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JPH07188291A - 蛋白質とその製造方法並びに用途 - Google Patents

蛋白質とその製造方法並びに用途

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Publication number
JPH07188291A
JPH07188291A JP5347017A JP34701793A JPH07188291A JP H07188291 A JPH07188291 A JP H07188291A JP 5347017 A JP5347017 A JP 5347017A JP 34701793 A JP34701793 A JP 34701793A JP H07188291 A JPH07188291 A JP H07188291A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
immunoglobulin
desensitizing agent
antibody
sugar
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP5347017A
Other languages
English (en)
Inventor
Tsukasa Sanou
吏 佐能
Katsuhiko Hino
克彦 日野
Masashi Kurimoto
雅司 栗本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Original Assignee
Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd filed Critical Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Priority to JP5347017A priority Critical patent/JPH07188291A/ja
Priority to EP94309386A priority patent/EP0661294A1/en
Priority to KR1019940036802A priority patent/KR950018048A/ko
Publication of JPH07188291A publication Critical patent/JPH07188291A/ja
Priority to US08/773,008 priority patent/US5874401A/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 花粉症を惹起する新規な蛋白質と、その製造
方法並びに減感作剤としての用途を提供する。 【構成】 特定の理化学的性質を有する蛋白質と、スギ
花粉を水性溶媒中で抽出し、その抽出物から当該蛋白質
を採取してなる方法と、有効成分として当該蛋白質を含
有する減感作剤を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、花粉症を惹起する新
規な蛋白質と、その蛋白質を製造するための方法並びに
花粉症を治療、予防、診断するための減感作剤としての
用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ここ十数年来、我国においては、春先に
なると花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が増加
し続けている。患者の数が多いことと、発症季がいろい
ろな行事が続く春先ということもあって、マスコミなど
でも頻繁に取上げられ、今や、公衆衛生上無視できない
問題の一つになっている。
【０００３】花粉症はアレルギー症の一種であり、その
主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花粉ア
レルゲンであると言われている。大気中に飛散したスギ
花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲンに
対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状態
で、次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のスギ花粉
アレルゲンとこのイムノグロブリンＥ抗体とが免疫反応
を起し、アレルギー症状を呈することとなる。
【０００４】現在、スギ花粉中には、抗原性の相違する
少なくとも２種類のアレルゲンの存在することが知られ
ている。その一つは、ヤスエダ等が『ジャーナル・オブ
・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、
第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報
告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ
Ｉ」と呼称されている。もう一つは、タニアイ等『エ
フ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２
号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチ等
『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９
９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、こ
れは「Ｃｒｙ ｊ ＩＩ」と呼称されている。スギ花粉
中には、通常、Ｃｒｙ ｊ ＩとＣｒｙ ｊ ＩＩが約
５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採
取した血清のほとんどがＣｒｙｊ ＩにもＣｒｙ ｊ
ＩＩにも反応すると言われている。澤谷等は、『アレル
ギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９
９３年）において、Ｃｒｙ ｊ ＩＩが、皮内試験やＲ
ＡＳＴ試験すると、Ｃｒｙ ｊ Ｉと同程度の抗原性を
発揮すると報告している。
【０００５】このように、スギ花粉アレルゲンがすでに
幾つか単離され、その性質・性状がある程度解明された
ことから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減
感作することにより、花粉症を治療・予防できる見通し
がついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか考
案されており、例えば、特開平１−１５６９２６号公報
や特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端にＡｓｐ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−又はＡｌａ
−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−で表わさ
れるアミノ酸配列を有するアレルゲンに多糖類の一種で
あるプルランを結合せしめ、得られる複合体を減感作剤
としてヒトに投与する提案が為されている。しかしなが
ら、花粉症を惹起するアレゲンはＣｒｙ ｊ ＩやＣｒ
ｙ ｊＩＩだけではなく、正確な診断や効果的な減感作
療法をするうえでも、その余のアレルゲンを単離し、性
質・性状を解明するのが斯界の急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は、花粉症を惹起する新規な蛋白質を提供
することにある。
【０００７】この発明の目的は、その蛋白質を製造する
ための方法を提供することにある。
【０００８】この発明のさらに別の目的は、その蛋白質
の減感作剤としての用途を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を理化学的性質が （１） 分子量 ４４，０００乃至５４，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動） （２） 等電点 ８．５乃至９．２（等電点電気泳動） （３） Ｃ末端アミノ酸配列 −Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表わされるＣ末
端アミノ酸配列を有する。 （４） 糖含量 分子中に、下記の化２に示す一般式で表わされる糖鎖を
重量で約５乃至２０％含む。ただし、式中、Ｘ、Ｘ′及
びＸ″はヒドロキシル基又はＦｕｃα１を、また、Ｙ及
びＹ′はヒドロキシル基又はＧａｌβ１を表わすものと
する。
【化２】 （５） 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に吸収極大を有する。 （６） 溶剤への溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶である。 （７） 生物作用 花粉症患者の血液から採取したイムノグロブリンＥ抗体
に結合する。花粉症を惹起する。 （８） 安定性 水溶液（ｐＨ７．２）中、１００℃で１０分間加熱する
と失活する。水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月間
放置しても、実質的に失活しない。 である蛋白質（以下、単に「蛋白質」と言う。）により
解決するものである。なお、この明細書においては、ア
ミノ酸、糖並びにそれらの結合様式等を国際純正及び応
用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定める略号にしたがって略
記することがある。
【００１０】この発明は、前記第二の課題を、スギ花粉
を水性溶媒中で抽出し、その抽出物から蛋白質を採取し
てなる方法により解決するものである。
【００１１】この発明は、前記第三の課題を、有効成分
として蛋白質を含有する減感作剤により解決するもので
ある。
【００１２】
【作用】この発明の蛋白質は、従来公知のスギ花粉アレ
ルゲンには見られない、独特の性質を有する新規物質で
ある。
【００１３】この発明の製造方法は、スギ花粉から蛋白
質を所望量製造することを可能ならしめる。
【００１４】この発明の減感作剤は、ヒトを含む哺乳動
物に投与すると、減感作効果を発揮する。
【００１５】この発明は、花粉症を惹起する新規な蛋白
質に関するものである。本発明者がスギ花粉中のアレル
ゲンについて研究していたところ、従来未知の全く新規
なアレルゲンが含まれていることを見出した。カラムク
ロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せ
てこのアレルゲンを単離し、その性質・性状を調べたと
ころ、その本質は蛋白質であり、従来公知のスギ花粉ア
レルゲンとは相違する性質・性状を有していることが判
明した。次に、この発明による蛋白質の独特の性質・性
状につき、実験例に基づいて説明する。
【００１６】
【実験例１ 蛋白質の精製】千葉県産のオモテスギの雄
花から採取した花粉１重量部を約１６重量部の０．１２
５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．２）に浮遊さ
せ、撹拌しながら４℃で１時間抽出後、遠心分離により
上清を採取した。残渣を同様に再処理し、得られた上清
と初回の抽出で得られた上清をプールし、これにセタブ
ロンを０．１％（ｗ／ｖ）加え、遠心分離後、硫酸アン
モニウムを８０％飽和になるように加えて蛋白質成分を
塩析した。沈澱部分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）に対して１０時間透析し、濾過後、予め５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化させて
おいたＤＥＡＥ−セファデックスカラムに負荷し、カラ
ムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を通液
して得られる非吸着画分を採取した。
【００１７】この非吸着画分に酢酸を加えてｐＨ５．０
に調製した後、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
で平衡化させておいたＣＭ−セファデックスカラムに負
荷し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を通液してカ
ラムを洗浄した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）
と０．３Ｍ塩化ナトリウムからなる溶離液を通液して蛋
白質成分を溶出させた。採取した蛋白質成分を含む画分
を、今度は、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液で平衡化させてお
いたＭｏｎｏ−Ｓカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに
上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下でカラムに１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液したとこ
ろ、塩化ナトリウムの濃度が０．１乃至０．３Ｍのとき
に当該蛋白質が溶出した。最後に、常法により、精製蛋
白質を含む画分を濃縮し、凍結乾燥して以下の実験に供
した。なお、収量は、原料のスギ花粉固形分当たりに換
算して約０．０２％であった。
【００１８】
【実験例２ 蛋白質の理化学的性質】本実験例では、実
験例１で得た精製蛋白質につき、その理化学的性質を調
べた。
【００１９】
【実験例２−１ 分子量】ユー・ケー・レムリが『ネー
チャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０
年）に報告している方法に準じて精製蛋白質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量４
４，０００乃至５４，０００ダルトンに相当する位置に
主要なバンドが観察された。なお、このときの分子量マ
ーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルト
ン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カル
ボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、
キモトリプシノーゲンＡ（２５，０００ダルトン）及び
チトクロームＣ（１２，４００ダルトン）であった。
【００２０】分子量４４，０００乃至５４，０００ダル
トンの画分をゲルからニトロセルロース膜に移し取り、
マウス由来の抗スギ花粉アレルゲン抗体及びセイヨウワ
サビ由来のパーオキシダーゼで標識したヤギ由来の抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を作用させたところ、顕著な
免疫反応が観察された。これは、当該蛋白質がスギ花粉
アレルゲンの一種であることを示唆している。
【００２１】
【実験例２−２ 等電点】等電点電気泳動法により測定
したところ、精製蛋白質の等電点は８．５乃至９．２で
あった。
【００２２】
【実験例２−３ Ｃ末端アミノ酸配列】精製蛋白質４０
０μｇを反応管にとり、６Ｍグアニジン塩酸塩と１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）３００μｌに溶解し、反応管内に窒素ガスを注
入し、適量のエチレンイミンとトリ−ｎ−ブチルフォス
フィンを加えた後、暗所に一晩静置してポリペプチドを
アミノエチル化した。反応物を蒸留水に対して透析し、
透析内液を採取して凍結乾燥後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）３００μｌに溶解し、Ｖ８プロテアーゼ
を１５μｇ加え、３７℃で４８時間インキュベートし
た。反応物を約１００℃に５分間加熱して酵素反応を停
止させた後、予め０．０２Ｍ塩化カルシウムを含む０．
０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させておいた
アンヒドロトリプシン−アガロースカラムに負荷し、次
いで、カラムに０．１Ｍ蟻酸を通液して吸着していたペ
プチド成分を溶出させた。
【００２３】その後、溶出液からペプチド成分を含む画
分を採取し、濃縮後、予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフル
オロ酢酸水溶液で平衡化させておいたバイダック社製高
速液体クロマトグラフィー用カラム『２１８ＴＰ５４』
に負荷し、次いで、２１４ｎｍ波長下で溶出液の吸光度
をモニターしながら、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ
酢酸を含み、アセトニトリル濃度が１％（ｖ／ｖ）／分
の割合で上昇する水性アセトニトリルを０．５ｍｌ／分
の流速で通液した。溶出液からペプチド成分を含む画分
を採取し、濃縮後、アプライド・バイオシステム社製ア
ミノ酸シーケンサ『４７３Ａ型』によりアミノ酸配列を
分析したところ、当該蛋白質は、Ｃ末端に、−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表わされるアミノ酸配列を
有していることが判明した。
【００２４】
【実験例２−４ 糖含量及び糖鎖構造の決定】本実験例
では、当該蛋白質の糖含量並びに糖鎖の構造及び結合部
位を明らかにする。
【００２５】
【実験例２−４（ａ） 糖含量】常法により、標準物質
にマンノースを使用して分析したところ、精製蛋白質１
００μｇ当たり、約５乃至２０μｇの糖が検出された。
この結果は、当該蛋白質の糖含量が、重量で、約５乃至
２０％であることを示している。
【００２６】
【実験例２−４（ｂ） 糖鎖の糖組成と結合部位】反応
容器に精製蛋白質を１ｍｇとり、６Ｍグアニジン塩酸塩
と１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）３００μｌを加えて均一に溶解し、反
応容器内に窒素ガスを注入後、４−ビニルピリジンを１
μｌとトリ−ｎ−ブチルホスフィンを２μｌ加え、暗所
に２４時間静置して蛋白質をピリジルエチル化した。次
いで、反応物を蒸留水に対して１０時間透析後、透析内
液を採取し、濃縮し、凍結乾燥し、０．２Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ８．６）３００μｌに溶解し、トリ
プシンを１５μｇ加え、３７℃で１７時間インキュベー
トした。
【００２７】得られたトリプシン消化物を０．１％（ｖ
／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む蒸留水で平衡化させたバ
イダック社製高速液体クロマトグラフィー用カラム『２
１８ＴＰ５４』に負荷し、次いで、２１４ｎｍの波長下
で溶出液の吸光度をモニターしながら、アセトニトリル
濃度が１分間に１％（ｖ／ｖ）上昇する濃度勾配下、１
％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の割合
で通液した。その後、溶出画分からペプチド断片を含む
画分を採取し、その一部を試験管にとり、レゾルシノー
ル法により中性糖の有無を調べたところ、２種類のペプ
チド断片に中性糖が検出された。これらペプチド断片を
『ペプチド断片Ａ』又は『ペプチド断片Ｂ』と命名し、
常法により、アプライド・バイオシステム社製アミノ酸
シーケンサ『４７３Ａ型』を使用してアミノ酸配列を分
析した。その結果、ペプチド断片Ａ、Ｂは、下記の表１
に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
【００２８】
【表１】
【００２９】次に、表１に示すアミノ酸配列において符
号「Ｘ」を付して示したアミノ酸残基を同定すべく、上
記で得たペプチド断片Ａ、Ｂの一部をそれぞれ別の試験
管にとり、６Ｎ塩酸を適量加え、減圧下、１１０℃で２
０時間インキュベートして加水分解した。反応終了後、
常法により、加水分解物のアミノ酸組成をベックマン社
製アミノ酸アナライザ『６３００型』を使用して分析し
たところ、下記の表２に示す結果が得られた。
【００３０】
【表２】
【００３１】表１に示すアミノ酸配列と表２に示すアミ
ノ酸組成を対比すれば、表１のアミノ酸配列における未
同定のアミノ酸「Ｘ」は明らかにアスパラギンであり、
糖鎖はこのアスパラギンに結合していると推定される。
【００３２】
【実験例２−４（ｃ） 糖鎖の単離と糖組成】実験例１
で得た精製蛋白質を１５０ｍｇとり、少量の蒸留水に溶
解後、蒸留水に対して１０時間透析した。透析内液を採
取し、塩酸でｐＨ２に調整後、ペプシンを１．５ｍｇ加
え、３７℃で１８時間インキユベートして蛋白質におけ
るペプチド結合を切断した。反応物を凍結乾燥し、０．
１Ｍクエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解後、生
化学工業社製『グリコペプチダーゼＡ』を１０ミリ単位
加え、３７℃で１６時間インキユベートしてペプチド断
片から糖鎖を遊離させた。
【００３３】その後、反応液を、蒸留水を使用してゲル
状に形成したバイオラッド社製『バイオゲルＰ−４』に
負荷し、カラムに蒸留水を通液して得られた溶出液を５
ｍｌずつ採取し、レゾルシノール−硫酸法により、画分
ごとに中性糖の有無を調べた。そして、中性糖が検出さ
れた画分の一部をとり、凍結乾燥後、２−アミノピリジ
ン０．０８ｇを含む４Ｎ塩酸６０μｌに溶解し、１００
℃で１３分間インキュベートし、次いで、シアン水素化
硼素ナトリウム１０ｍｇを溶解した蒸留水６μｌ加え、
９０℃でさらに１８時間インキュベートした。最後に、
反応物を、予め０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．２）で平衡化させておいたトーソー社製クロマト
グラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ＨＷ−４０Ｆ』を使用するカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し、未反応試薬等を含まない、蛍光標識さ
れた糖鎖を得た。
【００３４】次に、蛍光標識した糖鎖を、予め、３％
（ｖ／ｖ）酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．
３）とアセトニトリルを容量比で３５：６５の割合で含
む混液により平衡化させておいたトーソー社製高速液体
クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄ
ｏ−８０』に負荷し、蛍光光度計で溶出液をモニターし
ながら、３％（ｖ／ｖ）酢酸−トリエチルアミノ緩衝液
とアセトニトリルからなる溶離液を、両者の容量比が５
０分間で５０：５０に上昇する濃度勾配下、１ｍｌ／分
の流速で通液したところ、溶出開始から約１８分後、約
２２分後、約２７分後及び約３５分後に４種類の糖鎖が
溶出した。これらの糖鎖を、それぞれ、「糖鎖Ａ」、
「糖鎖Ｂ」、「糖鎖Ｃ」又は「糖鎖Ｄ」と命名し、下記
の糖組成分析に供した。なお、糖鎖Ａと糖鎖Ｃは比較的
多く存在し、糖鎖Ｂと糖鎖Ｄは少なかった。
【００３５】上記で得た糖鎖Ａ乃至Ｄをそれぞれ凍結乾
燥し、過剰量の４Ｍトリフルオロ酢酸を加えた後、減圧
下、１００℃で３時間加熱して加水分解した。加水分解
物を容量比３：６：２のピリジン／メタノール／蒸留水
混液の適量に溶解し、過剰量の無水酢酸を加えた後、常
温下で３０分間静置してアセチル化した。反応物を採取
し、凍結乾燥後、２−アミノピリジンを６６ｍｇ含む４
Ｎ塩酸５０μｌに溶解し、１００℃で１３分間加熱後、
シアン水素化硼素ナトリウムを０．８ｍｇ溶解した蒸留
水５μｌを加え、９０℃で１８時間インキュベートし
た。その後、反応物を、予め、２０ｍＭ酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたトーソー
社製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ２０００ＰＷ』に負荷し、新鮮な同じ緩衝液を
０．６ｍｌ／分の流速で通液して未反応試薬等を除去し
た。得られた糖混合物を含む溶出液を、今度は、予め、
１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．５Ｍ硼酸緩
衝液（ｐＨ８．７）で平衡化させておいたトーソー社製
高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌＳ
ｕｇａｒ ＡＸ−Ｉ』に負荷し、次いで、新鮮な同じ緩
衝液を６０℃、０．４ｍｌ／分の流速で通液することに
より、糖鎖を構成する糖の種類と量を分析した。結果を
下記の表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】表３に示す結果は、当該蛋白質に結合する
糖鎖Ａ乃至Ｄが０乃至２個のガラクトース残基、１乃至
３個のフコース残基、３個のマンノース残基、１個のキ
シロース残基及び４個のＮ−アセチルグルコサミン残基
により構成され、当該蛋白質には、これらの糖鎖のうち
の少なくとも一つが結合していることを示唆している。
【００３８】
【実験例２−４（ｄ） 糖鎖構造の決定】実験例２−４
（ｃ）で単離した糖鎖Ａ乃至Ｄを少量とり、それぞれ別
途に凍結乾燥後、少量の重水に溶解し、再度凍結乾燥し
た。この操作を糖鎖ごとに計３回繰返し、糖鎖における
解離性水素を重水素で置換した。次いで、常法により、
ＪＥＯＬ社製５００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴分光器を
使用し、重水中、３０℃における各糖鎖のアノマー性プ
ロトンとメチルプロトンの化学シフトを調べた。結果を
下記の表４に示す。
【００３９】一方、これらに近い化学シフトを示す既知
の糖鎖構造について調査したところ、エヌ・タカハシ等
『バイオケミストリー』、第２５巻、第３８８〜３９５
頁（１９８６年）に見られるように、シカモアカエデ由
来の酵素であるラッカーゼに結合する糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及
び糖鎖ｆは、４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴において
糖鎖Ａ乃至Ｄとほぼ同じ化学シフトを示すことが判明し
た。表４に、ラッカーゼの糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及び糖鎖ｆに
おけるアノマー性プロトンとメチルプロトンの化学シフ
トを併記する。
【００４０】
【表４】
【００４１】表４に示すように、タカハシ等が報告して
いる糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及び糖鎖ｆは、下記の化３、化４又
は化５に示すよう、Ｆｕｃα１、Ｘｙｌβ１及び／又は
Ｇａｌβ１を側鎖に持つ、４個のＮ−アセチルグルコサ
ミン残基と３個のマンノース残基からなるＮ結合型糖鎖
構造を有する。これらのことから、糖鎖Ａ乃至Ｄは、そ
れぞれ、下記の化６、化７、化８又は化９に示す構造を
有すると判断され、したがって、当該蛋白質に結合する
糖鎖は、前記化２に示す一般式で表わすことができる。
なお、糖鎖Ｂの核磁気共鳴スペクトルについて若干補足
説明しておくと、糖鎖Ｂの核磁気共鳴スペクトルにおい
ては、表４中のＦｕｃ−１に相当するアノマー性プロト
ンやメチルプロトンのシグナルが認められず、しかも、
ＧｌｃＮＡｃ−２の化学シフト値は、糖鎖ｅの４．５９
１ｐｐｍより低磁場側の４．６３０ｐｐｍにシフトして
いた。これらの事実は、糖鎖Ｂが、糖鎖ｅにおけるＦｕ
ｃα１を欠如した構造を有することを示している。
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【００４４】
【化５】
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
【化８】
【００４８】
【化９】
【００４９】
【実験例２−５ 紫外線吸収スペクトル】分光光度計を
用いて水溶液中における紫外線吸収スペクトルを測定し
たところ、精製蛋白質は波長２８０ｎｍ付近に吸収極大
を示した。
【００５０】
【実験例２−６ 溶剤への溶解性】常法により試験した
ところ、精製蛋白質は、水、生理食塩水及び燐酸緩衝液
に可溶であった。
【００５１】
【実験例２−７ 生物作用】当該蛋白質は、下記に示す
方法により試験すると、当該蛋白質に特異的に反応する
Ｔ細胞の増殖を誘導する性質と、花粉症患者の血液から
採取したイムノグロブリンＥ抗体に結合する性質を有す
る。また、当該蛋白質に結合する糖鎖は、独特な免疫学
的性質を有し、当該蛋白質から除去すると、当該蛋白質
の抗原性が有意に減弱する。
【００５２】
【実験例２−７（ａ） Ｔ細胞増殖誘導試験】フィコー
ル・ハイパック比重遠心法により、花粉症患者のヘパリ
ン加末梢血から単核細胞を分離した。単核細胞を１０％
（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．０）に濃度１×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、実験例１で得た精製蛋白質を２０μｇ／ｍｌ
加えた後、５％ＣＯ2培養器中、３７℃で５日間培養し
た。その後、培養培地に組換え型ヒトインターロイキン
−２を５０単位／ｍｌ加え、上記と同様にしてさらに９
日間培養した。このように前処理した単核細胞を下記の
Ｔ細胞増殖試験に供した。
【００５３】９６ウェルマイクロプレートに、１０％
（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．０）に浮遊させた培養単核細胞を４×１０4
個／ウェルと、前記と同一の花粉症患者から採取し、マ
イトマイシン５０μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で３０分
間処理しておいた末梢単核細胞１×１０6個／ウェル
と、精製蛋白質を５０μｇ／ｍｌ加え、新鮮な上記と同
じ培養培地で２００μｌ／ウェルとした。ウェル中の細
胞を５％ＣＯ2培養器中、３７℃で２日間培養し、3Ｈ−
チミジンを０．５μＣｉ／ウェル加え、同じ条件でさら
に１日培養した後、シンチレーションカウンタで細胞内
における3Ｈ−チミジンの取込み量を測定した。同時
に、蛋白質無含有の培養培地を使用する系を設け、これ
を上記と同様に処理して対照とした。
【００５４】その結果、対照系において約２００ｃｐｍ
の取込みが観察されたところ、精製蛋白質を添加した系
では、蛋白質５０μｇ／ｍｌ当たり約８，５００ｃｐｍ
と顕著な取込みが認められ、精製蛋白質が花粉症患者の
血液に含まれるＴ細胞の増殖を顕著に促すことが判明し
た。このことは、当該蛋白質に抗原性があることを示し
ている。
【００５５】
【実験例２−７（ｂ） イムノグロブリンＥ抗体への結
合性試験】精製蛋白質２５０μｇを少量の蒸留水に溶解
し、蒸留水に対して１８時間透析し、凍結乾燥後、０．
５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと５０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールを含む２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７．８）１２５μｌ
に溶解し、約１００℃で１０分間加熱した。次に、７．
５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０を６０μｌ、Ｎ−グ
リカナーゼを５単位、蒸留水を２００μｌ加え、３７℃
で２４時時間インキュベートして精製蛋白質の糖鎖を除
去した。別途、Ｎ−グリカナーゼを使用しない系を設
け、これを上記と同様に処理して対照とした。
【００５６】９６ウェルマイクロプレートに上記で得ら
れた糖鎖を有しない蛋白質及び糖鎖を有する蛋白質のい
ずれかを１μｇ／ウェルずつ吸着させ、さらに、花粉症
患者から採取した血清を１００μｌ／ウェルずつ加えた
後、３７℃で２時間インキュベートした。つぎに、マイ
クロプレートを０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
を含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄して未
結合血清を除去した後、セイヨウワサビ由来のパーオキ
シダーゼで標識したヤギ由来の抗ヒトイムノグロブリン
Ｅ抗体を１００μｌ／ウェルずつ加え、３７℃でさらに
２時間インキュベートした。マイクロプレートを新鮮な
上記と同じ燐酸緩衝液で洗浄して未結合の抗体を除去
し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジア
ミンと０．０３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水を含む０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌを加えて発
色させた後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５７】その結果、糖鎖を有しない蛋白質を使用す
る系における吸光度が約０．０５であったのに対して、
糖鎖を有する蛋白質を使用する系では、吸光度が約０．
３にも達しており、当該蛋白質が花粉症患者の血液から
採取したイムノグロブリンＥ抗体に結合する性質がある
こととともに、その抗原性に特定の糖鎖が不可欠である
ことを示している。また、本実験例２−７の結果は、当
該蛋白質が花粉症の原因物質の一つであり、ヒトを含む
哺乳動物において花粉症を惹起する性質のあることを裏
付けている。
【００５８】
【実験例２−８ 安定性】精製蛋白質を水溶液（ｐＨ
７．２）中、１００℃で１０分間インキュベートしたと
ころ、残存活性は認められなかった。一方、精製蛋白質
を水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月保存したとこ
ろ、実質的な活性低下は認められなかった。
【００５９】以上のような理化学的性質を有する蛋白質
は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
【００６０】次に、この発明による蛋白質の製造方法に
ついて説明するに、この発明の蛋白質は、スギ科スギ属
（クリプトメリア・ジャポニカ）に属するオモテスギや
ウラスギなどのスギ木から採取した花粉を水性溶媒中で
抽出し、その抽出物を精製することにより製造すること
ができる。スギ花粉から当該蛋白質を抽出するには、通
常、スギの雄花から採取した花粉を水若しくは水にメチ
ルアルコール、エチルアルコール、アセトンなどの親水
性有機溶媒や適宜の安定剤等を適量混合した水性溶媒に
浮遊させ、必要に応じて、撹拌しながら、１０℃未満の
温度、望ましくは、約０乃至５℃で３０分間以上、望ま
しくは、約１乃至２時間浸漬させる。スギ花粉の状態に
も依るが、通常、斯かる操作を１乃至５回行なうことに
より、スギ花粉から大半の蛋白質を抽出することができ
る。
【００６１】抽出物中の蛋白質を精製するには、斯界に
おける通常一般の方法を採用し得る。すなわち、前記の
ようにして得た抽出物に、例えば、塩析、透析、濾過、
濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方
法を適用すれば、部分精製蛋白質が得られる。この部分
精製蛋白質は、通常、当該蛋白質以外に、Ｃｒｙ ｊＩ
Ｉなどのスギ花粉アレルゲンを含んでいる。より高純度
の蛋白質を必要とする場合には、この部分精製蛋白質
に、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動、等電点電気泳動などの方法の１種若しく
は２種以上を適用することにより、Ｃｒｙ ｊ ＩＩを
始めとする当該蛋白質以外の成分を除去すればよい。
【００６２】斯くして得られる部分精製乃至精製蛋白質
は、花粉症を診断若しくは治療・予防するための減感作
剤に有利に配合使用できる。また、精製蛋白質は、当該
蛋白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗体を定性・定量
分析するための酵素免疫測定や放射免疫測定の検出用抗
原として有用であり、花粉症の診断や、アレルギー症一
般の発症機序を解明するための学術研究においても広範
な用途を有する。
【００６３】つぎに、この発明による蛋白質の製造方法
につき、２〜３の実施例を挙げて具体的に説明する。
【００６４】
【実施例Ａ−１ 部分精製蛋白質の調製】千葉県産のオ
モテスギの雄花から採取した花粉１重量部を約１６重量
部の０．１２５炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．
２）に浮遊させ、撹拌しながら４℃で１時間抽出した
後、遠心分離により上清を採取した。残渣を同様に再処
理し、得られた上清と初回の抽出で得られた上清をプー
ルし、これにセタブロンを０．１％（ｗ／ｖ）加え、遠
心分離後、硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように
加えて蛋白質成分を塩析した。沈澱部分を５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に対して１０時間透析
し、濾過した後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファデッ
クスカラムに負荷し、ついで、カラムに５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を通液し、非吸着画分を採
取した。この画分に酢酸を加えてｐＨ５．０に調整した
後、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化さ
せておいたＣＭ−セファデックスカラムに負荷し、１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を通液してカラムを洗浄
した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）と０．３Ｍ
塩化ナトリウムからなる溶離液をカラムに通液して蛋白
質成分を溶出させた。その後、常法により、この溶出画
分を濃縮し、凍結乾燥して、当該蛋白質以外にＣｒｙ
ｊ ＩＩを含む部分精製蛋白質を得た。収量は、原料の
スギ花粉固形分に換算して約０．１％であった。
【００６５】本例の部分精製蛋白質は、花粉症を診断若
しくは治療・予防するための減感作剤に有利に配合使用
できる。
【００６６】
【実施例Ａ−２ 精製蛋白質】実施例Ａ−１の方法によ
り得た部分精製蛋白質を少量の蒸留水に溶解し、溶液を
予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させて
おいたＭｏｎｏ−Ｓカラムに負荷した後、０Ｍから０．
５Ｍに上昇する濃度勾配下でカラムに１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液したところ、塩化ナト
リウム濃度が０．１乃至０．３Ｍのときに当該蛋白質が
溶出した。その後、常法により、溶出液を濃縮し、凍結
乾燥して、本質的に当該蛋白質のみからなる精製蛋白質
を得た。収量は、原料のスギ花粉固形分当たりに換算し
て約０．０２％であった。
【００６７】本例の精製蛋白質は、花粉症を治療、予
防、診断するための減感作剤や、酵素免疫測定や放射免
疫測定用の抗原として有用である。
【００６８】次に、この発明による蛋白質の用途につ
き、実施例、実験例を示して具体的に説明する。
【００６９】この発明の蛋白質は、花粉症の原因物質の
一つであることから、花粉症を治療、予防、診断するた
めの減感作剤として広範な用途を有する。この発明の減
感作剤は、有効成分として、当該蛋白質か、あるいは、
後述の、当該蛋白質と特定糖質との複合体を含有せしめ
てなるものである。花粉症の診断を目的とする減感作剤
には、通常、前述のような方法により得た部分精製乃至
精製蛋白質をそのまま配合し、一方、花粉症の治療・予
防を目的とする場合には、配合に先立って、当該蛋白質
に特定の糖質を共有結合させて複合体とする。
【００７０】この発明でいう糖質とは、当該蛋白質に共
有結合させることができ、且つ、複合体とすることによ
り、当該蛋白質の減感作効果及び／又は副作用を増強若
しくは低減するものをいう。斯かる糖質としては、例え
ば、澱粉、アミロース、デキストラン、ポリスクロー
ス、プルラン、エルシナン、カードラン、アラビアガ
ム、トラガカントガム、グアガム、キサンタンガム、カ
ラゲナン、セルロース、グルコマンナン、キトサン、リ
ポ多糖などの単純若しくは複合多糖並びにそれら糖質の
誘導体及び部分加水分解物が挙げられ、その平均分子量
は、通常、約５００乃至１０，０００，０００ダルト
ン、望ましくは、約１０，０００乃至１，０００，００
０ダルトンの範囲にある。上記糖質のうちでも、本質的
にマルトトリオースを反復単位とするプルラン、エルシ
ナン又はそれらの部分加水分解物との複合体は、ヒトを
含む哺乳動物に投与すると、減感作に有効なイムノグロ
ブリンＧ抗体やイムノグロブリンＭ抗体を著量産生する
一方、アナフィラキシーショックを含む望ましくない副
作用の主因たるイムノグロブリンＥ抗体を産生し難い性
質が顕著である。このことは、反復投与を必須とする減
感作療法を安全且つ効果的に実施するうえで極めて好都
合である。
【００７１】また、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、セ
ラチア菌などの微生物に由来するリポ多糖やその部分加
水分解物には、当該蛋白質との複合体とすることによ
り、当該蛋白質の哺乳動物の粘膜に対する親和性を高
め、摂取効率を有意に改善する性質がある。このことか
ら、これら糖質との複合体は、経皮若しくは経粘皮投与
を前提とする減感作剤において特に有用である。
【００７２】斯かる複合体は、通常、当該蛋白質を活性
化糖質と反応させるか、あるいは、１分子中に２以上の
活性官能基を有する試薬により、当該蛋白質と糖質とを
架橋すればよい。個々の反応方法としては、例えば、ジ
アゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋法、アミド結
合法、過沃素酸酸化法、ジスルフィド結合法などが挙げ
られるが、これら反応方法自体は斯界において公知であ
り、例えば、特開平３−９３７３０号公報などには、そ
の代表的な方法が詳述されている。反応開始時における
蛋白質と糖質との割合は、重量比で、通常、約１：０．
００１乃至１：１，０００、望ましくは、約１：０．０
１乃至１：１００の範囲が選ばれる。反応方法にも依る
が、この範囲を下回るとペプチド同志の結合が顕著とな
り、反対に、この範囲を上回ると糖質同志の反応が顕著
となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率低
下をもたらすものであり、上記の範囲をもって最良とし
た。反応時の温度、ｐＨ及び反応時間は、蛋白質が失活
したり、分解し難く、しかも、望ましくない副反応が最
少限になるように設定するのがよく、通常、温度を約０
乃至１００℃、ｐＨを約０．１乃至１２とし、約０．１
乃至５０時間で完結させるのが望ましい。
【００７３】反応により生成した複合体は、例えば、透
析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動な
どの斯界における通常一般の方法により精製でき、必要
に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、
最終使用形態に応じて、精製した複合体を濃縮・凍結乾
燥することにより、液状若しくは固状にすればよい。
【００７４】この発明の減感作剤は、上記のようにして
得られた蛋白質及び／又は複合体単独の形態はもとよ
り、それ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦
形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に
応じて、ステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウ
ムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤を含む１種又は２種
以上の他の薬剤との組成物としての形態を包含する。さ
らに、この発明の減感作剤は、投薬単位形態の薬剤をも
包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明の蛋白
質若しくは複合体を、例えば、１日当たりの用量又はそ
の整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０ま
で）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離
した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬
形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠
剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟膏
剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧
剤、注射剤などが挙げられる。
【００７５】この発明による減感作剤の使用方法につい
て説明するに、この発明の減感作剤は、スギ花粉アレル
ゲンを含む通常一般の減感作剤と同様に使用することが
できる。すなわち、この発明の減感作剤により花粉症の
診断をするには、スクラッチ試験あるいは皮内試験とし
て知られる通常の試験方法を採用し、まず、被験者の皮
膚面に出血しない程度の傷をつけ、この発明による診断
用減感作剤を適量滴下するか、あるいは、この発明によ
る診断用減感作剤の適量を皮内に注射投与する。そし
て、１５乃至３０分経過後に膨疹の有無と大きさを調
べ、膨疹の大きさが一定値以上の場合、陽性と判定す
る。
【００７６】この発明の減感作剤による治療において
は、通常、上述の診断結果に基づいて適切な用量・用法
を決定する。診断結果が陽性の被験者については、当該
蛋白質と特定糖質との複合体を含有するこの発明の減感
作剤を経口若しくは非経口的に投与する。症状、用法な
どに依っても変わるが、具体的には、患者の症状や投与
後の経過を観察しながら、通常、成人１回当たり約０．
０００１乃至１００，０００ｎｇ、望ましくは、約０．
００１乃至１０，０００ｎｇを目安とし、毎週１回乃至
毎月１回の頻度で、約１カ月乃至１年間、通常、用量を
増やしながら、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内若しくは経
粘皮的に反復投与する。花粉症の予防もほぼ同じ用量、
用法でよく、対象者の健康状態や投与後の経過を観察し
ながら、通常、成人１回当たり約０．０００１乃至１０
０，０００ｎｇ、望ましくは、約０．００１乃至１０，
０００ｎｇを目安とし、毎週１回乃至毎月１回の頻度
で、約１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら、皮
内、皮下、筋肉内若しくは経粘皮的に反復投与する。こ
の発明による減感作剤を秋口から翌年の春先にかけて定
期的に反復投与するときには、翌年の発症季におけるア
レルギー症状を僅少若しくは皆無とすることができる。
【００７７】次に、この発明による減感作剤につき、２
〜３の実施例を挙げて具体的に説明する。
【００７８】
【実施例Ｂ−１ 乾燥注射剤】平均分子量約２００，０
００ダルトンの精製プルラン２ｇを蒸留水１００ｍｌに
溶解し、塩化シアヌルの１．７％（ｗ／ｖ）アセトン溶
液を２ｍｌ加えた。次いで、５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリ
ウム水溶液により溶液のｐＨを７付近に保ちつつ、氷浴
中、４℃以下で２時間静置して反応させた。このように
して得られた活性化プルランを含む溶液に実施例Ａ−２
の方法により得た精製蛋白質を４０ｍｇ加え、撹拌下、
ｐＨ７．０、３７℃で５時間反応させた。その後、反応
物にグリシンを１％（ｗ／ｖ）加え、撹拌しながら３７
℃で２時間インキユベートして未反応活性基をブロック
した後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して
５時間透析し、次いで、予め０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）で平衡化させておいたＣＭ−セファデックス
カラムクロマトグラフィーにかけ、非吸着画分から当該
蛋白質とプルランとの複合体を採取した。その後、常法
により、複合体を１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを
含む生理食塩水に最終蛋白質濃度が約１００ｎｇ／ｍｌ
になるように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶
に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。
【００７９】本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶
内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均
一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として
当該蛋白質とプルランとの複合体を含有する本品は、花
粉症を治療・予防するための乾燥注射剤として有用であ
る。
【００８０】
【実施例Ｂ−２ 注射剤】平均分子量約２０，０００ダ
ルトンのＣＭ−セルロース１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶
解し、溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド−メチオジドを２ｇ加えた後、
１Ｎ塩酸により溶液のｐＨを４付近に保ちながら、撹拌
下、常温で２時間反応させた。反応物を蒸留水に対して
２４時間透析後、透析内液を採取し、実施例Ａ−２の方
法により調製した精製蛋白質を３０ｍｇ加え、常温下、
ｐＨ４．５で１５時間静置して反応させた。その後、反
応物中の複合体を実施例Ｂ−１と同様に精製し、濃縮
後、５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶液に溶解し、滅菌
濾過し、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密栓し
た。
【００８１】本品は、投与に先立ち、先ず、スクラッチ
試験や皮内試験等による診断結果を参考に、１００乃至
１００，０００倍容の５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶
液をバイアル瓶内に加え、次いで、内容物を均一に希釈
して使用する。有効成分として当該蛋白質とＣＭ−セル
ロースとの複合体を含有する本品は、花粉症を治療・予
防するための減感作注射剤として有用である。
【００８２】
【実施例Ｂ−３ 液剤】サルモネラ菌由来の精製リポ多
糖１００ｍｇを約４℃の５０％飽和酢酸ナトリウム水溶
液２５ｍｌに溶解し、０．５Ｎ水酸化ナトリウムにより
溶液のｐＨを９．０に調整後、溶液のｐＨを８．５付近
に保ちながら、ブロモアセチルブロミド２０μｌを含む
無水ジオキサン１ｍｌを滴々加えた。次いで、６Ｎ酢酸
により反応物のｐＨを約４．５に調整後、４℃の蒸留水
に対して４８時間透析して活性化リポ多糖を含む水溶液
を得た。この水溶液に実施例Ａ−１の方法により得た部
分精製蛋白質を４０ｍｇ加えた後、溶液のｐＨを約４．
５に保ちながら、室温下で４８時間静置して反応させ
た。その後、反応物を実施例Ｂ−１と同様に精製し、濃
縮し、凍結乾燥して当該蛋白質とリポ多糖との複合体固
状物を得た。その後、この固状物を最終濃度が１００ｎ
ｇ／ｍｌになるように１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含
む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して液剤とし
た。
【００８３】有効成分として当該蛋白質とリポ多糖との
複合体を含む本品は、花粉症を治療・予防するための点
眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用であ
る。
【００８４】
【実施例Ｂ−４ 舌下剤】平均分子量約２００，０００
ダルトンの精製エルシナンを蒸留水４００ｍｌに均一に
溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液により溶液のｐＨ
を１０．７に調整後、水溶液のｐＨを１０．０付近に保
ちながら、臭化シアン３ｇを徐々に加え、１時間反応さ
せた。１Ｎ塩酸により反応物のｐＨを５．０に調整後、
このｐＨを保ちつつ、冷水に対して１０時間透析するこ
とにより、活性化エルシナンを含む水溶液を得た。次い
で、この水溶液に実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋
白質を２０ｍｇ加え、常温下で２４時間静置して反応さ
せた。反応終了後、反応物に３倍容のアセトンを加え、
生成した沈澱部を採取し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）に溶解し、遠心分離により不溶物を除去した
後、予め０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化
させておいたＣＭ−セファデックスカラムクロマトグラ
フィーにかけ、非吸着画分から当該蛋白質とエルシナン
との複合体を含む画分を採取した。その後、常法によ
り、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕
後、林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントー
ス』を均一に混合し、常法により、混合物を打錠して製
品１錠（２００ｍｇ）当たり蛋白質を１００ｎｇ含む錠
剤を得た。
【００８５】摂取性、安定性に優れた本品は、花粉症を
治療・予防するための舌下剤として有用である。
【００８６】
【実施例Ｂ−５ 診断剤】実施例Ａ−１の方法により得
た部分精製蛋白質１０ｍｇを生理食塩水２０ｍｌに溶解
し、常法により、滅菌濾過した後、滅菌したバイアル瓶
に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓して診断剤を得
た。
【００８７】本品は、注射用蒸留水１ｍｌに溶解後、同
蒸留水でさらに１０倍希釈してスクラッチ試験や皮内試
験等による花粉症の診断に使用する。
【００８８】
【実施例Ｂ−６ 診断剤】実施例Ａ−２の方法により得
た精製蛋白質１ｍｇを５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムを
含む５０％（ｖ／ｖ）グリセリン２０ｍｌに溶解し、常
法により、滅菌濾過した後、滅菌したバイアル瓶に１ｍ
ｌずつ分注した。
【００８９】本品は、５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶
液に２０倍希釈してスクラッチ試験や皮内試験等による
花粉症の診断に使用する。
【００９０】次に、２〜３の実験例に基づき、この発明
による減感作剤の効果等について説明する。
【００９１】
【実験例３ 動物実験】本実験例は、この発明による減
感作剤を実際に実験動物に投与することにより、この発
明の蛋白質と特定糖質との複合体が花粉症の治療・予防
に効果があることを裏付けるためのものである。
【００９２】
【実験例３−１ 予防効果】１０乃至１２週齢の雌ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス６匹からなる一群に、実施例Ｂ−１の方
法により得た減感作剤を蛋白質の量に換算して１μｇ／
匹の割合で毎週１回、３週間に亙って腹腔内に注射投与
した。減感作剤の最終投与から１週間後に、花粉症を惹
起すべく、抗原として実施例Ａ−２の方法により得た精
製蛋白質１μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウ
ム４ｍｇを含む生理食塩水０．２ｍｌを上記と同様に注
射投与した。そして、抗原投与の直前と抗原投与から１
週間後にマウスの血液を採取し、そこに含まれる当該蛋
白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗体、イムノグロブ
リンＧ抗体及びイムノグロブリンＭ抗体の量を調べた。
【００９３】別途、減感作剤に代えて、実施例Ａ−２の
方法により得た精製蛋白質と平均分子量約２００，００
０ダルトンの精製プルランとを重量比で１：１５の割合
で含む混合物を投与する系を設け、これを上記と同様に
処置して対照とした。なお、当該蛋白質に特異的なイム
ノグロブリンＥ抗体の量は、アイ・モータ等『ライフ・
サイエンシーズ』、第８巻、第１６号、パートＩＩ、第
８１３〜８２０頁（１９６９年）に報告されているＰＣ
Ａ反応により、また、当該蛋白質に特異的なイムノグロ
ブリンＧ抗体とイムノグロブリンＭ抗体の量は、エス・
ヨシタケ等『ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー』、第９２巻、第５号、第１，４１３〜１，４２４頁
（１９８２年）に報告されている酵素免疫吸着法（ＥＩ
Ａ）により測定し、それぞれ、マウス６匹の平均抗体価
で表示した。結果を表５に示す。
【００９４】
【表５】
【００９５】表５に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とプルランとの複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系において
は、減感作に有効なイムノグロブリンＧ抗体及びイムノ
グロブリンＭ抗体が著量産生する一方、イムノグロブリ
ンＥ抗体の産生が実質皆無なまでに抑えられていた。イ
ムノグロブリンＥ抗体は、アナフィラキシーショックを
始めとする望ましくない副作用の主因と言われており、
この発明の減感作剤をマウスに投与することにより、そ
の産生が顕著に抑制されたことは、複合体を含有するこ
の発明の減感作剤が、ヒトを含む哺乳動物における花粉
症の予防に安全且つ効果的に使用し得ることを意味して
いる。
【００９６】
【実験例３−２ 非経口投与による治療効果】１０乃至
１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス６匹からなる一群に、
抗原として、実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質
１μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウム４ｍｇ
を含む生理食塩水０．２ｍｌを毎週１回、３週間に亙っ
て腹腔内に注射投与して花粉症を惹起した。抗原の最終
投与から１週間後に、実施例Ｂ−１の方法により得た減
感作剤を蛋白質量に換算して１００ｎｇ／匹の用量で毎
週１回、３週間に亙って上記と同様に注射投与した。減
感作剤の最終投与から１週間後に、再度、抗原のみを上
記と同様に投与してイムノグロブリンＥ抗体の産生を再
誘導する処置をした。そして、減感作剤の投与直前、減
感作剤の最終投与から１週間後及びイムノグロブリンＥ
抗体の再誘導から１週間後にマウスから採血し、そこに
含まれる当該蛋白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗
体、イムノグロブリンＧ抗体及びイムノグロブリンＭ抗
体の量を実験例３−１と同じ方法により調べた。
【００９７】別途、減感作剤に代えて、実施例Ａ−２の
方法により得た精製蛋白質と平均分子量約２００，００
０ダルトンの精製プルランとを重量比で１：１５の割合
で含む混合物を投与する系を設け、これを上記と同様に
処置して対照とした。結果を表６に示す。
【００９８】
【表６】
【００９９】表６に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とプルランとの複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系では、減感
作剤の投与後においても、イムノグロブリンＥ抗体の再
誘導後においても、著量のイムノグロブリンＧ抗体とイ
ムノグロブリンＭ抗体が認められた。イムノグロブリン
Ｅ抗体についてみると、減感作剤の投与後はもとより、
イムノグロブリンＥ抗体の再誘導後においてすら、産生
が実質皆無なまでに抑えられていた。これらの結果は、
複合体を含有するこの発明の減感作剤を非経口投与する
ことにより、ヒトを含む哺乳動物における花粉症を安全
且つ効果的に治療し得ることを意味している。
【０１００】
【実験例３−３ 経口投与による治療効果】１０乃至１
２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹からなる一群に、抗
原として、実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質１
μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウム４ｍｇを
含む生理食塩水０．２ｍｌを毎週１回、３週間に亙って
腹腔内に注射投与して花粉症を惹起した。抗原の最終投
与から１週間後に、実施例Ｂ−４の方法により得た舌下
剤を粉砕し、蛋白質の量に換算して１００ｎｇ／匹の用
量で毎週１回、３週間に亙って経口投与した。舌下剤の
最終投与から１週間後にマウスから採血し、そこに含ま
れる当該蛋白質に特異的なイムノグロブリンＡ抗体、イ
ムノグロブリンＧ抗体及びイムノグロブリンＥ抗体の量
を調べた。
【０１０１】別途、舌下剤に代えて、実施例Ａ−２の方
法により得た精製蛋白質とサルモネラ菌由来の精製リポ
多糖とを重量比で１：１５の割合で含む固状混合物を経
口投与する系を設け、これを上記と同様に処置して対照
とした。なお、当該蛋白質に特異的なイムノグロブリン
Ａ抗体とイムノグロブリンＧ抗体の量は、アール・メオ
リーニ等『ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ズ』、第６巻、第３５５〜３６２頁（１９７５年）に報
告されているＥＩＡ法により、また、当該蛋白質の特異
的なイムノグロブリンＥ抗体の量は、実験例３−１と同
様の方法により測定し、それぞれ、マウス６匹の平均抗
体価で表示した。結果を表７に示す。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】表７に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とリポ多糖との複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系において
は、イムノグロブリンＡ抗体及びイムノグロブリンＧ抗
体が著量産生する一方、イムノグロブリンＥ抗体の産生
は実質皆無なまでに抑えられていた。このことは、複合
体を含有するこの発明の減感作剤が、経口投与によって
も、ヒトを含む哺乳動物における花粉症を安全且つ効果
的に治療し得ることを示している。
【０１０４】なお、データは示していないものの、斯界
における通常一般の方法により、実施例Ｂ−１乃至Ｂ−
４の方法により得た減感作剤をマウス、ラット及びモル
モットの皮内、皮下、筋肉内若しくは腹腔内に注射投与
するか、あるいは、点眼剤、点鼻剤若しくは口腔内噴霧
剤の形態にして経粘皮投与したところ、以上すべての減
感作剤が重篤な副作用を惹起することなく、花粉症の治
療・予防に有意な効果を発揮した。このことは、当該蛋
白質とプルラン、エルシナンなどの、本質的にマルトト
リオースを反復単位とする糖質との複合体において特に
顕著となり、しかも、この場合、他の糖質との複合体と
比較して、所期の減感作を達成するに要する投与量と投
与期間が一段と低減乃至短縮できることが判明した。
【０１０５】
【実験例３−４ 急性毒性試験】常法により、生後２０
日目のマウスに実施例Ｂ−１乃至Ｂ−４の方法により得
た治療・予防用減感作剤を経口若しくは腹腔内投与し
た。その結果、これら減感作剤は、いずれの投与経路に
よっても１，０００，０００ｎｇ以上のＬＤ５０である
ことが判明した。このことは、当該蛋白質と特定糖質と
の複合体を含有するこの発明の減感作剤が、ヒトを含む
哺乳動物に投与する医薬品に安全に配合使用し得ること
を示している。
【０１０６】
【発明の効果】叙上のように、この発明による蛋白質
は、新規な花粉症原因物質である。この発明の蛋白質
は、ヒトを含む哺乳動物において花粉症を惹起する性質
を有することから、花粉症を診断若しくは治療・予防す
るための減感作剤はもとより、酵素免疫測定や放射免疫
測定による花粉症の診断、さらには、アレルギー症一般
の発症機序を解明する学術研究において広範な用途を有
する。とりわけ、この発明の蛋白質と特定糖質との複合
体は、ヒトを含む哺乳動物に投与すると、減感作に有効
なイムノグロブリン抗体を著量産生する一方、アナフィ
ラキシーショックを含む望ましくない副作用の主因たる
イムノグロブリンＥ抗体を実質的に産生しない性質があ
る。この性質により、この発明による減感作剤を使用し
て花粉症を治療・予防するときには、治療・予防に要す
る抗原の投与量と投与期間を有意に低減乃至短縮できる
こととなる。なお、斯くも有用なる当該蛋白質は、この
発明の製造方法により、スギ花粉を原料に、所望量を比
較的容易に製造することができる。
【０１０７】この発明は、斯くも顕著な効果を奏するも
のであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発
明であるといえる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 蛋白質とその製造方法並びに用途
【特許請求の範囲】
【化１】 （５） 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に吸収極大を有する。 （６） 溶剤への溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶である。 （７） 生物作用 花粉症患者の血液から採取したイムノグロブリンＥ抗体
に結合する。花粉症を惹起する。 （８） 安定性 水溶液（ｐＨ７．２）中、１００℃で１０分間加熱する
と失活する。水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月間
放置しても、実質的に失活しない。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、花粉症を惹起する新
規な蛋白質と、その蛋白質を製造するための方法並びに
花粉症を治療、予防、診断するための減感作剤としての
用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ここ十数年来、我国においては、春先に
なると花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が増加
し続けている。患者の数が多いことと、発症季がいろい
ろな行事が続く春先ということもあって、マスコミなど
でも頻繁に取上げられ、今や、公衆衛生上無視できない
問題の一つになっている。
【０００３】花粉症はアレルギー症の一種であり、その
主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花粉ア
レルゲンであると言われている。大気中に飛散したスギ
花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲンに
対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状態
で、次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のスギ花粉
アレルゲンとこのイムノグロブリンＥ抗体とが免疫反応
を起し、アレルギー症状を呈することとなる。
【０００４】現在、スギ花粉中には、抗原性の相違する
少なくとも２種類のアレルゲンの存在することが知られ
ている。その一つは、ヤスエダ等が『ジャーナル・オブ
・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、
第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報
告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ
Ｉ」と呼称されている。もう一つは、タニアイ等『エ
フ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２
号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチ等
『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９
９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、こ
れは「Ｃｒｙ ｊ ＩＩ」と呼称されている。スギ花粉
中には、通常、Ｃｒｙ ｊ ＩとＣｒｙ ｊ ＩＩが約
５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採
取した血清のほとんどがＣｒｙｊ ＩにもＣｒｙ ｊ
ＩＩにも反応すると言われている。澤谷等は、『アレル
ギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９
９３年）において、Ｃｒｙ ｊ ＩＩが、皮内試験やＲ
ＡＳＴ試験すると、Ｃｒｙ ｊ Ｉと同程度の抗原性を
発揮すると報告している。
【０００５】このように、スギ花粉アレルゲンがすでに
幾つか単離され、その性質・性状がある程度解明された
ことから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減
感作することにより、花粉症を治療・予防できる見通し
がついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか考
案されており、例えば、特開平１−１５６９２６号公報
や特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端にＡｓｐ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−又はＡｌａ
−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−で表され
るアミノ酸配列を有するアレルゲンに多糖類の一種であ
るプルランを結合せしめ、得られる複合体を減感作剤と
してヒトに投与する提案が為されている。しかしなが
ら、花粉症を惹起するアレゲンはＣｒｙ ｊ ＩやＣｒ
ｙ ｊ ＩＩだけではなく、正確な診断や効果的な減感
作療法をするうえでも、その余のアレルゲンを単離し、
性質・性状を解明するのが斯界の急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は、花粉症を惹起する新規な蛋白質を提供
することにある。
【０００７】この発明の目的は、その蛋白質を製造する
ための方法を提供することにある。
【０００８】この発明のさらに別の目的は、その蛋白質
の減感作剤としての用途を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を理化学的性質が （１） 分子量 ４４，０００乃至５４，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動） （２） 等電点 ８．５乃至９．２（等電点電気泳動） （３） Ｃ末端アミノ酸配列 −Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表されるＣ末端
アミノ酸配列を有する。 （４） 糖含量 分子中に、下記の化２に示す一般式で表される糖鎖を重
量で約５乃至２０％含む。ただし、式中、Ｘ、Ｘ′及び
Ｘ″はヒドロキシル基又はＦｕｃα１を、また、Ｙ及び
Ｙ′はヒドロキシル基又はＧａｌβ１を表すものとす
る。
【化２】 （５） 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に吸収極大を有する。 （６） 溶剤への溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶である。 （７） 生物作用 花粉症患者の血液から採取したイムノグロブリンＥ抗体
に結合する。花粉症を惹起する。 （８） 安定性 水溶液（ｐＨ７．２）中、１００℃で１０分間加熱する
と失活する。水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月間
放置しても、実質的に失活しない。 である蛋白質（以下、単に「蛋白質」と言う。）により
解決するものである。なお、この明細書においては、ア
ミノ酸、糖並びにそれらの結合様式等を国際純正及び応
用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定める略号にしたがって略
記することがある。
【００１０】この発明は、前記第二の課題を、スギ花粉
を水性溶媒中で抽出し、その抽出物から蛋白質を採取し
てなる方法により解決するものである。
【００１１】この発明は、前記第三の課題を、有効成分
として蛋白質を含有する減感作剤により解決するもので
ある。
【００１２】
【作用】この発明の蛋白質は、従来公知のスギ花粉アレ
ルゲンには見られない、独特の性質を有する新規物質で
ある。
【００１３】この発明の製造方法は、スギ花粉から蛋白
質を所望量製造することを可能ならしめる。
【００１４】この発明の減感作剤は、ヒトを含む哺乳動
物に投与すると、減感作効果を発揮する。
【００１５】この発明は、花粉症を惹起する新規な蛋白
質に関するものである。本発明者がスギ花粉中のアレル
ゲンについて研究していたところ、従来未知の全く新規
なアレルゲンが含まれていることを見出した。カラムク
ロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せ
てこのアレルゲンを単離し、その性質・性状を調べたと
ころ、その本質は蛋白質であり、従来公知のスギ花粉ア
レルゲンとは相違する性質・性状を有していることが判
明した。次に、この発明による蛋白質の独特の性質・性
状につき、実験例に基づいて説明する。
【００１６】
【実験例１ 蛋白質の精製】千葉県産のオモテスギの雄
花から採取した花粉１重量部を約１６重量部の０．１２
５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．２）に浮遊さ
せ、撹拌しながら４℃で１時間抽出後、遠心分離により
上清を採取した。残渣を同様に再処理し、得られた上清
と初回の抽出で得られた上清をプールし、これにセタブ
ロンを０．１％（ｗ／ｖ）加え、遠心分離後、硫酸アン
モニウムを８０％飽和になるように加えて蛋白質成分を
塩析した。沈澱部分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）に対して１０時間透析し、濾過後、予め５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化させて
おいたＤＥＡＥ−セファデックスカラムに負荷し、カラ
ムに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を通液
して得られる非吸着画分を採取した。
【００１７】この非吸着画分に酢酸を加えてｐＨ５．０
に調整した後、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
で平衡化させておいたＣＭ−セファデックスカラムに負
荷し、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を通液してカ
ラムを洗浄した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）
と０．３Ｍ塩化ナトリウムからなる溶離液を通液して蛋
白質成分を溶出させた。採取した蛋白質成分を含む画分
を、今度は、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液で平衡化させてお
いたＭｏｎｏ−Ｓカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに
上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下でカラムに１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液したとこ
ろ、塩化ナトリウムの濃度が０．１乃至０．３Ｍのとき
に当該蛋白質が溶出した。最後に、常法により、精製蛋
白質を含む画分を濃縮し、凍結乾燥して以下の実験に供
した。なお、収量は、原料のスギ花粉固形分当たりに換
算して約０．０２％であった。
【００１８】
【実験例２ 蛋白質の理化学的性質】本実験例では、実
験例１で得た精製蛋白質につき、その理化学的性質を調
べた。
【００１９】
【実験例２−１ 分子量】ユー・ケー・レムリが『ネー
チャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０
年）に報告している方法に準じて精製蛋白質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量４
４，０００乃至５４，０００ダルトンに相当する位置に
主要なバンドが観察された。なお、このときの分子量マ
ーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルト
ン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カル
ボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、
キモトリプシノーゲンＡ（２５，０００ダルトン）及び
チトクロームＣ（１２，４００ダルトン）であった。
【００２０】分子量４４，０００乃至５４，０００ダル
トンの画分をゲルからニトロセルロース膜に移し取り、
マウス由来の抗スギ花粉アレルゲン抗体及びセイヨウワ
サビ由来のパーオキシダーゼで標識したヤギ由来の抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を作用させたところ、顕著な
免疫反応が観察された。これは、当該蛋白質がスギ花粉
アレルゲンの一種であることを示唆している。
【００２１】
【実験例２−２ 等電点】等電点電気泳動法により測定
したところ、精製蛋白質の等電点は８．５乃至９．２で
あった。
【００２２】
【実験例２−３ Ｃ末端アミノ酸配列】精製蛋白質４０
０μｇを反応管にとり、６Ｍグアニジン塩酸塩と１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）３００μｌに溶解し、反応管内に窒素ガスを注
入し、適量のエチレンイミンとトリ−ｎ−ブチルフォス
フィンを加えた後、暗所に一晩静置してポリペプチドを
アミノエチル化した。反応物を蒸留水に対して透析し、
透析内液を採取して凍結乾燥後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）３００μｌに溶解し、Ｖ８プロテアーゼ
を１５μｇ加え、３７℃で４８時間インキュベートし
た。反応物を約１００℃に５分間加熱して酵素反応を停
止させた後、予め０．０２Ｍ塩化カルシウムを含む０．
０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させておいた
アンヒドロトリプシン−アガロースカラムに負荷し、次
いで、カラムに０．１Ｍ蟻酸を通液して吸着していたペ
プチド成分を溶出させた。
【００２３】その後、溶出液からペプチド成分を含む画
分を採取し、濃縮後、予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフル
オロ酢酸水溶液で平衡化させておいたバイダック社製高
速液体クロマトグラフィー用カラム『２１８ＴＰ５４』
に負荷し、次いで、２１４ｎｍ波長下で溶出液の吸光度
をモニターしながら、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ
酢酸を含み、アセトニトリル濃度が１％（ｖ／ｖ）／分
の割合で上昇する水性アセトニトリルを０．５ｍｌ／分
の流速で通液した。溶出液からペプチド成分を含む画分
を採取し、濃縮後、アプライド・バイオシステム社製ア
ミノ酸シーケンサ『４７３Ａ型』によりアミノ酸配列を
分析したところ、当該蛋白質は、Ｃ末端に、−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表されるアミノ酸配列を有
していることが判明した。
【００２４】
【実験例２−４ 糖含量及び糖鎖構造の決定】本実験例
では、当該蛋白質の糖含量並びに糖鎖の構造及び結合部
位を明らかにする。
【００２５】
【実験例２−４（ａ） 糖含量】常法により、標準物質
にマンノースを使用して分析したところ、精製蛋白質１
００μｇ当たり、約５乃至２０μｇの糖が検出された。
この結果は、当該蛋白質の糖含量が、重量で、約５乃至
２０％であることを示している。
【００２６】
【実験例２−４（ｂ） 糖鎖の糖組成と結合部位】反応
容器に精製蛋白質を１ｍｇとり、６Ｍグアニジン塩酸塩
と１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）３００μｌを加えて均一に溶解し、反
応容器内に窒素ガスを注入後、４−ビニルピリジンを１
μｌとトリ−ｎ−ブチルホスフィンを２μｌ加え、暗所
に２４時間静置して蛋白質をピリジルエチル化した。次
いで、反応物を蒸留水に対して１０時間透析後、透析内
液を採取し、濃縮し、凍結乾燥し、０．２Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ８．６）３００μｌに溶解し、トリ
プシンを１５μｇ加え、３７℃で１７時間インキュベー
トした。
【００２７】得られたトリプシン消化物を０．１％（ｖ
／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む蒸留水で平衡化させたバ
イダック社製高速液体クロマトグラフィー用カラム『２
１８ＴＰ５４』に負荷し、次いで、２１４ｎｍの波長下
で溶出液の吸光度をモニターしながら、アセトニトリル
濃度が１分間に１％（ｖ／ｖ）上昇する濃度勾配下、
０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分
の割合で通液した。その後、溶出画分からペプチド断片
を含む画分を採取し、その一部を試験管にとり、レゾル
シノール法により中性糖の有無を調べたところ、２種類
のペプチド断片に中性糖が検出された。これらペプチド
断片を『ペプチド断片Ａ』又は『ペプチド断片Ｂ』と命
名し、常法により、アプライド・バイオシステム社製ア
ミノ酸シーケンサ『４７３Ａ型』を使用してアミノ酸配
列を分析した。その結果、ペプチド断片Ａ、Ｂは、下記
の表１に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
【００２８】
【表１】
【００２９】次に、表１に示すアミノ酸配列において符
号「Ｘ」を付して示したアミノ酸残基を同定すべく、上
記で得たペプチド断片Ａ、Ｂの一部をそれぞれ別の試験
管にとり、６Ｎ塩酸を適量加え、減圧下、１１０℃で２
０時間インキュベートして加水分解した。反応終了後、
常法により、加水分解物のアミノ酸組成をベックマン社
製アミノ酸アナライザ『６３００型』を使用して分析し
たところ、下記の表２に示す結果が得られた。
【００３０】
【表２】
【００３１】表１に示すアミノ酸配列と表２に示すアミ
ノ酸組成を対比すれば、表１のアミノ酸配列における未
同定のアミノ酸「Ｘ」は明らかにアスパラギンであり、
糖鎖はこのアスパラギンに結合していると推定される。
【００３２】
【実験例２−４（ｃ） 糖鎖の単離と糖組成】実験例１
で得た精製蛋白質を１５０ｍｇとり、少量の蒸留水に溶
解後、蒸留水に対して１０時間透析した。透析内液を採
取し、塩酸でｐＨ２に調整後、ペプシンを１．５ｍｇ加
え、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質におけ
るペプチド結合を切断した。反応物を凍結乾燥し、０．
１Ｍクエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解後、生
化学工業社製『グリコペプチダーゼＡ』を１０ミリ単位
加え、３７℃で１６時間インキュベートしてペプチド断
片から糖鎖を遊離させた。
【００３３】その後、反応液を、蒸留水を使用してゲル
状に形成したバイオラッド社製『バイオゲルＰ−４』に
負荷し、カラムに蒸留水を通液して得られた溶出液を５
ｍｌずつ採取し、レゾルシノール−硫酸法により、画分
ごとに中性糖の有無を調べた。そして、中性糖が検出さ
れた画分の一部をとり、凍結乾燥後、２−アミノピリジ
ン０．０８ｇを含む４Ｎ塩酸６０μｌに溶解し、１００
℃で１３分間インキュベートし、次いで、シアン水素化
硼素ナトリウム１０ｍｇを溶解した蒸留水６μｌ加え、
９０℃でさらに１８時間インキュベートした。最後に、
反応物を、予め０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．２）で平衡化させておいたトーソー社製クロマト
グラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ＨＷ−４０Ｆ』を使用するカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し、未反応試薬等を含まない、蛍光標識さ
れた糖鎖を得た。
【００３４】次に、蛍光標識した糖鎖を、予め、３％
（ｖ／ｖ）酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．
３）とアセトニトリルを容量比で３５：６５の割合で含
む混液により平衡化させておいたトーソー社製高速液体
クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄ
ｏ−８０』に負荷し、蛍光光度計で溶出液をモニターし
ながら、３％（ｖ／ｖ）酢酸−トリエチルアミン緩衝液
とアセトニトリルからなる溶離液を、両者の容量比が５
０分間で５０：５０に上昇する濃度勾配下、１ｍｌ／分
の流速で通液したところ、溶出開始から約１８分後、約
２２分後、約２７分後及び約３５分後に４種類の糖鎖が
溶出した。これらの糖鎖を、それぞれ、「糖鎖Ａ」、
「糖鎖Ｂ」、「糖鎖Ｃ」又は「糖鎖Ｄ」と命名し、下記
の糖組成分析に供した。なお、糖鎖Ａと糖鎖Ｃは比較的
多く存在し、糖鎖Ｂと糖鎖Ｄは少なかった。
【００３５】上記で得た糖鎖Ａ乃至Ｄをそれぞれ凍結乾
燥し、過剰量の４Ｍトリフルオロ酢酸を加えた後、減圧
下、１００℃で３時間加熱して加水分解した。加水分解
物を容量比３：６：２のピリジン／メタノール／蒸留水
混液の適量に溶解し、過剰量の無水酢酸を加えた後、常
温下で３０分間静置してアセチル化した。反応物を採取
し、凍結乾燥後、２−アミノピリジンを６６ｍｇ含む４
Ｎ塩酸５０μｌに溶解し、１００℃で１３分間加熱後、
シアン水素化硼素ナトリウムを０．８ｍｇ溶解した蒸留
水５μｌを加え、９０℃で１８時間インキュベートし
た。その後、反応物を、予め、２０ｍＭ酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたトーソー
社製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ２０００ＰＷ』に負荷し、新鮮な同じ緩衝液を
０．６ｍｌ／分の流速で通液して未反応試薬等を除去し
た。得られた糖混合物を含む溶出液を、今度は、予め、
１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．５Ｍ硼酸緩
衝液（ｐＨ８．７）で平衡化させておいたトーソー社製
高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＴＳＫｇｅｌＳ
ｕｇａｒ ＡＸ−Ｉ』に負荷し、次いで、新鮮な同じ緩
衝液を６０℃、０．４ｍｌ／分の流速で通液することに
より、糖鎖を構成する糖の種類と量を分析した。結果を
下記の表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】表３に示す結果は、当該蛋白質に結合する
糖鎖Ａ乃至Ｄが０乃至２個のガラクトース残基、１乃至
３個のフコース残基、３個のマンノース残基、１個のキ
シロース残基及び４個のＮ−アセチルグルコサミン残基
により構成され、当該蛋白質には、これらの糖鎖のうち
の少なくとも一つが結合していることを示唆している。
【００３８】
【実験例２−４（ｄ） 糖鎖構造の決定】実験例２−４
（ｃ）で単離した糖鎖Ａ乃至Ｄを少量とり、それぞれ別
途に凍結乾燥後、少量の重水に溶解し、再度凍結乾燥し
た。この操作を糖鎖ごとに計３回繰返し、糖鎖における
解離性水素を重水素で置換した。次いで、常法により、
ＪＥＯＬ社製５００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴分光器を
使用し、重水中、３０℃における各糖鎖のアノマー性プ
ロトンとメチルプロトンの化学シフトを調べた。結果を
下記の表４に示す。
【００３９】一方、これらに近い化学シフトを示す既知
の糖鎖構造について調査したところ、エヌ・タカハシ等
『バイオケミストリー』、第２５巻、第３８８〜３９５
頁（１９８６年）に見られるように、シカモアカエデ由
来の酵素であるラッカーゼに結合する糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及
び糖鎖ｆは、４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴において
糖鎖Ａ乃至Ｄとほぼ同じ化学シフトを示すことが判明し
た。表４に、ラッカーゼの糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及び糖鎖ｆに
おけるアノマー性プロトンとメチルプロトンの化学シフ
トを併記する。
【００４０】
【表４】
【００４１】表４に示すように、タカハシ等が報告して
いる糖鎖ｃ、糖鎖ｅ及び糖鎖ｆは、下記の化３、化４又
は化５に示すように、Ｆｕｃα１、Ｘｙｌβ１及び／又
はＧａｌβ１を側鎖に持つ、４個のＮ−アセチルグルコ
サミン残基と３個のマンノース残基からなるＮ結合型糖
鎖構造を有する。これらのことから、糖鎖Ａ乃至Ｄは、
それぞれ、下記の化６、化７、化８又は化９に示す構造
を有すると判断され、したがって、当該蛋白質に結合す
る糖鎖は、前記化２に示す一般式で表すことができる。
なお、糖鎖Ｂの核磁気共鳴スペクトルについて若干補足
説明しておくと、糖鎖Ｂの核磁気共鳴スペクトルにおい
ては、表４中のＦｕｃ−１に相当するアノマー性プロト
ンやメチルプロトンのシグナルが認められず、しかも、
ＧｌｃＮＡｃ−２の化学シフト値は、糖鎖ｅの４．５９
１ｐｐｍより低磁場側の４．６３０ｐｐｍにシフトして
いた。これらの事実は、糖鎖Ｂが、糖鎖ｅにおけるＦｕ
ｃα１を欠如した構造を有することを示している。
【００４２】
【化３】
【００４３】
【化４】
【００４４】
【化５】
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
【化８】
【００４８】
【化９】
【００４９】
【実験例２−５ 紫外線吸収スペクトル】分光光度計を
用いて水溶液中における紫外線吸収スペクトルを測定し
たところ、精製蛋白質は波長２８０ｎｍ付近に吸収極大
を示した。
【００５０】
【実験例２−６ 溶剤への溶解性】常法により試験した
ところ、精製蛋白質は、水、生理食塩水及び燐酸緩衝液
に可溶であった。
【００５１】
【実験例２−７ 生物作用】当該蛋白質は、下記に示す
方法により試験すると、当該蛋白質に特異的に反応する
Ｔ細胞の増殖を誘導する性質と、花粉症患者の血液から
採取したイムノグロブリンＥ抗体に結合する性質を有す
る。また、当該蛋白質に結合する糖鎖は、独特な免疫学
的性質を有し、当該蛋白質から除去すると、当該蛋白質
の抗原性が有意に減弱する。
【００５２】
【実験例２−７（ａ） Ｔ細胞増殖誘導試験】フィコー
ル・ハイパック比重遠心法により、花粉症患者のヘパリ
ン加末梢血から単核細胞を分離した。単核細胞を１０％
（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．０）に濃度１×１０6個／ｍｌになるように
浮遊させ、実験例１で得た精製蛋白質を２０μｇ／ｍｌ
加えた後、５％ＣＯ2培養器中、３７℃で５日間培養し
た。その後、培養培地に組換え型ヒトインターロイキン
−２を５０単位／ｍｌ加え、上記と同様にしてさらに９
日間培養した。このように前処理した単核細胞を下記の
Ｔ細胞増殖試験に供した。
【００５３】９６ウェルマイクロプレートに、１０％
（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．０）に浮遊させた培養単核細胞を４×１０4
個／ウェルと、前記と同一の花粉症患者から採取し、マ
イトマイシン５０μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で３０分
間処理しておいた末梢単核細胞１×１０6個／ウェル
と、精製蛋白質を５０μｇ／ｍｌ加え、新鮮な上記と同
じ培養培地で２００μｌ／ウェルとした。ウェル中の細
胞を５％ＣＯ2培養器中、３７℃で２日間培養し、3Ｈ−
チミジンを０．５μＣｉ／ウェル加え、同じ条件でさら
に１日培養した後、シンチレーションカウンタで細胞内
における3Ｈ−チミジンの取込み量を測定した。同時
に、蛋白質無含有の培養培地を使用する系を設け、これ
を上記と同様に処理して対照とした。
【００５４】その結果、対照系において約２００ｃｐｍ
の取込みが観察されたところ、精製蛋白質を添加した系
では、蛋白質５０μｇ／ｍｌ当たり約８，５００ｃｐｍ
と顕著な取込みが認められ、精製蛋白質が花粉症患者の
血液に含まれるＴ細胞の増殖を顕著に促すことが判明し
た。このことは、当該蛋白質に抗原性があることを示し
ている。
【００５５】
【実験例２−７（ｂ） イムノグロブリンＥ抗体への結
合性試験】精製蛋白質２５０μｇを少量の蒸留水に溶解
し、蒸留水に対して１８時間透析し、凍結乾燥後、０．
５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと５０ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールを含む２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７．８）１２５μｌ
に溶解し、約１００℃で１０分間加熱した。次に、７．
５％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０を６０μｌ、Ｎ−グ
リカナーゼを５単位、蒸留水を２００μｌ加え、３７℃
で２４時時間インキュベートして精製蛋白質の糖鎖を除
去した。別途、Ｎ−グリカナーゼを使用しない系を設
け、これを上記と同様に処理して対照とした。
【００５６】９６ウェルマイクロプレートに上記で得ら
れた糖鎖を有しない蛋白質及び糖鎖を有する蛋白質のい
ずれかを１μｇ／ウェルずつ吸着させ、さらに、花粉症
患者から採取した血清を１００μｌ／ウェルずつ加えた
後、３７℃で２時間インキュベートした。つぎに、マイ
クロプレートを０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
を含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄して未
結合血清を除去した後、セイヨウワサビ由来のパーオキ
シダーゼで標識したヤギ由来の抗ヒトイムノグロブリン
Ｅ抗体を１００μｌ／ウェルずつ加え、３７℃でさらに
２時間インキュベートした。マイクロプレートを新鮮な
上記と同じ燐酸緩衝液で洗浄して未結合の抗体を除去
し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジア
ミンと０．０３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水を含む０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌを加えて発
色させた後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５７】その結果、糖鎖を有しない蛋白質を使用す
る系における吸光度が約０．０５であったのに対して、
糖鎖を有する蛋白質を使用する系では、吸光度が約０．
３にも達しており、当該蛋白質が花粉症患者の血液から
採取したイムノグロブリンＥ抗体に結合する性質がある
こととともに、その抗原性に特定の糖鎖が不可欠である
ことを示している。また、本実験例２−７の結果は、当
該蛋白質が花粉症の原因物質の一つであり、ヒトを含む
哺乳動物において花粉症を惹起する性質のあることを裏
付けている。
【００５８】
【実験例２−８ 安定性】精製蛋白質を水溶液（ｐＨ
７．２）中、１００℃で１０分間インキュベートしたと
ころ、残存活性は認められなかった。一方、精製蛋白質
を水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月保存したとこ
ろ、実質的な活性低下は認められなかった。
【００５９】以上のような理化学的性質を有する蛋白質
は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
【００６０】次に、この発明による蛋白質の製造方法に
ついて説明するに、この発明の蛋白質は、スギ科スギ属
（クリプトメリア・ジャポニカ）に属するオモテスギや
ウラスギなどのスギ木から採取した花粉を水性溶媒中で
抽出し、その抽出物を精製することにより製造すること
ができる。スギ花粉から当該蛋白質を抽出するには、通
常、スギの雄花から採取した花粉を水若しくは水にメチ
ルアルコール、エチルアルコール、アセトンなどの親水
性有機溶媒や適宜の安定剤等を適量混合した水性溶媒に
浮遊させ、必要に応じて、撹拌しながら、１０℃未満の
温度、望ましくは、約０乃至５℃で３０分間以上、望ま
しくは、約１乃至２時間浸漬させる。スギ花粉の状態に
も依るが、通常、斯かる操作を１乃至５回行なうことに
より、スギ花粉から大半の蛋白質を抽出することができ
る。
【００６１】抽出物中の蛋白質を精製するには、斯界に
おける通常一般の方法を採用し得る。すなわち、前記の
ようにして得た抽出物に、例えば、塩析、透析、濾過、
濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方
法を適用すれば、部分精製蛋白質が得られる。この部分
精製蛋白質は、通常、当該蛋白質以外に、Ｃｒｙ ｊＩ
Ｉなどのスギ花粉アレルゲンを含んでいる。より高純度
の蛋白質を必要とする場合には、この部分精製蛋白質
に、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの方法の１種若
しくは２種以上を適用することにより、Ｃｒｙ ｊ Ｉ
Ｉを始めとする当該蛋白質以外の成分を除去すればよ
い。
【００６２】斯くして得られる部分精製乃至精製蛋白質
は、花粉症を診断若しくは治療・予防するための減感作
剤に有利に配合使用できる。また、精製蛋白質は、当該
蛋白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗体を定性・定量
分析するための酵素免疫測定や放射免疫測定の検出用抗
原として有用であり、花粉症の診断や、アレルギー症一
般の発症機序を解明するための学術研究においても広範
な用途を有する。
【００６３】つぎに、この発明による蛋白質の製造方法
につき、２〜３の実施例を挙げて具体的に説明する。
【００６４】
【実施例Ａ−１ 部分精製蛋白質の調製】千葉県産のオ
モテスギの雄花から採取した花粉１重量部を約１６重量
部の０．１２５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．
２）に浮遊させ、撹拌しながら４℃で１時間抽出した
後、遠心分離により上清を採取した。残渣を同様に再処
理し、得られた上清と初回の抽出で得られた上清をプー
ルし、これにセタブロンを０．１％（ｗ／ｖ）加え、遠
心分離後、硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように
加えて蛋白質成分を塩析した。沈澱部分を５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に対して１０時間透析
し、濾過した後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファデッ
クスカラムに負荷し、ついで、カラムに５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を通液し、非吸着画分を採
取した。この画分に酢酸を加えてｐＨ５．０に調整した
後、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化さ
せておいたＣＭ−セファデックスカラムに負荷し、１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を通液してカラムを洗浄
した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）と０．３Ｍ
塩化ナトリウムからなる溶離液をカラムに通液して蛋白
質成分を溶出させた。その後、常法により、この溶出画
分を濃縮し、凍結乾燥して、当該蛋白質以外にＣｒｙ
ｊ ＩＩを含む部分精製蛋白質を得た。収量は、原料の
スギ花粉固形分に換算して約０．１％であった。
【００６５】本例の部分精製蛋白質は、花粉症を診断若
しくは治療・予防するための減感作剤に有利に配合使用
できる。
【００６６】
【実施例Ａ−２ 精製蛋白質】実施例Ａ−１の方法によ
り得た部分精製蛋白質を少量の蒸留水に溶解し、溶液を
予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させて
おいたＭｏｎｏ−Ｓカラムに負荷した後、０Ｍから０．
５Ｍに上昇する濃度勾配下でカラムに１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液したところ、塩化ナト
リウム濃度が０．１乃至０．３Ｍのときに当該蛋白質が
溶出した。その後、常法により、溶出液を濃縮し、凍結
乾燥して、本質的に当該蛋白質のみからなる精製蛋白質
を得た。収量は、原料のスギ花粉固形分当たりに換算し
て約０．０２％であった。
【００６７】本例の精製蛋白質は、花粉症を治療、予
防、診断するための減感作剤や、酵素免疫測定や放射免
疫測定用の抗原として有用である。
【００６８】次に、この発明による蛋白質の用途につ
き、実施例、実験例を示して具体的に説明する。
【００６９】この発明の蛋白質は、花粉症の原因物質の
一つであることから、花粉症を治療、予防、診断するた
めの減感作剤として広範な用途を有する。この発明の減
感作剤は、有効成分として、当該蛋白質か、あるいは、
後述の、当該蛋白質と特定糖質との複合体を含有せしめ
てなるものである。花粉症の診断を目的とする減感作剤
には、通常、前述のような方法により得た部分精製乃至
精製蛋白質をそのまま配合し、一方、花粉症の治療・予
防を目的とする場合には、配合に先立って、当該蛋白質
に特定の糖質を共有結合させて複合体とする。
【００７０】この発明でいう糖質とは、当該蛋白質に共
有結合させることができ、且つ、複合体とすることによ
り、当該蛋白質の減感作効果及び／又は副作用を増強若
しくは低減するものをいう。斯かる糖質としては、例え
ば、澱粉、アミロース、デキストラン、ポリスクロー
ス、プルラン、エルシナン、カードラン、アラビアガ
ム、トラガカントガム、グアガム、キサンタンガム、カ
ラゲナン、セルロース、グルコマンナン、キトサン、リ
ポ多糖などの単純若しくは複合多糖並びにそれら糖質の
誘導体及び部分加水分解物が挙げられ、その平均分子量
は、通常、約５００乃至１０，０００，０００ダルト
ン、望ましくは、約１０，０００乃至１，０００，００
０ダルトンの範囲にある。上記糖質のうちでも、本質的
にマルトトリオースを反復単位とするプルラン、エルシ
ナン又はそれらの部分加水分解物との複合体は、ヒトを
含む哺乳動物に投与すると、減感作に有効なイムノグロ
ブリンＧ抗体やイムノグロブリンＭ抗体を著量産生する
一方、アナフィラキシーショックを含む望ましくない副
作用の主因たるイムノグロブリンＥ抗体を産生し難い性
質が顕著である。このことは、反復投与を必須とする減
感作療法を安全且つ効果的に実施するうえで極めて好都
合である。
【００７１】また、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、セ
ラチア菌などの微生物に由来するリポ多糖やその部分加
水分解物には、当該蛋白質との複合体とすることによ
り、当該蛋白質の哺乳動物の粘膜に対する親和性を高
め、摂取効率を有意に改善する性質がある。このことか
ら、これら糖質との複合体は、経皮若しくは経粘皮投与
を前提とする減感作剤において特に有用である。
【００７２】斯かる複合体は、通常、当該蛋白質を活性
化糖質と反応させるか、あるいは、１分子中に２以上の
活性官能基を有する試薬により、当該蛋白質と糖質とを
架橋すればよい。個々の反応方法としては、例えば、ジ
アゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋法、アミド結
合法、過沃素酸酸化法、ジスルフィド結合法などが挙げ
られるが、これら反応方法自体は斯界において公知であ
り、例えば、特開平３−９３７３０号公報などには、そ
の代表的な方法が詳述されている。反応開始時における
蛋白質と糖質との割合は、重量比で、通常、約１：０．
００１乃至１：１，０００、望ましくは、約１：０．０
１乃至１：１００の範囲が選ばれる。反応方法にも依る
が、この範囲を下回るとペプチド同志の結合が顕著とな
り、反対に、この範囲を上回ると糖質同志の反応が顕著
となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率低
下をもたらすものであり、上記の範囲をもって最良とし
た。反応時の温度、ｐＨ及び反応時間は、蛋白質が失活
したり、分解し難く、しかも、望ましくない副反応が最
少限になるように設定するのがよく、通常、温度を約０
乃至１００℃、ｐＨを約０．１乃至１２とし、約０．１
乃至５０時間で完結させるのが望ましい。
【００７３】反応により生成した複合体は、例えば、透
析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳
動などの斯界における通常一般の方法により精製でき、
必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そし
て、最終使用形態に応じて、精製した複合体を濃縮・凍
結乾燥することにより、液状若しくは固状にすればよ
い。
【００７４】この発明の減感作剤は、上記のようにして
得られた蛋白質及び／又は複合体単独の形態はもとよ
り、それ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦
形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に
応じて、ステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウ
ムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤を含む１種又は２種
以上の他の薬剤との組成物としての形態を包含する。さ
らに、この発明の減感作剤は、投薬単位形態の薬剤をも
包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明の蛋白
質若しくは複合体を、例えば、１日当たりの用量又はそ
の整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０ま
で）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離
した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬
形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠
剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟膏
剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧
剤、注射剤などが挙げられる。
【００７５】この発明による減感作剤の使用方法につい
て説明するに、この発明の減感作剤は、スギ花粉アレル
ゲンを含む通常一般の減感作剤と同様に使用することが
できる。すなわち、この発明の減感作剤により花粉症の
診断をするには、スクラッチ試験あるいは皮内試験とし
て知られる通常の試験方法を採用し、まず、被験者の皮
膚面に出血しない程度の傷をつけ、この発明による診断
用減感作剤を適量滴下するか、あるいは、この発明によ
る診断用減感作剤の適量を皮内に注射投与する。そし
て、１５乃至３０分経過後に膨疹の有無と大きさを調
べ、膨疹の大きさが一定値以上の場合、陽性と判定す
る。
【００７６】この発明の減感作剤による治療において
は、通常、上述の診断結果に基づいて適切な用量・用法
を決定する。診断結果が陽性の被験者については、当該
蛋白質と特定糖質との複合体を含有するこの発明の減感
作剤を経口若しくは非経口的に投与する。症状、用法な
どに依っても変わるが、具体的には、患者の症状や投与
後の経過を観察しながら、通常、成人１回当たり約０．
０００１乃至１００，０００ｎｇ、望ましくは、約０．
００１乃至１０，０００ｎｇを目安とし、毎週１回乃至
毎月１回の頻度で、約１カ月乃至１年間、通常、用量を
増やしながら、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内若しくは経
粘皮的に反復投与する。花粉症の予防もほぼ同じ用量、
用法でよく、対象者の健康状態や投与後の経過を観察し
ながら、通常、成人１回当たり約０．０００１乃至１０
０，０００ｎｇ、望ましくは、約０．００１乃至１０，
０００ｎｇを目安とし、毎週１回乃至毎月１回の頻度
で、約１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら、皮
内、皮下、筋肉内若しくは経粘皮的に反復投与する。こ
の発明による減感作剤を秋口から翌年の春先にかけて定
期的に反復投与するときには、翌年の発症季におけるア
レルギー症状を僅少若しくは皆無とすることができる。
【００７７】次に、この発明による減感作剤につき、２
〜３の実施例を挙げて具体的に説明する。
【００７８】
【実施例Ｂ−１ 乾燥注射剤】平均分子量約２００，０
００ダルトンの精製プルラン２ｇを蒸留水１００ｍｌに
溶解し、塩化シアヌルの１．７％（ｗ／ｖ）アセトン溶
液を２ｍｌ加えた。次いで、５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリ
ウム水溶液により溶液のｐＨを７付近に保ちつつ、氷浴
中、４℃以下で２時間静置して反応させた。このように
して得られた活性化プルランを含む溶液に実施例Ａ−２
の方法により得た精製蛋白質を４０ｍｇ加え、撹拌下、
ｐＨ７．０、３７℃で５時間反応させた。その後、反応
物にグリシンを１％（ｗ／ｖ）加え、撹拌しながら３７
℃で２時間インキュベートして未反応活性基をブロック
した後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して
５時間透析し、次いで、予め０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）で平衡化させておいたＣＭ−セファデックス
カラムクロマトグラフィーにかけ、非吸着画分から当該
蛋白質とプルランとの複合体を採取した。その後、常法
により、複合体を安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清
アルブミンを含む生理食塩水に最終蛋白質濃度が約１０
０ｎｇ／ｍｌになるように溶解し、滅菌濾過した後、滅
菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓し
た。
【００７９】本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶
内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均
一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として
当該蛋白質とプルランとの複合体を含有する本品は、花
粉症を治療・予防するための乾燥注射剤として有用であ
る。
【００８０】
【実施例Ｂ−２ 注射剤】平均分子量約２０，０００ダ
ルトンのＣＭ−セルロース１ｇを蒸留水２００ｍｌに溶
解し、溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド−メチオジドを２ｇ加えた後、
１Ｎ塩酸により溶液のｐＨを４付近に保ちながら、撹拌
下、常温で２時間反応させた。反応物を蒸留水に対して
２４時間透析後、透析内液を採取し、実施例Ａ−２の方
法により調製した精製蛋白質を３０ｍｇ加え、常温下、
ｐＨ４．５で１５時間静置して反応させた。その後、反
応物中の複合体を実施例Ｂ−１と同様に精製し、濃縮
後、５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶液に溶解し、滅菌
濾過し、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、密栓し
た。
【００８１】本品は、投与に先立ち、先ず、スクラッチ
試験や皮内試験等による診断結果を参考に、１００乃至
１００，０００倍容の５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶
液をバイアル瓶内に加え、次いで、内容物を均一に希釈
して使用する。有効成分として当該蛋白質とＣＭ−セル
ロースとの複合体を含有する本品は、花粉症を治療・予
防するための減感作注射剤として有用である。
【００８２】
【実施例Ｂ−３ 液剤】サルモネラ菌由来の精製リポ多
糖１００ｍｇを約４℃の５０％飽和酢酸ナトリウム水溶
液２５ｍｌに溶解し、０．５Ｎ水酸化ナトリウムにより
溶液のｐＨを９．０に調整後、溶液のｐＨを８．５付近
に保ちながら、ブロモアセチルブロミド２０μｌを含む
無水ジオキサン１ｍｌを滴々加えた。次いで、６Ｎ酢酸
により反応物のｐＨを約４．５に調整後、４℃の蒸留水
に対して４８時間透析して活性化リポ多糖を含む水溶液
を得た。この水溶液に実施例Ａ−１の方法により得た部
分精製蛋白質を４０ｍｇ加えた後、溶液のｐＨを約４．
５に保ちながら、室温下で４８時間静置して反応させ
た。反応物を実施例Ｂ−１と同様に精製し、濃縮し、凍
結乾燥して当該蛋白質とリポ多糖との複合体固状物を得
た。その後、この固状物を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌ
になるように安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチン
を含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して液剤と
した。
【００８３】有効成分として当該蛋白質とリポ多糖との
複合体を含む本品は、花粉症を治療・予防するための点
眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用であ
る。
【００８４】
【実施例Ｂ−４ 舌下剤】平均分子量約２００，０００
ダルトンの精製エルシナンを蒸留水４００ｍｌに均一に
溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液により溶液のｐＨ
を１０．７に調整後、水溶液のｐＨを１０．０付近に保
ちながら、臭化シアン３ｇを徐々に加え、１時間反応さ
せた。１Ｎ塩酸により反応物のｐＨを５．０に調整後、
このｐＨを保ちつつ、冷水に対して１０時間透析するこ
とにより、活性化エルシナンを含む水溶液を得た。次い
で、この水溶液に実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋
白質を２０ｍｇ加え、常温下で２４時間静置して反応さ
せた。反応終了後、反応物に３倍容のアセトンを加え、
生成した沈澱部を採取し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）に溶解し、遠心分離により不溶物を除去した
後、予め０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化
させておいたＣＭ−セファデックスカラムクロマトグラ
フィーにかけ、非吸着画分から当該蛋白質とエルシナン
との複合体を含む画分を採取した。その後、常法によ
り、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕
後、株式会社林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファ
イントース』を均一に混合し、常法により、混合物を打
錠して製品１錠（２００ｍｇ）当たり蛋白質を１００ｎ
ｇ含む錠剤を得た。
【００８５】摂取性、安定性に優れた本品は、花粉症を
治療・予防するための舌下剤として有用である。
【００８６】
【実施例Ｂ−５ 診断剤】実施例Ａ−１の方法により得
た部分精製蛋白質１０ｍｇを生理食塩水２０ｍｌに溶解
し、常法により、滅菌濾過した後、滅菌したバイアル瓶
に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓して診断剤を得
た。
【００８７】本品は、注射用蒸留水１ｍｌに溶解後、同
蒸留水でさらに１０倍希釈してスクラッチ試験や皮内試
験等による花粉症の診断に使用する。
【００８８】
【実施例Ｂ−６ 診断剤】実施例Ａ−２の方法により得
た精製蛋白質１ｍｇを５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムを
含む５０％（ｖ／ｖ）グリセリン２０ｍｌに溶解し、常
法により、滅菌濾過した後、滅菌したバイアル瓶に１ｍ
ｌずつ分注した。
【００８９】本品は、５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶
液に２０倍希釈してスクラッチ試験や皮内試験等による
花粉症の診断に使用する。
【００９０】次に、２〜３の実験例に基づき、この発明
による減感作剤の効果等について説明する。
【００９１】
【実験例３ 動物実験】本実験例は、この発明による減
感作剤を実際に実験動物に投与することにより、この発
明の蛋白質と特定糖質との複合体が花粉症の治療・予防
に効果があることを裏付けるためのものである。
【００９２】
【実験例３−１ 予防効果】１０乃至１２週齢の雌ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス６匹からなる一群に、実施例Ｂ−１の方
法により得た減感作剤を蛋白質の量に換算して１μｇ／
匹の割合で毎週１回、３週間に亙って腹腔内に注射投与
した。減感作剤の最終投与から１週間後に、花粉症を惹
起すべく、抗原として実施例Ａ−２の方法により得た精
製蛋白質１μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウ
ム４ｍｇを含む生理食塩水０．２ｍｌを上記と同様に注
射投与した。そして、抗原投与の直前と抗原投与から１
週間後にマウスの血液を採取し、そこに含まれる当該蛋
白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗体、イムノグロブ
リンＧ抗体及びイムノグロブリンＭ抗体の量を調べた。
【００９３】別途、減感作剤に代えて、実施例Ａ−２の
方法により得た精製蛋白質と平均分子量約２００，００
０ダルトンの精製プルランとを重量比で１：１５の割合
で含む混合物を投与する系を設け、これを上記と同様に
処置して対照とした。なお、当該蛋白質に特異的なイム
ノグロブリンＥ抗体の量は、アイ・モータ等『ライフ・
サイエンシーズ』、第８巻、第１６号、パートＩＩ、第
８１３〜８２０頁（１９６９年）に報告されているＰＣ
Ａ反応により、また、当該蛋白質に特異的なイムノグロ
ブリンＧ抗体とイムノグロブリンＭ抗体の量は、エス・
ヨシタケ等『ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー』、第９２巻、第５号、第１，４１３〜１，４２４頁
（１９８２年）に報告されている酵素免疫吸着法（ＥＩ
Ａ）により測定し、それぞれ、マウス６匹の平均抗体価
で表示した。結果を表５に示す。
【００９４】
【表５】
【００９５】表５に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とプルランとの複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系において
は、減感作に有効なイムノグロブリンＧ抗体及びイムノ
グロブリンＭ抗体が著量産生する一方、イムノグロブリ
ンＥ抗体の産生が実質皆無なまでに抑えられていた。イ
ムノグロブリンＥ抗体は、アナフィラキシーショックを
始めとする望ましくない副作用の主因と言われており、
この発明の減感作剤をマウスに投与することにより、そ
の産生が顕著に抑制されたことは、複合体を含有するこ
の発明の減感作剤が、ヒトを含む哺乳動物における花粉
症の予防に安全且つ効果的に使用し得ることを意味して
いる。
【００９６】
【実験例３−２ 非経口投与による治療効果】１０乃至
１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス６匹からなる一群に、
抗原として、実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質
１μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウム４ｍｇ
を含む生理食塩水０．２ｍｌを毎週１回、３週間に亙っ
て腹腔内に注射投与して花粉症を惹起した。抗原の最終
投与から１週間後に、実施例Ｂ−１の方法により得た減
感作剤を蛋白質量に換算して１００ｎｇ／匹の用量で毎
週１回、３週間に亙って上記と同様に注射投与した。減
感作剤の最終投与から１週間後に、再度、抗原のみを上
記と同様に投与してイムノグロブリンＥ抗体の産生を再
誘導する処置をした。そして、減感作剤の投与直前、減
感作剤の最終投与から１週間後及びイムノグロブリンＥ
抗体の再誘導から１週間後にマウスから採血し、そこに
含まれる当該蛋白質に特異的なイムノグロブリンＥ抗
体、イムノグロブリンＧ抗体及びイムノグロブリンＭ抗
体の量を実験例３−１と同じ方法により調べた。
【００９７】別途、減感作剤に代えて、実施例Ａ−２の
方法により得た精製蛋白質と平均分子量約２００，００
０ダルトンの精製プルランとを重量比で１：１５の割合
で含む混合物を投与する系を設け、これを上記と同様に
処置して対照とした。結果を表６に示す。
【００９８】
【表６】
【００９９】表６に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とプルランとの複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系では、減感
作剤の投与後においても、イムノグロブリンＥ抗体の再
誘導後においても、著量のイムノグロブリンＧ抗体とイ
ムノグロブリンＭ抗体が認められた。イムノグロブリン
Ｅ抗体についてみると、減感作剤の投与後はもとより、
イムノグロブリンＥ抗体の再誘導後においてすら、産生
が実質皆無なまでに抑えられていた。これらの結果は、
複合体を含有するこの発明の減感作剤を非経口投与する
ことにより、ヒトを含む哺乳動物における花粉症を安全
且つ効果的に治療し得ることを意味している。
【０１００】
【実験例３−３ 経口投与による治療効果】１０乃至１
２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹からなる一群に、抗
原として、実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質１
μｇと免疫助成剤としての水酸化アルミニウム４ｍｇを
含む生理食塩水０．２ｍｌを毎週１回、３週間に亙って
腹腔内に注射投与して花粉症を惹起した。抗原の最終投
与から１週間後に、実施例Ｂ−４の方法により得た舌下
剤を粉砕し、蛋白質の量に換算して１００ｎｇ／匹の用
量で毎週１回、３週間に亙って経口投与した。舌下剤の
最終投与から１週間後にマウスから採血し、そこに含ま
れる当該蛋白質に特異的なイムノグロブリンＡ抗体、イ
ムノグロブリンＧ抗体及びイムノグロブリンＥ抗体の量
を調べた。
【０１０１】別途、舌下剤に代えて、実施例Ａ−２の方
法により得た精製蛋白質とサルモネラ菌由来の精製リポ
多糖とを重量比で１：１５の割合で含む固状混合物を経
口投与する系を設け、これを上記と同様に処置して対照
とした。なお、当該蛋白質に特異的なイムノグロブリン
Ａ抗体とイムノグロブリンＧ抗体の量は、アール・メオ
リーニ等『ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ズ』、第６巻、第３５５〜３６２頁（１９７５年）に報
告されているＥＩＡ法により、また、当該蛋白質の特異
的なイムノグロブリンＥ抗体の量は、実験例３−１と同
様の方法により測定し、それぞれ、マウス６匹の平均抗
体価で表示した。結果を表７に示す。
【０１０２】
【表７】
【０１０３】表７に示す結果から明らかなように、対照
と比較すると、予め、当該蛋白質とリポ多糖との複合体
を含有するこの発明の減感作剤を投与した系において
は、イムノグロブリンＡ抗体及びイムノグロブリンＧ抗
体が著量産生する一方、イムノグロブリンＥ抗体の産生
は実質皆無なまでに抑えられていた。このことは、複合
体を含有するこの発明の減感作剤が、経口投与によって
も、ヒトを含む哺乳動物における花粉症を安全且つ効果
的に治療し得ることを示している。
【０１０４】なお、データは示していないものの、斯界
における通常一般の方法により、実施例Ｂ−１乃至Ｂ−
４の方法により得た減感作剤をマウス、ラット及びモル
モットの皮内、皮下、筋肉内若しくは腹腔内に注射投与
するか、あるいは、点眼剤、点鼻剤若しくは口腔内噴霧
剤の形態にして経粘皮投与したところ、以上すべての減
感作剤が重篤な副作用を惹起することなく、花粉症の治
療・予防に有意な効果を発揮した。このことは、当該蛋
白質とプルラン、エルシナンなどの、本質的にマルトト
リオースを反復単位とする糖質との複合体において特に
顕著となり、しかも、この場合、他の糖質との複合体と
比較して、所期の減感作を達成するに要する投与量と投
与期間が一段と低減乃至短縮できることが判明した。
【０１０５】
【実験例３−４ 急性毒性試験】常法により、生後２０
日目のマウスに実施例Ｂ−１乃至Ｂ−４の方法により得
た治療・予防用減感作剤を経口若しくは腹腔内投与し
た。その結果、これら減感作剤は、いずれの投与経路に
よっても１，０００，０００ｎｇ以上のＬＤ５０である
ことが判明した。このことは、当該蛋白質と特定糖質と
の複合体を含有するこの発明の減感作剤が、ヒトを含む
哺乳動物に投与する医薬品に安全に配合使用し得ること
を示している。
【０１０６】
【発明の効果】叙上のように、この発明による蛋白質
は、新規な花粉症原因物質である。この発明の蛋白質
は、ヒトを含む哺乳動物において花粉症を惹起する性質
を有することから、花粉症を診断若しくは治療・予防す
るための減感作剤はもとより、酵素免疫測定や放射免疫
測定による花粉症の診断、さらには、アレルギー症一般
の発症機序を解明する学術研究において広範な用途を有
する。とりわけ、この発明の蛋白質と特定糖質との複合
体は、ヒトを含む哺乳動物に投与すると、減感作に有効
なイムノグロブリン抗体を著量産生する一方、アナフィ
ラキシーショックを含む望ましくない副作用の主因たる
イムノグロブリンＥ抗体を実質的に産生しない性質があ
る。この性質により、この発明による減感作剤を使用し
て花粉症を治療・予防するときには、治療・予防に要す
る抗原の投与量と投与期間を有意に低減乃至短縮できる
こととなる。なお、斯くも有用なる当該蛋白質は、この
発明の製造方法により、スギ花粉を原料に、所望量を比
較的容易に製造することができる。
【０１０７】この発明は、斯くも顕著な効果を奏するも
のであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発
明であるといえる。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年８月４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８４】
【実施例Ｂ−４ 舌下剤】平均分子量約２００，０００
ダルトンの精製エルシナン２ｇを蒸留水４００ｍｌに均
一に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液により溶液の
ｐＨを１０．７に調整後、水溶液のｐＨを１０．０付近
に保ちながら、臭化シアン３ｇを徐々に加え、１時間反
応させた。１Ｎ塩酸により反応物のｐＨを５．０に調整
後、このｐＨを保ちつつ、冷水に対して１０時間透析す
ることにより、活性化エルシナンを含む水溶液を得た。
次いで、この水溶液に実施例Ａ−２の方法により得た精
製蛋白質を２０ｍｇ加え、常温下で２４時間静置して反
応させた。反応終了後、反応物に３倍容のアセトンを加
え、生成した沈澱部を採取し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解し、遠心分離により不溶物を除去
した後、予め０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平
衡化させておいたＣＭ−セファデックスカラムクロマト
グラフィーにかけ、非吸着画分から当該蛋白質とエルシ
ナンとの複合体を含む画分を採取した。その後、常法に
より、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉
砕後、株式会社林原製無水結晶α−マルトース粉末『フ
ァイントース』を均一に混合し、常法により、混合物を
打錠して製品１錠（２００ｍｇ）当たり蛋白質を１００
ｎｇ含む錠剤を得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０５】
【実験例３−４ 急性毒性試験】常法により、生後２０
日目のマウスに実施例Ｂ−１乃至Ｂ−４の方法により得
た治療・予防用減感作剤を経口若しくは腹腔内投与し
た。その結果、これら減感作剤は、いずれの投与経路に
よっても１，０００，０００ｎｇ／ｋｇ以上のＬＤ５０
であることが判明した。このことは、当該蛋白質と特定
糖質との複合体を含有するこの発明の減感作剤が、ヒト
を含む哺乳動物に投与する医薬品に安全に配合使用し得
ることを示している。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する蛋白質。 （１） 分子量 ４４，０００乃至５４，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリ
    アクリルアミドゲル電気泳動） （２） 等電点 ８．５乃至９．２（等電点電気泳動） （３） Ｃ末端アミノ酸配列 −Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
    Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇ
    ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
    ｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓで表わされるＣ末
    端アミノ酸配列を有する。 （４） 糖含量 分子中に、下記の化１に示す一般式で表わされる糖鎖を
    重量で約５乃至２０％含む。ただし、式中、Ｘ、Ｘ′及
    びＸ″はヒドロキシル基又はＦｕｃα１を、また、Ｙ及
    びＹ′はヒドロキシル基又はＧａｌβ１を表わすものと
    する。 【化１】 （５） 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に吸収極大を有する。 （６） 溶剤への溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶である。 （７） 生物作用 花粉症患者の血液から採取したイムノグロブリンＥ抗体
    に結合する。花粉症を惹起する。 （８） 安定性 水溶液（ｐＨ７．２）中、１００℃で１０分間加熱する
    と失活する。水溶液（ｐＨ７．２）中、４℃で１カ月間
    放置しても、実質的に失活しない。
  2. 【請求項２】 スギ花粉に由来する請求項１に記載の蛋
    白質。
  3. 【請求項３】 スギ花粉を水性溶媒中で抽出し、抽出物
    に含まれる請求項１に記載の蛋白質を採取してなる蛋白
    質の製造方法。
  4. 【請求項４】 抽出物中の蛋白質を塩析、透析、濾過、
    濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
    交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
    フィー、電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種
    以上の方法により採取する請求項３に記載の蛋白質の製
    造方法。
  5. 【請求項５】 有効成分として請求項１の蛋白質を含有
    する減感作剤。
  6. 【請求項６】 蛋白質がスギ花粉に由来する請求項５に
    記載の減感作剤。
  7. 【請求項７】 蛋白質に糖質が共有結合している請求項
    ５又は６に記載の減感作剤。
  8. 【請求項８】 糖質が本質的にマルトトリオースを反復
    単位とする請求項７に記載の減感作剤。
  9. 【請求項９】 安定剤として血清アルブミン及び／又は
    びゼラチンを含有する請求項５、６、７又は８に記載の
    減感作剤。
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