TW202039558A - 抗ｃｄ４０抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本公開涉及抗CD40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。該抗CD40抗體、其抗原結合片段的重鏈恆定區含有突變，該突變使得抗CD40抗體喪失了其與Fc γ RIII結合的活性，同時增強了抗CD40抗體與Fc γ RIIB的結合，從而喪失了抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，但是增強了Fc γ RIIB介導的抗體交聯。重鏈恆定區中的突變導致增強了對CD40的激活，以及增強了樹突細胞對抗原的遞呈。本公開的抗CD40抗體及其抗原結合片段作為抗癌藥物具有治療CD40介導的疾病或病症的用途。
Description
本申請要求2018年11月30日提出的中國專利申請《抗CD40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途》(申請號CN201811448228.1)的優先權。
本公開涉及一種在重鏈恆定區包含突變的抗CD40抗體、其抗原結合片段、包含所述抗CD40抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體、以及包含人抗CD40抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物、及其作為抗癌藥物的用途。
癌症是當今人類社會長期面臨的最大健康挑戰。傳統的療法如手術、化療和放療在治療播散性實體腫瘤中收效甚微。腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個熱點，其中T細胞的腫瘤免疫治療又處於其核心位置。腫瘤免疫治療充分利用、調動腫瘤患者體內的殺傷性T細胞，對腫瘤進行殺傷作用。腫瘤免疫治療可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途
徑之一。腫瘤免疫療法目前對治療幾種不同類型的癌症，包括播散性轉移性腫瘤已具有很好的前景。
人體內T細胞的激活採取了雙信號通路的系統：藉由抗原遞呈細胞(APC)遞呈MHC-抗原肽給T細胞，從而提供第一信號；需要一系列協同刺激分子提供第二信號，進而使T細胞產生正常的免疫應答。這個雙信號通路系統對體內免疫系統的平衡起到著至關重要的作用，它嚴格調控者機體對自身和非自身抗原產生不同的免疫應答。如果缺少協同刺激分子提供的第二信號，將會導致T細胞的無應答或持續特異性免疫應答，從而產生耐受。因此，第二信號通路在機體免疫應答的整個過程中起著非常關鍵的調節作用。
CD40是細胞表面表達的糖蛋白之一，為分子量約48kDa的I型膜內在糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，並在免疫系統中發揮重要作用。CD40表達在多種免疫細胞中，如B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞。當藉由CD40發生信號傳導時，專門的抗原遞呈細胞會被激活。CD40的天然配體被命名為CD154或CD40L，已知主要表達在成熟T淋巴細胞中。CD40L介導的信號傳導會觸發一些細胞生物事件，包括免疫細胞激活、增殖、以及細胞因子和趨化因子的產生。CD40信號傳導對於T細胞依賴性免疫應答是非常重要的，尤其在腫瘤環境背景中。CD40刺激的樹突細胞能夠激活腫瘤特異性效應T細胞，該類T細胞具有根除腫瘤細胞的潛力。
CD40的表達發生在包括B淋巴細胞在內的許多正常細胞和腫瘤細胞中。例如，黑色素瘤即屬於具有CD40表達的腫瘤，30%至70%的實體腫瘤也具有CD40表達。目前，已知CD40的激活可有效觸發抗腫瘤反應(Tong等，Cancer Gene Therapy,2003，10：1-13)，包括腫
瘤特異性T細胞反應的免疫激活、對CD40陽性腫瘤直接的細胞凋亡作用，以及刺激導致ADCC的體液反應，並且觀察到腫瘤的根除與腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的出現存在強烈相關性。同時也不應被忽視的是，全身施用CD40抗體與副作用相關，如休克綜合症和細胞因子釋放綜合症(van Mierlo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99：5561-5566)。
目前有多家國際製藥公司在研發如上述針對CD40的單株抗體，它藉由特異性刺激免疫激活，最大限度提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，從而達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。相關專利如PCT/CN2018/089252、CN1198647、CN1369015、CN1582165、CN100430419、CN101014386、CN101237882、CN101289510、CN101490086、CN103842382、CN104918957、WO2002028904、WO2011123489、WO2012149356、WO2013034904、WO2015091853、WO2016196314、WO2017040932、WO2017004006等。迄今為止，輝瑞(相關產品已許可給羅氏)、Alligator等公司的抗CD40抗體均在臨床前動物模型中觀測到了良好的腫瘤殺傷效果，並已推進入I期臨床試驗階段當中。
對於抗體恆定區突變，WO2006019447、WO2014145806、US8734791、US9657106、US8084582、WO2008150494、WO2004099249公開了抗體重鏈的S267E、L328F、N325S的突變，該突變使得抗體去掉了與Fc γ RIII的結合，但是增強了與Fc γ RIIB的結合，從而去除了抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，但是增強了Fc γ RIIB介導的交聯，從而增強對CD40的激活，增強樹突細胞的抗原遞呈。
本公開旨在提供一種高親和力、高選擇性、高生物活性的抗CD40抗體，其缺失抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，但是具有增強的
Fc γ RIIB介導的交聯，從而抑制體內的腫瘤生長。本公開的抗體能夠用作藥物或組成物用於治療刺激CD40及其通路介導的癌症。
本公開提供一種CD40抗體或其抗原結合片段，其包含：
抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52；SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60；和/或
抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.50或者SEQ ID NO.58所示的LCDR1。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.51或者SEQ ID NO.59所示的LCDR2。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.52或者SEQ ID NO.60所示的LCDR3區。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.47或者SEQ ID NO.55所示的HCDR1。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.48或者SEQ ID NO.56所示的HCDR2。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.49或者SEQ ID NO.57所示的HCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些具體實施方案中，抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
且其中該抗體重鏈可變區包含分別如：
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR；或
SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些具體實施方案種，抗CD40抗體或其抗原結合片段可選自下述任一種：
(1)抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(2)抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
(3)抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(4)抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR。
(5)抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
一些具體實施方案中，該抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10；重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
上述的抗CD40抗體或其抗原結合片段可為鼠源抗體或者嵌合抗體。
一些具體實施方案中，該鼠源抗體或者該嵌合抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一些具體實施方案中，該鼠源抗體或者該嵌合抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.9所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
另一些具體實施方案中，該抗體或抗原片段的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO：38，重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO：37。
另一些具體實施方案中，該抗體或抗原片段的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO：46，重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO：45。
另一些具體實施方案中，該抗體或抗原片段的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO：54，重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO：53。
一些具體實施方案中，抗CD40抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其片段。
一些具體實施方案中，當該抗CD40抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段時，其抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ、λ鏈
或其變體的輕鏈FR區或輕鏈恆定區，和/或其抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區或重鏈恆定區。
一些具體實施方案中，當該抗CD40抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段時，其包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。一些具體實施方案中，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10所示，和/或重鏈可變區序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9所示。
一些具體實施方案中，當該抗CD40抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段時，抗體輕鏈序列為：SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20或其變體；該變體具體在輕鏈有0-10的胺基酸變化，更具體為第2和3位的胺基酸位點的突變，位點2和位點3突變後的胺基酸各自獨立地選自I、V或L；抗體重鏈序列為：SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19或其變體；該變體具體在重鏈有0-10的胺基酸變化，更具體為第6和8位的胺基酸位點的突變，兩個位點突變後的胺基酸各自獨立地選自I、A或L。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40人源化抗體或其片段，其人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區或FR區，具體包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區或FR區，更具體包含人源IgG1或IgG2重鏈恆定區或FR區，和/或包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO：22所示的人種系輕鏈IGkV1-33序列；或來源於如SEQ ID NO：24所示的人種系輕鏈IGkV2-28序列。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區變體具體在輕鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更具體為胺基酸位點在2和3位的突變，突變後的胺基酸均具體為I、V或L。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40人源化抗體或其片段，其進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於如SEQ ID NO：21所示的人種系重鏈IGHV1-69序列，和/或來源於如SEQ ID NO：22所示的人種系重鏈IGkV1-33序列；來源於如SEQ ID NO：23所示的人種系重鏈IGHV1-2序列，和/或來源於如SEQ ID NO：24所示的人種系重鏈IGkV2-28序列。
一些具體的實施方案中，抗CD40人源化抗體或其片段，重鏈可變區選自SEQ ID NO：25-30之一所示的序列或其變體，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：31-36之一所示的序列或其變體。
一些具體的實施方案中，抗CD40人源化抗體或其片段，重鏈可變區為SEQ ID NO：26所示的序列或其變體，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：33所示的序列或其變體。
一些具體的實施方案中，重鏈可變區為SEQ ID NO：30所示的序列或其變體，輕鏈可變區選自SEQ ID NO：34所示的序列或其變體。
一些具體實施方案中，人源化抗CD40抗體的重鏈序列如SEQ ID NO：17所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示。
一些具體的實施方案中，重鏈序列如SEQ ID NO：19所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示。
一些具體的實施方案中，抗CD40人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO：61、62、63、64或67所示的序列或其變體，和/或輕鏈可變區為SEQ ID NO：18、20所示序列或其變體。
一些具體實施方案中，抗CD40人源化抗體或其片段的重鏈序列如SEQ ID NO：61或62所示序列或其變體，輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示序列或其變體；重鏈序列如SEQ ID NO：63、64或67所示序列或其變體，輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示序列或其變體。
該變體在重鏈可變區有0-10的胺基酸變化，更具體為胺基酸位點在6和8的突變，突變後的胺基酸均具體為I、A或L。
其中，該SEQ ID NO：61包含相對於SEQ ID NO：17的第266位胺基酸殘基突變為谷胺酸(E)(例如S266E)；
該SEQ ID NO：62包含相對於SEQ ID NO：17的第266位胺基酸殘基突變為谷胺酸(E)(例如S266E)，第324位胺基酸殘基突變為絲胺酸(S)(例如N324S)，第327位胺基酸殘基突變為苯丙胺酸(F)(例如L327F)；
所述SEQ ID NO：63包含在相對於SEQ ID NO：19的第262位胺基酸殘基突變為谷胺酸(E)(例如S262E)；
該SEQ ID NO：64包含相對於SEQ ID NO：19的第262位胺基酸殘基突變為谷胺酸(E)(例如S262E)，第323位胺基酸殘基突變為苯丙胺酸(F)(例如L323F)；
該SEQ ID NO：67包含相對於SEQ ID NO：19的第262位胺基酸殘基突變為谷胺酸(E)(例如S262E)，第320位胺基酸殘基突變為絲胺酸(S)(例如N320S)，第323位胺基酸殘基突變為苯丙胺酸(F)(例如L323F)。其中，胺基酸位點的編號是按照自然順序標號。一些實施方案中，上述抗CD40抗體或其抗原結合片段在重鏈胺基酸序列的最後一位胺基酸(例如賴胺酸)到丙胺酸(A)的突變。
一些具體實施方案中，在SEQ ID NO：61、62、63、64、67所示重鏈序列的最後一位胺基酸突變為A。
另一些具體的實施方案中，提供了一種抗體，其包含SEQ ID NO：69所示重鏈和SEQ ID NO：66所示輕鏈。
另一些具體的實施方案中，提供了一種抗體，其包含SEQ ID NO：68所示重鏈和SEQ ID NO：66所示輕鏈。
一些具體的實施方案中，一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Ev、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、納米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。
本公開進一步提供一種單鏈抗體，其含有如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區。
本公開進一步提供一種多特異性抗體，其含有如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區。
本公開進一步提供一種核酸分子(DNA或RNA)，其編碼如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體或者單鏈抗體。
本公開進一步提供一種表達載體，其含有如上所述的核酸分子。
本公開進一步提供一種宿主細胞，其包含或轉化有如上所述的表達載體。一些具體實施方案中，宿主細胞為細菌、酵母菌、哺乳動物細胞，具體為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
本公開進一步提供一種抗體-藥物偶聯物，含有如前所述的抗CD40抗體輕鏈可變區和/或重鏈可變區。該抗體-藥物偶聯物是本領域公知的，其由抗體-接頭-藥物相互連接形成，已知的接頭包括裂解接頭、分裂解接頭，例如接頭包括但不限於SMCC、SPDP等等。藥物也是本領域公知的，例如DM1、DM4、MMAE、MMAF等。
本公開進一步提供一種醫藥組成物，其含有如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體或者單鏈抗體，以及可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的抗CD40抗體或其片段，或醫藥組成物單位劑量中含CD40抗體或其片段的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方式中為1-1000mg。
本公開進一步提供一種如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體、單鏈抗體或包含其的醫藥組成物，在製備用於治療CD40或CD40L介導的疾病或病症的藥物中的用途；其中該疾病具體為癌症；該癌症最具體為淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
本公開進一步提供一種治療和預防CD40或CD40L介導的疾病或病症的方法，該方法包括使受試者接觸預防有效量或治療有效量的如上所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體、單鏈抗體或其醫藥組成物；其中該疾病或病症具體為癌症；該癌症最具體為淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
本公開進一步提供上述抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體、單鏈抗體或其醫藥組成物在製備用於改善自身免疫疾病患者的症狀的藥物的用途。
本公開進一步提供一種上述抗CD40抗體或其抗原結合片段、多特異性抗體、單鏈抗體或其醫藥組成物在製備用於改善炎性疾病患者的症狀的藥物的用途。
第1圖顯示鼠源抗人CD40抗體基於CD80激活分子對DC細胞的激活作用。
第2圖顯示鼠源抗人CD40抗體基於CD86激活分子對DC細胞的激活作用。
第3圖顯示：Raji移植淋巴瘤與人PBMC和DC細胞共移植之後，Raji移植淋巴瘤的腫瘤生長曲線。
第4圖顯示：將Raji移植淋巴瘤與人PBMC和DC細胞共移植至NOG小鼠中，NOG小鼠的體重變化曲線。
第5圖顯示：向MC38結腸癌小鼠模型腹腔注射單劑量的抗CD40抗體之後的腫瘤生長曲線。
第6圖顯示具有重鏈恆定區突變的抗CD40抗體對DC細胞的激活作用。
第7A圖和第7B圖顯示具有重鏈恆定區突變的抗CD40抗體對DC細胞的激活並促進細胞因子的產生。
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本公開所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中的每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本公開中，本公開所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序依次為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2和LCDR3：重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
術語“抗原遞呈細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。術語“抗原遞呈”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“CD40”包括由細胞天然表達的CD40的任何變體或同種型。本公開的抗體可與非人物種的CD40交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人CD40特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。CD40或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。優選地，抗CD40抗體靶向具有正常糖基化模式的人源CD40。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人CD40的單株抗體。製備時用CD40抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個優選的實施方案中，該鼠源CD40抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本公開的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異種蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該抗體的可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種(如鼠源)抗體的可變區與另一物種(如人)抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕異源抗體誘發的免疫應答反應。建立鼠-人嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中
表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1或IgG2重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“F(ab′)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab′)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab′片段組成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
在本申請上下文中，當提及重鏈恆定區的突變位點時，術語“對應於SEQ ID NO：m的第n位”是指：在不同的抗體編碼體系中，一個突變位點在地位上與SEQ ID NO：m的第n位是可比較的或等價的。技術人員知曉，現行的抗體編碼體系包括但不限於EU、Kabat、Chothia、IMGT(Lefranc，2003)和AHo(Honegger和Pluckthun，2001)等。在一種編碼體系下，當某個位點被確定為第n位時，它在另一個編碼體系下可能被確定為第n’位。技術人員根據常識，能夠容易地確定特定位點在不同編碼體系下的對應關係(例如，EU編碼)。
術語“抗體-藥物偶聯物”(ADC)指與一種或多種化學合成分子(包括但不限於細胞毒劑)偶聯的抗體或抗體片段。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個
VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本公開的術語“與CD40結合”，指能與人CD40相互作用。本公開的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本公開抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本公開所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人CD40作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本公開的抗體與來自不同物種的CD40結合的能力。例如，結合人CD40的本公開的抗體也可以結合另一物種的CD40。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達CD40的細胞的結合或功
能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗CD40抗體接觸時，與未與抗CD40抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括任何可測量的細胞生長的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的刺激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指刺激特定的直接細胞殺傷機制。
本公開中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合體、IgG4的F235E、或L234A/E235A突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，可以用人CD40或其片段免疫小鼠，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。公開所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的
網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本公開的抗體指單株抗體。本公開所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-嫁接)，或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細
胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施、研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用的治療劑，諸如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段的組合物，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床不可測量的程度。
有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個受試者的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法(如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗)確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molec μ lar Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4
版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。胺基酸常見的保守取代如下：
“有效量”包含足以改善或預防醫學症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定所述或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、該總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在生物、細胞或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸殘基佔據時(例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時)，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，術語“轉化的細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA組成和或含量方
面不可能精確相同。該術語包括與最初的細胞具有相同的功能或生物學活性的突變後代。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
帶his標簽的人CD40(h-CD40-his)重組蛋白、帶Fc標簽的人CD40(h-CD40-Fc)重組蛋白、帶his標簽的小鼠CD40(m-CD40-his)重組蛋白和帶his標簽的恆河猴CD40(rhesus-CD40-his)重組蛋白(#CD0-C52H7)均為購買自Acrobiosvstems公司的純化商業蛋白試劑，其各自的序列來源見表1。所述蛋白試劑可用於下述各實施例實驗中。
抗人CD40單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用C57BL/6小鼠，雌性，6至8週齡(昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號：201503259)。飼養環境：SPF級。
小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠分成2籠，每籠5隻。
免疫抗原為帶Fc標簽的人修飾過的CD40重組蛋白(h-CD40-Fc，用磷酸鹽緩衝液配製成1μg/μl)。用弗氏佐劑(Sigma，Lot No.：F5881/F5506)乳化：首次用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用核酸類佐劑(CpG,Sangon Biotech)和注射用鋁(Imject Alum，Thermo，Lot No.：PH203866)。免疫注射時間為第0、14、28、42、56、70天。於第21、35、49、63、77天採血進行血檢，用ELISA方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清中的抗體滴度。
在第4次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平穩的小鼠進行脾細胞融合，融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射
10μg/隻的磷酸鹽緩衝液配製的抗原溶液。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到融合瘤細胞，選出體外活性好的五株單株融合瘤細胞株。
ELISA實驗被用來檢測抗CD40抗體的結合特性。用直接包被帶his標簽的CD40重組蛋白，抗體加入後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗一抗Fc的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。
人或恆河猴CD40-his蛋白包被96孔酶標板，按0.5μg/mL濃度每孔100μl，4℃孵育過夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。加入200μl/孔封閉液室溫孵育2小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。每孔加100μl用稀釋液稀釋好的抗CD40待測抗體。室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl用稀釋液按1：20000倍稀釋的HRP標記的山羊抗人IgG二抗。室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反應15分鐘。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo M μ ltiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算CD40抗體對CD40的結合EC50值。
本實驗中，藉由體外阻斷實驗，檢測所篩選出來的抗人CD40抗體阻斷人CD40和人CD40L之間的結合。
具體方法是將帶Fc標簽的CD40重組蛋白(h-CD40-Fc)包被到96孔酶標板上，加入抗CD40抗體充分結合佔據表位後，再加入帶his標簽的CD40L，藉由檢測his標簽，來計算CD40與CD40L的結合量，計算CD40抗體對CD40活性位點阻斷的IC50值。
人CD40-Fc蛋白包被96孔酶標板，按1μg/mL濃度每孔100μl，4℃孵育過夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。加入200μl/孔封閉液室溫孵育2小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。每孔加100μl用稀釋液稀釋好的抗CD40待測抗體，室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl稀釋好的CD40L-his，室溫孵育1小時，洗液洗三遍。每孔加入100μl用稀釋液按1：2000倍稀釋的HRP標記的抗his標
簽的二抗。室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反應15分鐘。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo M μ ltiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算CD40抗體對CD40與CD40L結合阻斷的IC50值。
按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的生物傳感芯片CM5上，從而親和捕獲一定量的待測嵌合或人源化抗體，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的CD40抗原(CD40抗原均購自Acrobiosystems)，利用Biacore儀器(Biacore X100，GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物芯片洗淨再生。實驗中用到的胺基偶聯試劑盒購自GE公司(Cat.# BR-1000-50，GE)，HBS-EP+10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)用雙蒸餾水稀釋至1×(pH 7.4)。
實驗得到的數據用BiacoreX100 evaluation software2.0 GE軟體以(1：1)Binding模型進行擬合，得出親和力數值，見表10和表11。
HEK-Blue CD40L細胞購自Invivogen(Cat#hkb-cd40)，該細胞穩定轉染了人CD40基因和NF-kB介導的SEAP基因組，可以藉由SEAP受質QUANTI-Blue檢測上清中分泌的SEAP來表徵CD40信號通路的激活水平。本實驗藉由檢測細胞HEK-Blue CD40L的激活，根據EC50大小評價CD40抗體的體外細胞活性。
細胞HEK-Blue CD40L培養在含10%FBS，100μg/mL Zeocin和30μg/mL Blasticidin的DMEM培養基中，一週繼代2至3次，繼代比例1：5或1：10。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3至5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入100μL的細胞懸液，密度為5×105細胞/mL，培養基為含10%FBS，100μg/mL博萊黴素Zeocin和30μg/mL殺稻瘟素Blasticidin的DMEM，96孔板外圍只加入100μl無菌水。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。細胞貼壁後，每孔加入100μl梯度稀釋的待測抗體。將培養板在培養箱孵育20-24小時(37℃，5% CO2)。每孔取40μl細胞上清到一個新的96孔平底板中，加入160μl QUANTI-Blue受質溶液，將培養板在培養箱內避光孵育1-3小時。用酶標儀(Thermo M μ ltiSlkanFc)測定在620nm處的吸光度，計算EC50值評價CD40抗體的體外細胞活性。
從正常人外周血中分離PBMC，然後用CD14 MACS珠分選單核細胞。加入含10ng/mL IL4和100ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培液培養6天，進行MoDC細胞(單核細胞來源的樹突細胞)的誘導培養。6天後收集細胞，取1×105個細胞，用CD209-PE、CD1a-PerCP/Cy5.5和CD14-PE/Cy7染色，藉由FACS分析是否成功誘導MoDC(上述操作均為本領域的常規操作)。
收集成功誘導的DC，加入各待測抗體及對照抗體，分別設置相應梯度濃度稀釋(抗體的梯度濃度詳見第1圖)。培養48小時後，收集細胞，進行CD80、CD86和HLA-DR染色，FACS檢測收集數據。
根據數據藉由激活原代DC細胞實驗，五個鼠源抗體均顯示了明顯的活性，激活了DC細胞表面的激活分子CD80和CD86，並呈劑量依賴效應，總體效果與兩株對照抗體(分別為Pfizer的CP-870,893和Alligator Bioscience的ADC-1013)相當或略優。見第1圖和第2圖。
取以上篩選鑒定出的5株抗體的融合瘤亞選殖，收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA(按照試劑盒說明書步驟)，進行反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara,cat # 2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。最終得到5株鼠源抗體的序列。
(1)鼠單抗2H6的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
2H6 HCVR
2H6 LCVR
其含有下表5中的CDR序列：
(2)9E5的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
9E5 HCVR
9E5 LCVR
其含有下表6中的CDR序列：
(3)1D9的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
1D9 HCVR
1D9 LCVR
其含有下表7中的CDR序列：
(4)14C10的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
14C10 HCVR
14C10 LCVR
其含有下表8中的CDR序列：
(5)38B4的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
38B4 HCVR
38B4 LCVR
其含有下表9中的CDR序列：
其中最優兩株抗體2H6和9E5進入後續開發。將獲得的可變區序列分別接上人的抗體IgG1恆定區序列，得到人-鼠嵌合的抗體序列。利用分子選殖技術，把嵌合抗體的序列插入到pCP表達載體中(購自邁博斯生物公司)中，經過PCR後測序鑒定(該部分的分子選殖等分子生物學操作方法按常規操作條件進行，具體可以參照《分子選殖：實驗室手冊》)。利用HEK293細胞表達系統，即可獲得人-鼠嵌合抗體2H6-C和9E5-C。
對經過MabSelect SuRe(GE Lifesciences)親和力層析純化後的嵌合抗體進行各項體外活性檢測，數據見表10。
在所獲得的鼠源抗體2H6和9E5的VH/VLCDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。
其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因，本公開抗體較佳人種系輕鏈模版Vk1-33/JK4(用於2H6)或Vk2-28/JK4(用於9E5)。
人類種系重鏈框架區來自人重鏈，本公開抗體較佳人種系重鏈模版VH1-69/JH6(用於2H6)或VH1-2/JH6(用於9E5)，如下所示：
2H6較佳人種系重鏈模版IGHV1-69
2H6較佳人種系輕鏈模板IGkV1-33
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP(SEQ ID NO：22)；
9E5較佳人種系重鏈模版IGHV1-2
9E5較佳人種系輕鏈模板IGkV2-28
將鼠源抗體的CDR區移植到選擇的人源化模板上，替換人源化可變區，再與相應的人源IgG恆定區(較佳重鏈為IgG1，輕鏈為κ)重組。然後以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，得到最終的人源化分子。
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：25-30所示；
輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：31-36所示。
hu2H6-H1a：
hu2H6-H1b：
hu2H6-H1c：
hu9E5-H1a：
hu9E5-H1b：
hu9E5-H1c：
hu2H6-L1a：
hu2H6-L1b：
hu2H6-L1c：
hu9E5-L1a：
hu9E5-L1b：
hu9E5-L1c：
經由以上輕重鏈組合的表達測試和回復突變數量對比，選擇出最終的人源化hu2H6(使用H1b重鏈和L1c輕鏈)和hu9E5抗體分子(使用H1c重鏈和L1a輕鏈)，其各自的完整輕鏈和重鏈序列如SEQ ID NO：17-20所示。
hu2H6 HC：
hu2H6 LC：
hu9E5 HC：
hu9E5 LC：
本公開人源化抗體hu2H6和hu9E5與人、恆河猴CD40的結合活性、阻斷活性等見表11。
結果表明，本公開人源化抗人CD40抗體的ELISA結合、阻斷活性與陽性抗體pfizer/alligator相當。尤其是，hu9E5和人CD40的Biacore測量親和力是陽性抗體Alligator對照的10倍以上、Pfizer對照的4倍以上。
取正常人外周血，用密度梯度離心法分離健康人PBMC。用CD14+ microbeads試劑盒分選單核細胞，按照試劑盒所提供的規程進行CD14+單核細胞的分離，即每107個細胞加入20μl Anti-CD14 microbeads，4℃孵育15分鐘。然後，將細胞加入磁柱中，洗三次後，收集磁柱中的細胞，即CD14+單核細胞。CD14+單核細胞中加入含10ng/mL IL-4和100ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培養液培養6天(培養方法為本領域常規方法)，進行MoDC細胞的誘導培養，剩餘的細胞加
入含IL-2的RPMI 1640，培養後收集懸浮的細胞(培養方法以及收集細胞的方法均為本領域的常規方法)，使用CD3+ microbeads試劑盒分選T細胞。六天後收集並分取MoDC細胞和CD3+ T細胞，將他們與Raji細胞(上海生科院細胞庫，培養於含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中)按1：5：20的比例混合，接種於每只NOG小鼠(南京銀河生物，適應性飼養5天)皮下。實驗動物均飼養於恆溫恆濕的獨立通風盒內，飼養室溫度18.0-26.0℃，濕度40-70%，10-20次/小時換氣，晝夜明暗交替時間12h/12h。
實驗分為人IgG1抗體對照組、hu2H6、hu9E5和對照抗體G12(即Alligator Bioscience的ADC-1013)，給藥劑量均為3mg/kg。每組5隻小鼠，每週一次，六週注射給藥，連續給藥3次。
整個實驗過程中：
(1)用遊標卡尺每週測量2次腫瘤長徑和寬徑，腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)計算。
(2)相對腫瘤抑制率TGI(%)：TGI%=(1-T/C)×100%。T/C%為相對腫瘤增殖率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和IgG1對照組在某一特定時間點的腫瘤體積(TV)或瘤重(TW)。
結果顯示，人源化的抗CD40抗體hu2H6和hu9E5相對IgG1對照均有非常顯著的抑瘤作用，給藥21天後腫瘤接近完全消除；對比對照抗體G12的抑瘤作用總體相當或稍好，如第3圖和第4圖所示。
本實施例中製備了前述抗CD40抗體在重鏈恆定區突變的變體。
具體而言：
-將hu2H6的重鏈SEQ ID NO：17的第266位胺基酸從絲胺酸(S)突變為谷胺酸(E)，以獲得突變體hu2H6-M；
-將hu2H6的重鏈SEQ ID NO：17的第266位胺基酸從絲胺酸(S)突變為谷胺酸(E)，且第324位胺基酸從天門冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)，且第327位胺基酸從亮胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，以獲得突變體hu2H6-SELFNS；
-將hu9E5的重鏈SEQ ID NO：19的第262位胺基酸從絲胺酸(S)突變為谷胺酸(E)，以獲得突變體hu9E5-M；
-將hu9E5的重鏈SEQ ID NO：19的第262位胺基酸從絲胺酸(S)突變為谷胺酸(E)，且第323位胺基酸從亮胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，以獲得突變體hu9E5-SELF；
-將hu9E5的重鏈SEQ ID NO：19的第262位胺基酸從絲胺酸(S)突變為谷胺酸(E)，且第320位胺基酸從天門冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)，且第323位胺基酸從亮胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，以獲得突變體hu9E5-SELFNS。
hu2H6-M、hu2H6-SELFNS的重鏈序列如下SEQ ID NO：61、62所示，輕鏈序列都如SEQ ID NO：18所示。
hu9E5-M、hu9E5-SELF、hu9E5-SELFNS的重鏈序列如下SEQ ID NO：63、64、67所示，其輕鏈序列都如SEQ ID NO：20所示。
hu2H6-M HC：
hu2H6-SELFNS HC：
hu9E5-M HC：
hu9E5-SELF HC：
hu9E5-SELFNS HC：
此外，SEQ ID NO：61、62、63、64、67的最後一位胺基酸K可以替換為A，該突變不影響抗體的活性，但可以一定程度地提高抗體的成藥性。
以及，根據CN104918957A中另一種抗CD40抗體APX005S267E的可變區(即其第1-120位胺基酸)製備獲得抗體005M用作陽性對照，抗體005M重鏈的第121-450位胺基酸序列和hu9E5-M重鏈的113-442位胺基酸序列相同。005M具體序列如下：
005M-HC：
005M-LC：
將005M的重鏈SEQ ID NO：65的第331位胺基酸從亮胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，以獲得突變體APX005-SELF；將005M的重鏈SEQ ID NO：65的第328位胺基酸從天門冬醯胺(N)突變為絲胺酸(S)，第331位胺基酸從亮胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，以獲得突變體APX005-SELFNS。
APX005-SELF HC(L331F)：
APX005-SELFNS HC(L331F、N328S)：
經測序確認，製備獲得抗體hu2H6-M、hu2H6-SELFNS、hu9E5-M、hu9E5-SELF、hu9E5-SELFNS和005M、APX005-SELF、APX005-SELFNS。
從正常人外周血中分離PBMC，然後用CD14 MACS珠分選單核細胞。加入含25ng/mL IL-4和50ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培液培養6天，進行MoDC細胞(單一核細胞來源的樹突細胞)的誘導培養。
6天後收集細胞，取1×105個細胞，用CD209-PE、CD1a-PerCP/Cy5.5和CD14-PE/Cy7染色，FACS分析是否成功誘導MoDC(上述操作均為本領域的常規操作)。收集成功誘導的DC，加入各待測抗體及對照抗體，分別設置相應梯度濃度稀釋，獲得0.01nM、0.16nM、0.8nM、4nM、20nM、100nM的抗體梯度。培養48小時後，收集細胞，
進行CD86和HLA-DR染色，FACS檢測收集數據。APX005M-SELFNS與2H6-SELFNS均表現出極強的激動劑活性，激活了DC細胞表面的激活分子CD86，並呈劑量依賴效應，效果強於Alligator的對照抗體G12。參見第6圖。
從正常人外周血中分離PBMC，然後用CD14 MACS beads分選單核細胞。加入含25ng/mL IL4和50ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培液培養6天，進行MoDC細胞(單一核細胞來源的樹突細胞)的誘導培養。6天後收集細胞，取1×105個細胞，用CD209-PE，CD1a-PerCP/Cy5.5和CD14-PE/Cy7染色，FACS分析是否成功誘導MoDC(上述操作均為本領域的常規操作)。收集成功誘導的DC，加入各待測抗體及對照抗體，分別設置相應梯度濃度稀釋，獲得0.01nM、0.16nM、0.8nM、4nM、20nM、100nM的抗體梯度。培養48小時後，收集上清，用ELISA檢測IL-12 p40的含量。
APX005M-SELFNS、APX005M-SELF、2H6-SELFNS、9E5-SELFNS均表現出極強的激動劑活性，促進DC細胞分泌細胞因子IL-12 p40，並呈劑量依賴效應，效果均強於Alligator的對照抗體G12。結果參見第7A圖、第7B圖和表12、13。
本實施例在人源化hFc γ R/hCD40 C57BL/6小鼠的MC38腫瘤模上，藉由腫瘤的大小及小鼠體重來評價CD40抗體用藥對抗腫瘤作用及其安全性。
MC38細胞的培養與準備方法：MC38小鼠結腸癌細胞系，使用DMEM培養(10% FBS、1%青黴素-鏈黴素、1mM丙酮酸鈉、10mM HEPES)，細胞增殖到培養皿的80%-90%的密度時，加入胰蛋白酶-EDTA(0.25%)，於37℃放置3到5分鐘消化，之後用含有10% FBS的培養基終止，然後離心，並用PBS洗淨2次，最後用PBS重新懸浮製備單細胞懸液，並調整細胞密度到107細胞/mL備用。
MC38腫瘤模型的建立方法：使用上述製備的MC38單細胞懸液，在第7天時將2 x106個MC38細胞(200μL)接種於32隻人源化hFc γ R/hCD40 C57BL/6小鼠(由上海交通大學醫學院李福彬課題組繁殖，SPF級飼養)右肋部皮下，待小鼠平均腫瘤體積達到55mm3左右時，隨機分成4組，每組8隻。
分組後，根據如表12的方案給予單劑腹腔注射抗CD40抗體，每週兩次測量腫瘤體積，稱體重，記錄數據。其中，對照IgG、hu9E5、hu9E5-M均由上海恆瑞醫藥股份有限公司提供，用PBS稀釋，使最終濃度為0.3mg/mL。
抗體抗腫瘤活性的評價指標：
1)從受試小鼠分組開始，連續測量小鼠的腫瘤體積，使用腫瘤體積大小作為評價受試抗體的抗腫瘤活性指標，腫瘤體積(TV)計算公式：
TV=0.5×L短×L短×L長，
其中L短是腫瘤的最短直徑，L長是腫瘤的最長直徑。
2)T/C %為相對腫瘤增殖率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積的百分比值。計算公式如下：
T/C%=(T-T0)/(C-C0)×100
其中，T、C為實驗結束時的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
3)相對腫瘤抑制率TGI(%)=(1-T/C)×100%。
數據表達和統計學處理：所有數據採用GraphPad Prism 5.0軟件分析。數據用平均值±標準差表示，各組間採用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。
各組抗體在hFc γ R/hCD40Tg小鼠的MC38腫瘤模型中的體內活性結果，藉由腫瘤體積大小的變化可判斷，在第0天、第3天和第6天給予對照抗體和受試抗體結束以後，與對照組(對照IgG)相比，hu9E5組、hu9E5-M組和005M組小鼠腫瘤體積的增長受到抑制，相對腫瘤抑制率分別為42.0%、68.9%、53.8%。hu9E5有一定的抗腫瘤活性(p>0.05),hu9E5-M和005M具有強抗腫瘤活性(p<0.05)，並且，hu9E5-M具有比005M更有益的效果，如表15和第5圖所示。
結果顯示，在對應於SEQ ID NO：17的第266位胺基酸或SEQ ID NO：19的第262位胺基酸將S突變為E，能顯著提高本申請中抗CD40抗體在體內的抗腫瘤效果。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 抗CD40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<220>
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<222> (1)..(116)
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<400> 1
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<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> 鼠單抗2H6的輕鏈可變區序列2H6 LCVR
<400> 2
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 2H6 HCDR1
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 2H6 HCDR2
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 2H6 HCDR3
<400> 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(11)
<223> 2H6 LCDR1
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 2H6 LCDR2
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> 2H6 LCDR3
<400> 8
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> 9E5的重鏈可變區序列9E5 HCVR
<400> 9
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> 9E5的輕鏈可變區序列9E5 LCVR
<400> 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 9E5 HCDR1
<400> 11
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 9E5 HCDR2
<400> 12
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(3)
<223> 9E5 HCDR3
<400> 13
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(16)
<223> 9E5 LCDR1
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 9E5 LCDR2
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> 9E5 LCDR3
<400> 16
<210> 17
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(446)
<223> hu2H6 HC
<400> 17
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(214)
<223> hu2H6 LC
<400> 18
<210> 19
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(442)
<223> hu9E5 HC
<400> 19
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(219)
<223> hu9E5 LC
<400> 20
<210> 21
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(98)
<223> 2H6較佳人種系重鏈模版IGHV1-69
<400> 21
<210> 22
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(95)
<223> 2H6較佳人種系輕鏈模板IGkV1-33
<400> 22
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(98)
<223> 9E5較佳人種系重鏈模版IGHV1-2
<400> 23
<210> 24
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(100)
<223> 9E5較佳人種系輕鏈模板IGkV2-28
<400> 24
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(116)
<223> hu2H6-H1a
<400> 25
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(116)
<223> hu2H6-H1b
<400> 26
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(126)
<223> hu2H6-H1c
<400> 27
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-H1a
<400> 28
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-H1b
<400> 29
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-H1c
<400> 30
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> hu2H6-L1a
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> hu2H6-L1b
<400> 32
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> hu2H6-L1c
<400> 33
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-L1a
<400> 34
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-L1b
<400> 35
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(112)
<223> hu9E5-L1c
<400> 36
<210> 37
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(116)
<223> 1D9的重鏈可變區序列1D9 HCVR
<400> 37
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> 1D9的輕鏈可變區序列1D9 LCVR
<400> 38
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 1D9 HCDR1
<400> 39
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 1D9 HCDR2
<400> 40
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 1D9 HCDR3
<400> 41
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(11)
<223> 1D9 LCDR1
<400> 42
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 1D9 LCDR2
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> 1D9 LCDR3
<400> 44
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(116)
<223> 14C10的重鏈可變區序列14C10 HCVR
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> 14C10的輕鏈可變區序列14C10 LCVR
<400> 46
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 14C10 HCDR1
<400> 47
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 14C10 HCDR2
<400> 48
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 14C10 HCDR3
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(11)
<223> 14C10 LCDR1
<400> 50
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 14C10 LCDR2
<400> 51
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> 14C10 LCDR3
<400> 52
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(119)
<223> 38B4的重鏈可變區序列38B4 HCVR
<400> 53
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> 38B4的輕鏈可變區序列38B4 LCVR
<400> 54
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 38B4 HCDR1
<400> 55
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(17)
<223> 38B4 HCDR2
<400> 56
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(10)
<223> 38B4 HCDR3
<400> 57
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(11)
<223> 38B4 LCDR1
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(7)
<223> 38B4 LCDR2
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222> (1)..(9)
<223> 38B4 LCDR3
<400> 60
<210> 61
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(446)
<223> hu2H6-M HC
<400> 61
<210> 62
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(446)
<223> hu2H6-SELFNS HC
<400> 62
<210> 63
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(442)
<223> hu9E5-M HC
<400> 63
<210> 64
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(442)
<223> hu9E5-SELF HC
<400> 64
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(450)
<223> 005M-HC
<400> 65
<210> 66
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(215)
<223> 005M-LC
<400> 66
<210> 67
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(442)
<223> hu9E5-SELFNS HC
<400> 67
<210> 68
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(450)
<223> APX005-SELF HC
<400> 68
<210> 69
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(450)
<223> APX005-SELFNS HC
<400> 69
Claims (40)
- 一種抗CD40抗體或其抗原結合片段，其在重鏈恆定區存在突變，其中：1)該抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，2)該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，3)該抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗體重鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，4)該抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR；或者，5)該抗體輕鏈可變區包含序列分別如：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；且抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該鼠源抗體或嵌合抗體可變區的胺基酸序列選自：1)重鏈可變區如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO.2所示；2)重鏈可變區如SEQ ID NO.9所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO.10所示；3)重鏈可變區如SEQ ID NO.37所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO.38所示；4)重鏈可變區如SEQ ID NO.45所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO.46所示；5)重鏈可變區如SEQ ID NO.53所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO.54所示。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體重鏈可變區進一步包含：人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第4項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第5項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1或IgG2重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體的輕鏈可變區上的輕鏈FR區來源於：如SEQ ID NO：22所示的人種系輕鏈IGkV1-33序列、或如SEQ ID NO：24所示的人種系輕鏈IGkV2-28序列；該人源化抗體的重鏈可變區上的重鏈FR區來源於：如SEQ ID NO：21所示的人種系重鏈IGHV1-69序列、或如SEQ ID NO：23所示的人種系重鏈IGHV1-2序列。
- 如申請專利範圍第7項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體的輕鏈可變區上的輕鏈FR區來源於如SEQ ID NO：22所示的人種系輕鏈IGkV1-33，且人源化抗體的重鏈可變區上的重鏈FR區來源於如SEQ ID NO：21所示的人種系重鏈IGHV1-69；或，人源化抗體的輕鏈可變區上的輕鏈FR區來源於如SEQ ID NO：24所示的人種系輕鏈IGkV2-28，且重鏈可變區上的重鏈FR區來源於如SEQ ID NO：23所示的人種系重鏈IGHV1-2。
- 如申請專利範圍第7或8項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中：該人源化抗體輕鏈為如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示或其變體，該變體在輕鏈可變區有0至10個胺基酸突變；和/或，重鏈恆定區突變前，該人源化抗體重鏈為如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示或其變體；該變體在重鏈可變區有0至10個胺基酸突變。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該該人源化抗體輕鏈為如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示或其變體，該變體在輕鏈可變區有在第2位和/或第3位胺基酸位點的突變。
- 如申請專利範圍第10項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體輕鏈為如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示或其變體，該變體在輕鏈可變區突變後的胺基酸殘基為I、V或L。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，重鏈恆定區突變前，該人源化抗體重鏈為如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示或其變體；該變體在重鏈可變區有在第6位和/或第8位胺基酸位點的突變。
- 如申請專利範圍第12項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，重鏈恆定區突變前，該人源化抗體重鏈為如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示或其變體；該變體在重鏈可變區突變後的胺基酸為I、A或L。
- 如申請專利範圍第9至13項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中：重鏈的可變區如SEQ ID NO：25-30之一或其變體所示，輕鏈的可變區如SEQ ID NO：31-36之一或其變體所示。
- 如申請專利範圍第14項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其選自以下：重鏈的可變區如SEQ ID NO：26或其變體所示，輕鏈的可變區如SEQ ID NO：33或其變體所示；或重鏈的可變區如SEQ ID NO：30或其變體所示，輕鏈的可變區如SEQ ID NO：34或其變體所示；或重鏈的可變區如SEQ ID NO：17或其變體所示，輕鏈的可變區如SEQ ID NO：18或其變體所示；或重鏈的可變區如SEQ ID NO：19或其變體所示，輕鏈的可變區如SEQ ID NO：20或其變體所示。
- 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈在選自以下的位點處包含胺基酸殘基的突變：1)對應於SEQ ID NO：19的第262位或對應於SEQ ID NO：17的第266位；和/或2)對應於SEQ ID NO：19的第320位或對應於SEQ ID NO：17的第324位；和/或3)對應於SEQ ID NO：19的第323位或對應於SEQ ID NO：17的第327位。
- 如申請專利範圍第16項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈包含選自以下的突變：1)在對應於SEQ ID NO：19的第262位或SEQ ID NO：17的第266位突變為谷胺酸；和/或2)在對應於SEQ ID NO：19的第320位或SEQ ID NO：17的第324位突變為絲胺酸；和/或3)在對應於SEQ ID NO：19的第323位或SEQ ID NO：17的第327位突變為苯丙胺酸。
- 如申請專利範圍第17項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈包含選自以下的突變或其組合：1)在對應於SEQ ID NO：19的262E；2)在對應於SEQ ID NO：19的262E和323F；3)在對應於SEQ ID NO：19的262E、320S和323F；4)在對應於SEQ ID NO：17的266E；5)在對應於SEQ ID NO：17的266E、324S和327F。
- 如申請專利範圍第1、2和4至18項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體包含：如SEQ ID NO：61或62所示的重鏈，和如SEQ ID NO：18所示的輕鏈；或，該人源化抗體包含：如SEQ ID NO：63、64、67所示的重鏈，和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
- 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈羧基末端的胺基酸殘基突變為丙胺酸殘基。
- 如申請專利範圍第20項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段，其中，該SEQ ID NO：61、62、63、64或67所示重鏈羧基末端的胺基酸殘基突變為丙胺酸殘基。
- 一種單鏈抗體，其含有：如申請專利範圍第1至21項中任一項所限定的輕鏈可變區和重鏈可變區。
- 一種抗體-藥物偶聯物，其中，該抗體含有如申請專利範圍第1至21項中任一項所限定的輕鏈可變區和重鏈可變區。
- 如申請專利範圍第23項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗體含有如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段。
- 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或抗原結合片段或申請專利範圍第22項所述的單鏈抗體。
- 一種載體，其含有如申請專利範圍第25項所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，其含有或表達申請專利範圍第26項所述的載體。
- 如申請專利範圍第27項所述的宿主細胞，該宿主細胞選自：細菌、酵母菌、哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該細菌為大腸桿菌。
- 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該酵母菌為畢赤酵母。
- 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞。
- 一種醫藥組成物，其含有：如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第22項所述的單鏈抗體、或者申請專利範圍第23或24項所述的抗體-藥物偶聯物，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種申請專利範圍第1至21項任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第22項所述的單鏈抗體、或者申請專利範圍第23或24項所述的抗體-藥物偶聯物、申請專利範圍第32項所述的醫藥組成物的用途，其用於製備藥物；該藥物用於治療或預防CD40介導的或CD40L介導的疾病或病症。
- 如申請專利範圍第33項所述的用途，其中，該疾病或病症為癌症。
- 如申請專利範圍第34項所述的用途，其中，該癌症選自：淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
- 選自以下的任一項在製備藥物中的用途：一種申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第22項所述的單鏈抗體、或者申請專利範圍第23或24項所述的抗體-藥物偶聯物、申請專利範圍第32項所述的醫藥組成物的用途，其用於製備藥物；該藥物用於改善自身免疫性疾病患者或炎性疾病患者的症狀。
- 一種預防或治療CD40介導的或CD40L介導的疾病的方法，該方法包括使受試者接觸預防有效量或治療有效量的選自以下的任一項：申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第22項所述的單鏈抗體、申請專利範圍第23或24項所述的抗體-藥物偶聯物、申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物。
- 如申請專利範圍第37項所述的方法，其中，該疾病為癌症。
- 如申請專利範圍第38項所述的方法，其中，該癌症選自：淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、食管癌、宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
- 一種改善自身免疫性疾病或炎性疾病症狀的方法，該方法包括使受試者接觸預防有效量或治療有效量的選自以下的任一項：申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第2項所述的單鏈抗體、申請專利範圍第23或24項所述的抗體-藥物偶聯物、申請專利範圍第2項所述的醫藥組成物。
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