MXPA03008350A - Mutantes estables al calor de enzimas para la biosintesis del almidon. - Google Patents
Mutantes estables al calor de enzimas para la biosintesis del almidon.Info
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Abstract
La presente invencion pertenece a algunas moleculas polinucleotidicas que codifican enzimas que tienen estabilidad incrementada al calor; estos polinucleotidos, cuando se expresan en plantas, producen un rendimiento incrementado en el crecimiento de las plantas bajo condiciones de estres por calor; en una modalidad, las moleculas polinucleotidicas de la presente invencion codifican actividades de las enzimas ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) del endospermo del maiz y de la sintasa del almidon soluble (SSS); tambien se contemplan por la presente invencion las plantas y los tejidos vegetales cruzados para que contengan, o para que se transformen con, los polinucleotidos mutantes, y expresen los polipeptidos codificados por los polinucleotidos; la presente invencion tambien concierne a los metodos para aislar polinucleotidos y polipeptidos contemplados dentro del alcance de la invencion; tambien se proveen metodos para incrementar el rendimiento en el crecimiento de las plantas bajo condiciones de estres por calor.
Description
MUTANTES ESTABLES AL CALOR DE ENZIMAS PARA LA BIOSINTESIS DEL ALMIDON
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo el apoyo de la National Science Foundation (Fundación Nacional de la Ciencia) número 9316887. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los E.U.A. número de serie 60/275, 768, presentada el 14 de marzo del 2001.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La naturaleza sésil de la vida vegetal genera una exposición constante a factores ambientales que ejercen efectos positivos y negativos en su crecimiento y desarrollo. Uno de los mayores impedimentos con que se enfrenta la agricultura moderna son las condiciones ambientales adversas. Un factor importante que ocasiona una pérdida importante en las cosechas es el estrés por calor. El estrés por temperatura reduce de manera importante el rendimiento de los granos en muchas cosechas de cereales tales como maíz, trigo, y cebada. El rendimiento se reduce debido al estrés por calor en un intervalo de aproximadamente 7 a 35% en los cereales de importancia mundial. Numerosos estudios han identificado consecuencias probablemente fisiológicas del estrés por calor. El trabajo pionero por Hunter et al. (Hunter, R. B., Tollenaar, ., y Breuer, C. M. [19/7] Can. J Plant Sci. 57: 1127-1 133) utilizando condiciones de cámara de crecimiento mostraron que la temperatura disminuyó la duración del llenado del grano en el maíz. Resultados similares en los que la duración del llenado de granos se alteró de manera adversa mediante el incremento en la temperatura fueron identificados por Tollenaar y Bruulsema (Tollenaar, M. y Bruulsema, T. W.
[1988] Can. J. Plant] Sci. 68: 935-940). Badu-Apraku et al. (Badu-Apraku, B., Hunter, R. B., y Tollenaar, M.
[1983] Can. J Plant. Sci. 63: 357-363) midieron una reducción marcada en el rendimiento de crecimiento de las plantas de maíz bajo el régimen de temperatura día/noche de 35/15°C en comparación con el crecimiento a un régimen de temperatura de 25/15°C. Los rendimientos reducidos debido a temperaturas incrementadas también están apoyados por estudios históricos así como climatológicos (Thompson, L. M.
[1986] Agron. J 78: 649-653; Thompson, L. M.
[1975] Science 188: 535-541 ; Chang, J.
[1981] Agricul. Metero. 24: 253-262; y Conroy, J. P., Seneweera, S., Basra, A. S., Rogers, G., y Nissen-Wooller, B.
[1994] Aust. Plantphysiol. 21 : 741-758). Es evidente que los procesos fisiológicos del desarrollo de la semilla están afectados de manera adversa por el estrés por calor a partir de estudios utilizando un sistema de cultivo de grano in vitro (Jones, R. J., Gengenbach, B. G., y Cardwell, V. B.
[1981] Crop Science 21 : 761-766; Jones, R. J., Ouattar, S., y Crookston, R. K.
[1984] Crop Science 24: 133-137; y Cheikh, N., y Jones, R. J. [995] Physiol. Plant. 95: 59-66). Los granos de maíz cultivados a la temperatura óptima anteriormente mencionada de 25°C exhibieron una reducción dramática en el peso. El trabajo con el trigo identificó la pérdida de actividad de sintasa soluble de almidón (SSS) como una marca distintiva de la respuesta del endospermo de trigo al estrés por calor (Hawker, J. S. y Jenner, C. F.
[1993] Aust. J. Plant Physiol. 20: 197-209; Denyer, K., Hylton, C. M., y Smith, A. M.
[1994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 783-789; Jenner, C. F.
[1994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 791-806). Estudios adicionales con SSS de endospermo de trigo demuestran que éste es lábil al calor (Rijven, A. H. G. C.
[1986] Plant Physiol. 81 : 448-453; Keeling, P. L, Bacon, P. J., Holt, D. C.
[1993] Planta. 191 : 342-348; Jenner, C. F., Denyer, K., y Guerin, J.
[1995] Aust. J. Plant Physiol. 22: 703-709). Los papeles de SSS y de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) bajo condiciones de estrés por calor de maíz son menos claros. La AGP cataliza la conversión de ATP y de a- gIucosa-1- fosfato a ADP- glucosa y pirofosfato. La ADP- glucosa se utiliza como un donante de grupo glucosilo en la biosintesis del almidón por las plantas y en la biosíntesis del glucógeno por las bacterias. La importancia de la ADP- glucosa pirofosforilasa como una enzima clave en la regulación de la biosíntesis del almidón se evidenció en el estudio de mutantes de endospermo del maíz deficientes en almidón (Zea mays) (Tsai, C. Y., y Nelson, Jr., O. E.
[1966] Science 151 : 341-343; Dickinson, D. B., J. Preiss
[1969] Plant Physiol. 44: 1058-1062). Ou-Lee y Setter (Ou-Lee, T. y Setter, T. L.
[1985] Plant Physiol. 79: 852- 855) examinaron los efectos de la temperatura sobre las regiones apicales o regiones superiores de las espigas del maíz. Con temperaturas elevadas, la actividad de la AGP fue menor en los granos apicales en comparación con los granos básales durante el tiempo de depositación intensa del almidón. En contraste, en los granos desarrollados a temperaturas normales, la actividad de la AGP fue similar en los granos apicales y básales durante este periodo. Sin embargo, la actividad de sintasa del almidón durante este periodo no se afectó de manera diferencial en los granos apicales y básales. Además, los granos apicales tratados mediante calor exhibieron un incremento en la actividad de la sintasa del almidón sobre el control. Esto no se observó por la actividad de la AGP. Singletary et al. (Singletary, G. W., Banisadr, R., y Keeling, P. L.
[1993] Plant Physiol. 102: 6 (supl). ; Singletary, G. W., Banisadra, R., Keeling, P. L
[1994] Aust. J. Plant Physio. 21 : 829-841 ) utilizando un sistema de cultivo ¡n vitro cuantificaron el efecto de diversas temperaturas durante el período de llenado del grano. El peso de la semilla disminuyó de manera constante conforme la temperatura se incrementaba de 22- 36°C. Un papel para la AGP en la pérdida de rendimiento también se sustentó por el trabajo a partir de Duke y Doehlert (Duke, E. R. y Doehlert, D. C.
[1996] Environ. Exp. Botany. 36: 199-208).
El trabajo por Keeling et al. (1994, anteriormente mencionado) cuantificó la actividad de SSS en maíz y en trigo utilizando análisis Q10, y mostró que SSS es un punto de control importante en el flujo del carbono hacia el almidón. Los estudios bioquímicos in vitro con AGP y SSS muestran claramente que ambas enzimas son lábiles al calor. La AGP del endospermo del maíz pierde 96% de su actividad cuando se calienta a 57°C por cinco minutos (Hannah, L. C, Tuschall, D. M., y Mans, R. J.
[1980] Genetics 95: 961-970). Esto está en contraste con la AGP de patata la cual es completamente estable a 70°C (Sowokinos, J. R. y Preiss, J.
[1982] Plant Physiol. 69: 1459-1466; Okita, T. W., Nakata, P. A., Anderson, J. M., Sowokinos, J., Morell, J., y Preiss, J.
[1990]m Plant Physiol. 93: 785-90). Los estudios de inactivación por calor con SSS mostraron que ésta también es lábil a temperaturas superiores, y los estudios cinéticos determinaron que el valor Km para la amilopectina se elevó exponencialmente cuando la temperatura se incrementaba de 25- 45°C (Jenner et al., 995, anteriormente mencionado). La evidencia bioquímica y genética ha identificado a la AGP como una enzima clave en la biosíntesis del almidón en plantas superiores y en la biosíntesis del glucógeno en E. coli (Preiss, J. y Romeo, T.
[1994] Progress ¡n Nuc. Acid Res. and Mol Biol 47: 299-329; Preiss, J. y Sivak, M.
[1996] "Starch synthesis in sinks and sources," En Photoassimilate distribution in plants and crops: source-sink relationships. Zamski, E., ed., Marcil Dekker Inc. pp. 139-168). La AGP cataliza lo que se observa como el paso inicial en la ruta biosintética del almidón con el producto de la reacción ADP glucosa siendo el donante del grupo glucosilo activado. Este se utiliza por la sintasa del almidón para la extensión del polímero de polisacárido (revisado en Hannah, L. Curtís
[1996] "Starch synthesis in the maíze endosperm," En: Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 4. B. A. Larkins e I. K. Vasil (eds.). Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Los Países Bajos). Estudios iniciales con la AGP de patata mostraron que la expresión en E. coli produjo una enzima con propiedades alostéricas y cinéticas similares a las de la enzima del tubérculo nativo (Iglesias, A., Barry,
G. F., Meyer, C, Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. J., Okita, T. W., Kishore, G. M., y Preiss, J.
[1993] J. Biol. Chem. 268: 1081-86; Ballicora, M. A., Laughlin, M. J., Fu, Y., Okita, T. W., Barry, G. F., y Preiss, J.
[1995] Plant Physiol. 109: 245-251). Greene et al. (Greene, T. W., Chantler, S. E., Kahn, M. L, Barry, G. F., Preiss, J., y Okita, T. W.
[1996] Proc. Nati. Acad. Sci.] 93: 1509-1513; Greene, T. W., Woodbury, R. L, y Okita, T. W.
[1996] Plant Physiol. ( 12: 315-1320) mostraron la utilidad del sistema de expresión bacteriano en los estudios de estructura- función con la AGP de patata. Múltiples mutaciones fueron identificadas como importantes en el mapeo de los sitios alostéricos y de los sitios de unión al sustrato (Okita, T. W„ Greene, T. W., Laughlin, M. J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito, H., Kavakli,
H. , y Stephens, K.
[1996] "Engineering Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic Enzymes," En Engineering Crops For Industrial End Uses, Shewry, P. R., Napier, J. A., y Davis, P., eds., Portland Press Ltd., Londres). Las enzimas AGP han sido aisladas tanto a partir de bacterias como de plantas. La AGP bacterianas consisten de un homotetrámero, mientras que la AGP vegetal a partir de tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos es un heterotetrámero compuesto de dos subunidades diferentes. La enzima vegetal esta codificada por dos genes diferentes, con una subunidad siendo más grande que la otra. Esta característica se ha evidenciado en numerosas plantas. Las subunidades de AGP en hojas de espinaca tienen pesos moleculares de 54 kDa y 51 kDa, como se estima mediante SDS-PAGE. Ambas subunidades son inmunoreactivas con anticuerpos generados en contra de la AGP purificada a partir de hojas de espinaca (Copeland, L., J. Preiss (1981 ) Plant Physiol. 68: 996-1001 ; Morell, M., M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss
[1988] J. Bio. Chem. 263: 633). Los análisis inmunológicos utilizando antisuero preparado en contra de las subunidades pequeña y grande de la hoja de espinaca mostraron que la AGP del tubérculo de la patata también esta codificada por dos genes (Okita et al., 1990, anteriormente mencionado). Las clonas de ADNc de las dos subunidades del tubérculo de la patata (50 y 51 kDa) también han sido aisladas y secuencias (Muller-Rober, B. T., J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willmitzer, U. Sounewald
[1990] Mol. Gen. Genet. 224: 136-146; Nakata, P. A., T. W. Greene, J. M. Anderson, B. J. Smith-White, T. W. Okita, J. Preiss
[1991] Plant Mol. Biol 17: 1089-1093). La subunidad grande de la AGP del tubérculo de la patata es estable al calor (Nakata et al.
[1991], anteriormente mencionado). Como Hannah y Nelson (Hannah, L. C, O. E. Nelson (1975) Plant Physiol. 55: 297- 302.; Hannah, L. C, y Nelson, Jr., O. E.
[1976] Biochem. Genet. 14: 547-560) postularon, que tanto Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M. R., S. Lawrence, C. Barton, L. C. Hannah
[1990] Plant Cell 2: 581-588) como Brittle-2 (Bt2) (Bae, J. M., M. Giroux, L. C. Hannah
[1990] Maydica 35: 317-322 son genes estructurales de la ADP- glucosa pirofosforilasa del endospermo del maíz. Sh2 y Bt2 codifican a la subunidad grande y la subunidad pequeña de la enzima, respectivamente. A partir de la secuenciación del ADNc, las proteínas Sh2 y Bt2 tienen pesos moleculares pronosticados de 57,179 Da (Shaw, J. R., L. C. Hannah
[1992] Plant Physiol. 98: 1214- 1216) y 52,224 Da, respectivamente. El endospermo es el sitio de mayor depositación del almidón durante el desarrollo del grano en el maíz. Los mutantes Sh2 y bt2 del endospermo del maíz tienen niveles de almidón en gran medida reducidos que corresponden a niveles deficientes de actividad de AGP. Se ha mostrado que las mutaciones de cualesquiera de estos genes reducen la actividad de la AGP en aproximadamente 95% (Tsai y Nelson, 1966, anteriormente mencionado; Dickinson y Preiss, 1969, anteriormente mencionado). Además, se ha observado que las actividades enzimáticas se incrementan con la dosis de alelos Sh2 y Bt2 funcionales de tipo silvestre, mientras que las enzimas mutantes tienen propiedades cinéticas alteradas.
Stark et al. colocó a una muíante a partir de la AGP de E. coli en el tubérculo de patata y obtuvo un incremento del 35% en el contenido de almidón (Stark et al.
[1992] Science 258: 287). La clonación y caracterización de los genes que codifican las subunidades de la enzima AGP han sido reportadas para diversas plantas. Estas incluyen el ADNc de Sh2 (Bhave et al., 1990, anteriormente mencionado), el ADN genómico de Sh2 (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado), y el ADNc de Bt2 (Bae et al., 1990, anteriormente mencionado) a partir del maíz; el ADNc de la subunidad pequeña (Anderson, J. M., J. Hnllo, R. Larson, T. W. Okita, M. Morell, J. Preiss
[1989] J. Biol. Chem. 264: 12238-12242) y el ADN genómico (Anderson, J. M., R. Larson, D. Landencia, W. T. Kim, D. Morrow, T. W. Okita, J. Preiss
[1991] Gene 97: 199-205) a partir del arroz; y los ADNc de la subunidad pequeña y grande a partir de la hoja de espinaca (Morell et al., 1988, anteriormente mencionado) y del tubérculo de la patata (Muller-Rober et al., 1990, anteriormente mencionado; Nakata, P. A., Greene, T. W., Anderson, J. W., Smith-White, B. J.( Okita, T. W., y Preiss, J.
[1991] Plant Mol. Biol. 17: 1089-1093). Además, las clonas de ADNc han sido aisladas a partir del endospermo del trigo y del tejido de la hoja (Olive, M. R., R. J. Ellis, W. W. Schuch
[1989] Plant Physiol. Mol. Biol. 12: 525-538) y de la hoja de Arabidopsis thaliana (Lin, T., Caspar, T., Sommerville, C. R., y Preiss, J.
[1988] Plant Physiol. 88: [1175-1181 ). Las secuencias de AGP a partir de la cebada también han sido descritas en Ainsworth et al. (Ainsworth, C, Hosein, F., Tarvis, M., Weir, F., Burrell, M., Devos, K. M., Gale, M. D.
[1995] Planta 197: 1-10). AGP funciona como una enzima alostérica en todos los tejidos y organismos investigados hasta el momento. Inicialmente se demostró que las propiedades alostéricas de la AGP eran importantes en E. coli. Se aisló una muíante sobreproductora de glucógeno de E. coli y la mutación se mapeó en el gen estructural para la AGP, designada como glyC. Se mostró que la E. coli muíante, conocida como glyC-16, era menos sensible al activador, fructuosa 1 ,6- bifosfato, y menos sensible al inhibidor, AMPc (Preiss, J.
[1984] Ann. Rev. Microbiol. 419-458). A pesar de que las AGP's vegetales también son alostéricas, éstas responden a diferentes moléculas efectoras que las AGP's bacterianas. En las plantas, el ácido 3- fosfogl ¡cérico (3-PGA) funciona como un activador mientras que el fosfato (P04) sirve como un inhibidor (Dickinson y Preiss, 1969, anteriormeníe mencionado). Uíilizando un sisfema de mutagénesis in vivo creado por la escisión mediada por Ac de un elemento Ds que se transpone fortuitameníe localizado de manera cercana a un siíio conocido para la unión al activador, Giroux et al. (Giroux, M. J., Shaw, J., Barry, G., Cobb, G. B., Greene, T., Okita, T. W., y Hannah, L. C.
[1996] Proc. Naíl. Acad. Sci. 93: 5824-5829) fueron capaces de generar mutantes específicas de sitios en regiones funcionalmeníe imporíaníes de la AGP del endospermo del maíz. Una mufaníe, Rev6, coníenía un inserto de tirosina- serina en la subunidad grande de AGP condicionó un incremento del 1 1- 18% en el peso de la semilla.
Además, la solicitud internacional publicada WO 01/64928 enseña que diversas características, tales como el número de semillas, la biomasa de la planta, el índice de cosecha, etc., pueden ser incrementados en plantas transformadas con un polinucleótido que codifica una subunidad grande de la AGP del maíz que contiene la mutación Rev6. Las solicitudes de patentes internacional publicadas WO 99/58698 y WO 98/22601 y la patente de E.U.A. presentada No. 6, 069, 300 describen mutaciones en la subunidad grande de la enzima AGP de maíz que, cuando se expresan, confieren un incremento en la estabilidad al calor en comparación con la observada para las enzimas AGP de tipo silvestre. Diversas mutantes estables al calor están descritas en la patente '300 y en las publicaciones WO, incluyendo las mutantes designadas como HS 13 (que tienen una sustitución Ala por Pro en la posición 177); HS 14 (que tienen una sustitución Asp por His en la posición 400 y una sustitución Val por lie en la posición 454; HS 16 (que tienen una sustitución Arg por Thr en la posición 104); Hs 33 (que tienen una sustitución His por Tyr en la posición 333); HS 39 (que tienen una sustitución His por Tyr en la posición 333); HS 40 (que tienen una sustitución His por Tyr en la posición 333 y una sustitución Thr por lie en la posición 460); HS 47 (que tienen una sustitución Arg por Pro en la posición 216 y una sustitución His por Tyr en la posición 333); RTS 48-2 (que tienen una sustitución Ala por Val en la posición 177); y RTS 60-1 (que tienen una sustitución Ala por Val en la posición 396).
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención pertenece a materiales y métodos útiles para mejorar rendimientos en cosechas en plantas, tales como aquellas plantas que producen cosechas de cereales. En una modalidad, la presente invención provee las enzimas AGP estables al calor y secuencias nucleotídicas que codifican a estas enzimas. En una modalidad preferida, las enzimas estables al calor de la invención pueden ser utilizadas para proveer plantas que tienen una mayor tolerancia a temperaturas mayores, mejorando así lo rendimientos de la cosecha a partir de estas plantas. En una modalidad particularmente preferida, la planta mejorada es un cereal. Los cereales a los que esta invención se aplica incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, y cebada.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la secuencia genómica nucleotídica de un alelo de tipo silvestre Shrunken-2 de Zea mays. Los intrones están indicados por letras minúsculas. El número base 1 es el sitio de inicio de la transcripción. La figura 2 muestra una comparación de la actividad enzimática de la AGP de tipo silvestre y diversas mutantes de la subunidad grande de la AGP del maíz. Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado. Los números dados son el promedio de los duplicados, después de la remoción del nivel de fondo. Los porcentajes se refieren a la actividad remanente después del tratamiento con calor en comparación con la actividad antes del tratamiento con calor. La leyenda de la figura es como sigue: "sh2" = proteína sh2 de tipo silvestre; "sh2ht" = proteína sh2 de tipo silvestre, seguida por tratamiento con calor; "33" = proteína sh2 que contiene la mutación HS 33 (por ejemplo, una sustitución del aminoácido histidina por tirosina en la posición 333 en la subunidad grande de la AGP del maíz); "33ht" = proteína sh2 que contiene la mutación HS 33, seguida por tratamiento con calor; "177" = proteína sh2 que contiene la mutación rts48-2 (por ejemplo, una sustitución del aminoácido alanina por valina en la posición 177 de la subunidad grande de la AGP del maíz); "177ht" = proteína sh2 que contiene la mutación rts48-2 (por ejemplo, una sustitución del aminoácido alanina por valina en la posición 177 en la subunidad grande de la AGP del maíz), seguido por tratamiento con calor; "396" = proteína sh2 que contiene la mutación rts60-2 (por ejemplo, una sustitución del aminoácido alanina por valina en la posición 396 en la subunidad grande de la AGP del maíz); "396ht" = proteína sh2 que contiene la mutación rts60-1 (por ejemplo, una sustitución del aminoácido alanina por valina en la posición 396 en la subunidad grande de la AGP del maíz), seguido por el tratamiento con calor; "7+6" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "177" y "396"; "7+6ht" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "177" "396", seguido por el tratamiento con calor; "7+3" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "177" y "HS 33"; "7+3ht" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "177" y "HS 33", seguido por el tratamiento con calor; "6+3" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "396" y "HS 33"; "6+3ht" = proteína sh2 que contiene la combinación de las mutaciones "396" y "HS 33", seguido por el tratamiento con calor. La figura 3 muestra un mapa de restricción de la región codificante de Sh2. Las enzimas de restricción mostradas son aquellas utilizadas en el aislamiento de toda la región codificante y en la creación de dobles mutantes y de triples mutantes. Las mutaciones están indicadas con asteriscos (*).
BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS
SEQ ID NO. 1 es una secuencia de aminoácidos de una región que corresponde a los aminoácidos 318 a 350 de la subunidad grande de la AGP en el maíz que contiene la mutación HS 33. SEQ ID NO. 2 es una secuencia de aminoácidos de una región que corresponde a los aminoácidos 170 a 189 de la subunidad grande de la AGP en el maíz que contiene la mutación RTS48-2. SEQ ID NO. 3 es una secuencia de aminoácidos de una región que corresponde a los aminoácidos 389 a 406 de la subunidad grande de la AGP en el maíz que contiene la mutación RTS60-1. SEQ ID NO. 4 es una secuencia genómica nucleotídica de un alelo Shrunken-2 de tipo silvestre de Zea mays. SEQ ID NO. 5 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 6 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 7 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 8 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención. SEQ ID NO. 9 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención.
SEQ ID NO. 10 es un iniciador sintético oligonucleótido que puede ser utilizado de conformidad con la presente invención.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención concierne a moléculas novedosas de polinucleótidos mutantes, y los polipéptidos codificados por las mismas, que confieren una resistencia incrementada al calor y un mayor rendimiento en plantas en crecimiento bajo condiciones de estrés por calor con relación a plantas que expresan el genotipo de tipo silvestre. En modalidades específicas, las moléculas polinucleótidas de la presente invención codifican actividades de las enzimas ÁDP glucosa pirofosforilasa (AGP) y de la almidón soluble sintasa (SSS) del endospermo del maíz . Las enzimas mutantes confieren estabilidad incrementada a condiciones de estrés por calor durante el desarrollo de la semilla y de la planta en semillas y tejidos vegetales que expresan las enzimas en comparación con las actividades enzimáticas de tipo silvestre. Un aspecto de la presente invención concierne a polinucleótidos que codifican dos o más cambios de aminoácidos en la subunidad grande de AGP en comparación con la secuencia de tipo silvestre del polipéptido de la subunidad grande de la AGP, en donde la proteína muíante expresada exhibe una estabilidad incrementada. Preferiblemente, cuando el polipéptido codificado por los presentes polinucleótidos se expresa con la subunidad pequeña, exhibe una actividad enzimátíca incrementada en comparación con la proteína de tipo silvestre y, preferiblemente, a un nivel que es aproximadamente el mismo o mayor que el nivel exhibido por una mutación de un solo aminoácido que confiere estabilidad incrementada al calor, tal como HS 33. Los polinucleótidos de la invención pueden codificar dos, tres, o más cambios de aminoácidos a partir de la secuencia de tipo silvestre. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención codifica un polipéptido que tiene una sustitución de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones que corresponden a las posiciones en la subunidad grande de la AGP: posición 177, 333, y 396. En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención codifica una subunidad grande muíante de una AGP vegetal que contiene una mutación doble: una sustitución del aminoácido histidina por tirosina y una sustitución del aminoácido alanina por valina en la secuencia del polipéptido. En una modalidad ejemplificada, la sustitución de histidina por tirosina ocurre en el aminoácido que corresponde al residuo número 333 en la secuencia de la subunidad grande de la AGP del maíz. En una modalidad, la sustitución de alanina por valina ocurre en el aminoácido que corresponde al residuo número 177 en la secuencia de la subunidad grande de la AGP del maíz. En otra modalidad, la sustitución de alanina por valina ocurre en el aminoácido que corresponde al residuo 396 en la secuencia de la subunidad grande de la AGP del maíz.
En una modalidad adicional, un polinucleótido de la presente invención codifica una subunidad grande muíante de una AGP vegetal que contiene dos sustituciones de aminoácidos alanina por valina dentro de la secuencia del polipéptido. En una modalidad ejemplificada, la primera sustitución de alanina por valina ocurre en el aminoácido que corresponde al residuo número 177 y la segunda sustitución de alanina por valina ocurre en el aminoácido que corresponde al residuo número 396 en la secuencia de la subunidad grande de la AGP del maíz. La actividad enzimática asociada con las proteínas mutantes de la presente invención que tienen dos mutaciones se muestra en la figura 2. Otra modalidad concierne a una mutante triple que comprende una sustitución de histidina por tirosina en el aminoácido que corresponde al residuo número 333, una sustitución de alanina por valina en el aminoácido que corresponde al residuo número 177, y una sustitución de alanina por valina en el aminoácido que corresponde al residuo 396 en la secuencia de la subunidad grande de la AGP. Los números de los residuos de aminoácidos referidos anteriormente están basados en los números aceptados de los aminoácidos en esta proteína (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado). La posición de estas sustituciones se puede identificar fácilmente por una persona experta en la técnica. El cuadro 1 a continuación muestra la sustitución doble y triple de aminoácidos mutantes ejemplificados en la presente invención.
CUADRO 1
Debido a la homología de los polipéptidos AGP entre diversas especies de plantas (Smith-White y Preiss
[1992] J. Mol. Evol. 34: 449-464), el experto en la técnica puede determinar fácilmente la posición de las mutaciones en AGP a partir de plantas diferentes al maíz que corresponde a la posición de las mutaciones en la AGP como se describe en la presente invención. Por lo tanto, la presente invención aparta polinucleótidos que codifican AGP mutantes de plantas diferentes del maíz, incluyendo, pero no limitadas, al trigo, cebada, avena, y arroz, que confieren estabilidad incrementada al calor cuando se expresan en la planta.
Las mutaciones de un solo aminoácido en AGP que confieren estabilidad al calor, y los métodos para producir y seleccionar dichas mutaciones, se describen en la patente de E.U.A. No. 6, 069, 300 y en las solicitudes internacionales publicadas WO 99/58698 y WO 98/22601. Típicamente, un plásmido que comprende un polinucleótido que codifica para la subunidad SH2 de la AGP del maíz se mutó, se colocó dentro de células mutantes de E. coli glgC" que expresan la subunidad BT2, y las células se crecieron 42°C para seleccionar mutantes que podían producir glucógeno a esa temperatura. Diversas mutantes, denominadas mutantes estables al calor (HS), fueron aisladas. Los extractos sin purificar de estas mutantes fueron preparados y se monitoreó la estabilidad al calor de la AGP resultante. Las mutantes con una sola sustitución de aminoácidos retuvieron entre 8- 59% de su actividad después de la incubación a 60°C por cinco minutos. Además, la actividad enzimática total de la AGP muíante del endospermo del maíz antes del tratamiento con calor se elevó aproximadamente dos a tres veces en varios de los mutantes. Las mutaciones múltiples que confieren estabilidad al calor se pueden combinar fácilmente dentro de una subunidad. Por ejemplo, pueden ser utilizados diferentes sitios de restricción únicos que dividen a las regiones codificantes de Sh2 en tres fragmentos distintos. Cuando es apropiado, se pueden generar las combinaciones de mutaciones mediante la subclonación del fragmento correspondiente que contiene la mutación añadida. Si dos mutaciones están en cercana proximidad, entonces se puede utilizar mutagénesis sitio dirigida para diseñar dichas combinaciones. Un método de mutaciones de sitio específico implica el uso del PCR, iniciador mutagénico, y el uso de endonucleasa de restricción Dpnl. Los iniciadores se pueden construir para que contengan la mutación en el extremo 5', y se utilizan para la amplificación mediante PCR utilizando la polimerasa Vent a prueba de lectura. El ADN amplificado se puede digerir con Dnpl. El ADN parenteral aislado a partir de E. coli se metila y por lo tanto se vuelve susceptible a la Dnpl. El ADN digerido se fracciona con respecto a su tamaño mediante electroforesis en gel, se liga, y se clona dentro de vectores de expresión. Las mutaciones son confirmadas medíante análisis de secuencia y se transforman dentro de la cepa AC70R1-504 que porta la subunidad pequeña de tipo silvestre. Las mutantes por combinación pueden ser analizadas. La presente invención también concierne a los polipéptidos mutantes, codificados por los presentes polinucleótidos, que tienen las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente invención. En una modalidad preferida, los polipéptidos mutantes derivan a partir del maíz. La presente invención también concierne a mutantes de la AGP estables al calor de la presente invención combinados con mutaciones estables al calor en la subunidad pequeña de la enzima. Las mutaciones en la subunidad pequeña de la AGP que confieren estabilidad al calor a la enzima también pueden prepararse e identificarse fácilmente utilizando los métodos descritos en la patente de E.U.A. No. 6, 069, 300 y en las solicitudes internacionales publicadas WO 99/58698 y WO 98/22601. Las mutantes estables al calor de la subunidad pequeña pueden co- expresarse con los mutantes de la presente invención para mejorar adicionalmente la estabilidad de una enzima AGP. Las plantas y los tejidos vegetales que se cruzan para contener o para ser transformadas con los polinucleótidos mutantes de la invención, y expresar así los polipéptidos codificados por los polinucleótidos, también se contemplan por la presente invención. Las plantas y tejidos vegetales expresan los tejidos que producen polinucleótidos mutantes que tienen, por ejemplo, menor pérdida inducida por calor tanto en peso como en rendimiento cuando se someten al estrés por calor durante el desarrollo. Las plantas dentro del alcance de la presente invención incluyen plantas monocotiledóneas, tales como el arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo, y plantas dicotiledóneas, tales como los chícharos, alfalfa, garbanzo, achicoria, clavo, lenteja, césped de la planicie, frijol de soya, tabaco, patata, patata dulce, rábano, calabaza, colza, árboles de manzana, y lechugas. En una modalidad particularmente preferida, la planta es un cereal. Los cereales a los que esta invención se aplica incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, sorgo, y mijo. La presente invención también concierne a los métodos para producir e identificar polinucleótidos y polipéptidos contemplados dentro del alcance de la invención. En una modalidad, la mutación génica, seguida por la selección utilizando un sistema de expresión bacteriana, se puede utilizar para aislar moléculas polinucleotídicas que codifican subunidades AGP vegetales que poseen mutaciones que pueden aliviar la pérdida inducida por calor en la síntesis del almidón en plantas. La sustituciones individuales de aminoácidos pueden combinarse en una subunidad como se describe en la presente invención. La presente invención además concierne a plantas y tejido vegetal que comprende un polinucleótido de la presente invención que codifica un polipéptido mutante de la invención. En una modalidad preferida, la planta o tejido vegetal tiene un gen mutante AGP de la invención incorporado dentro de su genoma. Otros alelos que confieren fenotipos ventajosos también pueden ser incorporado dentro de un genoma vegetal. En una modalidad preferida, la planta es una planta de cereal. Más preferiblemente, la planta es Zea mays. Las plantas que tienen un gen mutante AGP pueden crecer a partir de semillas que comprenden un gen mutante en su genoma. Además, las técnicas para transformar plantas con un gen, tal como la infección por Agrobacterium, métodos biolísticos, etcétera, son conocidos en la técnica. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de diferentes secuencias polinucleotídicas puede codificar cada una de los polipéptidos AGP variantes descritos en la presente invención. Además, se sabe bien por una persona experta en la técnica cómo crear secuencias polinucleotídicas alternativas que codifican a los mismos polinucleótidos, o esencialmente a los mismos polinucleótidos de la presente invención. Estas secuencias polinucleotídicas variantes o alternativas están dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, las referencias a una secuencia que es "esencialmente la misma" concierne a secuencias que codifican sustituciones, deleciones, adiciones, o inserciones de aminoácidos que no alteran materialmente la actividad funcional del polipéptido codificado por el polinucleótido AGP muíante descrito en la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, los términos "ácido nucleico" y "secuencia polinucleotídica" sr refieren a un polímero de desoxiribonucleótido o de ribonucleótido ya sea en forma de una sola cadena o de doble cadena, y que a menos de que se encuentre limitado de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera similar como nucleótidos que ocurren naturalmente. Las secuencias polinucleotídicas incluyen tanto la secuencia de ADN en cadena que se transcribe hacia ARN como la secuencia de ARN que se traduce hacia la proteína. Las secuencias polinucleotídicas incluyen tanto las secuencias de longitud total así como las secuencias más cortas derivadas a partir de las secuencias de longitud total. Se entiende que una secuencia polinucleotídica particular incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden ser introducidas para proveer una preferencia del codón en una célula hospedera específica. Las variaciones alélicas de las secuencias ejemplificadas también están dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias polinucleotídicas que caen dentro del alcance de la presente invención incluyen adicionalmente secuencias que hibridan de manera específica con las secuencias ejemplificadas. Los polinucleótidos incluyen tanto las cadenas sentido y antisentido así como cadenas individuales o en dúplex. La sustitución de aminoácidos diferentes a aquellos ejemplificados de manera específica en los mutantes descritos en la presente invención también se contempla dentro del alcance de la presente invención. Los aminoácidos se pueden colocar en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos, y ácidos. Las sustituciones conservativas en donde un polipéptido AGP muíante que tiene un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido de la misma clase caen dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando el polipéptido AGP mutante que tiene la sustitución retenga aún así la estabilidad incrementada al calor con relación al polipéptido de tipo silvestre. El cuadro 2 a continuación provee una lista de los ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.
CUADRO 2
Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos No polar Ala, Val, Leu, He, Pro, et, Phe, Trp Polar no cargado Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Acido Asp, Glu Básico Lys, Arg, His Por ejemplo, la sustitución de la tirosina en la posición 333 en los mutantes HS 33, HS 7+3, HS 6+3, y HS 7+6+3 con otros aminoácidos, tales como glicina, serina, treonina, cisteína, asparagina, y glutamina, están abarcadas dentro del alcance de la invención. También específicamente contemplada dentro del alcance de la invención está la sustitución ya sea de una fenilalanina o de una metionina en la posición 333 en la subunidad grande de la AGP. Por lo tanto, una combinación de fenilalanina o de metionina en la posición 333 ya sea con una valina en la posición 177 o una valina en la posición 396, o ambas, se contemplan específicamente por la presente invención. Similarmente, la sustitución de la valina en las posiciones 177 y 396 en los mutantes RTS 48-2, RTS 60-1 , HS 7+3, HS 7+6, y HS 7+6+3 con otros ácidos aminoácidos tales como leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina, y triptofano, esta dentro del alcance de la invención. Las sustituciones de aminoácidos en las posiciones diferentes al sitio de la mutación estable al calor también se contemplan dentro del alcance de la invención siempre y cuando el polipéptido retenga o confiera estabilidad incrementada al calor con relación a los polipéptidos de tipo silvestre. Los polinucleótidos y proteínas de la presente invención también pueden definirse en términos de mayor intervalo de identidad y/o similitud particular con aquellos ejemplificados en la presente invención. La identidad de secuencia típicamente será mayor del 60%, preferiblemente mayor del 75%, más preferiblemente mayor del 80%, incluso más preferiblemente mayor del 90%, y puede ser mayor del 95%. La identidad y/o similitud de una secuencia puede ser 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 8 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% en comparación con una secuencia ejemplificada en la presente invención. A menos que se especifique de otra manera, como se utiliza en la presente invención, el porcentaje de identidad y/o similitud de secuencia de dos secuencias puede determinarse utilizando el algoritmo de Karlin y AltschuI (Karlin y AltschuI
[1990] Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), modificado como en Karlin y AltschuI (Karlin y AltschuI
[1993] Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Dicho algoritmo se incorpora dentro de los programas NBLAST y XBLAST de AltschuI et al. (AltschuI et al.
[1990] J. Mol. Biol. 215: 402-410). Las búsquedas de BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST, evaluación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias con el porcentaje de identidad de secuencia deseado. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos de comparación, el BLAST con espacios puede ser utilizado como se describe en AltschuI et al. (AltschuI et al.] [ 997] Nucí. Acids Res. 25: " 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con espacios, los parámetros por omisión de los programas respectivos (NBLAST y XBLAST) pueden ser utilizados. Véase la página en la red NCBI/NIH. La presente invención también concierne a polinucleótidos los cuales codifican fragmentos del polipéptido muíante de longitud total, siempre y cuando esos fragmentos retengan sustancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido de longitud total. Los fragmentos del polipéptido AGP mutante codificado por esos polinucleótidos también están dentro del alcance de la presente invención. Los fragmentos de la secuencia de longitud total se pueden preparar utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica. La presente invención también contempla aquellas moléculas polinucleotídicas que codifican enzimas biosintéticas de almidón que tienen secuencias que son suficientemente homologas con la secuencia de tipo silvestre de manera que se permite la hibridación con esa secuencia bajo condiciones severas estándares y métodos estándares (Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook
[1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Como se utiliza en la presente invención, condiciones "severas" para la hibridación se refiere a condiciones en donde la hibridación se lleva a cabo típicamente durante toda la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en SSPE 6x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0.1 %, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula (Beltz, G. A., K. A. Jacobs, T. H. Eickbush, P. T. Cherbas, y F. C. Kafatos
[1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100: 266-285): Tm = 81.5°C + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (% de G+C)-0.61 (% de formamida)-6 00/longitud del dúplex en pares de bases.
Típicamente los lavados se llevan a cabo como sigue: (1 ) dos veces a temperatura ambiente por 15 minutos en SSPE 1x, SDS al 0.1 % (lavado a baja severidad). (2) una vez a Tm-20°C por 15 minutos en SSPE 0.2x, SDS al 0.1 % (lavado a severidad moderada). Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención pueden ser utilizadas para transformar plantas para que expresen la enzima mutante estable al calor en esas plantas. Además, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para expresar la enzima variante recombinante. Estos también pueden ser utilizados como una sonda para detectar enzimas relacionadas. Los polinucleótidos también pueden ser utilizados como estándares de tamaño del ADN. Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención también incluyen aquellos polinucleótidos que codifican enzimas biosintéticas del almidón, tales como enzimas AGP, que contienen mutaciones que pueden conferir peso incrementado de la semilla, además de estabilidad al calor mejorada, a la planta que expresar estas mutantes. La combinación de una mutación estabilizante al calor, tal como, por ejemplo, Sh2-HS 7+6 o Sh2-HS 7+3, con una mutación que confiere peso incrementado de la semilla, por ejemplo, Rev6, en un polinucleótido que codifica la subunidad grande de la AGP se contempla específicamente en la presente invención. Las patentes de E.U.A. Nos. 5, 589, 618 y 5, 650, 557 describen polinucleótidos (por ejemplo, Rev6) que codifican mutaciones en la subunidad grande de AGP que confieren peso incrementado de la semilla en plantas que expresan el polipéptido muíante. Las mutaciones de las subunidades AGP que confieren estabilidad al calor pueden combinarse de conformidad con la presente invención con mutantes del maíz insensibles al fosfato, tales como la mutación Rev6, para mejorar la estabilidad de la Rev6 que codifica la subunidad grande. Se espera que la actividad enzimática de SSS se mejore a temperaturas mayores como se observa con AGP. Por lo tanto, las formas mutadas de SSS pueden ser expresadas bajo condiciones térmicas incrementadas (42°C), para aislar variantes estables al calor de conformidad con los métodos descritos en la presente invención. Estas formas mutadas de SSS estables al calor son aspectos adicionales de la presente invención. La presente invención también concierne a métodos para incrementar características de rendimiento de plantas bajo condiciones de estrés por calor mediante la incorporación de un polinucleótido de la presente invención que comprende una mutación en una enzima para la biosíntesis del almidón que confiere estabilidad o resistencia incrementada a las condiciones de estrés por calor y una mutación que confiere características de rendimiento incrementado en la planta. Las características de rendimiento incrementado incluyen, por ejemplo, número de semillas incrementado, peso de semillas incrementado, biomasa de la planta incrementada, e índice de cosecha incrementado.
Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales, y publicaciones referidas o citadas en la presente invención se incorporan aquí como referencias en su totalidad hasta el grado en que no son inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación. A continuación se encuentran los ejemplos que ilustran procedimientos para la práctica de la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes. Todos los porcentajes son por peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes están en volumen a menos que se mencione de otra manera.
EJEMPLO 1 Evaluación de las APP-glucosa pirofosforilasas del endospermo del maíz que tienen múltiples mutaciones de aminoácidos
Expresión de las APP-glucosa pirofosforilasas del endospermo del maíz. Alícuotas de 10 mi de caldo Luria (75 g/mL de espectinomicina y 50 g/mL de canamicina) fueron inoculadas a partir de cultivos madre en glicerol de células de E. coli AC70R1-504 que expresan ya sea ADP-glucosa pirofosforilasa de endospermo del maíz o de tubérculo de patata, y se crecieron durante toda la noche a 37°C con agitación a 220 rpm. Estos cultivos se utilizaron para inocular 250 mL de caldo Luria (75 g/mL de espectinomicina y 50 g/mL de canamicina). Los cultivos se crecieron hasta una D06oo= 0.55 a 37°C con agitación a 220 rpm. Los cultivos fueron inducidos con isopropil-D-tiogalactósido 0.2 mM y 0.02 mg/mL de ácido nalidíxico por 7 horas a temperatura ambiente con agitación a 220 rpm. Las células de cosecharon a 3500 rpm por 10 minutos a 4°C. Los concentrados celulares fueron suspendidos en 800 L del regulador de pH para extracción: HEPES 50 mM, pH 7.5, MgCI2 5 mM, EDTA 5 mM, sacarosa al 20%, y sulfato de amonio al 30%. Se añadieron DTT (1 mM), 50 g/ml de lisozima, 1 g/mL de pepstatina, 1 g/mL de leupeptina, 1 g/mL de antipaina, 10 g/mL de quimostatina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, y benzamidina 1 mM al regulador de pH para extracción justo antes de su uso. Los lisados fueron sonicados tres veces por tres segundos con incubación en hielo entre las sonicaciones. Las muestras fueron centrifugadas por 1 minuto a 13,000 rpm a 4°C. Los sobrenadantes fueron removidos y se alicuotaron para los ensayos.
Combinación de mutaciones individuales. Se diseñó una estrategia de subclonación para estudiar los efectos de las mutaciones en combinación con HS 33, y entre sí. Para combinar las mutaciones de reversión de RTS 48-2 y RTS 60-1 , los plásmidos que contenían cada mutación para reversión (las mutaciones parenterales sensibles a temperatura fueron removidas antes de combinar las mutaciones) fueron digeridas con Eco RV y se intercambió un fragmento de 339 pb de RTS 48-2 por el fragmento correspondiente de RTS 60-1 (figura 3). El plásmido resultante fue designado Sh2-HS 7+6. Una estrategia similar se utilizó para combinar la mutación de reversión de RTS 48-2 con la mutación identificada en HS 33. Los plásmidos que contenían la mutación fueron digeridos con Eco RV y se intercambió un fragmento de 339 pb de RTS 48-2 por el fragmento correspondiente de HS 33. El plásmido resultante se designó Sh2-HS 7+3. Para combinar la mutación de reversión de RTS 60-1 con la mutación identificada en HS 33, los plásmidos que contenían las mutaciones fueron digeridos con Mun ?/??? I y un fragmento de 390 pb de RTS 60-1 se intercambió por el fragmento correspondiente de HS 33 (figura 3). El plásmido resultante se designó Sh2-HS 6+3. Con el objeto de combinar las mutaciones de reversión de RTS 60-1 y RTS 48-2 con la mutación identificada en HS 33, el plásmido Sh2-HS 6+3 y un plásmido que contenía la mutación de reversión RTS 48-2 fueron digeridos con Eco RV y un fragmento de 339 pb de RTS 48-2 se intercambió por el fragmento correspondiente de Sh2-HS 6+3. El plásmido resultante se designó Sh2-HS 7+6+3. Las secuenciación final de todos los plásmidos se llevó a cabo utilizando seis iniciadores para cubrir toda la región codificante de Sh2 en ambas direcciones. Los iniciadores utilizados son los siguientes: LHBBL (5'— ? 3'): 5'-CGACTCACTATAGGGAGACC-3' (SEQ ID
NO. 5); LH27 (5' 5 -CCCTATGAGTAACTG-3' (SEQ ID NO. 6); LH9 (5' — ? 3'): 5'-TATACTCAATTACAT-3' (SEQ ID NO. 7); LHBB2 (3'? 5'): 5'-GTGCCACCTGACGTCTAAG-3' (SEQ ID
NO. 8); LH2135 5'): 5'-CAGAGCTGACACGTG-3' (SEQ ID NO. 9);
LH32 (3'? 5'): 5'-AAGCTGATCGCCACTC-3' (SEQ ID NO.
10).
Tratamiento con calor de la ADP- glucosa pirofosforilasa. La ADP-glucosa pirofosforilasa de tipo silvestre (sh2) y muíante que contenían cambios de aminoácidos con una sola mutación de aminoácidos (HS 33, RTS 48-2, RTS 60-1) y con mutaciones múltiples (HS 7+3, por ejemplo, RTS 48-2 más HS 33; HS 6+3, por ejemplo, RTS 60-1 menos HS 33; y HS 7+6, por ejemplo, RTS 48-2 más RTS 60-1) fueron evaluadas para actividad enzimática antes y después del tratamiento con calor. El tratamiento con calor consistió de la incubación de la proteína prueba a 60°C por 5 minutos. El porcentaje de actividad remanente después del tratamiento con calor a 60°C por 5 minutos se presenta en el cuadro 3. Los fenotipos en la serie de datos son Sh2 tipo silvestre, HS 33, RTS 60-1 (solamente mutación de reversión), RTS 48-2 (solamente mutación de reversión), Sh2-HS 7+6, Sh2-HS 6+3, Sh2-HS 7+3, y S 2-HS 7+6+3.
CUADRO 3
a error estándar de la media b número de réplicas experimentales Representa el intervalo, más que la S.E.M.
La actividad antes del tratamiento con calor para Sh2 tipo silvestre, HS 33, RTS 60-1 , RTS 48-2, Sh2-HS 7+6, Sh2-HS 6+3, Sh2-HS 7+3, y Sh2-HS 7+6+3 se muestra en el cuadro 4. HS 33 tiene una actividad de 2.1 más veces que la Sh2 de tipo silvestre. Tanto RTS 48-2 como RTS 60-1 muestra un incremento de 1.4 veces en actividad. Su mutante doble contiene un incremento de 1.9 veces en su actividad. Aunque la combinación de los dos mutantes incrementa la actividad, el mutante doble no experimenta efectos sinergísticos. La mutación de RTS 60-1 cuando se combina con la de HS 33 experimenta un efecto aditivo, elevando la actividad 3.4 veces en comparación con Sh2 de tipo silvestre. La mutación de RTS 48-2 en combinación con la de HS 33 exhibe un incremento ligeramente menor a 2.9 veces. De manera interesante, el muíante triple muestra un incremento ligeramente mayor que ya sea la mutación de reversión sola de un segundo sitio, pero menor que el muíante doble entre los revertidos del segundo sitio.
CUADRO 4
a error esíándar de la media b número de réplicas experimeníales n/a no aplicable Ensayos de ADP-qlucosa pirofosforilasa. Para obtener datos cuantitativos para los mutantes descritos anteriormente, se midió la actividad con el ensayo de síntesis (sentido) que mide la incorporación de [14C] glucosa-1-P dentro del nucleótido de azúcar de la ADP- glucosa. Los ensayos fueron llevados a cabo en extractos de enzima sin purificar preparados como se describe a continuación. La reacción de síntesis de ADP-glucosa mide la incorporación de [14C] glucosa-1-? dentro de la ADP- glucosa. La mezcla de reacción contenía HEPES 80 mM, pH 7.5, glucosa-1-? 1 mM, MgCI2 4 mM, 0.5 mg mL-1 de albúmina se suero de bovino, 3-PGA 10 mM, y 5,000 cpm de [14C]glucosa-1-P. El volumen de reacción fue de 50 mL. Los ensayos se iniciaron mediante la adición de ATP 1.5 mM. La reacción se incubó por 30 minutos a 37°C y se terminó mediante la ebullición por 2 minutos. La glucosa-1-? no incorporada se escindió mediante la adición de 0.3 U de fosfatasa alcalina bacteriana (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) y la incubación por 2.5 horas a 37°C. Una alícuota de 20 mL de la mezcla de reacción se goteó sobre papel DEAE, se lavó con agua destilada tres veces, se secó, y se cuantificó en un contador de centelleo líquido. Los resultados adicionales para los mutantes únicos y mutantes dobles se muestran en la figura 2. Para el muíante de combinación Sh2-HS 7+6 (RTS 84-2 más RTS 60-1 ) y el mutante de combinación Sh2-HS 6+3 (RTS 60-1 más HS 33), los números dados son el promedio de los datos a partir de 3 diluciones de la enzima (en duplicado), multiplicados por su factor de dilución, menos el nivel de fondo. Para el muíante de combinación Sh2-HS 7+3 (RTS 48-2 más HS 33), los números dados son el promedio de 2 diluciones de la enzima (en duplicado), multiplicados por su factor de dilución, menos el nivel de fondo. La representación gráfica de los números se llevó a cabo utilizando Microsoft Excel.
EJEMPLO 2 Combinación de mutaciones para estabilidad al calor con Rev6
De conformidad con la presente invención, las mutaciones estable al calor pueden ser combinadas con una mutación asociada con peso elevado de la semilla, tal como, por ejemplo, la mutación Rev6. El objetivo es mantener la insensibilidad deseada al fosfato característica de Rev6 mientras que se mejora su estabilidad. Los mutantes que comprenden mutaciones estables al calor combinadas con la mutación Rev6 pueden construirse y confirmarse como se describe a continuación. Estas mutantes de "combinación" pueden ser transformadas dentro de AC70R1-504 que porta la subunidad pequeña de tipo silvestre. La estabilidad incrementada al calor puede identificarse fácilmente mediante una tinción positiva para el glucógeno en un medio con baja glucosa. Rev6 no tiñe cuando las células se crecen en este medio. Inicialmente todas las combinaciones de mutantes pueden seleccionarse enzimáticamente para el mantenimiento de la insensibilidad al fosfato, y solamente las combinaciones que mantienen la insensibilidad al fosfato se analizan adicionalmente. Debe entenderse que los ejemplos y las modalidades descritas en la presente invención son solamente para ejemplos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de las mismas serán sugeridas por las personas expertas en la técnica y serán incluidas dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas.
LISTADO DE SECUENCIA
<110> Hannah, L. Curtís Greene, Thomas W. Burger, Brian <120> Mutantes estables al calor de enzimas para la biosíntesis del almidón <130> UF-305 <160> 10 <170> Patente En versión 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> utante HS 33 de Zea mays <400> 1 Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp Tyr 1 5 10 15
Ser Val Gln Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr 20 25 30 lie
<210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Mutante RTS48-2 de Zea mays <400> 2 Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Val Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15
Ser lie Arg Lys 20
<210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Mutante RTS60-1 de Zea mays Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Val Phe lie Ser Asp Gly Cys Leu Leu 1 5 10 15
Arg Glu
<210> 4 <211> 7739 <212> ADN <213> alelo Shrunken-2 de tipo silvestre de Zea mays <400> 4 taagaggggt gcacctagca tagatttttt gggctccctg gcctctcctt tcttccgcct 60 gaaaacaacc tacatggata catctgcaac cagagggagt atctgatgct ttttcctggg 120 cagggagagc tatgagacgt atgtcctcaa agccactttg cattgtgtga aaccaatatc 180 gatctttgtt acttcatcat gcatgaacat ttgtggaaac tactagctta caagcattag 240 tgacagctca gaaaaaagtt atctctgaaa ggtttcatgt gtaccgtggg aaatgagaaa 300 tgttgccaac tcaaacacct tcaatatgtt gtttgcaggc aaactcttct ggaagaaagg 360 tgtctaaaac tatgaacggg ttacagaaag gtataaacca cggctgtgca ttttggaagt 420 atcatctata gatgtctgtt gaggggaaag ccgtacgcca acgttattta ctcagaaaca 480 gcttcaacac acagttgtct gctttatgat ggcatctcca cccaggcacc caccatcacc 540 tattcaccta tctctcgtgc ctgtttattt tcttgccctt tctgatcata aaaaatcatt 600 aagagtttgc aaacatgcat aggcatatca atatgctcat ttattaattt gctagcagat 660 catcttccta ctctttactt tatttattgt ttgaaaaata tgtcctgcac ctagggagct 720 cgtatacagt accaatgcat cttcattaaa tgtgaatttc agaaaggaag taggaaccta 780 tgagagtatt tttcaaaatt aattagcggc ttctattatg tttatagcaa aggccaaggg 840 caaaatcgga acactaatga tggttggttg catgagtctg tcgattactt gcaagaaatg 900 tgaacctttg tttctgtgcg tgggcataaa acaaacagct tctagcctct tttacggtac 960 ttgcacttgc aagaaatgtg aactcctttt catttctgta tgtggaca'ta atgccaaagc 1020 atccaggctt tttcatggtt gttgatgtct ttacacagtt cat'ctccacc agtatgccct 1080 cctcatactc tatataaaca catcaacagc atcgcaatta gccacaagat cacttcggga 1140 ggcaagtgtg atttcgacct tgcagccacc tttttttgtt ctgttgtaag tatactttcc 1200 cttaccatct ttatctgtta gtttaatttg taattgggaa gtattagtgg aaagaggatg 1260 agatgctatc atctatgtac tctgcaaatg catctgacgt tatatgggct gcttcatata 1320 atttgaattg ctccattctt gccgacaata tattgcaagg tatatgccta gttccatcaa 1380 aagttctgtt ttttcattct aaaagcattt tagtggcacg caattttgtc catgagggaa 1440 aggaaatctg ttttggttac tttgcttgag gtgcattctt catatgtcca gttttatgga 1500 agtaataaac ttcagtttgg tcataagatg tcatattaaa gggcaaacat atattcaatg 1560 ttcaattcat cgtaaatgtt ccctttttgt aaaagattgc atactcattt atttgagttg 1620 caggtgtatc tagtagttgg aggagatatg cagtttgcac ttgcattgga cacgaactca 1680 ggtcctcacc agataagatc ttgtgagggt gatgggattg acaggttgga aaaattaagt 1740 attgggggca gaaagcagga gaaagctttg agaaataggt gctttggtgg tagagttgct 1800 gcaactacac aatgtattct tacctcagat gcttgtcctg aaactcttgt aagtatccac 1860 ctcaattatt actcttacat gttggtttac tttacgtttg tcttttcaag ggaaatttac 1920 tgtafcttttt gtgttttgtg ggagttctat acttctgttg gactggttat tgtaaagatt 1980 tgttcaaata gggtcatcta ataattgttt gaaatctggg aactgtggtt tcactgcgtt 2040 caggaaaaag tgaattattg gttactgcat gaataactta tggaaataga ccttagagtt 2100 gctgcatgat tatcacaaat cattgctacg atatcttata atagttcttt cgacctcgca 2160 ttacatatat aactgcaact cctagttgcg ttcaaaaaaa aaaatgcaac tcttagaacg 2220 ctcaccagtg taatctttcc tgaattgtta tttaatggca tgtatgcact acttgtatac 2280 ttatctagga ttaagtaatc taactctagg ccccatattt gcagcattct caaacacagt 2340 cctctaggaa aaattatgct gatgcaaacc gtgtatctgc tatcattttg ggcggaggca 2400 ctggatctca gctctttcct ctgacaagca caagagctac gcctgctgta agggataaca 2460 ctgaacatcc aacgttgatt actctattat agtattatac agactgtact tttcgaattt 2520 atcttagttt tctacaatat ttagtggatt cttctcattt tcaagataca caattgatcc 2580 ataatcgaag tggtatgtaa gacagtgagt taaaagatta tattttttgg gagacttcca 2640 gtcaaatttt cttagaagtt tttttggtcc agatgttcat aaagtcgccg ctttcatact 2700 ttttttaatt ttttaattgg tgcactatta ggtacctgtt ggaggatgtt acaggcttat 2760 tgatatccct atgagtaact gcttcaacag tggtataaat aagatatttg tgatgagtca 2820 gttcaattct acttcgctta accgccatat tcatcgtaca taccttgaag gcgggatcaa 2880 ctttgctgat ggatctgtac aggtgattta cctcatcttg ttgatgtgta atactgtaat 2940 taggagtaga tttgtgtgga gagaataata aacagatgcc gagattcttt tctaaaagtc 3000 tagatccaaa ggcattgtgg ttcaaaacac tatggacttc taccatttat gtcattactt 3060 tgccttaatg ttccattgaa tggggcaaat tattgattct acaagtgttt aattaaaaac 3120 taattgttca tcctgcaggt attagcggct acacaaatgc ctgaagagcc agctggatgg 3180 ttccagggta cagcagactc tatcagaaaa tttatctggg tactcgaggt agttgatatt 3240 ttctcgttta tgaatgtcca ttcactcatt cctgtagcat tgtttctttg taattttgag 3300 ttctcctgta tttctttagg attattacag tcacaaatcc attgacaaca ttgtaatctt 3360 gagtggcgat cagctttatc ggatgaatta catggaactt gtgcaggtat ggtgttctct 3420 tgttcctcat gtttcacgta atgtcctgat tttggattaa ccaactactt ttggcatgca 3480 ttatttccag aaacatgtcg aggacgatgc tgatatcact atatcatgtg ctcctgttga 3540 tgagaggtaa tcagttgttt atatcatcct aatatgaata tgtcatcttg ttatccaaca 3600 caggatgcat atggtctaat ctgctttcct tttttttccc ttcggaagcc gagcttctaa 3660 aaatgggcta gtgaagattg atcatactgg acgtgtactt caattctttg aaaaaccaaa 3720 gggtgctgat ttgaattcta tggttagaaa ttccttgtgt aatccaattc ttttgttttc 3780 ctttctttct tgagatgaac ccctctttta gttatttcca tggataacct gtacttgact 3840 tattcagaaa tgattttcta ttttgctgta gaatctgaca ctaaagctaa tagcactgat 3900 gttgcagaga gttgagacca acttcctgag ctatgctata gatgatgcac agaaatatcc 3960 ataccttgca tcaatgggca tttatgtctt caagaaagat gcacttttag accttctcaa 4020 gtaatcactt tcctgtgact tatttctatc caactcctag tttaccttct aacagtgtca 4080 attcttaggt caaaatatac tcaattacat gactttggat ctgaaatcct cccaagagct 4140 gtactagatc atagtgtgca ggtaagtctg atctgtctgg agtatgtgtt ctgtaaactg 4200 taaattcttc atgtcaaaaa gttgtttttg tttccagttt ccactaccaa tgcacgattt 4260 atgtattttc gcttccatgc atcatacata ctaacaatac attttacgta ttgtgttagg 4320 catgcatttt tacgggctat tgggaggatg ttggaacaat caaatcattc tttgatgcaa 4380 acttggccct cactgagcag gtactctgtc atgtattctg tactgcatat atattacctg 4440 gaattcaatg catagaatgt gttagaccat cttagttcca tcctgttttc ttcaattagc 4500 ttatcattta atagttgttg gctagaattt aaacacaaat ttacctaata tgtttctctc 4560 ttcagccttc caagtttgat ttttacgatc caaaaacacc tttcttcact gcaccccgat 4620 gcttgcctcc gacgcaattg gacaagtgca aggtatatgt cttactgagc acaattgtta 4680 cctgagcaag attttgtgta cttgacttgt tctcctccac agatgaaata tgcatttatc 4740 tcagatggtt gcttactgag agaatgcaac atcgagcatt ctgtgattgg agtctgctca 4800 cgtgtcagct ctggatgtga actcaaggta catactctgc caatgtatct actcttgagt 4860 ataccatttc aacaccaagc atcaccaaat cacacagaac aatagcaaca aagcctttta 4920 gttccaagca atttagggta gcctagagtt gaaatctaac aaaacaaaag tcaaagctct 4980 atcacgtgga tagttgtttt ccatgcactc ttatttaagc taattttttg ggtatactac 5040 atccatttaa ttattgtttt attgcttctt ccctttgcct ttcccccatt actatcgcgt 5100 cttaagatca tactacgcac tagtgtcttt agaggtctct ggtggacatg ttcaaaccat 5160 ctcaatcggt gttggacaag tttttcttga atttgtgcta cacctaacct atcacgtatg 5220 tcatcgtttc aaactcgatc cttcctgtat catcataaat ccaatgcaac atacgcattt 5280 atgcaacatt tatctgttga acatgtcatc tttttgtagg ttaacattat gcaccataca 5340 atgtagcatg tctaatcatc atcctataaa atttacattt tagcttatgt ggtatcctct 5400 tgccacttag aacaccatat gcttgatgcc atttcatcca ccctgctttg attctatggc 5460 taacatcttc attaatatcc tcgcctctct gtatcattgg tcctaaatat ggaaatacat 5520 tctttctggg cactacttga ccttccaaac taacgtctcc tttgctcctt tcttgtgtgt 5580 agtagtaccg aagtcacatc tcatatattc ggttttagtt ctactaagtc ccgggttcga 5640 tccccctcag gggtgaattt cgggcttggt aaaaaaaatc ccctcgctgt gtcccgcccg 5700 ctctcgggga tcgatatcct gcgcgccacc ctccggctgg gcattgcaga gtgagcagtt 5760 gatcggctcg ttagtgatgg ggagcggggt tcaagggttt tctcggccgg gaccatgttt 5820 cggtctctta atataatgcc gggagggcag tctttccctc cccggtcgag ttttagttct 5880 accgagtcta aaacctttgg actctagagt cccctgtcac aactcacaac tctagttttc 5940 tatttacttc tacctagcgt ttattaatga tcactatatc gtctgtaaaa agcatacacc 6000 aatgtaatcc ccttgtatgt cccttgtaat attatccatc acaagaaaaa aaggtaaggc 6060 tcaaagttga cttttgatat agtcctattc taatcgagaa gtcatctgta tcttcgtctc 6120 ttgttcgaac actagtcaca aaattttttg tacatgttct taatgagtcc aacgtaatat 6180 tccttgatat tttgtcataa gccctcatca agtcaatgaa aatcacgtgt aggtccttca 6240 tttgttcctt atactgctcc atcacttgtc tcattaagaa aatctctctc atagttaacc 6300 ttttggcatg aaacaaaatc acacagaagt tgtttccttt ttttaagatc ccacacaaaa 6360 gaggtttgat ctaaggaatc tggatccctg acaggtttat caaaatcctt tgtgtttttc 6420 ttaaaactga atattcctcc agcttctagt attgatgtaa tattcaatct gtttagcaag 6480 tgaacacctt ggttcttgtt gttactgtac cccccccccc cccccccccc cgaggcccag 6540 attaccacga catgaataca agaatattga acccagatct agagtttgtt tgtactgttg 6600 aaaatcggtg acaattcatt ttgttattgc gctttctgat aacgacagga ctccgtgatg 6660 atgggagcgg acacctatga aactgaagaa gaagcttcaa agctactgtt agctgggaag 6720 gtcccagttg gaataggaag gaacacaaag ataaggtgag tatggatgtg gaaccaccgg 6780 ttagttccca aaaatatcac tcactgatac ctgatggtat cctctgatta ttttcaggaa 6840 ctgtatcatt gacatgaatg ctaggattgg gaagaacgtg gtgatcacaa acagtaaggt 6900 gagcgagcgc acctacatgg gtgcagaatc ttgtgtgctc atctatccta attcggtaat 6960 tcctatccag cgctagtctt gtgaccatgg ggcatgggtt cgactctgtg acagggcatc 7020 caagaggctg atcacccgga agaagggtac tacataaggt ctggaatcgt ggtgatcttg 7080 aagaatgcaa ccatcaacga tgggtctgtc atatagatcg gctgcgtgtg cgtctacaaa 7140 acaagaacct acaatggtat tgcatcgatg gatcgtgtaa ccttggtatg gtaagagccg 7200 cttgacagaa agtcgagcgt tcgggcaaga tgcgtagtct ggcatgctgt tccttgacca 7260 tttgtgctgc tagtatgtac tgttataagc tgccctagaa gttgcagcaa acctttttat 7320 gaacctttgt atttccatta cctgctttgg afccaactata tctgtcatcc tatatattac taaattttta cgtgtttttc taattcggtg ctgcttttgg gatctggctt cgatgaccgc tcgaccctgg gccattggtt cagctctgtt ccttagagca actccaagga gtcctaaatt ttgtattaga tacgaaggac ttcagccgtg tatgtcgtcc tcaccaaacg ctctttttgc atagtgcagg ggttgtagac ttgtagccct tgtttaaaga ggaatttgaa tatcaaatta taagtattaa atatatattt aattaggtta acaaatttgg ctcgttttta gtctttattt atgtaattag ttttaaaaat agacctatat ttcaatacga aatatcatta acatcgata
<210> 5 <211 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético <400> 5 cgactcacta tagggagacc
<210> 6 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético <400> 6 ccctatgagt aactg
<210> 7 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético <400> 7 tatactcaat tacat 15
<210> 8 <211 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético
<400> 8 gtgccacctg acgtctaag 19
<210> 9 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético
<400> 9 cagagctgac acgtg 15
<210> 10 <2XX 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador del oligonucleótido sintético
<400> 10 aagctgatcg ccactc 1S
Claims (1)
- NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polinucleótido que codifica una subunidad grande muíante de un polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa vegetal, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido muíante, en donde dicho polipéptido muíante comprende mutaciones de aminoácidos en dos o más sitios en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido y en donde dicho polipéptido mutaníe se expresa con la subunidad pequeña de la ADP-glucosa pirofosforilasa para formar una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa muíaníe, dicha enzima muíante o un fragmento biológicamente tipo de dicha enzima muíante, exhibe estabilidad incrementada al calor en relación con la enzima ADP-glucosa pirofosforilasa de tipo silvestre. 2.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha enzima muíante exhibe actividad enzimática que es substancialmente la misma o que es mayor que la exhibida por una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa que solamente tiene una sustiíución de un solo aminoácido de una histidina por firosina en la posición 333 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de íipo silvesíre del maíz. 3.- El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una mutación de un primer aminoácido en donde el aminoácido histidina que corresponde a la posición 333 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 4. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la histidina en la posición número 333 se selecciona a partir del grupo que consiste de tirosina, fenilalanina, metionina, glicerina, serina, treonina, cisteína, asparagina, y glutamina. 5. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la histidina en la posición número 333 es tirosina. 6. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la histidina en la posición número 333 es fenilalanina. 7. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la histidina en la posición número 333 es metionina. 8.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una primera muíación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 9. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 10. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una valina. 11.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una primera mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvesíre del polipépíido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz esíá reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutanfe. 12.- El polinucleófido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 13.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 14. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 15. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición 177 es una valina. 16.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 17 - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 18.- El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 16, caracíerizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una valina. 19. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 20. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 21. -El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 19, caracíerizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una valina. 22. - El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 6, caracíerizado además porque dicho polipépíido muíaníe codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de íipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíanle. 23. - El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 22, caracíerizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 24. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una valina. 25. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 177 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 26. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 177 es una prolina. 27. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza al alanina en la posición número 177 es una valina. 28. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 29. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 30. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforiiasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 31. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 32. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforiiasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 33. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 34. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 35. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 36. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 37. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 38. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 39.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una vaüna. 40.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 41.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 42.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP- glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 43. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 44. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 45. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 46. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 47. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 48. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 49. - El polinucleófido de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 50. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha esíabilidad incremeníada al calor en dicha enzima muíante. 51. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 52 - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 53. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 54. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 55. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 56. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 57.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 58.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 59.- El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 58, caracíerizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 60.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho polipéptido mutaníe codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP- glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 61. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 62. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mufación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 63. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 64. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho polipéptido muíante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de íipo silvesíre del polipépíido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima muíante. 65. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 66. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 67. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 68. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 69. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 70. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 71. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 72. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho polipéptido mutante codificado por dicho polinucleótido comprende una segunda mutación de aminoácido en donde el aminoácido alanina que corresponde a la posición 396 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz está reemplazado por un aminoácido que confiere dicha estabilidad incrementada al calor en dicha enzima mutante. 73. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la alanina en la posición número 396 es una valina. 74. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha proteína mutante codificada por el polinucleótido comprende adicionalmente una mutación de aminoácidos que confiere peso incrementado de semilla a una planta que expresa dicho polinucleótido. 75. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende la mutación Rev6. 76. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una enzima AGP de la subunidad grande en donde al menos un residuo de serina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 494 y 495 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP- glucosa pirofosforilasa del maíz de la subunidad nativa de la enzima AGP. 77. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una enzima AGP de la subunidad grande en donde al menos un residuo de serina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 494 y 495 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP- glucosa pirofosforilasa del maíz de la subunidad nativa de la enzima AGP. 78.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una enzima AGP de la subunidad grande en donde al menos un residuo de serina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 495 y 496 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre del polipéptido de ADP- glucosa pirofosforilasa del maíz de la subunidad nativa de la enzima AGP. 79.- Un método para incrementar la resistencia de una planta a condiciones de estrés por calor, dicho método comprendiendo la incorporación de un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste del polinucleótido de la reivindicación 1 , el polinucleótido de la reivindicación 2, el polinucleótido de la reivindicación 3, el polinucleótido de la reivindicación 4, el polinucleótido de la reivindicación 5, el polinucleótido de la reivindicación 6, el polinucleótido de la reivindicación 7, el polinucleótido de la reivindicación 8, el polinucleótido de la reivindicación 9, el polinucleótido de la reivindicación 10, el polinucleótido de la reivindicación 1, el polinucleótido de la reivindicación 12, el polinucleótido de la reivindicación 13, el polinucleótido de la reivindicación 14, el polinucleótido de la reivindicación 15, el polinucleótido de la reivindicación 16, el polinucleótido de la reivindicación 17, el polinucleótido de la reivindicación 18, el polinucleótido de la reivindicación 19, el polinucleótido de la reivindicación 20, el polinucleótido de la reivindicación 21, el polinucleótido de la reivindicación 22, el polinucleótido de la reivindicación 23, el polinucleótido de la reivindicación 24, el polinucleótido de la reivindicación 25, el polinucleótido de la reivindicación 26, el polinucleótido de la reivindicación 27, el polinucleótido de la reivindicación 28, el polinucleótido de la reivindicación 29, el polinucleótido de la reivindicación 30, el polinucleótido de la reivindicación 31 , el polinucleótido de la reivindicación 32, el polinucleótido de la reivindicación 33, el polinucleótido de la reivindicación 34, el polinucleótido de la reivindicación 35, el polinucleótido de la reivindicación 36, el polinucleótido de la reivindicación 37, el polinucleótido de la reivindicación 38, el polinucleótido de la reivindicación 39, el polinucleótido de la reivindicación 40, el polinucleótido de la reivindicación 41, el polinucleótido de la reivindicación 42, el polinucleótido de la reivindicación 43, el polinucleótido de la reivindicación 44, el polinucleótido de la reivindicación 45, el polinucleótido de la reivindicación 46, el polinucleótido de la reivindicación 47, el polinucleótido de la reivindicación 48, el polinucleótido de la reivindicación 49, el polinucleótido de la reivindicación 50, el polinucleótido de la reivindicación 51 , el polinucleótido de la reivindicación 52, el polinucleótido de la reivindicación 53, el polinucleótido de la reivindicación 54, el polinucleótido de la reivindicación 55, el polinucleótido de la reivindicación 56, el polinucleótido de la reivindicación 57, el polinucleótido de la reivindicación 58, el polinucleótido de la reivindicación 59, el polinucleótido de la reivindicación 60, el polinucleótido de la reivindicación 61 , el polinucleótido de la reivindicación 62, el polinucleótido de la reivindicación 63, el polinucleótido de la reivindicación 64, el polinucleótido de la reivindicación 65, el polinucleótido de la reivindicación 66, el polinucleótido de la reivindicación 67, el polinucleótido de la reivindicación 68, el polinucleótido de la reivindicación 69, el polinucleótido de la reivindicación 70, el polinucleótido de la reivindicación 71 , el polinucleótido de la reivindicación 72, y el polinucleótido de la reivindicación 73 en dicha planta y que expresa la proteína codificada por dicho polinucleótido. 80.- El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado además porque dicha planta es una planta monocotiledónea. 81 - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque dicha planta monocotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo. 82. - El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado además porque dicha planta es Zea mays. 83. - El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado además porque dicha planta es una planta dicotiledónea. 84. - El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque dicha planta dicotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de chícharos, alfalfa, garbanzo, achicoria, clavo, col, lenteja, césped de la planicie, frijol de soya, tabaco, patata, patata dulce, rábano, calabaza, colza, árboles de manzana, y lechuga. 85. - Una planta o tejido vegetal que comprende un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste del polinucleótido de la reivindicación 1 , el polinucleótido de la reivindicación 2, el polinucleótido de la reivindicación 3, el polinucleótido de la reivindicación 4, el polinucleótido de la reivindicación 5, el polinucleótido de la reivindicación 6, el polinucleótido de la reivindicación 7, el polinucleótido de la reivindicación 8, el polinucleótido de la reivindicación 9, el polinucleótido de la reivindicación 10, el polinucleótido de la reivindicación 11, el polinucleótido de la reivindicación 12, el polinucleótido de la reivindicación 13, el polinucleótido de la reivindicación 14, el polinucleótido de la reivindicación 5, el polinucleótido de la reivindicación 16, el polinucleótido de la reivindicación 7, el polinucleótido de la reivindicación 18, el polinucleótido de la reivindicación 19, ei polinucleótido de la reivindicación 20, el polinucleótido de la reivindicación 21 , el polinucleótido de la reivindicación 22, el polinucleótido de la reivindicación 23, el polinucleótido de la reivindicación 24, el polinucleótido de la reivindicación 25, el polinucleótido de la reivindicación 26, el polinucleótido de la reivindicación 27, el polinucleótido de la reivindicación 28, el polinucleótido de la reivindicación 29, el polinucleótido de la reivindicación 30, el polinucleótido de la reivindicación 31 , el polinucleótido de la reivindicación 32, el polinucleótido de la reivindicación 33, el polinucleótido de la reivindicación 34, el polinucleótido de la reivindicación 35, el polinucleótido de la reivindicación 36, el polinucleótido de la reivindicación 37, el polinucleótido de la reivindicación 38, el polinucleótido de la reivindicación 39, el polinucleótido de la reivindicación 40, el polinucleótido de la reivindicación 41 , el polinucleótido de la reivindicación 42, el polinucleótido de la reivindicación 43, el polinucleótido de la reivindicación 44, el polinucleótido de la reivindicación 45, el polinucleótido de la reivindicación 46, el polinucleótido de la reivindicación 47, el polinucleótido de la reivindicación 48, el polinucleótido de la reivindicación 49, el polinucleótido de la reivindicación 50, el polinucleótido de la reivindicación 51 , el polinucleótido de la reivindicación 52, el polinucleótido de la reivindicación 53, el polinucleótido de la reivindicación 54, el polinucleótido de la reivindicación 55, el polinucleótido de la reivindicación 56, el polinucleótido de la reivindicación 57, el polinucleótido de la reivindicación 58, el polinucleótido de la reivindicación 59, el polinucleótido de la reivindicación 60, el polinucleótido de la reivindicación 61 , el polinucleótido de la reivindicación 62, el polinucleótido de la reivindicación 63, el polinucleótido de la reivindicación 64, el polinucleótido de la reivindicación 65, el polinucleótido de la reivindicación 66, el polinucleótido de la reivindicación 67, el polinucleótido de la reivindicación 68, el polinucleótido de la reivindicación 69, el polinucleótido de la reivindicación 70, el polinucleótido de la reivindicación 71, el polinucleótido de la reivindicación 72, y el polinucleótido de la reivindicación 73. 86. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal es monocotiledónea. 87. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada además porque dicha planta monocotiledónea o tejido vegetal se selecciona a partir del grupo que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo. 88. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada además porque dicha planta es Zea mays o dicho tejido vegetal es a partir de Zea mays. 89. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal es dicotiledónea. 90. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada además porque dicha planta dicotiledónea o tejido vegetal se selecciona a partir del grupo que consiste de chícharos, alfalfa, garbanzo, achicoria, clavo, col, lenteja, césped de la planicie, frijol de soya, tabaco, patata, patata dulce, rábano, calabaza, colza, árboles de manzana, y lechuga. 91.- El tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado además porque dicho tejido vegetal es una semilla. 92. - Una proteína mutante para biosíntesis del almidón codificada por el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1. 93. - Un método para incrementar una característica de una planta selecciona a partir del grupo que consiste de número de semillas, biomasa vegetal, índice de cosechas, peso de la hoja bandera, cabezas de las semillas, y peso total de la semilla, dicho método comprendiendo la incorporación del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 75 dentro del genoma de dicha planta y expresando la proteína codificada por dicha molécula polinucleotídica.
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