MXPA02008123A - Nitrilasa a partir de rhodococcus rhodochrous ncimb 11216. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican para un polipeptido con actividad nitrilasa, a las construcciones de acido nucleico que comprenden las secuencias de acido nucleico, y a los vectores que comprenden las secuencias de acido nucleico o las construcciones de acido nucleico. La invencion ademas se refiere a las secuencias de aminoacidos las 10 cuales se codifican mediante las secuencias de acido nucleico, y a los microorganismos que comprenden las secuencias de acido nucleico, las construcciones de acido nucleico o vectores que comprenden las secuencias de acido nucleico o las construcciones de acido nucleico. La invencion ademas se refiere a un proceso enzimatico para preparar acidos carboxilicos a partir de los nitrilos correspondientes.

Description

- ^ ft ' * NITRILASA A PARTIR DE RHODOCOCCUS RHODOCHROUS NCIMB 11216 La invención se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que tiene actividad nitrilasa, a las construcciones de ácidos nucleicos que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, y a los vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos o las construcciones de ácidos nucleicos. La invención además se refiere a las 10 secuencias de aminoácidos que están codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos, y a los microorganismos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, las construcciones de ácidos nucleicos o los vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos o las 15 construcciones de ácidos nucleicos.

La invención además se refiere a un proceso enzimático para preparar ácidos carboxílicos a partir de los nitrilos correspondientes. 20 Los ácidos carboxílicos alifáticos, aromáticos y heteroaromáticos son compuestos que tienen demanda para la síntesis química orgánica. Estos son materias primas para una gran cantidad de ingredientes farmacéuticos 25 activos e ingredientes activos para la protección dé 7 - *} cultivos .

En la literatura se describen múltiples vías sintéticas diferentes para ácidos carboxílicos quirales o aquirales. Así pues, por ejemplo, se obtienen aminoácidos ópticamente activos a escala industrial por procesos de fermentación. Estos enfrentan la desventaja que debe desarrollarse un proceso específico para cada aminoácido. Esta es la razón por la que se utilizan procesos químicos o enzimáticos para poder preparar una gama muy amplia de diferentes compuestos. Una desventaja de los procesos químicos es que por lo regular se tiene que construir el estereocentro en síntesis complicada, en múltiples etapas, no extensamente aplicable [sic] .

La síntesis enzimática de los ácidos carboxílicos quirales se debe encontrar en numerosas patentes o solicitudes de patente. WO 92/05275 describe la síntesis de ácidos .-hidroxi-.-alquil- o .-alquilcarboxílicos enantioméricos en presencia de materiales biológicos. Otras síntesis de ácidos orgánicos sustituidos en la posición ., ópticamente activos, con microorganismos están descritas en EP-B-O 348 901, EP-B-O 332 379, EP-A-O 348 901 o sus US equivalentes US 5,283,193, EP-A-O 449 648, EP-B-O 473 328, EP-B-O 527 553 o sus US equivalentes US 5,296,373, EP-A-O 610 048, EP-A-O 610 049, EP-A-O 666 320 o WO 97/32030.

La síntesis biotecnológica de ácidos carboxílicos estos proceden con solo bajos rendimientos de espacio- tiempo. Esto da origen a procesos poco atractivos desde el punto de vista económico. Otra desventaja es que las 15 enzimas presentes en los microorganismos que se utilizan para sintetizar los ácidos carboxílicos aquirales o quirales por lo regular solo tienen un intervalo de sustratos restringido, es decir, un microorganismo siempre convierte solo nitrilos alifáticos, aromáticos o 20 heteroaromáticos específicos. Específicamente, los nitrilos aromáticos y heteroaromáticos como pueden ser, por ejemplo, los cianotiofenos o benzonitrilo se convierten en forma deficiente o no en absoluto en los ácidos carboxílicos correspondientes.

Un objetivo de la presente invención es desarrollar otras enzimas para preparar ácidos carboxílicos aquirales y/o quirales que puedan utilizarse en un proceso para preparar ácidos carboxílicos aquirales y/o quirales que 5 no tengan las desventajas antes mencionadas y hagan disponibles específicamente ácidos carboxílicos aromáticos y/o heteroaromáticos a partir de los nítrilos correspondientes . 10 Hemos encontrado que este objetivo se logra medíante la secuencia de ácidos nucleicos aislada de acuerdo con la invención, la cual codifica para un polipéptido que tiene actividad nitrilasa, seleccionada del grupo de: 15 a) una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, b) secuencias de ácidos nucleicos que provienen de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ 20 ID NO: 1 como resultado de la degeneración del código genético, c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 1, la cual codifica 25 para polipéptidos que tienen las secuencias de "-F-A* ,* aminoácidos representadas en la SEQ ID NO: 2, y tienen cuando menos 95% de homología a nivel de los aminoácidos, con reducción insignificante de la acción enzimática de los polipéptidos.

Los homólogos de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención con la secuencia SEQ ID NO: 1 significa, por ejemplo, variantes alélicas que tienen cuando menos 95% de homología a nivel del aminoácido derivado, convenientemente cuando menos 97% de homología, preferentemente cuando menos 98%, muy particularmente de preferencia cuando menos 99% de homología, sobre el completo intervalo de la secuencia. Es posible y ventajoso que las homologías sean mayores sobre regiones que forman parte de las secuencias. La secuencia de aminoácidos proveniente de la SEQ ID NO: 1 se observa en la SEQ ID NO: 2. Las variantes alélicas comprenden, en particular, variantes funcionales que pueden obtenerse por deleción, inserción o sustitución de nucleótidos provenientes de la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, pero con reducción insignificante en la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas obtenidas. Una reducción insignificante en la actividad enzimática significa una actividad enzimática que es convenientemente cuando menos 10%, de preferencia 30%, *-fU particularmente de preferencia 50%, muy particularmente de preferencia 70% de la actividad enzimática de la enzima representada por la SEQ ID NO: 2. Así pues, la invención también se refiere a las secuencias d® aminoácidos que están codificadas por el grupo de las secuencias de aminoácidos antes descritas. La invención ventajosamente se refiere a las secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia SEQ ID NO: 1.

Los homólogos de la SEQ ID NO: 1 también significa, por ejemplo, homólogos micóticos o bacterianos, secuencias truncadas, DNA monocatenario o RNA de la secuencia de DNA codificante y no codificante. Los homólogos de la SEQ ID NO: 1 tienen a nivel del DNA una homología de cuando menos 60%, preferentemente de cuando menos 70%, particularmente de preferencia de suando menos 80%, muy particularmente de preferencia de cuando menos 90%, sobre toda la región del DNA indicada en la SEQ ID NO: 1.

Los homólogos de la SEQ ID NO: 1 además significa derivados como pueden ser, por ejemplo, las variantes promotores. Los promotores que preceden las secuencias de nucleótidos mencionadas pueden ser modificados por uno o más intercambios de nucleótidos, por inserción (es) y/o deleción (es) , sin embargo, sin afectar de manera adversa la funcionalidad o eficacia de los promotores. Además, es posible aumentar la eficacia de los promotores modificando su secuencia o pueden ser completamente sustituidos por promotores más eficaces incluso de organismos de diferentes especies.

Derivados también significan variantes cuya secuencia de nucleótidos en la región desde -1 hasta -200 enfrente de codón de inicio o 0 a 1000 pares de bases después del codón de interrupción haya sido modificada en tal forma que se altere, preferentemente aumente la expresión génica y/o la expresión de proteínas.

La SEQ ID NO: 1 o sus homólogos pueden ser aislados ventajosamente por los métodos conocidos para el trabajador experto a partir de bacterias, ventajosamente de bacterias Gram positivas, preferentemente de bacterias de los géneros Nocardia, Rhodococcus, Streoptomyces, Mycobacterium, Corynebacyterium, Micrococcus, Proactinomyces o Bacillus, particularmente de preferencia de bacterias del género Rhodococcus, Mycobacterium o Nocardia, muy particularmente de preferencia del género o especie Rhodococcus sp., Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous o Mycobacterium rhodochrous.

! ! . La SEQ ID NO: 1 o sus homólogos o partes de estas secuencias pueden ser aislados de otros hongos o bacterias, por ejemplo, utilizando procesos de hibridación habituales o la técnica PCR. Estas secuencias de DNA hibridan en condiciones normales con las secuencias de acuerdo con la invención. La hibridación se realiza ventajosamente con oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas, por ejemplo, del centro activo, y estos pueden ser identificados en una forma conocida por el trabajador experto haciendo comparaciones con otras nitrilasas o nitrilo hidratasas. No obstante, también es posible utilizar fragmentos más grandes de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o las secuencias completas para la hibridación. Estas condiciones normales varían dependiendo del ácido nucleico que se utilice. Sí es oligonucleótido, fragmento más grande o secuencia completa, o dependiendo de que tipo de ácido nucleico, DNA o RNA se utiliza para la hibridación. Así pues, por ejemplo, las temperaturas de fusión de los híbridos DNA: DNA son de alrededor de 10 °C menores que las de los híbridos DNA: RNA de la misma longitud.

Condiciones normales significa, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico, temperaturas entre 42 y 58 °C en una solución amortiguadora acuosa con una concentración entre 0.1 y 5 x SSC (1 x SSC = NaCl 0.15 M citrato de sodio 15 mM, pH 7.2) o además en presencia de formamida al 50%, como puede ser, por ejemplo, 42°C en 5 x SSC, formamida al 50%. Las condiciones de hibridación 5 para los híbridos DNA: DNA ventajosamente comprende 0.1 x SSC y temperaturas entre alrededor de 20°C y 45°C, preferentemente entre cerca de 30 °C y 45 °C. Las condiciones de hibridación para los híbridos DNA: RNA preferentemente comprenden 0.1 x SSC y temperaturas entre 10 aproximadamente 30°C y 55°C, preferentemente entre cerca de 45 °C y 55 °C. Estas temperaturas mencionadas para la hibridación son temperaturas de fusión calculadas como ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido G + C de 15 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de DNA están descritas en libros de texto pertinentes de genética como pueden ser, por ejemplo, Sambrook y col., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y se pueden calcular 20 por las fórmulas conocidas para el trabajador experto, por ejemplo dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido G + C. El trabajador experto puede además encontrar información sobre hibridación en los siguientes libros de 25 texto: Ausubel y col., (eds), 1985, Current Protocols, in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds) , 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford: Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención significa el gen nitrilasa de la secuencia SEQ ID NO: 1 y sus homólogos, los cuales tienen que haber sido por conveniencia funcionalmente ligados a una o más señales reguladoras para aumentar la expresión génica. Estas secuencias reguladoras son, por ejemplo, secuencias a las cuales se unen los inductores o represores y de este modo regulan la expresión del ácido nucleico. Además de estas secuencias reguladoras novedosas, también es posible que este presente la regulación natural de estas secuencias enfrente de los genes estructurales reales y, según sea adecuado, hayan sido genéticamente modificados de modo que se interrumpa la regulación natural y se incremente la expresión de los genes. La construcción del ácido nucleico, no obstante, también puede tener una estructura más sencilla, es decir, que ninguna de las señales reguladoras adicionales haya sido insertada enfrente de la secuencia SEQ ID NO: l o sus homólogos, y 11 • t *" " \ el promotor natural con su regulación no haya sido delecionado. En cambio, la secuencia reguladora natural es mutada en tal forma que ya no toma lugar la regulación, y aumenta la expresión génica. La construcción del ácido nucleico además puede comprender ventajosamente una o más secuencias potenciadotas, funcionalmente ligadas al promotor, lo cual hace posible expresión aumentada de la secuencia del ácido nucleico también es posible insertar otras secuencias ventajosas en el extremo 3' de las secuencias de DNA, como pueden ser otros elementos reguladores o terminadores. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden estar presentes en una o más copias en la construcción. La construcción también puede comprender otros marcadores como resistencias a antibióticos o genes que complementen la auxotrofía donde sea adecuado para la selección de la construcción.

Las secuencias reguladoras ventajosas para el proceso de acuerdo con la invención, por ejemplo, están presentes en promotores como eos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, tre, ara, SP6, .PR Ó el .-PL, los cuales se utilizan ventajosamente en bacterias Gram negativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas están en, por ejemplo, los promotores Gram 5 ! . .; g5e 12 positivos amy y SP02, en los promotores micóticos o de levadura ADC1, MF., AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. En este contexto también son ventajosos los promotores de piruvato descarboxilasa y de metanol oxidasa de, por ejemplo, Hansenula. También es posible utilizar promotores artificiales para la regulación.

La construcción de los ácidos nucleicos se inserta ventajosamente en un vector como puede ser, por ejemplo, un plásmido, un fago u otro DNA para la expresión en un organismo hospedador, lo cual hace posible la expresión óptima de los genes en el hospedador. Estos vectores representan otro desarrollo de la invención. Los ejemplos de los plásmidos convenientes en E. coli son pLG338, pACY184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, .gtll ó pBdCI, en Streptomyces son pIJIOl, pIJ364, pIJ702, o pIJ361, en bacilos son pUBUO, pC194 o pBD214, en Corynebacterium son pSA77 o pAJ667, en hongos son pALSl, pIL2 ó pBBllß, en levaduras son 2 .M, pAG-1, YEp6, YEpl3 ó pEMBLYe23 o en plantas son pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ó pDH51. Estos plásmidos representan una pequeña selección de los plasmados posibles. Otros plásmidos son bien conocidos para el trabajador experto y se pueden encontrar, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (eds.

Pouwels P. H. y col., Elsevier, Ámsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) .

La construcción de ácidos nucleicos ventajosamente también contiene, para la expresión de otros genes presentes, además las secuencias reguladoras terminales 3' y/o 5' para aumentar la expresión, las cuales se seleccionan para la expresión óptima dependiendo del organismo hospedador seleccionado y el gen o genes.

Estas secuencias reguladoras están propuestas para hacer posible la expresión específica de los genes y la expresión de las proteínas. Esto puede significar, por ejemplo, dependiendo del organismo hospedador, que el gen se expresa o sobre expresa solo después de inducción, o que se expresa y/o sobre expresa inmediatamente.

Las secuencias reguladoras o factores además preferentemente pueden influir positivamente, y de este modo aumentar, la expresión de los genes introducidos. Así pues, el mejoramiento de los elementos reguladores puede tomar lugar convenientemente a nivel de la transcripción, utilizando señales de transcripción fuertes como promotores y/o potenciadores. No obstante, también es posible además de mejorar la traducción, por ejemplo, mejorando la estabilidad del mRNA.

En otra modalidad del vector, el vector comprende la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el ácido nucleico de acuerdo con la invención también puede estar introducido ventajosamente en la forma de un DNA lineal en los microorganismos y estar integrado por recombinación heteróloga u homologa en el genoma del organismos hospedador. Este DNA lineal puede consistir en un vector linealizado como un plásmido o solo de la construcción de ácido nucleico o del ácido nucleico.

Para la expresión óptima de los genes heterólogos en los organismos, es ventajoso modificar las secuencias de ácidos nucleicos para conformar con el uso del codón específicamente utilizado en el organismo. La usanza del codón puede establecerse fácilmente con base en los análisis de cómputo de otros genes conocidos en el organismo pertinente.

Los organismos hospedadores convenientes para el ácido nucleico de acuerdo con la invención o la construcción de ácido nucleico son, en principio, todos los organismos procarióticos o eucarióticos. Los , i * ' i 15 t * 3 * u organismos hospedadores que se utilizan ventajosamente son microorganismos como bacterias, hongos o levaduras. Es ventajoso utilizar bacterias Gram positivas o GraKi negativas, preferentemente bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae, Streptomycetaceae, Mycobacteriaceae o Nocardiaceae, particularmente de preferencia bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces ó Rhodococcus. Se da muy particular preferencia al género y especie Escherichia Coli, Rodococcus rhodochrous, , Nocardia rhodochrous, Mycobacterium rhodochrous o Streptomyces lividans.

El organismo hospedador de acuerdo con la invención además preferentemente comprende cuando menos un agente proteináceo para plegar los polipéptidos que ha sintetizado, y en particular, las secuencias del ácido nucleico que tengan actividad nitrilasa descrita en esta invención y/o los genes que codifican este agente, la cantidad de este agente presente siendo mayor que la que corresponde a la cantidad fundamental en el microorganismo considerado. Los genes que codifican para este agente están presentes en el cromosoma o en los elementos extracromosomales como pueden ser, por ejemplo, los plásmidos.

La invención además se refiere a un proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales o aquirales, el cual consiste en convertir los nitrilos en presencia de una secuencia de aminoácidos codificada por los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, o un microorganismo en crecimiento, latente o con disrupción antes mencionado (= organismo hospedador) que " contenga una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, una construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que contenga un ácido nucleico de acuerdo con la invención ligado a una o más señales reguladoras, o un vector de acuerdo con la invención, en los ácidos carboxílicos quirales o aquirales.

Una modalidad ventajosa del proceso es la conversión de nitrilos alifáticos quirales o aquirales en los ácidos carboxílicos correspondientes.

Otra modalidad preferida del proceso es un proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales o aquirales, en donde los nitrilos de la fórmula I: (I) - 17 se convierten en presencia de una secuencia de aminoácidos codificados por los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, o un microorganismo en crecimiento, latente o con disrupción antes mencionado que contenga una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención que contenga un ácido nucleico de acuerdo con la invención ligado a una o más señales reguladoras, o un vector de acuerdo con la invención, en los ácidos carboxílicos de la fórmula general II: donde los sustituyentes y las variables en las fórmulas I y II tienen los siguientes significados: n = 0 ó 1 m = 0, 1, 2 ó 3, donde para m > 2 hay uno o ningún doble enlace presente entre dos átomos de carbono adyacentes, p = 0 ó 1 A, B, D y E independientes entre sí son CH, N ó CR H = 0, S, NR4, CH ó CR3, cuando n = 0, o CH, N o CR3, cuando n = 1, siendo posible que variables adyacentes A, B, D, E ó H juntas formen otro anillo aromático sustituido o no sustituido, saturado o parcialmente saturado con 5 a 8 átomos en el anillo, el cual puede contener uno o más heteroátomos como O, N ó S, y no más que 3 de las variables A, B, D, E ó H siendo un heteroátomo, R es hidrógeno, alquilo de C -C10 o alcoxi de Ci-Cio sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, hidroxilo, halógeno, alquilamino de Ci-Cio o amino, 2 R es hidrógeno alquilo de Ci-Cio o alcoxi de C2.-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, alquilamino de U-Cio o amino, 3 R es hidrogeno, alquilo de U-Cio o alcoxi de U-Cio sustituido o no sustituido , ramificado o no ¿At_ Mi_ í- ^-^^¿¿názu ramificado, aplo sustituido o no sustituido, hetarilo, hidroxilo, halógeno, alquilamíno de C1-C10 o amino, 4 R es hidrógeno, alquilo de C1-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, R en los compuestos de las fórmulas I y II es hidrógeno, alquilo de C!-C10 o alcoxi de U-Cio sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, hidroxilo, halógeno como flúor, cloro o bromo, alquilamino de U-Cio o auno.

Los radicales alquilo que se pueden mencionar son cadenas alquilo de Ci-Cio sustituidas o no sustituidas, ramificadas o no ramificadas como pueden ser, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1, 1-dimetíletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2, 2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1, 2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1, 2-dimetilbutilo, 1, 3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2, 3-dimetilbutilo, 3, 3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1, 1, 2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-l-metilpropilo, l-etil-2-metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i-propilo ó i-butilo.

Los radicales alcoxi que pueden mencionarse son cadenas alcoxi de U-Cio sustituidas o no sustituidas, ramificas o no ramificadas, como puede ser, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi, 1-metilpropoxi, 2-metilpropox?, 1, 1-dimetiletoxi, pentoxi, 1-metilbutoxi, 2-met?lbutox?, 3-metilbutoxi, 1,1-dimetilpropoxi, 1, 2-dimet?lpropoxi, 2, 2-d?metilpropoxi, 1-etilpropoxi, hexoxi, 1-metilpentoxi, 2-metilpentoxi, 3-metilpentoxi, 4-metilpentox?, 1, 1-dimetilbutoxi, 1,2-dimetilbutoxi, 1, 3-dimetílbutoxi, 2, 2-dimetilbutoxi, 2,3-dimetilbutoxi, 3, 3-d?metilbutoxi, 1-etilbutoxi, 2-etilbutoxi, 1, 1, 2-trimet?lpropoxi, 1, 2, 2-tpmetilpropoxi, 1-etil-l-metilpropoxi, l-etil-2-metilpropoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi ó deciloxi y los homólogos de cadena ramificada de éstos.

Los radicales arilo que se pueden mencionar son radicales arilo sustituidos y no sustituidos que contienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo o el sistema de anillos. Estos pueden comprender anillos aromáticos fusionados entre sí o anillos aromáticos ligados por cadenas alquilo, alquicarbonilo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Los radicales aplo también pueden estar ligados, según sea adecuado, por una cadena alquilo de U-Cio, alquenilo de Cß-Cg, alquinilo de C3-C6 o cicloalquilo de C3~Ce a la estructura básica. Se prefiere fenilo o naftilo.

Los sistemas hetarilo que pueden mencionarse son sistemas de anillos aromáticos simples o fusionados sustituidos o no sustituidos con uno o más anillos heteroaromáticos de 3 a 7 miembros que pueden contener uno o más heteroátamos como N, O ó S y pueden, según sea adecuado, estar ligados por una cadena alquilo de C1-C10, alquenilo de C3-C8 o cicloalquilo de C3-Cs a la estructura básica. Los ejemplos de estos radicales hetarilo son pirazol, ímidazol, oxazol, isoxazol, tiazol, tríazol, piridina, quinolina, isoqumolina, acridina, pirimidina, piridazina, pirazina, fenazina, purina o pteridina. Los radicales hetarilo pueden estar ligados por los heteroátomos o por los diferentes átomos de carbpno en el anillo o el sistema de anillos o por los sustifuyentes a la estructura básica. Se prefiere piridina, imidazol, pirimidma, pupna, pirazina o quinolina. &». ?? 22 Los radicales alquilamino que pueden mencionarse son cadenas alquilamino de U-Cio ramificadas o no ramificadas, sustituidas o no sustituidas como pueden ser, por ejemplo, metilamino, etilamino, n-propilamino, 5 1-metiletilamino, n-butilamino, 1-metipro?ilaminoamino [sic], 2-metilpropilamino, 1, 1-dimetiletilamino, 2- pentilamino, 1-metilbutilamino, 2-metilbutilamino, 3- metilbutilamino, 2, 2-dimetilpropilamino, 1- etilpropilamino, n-hexilamino, 1, 1-dimetilpropilamino, 10 1, 2-dimetilpropilamino, 1-metilpentilamino, 2- metilpentilamino, 3-metilpentilamino, 4-metilpentilamino, 1, 1-dimetilbutilamino, 1, 2-dimetilbutilamino, 1,3- dimetilbutilamino 2, 2-dimetilbutilamino, 2,3- dimetilbutilamino, 3, 3-dímetilbutilamino, 1- 15 etilbutilamino, 2-etilbutilamino, 1,1,2- trimetilpropilamino, 1, 2, 2-trimetilpropilamino, 1-etil-l- metilpropilamino, l-etil-2-metilpropilamino, n- heptilamino, n-octilamino, n-nonilamino o n-decilamino. Se prefiere metilamino, etilamino, n-propilamino, n- 20 butilamino, i-propilamino o i-butilamino.

Los sustituyentes convenientes para los radicales R son, por ejemplo, uno o más sustituyentes como halógeno, como flúor, cloro o bromo, tio, ciano, nitro, amino, 25 hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, ttxá ..iXkT&i-ittekv ^.. A... ¿ *^±??_______ ..***! 23 -*Z* S alquinilo u otros anillos o sistemas de anillos aromáticos u otros no aromáticos saturados o insaturados. Se da preferencia a los radicales alquilo como pueden ser alquilo de C?-C6 como metilo, etilo, propilo o butilo, arilo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxilo o amino. 2 R en los compuestos de las fórmulas I y II es hidrógeno, como puede ser [sic] alquilo de Ci-Cio o alcoxi de Ci-Cio ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, hidroxilo, alquilamino de C?-C?0 o amino.

Los radicales alquilo que se pueden mencionar son cadenas alquilo de U-Cio sustituidas o no sustituidas, ramificadas o no ramificadas como pueden ser, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n- butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1, 1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2, 2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1- dimetilpropilo, 1, 2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2- metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentílo, 1,1- dimetilbutilo, 1, 2-dimetilbutilo, 1, 3-dimetilbutilo, 2,2- dimetilbutilo, 2, 3-dimetilbutilo, 3, 3-dimetilbutilo, 1- etilbutilo, 2-etilbutilo, 1, 1, 2-trimetilpropilo, 1,2,2- S 24 trimetilpropilo, 1-etil-l-metilpropilo, l-etíl-2- metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i- propilo ó i-butilo. 5 Los radicales alcoxi que pueden mencionarse son cadenas alcoxi de C?-C?o sustituidas o no sustituidas, ramificas o no ramificadas, como puede ser, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi, 1- 10 metilpropoxí, 2-metilpropoxi, 1, 1-dimetiletoxi, pentoxi, 1-metilbutoxi, 2-metilbutoxi, 3-metilbutoxi, 1,1- dimetilpropoxi, 1, 2-dimetilpropoxi, 2, 2-dimetilpropoxi, 1-etilpropoxi, hexoxi, 1-metilpentoxi, 2-metílpentoxi, 3- metilpentoxi, 4-metilpentoxi, 1, 1-dimetilbutoxi, 1,2- 15 dimetilbutoxi, 1, 3-dimetilbutoxi, 2, 2-dimetilbutoxi, 2,3- dimetilbutoxi, 3, 3-dimetilbutoxi, 1-etilbutoxi, 2- etilbutoxi, 1, 1, 2-trimetilpropoxi, 1, 2, 2-trimetilpropoxi, 1-etil-l-metilpropoxi, l-etil-2-metilpropoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi ó deciloxi y los homólogos 20 de cadena ramificada de éstos.

Los radicales arilo que se pueden mencionar son radicales arilo sustituidos y no sustituidos que contienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo o el 25 sistema de anillos. Estos pueden comprender anillos aromáticos fusionados entre sí o anillos aromáticos ligados por cadenas alquilo, alquicarbonílo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Los radicales arilo también pueden estar ligados, según sea adecuado, por una cadena alquilo de C1-C10, alquenílo de C3-C8, alquinilo de C3-C6 o cicloalquilo de C3-C8 a la estructura básica. Se prefiere fenilo o naftilo.

Los sistemas hetarilo que pueden mencionarse son sistemas de anillos aromáticos simples o fusionados sustituidos o no sustituidos con uno o más anillos heteroaromáticos de 3 a 7 miembros que pueden contener uno o más heteroátamos como N, O ó S y pueden, según sea adecuado, estar ligados por una cadena alquilo de C?-C?o, alquenilo de C3-C8 o cicloalquilo de C3-C8 a la estructura básica. Los ejemplos de estos radicales hetarilo son pirazol, imidazol, oxazol, isoxazol, tiazol, triazol, piridina, quinolina, isoquinolma, acridina, pirimidina, piridazina, pirazina, fenazina, purina o pteridina. Los radicales hetarilo pueden estar ligados por los heteroátomos o por los diferentes átomos de carbono en el anillo o el sistema de anillos o por los sustituyentes a la estructura básica. Se prefiere piridina, imidazol, pirimidina, purina, pirazina o quinolina. 26 A ^;*i Los radicales alquilamino que pueden mencionarse son cadenas alquilamino de U-Cio ramificadas o no ramificadas, sustituidas o no sustituidas como pueden ser, por ejemplo, metilammo, etilamino, n-propilamino, 1-metiletilamino, n-butilamino, 1-metipropilaminoamino [sic], 2-metilpropilamino, 1, 1-dimetiletilamino, 2-pentilamino, 1-metilbutilamino, 2-metilbutilamino, 3-metilbutilamino, 2, 2-dimetilpropilamino, 1-etilpropilamino, n-hexilamino, 1, 1-dimetilpropilamino, 1, 2-dimetilpropilamino, 1-metilpentilamino, 2-metilpentilamino, 3-metilpentilamino, 4-metilpentilamino, 1, 1-dimetilbutilamino, 1, 2-dimetilbutilamino, 1,3-dimetilbutilamino 2, 2-dimetilbutilamino, 2,3-dimetilbutilamino, 3, 3-dimetilbutilamino, 1-etilbutilamino, 2-etilbutilamino, 1,1,2-trimetilpropilamino, 1, 2, 2-trimetilpropilamino, 1-etil-l-*-metilpropilamino, l-etil-2-metilpropilamino, n-heptilamino, n-octilamino, n-nonilamino o n-decilamino. Se prefiere metilamino, etilamino, n-propilamino, n-butilamino, i-propilamino o i-butilamino. 2 Los sustituyentes convenientes para los radicales R son, por ejemplo, uno o más sustituyentes como halógeno, como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo u ^^^jájn^^fc y*» 27 ?-(ie otros anillos o sistemas de anillos aromáticos u otros no aromáticos saturados o insaturados. Se da preferencia a los radicales alquilo co o pueden ser alquilo de Ci-Cß como metilo, etilo, propilo o butilo, arilo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxilo o amino.

R en los compuestos de las fórmulas I y II es hidrógeno, alquilo de C1-C10 o alcoxi de C1-C10 ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, arilo o hetarilo 10 sustituido o no sustituido, hidroxilo, halógeno como flúor, cloro o bromo, alquilamino de C1-C10 o amino.

Los radicales alquilo que se pueden mencionar son cadenas alquilo de C?-C?o sustituidas o no sustituidas, 15 ramificadas o no ramificadas como pueden ser, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n- butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1, 1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2, 2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1- 20 dimetilpropilo, 1, 2-dimet?lpropilo, 1-metilpentilo, 2- metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1- dimetilbutilo, 1, 2-dimet?lbutilo, 1, 3-dimetilbutilo, 2,2- dimetilbutilo, 2, 3-dimetilbutilo, 3, 3-dimetilbutilo, 1- etilbutilo, 2-et?lbutilo, 1, 1, 2-trimetilpropilo, 1,2,2- 25 trimetilpropilo, 1-etil-l-metilpropilo, l-etil-2- i ** - g#..~ t$ i },Ife. 28 metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i- propilo ó i-butilo.

Los radicales alcoxi que pueden mencionarse son cadenas alcoxi de C?-C?o sustituidas o no sustituidas, ramificas o no ramificadas, como puede ser, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi, 1- metilpropoxi, 2-metilpropoxi, 1, 1-dimetiletoxi, pentoxi, 1-metilbutoxi, 2-metilbutoxi, 3-metilbutoxi, 1,1- dimetilpropoxi, 1, 2-dimetilpropoxi, 2, 2-dimetilpropoxi, 1-etilpropoxi, hexoxi, 1-metilpentoxi, 2-metilpentoxi, 3- metilpentoxi, 4-met?lpentoxi, 1, 1-dimetilbutoxi, 1,2- dimetilbutoxi, 1, 3-dimetilbutoxi, 2, 2-dimetilbutoxi, 2,3- dimetilbutoxi, 3, 3-dimet?lbutoxi, 1-et?lbutoxi, 2- etilbutoxi, 1, 1, 2-trimetilpropoxi, 1, 2, 2-trimetilpropoxi, 1-etil-l-metilpropoxi, l-et?l-2-met?lpropoxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi ó deciloxi y los homólogos de cadena ramificada de éstos.

Los radicales arilo que se pueden mencionar son radicales arilo sustituidos y no sustituidos que contienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo o el sistema de anillos. Estos pueden comprender anillos aromáticos fusionados entre sí o anillos aromáticos ligados por cadenas alquilo, alquicarbonilo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Los radicales arilo también pueden estar ligados, según sea adecuado, por una cadena alquilo de C1-C10, alquenilo de-C3-Cs, alquinilo de C3-C6 o cicloalquilo de C3-C8 a la estructura básica. Se prefiere fenilo o naftilo.

Los sistemas hetarilo que pueden mencionarse son sistemas de anillos aromáticos simples o fusionados sustituidos o no sustituidos con uno o más anillos heteroaromáticos de 3 a 7 miembros que pueden contener uno o más heteroátamos como N, O ó S y pueden, segfn sea adecuado, estar ligados por una cadena alquilo de C1-C10, alquenilo de C3-C8 o cicloalquilo de C3-C8 a la estructura básica. Los ejemplos de estos radicales hetarilo son pirazol, imidazol, oxazol, isoxazol, -tiazol, triazol, piridina, quinolina, isoquinolína, acridina, pirimidina, piridazina, pirazina, fenazina, purina o pteridina. Los radicales hetarilo pueden estar ligados por los heteroátomos o por los diferentes átomos de carbono en el anillo o el sistema de anillos ,' o por los sustituyentes a la estructura básica. Se prefiere piridina, imidazol, pirimidina, purínar pirazina o quinolina. *" "1 30 Los radicales alquilamino que pueden mencionarse son cadenas alquilamino de C?-C10 ramificadas o no ramificadas, sustituidas o no sustituidas como pueden ser, por ejemplo, metilammo, etilamino, n-propilamino, 1-metiletilamino, n-butilamino, 1-metipropilaminoami?io [sic], 2-metilpropilamino, 1, 1-dimetiletilamino, 2-pentilamino, 1-metilbutilamino, 2-metilbutilamino, 3-metilbutilamino, 2, 2-dimetilpropilamino, 1-etilpropilamino, n-hexilamino, 1, 1-dimetilpropilamino, 1, 2-dimetilpropilamino, 1-metilpentilamino, 2-metilpentilamino, 3-metilpentilamino, 4-metilpentilamino, 1, 1-dimetilbutilamino, 1, 2-dimetilbutilamino, 1,3-dimetilbutilamino 2, 2-dimetilbutilamino, 2,3-dimetilbutilamino, 3, 3-dimetilbutilamino, 1-etilbutilamino, 2-etilbutilamino, 1,1,2-trimetilpropilamino, 1, 2, 2-trimetilpropilamino, 1-etil-l-metilpropilamino, l-etil-2-metilpropilamino, n-heptilamino, n-octilamino, n-nonilamino o n-decilamino. Se prefiere metilamino, etilamino, n-propilamino, n-butilamino, i-propilamino o i-butilamino.

Los sustituyentes convenientes para los radicales R 3 son, por ejemplo, uno o más sustituyentes como halógeno, como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo u fiíifÉJ Ér 31 : : t Wfews otros anillos o sistemas de anillos aromáticos u otros no aromáticos saturados o insaturados. Se da preferencia a los radicales alquilo como pueden ser alquilo de C?-Cg como metilo, etilo, propilo o butilo, arilo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxilo o amino. 4 R en los compuestos de las fórmulas I y II es hidrógeno o alquilo de C?-C?o ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido.

Los radicales alquilo que se pueden mencionar son cadenas alquilo de C?-C10 sustituidas o no sustituidas, ramificadas o no ramificadas como pueden ser, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n- butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpro?ilo, 1, 1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2, 2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1- dimetilpropilo, 1, 2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2- metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1- dimetilbutilo, 1, 2-dimetilbutilo, 1, 3-dimetilbutilo, 2,2- dimetilbutilo, 2, 3-dimetilbutilo, 3, 3-dimetilbutilo, 1- etilbutilo, 2-etilbutilo, 1, 1, 2-trimetilpropilo, 1,2,2- trimetilpropilo, 1-etil-l-metilpropilo, l-etil-2- metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i- # itlíÜÉ irl ?f — Jr i ?? ifliltlÉil fltfíil fiílliir-^ propilo ó i-butilo.

Los sustituyentes convenientes para los radicales R son, por ejemplo, uno o más sustituyentes como halóger , como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo u otros anillos o sistemas de anillos aromáticos u otros no aromáticos saturados o insaturados. Se da preferencia a los radicales alquilo como pueden ser alquilo de C?-Cg como metilo, etilo, propilo o butilo, aplo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxilo o amino.

También es posible y ventajoso convertir los dinitplos aromáticos o alifáticos, saturados o insaturados en el proceso de acuerdo con la invención.

El proceso de acuerdo con la invención se realiza convenientemente a un pH desde 4 hasta 11, preferentemente desde 4 hasta 9.

Además, es ventajoso utilizar en el proceso desde 0.01 hasta 10% en peso, preferentemente 0.1 hasta 10% en peso, particularmente de preferencia 0.5 a 5% en peso de nitrilo. Es posible utilizar en la reacción diferentes cantidades de nitplo dependiendo del nitrilo. Las cantidades más pequeñas (cantidades iguales entre 0.01 hasta [sic] 5% en peso) del nitrilo se utilizan ventajosamente en el caso de los nitrilos (cianohidrinas) las cuales están en equilibrio con los aldehidos y el ácido cianhídrico correspondiente. [sic] dado que el aldehido por lo regular es tóxico para los microorganismos o enzimas.

Del mismo modo se emplean ventajosamente los nitrilos volátiles en cantidades entre 0.01 hasta [sic] 5% en peso. Con cantidades más grandes de cianohidrina o nitrilo se retarda la reacción. En el caso de los nitrilos que solo tienen poca o casi ninguna propiedad solvente, o los nitrilos que se disuelven solo en cantidades muy pequeñas en medio acuoso, también es posible y ventajoso emplear cantidades más grandes que las antes mencionadas. Para aumentar la conversión y el rendimiento, es ventajoso efectuar la reacción con adición continua de nitrilo. El producto puede aislarse después del término de la reacción o incluso ser separado en forma continua en una derivación.

El proceso de acuerdo con la invención se realiza convenientemente a una temperatura entre 0°C hasta [sic] 80°C, preferentemente entre 10°C hasta 60°C, particularmente de preferencia entre 15°C hasta 50°C.

Es ventajoso mencionar en el proceso de acuerdo con la invención los nitrilos aromáticos o heteroaromáticos como 2-fenilpropionitrilo, 2-hidroxi-fenilactonitrilo [sic], 2-amino-2-fenilacetonitrilo, benzonitrilo, fenilacetonitrilo, trans-cinamonitrilo, 3-cianotiofeno o 3-cianometiltiofeno.

Los nitrílos quirales en el proceso de acuerdo con la invención significa nitrilos que consisten en una mezcla 50:50 de los dos enantiómeros o de alguna de otras mezclas con enriquecimiento de uno de los dos enantiómeros en la mezcla. Los ejemplos que pueden mencionarse de estos nitplos son 2-fenilpropionitril?, 2-hidroxi-fenilacetonitrilo, 2-amino-2-fenilacetonitrilo, 2-cloropropionitrilo o 2-hidroxipropionitrilo.

Los ácidos carboxílicos quirales en el proceso de acuerdo con la invención significa aquellos que muestran un enriquecimiento enantiomérico. El proceso preferentemente da origen a purezas enantioméricas de cuando menos 90% ee, preferentemente cuando menos 95% ee, particularmente de preferencia de cuando menos 98% ee, muy particularmente de preferencia cuando menos 99% ee.

Fil proceso de acuerdo con la invención hace posible convertir un número grande de nitrilos quirales aquirales en los ácidos carboxílicos quirales o aquiral g correspondientes. Es posible en el proceso convertir cuando menos 25 mmol de nitrílo/h por mg de proteína o cuando menos 25 mmol de nitrilo/h por g de peso anhidro de los microorganismos, preferentemente cuando menos 30 mmol de nitrilo/h por mg de proteína o cuando menos 30 mmol de nitrilo/h por g de peso anhidro, particularmente de preferencia cuando menos 40 mmol de nitrilo/h por g de proteína o cuando menos 40 mmol de nitrilo/h por g de peso anhidro, muy particularmente de preferencia cuando menos 50 mmol de nitrilo/h por mg de proteína o cuando menos 50 mmol de nitrilo/h por g de peso anhidro.

Para el proceso de acuerdo con la invención, es posible utilizar células en crecimiento que contengan los ácidos nucleicos, las construcciones de ácidos nucleicos o vectores de acuerdo con la invención. También e¡$ ! posible utilizar células inertes o con disrupción. Las células con disrupción significa, por ejemplo, células que se han preparado permeables mediante un tratamiento con, por ejemplo, solventes, o células que se han desintegrado por un tratamiento enzimático, o un tratamiento mecánico (por ejemplo prensa French o .fcÜ? ultrasonido) o por algún otro método. Los extractos crudos obtenidos de este modo son convenientes y ventajosos para el proceso de acuerdo con la invención. También es posible utilizar para el proceso enzimas purificadas o parcialmente purificadas. Los microorganismos o las enzimas inmovilizados del mismo modo son convenientes y pueden utilizarse ventajosamente en la reacción.

Los ácidos carboxílicos quirales o aquirales que se preparan en el proceso de acuerdo con la invención pueden ser aislados ventajosamente a partir de la solución acuosa de la reacción por extracción o cristalización o por extracción y cristalización. Para este propósito, la solución acuosa de la reacción se acidifica con un ácido como puede ser un ácido mineral (por ejemplo HCl ó H2SO4) o un ácido orgánico, ventajosamente a valores de pH por debajo de 2, y luego pueden ser extraídos con un solvente orgánico. La extracción se puede repetir varias veces para aumentar el rendimiento. Los solventes orgánicos que pueden utilizarse son, en principio, todos los solventes que muestren un límite de fase con el agua, según sea adecuado, después de la adición de las sales. Los solventes ventajosos son solventes como tolueno, benceno, hexano, metil ter-butil éter o acetato de etilo. Los 2Ka23£ES productos también pueden ser purificados ventajosamente uniéndolos a un intercambiado! iónico y posteriormente fluyendo con un ácido mineral o ácido carboxíi ico como HCl [sic], H2S04, ácido fórmico o ácido acético.

Después de la concentración de la fase acuosa o la orgánica, por io regular es posible aislar los productos con buenas purezas químicas, entendiéndose una pureza química mayor q?e 90%. Después de la extracción, la fase orgánica con el producto puede, no obstante, también ser solo parcialmente concentrado, y el producto puede ser cristalizado. Para este propósito, la solución se enfría ventajosamente a una temperatura desde 0°C hasta 10 °C. La cristalización tambLén puede tomar lugar _ directamente de la solución orgánica. EJ producto cristalizado puede ser tomado otra vez en el mismo o un solvente diferente para la cristalización renovada y puede ser cristalizado una vez más. La cristalización ulterior cuando menos una vez puede, dependiendo de la posición de la composición eutéctica, aumentar más la pureza enantiomérica del producto.

Los ácidos carboxílicos quirales o aquirales, no obstante, también pueden ser cristalizados de la solución acuosa de reacción inmediatamente después de la ^M^¿___?_ _ É_^ __m acidificación con un ácido a un pH ventajosamente por debajo de 2. Esto implica ventajosamente concentrar la solución acuosa calentando para reducir su volumen en un 10 hasta 90%, preferentemente de 20 a 80%, particularmente de preferencia de 30 a 70%. La cristalización preferentemente se efectúa con enfriamiento. Se prefieren temperaturas entre 0°C y 10°C para la cristalización. La cristalización directa a partir de la solución acuosa se prefiere por razones de costos. Del mismo modo se prefiere tratar los ácidos carboxílicos quirales por extracción y, según sea adecuado, cristalización posterior.

Con estos tipos de tratamiento preferidos, el producto del proceso de acuerdo con la invención puede ser aislado en rendimientos desde 60 hasta 100%, preferentemente desde 80 hasta 100%, particularmente de preferencia desde 90 hasta 100%, con base en el nitrilo que se utilice para la reacción. El producto aislado tiene una pureza química alta de >90%, preferentemente >95%, particularmente de preferencia >98%. Además, el producto en el caso de nitrilos quirales y ácidos carboxílicos quirales tiene alta pureza enantiomérica, la cual puede aumentar más por cristalización.

Los productos obtenidos de este modo son convenientes como materias primas para síntesis orgánicas para preparar fármacos o agroquímicos o para resolución de racematos.

Ejemplos : Aislamiento y expresión heteróloga del gen ni tA a partir de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 Ejemplo 1: Aislamiento del gen ni tA a partir de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 Se aisló el gen ni tA a partir de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 aislando el DNA de las células, estableciendo un banco de genes fágicos y realizando el escrutinio de este último con una sonda de oligonucleótido . 1.1. Aislamiento del DNA a partir de R. rhodochrous NCIMB 11216 Para preparar el DNA genómico a partir de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 como lo describe Sambrook y col., 1989, 2 x 100 mL de cultivo durante la á¡ ___ _ _m_ _ É___ noche (en medio dYT, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T7, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York) . Se centrifugó y los paquetes fueron resuspendidos en 8 mL de Tris/HCl 2 mM, EDTA 25 mM sacarosa al 10% (p/v), pH 8.0. El tratamiento de lisozima de los cultivos combinados a 37 °C durante 15 minutos (adición de 2 mL de lisozima, 100 mg/mL en Tris/HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.0) fue seguido por la adición de 2 mL de lauroil sarcosinato de Na al 10% (p/v) e incubación a 65°C durante 15 minutos, mezclando perfectamente varias veces. Luego se adiciona CsCl en una concentración final de 1 g/mL y se disuelve a 65°C y, después de la adición de bromuro de etidio en una concentración final de 0.4 mg/mL, se efectúa ultracentrifugación en un rotor de ángulo fijo (Sorvall T1270, 83500 g, 48 h, 17°C). Se aspiró la banda de DNA cromosómico bajo luz UV, se dializó contra TE 10.1 (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) durante 2 horas y se extrajo 3 veces con solución de fenol (saturado con Tris/HCl 10 mM, pH 8) . Por último, nuevamente se dializó 3 veces el DNA contra TE 10.01 [sic] Tris/HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.0), y se almacenó a 4°C. Esto dio como resultado aproximadamente 1.5 mL de solución de DNA con una concentración de aproximadamente 500 .g/mL. u M___ ___ ___M_^_v?_w__ ÉsÉ__^___ Zr 41 *%& •- 1.2 Preparación de un banco de genes fágicos a partir del DNA de R. rhodochrous NCIMB 11216 El vector que se utilizó para el banco de genes fue el fago .. RESIII: este vector de sustitución contiene el operón lux como fragmento de reemplazo, el cual hace posible la detección visual del fondo por bioluminiscencia, y los sitios res ("resolución") integrados a partir de Tnl721 y las funciones de replicación de pTW601-l, de modo que el vector pudiera ser transformado en una cepa con la transposasa adecuada en un plásmido autónomamente replicante (Altenbuchner, 1993, A new . RES vector with a built-in Tnl 721-encoded, excisión system, Gene 123, 63-68) . 1.2.1 Aislamiento de ..RESIII-DNA (como esta descrito por Sambrook y col., 1989).

Se centrifugaron 10 10 células de un cultivo durante la noche de E. coli TAP 90 (LB0, Sambrook y col., 1989, y MgS04 10 mM maltosa al 0.2% (p/v)) y se resuspendió el paquete en 3 mL de solución amortiguadora para fago SM (Tris/HCl 50 mM, NaCl 100 mM, MgS04 8 mM, gelatina al Q 0.01% (p/v)). Después de infección con 1.5 x 10 -1.5 x 10 unidades formadoras de placas (ufp) del lisado del * 42 lif fago .RESIII a 37 °C 0 minutos, se adicionó la mezcla a 500 L de 10 mM, maltosa al 0.2% en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Un total de 4 de estas mezclas se agitó a 7C,C durante 9 a *12 horas hasta "q& fue detectable la lisis de las células. Para la lisis completa se adicionó 10 mL de cloroformo a cada matraz y se continuó la agitación a 37 °C durante 30 jrtinutos. Los ácidos nucleicos celulares fueron digeridos adicionando DNasa y RNasa (1 .g/mL de cada una) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entonces se adicionaron 29.2 g de NaCl a cada mezcla y se disolvió, la mezcla se centrifugó a 8300 g durante 10 minutos, y los sobrenadantes fueron mezclados con PEG 6000 al 10%. Para la precipitación ulterior del fago, se agitaron las mezclas a 4°C durante la noche y luego se centrifugaron a 14,000 g durante 15 minutos. Los paquetes fueron secados y luego cada uno tomados en 5 mL de solución amortiguadora SM, se mezclaron con 5 mL de cloroformo y se centrifugaron a 3000 g durante 15 minutos. Las fases acuosas con los fagos fueron combinadas, mezcladas con 0.75 g/mL de CsCl y, después de que la disolución fufe. completa, se centrifugaron durante 24 horas (rotor de ángulo fijo (Sorvall T1270, 98400 g 48 horas, 17°C). Se aspiró la banda visible del fago y se dializó 2 x contra Tris/HCl 50 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 10 M, pH 8.0. La adición de EDTA 20 mM, 50 .g/mL de proteinasa K y SDS al 0.5% fue seguida por incubación a 65 °C durante una hora. Luego se efectuaron las extracciones 1 x con fenol (saturado con Tgris/HCl 10 mM, pH 8), 1 x con fenol (saturado con Tps/HCl 10 mM, pH 8) /cloroformo (50/50 v/v) y 1 x con cloroformo. Por último se dializó el DNA 3 x contra TE 10.1 y 1 x contra TE 10.01, se determinó el título en E. coli TAP 90 (véase 1.2.3 [sic]), y se almacenó el ..RESIII a 4°C. 1.2.2 Clonación del DNA genómico en vectores ..RESIII Para la clonación de los fragmentos de DNA genómicos de R . rhodochrous NCIMB 11216, en primer lugar se prepararon los fragmentos brazos de ..RESIII digiriendo el DNA de ..RESIII, 1 .g en un volumen de 100 .L, con 20U de Bamtil a 37 °C durante 5 h. Después de la extracción con fenol (saturado con Tris/HCl 10 mM, pH 8 ) /cloroformo (50/50 v/v), precipitación con isopropanol y el lavado con etanol al 70% y 100% (preenfriado a -20°C), se disolvió el DNA en TE 10.01 y luego se trató con 20 U de Salí (37°C durante 5 h) . Se repitió la extracción con fenol/cloroformo, la precipitación con isopropanol, el lavado y disolución en TE 10.01.

Se prepararon los fragmentos de DNA genómico por digestión parcial —después de registrar la cinética dei lote de la enzima utilizada— de 10 µg de DNA genómico en 100 .L de la mezcla con 0.5 U de Sau3AI durante 5 minutos. Después de la fraccionación por electroforesis sobre un gel de agarosa con punto de fusión bajo al 0.8%, el intervalo del fragmento desde 8 hasta 14 kb se aisló y eluyó del gel como se describe por Parker & Seed (1980) . Los fragmentos de DNA genómico fueron ligados con los brazos de ?±RESIII a 16°C, durante la noche.

Las mezclas de la ligación finalmente fueron empacadas in vitro utilizando extractos de fago que habían sido previamente preparados del "donador del extracto para empacado" E. coli BHB 2688 ("lísado congelado-descongelado", FTL, Sambrook y col., 1989) y el "donador prehead" E. coli BHB 2690 ("extracto sonicado", SE, Sambrook y col., 1989). Para el empacado, 5 µL de la mezcla para ligación, 7 µL de solución amortiguadora A (Tris/HCl 20 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 1 mM, .-mercaptoetanol al 0.05, pH 8.0), 7 µL de solución amortiguadora Ml (Tris/HCl 6.7 mM, espermidina 33 mM, putrescina 100 mM, ATP 17.8 mM, .-mercaptoetanol al 0.2%, MgCl2 20 mM, pH 8), 15 µL de SE y 10 µL de FTL se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después se adicionó y mezcló 500 µL de la solución amortiguadora SM y una gota de cloroformo, y las mezclas fueron centrifugadas y almacenadas a 4°C.

El título del banco de genes fágicos preparado se determinó infectando la cepa E. coli TAP 90 (Patterson & Dean, 1987). Estos se hizo incubando células en crecimiento logarítmico (cultivadas en LBo, MgCl2 10 mM, maltosa al 0.5%) con 100 µL de diversas diluciones del empacado o lisado de fago en solución amortiguadora SM a 37°C durante 30 minutos. Las mezclas entonces cada una fue brevemente mezclada con 3 mL de agar superior (0.8% de agar bacto, MgCl2 10 mM, maltosa al 0.5%) equilibrado a 42 °C, y se cubrió sobre placas de agar LBo con MgCl2 10 mM (precalentado a 37 °C) . Después de incubación a 37 °C durante 12-16 h, las placas fueron contadas para determinar el título. El título del banco de genes preparado fue de aproximadamente 4 x 10 ufp/mL. 1.2.3. Conversión de los fagos ?±RESIII recombinantes en un plásmido Los fagos recombinantes ?±RESIII resultantes fueron convertidos en la cepa E. coli HB 101 F' [ : :Tnl 7391ac] f que alberga el transposón Tnl73 con el gen de resolvasa bajo el control del promotor tac (Altenbuchner, 1993, véase en lo anterior) , en un plásmido con replicación autónoma. Antes de la infección, se cultivó la cepa en 5 mL de LBo con MgCl2 10 mM y maltosa al 0.5% hasta que la DOßoo fu® 0.6 a 0.8 y 100 µL de éste fueron infectados con una cantidad conveniente del lisado de fago a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se cultivó con rotación en 5 mL de dYT precalentado, isopropil tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG) a 37°C durante una hora, se centrifugo y resuspendió en el retroceso, y las células fueron plaqueadas sobre placas de agar dYT con 100 µg/mL de canamicina y se incubaron a 37 °C durante la noche.

Las células cuya moléculas ?±RESIII convertida todavía contienen el fragmento de sustitución original con el operón l ux y de este modo no contienen inserto genómico (fondo del banco de genes) fueron visualizadas introduciendo las placas a 30°C durante 3 h y contando las células bioluminiscentes en la oscuridad. El fondo del banco de genes representó 13% de acuerdo con la proporción de las células luminiscentes. ||^^^jj^^ & g 1.3. Detección del gen de nitrilasa nitA a partir de R. rhodochrous NCIMB 11216 Fagos ?±RESIII recombinantes que contenían fragmentos de DNA cromosómico con el gen de nitrílasa proveniente de R . rhodochrous NCIMB 11216 fueron identificados por hibridación de las placas de fagos co , la sonda de oligonucleótido: "nitllower" con la secuencia: 5' -TGGAA (AG) TG (CT) TCCCA (AG) CA-3' Kobayashi, M., Komeda, H., Yanaka, N., Nagasawa, T. y Yamada, H. (1992) Nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous Jl .

Kobayashi, M., Izui, H., Nagasawa, T., and Yamada, H., (1993) Nitrilasa in biosynthesis of the plant hormone indole-3-acetic acid from indole-3-acetonitrile: Cloning of the Alcaligenes gene and site-directed mutagenesis of cysteine residues.

La secuencia del oligonucleótido fue [lacuna] a partir de una región de la secuencia de aminoácidos conservada con el supuesto residuo de cisteína catalítico IKobayashi y col., J. ¡flÜU Chem. 267, 1992, 20746-20751 y Proc Nati. Acad. Sci. USA; 90, 1953, 247-251). Este motivo también fue encontrado en las secuencias de DNA anteriormente descritas del gen de la nitrilasa a partir de las cepas Rhodococcus rhodochrous Jl (GenBank Acceso # D11425) y R . rhodochrous K22 (GenBank Acceso # D12583) . 1.3.1 Transferencia de DNA e hibridación Se colocaron membranas redondas de nailon sobre 5 cajas de agar con un total de 2500 placas que habían sidb preparadas como se describe para la determinación del título en 1.2.2 durante un minuto. Las membranas fueron de nuevo colocadas con el lado de la placa sobre un papel* filtro con solución de desnaturalización (NaCl 1.5 M, NaOH 0.5 M) durante 2 x 5 minutos y luego sobre papel filtro con solución para neutralización (Trís/HCl 0.5 M, NaCl 1.5 M, pH 7.5) durante 2 x 5 minutos. Después fueron lavadas rápidamente en NaCl 50 mM y secadas, se fijó el DNA a 120°C durante 30 minutos.

Para la hibridación, las membranas fueron preincubadas con 50 mL de solución amortiguadora para hibridación a 37 °C durante 2 horas y luego hibridadas con 10 pmol del oligonucleótido etiquetado con 32P en 12 mL de solución amortiguadora para hibridación a 37 °C durante la noche. El oligonucleótido fue etiquetado en 30 µL de una mezcla con 80 µCi de (.-32P)-ATP por 10 U de la T4 32 polinucleotido cinasa y separado del (.- P) -ATP en exceso por filtración a través de un gel de una columna de goteo por Sephadex G-25.

Después de la neutralización, las membranas de nailon fueron lavadas con 0.5 g/L de NaCl, 8.8 g/L de citrato de Na (2 x SSC), 0.1% de SDS a temperatura ambiente durante 1 5 minutos y con 0.125 g/L de NaCl, 2.2 g/L de citrato de Na (0.5 x SSC), 0.1% de SDS a 32°C durante 2 x 15 minutos, y se expusieron a una película de rayos X en un cásete de película con pantalla intensificadora. 1.3.2 Identificación y secuenciación del gen ni tA Se identificó un total de 3 clones positivos, dos de los cuales albergaron un fragmento del gen ni tA incompleto y uno albergó el gen ni tA completo. Las placas positivas fueron retiradas por corte, cada una incubada en 0.5 mL de solución amortiguadora SM a temperatura ambiente durante 2 horas y, después de adicionar 2 gotas de cloroformo, se almacenaron a 4°C. El plásmido resultante después de la conversión del fago recombinante ?±RESIII con el gen ni tA completo (véase 1.2.3) fue denominado pDHE6 (la Figura 1 muestra el pDHEd con 12 kb del fragmento del banco de genes genómico proveniente de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216) y los alrededores del gen ni tA fue determinado por restricción por hibridaciones Southern utilizando la sonda de oligonucleótido "nitllower". Un fragmento de 1.5 kb de Pvul con el gen ni tA completo se trato con el fragmento de Klenow y se subclonó en pBluescriptSK+ tratado con EcoRV (pDHE7 con el fragmento PuvI 1.5 kb proveniente del fragmento del banco génico de 12 kb genómico de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 en pDHEd, Figura 2) . Después de la subclonación posterior de los fragmentos traslapantes fíindIII (vector) /EcoRl , Kpnl/Xhol , EcoRV/Bamñl y Apal /EcoRl (vector) del pDHE 7 en el pBluescriptSK+ digeridos correspondientemente en cada caso, el fragmento Pvul fue sometido a secuenciacíón de la doble hebra por el método de Sanger y col., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463-5467) utilizando un secuenciador automático. La reacción de secuenciación se efectuó utilizando un kit de secuenciación disponible en el comercio con los cebadores universal e inverso igualmente disponibles en el comercio (Vieira & Messing, Gene, 19, 1982: 259-268). La secuencia del DNA encontrada ÜÉttltattÉliífiÉkÜiMIli 51 (-JÉ!» para el fragmento Pvul de 1.5 kb esta representado en las SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos derivada se -ha de encontrar en la SEQ ID NO: 2. 2 Expresión heteróloga del gen ni tA a partir de R. rhodochrous NCIMB 11216 en E. coli y purificación de la proteína nitrilasa recombinante.

Para la clonación en un vector de expresión, el gen nitA proveniente de R . rhodochrous NCIMB 11216 fue amplificado a partir del codón de inicio de la traducción hasta el codón de interrupción de la traducción. Los cebadores utilizados para esto fueron: "nit Ndel" (superior" con la secuencia: 5' -TATATATCATATGGTCGAATACACAAACA-3' y "nit HandIII" (inferior) con la secuencia: 5 ' -TAATTAAGCTTCAGAGGGTGGCTGTCGC-3' En los cuales un sitio de desdoblamiento Ndel traslapante con el inicio de la traducción esta unido en el extremo 5' -nitA, y un sitio de desdoblamiento ífindlll traslapante con el codón de interrupción esta unido en el extremo 3' -nitA. Este par de cebadores o iniciadores se utilizó para amplificar el gen ni tA a partir de pDHE7 utilizando Pwo polimerasa en un volumen de reacción de 40 µL con, en cada caso, 8 pmol del cebador, 100 pg de la plantilla pDHE7 y 2.5 unidades de Pwo en Tris/HCl pH 8.85, KCl 25 mM, (NH4)S04 [sic] 5 mM, MgS04 2 mM, dATP 0.2 mM, dTTP 0.2 mM, dGTP 02 mM y dCTP 0.2 mM con las siguientes condiciones: Desnaturalización a 9 °C durante 3 minutos 25 ciclos con desnaturalización a 93°C durante un minuto, templado del cebador a 48°C durante 1' 30'' y polimerización a 72°C durante 1' 30''; Polimerización final a 72 °C durante 5 minutos El fragmento de la PCR nit resultante se purificó, digirió con Ndel/ífindlII y se integró en moléculas igualmente digeridas del vector pJOE 2702 (Volff y col., Mol. Microbiol., 21, 1996: 1037-1047), y el plásmido resultante fue denominado pDHE 17 (Figura 2: pDHE 17 con nitA en el vector de expresión pJOE 2702 que puede ser inducido con L-ramnosa) . La integración a través de Ndel /Hindl I I significa que el gen ni tA en el plásmido pDHE 17 esta bajo e control de la transcripción del promotor rhap que esta presente en pJOE 2702 y proviene del operón rhaBAD de L-ramnosa en E. coli (Egan & Schleif, Mol. Biol. 243, 1994: 821- 829) . La terminación de la transcripción del gen ni tA y la iniciación de la traducción de los transcritos del mismo modo toma lugar a través de las secuencias de los vectores (Volff y col., 1996). Después de la transformación de pDHE 17 en E. coli JM 109, el gen ni tA de R . rhodochrous NCIMB 11216 puede ser inducido por adición de L-ramnosa.

Para la purificación de la proteína nitrilasa recombinante por cromatografía de afinidad con imidazol, el gen ni tA además fue fusionado a una secuencia 3' para el motivo Hisg C terminal utilizando para la amplificación del gen ni tA, la cual tomó lugar en las condiciones antes mencionadas, no solo el cebador 5' "nitlVdel" (superior) sino también un cebador 3' modificado sin codón de interrupción teniendo la secuencia 5' -CGAGGGTGGCTGTCGCCCG-3' , e integrando el fragmento de la PCR resultante en un vector pJOE 2702 modificado que contenía la secuencia [CAT]sTGA detrás del sitio de desdoblamiento BaiOHI. La digestión con BaiiiHI, el tratamiento de Klenow y la digestión con Ndel del vector fueron seguidos por fusión del amplicón Pwo de ni tA que había sido cortado con Ndel por ligación en el extremo 3' a través de los extremos romos en el marco de lectura con la secuencia motivo HiSß, y el' plásmido resultante fue denominado pDHE 18.

Para la expresión heteróloga a escala de' laboratorio, JM 109 (pDHE17) de un cultivo durante la noche a 37 °C fue inoculado 1:200 en 50 mL de medio completo dYT (Sambrook y col., 1989) con 0.2% de L-ramnosa, y el cultivo fue cultivado con inducción en el baño de agua con agitación a 37 °C durante 8 horas. Entonces las células fueron lavadas una vez en Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, se resuspendieron en la misma solución amortiguadora equivalente a una DOgoo de 10, y se rompieron por tratamiento de ultrasonido. El procedimiento con JM 109 (pDHE 18) fue del mismo modo. El modelo de proteína de los extractos crudos obtenidos por tratamiento con ultrasonido y clarificados por centrifugación se determinó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, comparando con el control no inducido; con las condiciones de la inducción mencionadas, la proporción de la nitrilasa en la proteína fue cerca de 30% para cada uno de JM 109 (pDHE 17) y JM 109 (pDHE 18) .

La nitrilasa con el motivo Hisß proveniente de JM109 (pDHE 18) se purificó lavando las células en Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, resuspendiendo un equivalente de aproximadamente 50 ?O^QQ /VOL y preparando los extractos con una prensa French (2 x a 20000 psis) . La clarificación de los extractos por centrifugación a 15000 g durante 30 minutos fue seguida por la purificación con QIAexpress-Ni2+-NTA (QUIAGEN) . 1 mL de la matriz equilibrada con Tris/HCl 20 mM; pH 7.5, se utilizó por mL del extracto crudo. Después de cargar la columna, ésta se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris/HCl 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 40 mM, pH 7.0, y se eluyó con Tris/HCl 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 7.5. La pureza de la proteína nitrilasa obtenida de este modo fue >90% de acuerdo con la electroforesis en gel. Después de la diálisis doble contra Tris/HCl 50 mM, DTT 0.1 mM, (NH4)2S04 0.5 M, pH 7.5 fue posible almacenar la nitrilasa purificada a -20°C.

Las mediciones sobre los extractos crudos mostró en cada caso alrededor de 2 U/mg para la conversión de 2-benzonitrilo [sic] en ácido benzoico, y de la nitrilasa con motivo HiSß purificada utilizando QIAexpress-Ni 2+-NTA mostraron alrededor de 11 U/mg a una concentración de la enzima de 50 µg/mL. En este caso, una unidad es equivalente a la producción de 1 µmol de ácido benzoico a una concentración inicial del benzonitrilo de 10 mM, 30°C y pH 7.5. Las conversiones de 2-benzonitrilo [sic] en ácido benzoico a través del extracto crudo de nitrilasa tomó lugar en Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, y las conversiones con nitrilasa purificada tomo lugar en Tris/HCl 50 mM, pH 7.5, DTT 0.1 mM. La formación del ácido benzoico se determinó por HPLC (columna RP 18, 250 x 4 [lacuna], fase móvil metanol al 47%, H3PO4 al 0.3%).

Se convirtieron diferentes nitrilos, y las conversiones fueron determinadas, del mismo modo que en el ejemplo antes descrito.

Se convirtieron diferentes nitrilos utilizando el E. coli cepas JM 109 (pDHE 17 y pDHE 18). Para este propósito, las células fueron cultivadas en 250 mL de medio LB/Amp + 2 g/L de ramnosa a 30 °C y 200 rpm durante 9 horas (= h) . Las células fueron cosechadas por centrifugación (20 min, 4°C, 5000 rpm). Luego las células fueron resuspendidas en solución amortiguadora de fosfatos 10 mM, pH 7.2, de modo que la concentración de la biomasa anhidra (DBM) fue de 2 g DBM/L. Se pipeteó porciones de 150 µL de la suspensión celular a cada pozo de una placa de microtitulación. La placa _ ^ -¡¿XA j^j^^ga^ * luego fue centrifugada. El sobrenadante fue activado y los paquetes de células fueron lavados dos veces -con Na2HP04 [sic] (1.42 g/L en Finnaqua, pH 7.2). Después de otro paso de centrifugación, los paquetes celulares se resuspenden en la solución del sustrato respectivo (150 µL) . Se adicionó un sustrato a cada fila de 12 en la placa de microtitulación. Una fila con solución de sustrato pero sin células se utilizó como control (blanco) . Las placas de microtitulación fueron incubadas en un incubador con agitación a 30°C y 200 rpm durante una hora. Las células luego fueron centrifugadas y la cantidad de iones NH4 [sicj producida en el sobrenadante se determinó utilizando un instrumento Biomek. La medición tomó lugar a 620 nm, comparando con una gráfica de calibración producida utilizando diferentes soluciones de NHOH. Los sustratos empleados en el Experimento 1 (véase la Figura 3, Tabla 1) fueron los siguientes sustratos: benzonitrilo (=1), 3-hidroxipropionitrilo (=2), 2-metilglutaronitrilo (=3), 4-cloro-3-hidroxibutironitrilo (=4), malononitrilo (=5), crotononitrilo (=6), geranonitrilo (=7), octandinitplo (=8), pivalonitrilo (=9), aminocapronitrilo (=10), 3, 4-dihidroxibenzonitrilo (=11), 3, 5-dibromo-4-hidroxibenzonitrilo (=12), 3-cianopiridina (=13), cianuro de 4-bromobencilo (=14), cianuro de 4-clorobencilo (=15), 2-fenilbutironitrilo (=16), cianuro de 2-clorobencilo (=17), 2- piridilacetonitrilo (=18), cianuro de 4-fluorobencilo (=19), 4-metilbenzonitrilo (=20), cianuro de bencilo (=21). Los sustratos que se utilizan en el Experimento 2 (véase la Figura 4, Tabla 2) que se realizó del mismo modo que el Experimento 1, fueron como sigue: 2-fenilpropionitrilo (=1), mandelonitrilo (=2), 2- amino-2-fenílacetonitrilo (=3) , 2-hidroxipropionitrilo (=4), 3, 3-dimetoxipropionitrilo (=5), 3-cianotiofeno (=6), 3-cianometiltiofeno (=7), benzonitrilo (=8), propionitrilo (=9) , 2-hidroxi-4-fenilbutironitrilo (=11), 3-fenilglutaronitrilo (=12), fumaronitrilo (=13), glutaronitrilo (=14), valeronitrilo (=15).

Tabla 1 tss&ta Tabla LISTADO DE SECUENCIAS <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <221> CDS <222> (286).. (1386) <400> 1 cgatcgaacc agcaacgggg acgcacagtc gacgtagacc tcgacctatc cgccgttccg 60 cagaaggaca ccgaccacca ccacttcaac atccttcaac gtgcccggcc agtccttcga 120 cgaatcgaaa cggcgaagag ccgcctcgga ccccccggcc gaaccgctcg atgaactccc 180 ctacacgggt ggcgcagaat gccaggaccc gtgtcattcc acgtcaattc acgcgccttt 240 tcacctcgta ctgtcctgcc aaacacaagc aacggaggta cggac atg gtc gaa tac 297 Met Val Glu Tyr 1 acá aac acá ttc aaa gtt gct gcg gtg cag gca cag cct gtg tgg ttc 345 Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln Pro Val Trp Phe 5 10 15 20 gac gcg gcc aaa acg gtc gac aag acc gtg tcc atc atc gcg gaa gca 393 Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser He He Ala Glu Ala 25 30 35 gcc cgg aac ggg tgc gag etc gtt gcg ttt ccc gag gta ttc atc ceg 441 Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu Val Phe He Pro 40 45 50 ggg tac ceg tac cae atc tgg gtc gac age ceg etc gcc gga atg gcg 489 Gly Tyr Pro Tyr His He Trp Val Asp Ser Pro Leu Ala Gly Met Ala 55 60 65 aag ttc gcc gtg ego tac cae gag aat tcc ctg acg atg gac age ceg 537 Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr Met Asp Ser Pro 70 75 80 cae gta cag cgg ttg etc gat gcc gcc cgc gac cae aac atc gcc gta 585 His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His Asn He Ala Val 85 90 95 100 gtg gtg gga atc age gag cgg gat ggc ggc age ttg tac atg acc cag 633 Val Val Gly He Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Met Thr Gln 105 110 115 etc atc atc gac gcc gat ggg caá ctg gtc gcc cga cgc cgc aag etc 681 Leu He He Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg Arg Arg Lys Leu 120 125 130 aag ccc acc cae gtc gag cgt teg gta tac gga gaa gga aac ggc teg Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu Gly Asn Gly Ser 135 140 145 gat atc tcc gtg tac gac atg cct ttc gca cgg ctt ggc gcg etc aac Asp He Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu Gly Ala Leu Asn 150 155 160 tgc tgg gag cat ttc cag acg etc acc aag tac gca atg tac teg atg Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala Met Tyr Ser Met 165 170 175 180 cae gag cag gtg cae gtc gcg age tgg cct ggc atg teg ctg tac cag His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met Ser Leu Tyr Gln 185 190 195 ceg gag gtc ccc gca ttc ggt gtc gat gcc cag etc acg gcc acg cgt Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu Thr Ala Thr Arg 200 205 210 atg tac gca etc gag gga caá acc ttc gtg gtc tgc acc acc cag gtg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys Thr Thr Gln Val 215 220 225 gtc acá ceg gag gcc cae gag ttc ttc tgc gag aac gag gaa cag cga Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn Glu Glu Gln Arg 230 235 240 aag ttg atc ggc cga ggc gga ggt ttc gcg cgc atc atc ggg ccc gac Lys Leu He Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg He He Gly Pro Asp 245 250 255 260 ggc cgc gat etc gca act cct etc gcc gaa gat gag gag ggg atc etc Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu Glu Gly He Leu 265 270 275 tac gcc gac atc gat ctg tct gcg atc acc ttg gcg aag cag gcc gct Tyr Ala Asp He Asp Leu Ser Ala He Thr Leu Ala Lys Gln Ala Ala 280 . 285 290 Ala Thr Hie Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu Asp Gly Val Arg 325 330 335 340 gag etc aac gga gcg gac gaa cag cgc gca ttg ccc tcc acá cat tcc 13 Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro Ser Thr His Ser 345 350 355 gac gag acg gac cgg gcg acá gcc acc etc tga ctcgggcgca cccgtggcgc 14 Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu 360 365 ctccgaagcg ccacgggtgt gtgaaggggc gagacagggg aatcggagga tcaccgagta 14 caacgcatcg tegateg 14 <210> 2 <211> 366 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 2 Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln 1 5 10 15 Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser He 20 25 30 He Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu 35 40 45 Val Phe He Pro Gly Tyr Pro Tyr Hte He Trp Val Asp Ser Pro Leu 50 55 60 Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr 65 70 75 80 Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His 85 90 95 Aen He Ala Val Val Val Gly lie Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu 100 105 110 Tyr Met Thr Gln Leu He He Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg 115 120 125 Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu 130 135 140 Glv Asn Gl? Ser Asp He Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr I 165 170 175 Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly ? 180 185 190 Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln I 195 200 205 Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val C 210 215 220 Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu 1 225 230 235 í GÍu Glu Gln Arg Lys Leu He Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg 3 245 250 255 He Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp C 260 265 270 Glu Gly He Leu Tyr Ala Asp He Asp Leu Ser Ala He Thr Leu í 275 280 285 Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val 1 290 295 300 Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro 1 305 310 315 3 Ser Thr He His Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala L 325 330 335 Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu P 340 345 350

Claims (13)

1. - 65 REIVINDICACIONES Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica para un polipéptido que tienen actividad nitrilasa, seleccionada del grupo de: a) una secuencia de ácidos nucleicos que tenga la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, b) secuencias de ácidos nucleicos que provengan de la secuencia de áciaos nucleicos representada en la SEQ ID NO: 1 como resultado de la degeneración del código genético, derivados de la secuencia de ácidos nucleicos representada en la SEQ ID NO: 1, que codifique para polipéptidos que tengan las secuencias de aminoácidos representadas en la SEQ ID NO: 2 y que tengan cuando menos 97% de homología a nivel de los aminoácidos, con reducción insignificante en la acción enzimática de los polipéptidos . Una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 1. Una secuencia de aminoácidos como se reclama en la reivindicación 2, codificada por la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 1, la secuencia de ácido nucleico estando ligada a una o más señales reguladoras. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 1 o una construcción de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 4. Un microorganismo recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 1, una construcción de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 4 o un vector como se reclama en la reivindicación 5. El microorganismo recombinante como se reclama en la reivindicación 6, donde el microorganismo es una bacteria del género Escherichia, Rhodococcus, __*?h & ±á! á xá Nocardia, Streptomyces o Mycobacterium. Un proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales o aquirales, el cual consiste en convertir nitrilos en presencia de una secuencia de aminoácidos como se reclama en la reivindicación 2 ó 3 o un microorganismo en crecimiento, latente o con disrupción como se reclama en la reivindicación 6 ó 7 en ácidos carboxílicos quirales o aquirales. El proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales o aquirales como se reclama en la reivindicación 8, en donde los nitrilos de la fórmula general I: se convierten en presencia de una secuencia de aminoácidos como se reclama en la reivindicación 2 ó 3 o un microorganismo en crecimiento, latente o con disrupción como se reclama en la reivindicación 6 ó 7, en ácidos carboxílicos de la fórmula II: donde los sustituyentes y variables en las fórmulas I y II tienen los siguientes significados: n = 0 ó 1 m = 0, 1, 2 ó 3, donde para m > 2 hay uno o ningún doble enlace presente entre dos átomos de carbono adyacentes, 0 ó 1 A, B, D y E independientes entre sí son CH, N ó CR" H = O, S, NR4, CH ó CR3, cuando n = 0, o CH, N ó 3 CR , cuando n = 1, siendo posible que dos variables adyacentes A, B, D, E o H juntas formen otro anillo aromático saturado o parcialmente saturado, sustituido o no sustituido con 5 a 8 átomos en el anillo, que pueden contener »~» uno o más heteroátomos como 0, N ó S, y no más que tres de las variables A, B, D, E ó H siendo un heteroátomo, R es hidrógeno, alquilo de C?-C10 o alcoxi de C?~ C?o ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, hidroxilo, halógeno, alquilamino de Ci-Cio ° amino, 0 2 R es hidrógeno, alquilo de Ci-Cio o alcoxi de CL-C?o ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido, hidroxilo, alquilamino de U-Cio o 5 amino, R es hidrógeno, alquilo de C?-C?o o alcoxí de Ci-Cio ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no 0 sustituido, hetarilo, hidroxilo, halógeno, al quílamino de U-Cio o amino, R es hidrógeno, alquilo de C?-C?o ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. 5 10. El proceso como se reclama en la reivindicación 8 ó 9, en donde el proceso se efectúa en una solución acuosa de reacción a un pH entre 4 y 11. 11. El proceso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde en el proceso se hace reaccionar desde 0.01 hasta 10% en peso de nitrilo. 12. El proceso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el proceso se efectúa a una temperatura entre 0°C y 80°C. 13. El proceso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el ácido carboxílico aquiral o quiral se aisla de la solución de reacción en rendimientos desde 60 hasta 100% por extracción o cristalización o extracción y cristalización. * • ^6 ? RESUMEN* DE LA INVENCIÓN La invención ee refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido con actividad nitrilasa, a las construcciones de ácido nucleico que comprenden las secuencias de ácido nucleico, y a los vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico o las construcciones de ácido nucleico. La invención además se lefiere a las secuencias de aminoácidos las cuales se codifican mediante las secuencias de ácido nucleico, y a los microorganismos que comprenden las secuencias de ácido nucleico, las construcciones de ácido nucleico o vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico o las construcciones de ácido nucleico. La invención además se refiere a un proceso enzimático para preparar ácidos carboxílicos a partir de los nitrilos correspondientes. °ljl\l2>