MXPA02000190A - Preparacion de una composicion terapeutica. - Google Patents

Abstract

El Producto R, una composicion terapeutica novedosa para el tratamiento de infecciones virales y estimulante del sistema inmune, comprende nucleotidos y peptidos que tienen pesos moleculares no mayores que 14 KDa y substancialmente no mayores que 8 KDa. La composicion tiene un ligero espectro de absorcion con relaciones tipicas de absorcion de 1.998 a 260 nm/280 nm y de 1.359 a 260 nm/230 nm.

Description

PREPARACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN TERAPÉUTICA SOLICITUDES RELACIONADAS La presente es una solicitud de continuación en parte de la solicitud en trámite del solicitante, No. de serie 08/735,236, presentada el 22 de octubre de 1996. Esta solicitud incorpora los contenidos de la solicitud No. de serie 08/735,236, mediante esta referencia, en su totalidad .

ANTECEDENTES DE LA I NVENCION 1.- CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método mejorado para preparar una composición terapéutica, el producto R1, como se definirá aq uí posteriormente, q ue contiene péptidos y nucleótidos .

Los componentes del producto R tienen pesos moleculares no superiores a los 14 kilodalton (KDa). 2. - D ESCRI PCIÓ N D E LA TÉCNI CA RELACIONADA El concepto de un agente antiviral compuesto de peptonas, péptidos, prote ínas y ácido n ucleico se originó en 1 934.

Se usó producto R como sinónimo de RETICULOSE en cierta literatura. Para los fines de la presente solicitud, producto R y RETICULOSE representan dos productos distintos Después de algunos años de experimentación, dicho agente antiviral fue modificado usando albúmina de suero bovino en combinación con peptona y ácido ribonucleico, para producir un agente biótico antiviral, que es no tóxico, carece de propiedades anafilactogénicas y es miscible con los fluidos de tejido y el suero de la sangre. El agente usado será descrito como "compuesto de lipopéptido-ácido nucleico" y se registró bajo la marca RETICULOSE® por Chemico Laboratories, Inc.; Physician Desk Reference, página 651, 1960. Se informó RETICULOSE® como un agente antiviral para tratar una variedad de infecciones virales, tales como influenza, herpes, hepatitis A y B. Se supuso entonces que RETICULOSE® actuaba como un agente antiviral por lo menos aumentando la leucogénesis, la síntesis de anticuerpos y acrecentando la fagocitosis. RETICULOSE® fue vendido por última vez en los Estados Unidos en 1964.

El método para preparar RETICULOSE® había sido mantenido como un secreto comercial por el fabricante, hasta la expedición de la patente estadounidense 5,849, 1O6, que describe el método de preparar RETICULOSE®.

Como se describió en la patente estadounidense 5,849,196, los materiales de partida para preparar RETICULOSE® consisten, en peso, de: 40-50 por ciento de caseína; 1 a 10 por ,ciento de albúmina de sangre; 15 a 40 por ciento de pept.ona de res; 10 a 25 por ciento de ARN y 5 a 25 por ciento de hidróxido de sodio. Estos materiales de partida son suspendidos en agua, lo que produce una proporción de proteínas (caseína, peptona y albúmina de sangre a agua igual a aproximadamente 4.3 a 100 por ciento en peso. Después de tratamiento en autoclave de la mezcla de los materiales de partida, se filtra la solución resultante y se ajusta el pH aproximadamente a 8.5 y luego a 7.8, después de lo cual se vuelve a filtrar la solución neutralizada. Se ajusta adicionalmente el pH aproximadamente a 7.5 después que se diluye la solución. Dicho proceso produce una mezcla de péptidos y ácidos nucleicos que tienen pesos moleculares en la escala aproximada de 1 a 25 KDa.

Como se enseña en la patente estadounidense 5,849,196, los componentes de más de 15 KDa de la composición convencional de RETICULOSE® son más efectivos para tratar las enfermedades virales, tales como VIH, el virus de la influenza, el virus de herpes simplex, etc., mientras que los componentes en la escala aproximada de 1 a 15 KDa funcionan como inhibidores de la fagocitosis.

Sin embargo, los métodos convencionales sufren de varias desventajas: 1) el método no garantiza que cada preparación produzca los componentes finales con la misma proporción, de manera que el producto no es reproducible; 2) el método convencional produce una escala amplia de componentes finales, lo que hace extremadamente difícil el control de la preparación, en caso de ser posible, debido a que es necesario determinar demasiados parámetros; 3) la presencia de los componentes de mayor peso molecular, como un componente de 25 KDa, esencialmente los péptidos, aumenta los riesgos de hipersensibilidad o de una reacción inmunológica, y hace menos estable el producto. Por lo tanto, es conveniente tener un producto desprovisto de las deficiencias de la RETICULOSE® convencional, al mismo tiempo que se mantienen sus propiedades terapéuticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Consecuentemente, un objetivo de la presente ¡nvención está dirigido a una composición terapéutica novedosa, el producto R. Al contrario de la RETICULOSE®, el producto R es reproducible, sumamente estable y no es antigénico. Similar a RETICULOSE®, el producto R es un agente antiviral de amplio rango para tratar infecciones virales, como las infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de herpes simplex, adenovirus y virus del papiloma. Sorprendentemente, se ha demostrado que el producto R es efectivo para estimular la producción de quimiocinas, incluyendo gamma-interferón, interleucina-6 e interleucina-1 (J. Investig. Med. 1996; 44: 347-351), la producción de glóbulos rojos de I sangre (patente estadounidense 5,807,839), el tratamiento de carcinoma de células básales (patente estadounidense No. 5,902,786) y el tratamiento de infecciones virales de moquillo canino (patente estadounidense No. 5,807,840).

Otro objetivo de la presente invención está dirigido a un método mejorado para preparar la composición terapéutica novedosa, producto R. De acuerdo con el método mejorado de la presente, producto R comprende componentes novedosos que generan un espectro de absorción UV novedoso y un perfil de peso molecular novedoso. En particular producto R comprende moléculas que tienen pesos moleculares no superiores a 14 KDa.

Otro objetivo de la presente invención es definir los componentes del producto R, con base en métodos q u ímicos y físicos. Otros objetivos y aspectos de la presente invención serán evidentes de la descripción detallada siguiente, considerada junto con los dibujos anexos. Sin embargo, se debe entender que los dibujos están ideados exclusivamente para fines ilustrativos, y no como una definición de los límites de la i nvención , para los cuales se debe hacer referencia a las reivindicaciones que vienen al final. Se debe entender adicionalmente q ue los dibujos no están dibujados necesariamente a escala y que, a menos q ue se ind iq ue de otra manera, simplemente están destinados a ilustrar conceptualmente las estructuras y los procedimientos aq u í descritos.

BREVE D ESC RIPCIÓN DE LOS DI BUJOS En los dibujos: La fig ura 1 muestra un perfil de absorción u ltravioleta representativo del prod ucto R.

La fig ura 2 muestra un cromatograma representativo de producto R obtenido de un análisis de HPLC de fase inversa.

La figura 3 muestra un perfil de fraccionación BioGel P2 del producto R.

La figura 4 muestra los componentes de la fracción I del perfil de fraccionación BioGel P-2, resuelto en una electroforesis sobre un gel de 16 por ciento de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

La figura^5 muestra la masa relativa (Mr.) de los dos principales componentes de péptido de producto R, resuelta en un SDS-PAGE al 16%.

La figura 6 es un SDS-PAGE al 16%, que muestra los efectos de una variedad de enzimas catabólicas, sobre producto R.

La figura 7 es un histograma citométrico de flujo, que muestra el efecto de producto R sobre la fagocitosis de Dextran-FITC; y La figura 8 es un hidrograma citométrico de flujo, que muestra el efecto de producto R sobre la fagocitosis de Dextran-BoDipyFL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES ACTUALMENTE PREFERIDAS PREPARACIÓN DEL PRODUCTO R En general, se prepara el producto R de acuerdo con la siguiente manera: Primeramente se suspende los materiales de partida caseína, peptona de res, ARN, BSA e hidróxido de sodio en proporciones en peso de: 35-50 por ciento de caseína, 15 a 40 por ciento de peptona de res; 10 a 25 por ciento de ARN, 1 a 10 por ciento de BSA y 5 a 25 por ciento de hidróxido de sodio, en un volumen apropiado de agua destilada. Todos los materiales están disponibles generalmente, o si no, pueden ser preparados fácilmente por quien tenga experiencia ordinaria en la materia. Si bien es adecuado cualquier ARN para el propósito pretendido en la presente invención, se prefiere el ARN de plantas y el más preferido es el ARN de levadura. La razón de proteínas totales a volumen de agua destilada generalmente es alrededor de 1.5-2.5 a 100, en peso; de preferencia, aproximadamente 2.2 a 100 en peso. Esto significa que cada 1.5 a 2.5 g de proteínas totales son suspendidos en'alrededor de 100 mL de agua destilada.

Todos los materiales de partida, pueden ser obtenidos generalmente en el comercio, o por el contrario, pueden ser preparados fácilmente por una persona que tenga experiencia ordinaria en la materia.

La suspensión que se prepara como se dijo arriba, se trata luego en autoclave a una presión aproximada de 2.27 a 6.81 kg, de preferencia de 3.63 a 4.54 kg, bajo temperatura elevada, en una escala aproximada, por ejemplo, de 65 a 148°C, de preferencia aproximadamente entre 93°C y 110°C, durante un periodo aproximado de 2 a 10 horas, de preferencia más de 3 horas. Como lo sabe quien tenga experiencia ordinaria en la materia, bajo tales condiciones, el ARN puede ser hidrolizado completamente a nucleótidos. Después del tratamiento en autoclave se enfría la solución hasta la temperatura ambiente, y luego se la deja permanecer a una temperatura de 3 a 8°C durante al menos 12 horas, para precipitar los elementos insolubles. Alternativamente se puede centrifugar la solución enfriada a una temperatura de menos de 8°C, para eliminar los precipitados.

A continuación se filtra la solución resultante a través de un filtro de 2 mieras y un filtro de 0.45 mieras, bajo un gas inerte, tal como nitrógeno o argón, a presión aproximada de 6.89 kPa a 41.36 kPa. De manera similar se filtra la solución nuevamente a través de un filtro que retenga los pirógenos, de preferencia de 0.2 mieras.

Después de la filtración anterior se puede enfriar la solución a 3 hasta 8°C nuevamente durante al menos alrededor de 12 horas, y se vuelve a filtrar de la misma manera que se describió anteriormente.

Luego se somete a análisis el filtrado resultante para ver el contenido total de nitrógeno, usando métodos conocidos por las personas que tengan experiencia ordinaria en la materia, por ejemplo, mediante el método de Kjeldahl, J. G. C. D. Kjeldahl, Z. Anal. Chem., tomo 22, página 366 (1883), y sus mejoras. Con base en el análisis se diluye entonces el filtrado con agua destilada fría, hasta un volumen apropiado que tenga un contenido total de nitrógeno, de preferencia, entre 165 y 210 mg/ml.

A continuación se ajusta con HCl el pH de la solución diluida hasta un valor de pH fisiológicamente aceptable, de preferencia alrededor de 7.3 a 7.6, después de lo cual se vuelve a filtrar la solución diluida a través de un filtro de 0.2 miera, bajo un gas inerte, tal como se describió con anterioridad.

El producto R así producido contiene esencialmente nucleótidos, nucleosidas y bases de ácido nucleico libres, de bajo peso molecular, procedentes de la hidrólisis completa del ARN, y péptidos pequeños, procedentes de la hidrólisis parcial de las proteínas. Es posible que la hidrólisis de base de las proteínas también produzca aminoácidos libres.

Se entiende que el uso de la técnica de filtración es esencialmente para eliminar las bacterias u otras partículas que tengan un tamaño similar a, o mayor que, las bacterias. Así, cualquier filtro, independientemente de su fabricante o del material del que esté hecho, es adecuado para el propósito pretendido. Todos los filtros usados en el presente proceso están disponibles ampliamente para los expertos en la materia.

A continuación se llena con el filtrado final ampolletas apropiadas y se las sella; por ejemplo, ampolletas de 2 ml o de 10 ml, bajo gas inerte. Se trata en autoclave las ampolletas llenas, para esterilización final, después de lo cual están listas para ser usadas. ' En el uso, se administra el producto R parenteralmente o tópicamente a pacientes que lo necesiten, tal como se describió en las patentes estadounidenses 5,807,839, 5,807,840 y 5,902,786; cuyos contenidos quedan incorporados aquí en su totalidad, por medio de esta referencia.

CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO R El espectro de absorción ultravioleta La figura 1 es un espectro de absorción ultravioleta representativo del producto R, medido en una microcubeta (capacidad de 100 µl) de cuarzo, con longitud de trayectoria de 1 cm, usando un espectrofotómetro Shimadzu, modelo UV1201 UV-VIS. Se diluyó el producto R con agua destilada hasta 100 veces. Se registra el espectro entre 220-320 nm y muestra una absorción máxima a 260 nm y un tránsito a 235 nm. La razón de la absorbencia (A) a 260 nm con respecto a la absorbencia a 280 nm es 1.998 (±10%), y de A a 260 nm con respecto a A a 230 nm es de 1.359 (±10%).

El perfil de HPLC: La figura 2 es un cromatograma representativo del producto R, obtenido a partir de un análisis de HPLC en fase inversa, usando un sistema HPLC Hewlett Packard 1100 (Hewlett Packard Co.), que incluye una bomba binaria (modelo G1312A), un detector de formación de diodo (Modelo G1315A), un termostato de columna (modelo G 1316A), un automuestreador' con termostato (modelo G1329A), un termostato de prueba y un desgasificador de vacío (modelo G 1322A), y una columna de acero inoxidable YMC-pack ODS-AQ S-5 µM (YMC, Inc., 3223 Burnt Mili Dr., Wilmington, NC 28403), que tiene un tamaño de 250 x 10 mm de diámetro interior y un tamaño de poro de 120 ángstrom. Se prepara la fase móvil que consiste de una mezcla de 0.1M de ácido acético:trietilamina, de la siguiente manera: Se disuelve 6.0 ml de ácido acético glacial en 1000 mL de agua de calidad para HPLC. Se titula la solución agitada de ácido acético con trietilamina a pH 4.8. Se deja equilibrar la solución durante la noche a la temperatura ambiente y luego se filtra a través de un filtro de 52 mm de diámetro y 0.45 µM de tamaño de poro. Se vuelve a ajustar el pH de la solución a 4.8, de ser necesario añadiendo trietilamina antes del uso. Se desgasifica la fase móvil mediante el desgasificador de vacío, incorporado en el sistema de flujo de HPLC. Se inyecta 8 µL de muestra del producto R por medio de un automuestreador, a la columna que tiene un reglaje de temperatura de 30°C para cada inyección. Luego se eluye ¡socráticamente la muestra de la columna con 0.1M de ácido acético:tpetilamina como fase móvil (pH 4.8) a razón de 1 mL por minuto, bajo presión de bomba de 92-102 barias. Se opera los cromatogramas (absorbencias de UV a 260 nm) a 160 minutos por muestra, y se recoge los datos mediante el detector de formación de diodos, y luego se los analiza usando el programa de aplicación HPLC ChemStation de Hewlett-Packard. Se genera gráficas y se lleva a cabo el análisis estadístico usando el programa SigmaPlot. La HPLC en fase inversa, bajo esas condiciones, da por resultado 13 picos de HPLC característicos: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L y M, cada uno de los cuales tiene un perfil de absorción de UV característico (datos no mostrados).

El perfil de filtración en qel BioGel P-2: La figura 3 muestra un perfil de fraccionación del producto R en una columna BioGel P-2 (Bio-Rad Laboratories, Inc.), que tiene un tamaño de 2.6 cm x 55 cm de tamaño empacado. Después de cargar el producto R en la columna se eluye la columna con un PBS a 0.1X, de preferencia PBS de DULBECCO, libre de ion calcio (Ca + + ) y de ion magnesio (Mg + + ), a un caudal de 0.5 mL por minuto. PBS 1X contiene 1.47 mM de KH2PO4, 2.67 mM de KCl, 138 mM de NaCI y 8.1 mM de Na2HPO4 7H2O. El eluyente pasa a través de un monitor "Uvcord SU", que está fijado a una grabadora de diagrama REC 101, equipado con un filtro de 254 nm y se recoge a 12 minutos por fracción en un recolector de fracciones "Frac 200". La cromatografía por filtración en gel, bajo esas condiciones, da por resultado 9 fracciones: I, la, II, lia, llb, lll, Illa, IV y IVa. Cada pico individual es comparado con nucleótidos conocidos, nucleosidas conocidas y bases de ácido nucleico libres conocidas, eluidas a los mismos volúmenes o muy cercanos, de las respectivas fracciones, como se muestra en la Tabla I. Los compuestos conocidos que tienen valores comparables están mostrados en la columna "Observaciones".

TABLA I A continuación se concentra las fracciones y se las analiza mediante SDS-PAGE (véase lo que viene después) en un gel al 16 por ciento. La tinción del gel con plata demuestra que únicamente la fracción I muestra esencialmente dos bandas principales obtenibles con plata, que tienen pesos moleculares aparentes de 4.3 KDa, 5.2 KDa y una banda menor a 7.6 KDa, como se muestra en la figura 4.

La masa relativa (Mr.): La figura 5 muestra la masa relativa (medición del peso molecular) de los dos principales componentes péptidos del producto R, resueltos en una electroforesis en gel de 16 por ciento de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y teñido con tinción de plata, usando el equipo de tinción "SilverXpress" de NOVEX, siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.

Se resuelve el producto R a dos bandas principales teñibles con plata, que tienen el peso molecular aparente de alrededor de 4.3 y alrededor de 5.2 KDa. También es visible un componente menor teñible con plata que tiene un peso molecular aproximado de 7.6 KDa, en un gel sobrecargado de SDS-PAGE, y puede haber cantidades oligoméricas de otros péptidos teñibles con plata, que tienen pesos moleculares que van desde alrededor de 5 KDa a alrededor de 14 KDa. Coomassie Blue, un teñido de proteína universal, tiñe la banda de 4.3 KDa de manera extremadamente pobre. Las tres bandas, 4.3 KDa, 5.2 KDa y 7.6 KDa, constituyen más de alrededor de 90 por ciento de los péptidos. De tal manera, el producto R consiste esencialmente de moléculas que tienen pesos moleculares inferiores a 8 KDa.

La Tabla II muestra las composiciones de aminoácidos de los componentes de 5.2 KDa y 4.3 KDa. El análisis de aminoácidos de la banda de 5.2 KDa (muestra A) y la banda de 4.3 KDa (muestra B) se llevó a cabo en un analizador PE Bio-system 420, con hidrólisis automática, usando química común y corriente de feno-iso-tiocianito (PTIC).

TABLA II Aminoácido Mués ;tra A (al Iré dedor Muestra B (alrededor de 5. 2 KDa). % mol. de 4.3 KDa). % mol.

Acido aspártico 9.92 8.95 Ácido glutámico 19.27 17.30 Serina 1.03 1.23 Glicina 5.74 13.87 Histidina 2.58 3.11 Arginina 0.69 0.52 Treonina 0.73 1.78 Alanina 5.49 8.19 Prolina 13.05 15.28 Tirosina 4.39 3.37 Valina 9.95 5.39. Metionina 2.92 2.21 Isoleucina 5.47 3.45 Leucina 10.99 4.37 Fenilalanina 3.27 1.45 Lisina 5.12 9.53 LAS PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LOS PÉPTIDOS Se analiza algunas de las propiedades bioquímicas de los componentes de péptido teñibles con plata, del producto R; usando diversas enzimas catabólicas, de la manera que se describe a continuación: El tratamiento con proteinasa K (ICN Biochemicals): La proteinasa K es una proteasa de amplio espectro, no específica, que rompe las ligaduras peptídicas en el terminal C de los aminoácidos alifáticos, aromáticos e hidrófobos. Puede romper todos los péptidos del suero completamente a 50 µg/ml en el término de una hora. Se incuba una muestra del producto R en un regulador de reacción que tiene 10 mM de Tris-HCl, pH 7.6; 0.5% de SDS, 1 mM de CaCI2, 100 µg/ml de proteinasa K a 40°C durante 30 minutos; y luego se somete a SDS-PAGE en gel al 16 por ciento, tal como se describió más arriba. Bajo esas condiciones la tinción con plata del producto R no muestra cambios importantes. Sin embargo, cuando se incrementa la cantidad de proteinasa K a 800 µg/mL y se prolonga el tiempo de incubación a una hora, desaparece la banda de 5.2 KDa, pero no hay cambio obvio en la banda de 4.3 KDa.

El tratamiento con tripsina (Boehrinqer Mannheim, USA): La tripsina es una proteasa para serina, que rompe específicamente las ligaduras peptídicas de lisina y arginina en el terminal C, a pH 7.5 a 9.0. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de retención que tiene 100 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 por ciento de SDS y 250 µg/mL de tripsina de calidad secuenciadora, a 25°C durante 19 horas, y a continuación se somete a SDS-PAGE en un gel al 16 por ciento. Si bien las proteínas del suero serán descompuestas a péptidos más pequeños que 4.3 KDa bajo dichas condiciones de reacción, ninguno de los componentes teñibles con plata, del producto R, es afectado por la tripsina.

El tratamiento con quimiotripsina (Boehrinqer Mannheim, USA): La quimiotripsina es una serina-proteasa que hidroliza específicamente las ligaduras peptídicas de tirosina, fenilalanina y triptofano en los terminales C. También rompe las ligaduras peptídicas de leucina, metionina, alanina, ácido aspártico y ácido glutámico en los terminales C, a velocidades relativamente más lentas. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de reacción que contiene 100 mM de Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM de CaCI2 y 250 µg/ml de quimiotripsina de calidad secuenciadora a 25°C durante 19 horas, y luego se somete a SDS-PAGE en un gel al 16 por ciento. El tratamiento con quimiotripsina reduce significativamente la intensidad de las bandas de 5.2 KDa y de 7.6 KDa, pero no tiene efecto aparente sobre la banda de 4.3 KDa.

El tratamiento con pronasa (Boehrinqer Mannheim. USA): La pronasa es una proteasa no específica; actúa tanto sobre proteínas naturales como sobre proteínas desnaturalizadas. Descompone virtualmente todas las proteínas a sus aminoácidos individuales. La preparación contiene diversos tipos de endopeptidasas, como serina, y de metaloproteasas, exopeptidasas, como carboilpepsidasas, proteasa neutra y fosfatasas neutra y alcalina. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de reacción que contiene 100 mM de Tris-HCl, pH 7.4; 10 mM de CaCI2; 0.1% de SDS y 2 mg/ml de pronasa de S. griseus a 40°C durante 75 minutos, y luego se somete a SDS-PAGE en un gel a 16%. Todos los componentes teñibles con plata desaparecen después de dicho tratamiento de pronasa.

El tratamiento con N-qlicosidasa F (Boehrinqer Mannheim. USA): La N-glicosidasa F rompe todos los tipos de N-glicanos unidos a asparagina, a condición de que estén presentes el grupo amino y el grupo carboxilo en una ligadura peptídica, y que el oligosacárido tenga la longitud mínima de la unidad central de quitobiosa. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de reacción que contiene PBS 0.4X de Dulbecco (donde PBS 1X contiene 1.47 mM de KH2PO4, 2.67 mM de KCl, 138 mM de NaCI y 8.1 mM de Na2PO4.7H2O), 0.1% de SDS, 0.5% de NP40 y 50 unidades/mL de N-glícosidasa F recombinante, a 37°C, durante cuatro horas; y se somete a SDS-PAGE en un gel al 16%. El tratamiento con N-glicosidasa F no altera la intensidad de ninguna de las bandas del producto R en el gel SDS al 16%. La resistencia a la N-glicosidasa F indica la carencia de N-glicano unido a asparagina, que se observa comúnmente en las glicoproteínas. El tratamiento con ribonucleasa A (ICN Biochemicals, E. U. A.): La ribonucleasa A es una endorribonucleasa específica para la pirimidina, que actúa sobre el ARN de un solo filamento. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de reacción que contiene 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM de MgCI2 y 1 mg/ml de ribonucleasa A pancreática bovina, a 37°C durante alrededor de una hora, y se somete a SDS-PAGE en un gel al 16 por ciento. La ribonucleasa A no altera la intensidad de ninguna de las bandas del producto R resueltas mediante el gel de SDS-PAGE al 16 por ciento. La resistencia a la ribonucleasa A excluye la posibilidad de la presencia de un fragmento de ARN fijado al péptido. El tratamiento con fosfatasa alcalina (Life Technologies. E. U. A.): La fosfatasa alcalina del timo de ternera (CIAP) es una fosfomonoesterasa que hidroliza los grupos 5'-fosfato de ADN, ARN y nucleótidos. Se incuba una muestra de producto R en un regulador de reacción provisto por el fabricante de la enzima y 200 unidades/ml de CIAP a 37°C durante alrededor de una hora, y se somete a SDS-PAGE en un gel al 16 por ciento. CIAP no altera la intensidad de ninguna de las bandas del producto R resueltas por medio de SDS-PAGE. Se da un resumen de los tratamientos descritos en lo que antecede, por las enzimas catabólicas, en la siguiente Tabla lll, y los resultados del tratamiento están mostrados en la figura 5, donde "-" representa ninguna alteración de las bandas teñibles y " + " representa una alteración sustancial de las bandas teñibles.

TABLA III Enzima Sensibilidad de los componentes peptídicos del producto R (SDS-PAGE) 4.3 KDa 5.2 KDa 7.6 KDa Proteinasa K (100 µg/mL) 7* (800 µg/mL) 7* Tripsina (250 µg/mL) Quimiotripsina (250 µg/mL) Pronasa (2 mg/mL) N-glicosidasa F (50 unidades/mL) Ribonucleasa A (1 mg/mL) Fosfatasa alcalina (200 unidades/mL) *Esta banda no está identificada claramente debido a la presencia de los fragmentos de enzima en esa región. La complejidad de esos patrones de digestión enzimática sugiere que los componentes peptídicos del producto R pueden conjugarse con otras moléculas, tales como mononucleótidos y/o carbohidratos, o se pueden entrelazar intra/inter-molecularmente. Electroforesis en gel del ARN: Ni la electroforesis en gel de agarosa ni en gel de poliacrilamida para los ácidos nucleicos genera ninguna banda teñible con bromuro de etidio, lo que indica que no hay fragmentos de ARN en el producto R.

EL EFECTO DEL PRODUCTO R SOBRE LA FAGOCITOSIS Las figuras 7 y 8 son histogramas citométricos de flujo que representan la fluorescencia asociada con las células, que muestra el efecto del producto R sobre la fagocitosis de Dextrano-FITC o de Dextrano-BoDipyFL después de 24 horas y de 8 días del tratamiento del producto R, respectivamente. Los efectos del producto R sobre la fagocitosis son probados usando una línea de células monocíticas humanas, U937. Las células U937 son cultivadas en un medio que tiene 5 por ciento de producto R, o 5 por ciento de PBS, como control, durante 24 horas, antes de la prueba de Dextrano-FITC, o durante ocho días antes de la prueba con Dextrano-BoBipyFL. Para medir la fagocitosis se alimenta continuamente las células con un marcador fagocítico, tal como Dextrano-FITC marcado de manera fluorescente, durante 5, 15, 30 y 45 minutos, como se indica en la figura 5, o Dextrano-BoDipyFL durante 5, 15, 25 y 40 minutos, como se indica en la figura 6, a 37°C. Se vigila la cantidad de una fluorescencia asociada con las células, después de la absorción fagocítica, usando análisis citométrico de flujo, de acuerdo esencialmente con el método descrito por Sallusto, F. y coautores (1995), J. Exp. Med., 182:389-400, que queda incorporada aquí mediante esta referencia, en su totalidad. En estas pruebas, se ha restado los valores de fondo de los correspondientes a las muestras experimentales, y se ha excluido de los datos las células muertas, usando exclusión con yoduro de propidio. Cada una de las figuras 7 y 8 muestra un desplegado de la fluorescencia logarítmica contra el número de células para el control PBS (púrpura) el tratamiento de producto R (verde) y el dextrano de fondo que se une a las células (negro). Las curvas púrpura (control PBS) están traslapadas sustancialmente con las curvas verdes (producto R) en cada punto del tiempo, lo que indica que el producto R no inhibe la fagocitosis de las células monocíticas humanas. Otras funciones biológicas del producto R: Algunas de las demás funciones biológicas conocidas del producto R han sido descritas en las patentes estadounidenses No. 5,807,840, 5,807,839 y 5,902,786; en las solicitudes de patente estadounidense No. de serie 08/838,077, 08/838,069, 08/835,793, 08/735,794, 08/833,950, 08/837,992, 08/837,988, 08/838,070, 08/834,190, 08/835,791, 08/838,134, 08/839,651, 0/835,796, 08/964,250, 08/964,427, 08/923,516, 08/923,343, 08/922.888. 09/189,172, 09/007,565, 09/316,624, 09/316,374, 09/257,739, y en la publicación de Hirschman y coautores, J. Investig. Med., 1996; 44:347-351. Estas patentes, solicitudes de patente y publicaciones quedan incorporadas en la presente por medio de la referencia a ellas, en su totalidad.

CONCLUSIONES Se ha determinado así que la composición del producto R, preparado de acuerdo con los métodos descritos en la presente, comprende nucleótidos y péptidos que tienen pesos moleculares no superiores a 14 KDa, primariamente no superiores a 8 KDa. Los componentes peptídicos del producto R están distribuidos desigualmente y están localizados típicamente en las dos bandas principales, teñibles con plata, que tienen pesos moleculares de 4.3 KDa, 5.2 KDa y una banda menor de 7.6 KDa. El espectro de absorción UV del producto R muestra típicamente una absorción máxima a 260 nm y un tránsito a 235 nm, y las razones características de la absorbencia a 260 nm con respecto a la absorbencia a 280 nm es 1.998, y a 260 nm con respecto a 230 nm es 1.359. El perfil de HPLC del producto R comprende fracciones de A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L y M, tal como se muestra en la figura 2. El perfil de filtración en gel BioGel P-2, del producto R, comprende las fracciones de I, la, II, lia, llb, lll, Illa, IV y IVa que están mostradas en la figura 3.

COMPARACIÓN ENTRE LA COMPOSICIÓN CONVENCIONAL DE RETICULOSE® Y EL PRODUCTO R Se compara la composición del producto R preparado de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención con la composición convencional de RETICULOSE®, con respecto a sus pesos moleculares (MW) y absorbencias ultravioleta (UV) (A) a longitudes de onda de 230 nm, 260 nm y 280 nm, como se muestra en la Tabla IV. Si bien se ha informado que los componentes que tienen pesos moleculares inferiores a 15 KDa de RETICULOSE® inhiben la fagocitosis, la presente solicitud demuestra que el producto R no inhibe la fagocitosis.

CUADRO IV MW UV l/PH* »60 1280. 26030. Producto R <14 KDa 1.998 1.359 NO RETICULOSE® 1-25 KDa 2.839 1.198 Sí "Inhibición de la fagocitosis por moléculas que tienen peso molecular inferior a 15 KDa.

Así pues, el producto R difiere sustancialmente de RETICULOSE® en su composición y en sus funciones biológicas. La Tabla V es una comparación entre las cantidades relativas de los materiales de partida usados para las preparaciones de la presente composición terapéutica, el producto R, y la composición convencional RETICULOSE®.

TABLA V Materiales de partida para la reacción inicial, en 10 litros.- RETICULOSE® Producto R .

Caseína 250 gramos 140 gramos Peptona de res 150 gramos 68.4 gramos Albúmina de suero 15 gramos 13 gramos ARN 80 gramos 88 gramos NaOH 75 gramos 66 gramos Se usa alrededor de 221 g de proteínas en la reacción inicial, para la preparación del producto R, mientras que se usa alrededor de 415 g para la preparación de RETICULOSE®. Por lo tanto, la concentración inicial de proteína para la preparación de RETICULOSE® es el doble que la de la preparación del producto R. El siguiente ejemplo sirve únicamente como ilustración del proceso para preparar el producto R, y no se debe considerar como limitación a la presente invención.

EJEMPLO Se suspende alrededor de 35.0 g de caseína, alrededor de 17.1 g de peptona de res, alrededor de 22.0 g de ácido nucleico (ARN de levadura), alrededor de 3.25 g de albúmina de suero bovino, en aproximadamente 2.5 litros de agua para inyección USP, aproximadamente a 3 hasta 7°C, en un recipiente adecuado, y se agita suavemente hasta que se haya humedecido apropiadamente la totalidad de los ingredientes. Se añade cuidadosamente, mientras se agita, alrededor de 16.5 g de hidróxido de sodio (calidad de reactivo ACS), y se continúa agitando hasta que se disuelva completamente el hidróxido de sodio. Se trata en autoclave, aproximadamente a 4.08 kg de presión y 93° a 110°C durante un periodo de tiempo, hasta que se digiera completamente el ARN, por ejemplo, aproximadamente 4 horas. Al final del periodo se detiene el tratamiento en autoclave y se permite que se enfríen lentamente el matraz de reacción y sus contenidos, hasta la temperatura ambiente. Luego se enfría durante al menos seis horas a alrededor de 3-8°C. Se filtra la solución resultante a través de filtros de 2 mieras y de 0.45 mieras, usando gas inerte, tal como nitrógeno o argón, a baja presión (6.89 a 41.36 kPa). De manera similar, se filtra la solución nuevamente a través de filtros de 0.2 mieras para retención de pirógenos. Se muestrea el filtrado resultante y se analiza en cuanto al nitrógeno total. Se efectúa entonces un cálculo para determinar la cantidad de agua fría para inyección que se ha de añadir al filtrado para producir un filtrado diluido con un contenido de nitrógeno de entre alrededor de 165 y 210 mg/100 mL; el volumen final es aproximadamente de 5 litros. Se ajusta entonces el pH ya sea con HCl concentrado (calidad de reactivo, ACS), o bien con NaOH 1.0 normal, aproximadamente a la escala de 7.3-7.6. Después se filtra la solución diluida nuevamente a través de filtros de 0.2 miera con gas inerte, a baja presión. Se llena con el filtrado final ampolletas de vidrio de 2 ml, y se las sella mientras están bajo atmósfera de gas inerte. Se recoge las ampolletas y se las trata en autoclave para esterilización final a 115°C y presión de 6.35-7.26 kg, durante alrededor de 30 minutos. Después del ciclo de esterilización se enfría y se lava las ampolletas con el producto R. Todas las cantidades están sujetas a una variación de más o menos 15 por ciento para el pH, el volumen y los ajustes analíticos. De esa manera, aun cuando se ha mostrado y descrito y señalado los aspectos novedosos fundamentales de la invención, como se los aplica a una modalidad preferida de la misma, se entenderá que quienes sean expertos en la materia podrán efectuar diversas omisiones y sustituciones y cambios en la forma y en los detalles de los dispositivos ilustrados, así como en su funcionamiento, sin salirse del espíritu de la invención. Pof ejemplo, se pretende expresamente que todas las combinaciones de aquellos elementos y/o pasos de método que efectúen sustancialmente la misma función, sustancialmente de la misma manera, para obtener los mismos resultados, estén dentro del alcance de la invención. Más aún, se debe reconocer que las estructuras y/o los elementos y/o los pasos de método mostrados y/o descritos con relación a cualquier forma o modalidad descritas de la invención, puede ser incorporada en cualquier otra forma o modalidad descrita, exhibida o sugerida, como cuestión general de selección de diseño. Por lo tanto, es la intención que la única limitación esté indicada por el alcance de las reivindicaciones que siguen.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1.- Una composición de ácido nucleico de péptido que absorbe luz a longitudes de onda de 230 nm, 260 nm y 280 nm, de manera que dé por resultado una razón de absorción a 260 nm/280 nm de alrededor de 1.998, y una razón de absorción a 260 nm/230 nm de alrededor de 1.359; que comprende moléculas de nucleótidos que resultan de un ARN de planta y péptidos que resultan de una mezcla de caseína, peptona de res y albúmina de suero bovino; teniendo dichas moléculas pesos moleculares distribuidos de manera no uniforme.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque los nucleótidos son mononucleótidos.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque las moléculas tienen pesos moleculares distribuidos de manera no uniforme, en una escala de cero a sustancialmente no más de 14 KDa.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque las moléculas tienen pesos moleculares distribuidos de manera no uniforme, en una escala de cero a sustancialmente no más de 8 KDa.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque las moléculas tienen concentraciones sustanciales a pesos moleculares de sustancialmente 5.2 KDa y 4.3 KDa.

6.- Un método para preparar una composición de ácido nucleico de péptido que absorbe la luz a longitudes de onda de 230 nm, 260 nm y 280 nm, de manera que dé por resultado una razón de absorción de 260 nm/280 nm de alrededor de 1.998 y una razón de absorción de 260 nm/230 nm de alrededor de 1.359; conteniendo la composición moléculas de nucleótidos y péptidos que tienen pesos moleculares distribuidos de manera no uniforme; caracterizado dicho método porque comprende los pasos de: a) formar una mezcla que incluye una combinación de proteínas que consiste de caseína, peptona de res y albúmina de suero bovino; un ARN de planta y una base en agua, donde la razón de la combinación de proteína al agua está en una escala aproximada de 1.5/100 a alrededor de 2.5/100, en peso; b) procesar la mezcla a una temperatura elevada y a presión elevada, de manera que forme una solución y elementos insolubles; c) eliminar los elementos insolubles; d) diluir la solución en agua; y e) después de efectuar los pasos b, c y d, ajustar el pH de la solución a un pH fisiológicamente aceptable.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la razón de la combinación de proteínas al agua es aproximadamente 2.2/100 en peso.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque los nucleótidos son mononucleótidos.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizado además porque las moléculas tienen pesos moleculares no d istribuidor uniformemente, en una escala de cero hasta sustancialmente no más de 14 KDa . 1 0.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque las moléculas tienen pesos moleculares no distribuidor uniformemente, en una escala de cero hasta sustancialmente no más de 8 KDa . 1 1 .- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque las molécu las tienen concentraciones sustanciales a pesos moleculares de sustancialmente 5.2 KDa y 4.3 KDa.