Inc Dosage and administration of non-fucosylated anti-cd40 antibodies
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
PT3283527T (pt) 2015-04-13 2021-03-03 Five Prime Therapeutics Inc Terapêutica de combinação para o cancro
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
PT3288573T (pt) 2015-04-30 2020-03-25 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovírus oncolítico que codifica uma proteína b7
DK3313879T3 (da) 2015-06-24 2022-03-14 Hoffmann La Roche Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet
KR20180021833A (ko) * 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
HK1252666A1 (zh) * 2015-06-29 2019-05-31 Bristol-Myers Squibb Company 针对cd40的抗体
AU2016291817A1 (en) 2015-07-16 2018-02-22 Biolinerx Ltd. Compositions and methods for treating cancer
HUE056769T2 (hu) * 2015-09-04 2022-03-28 Primatope Therapeutics Inc Humanizált anti-CD40 antitestek és felhasználásuk
BR112018006360A2 (pt) * 2015-09-30 2018-10-09 Janssen Biotech Inc anticorpos agonísticos que se ligam especificamente ao cd40 humano e métodos de uso
EP3356406A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
LT3370768T (lt) 2015-11-03 2022-05-25 Janssen Biotech, Inc. Antikūnai, specifiškai surišantys pd-1, ir jų panaudojimas
EP3757117A1 (en) * 2015-11-16 2020-12-30 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
WO2017100305A2 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Composition of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
WO2017103291A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Psioxus Therapeutics Limited Virus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment
US10894835B2 (en) * 2016-03-04 2021-01-19 The Rockefeller University Antibodies to CD40 with enhanced agonist activity
EP3426271B1 (en) 2016-03-10 2025-08-27 CG Oncology, Inc. Methods of treating solid tumors by combination therapy
CA3017776A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
CN109843919A (zh) 2016-03-25 2019-06-04 西雅图基因公司 用于制备聚乙二醇化的药物-接头及其中间体的方法
SI3464361T1 (sl) 2016-05-27 2022-01-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
BR112018074453A2 (pt) 2016-05-27 2019-03-19 Abbvie Biotherapeutics Inc. proteínas de ligação biespecíficas ligando uma protéina imunomoduladora e um antígeno tumoral
JP2019528082A (ja) 2016-06-08 2019-10-10 シャンハイ ジャオ トン ユニバーシティ スクール オブ メディシン アゴニスト抗体の活性を増強する抗体重鎖定常領域配列
EP3468997B1 (en) 2016-06-08 2023-09-13 Xencor, Inc. Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
SG11201810509PA (en) 2016-06-20 2018-12-28 Kymab Ltd Anti-pd-l1 antibodies
EP3484922A1 (en) 2016-07-14 2019-05-22 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
US11618784B2 (en) 2016-07-19 2023-04-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD47 combination therapy
US20180044430A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. FC Engineered Anti-TNFR Superfamily Member Antibodies Having Enhanced Atonistic Activity and Methods of Using Them
US10669344B2 (en) 2016-08-12 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other Fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
CN109790220A (zh) 2016-08-25 2019-05-21 豪夫迈·罗氏有限公司 与巨噬细胞激活剂组合的抗csf-1r抗体的间歇给药
IL264902B2 (en) 2016-08-29 2023-11-01 Akamis Bio Ltd Adenovirus with bispecific T cell activator
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
US11905331B2 (en) 2016-11-11 2024-02-20 Kumho Ht, Inc. Antibody binding specifically to CD40 and use thereof
JP2020504105A (ja) 2016-12-19 2020-02-06 グレンマーク・ファーマシューティカルズ・エスエー 新規なｔｎｆｒアゴニストおよびその使用
EP3558360A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
US10537637B2 (en) 2017-01-05 2020-01-21 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
EP3576782A4 (en) * 2017-02-02 2020-12-30 Silverback Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS OF RECOMBINATION PRODUCT-PEPTIDE AND THEIR METHODS OF USE
CN110945021B (zh) 2017-02-10 2025-09-12 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
US12503700B2 (en) 2017-03-14 2025-12-23 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN110430901B (zh) 2017-03-24 2024-08-16 西雅图基因公司 制备葡糖苷酸药物-接头及其中间体的方法
EP3601348A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 Glycotope GmbH Humanized anti-cd40 antibodies
WO2018180914A1 (ja) 2017-03-30 2018-10-04 日油株式会社 自壊性アセタールリンカーを有する親水性ポリマー誘導体及びそれを用いた複合体
CN110475802B (zh) 2017-03-30 2022-03-08 日油株式会社 异双官能性单分散聚乙二醇以及使用该异双官能性单分散聚乙二醇的缀合物
EP3606956B1 (en) 2017-04-04 2024-07-31 F. Hoffmann-La Roche AG Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
AU2018250875A1 (en) 2017-04-13 2019-10-03 F. Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a CD40 agonist, and optionally a PD-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
BR112019025048A2 (pt) * 2017-06-01 2020-06-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso médico dos mesmos
LT3630143T (lt) * 2017-06-01 2023-09-25 Akamis Bio Limited Onkolitinis virusas ir būdas
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
CN110506058A (zh) * 2017-06-02 2019-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫激动剂的施用路径
EA202090286A1 (ru) 2017-07-14 2020-05-12 Пфайзер, Инк. АНТИТЕЛА К MAdCAM
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
SG11202002366VA (en) * 2017-09-19 2020-04-29 Mab Discovery Gmbh Agonistic cd40 antibodies
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
CN111344307B (zh) 2017-11-08 2025-01-14 协和麒麟株式会社 与CD40和EpCAM结合的双特异性抗体
CN111788227B (zh) 2017-12-27 2025-02-25 百时美施贵宝公司 抗cd40抗体及其用途
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
CN109971723B (zh) * 2017-12-28 2023-07-07 上海细胞治疗研究院 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
CA3093645A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Nof Corporation Heterobifunctional compound having monodispersed polyethylene glycol in main chain and side chain
US12325737B2 (en) 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
KR20200139720A (ko) 2018-04-02 2020-12-14 암젠 인크 에레누맙 조성물 및 이의 용도
CA3097007A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2019217833A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
WO2019232533A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Combination treatments of hsp90 inhibitors for enhancing tumor immunogenicity and methods of use thereof
US20210251994A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
JP2021529556A (ja) 2018-06-29 2021-11-04 ジェンサン バイオファーマ、 インコーポレイテッドＧｅｎｓｕｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ． 抗腫瘍アンタゴニスト
EP3841121A2 (en) 2018-08-20 2021-06-30 Pfizer Inc. Anti-gdf15 antibodies, compositions and methods of use
CN112867735B (zh) 2018-09-07 2025-05-09 埃泰美德(香港)有限公司 双特异性抗原结合蛋白及其用途
WO2020070288A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
TW202039558A (zh) 2018-11-30 2020-11-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗ｃｄ４０抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CA3121291A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Cd40 antibody pharmaceutical composition and use thereof
CN113677365A (zh) * 2019-01-22 2021-11-19 瑞伟生物科技公司(美国) 新型抗cd40抗体
US10570210B1 (en) 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
EP3947454A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Recombinant proteins with cd40 activating properties
WO2020207470A1 (zh) 2019-04-10 2020-10-15 南开大学 抗cd40抗体及其用途
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
EP3971293A4 (en) 2019-05-15 2023-02-08 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO CD40 AND GPC3
TW202108626A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及fap結合之雙專一性抗體
CN114340735B (zh) 2019-06-28 2024-11-12 璟尚生物制药公司 突变的TGFβ1-RII胞外域和免疫球蛋白支架组成的抗肿瘤拮抗剂
US20220370418A1 (en) 2019-09-09 2022-11-24 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
US20220362397A1 (en) 2019-09-26 2022-11-17 Nof Corporation Heterobifunctional monodispersed polyethylene glycol having peptide linker
CN114450593A (zh) 2019-09-26 2022-05-06 美国安进公司 产生抗体组合物的方法
CA3163358A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins and uses thereof
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
UY38995A (es) 2019-12-20 2021-06-30 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecíficos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores sólidos
AR121013A1 (es) * 2020-01-10 2022-04-06 Symphogen As Anticuerpos anti-cd40 y composiciones
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multispecific antibodies for use in treating diseases
US20230210967A1 (en) 2020-04-23 2023-07-06 Brightpath Biotherapeutics Co., Ltd. Improved peptide vaccine
CA3177717A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
JP2023528204A (ja) 2020-05-14 2023-07-04 モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト 多選択性タンパク質
US20240279309A1 (en) 2020-05-14 2024-08-22 Molecular Partners Ag Recombinant cd40 binding proteins and their use
WO2021239838A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) polypeptides and uses thereof for vaccine purposes
GB202008003D0 (en) * 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
AU2021283455A1 (en) * 2020-06-04 2023-01-19 Selvax Pty Ltd Agonist anti-CD40 antibodies
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
US20230348609A1 (en) * 2020-08-21 2023-11-02 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Cd40 agonistic antibody and method of use
JP2023548767A (ja) 2020-10-15 2023-11-21 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体製造方法における相対不対グリカン
CA3200878A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes
CA3205280A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Chlamydia vaccine based on targeting momp vs4 antigen to antigen presenting cells
WO2022147481A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma Inc. Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen
KR20230142724A (ko) * 2021-01-08 2023-10-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 인자 XIa 억제제에 대한 항체 및 항원 결합 펩티드및 그의 용도
US20240173442A1 (en) 2021-01-13 2024-05-30 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy
CA3206549A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Frederick G. Vogt Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
MX2023008986A (es) 2021-01-29 2023-08-15 Inst Nat Sante Rech Med Polipeptidos antigenicos de chlamydia trachomatis y usos de los mismos con fines de vacuna.
WO2022178218A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Mevion Medical Systems, Inc. Gantry for a particle therapy system
IL305681A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Genmab As Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in therapy
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
JP2024523514A (ja) * 2021-06-28 2024-06-28 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合断片及び医薬用途
CA3224374A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
CN118234749A (zh) * 2021-09-17 2024-06-21 诺华股份有限公司 用于预防异种移植中的移植物排斥的方法
EP4408537A1 (en) * 2021-10-01 2024-08-07 MAB Discovery GmbH Agonistic cd40 antibodies as immune stimulatory agents
US20250076309A1 (en) 2021-10-05 2025-03-06 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US12234294B2 (en) 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
JP2024540505A (ja) 2021-11-17 2024-10-31 アンスティチュート、ナシオナル、ドゥ、ラ、サンテ、エ、ドゥ、ラ、ルシェルシュ、メディカル ユニバーサルサルベコウイルスワクチン
JP2025504908A (ja) 2022-01-28 2025-02-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド サイトカイン関連腫瘍浸潤リンパ球組成物及び方法
EP4490196A2 (en) * 2022-03-07 2025-01-15 Agenus Inc. Anti-ilt2 antibodies and uses thereof
WO2023193239A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Peter Peizhi Luo Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof
US20250249278A1 (en) 2022-04-14 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CA3257929A1 (en) 2022-05-31 2025-04-22 Futuregen Biopharmaceutical (Beijing) Co., Ltd. Anti-CD40 antibodies, bispecific anti-PD-L1×CD40 antibodies, and their use
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
AU2023347072A1 (en) * 2022-09-20 2025-01-02 Currus Biologics Pty Ltd Bispecific polypeptides and uses thereof
EP4598576A1 (en) * 2022-10-04 2025-08-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
EP4598953A1 (en) 2022-10-05 2025-08-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dc-targeting vaccine against nipah virus infection
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
JP2025541738A (ja) 2022-12-01 2025-12-23 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア 抗ｐｄ１ａｂと化学療法での併用療法におけるｃｄ４０およびｃｄ１３７に対する多重特異性抗体
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116375870B (zh) * 2022-12-30 2023-09-15 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人cd40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024213635A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins for use for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025250159A2 (en) * 2023-08-24 2025-12-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York N-linked glycan removal mutant antibodies and their use against influenza viruses
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN120424223A (zh) * 2024-02-04 2025-08-05 苏州泽璟生物制药股份有限公司 包含lrrc15抗原结合结构域的多特异性抗体
WO2025245964A1 (zh) * 2024-05-28 2025-12-04 中生康元生物科技(北京)有限公司 一种树突状细胞制剂及其制备方法

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US59427A (en) * 1866-11-06 Improvement in fences
US142358A (en) * 1873-09-02 Improvement in the purification of illuminating-gas
US439216A (en) * 1890-10-28 Maker
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
US5416367A (en) * 1991-03-06 1995-05-16 Quicklogic Corporation Programmable application specific integrated circuit and logic cell therefor
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
JPH05242071A (ja) * 1991-11-20 1993-09-21 Mitsubishi Electric Corp 対象システムを制御または決定・推定する方法、およびその装置
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
EP0652950B1 (en) 1992-07-24 2007-12-19 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
CA2172376C (en) 1993-10-01 2008-11-18 William C. Fanslow, Iii Antibodies to cd40
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
DK0751781T3 (da) * 1993-12-23 2004-08-09 Immunex Corp Anvendelse af monoklonale antistoffer eller oplöselige oligomere ligander til fremstillingen af et medikament til forebyggelse eller behandling af neoplastiske sygdomme
US5612126A (en) * 1994-01-19 1997-03-18 Burlington Industries, Inc. Stiff fabric and method of forming the stiff fabric
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
JPH0812700A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
GB9425060D0 (en) * 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
JPH11503360A (ja) * 1995-04-11 1999-03-26 ローベルト ボツシユ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング 燃焼排ガス中の有害物質、特に窒素酸化物を減少させる方法および装置
US5861510A (en) 1995-04-20 1999-01-19 Pfizer Inc Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as MMP and TNF inhibitors
CA2218489A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Aya Jakobovits Generation of large genomic dna deletions
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5780215A (en) * 1995-07-26 1998-07-14 Konica Corporation Silver halide color photographic light-sensitive material
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DE69624081T2 (de) 1995-12-20 2003-06-12 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Matrix-metalloprotease Inhibitoren
ES2169355T3 (es) 1996-03-05 2002-07-01 Astrazeneca Ab Derivados de 4-anilinoquinazolina.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ES2191187T3 (es) 1996-07-13 2003-09-01 Glaxo Group Ltd Compuestos heteroaromaticos biciclicos como inhibidores de la proteina tirosin-quinasa.
EP0912559B1 (en) 1996-07-13 2002-11-06 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
EA199900036A1 (ru) 1996-07-18 1999-06-24 Пфайзер Инк Ингибиторы металлопротеаз матрикса на основе фосфинатов, фармацевтическая композиция, способ лечения
PL331895A1 (en) 1996-08-23 1999-08-16 Pfizer Arylosulphonylamino derivatives of hydroxamic acid
US5817690A (en) * 1996-08-27 1998-10-06 American Home Products Corporation 4-aminoethoxy indolone derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
DK0950059T3 (da) 1997-01-06 2004-11-01 Pfizer Cycliske sulfonderivater
ATE248812T1 (de) 1997-02-03 2003-09-15 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylhydroxamsäurederivate
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
PL334997A1 (en) 1997-02-11 2000-03-27 Pfizer Derivatives or arylosulphonyl-hydroxamic acid
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998054093A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
BR9811868A (pt) 1997-08-08 2000-08-15 Pfizer Prod Inc Derivados de ácido ariloxiarilsulfonilamino hidroxâmico
US6294532B1 (en) 1997-08-22 2001-09-25 Zeneca Limited Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
EP1017682A4 (en) 1997-09-26 2000-11-08 Merck & Co Inc NEW ANGIOGENESIS INHIBITORS
CN1280580A (zh) 1997-11-11 2001-01-17 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
WO1999061057A2 (en) * 1998-05-23 1999-12-02 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
HUP0103617A2 (hu) 1998-05-29 2002-02-28 Sugen, Inc. Protein kinázt gátló, pirrolilcsoporttal helyettesített 2-indolszármazékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint e vegyületek alkalmazása
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ES2213985T3 (es) 1998-11-05 2004-09-01 Pfizer Products Inc. Derivados de hidroxiamida de acido 5-oxo-pirrolidin-2-carboxilico.
CA2342967A1 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Modifying protein immunogenicity
CA2356215C (en) 1998-12-23 2015-11-24 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
EP1181050A4 (en) * 1999-04-30 2005-05-18 Jolla Inst Allergy Immunolog METHODS FOR PREVENTING THE REACTIVATION OF A LATENT VIRUS AND CONTROLLING ITS REPLICATION
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6482411B1 (en) * 1999-08-27 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of reducing bone loss with CD40 ligand
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
EP1975182A1 (en) * 2000-02-01 2008-10-01 PanGenetics B.V. CD40-binding APC-activating molecules
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
AU2001259215A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
SV2007000775A (es) 2001-01-05 2007-03-15 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
DE602005026779D1 (de) 2004-01-09 2011-04-21 Pfizer ANTIKÖRPER GEGEN MAdCAM
US9672526B2 (en) 2012-03-13 2017-06-06 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
US20030211100A1 (en) 2003-11-13
US20130024956A1 (en) 2013-01-24
EP2343086A3 (en) 2012-02-22
JP2005508176A (ja) 2005-03-31
NI200200128A (es) 2010-01-11
CR7343A (es) 2004-10-28
HRP20040525B1 (hr) 2017-06-02
EP2343086A2 (en) 2011-07-13
ME00503B (me) 2011-10-10
TWI331040B (en) 2010-10-01
AP1918A (en) 2008-11-13
US20090130715A1 (en) 2009-05-21
HU229829B1 (en) 2014-09-29
EP1476185A4 (en) 2007-04-04
HN2002000318A (es) 2003-03-10
OA12725A (en) 2006-06-28
HUP0402247A3 (en) 2012-09-28
PL392809A1 (pl) 2011-03-14
WO2003040170A9 (en) 2004-06-10
JP5547532B2 (ja) 2014-07-16
NO334339B1 (no) 2014-02-10
PL214289B1 (pl) 2013-07-31
RS52484B (sr) 2013-02-28
HRP20040525A2 (en) 2005-04-30
SI1476185T1 (sl) 2013-12-31
US20120225014A1 (en) 2012-09-06
IS2940B (is) 2016-03-15
DK1476185T3 (da) 2013-10-14
HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
AU2002356926C1 (en) 2003-05-19
US7563442B2 (en) 2009-07-21
ZA200404207B (en) 2005-08-31
GEP20074222B (en) 2007-10-25
KR20050063749A (ko) 2005-06-28
BR0214137A (pt) 2004-09-14
AU2002356926A2 (en) 2003-05-19
CN103450360A (zh) 2013-12-18
CY1115675T1 (el) 2017-01-25
EP1476185A2 (en) 2004-11-17
RS39204A (sr) 2006-12-15
BRPI0214137B8 (pt) 2021-05-25
AU2002356926B2 (en) 2007-01-04
CA2466128A1 (en) 2003-05-15
CR10878A (es) 2011-01-12
US20100098694A1 (en) 2010-04-22
PA8557701A1 (es) 2003-12-19
UY27537A1 (es) 2003-02-28
CL2009001779A1 (es) 2010-02-05
JP2013099333A (ja) 2013-05-23
TW200306204A (en) 2003-11-16
DOP2002000507A (es) 2003-05-15
US8388971B2 (en) 2013-03-05
CN1582165B (zh) 2013-05-29
IL161823A (en) 2014-02-27
TWI338579B (en) 2011-03-11
CU23745A3 (es) 2012-01-31
WO2003040170A2 (en) 2003-05-15
EG25801A (en) 2012-08-08
JP5848232B2 (ja) 2016-01-27
US20070190051A1 (en) 2007-08-16
PL214634B1 (pl) 2013-08-30
ECSP045093A (es) 2004-07-23
US7618633B2 (en) 2009-11-17
CA2466128C (en) 2013-10-29
US7338660B2 (en) 2008-03-04
MY137641A (en) 2009-02-27
MA27139A1 (fr) 2005-01-03
AP2004003034A0 (en) 2004-06-30
EA011449B1 (ru) 2009-02-27
IL161823A0 (en) 2005-11-20
US20090169563A1 (en) 2009-07-02
BRPI0214137B1 (pt) 2019-03-19
EA200400654A1 (ru) 2004-12-30
GT200200228A (es) 2008-09-26
EP1476185B1 (en) 2013-07-31
CN1582165A (zh) 2005-02-16
JP4616555B2 (ja) 2011-01-19
PT1476185E (pt) 2013-11-05
PE20030846A1 (es) 2003-10-11
US20160152713A1 (en) 2016-06-02
US7288251B2 (en) 2007-10-30
CN103450360B (zh) 2016-11-02
US7626012B2 (en) 2009-12-01
PL370514A1 (en) 2005-05-30
IS7253A (is) 2004-05-06
WO2003040170A3 (en) 2003-10-09
ES2432968T3 (es) 2013-12-05
US20060093600A1 (en) 2006-05-04
JP2010213704A (ja) 2010-09-30
AR039067A1 (es) 2005-02-09
KR100830086B1 (ko) 2008-05-20
NZ533180A (en) 2008-03-28
TW201034686A (en) 2010-10-01
HK1069122A1 (en) 2005-05-13
TNSN04078A1 (fr) 2006-06-01
NO20042388L (no) 2004-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7338660B2 (en) Methods of treating cancer and enhancing immune responses with antibodies that bind CD40
AU2002356926A1 (en) Antibodies to CD40
HK1069122B (en) Antibodies to cd40
HK1192569A (en) Antibodies to cd40

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration
GB Transfer or rights