MXPA01013458A

MXPA01013458A - Anticuerpos humanizados anti-erbb2 y tratamiento con anticuerpos anti-erbb2.

Info

Publication number: MXPA01013458A
Application number: MXPA01013458A
Authority: MX
Inventors: Camellia W Adams
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2002-07-30
Also published as: EP2112167A2; FR13C0016I1; NO20091792L; HUP0201695A3; JP4283474B2; EP1189641A2; DK1189641T5; PT1189641E; BR0012198A; CA2727172A1; CY2013010I1; DE10084743T1; HK1044888A1; NO2013005I1; CA2376596C; ZA200109786B; AT500848B1; GEP20104998B; RU2270029C2; DE60042648D1

Abstract

La presente solicitud describe los anticuerpos humanizados anti-ErbB2 y los metodos para el tratamiento del cancer con anticuerpos anti-ErbB2, tales como los anticuerpos humanizados anti-ErbB2.

Description

ANTICUERPOS HUMANIZADOS ANTI-ErbB2 Y TRATAMIENTO CON ANTICUERPOS ANTI-ErbB2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los anticuerpos humanizados anti-ErbB2 y a los métodos para el tratamiento del cáncer con los anticuerpos anti-ErbB2, tales como los anticuerpos humanizados anti-ErbB2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia ErbB de tirosina-cinasas receptoras son mediadores importantes del desarrollo celular, la diferenciación y la supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro distintos miembros que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbBl) , HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tiro2). EGFR, codificado por el gen erJbBl, ha sido causalmente implicado en la malignidad humana. En particular, la expresión incrementada de EGFR ha sido observada en cáncer de mama, de vejiga, de pulmón, de cabeza, de cuello y de estómago, así como glioblastomas . La expresión incrementada del receptor de EGFR es a menudo asociada con la producción incrementada del ligando EGFR, el REF: 134821 ? é -¿ ? factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) , por las mismas células tumorales dando como resultado la activación del receptor por una vía estimuladora autócrina. Baselga y Mendelsohn Pharmac . Ther. 64: 127-154 (1994). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR o sus ligandos, TGF-a y EGF, han sido evaluados como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales malignidades. Ver, por ejemplo, Baselga y Mendelsohn, supra; Masui et al. Cáncer Research 44: 1002-1007 (1984); y Wu et al. J. Clin . Invest . 95: 1897-1905 (1995) . El segundo miembro de la familia ErbB, pl85neu, fue identificado originalmente como el producto del gen transformante proveniente de neuroblas omas de ratas químicamente tratadas. La forma activada del proto-oncogen neu resulta de una mutación puntual (valina a ácido glutámico) en la región transmembranal de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de neu es observada en cánceres de mama y de ovario y correlacionan con una pobre prognosis (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); y la Patente de los Estados Unidos No. 4,968,603). A la fecha, no ha sido reportada ninguna mutación puntual análoga a aquella en el proto-oncogen neu para tumores humanos. La sobreexpresión de ErbB2 (frecuentemente pero no uniformemente debido a la amplificación del gen) ha sido también observada JL ft4.*AJM¿.^fc .AriJfr-S en otros carcinomas incluyendo carcinoma del estómago, del endometrio, de las glándulas salivales, del pulmón, del riñon, del colon, de la tiroides, del páncreas, y de la vejiga. Ver entre otros King et al., Science 229 : 974 : (1985); Yokota et al., Lancet : 1: 765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol . Cell Biol . , 6: 955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res . , 3: 21-31 (1988); Cohén et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res . , 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol . Oncol . , 38: 364 (1990); Weiner et al., Cáncer Res . , 50: 421-425 (1990); Kern et al., Cáncer Res . , 50: 5184 (1990); Park et al., Cáncer Res . , 49: 6605 (1989); Zhau et al., Mol . Carcinog. , 3: 354-357 (1990); Aasland et al. Br. J. Cáncer 57: 358-363 (1988); Williams et al. Pathiobiology 59: 46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65: 88-92 (1990) . ErbB2 puede ser sobreexpresado en cáncer de próstata (Gu et al., Cáncer Lett . 99: 185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol . 28: 827-33 (1997); Ross et al. Cáncer 79: 2162-70 (1997); y Sadasivan et al., J". Urol . 150: 126-31 (1993) ) . Los anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos pl85neu de rata y ErbB2 humano han sido también descritos. Drebin y colegas han producido anticuerpos contra el producto del gen neu de rata, pl85neu. Ver, por ei emplo, Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., ?fet . Enzym. 198: 277-290 (1991); y W094/22478,. Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988) reportan que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de pl85neu dan como resultado efectos antitumorales sinérgicos sobre las células NIH-3T3 transformadas con neu, implantadas en ratones desnudos. Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 5,824,311 expedida el 20 de octubre de 1998. Hudziak et al., Mol . Cell . Biol . 9(3): 1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que fueron caracterizados utilizando la línea de células tumorales de cáncer de mama humano SK-BR-3. La proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 después de la exposición a los anticuerpos fue determinada por tinción con violeta de cristal de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este ensayo, se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5 el cual inhibió la proliferación celular en 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular a un grado menor en este ensayo. El anticuerpo 4D5 fue además enlazado para sensibilizar las líneas de células tumorales de mama que sobreexpresan ErbB2 para los efectos citotóxicos de TNF-a. Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos anti-ErbB2 discutidos en Hudziak et al. son además caracterizados en Fendly et al., Cáncer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vi tro 26(3): 59A (1990); Sarup et al. Growth i J,l H ». A i^__.__lr . _!, _..

Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin . Immunol 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol . Cell . Biol . 11(2) 979-986 (1991); Lewis et al., Cáncer Immunol . Immunother. 37 255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994) Vitetta et al. Cáncer Research 54: 5301-5309 (1994) Sliwkowski et al. J. Biol . Chem. 269 (20) : 14661-14665 (1994) Scott et al. J. Biol . Chem. 266: 14300-5 (1991); D ' souza et al. Proc . Nati . Acad. Sci . 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al. Cáncer Research 56: 1457-1465 ) (1996) ; y Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997). Una versión humanizada recombinante del anticuerpo 4D5 anti-ErbB2, murino (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®; Patente de los Estados Unidos No. 5,821,337) es clínicamente activo en pacientes con cánceres de mama metastáticos que sobreexpresan ErbB2 que han recibido extensa terapia previa contra el cáncer (Baselga et al., J. Clin . Oncol . 14: 737-744 (1996) ) . HERCEPTIN" recibió aprobación de comercialización de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) el 25 de septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2. Otros anticuerpos anti-ErbB2 con diversas propiedades han sido descritos en Tagliabue et al. Jnt. ". Cáncer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Cáncer Res . 51: 5361-5369 (1991); ... i ,. i i .? Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (EUA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al. Cáncer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu et al. Int . J. Cáncer 53: 401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cáncer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al. Cáncer Res . 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al. Cáncer Res . 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cáncer Res . 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol . Chem. 267: 15160-15167 (1992); Patente de los Estados Unidos No. 5,783,186; y Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997). La selección de homología ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores de ErbB; ErbB3 (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como Kraus et al. PNAS (EUA) 86: 9193-9197 (1989)) y ErbB4 (Solicitud de Patente Europea No. 599,274; Plowman et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Estos dos receptores muestran expresión incrementada sobre al menos algunas de las líneas celulares de cáncer de mama. Los receptores de ErbB son en general encontrados en diversas combinaciones en células y se piensa que la heterodimerización incrementa la diversidad de las respuestas celulares a una variedad de ligandos de ErbB (Earp et al. Breast Cáncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)).

EGFR es enlazado por seis diferentes ligandos: el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) , la anfirregulina, el factor de crecimiento epidérmico de enlace a la heparina (HB-EGF) , la betacelulina y la epirregulina (Groenen et al., Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Una familia de proteínas herregulinas que resultan del empalme alternativo de un gen simple, son ligandos para ErbB3 y ErbB4. La familia de herregulina incluye las herregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patente de los Estados Unidos No. 5,641,869; y Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); los factores de diferenciación neu (NDFs) , los factores de crecimiento glial (GGFs) ; el receptor de acetilcolina inductor de actividad (ARIA) ; y el factor derivado de neuronas sensoras y motoras (SMDF) . Para una revisión ver Groenen et al., Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec . & Cell . Neurosci . 7: 247-262 (1996) y Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Recientemente fueron identificados tres ligandos de ErbB adicionales; neurregulina 2 (NRG-2) la cual se reporta que se enlaza ya sea a ErbB3 o ErbB4 (Chang et al., Nature 387 509-512 (1997); y Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); neurregulina 3 que se enlaza a ErbB4 (Zhang et al. PNAS (EUA) 94 (18): 9562-7 (1997)); y neurregulina 4 que se enlaza a ErbB4 iiai1*_^ iSái^te»j (Harari et al., Oncogene 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epirregulina también se enlazan a ErbB4. Mientras que EGF y TGFa no se enlazan a ErbB2 , EGF estimula a EGFR y a ErbB2 para formar un heterodímero, el cual activa a EGFR y da como resultado la transfosforilación de ErbB2 en el heterodímero. La dimerización y/o la transfosforilación parecen activar la ErbB2 tirosina-cinasa. Ver Earp et al., supra . De igual modo, cuando ErbB3 es coexpresado con ErbB2 , se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de perturbar este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol . Chem. , 269 (20): 14661-14665 (1994)). Además, la afinidad de ErbB3 por la herregulina (HRG) es incrementada a un estado de mayor afinidad cuando es coexpresado con ErbB2. Ver también, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Na ti . Acad. Sci . EUA 92: 1431-1435 (1995); y Lewis et al., Cáncer Res . , 56: 1457-1465 (1996) con respecto al complejo proteico ErbB2-EÍrbB3. ErbB4 , como ErbB3 , forma un complejo de señalización activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un cáncer en un i ' _± .i j.._i A.í .ib?** -. . humano, en donde el cáncer expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , que comprende la administración a un humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2. Diversas ventajas en el uso de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 para tratar tal cáncer, en oposición a los fármacos dirigidos a EGFR, son contempladas en la presente. En particular, EGFR es altamente expresado en el hígado y en la piel, y esto proporciona un enorme avance para el fármaco activo, donde el fármaco se enlaza a EGFR. Además, la toxicidad a la piel ha sido observada para otros fármacos dirigidos a EGFR tales como el anticuerpo quimérico C225 anti-EGFR y el fármaco de molécula pequeña ZD1839 el cual se enlaza a EGFR. Se anticipa que los anticuerpos que se enlazan a ErbB2 tengan un mejor perfil de seguridad que tales fármacos . Donde el anticuerpo utilizado para terapia en la presente bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB y/o tiene una característica biológica del anticuerpo monoclonal 2C4, son logradas ventajas adicionales. Por ejemplo, mientras que los fármacos dirigidos a EGFR interfieren únicamente con EGFR, los anticuerpos de interés particular en la presente (por ejemplo 2C4, incluyendo las variantes humanizadas y/o maduradas por afinidad, del mismo) interferirán con los heterodímeros EGFR/ErbB2 , ErbB3/ErbB4 y i^tA^má.' -- - - - - - ' "'-'-—'--—-ir f-'-tj ErbB2/ErbB3. Además, los anticuerpos de la presente que se enlazan a ErbB2 y bloquean la activación del ligando de un receptor de ErbB serán complementarios a los fármacos dirigidos a EGFR, donde los fármacos dirigidos a EGFR no son complementarios uno al otro. La invención proporciona además un método de tratamiento del cáncer en un humano, en donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor ErbB2 , que comprende la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación de un receptor ErbB. Además, la presente invención proporciona un método de tratamiento del cáncer independiente de hormonas en un humano, que comprende administrarle al humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza al receptor de ErbB2 , y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB. La invención proporciona además un método de tratamiento de cáncer en un humano, que comprende administrarle al humano cantidades terapéuticamente efectivas de (a) un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el desarrollo de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2 ; y; (b) un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB. . --.,.»* iflt¡Aft La invención también proporciona un método de tratamiento de un cáncer en un humano, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal, que comprende administrarle al humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB2. En modalidades adicionales, la invención proporciona los artículos de fabricación para el uso (entre otras cosas) en los métodos anteriores. Por ejemplo, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 , y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) . La invención pertenece además J a un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer, en donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor de ErbB2.

I«t ? ? H ?- t.. _t^í i También, la invención se refiere a un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer independiente de hormonas. En una modalidad adicional, se proporciona un artículo de fabricación que comprende (a) un primer recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el desarrollo de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB. Un artículo de fabricación adicional es proporcionado, el cual comprende un ' recipiente y una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloque la activación del ligando de un receptor de ErbB, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de colon, cáncer rectal y colorrectal. i_l_* __A¿L.¿~ ?t*..t. 1 •«* La invención proporciona además: un anticuerpo humanizado que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB; una composición que comprende el anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable; y un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo humanizado conjugado con un agente citotóxico. Además, la invención proporciona los ácidos nucleicos aislados que codifican para el anticuerpo humanizado; un vector que comprende el ácido nucleico,- una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector; así como un proceso para la producción del anticuerpo humanizado, que comprende el cultivo de una célula huésped que incluye el ácido nucleico, de modo que el ácido nucleico es expresado y, opcionalmente, que comprende además la recuperación del anticuerpo humanizado del cultivo de célula huésped (por ejemplo del medio de cultivo de la célula huésped) . La invención pertenece además a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se enlaza al ErbB2 conjugado a una o más moléculas de calicheamicina, y el uso de tales conjugados para el tratamiento de cáncer que expresa ErbB2 , por ejemplo, el cáncer que sobreexpresa ErbB2 , en un humano. Preferentemente, el anticuerpo en el conjugado es el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado (y preferentemente huMAb4D5-8 (HERCEPTIN ) ; o el anticuerpo monoclonal 2C4, por ejemplo 2C4 humanizado. El anticuerpo en el inmunoconjugado puede ser un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgG? intacto) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo un Fab, F(ab)2, diacuerpo, etc.).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras ÍA y IB describen el trazado del mapa del epítope de los residuos 22-645 dentro del dominio extracelular (ECD) de ErbB2 (secuencia de aminoácidos incluyendo la secuencia de señal, mostrado en la Figura ÍA; SEQ ID NO. 13) como se determina por el análisis del mutante de truncamiento y mutagénesis dirigida al sitio (Nakamura et al., J. of Virology 61 (10): 6179-6191 (1993); y Renz et al., J". Cell Biol . 125 (6): 1395-1406 (1994)). Los diversos truncamientos de ErbB2-ECD o las mutaciones puntuales fueron preparados a partir del ADNc utilizando la tecnología de reacción en cadena de polimerasa. Los mutantes de ErbB2 fueron expresados como las proteínas de fusión gD en un plásmido de expresión en mamífero. Este plásmido de expresión utiliza el promotor/aumentador del citomegalovirus con la terminación de SV40 y las señales de poliadenilación localizada corriente abajo (3') del ADNc insertado. El ADN plasmídico fue transfectado en células 293. Un día después í _Ár? _Á _£. . fe«^a de la transfección, las células fueron metabólicamente marcadas toda la noche en DMEM con bajo contenido de glucosa, con metionina y libre de cisteína que contenía 1% de suero fetal bovino dializado y 25 µCi de cada uno de 35S-metionina y 35S-cisteína. Los sobrenadantes fueron cosechados y los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 o los anticuerpos control fueron agregados al sobrenadante, e incubados 2 a 4 horas a 4°C. Los complejos fueron precipitados, aplicados a un gel en gradiente de 10 a 20% de Tricine-SDS y sometidos a electroforesis a 100 V. El gel fue sometido a electromanchado sobre una membrana y analizado mediante autorradiografía. Como se muestra en la Figura IB, los anticuerpos anti-ErbB2, 7C2 , 7F3 , 2C4, 7D3 , 3E8, 4D5 , 2H11 y 3H4 se enlazan a diversos epítopes ECD de ErbB2. Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2, 2C4 y 7F3 sobre la activación de rHRGßl de las células MCF7. La Figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición de 2C4 ó 7F3 de la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina. La Figura 2B muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición del rHRGßl?77-24 marcado con 125I, que se enlaza a las células MCF7 por 2C4 o 7F3. La Figura 3 describe la inhibición del rHRGßl?77-244 marcado con 125I, que se enlaza a un panel de líneas de células tumorales humanas por los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2, 2C4 o 7F3. Los controles de anticuerpo monoclonal son anticuerpos monoclonales murinos con concordancia en el isotipo que no bloquean el enlace a rHRG. El enlace de rHRGßl?77-2 marcado con 125I no específico, fue determinado a partir de incubaciones paralelas realizadas en presencia de rHRGßl 100 nM. Valores para el enlace de rHRGßl177.44 marcado con 125I no específico fueron menores de 1% del total para todas las líneas celulares probadas. Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre la proliferación de las células MDA-MB-175 (Figura 4A) y SK-BR-3 (Figura 4B) . Las células MDA-MB-175 y SK-BR-3 fueron sembradas en placas de 96 pozos y se dejaron adherirse por 2 horas. El experimento se llevó a cabo en medio que contenía 1% de suero. Los anticuerpos anti-ErbB2 o el medio solo fueron agregados, y las células fueron incubadas por 2 horas a 37°C. Subsecuentemente se agregaron rHRGßl (1 nM ) o medio solo y las células fueron incubadas por 4 días . Las monocapas fueron lavadas y teñidas/fijadas con 0.5% de cristal violeta. Para determinar la proliferación celular se midió la absorbancia a 540 nm. Las Figuras 5A y 5B muestran el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4, el anticuerpo HERCEPTIN® o un anticuerpo anti-EGFR sobre la asociación dependiente de la herregulina (HRG) de ErbB2 con ErbB3 en células MCF7 que expresan niveles bajos/normales de ErbB2 (Figura 5A) y las células SK-BR-3 que expresan altos niveles de ErbB2 (Figura 5B) ; ver Ejemplo 2 siguiente. Las Figuras 6A y 6B comparan las actividades del anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 (mu 2C4) y un fragmento de Fab 2C4 quimérico. La Figura 6A muestra la inhibición de 125I-HRG que se enlaza a las células MCF7 por el Fab 2C4 quimérico o el anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4. Las células MCF7 fueron sembradas en placas de 24 pozos (1 x 105 células/pozo) y desarrolladas hasta aproximadamente 85% de confluencia por dos días. Los experimentos de enlace fueron conducidos como se describe en Lewis et al . Cáncer Research 56: 1457-1465 (1996). La Figura 6B describe la inhibición de la activación de rHRGßl de la fosforilación de la tirosina pl80 en células MCF7, realizada como se describe en Lewis et al. Cáncer Research 56: 1457-1465 (1996). Las Figuras 7A y 7B describen alineamientos de las secuencias de aminoácidos de los dominios ligero variable (VL) (Figura 7A) y pesado variable (VH) (Figura 7B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID NOs.: 1 y 2, respectivamente) ; los dominios V y VH de la versión 574 de 2C4 humanizado (SEQ ID NOs.: 3 y 4, respectivamente), y las estructuras de consenso VL y VH humanas (hum ?l , el subgrupo I de kappa ligera; humIII, el subgrupo pesado III) (SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente) . Los asteriscos identifican las diferencias entre la versión 574 de 2C4 humanizado y el anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre la versión 574 de 2C4 humanizado y la estructura humana. Las Regiones de Determinación de la Complementariedad (CDRs) están en corchetes. Las Figuras 8A a C muestran el enlace de Fab 2C4 quimérico (Fab.vl) y diversas variantes de 2C4 humanizadas para el dominio extracelular de ErbB2 (ECD) como se determinó mediante ELISA en el Ejemplo 3. La Figura 9 es un diagrama de barras de los dominios de VL y VH del anticuerpo monoclonal 2C4 con la cadena principal CDR blanca marcada (Ll, L2 , L3 , Hl, H2 , H3) . Las cadenas laterales VH evaluadas mediante la mutagénesis durante la humanización (ver Ejemplo 3, Tabla 2) son también mostradas. La Figura 10 describe el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 o HERCEPTIN® sobre la activación mediada por EGF, TGF-a o HRG de la proteína-cinasa activada por mitógeno (MAPK) . La Figura 11 es un diagrama de barras que muestra el efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 (solo o en combinaciones) sobre los xenoinjertos de adenocarcinoma de pulmón Calu3 (sobreexpresor de 3-ErbB2). Nota: el tratamiento fue detenido en el día 24.

La Figura 12 describe el efecto del anticuerpo monoclonal humanizado recombinante 2C4 (rhuMAb 2C4) o HERCEPTIN® sobre el desarrollo de las células MDA-175 como se evalúa en un ensayo de Azul Alamar. 5 La Figura 13 muestra la eficacia de rhuMAb 2C4 contra los xenoinjertos de MCF7.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS 10 I. Definiciones Un "receptor de ErbB" es una tirosina-cinasa proteína receptora que pertenece a la familia de receptores de ErbB e incluye los receptores de EGFR, ErbB2 , ErbB3 y 15 ErbB4 y otros miembros de esta familia que van a ser identificados en el futuro. El receptor de ErbB comprenderá en general un dominio extracelular, el cual puede enlazarse a un ligando de ErbB; un dominio transmembranal lipofílico; un dominio de tirosina-cinasa intracelular conservado; y un 20 dominio de señalización carboxilo-terminal que alberga varios residuos de tirosina que pueden ser fosforilados. El receptor de ErbB puede ser un receptor ErbB de "secuencia nativa" o una "variante de secuencia de aminoácidos" del mismo. Preferentemente, el receptor de ErbB es el receptor 25 de ErbB humano de secuencia nativa. -»^a^aaiaatf ^aBi?agaiafe..i ? .? .? A. ± .S SL** Í Los términos "ErbBl", "receptor de factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" son utilizados intercambiablemente en la presente si se refieren a este EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann . Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), incluyendo las formas mutantes de origen natural del mismo (por ejemplo, un EGFR mutante de supresión como en Humphrey et al. PNAS (EUA) 87: 4207-4211 (1990) ) . erbBl se refiere al gen que codifica para el producto de la proteína EGFR. Las expresiones "ErbB2" y "HER2" son utilizadas intercambiablemente en la presente y se refieren a la proteína humana HER2 descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (EUA) 82: 6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (número de acceso de Genebank X03363) . El término "erbB2" se refiere al gen que codifica para ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica para pl85neu de rata. ErbB2 preferido es ErbB2 humano de secuencia nativa. "ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como en Kraus et al. PNAS (EUA) 86: 9193-9197 (1989) . Los términos "ErbB4" y "HER4" se refieren en la presente al polipéptido receptor como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea No. 599,274; Plowman et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 1746-1750 á____u_i___*A*é •***-•* * * -*---»----»-«-. - _-. ---... - (1993); y Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), incluyendo isoformas del mismo, por ejemplo, como se describe en el documento W099/19488, publicado el 22 de abril de 1999. Por "ligando de ErbB" se entiende un polipéptido que se enlaza a y/o activa un receptor de ErbB. El ligando de ErbB de interés particular en la presente es un ligando ErbB humano de secuencia nativa tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol . Chem. 247: 7612-7621 (1972)); el factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082 (1984) ) ; anfirregulina también conocida como schwanoma o factor de crecimiento autócrino de queratinocitos (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257-260 (1990); y Cook et al. Mol . Cell . Biol . 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993); y Sasada et al. Biochem . Biphys . Res . Commun . 190: 1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de enlace a la heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol . Chem . 270: 7495-7500 (1995); y Komurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997) ) ; una herregulina (ver más adelante) ; neurregulina-2 (?RG-2) (Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); neurregulina-3 (?RG-3) (Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan et al.

J. Biol . Chem. 272 (6): 3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB que se enlazan a EGFR incluyen EGF, TGF-a, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF y epirregulina . Los ligandos de ErbB que se enlazan a ErbB3 incluyen 5 herregulinas. Los ligandos de ErbB capaces de enlazarse a ErbB4 incluyen betacelulína, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y herregulinas. "Herregulina" (HRG) cuando se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido codificado por el 10 producto del gen de la herregulina como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,641,869 o Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Los ejemplos de herregulinas incluyen la herregulina-a, herregulina-ßl, herregulina-ß2 y herregulina-ß3 (Holmes et al., Science, 256: 15 1205-1210 (1992) ; y Patente de los Estados Unidos ?o. 5,641,869); el factor de diferenciación neu (?DF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls 'et al. Cell 72: 801- 815 (1993)); factores de crecimiento glial (GGFs) (Marchionni 20 et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoras y motoras (SMDF) (Ho et al. J". Biol . Chem. 270: 14523-14532 (1995)); ?-herregulina (Schaefer et al. Oncogrene 15: 1385-1394 (1997)). El término incluye los fragmentos biológicamente activos y/o las variantes de las 25 secuencias de aminoácidos de un polipéptido HRG de secuencia rw?ffltt ilÍlWiif ' r-fil . Í.* ~ ?.* *A^. nativa, tal como un fragmento del dominio similar a EGF del mismo (por ejemplo HRGßli77-24 ) . Un "hetero-oligómero ErbB" en la presente es un oligómero no covalentemente asociado que comprende al menos dos diferentes receptores de ErbB. Tales complejos se pueden formar, cuando una célula que expresa dos o más receptores de ErbB es expuesta a un ligando de ErbB y puede ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizada por SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol . Chem. , 269 (20): 14661-14665 (1994) , por ejemplo. Los ejemplos de tales hetero-oligómeros de ErbB incluyen los complejos EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 y ErbB3-ErbB4. Además, el hetero-oligómero ErbB puede comprender dos o más receptores de ErbB2 combinados con un receptor diferente de ErbB, tal como ErbB3 , ErbB4 o EGFR. Otras proteínas, tales como la subunidad del receptor de citocina (por ejemplo gpl30) pueden ser incluidos en el hetero-oligómero . Por "activación del ligando de un receptor de ErbB" se entiende la transducción de la señal (por ejemplo aquella provocada por un dominio de cinasa intracelular de un receptor de ErbB de fosforilación de residuos de tirosina en el receptor de ErbB o un polipéptido sustrato) mediado por el ligando de ErbB que se enlaza al hetero-oligómero ErbB que comprende el receptor ErbB de interés. En general, esto involucrará el enlace de un ligando ErbB a un hetero-oligómero ErbB el cual activa un dominio de cinasa de uno o más de los receptores de ErbB en el hetero-oligómero y con esto da como resultado la fosforilación de los residuos de tirosina en uno o más de los receptores de ErbB y/o la fosforilación de los residuos de tirosina en uno o varios polipéptidos sustrato adicionales. La activación del receptor ErbB puede ser cuantificada utilizando diversos ensayos de fosforilación de tirosina. Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo el receptor de ErbB o el ligando de ErbB) derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia nativa pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producidos por medios recombinantes o sintéticos. De este modo, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano de origen natural, el polipéptido murino, o el polipéptido proveniente de cualquier otra especie de mamífero. El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a los polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierto grado de un polipéptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente 70% de homología con al menos un dominio de enlace al receptor de un ligando ErbB nativo o con al menos un ligando que se enlaza ..i. ..t i al dominio de un receptor de ErbB nativo, y preferentemente, éstos serán al menos aproximadamente 80%, más preferentemente al menos aproximadamente 90% homólogos con tal receptor o dominios de enlace al ligando. Las variantes en secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones, y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. "Homología" es definida como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticas después del alineamiento de las secuencias y la introducción de espacios vacíos, si es necesario, para lograr la máxima homología porcentual . Los métodos y programas de computadora para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Un programa de computadora de este tipo es "Align 2", inventado por Genentech, Inc., el cual fue presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos en Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991. El término "anticuerpo" en la presente es utilizado en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y los fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando éstos muestren la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante simple sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que éstos pueden ser sintetizados no contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como es obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que requiera la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método del hibridoma primeramente descrito por Kohier et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de AD? recombinante (ver por ejemplo la Patente de los Estados Unidos ?o. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden también ser aislados de genotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J". Mol . Biol . , 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie, o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando éstos muestren la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA, 81: 6851-6855 (1984)) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen los anticuerpos "primatizados" que comprenden las secuencias de enlace al antígeno, de dominio variable, derivadas de un primate no humano (por ejemplo el Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias humanas de región constante. . - <* . » i «. ¡ Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región variable o de enlace al antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir del o de los fragmentos de anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de enlace al antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 , y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen enlace a Clq; la citotoxicidad dependiente del complemento; el enlace al receptor de Fc; la citotoxicidad mediada por células, dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; i .__ _á ._.,i-_ií.?.i¿¿~*~t. subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B, BCR), etc. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a diferentes "clases". Existen cinco clases mayores de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden ser divididos en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. "Citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo, células asesinas Naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetivo, y subsecuentemente provocan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para la mediación de ADCC, las células NK, expresan Fc?RIII únicamente, mientras que los monocitos expresan Fc?RI , Fc?RII y Fc?RIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas es resumida en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9: 457-92 (1991) . Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede ser realizado un ensayo de ADCC in vi tro , tal como aquél descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,500,362 ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Asesinas Naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquél descrito en Clynes et al. PNAS (EUA) 95: 652-656 (1998). "Las células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos Fc?RIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que son mediadores de ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (?K) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con PBMCs y células ?K que ' son las preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo de sangre o de PBMCs como se describe en la presente. Los términos "receptor de Fc" o "FcR" son utilizados para describir un receptor que se enlaza a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano, de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno Í? -fa.-.-» «>.* «s».~ que se enlaza a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases Fc?RI , Fc?RII y Fc?RIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB (un "receptor de inhibición"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Fc?RIIA receptor de activación contiene una porción de activación basada en la tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. La inhibición del receptor Fc?RIIB contiene una porción de inhibición basada en la tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Ver revisión M. En Daéron, Annu . Rev. Immunol . 15: 203-234 (1997)). Los FcRs son revisados en Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9 : 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J". Lab . Clin . Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcrS, incluyendo aquellos que van a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de las IgGs maternas al feto (Guyer et al., J". Immunmol . 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . 24: 249 (1994)). . ¿ , ,é JL La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la habilidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La vía de activación del complemento es iniciada por el enlace del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) formado en complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede ser realizado un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202: 163 (1996). Los "anticuerpos nativos" son usualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestos de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios, regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V) y un dominio constante en el otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácidos particulares se cree que forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos, y son utilizados en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no está uniformemente distribuida a todo lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Ésta se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables, ambas en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las regiones estructurales (FRs) . Los dominios variables de las cadenas nativas pesadas y ligeras comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando en gran medida una configuración de lámina ß, conectada' por tres regiones intervariables, que forman rizos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas unidas en estrecha proximidad por los FRs y, con las regiones hipervariables provenientes de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Í__k_ L __. ?? ? . t_^_ ,_.í... ..?_____m_? .„ • -- - -«——».-«».- - <* = 1 --» —-"- **•* ' '*"*"« Immunological Interest, 5a Edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo, que son responsables del enlace al antígeno. La región hipervariable comprende en general los residuos de aminoácidos de una "región de determinación de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos provenientes de un "rizo hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987)). La "Región Estructural" o los residuos "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervarible como se definen en la presente. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de enlace al antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de enlace al antígeno simple, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un anticuerpo F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace al antígeno y es todavía capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento al antígeno completo y de enlace al antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, apretada. Es en esta configuración en que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace al antígeno sobre la superficie ' del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace al antígeno al anticuerpo. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la habilidad para reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una más baja afinidad que el sitio de enlace completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en 5 el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo o más cisteínas provenientes de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab ' en el cual el o los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol 10 libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab ' que tenían cisteína de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo son también conocidos . 15 Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos provenientes de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (?) con base en' las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. 20 Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los 25 dominios VH y VL, que hace posible que scFv forme la *H***á*a***l*??t**m*>'t< . > . . __ ____________ . . ^fcm. ...__. i .1 * estructura deseada para el enlace al antígeno. Para una revisión de scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994) . Los 5 fragmentos de scFv del anticuerpo anti-ErbB2 son descritos en el documento W093/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5,571,894; y Patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos pequeños de anticuerpo con dos sitios de enlace al antígeno, 10 cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son 15 forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, y crear dos sitios de enlace al antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente por ejemplo en la Patente Europea EP 404,097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 6444-6448 20 (1993) . Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados 25 son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en el -. ~ . _-?¿smáH__?_t_p____________ .. i.j. ^-A.faA^. cual son reemplazados los residuos provenientes de una región hipervariable del recipiente, por residuos provenientes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones son realizadas para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos, o sustancialmente todos los rizos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante Fc de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332 : 323 -329 (1988) ; y Presta, Curr. Op. Struct . Biol. 2 : 593 -596 (1992) .

Los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 de la Patente de los Estados Unidos No. 5,821,337 expresamente incorporada por referencia en la presente; los anticuerpos 520C9 humanizado (W093/21319) y 2C4 humanizado, como se describe más adelante en la presente. Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo, como es determinado por el método de Lowri , y más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomasie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente.

Ordinariamente, no obstante, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación. Un anticuerpo "que se enlaza" a un antígeno de interés, por ejemplo el antígeno ErbB2 , es uno capaz de enlazarse a ese antígeno con suficiente afinidad tal que el anticuerpo es útil como un agente terapéutico en la dirección a una célula que expresa el antígeno. Donde el anticuerpo es uno que se enlaza a ErbB2 , éste se enlazará usualmente y de manera preferida a ErbB2 , en oposición a otros receptores de ErbB, y puede ser uno que no reacciona cruzadamente de manera significativa con otras proteínas tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En tales modalidades, el grado de enlace al anticuerpo a estas proteínas no ErbB2 (por ejemplo, el enlace a la superficie celular al receptor endógeno) será menor del 10% como se determina por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o la radioinmunoprecipitación (RÍA) . Algunas veces, el anticuerpo anti-ErbB2 no reaccionará significativamente de manera cruzada con la proteína neu de rata, por ejemplo, como se describe en Schecter et al., Nature 312: 513 (1984) y Drebin et al., Nature 312: 545-548 (1984) . Un anticuerpo que "bloquea" la activación del ligando de un receptor de ErbB es uno que reduce o previene tal activación como se definió anteriormente en la presente, en donde el anticuerpo es capaz de bloquear la activación del ligando del receptor de ErbB sustancialmente de manera más efectiva que el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo aproximadamente de manera tan efectiva como los anticuerpos monoclonales 7F3 o 2C4 o los fragmentos Fab de los mismos, y preferentemente aproximadamente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal 2C4 o un fragmento Fab del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB puede ser uno que sea aproximadamente 50-100% más efectivo que 4D5 al bloquear la formación de un hetero-oligómero de ErbB. El bloqueo de la activación del ligando de un receptor de ErbB puede ocurrir por cualquier medio, por ejemplo mediante la interferencia con: el enlace del ligando a un receptor de ErbB, la formación del complejo con ErbB, la actividad de la tirosina-cinasa de un receptor de ErbB en un complejo de ErbB y/o la fosforilación del o de los residuos de tirosina-cinasa en o por un receptor de ErbB. Los ejemplos de anticuerpos que bloquean la activación del ligando de un receptor de ErbB incluyen los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (los cuales bloquean la activación de HRG de los hetero-oligómeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4 ; y la activación de EGF, TGF-a, anfirregulina, HB-EGF y/o epirregulina de un hetero-oligómero EGFR/ErbB2) ; y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997) ) , que bloquean el enlace de EGF y NDF a las células T47D que expresan EGFR, ErbB2 , ErbB3 y ErbB4. i A e ii. A* é.- isak&? *.* 9 $te,&- .*¿.- Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado, tal como el anticuerpo monoclonal designado 2C4, es uno que posee una o más características biológicas de ese anticuerpo que lo 5 distinguen de otros anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno (por ejemplo ErbB2) . Por ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de 2C4 puede bloquear la activación de HRG de un hetero-oligómero de ErbB que comprende ErbB2 y ErbB3 o ErbB4 ; bloquear la activación de 10 EGF, TGF-a, HB-EGF, epirregulina y/o anfirregulina de un receptor de ErbB que comprende EGFR y ErbB2 ; bloquear la activación mediada por EGF, TGF-a y/o HRG de MAPK; y/o enlazarse al mismo epítope en el dominio extracelular de ErbB2 que aquel enlazado por 2C4 (por ejemplo que bloquea el 15 enlace del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2) . A no ser que se indique de otro modo, la expresión "anticuerpo monoclonal 2C4" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de enlace al antígeno de, o derivados de, el anticuerpo murino 2C4 de los Ejemplos siguientes. Por 20 ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C4 puede ser el anticuerpo murino monoclonal 2C4 muríno o una variante del mismo, tal como el anticuerpo humanizado 2C4, que posee los residuos de aminoácidos que se enlazan al antígeno, del anticuerpo monoclonal murino 2C4. Los ejemplos de anticuerpos 2C4 25 humanizados son proporcionados en el Ejemplo 3 siguiente. A ^^3¡¿aMi^Ateafea»aMiateJ-..t.?i,4j * í-..n?^í^J?M__Ja. no ser que se indique de otro modo, la expresión "rhuMAb 2C4" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias ligera variable (VL) y pesada variable (VH) de las SEQ ID NOs. 3 y 4, respectivamente, fusionada a las secuencias de región constante de IgGl ligera y pesada no humana (alotipo no A) opcionalmente expresada por una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) . A no ser que se indique de otro modo, el término "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de enlace al antígeno de, o derivados de, el anticuerpo murino 4D5 (ATCC CRL 10463) . Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser el anticuerpo monoclonal murino 4D5 o una variante del mismo, tal como un 4D5 humanizado, que posee residuos de enlace al antígeno del anticuerpo monoclonal murino 4D5. Los anticuerpos 4D5 humanizados, ejemplares incluyen huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como en la Patente de los Estados Unidos No. 5,821,337, con huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) que es un anticuerpo 4D5 humanizado, preferido. •Un "agente inhibitorio de crecimiento" cuando se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el desarrollo de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa ErbB ya sea in vitro o in vivo . De este modo, el agente inhibitorio del A**A i- crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan ErbB en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del desarrollo incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un 5 sitio diferente de la fase S) , tales como los agentes que inducen la detención en Gl y la detención en la fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen los vinca per vinca (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores topo II tales como doxorrubicina, epirrubicina, 10 daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se dispersan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como el tamoxifeno, prednisona, decarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. La 15 información adicional puede ser encontrada en The Molecular Basi s of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Regulación del ciclo celular, oncogenes, y fármacos antineoplásicos" por Murakami et al. (WB Saunders : Filadelfia, 1995), especialmente p. 13. 20 Los ejemplos de anticuerpos "inhibidores del desarrollo o crecimiento" son aquellos que se enlazan a ErbB2 e inhiben el desarrollo de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. Los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento, preferidos inhiben el desarrollo de las 25 células de tumor de mama SK-BR-3 en cultivo celular, por más de 20%, y preferentemente más de 50% (por ejemplo de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a cualquier concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml, donde la inhibición del crecimiento es determinada seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (ver Patente de los Estados Unidos No. 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997) . El ensayo de inhibición del crecimiento de células SK-BR-3 es descrito con más detalle en esa patente y más adelante en la presente. El anticuerpo inhibidor del crecimiento, preferido es el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo 4D5 humanizado. Un anticuerpo que "induce muerte celular" es uno que provoca que una célula viable se vuelva no viable. La célula es en general una que expresa el receptor de ErbB2 , especialmente donde la célula sobreexpresa el receptor de ErbB2. Preferentemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo una célula de mama, de ovario, de estómago, endometpal, de glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, de tiroides, pancreática o de vejiga. In vi tro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vi tro puede ser determinada en ausencia del complemento y de células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células, dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del t.,. JAJ 1-complemento (CDC) . De este modo, el ensayo para la muerte celular puede ser realizado utilizando el suero inactivado por calor (por ejemplo en ausencia del complemento) o en ausencia de las células efectoras inmunes . Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de la actividad membranal como es evaluada por la captación del yoduro de propidio (Pl) , azul de tripan (ver Moore et al. Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) o 7AAD puede ser evaluada con relación a las células no tratadas. Los anticuerpos que inducen la muerte celular, preferidos son aquellos que inducen la captación de Pl en el ensayo de captación de Pl en células BT474 (ver más adelante) . Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada como se determina por el enlace de la anexina V, la fragmentación del ADN, el encogimiento celular, la dilatación del retículo endoplásmico, la fragmentación celular, y/o la formación de vesículas membranales (llamados cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexpresa el receptor de ErbB2. Preferentemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo una célula de mama, de ovario, de estómago, endometrial, de glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, de tiroides, pancreática o de vejiga. In vi tro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. Son disponibles diversos métodos para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis, por ejemplo, la translocación de la fosfatidin- serina (PS) puede ser medida mediante el enlace de anexina; la fragmentación del ADN puede ser evaluada a través de la 5 escalera de ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN puede ser evaluada mediante cualquier incremento en las células hipodiploides . Preferentemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es uno que da como resultado aproximadamente 2 a 50 veces, 10 preferentemente aproximadamente 5 a 50 veces, y lo más preferentemente aproximadamente 10 a 50 veces inducción del enlace de anexina con relación a la célula no tratada, en un ensayo de enlace a la anexina utilizando las células BT474 (ver más adelante) . Algunas veces el anticuerpo pro- 15 apoptótico será uno que además bloquee la activación del ligando ErbB de un receptor de ErbB (por ejemplo el anticuerpo 7F3) ; por ejemplo el anticuerpo comparte una característica biológica con un anticuerpo monoclonal 2C4. En otras situaciones, el anticuerpo es uno que no bloquea 20 significativamente la activación del ligando ErbB de un receptor de ErbB (por ejemplo 7C2) . Además, el anticuerpo puede ser uno como 7C2 el cual, mientras que induce la apoptosis, no induce una reducción grande en el porcentaje de células en la fase S (por ejemplo uno que induce únicamente aproximadamente una reducción de 0-10% en el porcentaje de estas células con relación al control) . El "epítope 2C4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlaza al anticuerpo 2C4. Con el fin de seleccionar los anticuerpos que se enlazan al epítope 2C4, puede ser realizado un ensayo rutinario de bloqueo cruzado tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Alternativamente, el trazado del mapa del epítope puede ser realizado para evaluar si el anticuerpo se enlaza al epítope 2C4 de ErbB2 (por ejemplo cualquiera de uno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 584 de ErbB2 , inclusive; ver Figuras 1A-B) . El "epítope 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la cual se enlaza el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) . Este epítope está cercano al dominio transmembranal de ErbB2. Para seleccionar los anticuerpos que se enlazan al epítope 4D5, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Alternativamente, el trazado del mapa del epítope puede ser realizado para evaluar si el anticuerpo se enlaza al epítope 4D5 de ErbB2 (por ejemplo cualquiera de uno o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 529 hasta aproximadamente el residuo 625, inclusive; ver Figuras 1A-B) . El "epítope 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlaza el anticuerpo 3H4. 5 Este epítope incluye residuos de aproximadamente 541 a aproximadamente 599, inclusive, en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de ErbB2 ; ver Figuras 1A-B. El "epítope 7C2/7F3" es la región en el extremo N 10 del dominio extracelular de ErbB2 al cual se enlazan los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositados con la ATCC, ver más adelante) . Para seleccionar los anticuerpos que se enlazan al epítope 7C2/7F3, se puede realizar un ensayo rutinario de bloqueo cruzado tal como aquel descrito en 15 Antibodi es, A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Alternativamente, el trazado del mapa del epítope puede ser realizado para establecer si el anticuerpo se enlaza al epítope 7C2/7F3 en ErbB2 (por ejemplo uno o más de los residuos en la región de 20 aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 53 de ErbB2; ver Figuras 1A-B) . "Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el 25 desorden, así como aquellos en los cuales el desorden va a ser prevenido. Por lo tanto, el mamífero que va a ser tratado en la presente puede haber sido diagnosticado como poseedor del desorden o puede estar predispuesto o susceptible al desorden. 5 "Mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, mascotas deportivas, o animales de mascota, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, 10 el mamífero es un humano. Un "desorden" es cualquier condición que pudiera beneficiarse del tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB2. Éste incluye los desórdenes o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen 15 al mamífero al desorden en cuestión. Los ejemplos no limitantes de desórdenes que van a ser tratados en la presente incluyen los tumores benignos y malignos; leucemias y malignidades linfoides; desórdenes neuronales, guales, astrocitales, hipotalámicos y otros desórdenes glandulares, 20 macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocólicos; y desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco, efectiva para tratar una enfermedad o desorden en un mamífero. En el caso del 25 cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco .?^á.^^íáUm?&íMil?t...kJ. ? ? A. ?_^__?i._. J. ?_t?U_.^ *"** puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (por ejemplo, retardar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de las células cancerosas dentro de los órganos periféricos; inhibir 5 (por ejemplo retardar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el desarrollo del tumor; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Al grado en que el fármaco puede prevenir el desarrollo y/o matar las células 10 cancerosas existentes, éste puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia puede, por ejemplo, ser medida mediante la evaluación del tiempo para la progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación de la velocidad de respuesta (RR) . 15 Los términos "cáncer" y "cancerosos" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos, que está típicamente caracterizada por el desarrollo celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia 20 o malignidades linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de células escamosas (por ejemplo el cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer pulmonar, incluyendo el cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del 25 pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer hepático, cáncer anal, cáncer del pene, así como cáncer de la cabeza y del cuello. Un "cáncer que expresa ErbB" es uno que comprende células que tienen la proteína ErbB presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa ErbB2" es uno que produce suficientes niveles de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, tal que un anticuerpo anti-ErbB2 puede enlazarse a éste y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Un cáncer "caracterizado por activación excesiva" de un receptor de ErbB es uno en el cual el grado de activación del receptor ErbB en las células cancerosas excede significativamente el nivel de activación de ese receptor en células no cancerosas del mismo tipo tisular. Tal activación excesiva puede resultar de la sobreexpresión del receptor de ErbB y/o mayor que los niveles normales de un ligando de ErbB disponible para activar el receptor de ErbB en las células cancerosas. Tal activación excesiva puede provocar y/o ser provocada por el estado maligno de una célula cancerosa. En a__ . ^..i _í.__?. ?.M^ ..í . ______ * ? L.-algunas modalidades, el cáncer será sujeto a un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si la amplificación y/o la sobreexpresión de un receptor de ErbB está ocurriendo, lo cual da como resultado tal activación excesiva del receptor de ErbB. Alternativamente, o adicionalmente, el cáncer puede ser sujeto a un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si está ocurriendo la amplificación y/o la sobreexpresión de un ligando ErbB en el cáncer, se atribuye a la activación excesiva del receptor. En un subgrupo de tales cánceres, la activación excesiva del receptor puede resultar de una vía estimuladora autócrina. En una vía estimuladora "autócrina", la autoestimulación ocurre en virtud de la célula cancerosa que produce un ligando ErbB y su receptor ErbB cognado. Por ejemplo, el cáncer puede expresar o sobreexpresar EGFR y también expresar o sobreexpresar un ligando EGFR (por ejemplo EGF, TGF-a, o HB-EGF) . En otra modalidad, el cáncer puede expresar o sobreexpresar ErbB2 y también expresar o sobreexpresar una herregulina (por ejemplo ?-HRG) . Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor ErbB es uno que tiene niveles significativamente altos de un receptor ErbB, tal como ErbB2 , en la superficie celular del mismo, comparado a una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. Tal sobreexpresión puede ser provocada por la amplificación del gen o por transcripción o traducción incrementadas. La sobreexpresión del receptor de ErbB puede ser determinada en un ensayo de diagnóstico o de pronóstico mediante la evaluación de los niveles incrementados de la proteína ErbB presente sobre la superficie de la célula (por ejemplo vía un ensayo de inmunohistoquímica; IHC) . Alternativamente o adicionalmente, se pueden medir los niveles del ácido nucleico que codifica para ErbB en la célula, por ejemplo vía la hibridación fluorescente in si tu (FISH; ver W098/45479 publicada en octubre de 1998) , manchado de southern, o las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , tales como la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . Se puede también estudiar la sobreexpresión del receptor de ErbB mediante la medición del antígeno disperso (por ejemplo, el dominio extracelular de ErbB) en un fluido biológico tal como suero (ver, por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; Patente de los Estados Unidos No. 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. I munol . Methods 132: 73-80 (1990)). Además de los ensayos anteriores, son disponibles diversos ensayos in vivo para el experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden exponer las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo el cual está opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y el enlace del anticuerpo a las células en el paciente puede también ser evaluado, por ejemplo mediante exploración externa para la radioactividad o mediante análisis de una biopsia tomada previamente de un paciente expuesto al anticuerpo. De manera contraria, un cáncer que "no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor de ErbB2 " es uno que, en un ensayo de diagnóstico, no expresa niveles más altos de los normales del receptor de ErbB2 en comparación a una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. Un cáncer que "sobreexpresa" un ligando ErbB es uno que produce niveles significativamente más altos de ese ligando en comparación a una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. Tal sobreexpresión puede ser provocada por la amplificación del gen o por transcripción o traducción incrementadas. La sobreexpresión del ligando ErbB puede ser determinada diagnósticamente mediante la evaluación de los niveles del ligando (o el ácido nucleico que lo codifica) en el paciente, en una biopsia tumoral 'o mediante diversos ensayos de diagnóstico tales como IHC, FISH, manchado de southern, PCR o ensayos in vivo descritos anteriormente. Un cáncer "independiente de hormonas" es uno en el cual la proliferación del mismo no es dependiente de la presencia de una hormona que se enlaza a un receptor expresado por las células en el cáncer. Tales cánceres no sufren regresión clínica después de la administración de las estrategias farmacológicas o quirúrgicas que reducen la concentración hormonal en o cerca del tumor. Los ejemplos de cánceres independientes de hormona incluyen el cáncer de próstata independiente de andrógeno, el cáncer de mama 5 independiente de estrógeno, el cáncer endometrial y el cáncer de ovario. Tales cánceres pueden comenzar como tumores dependientes de hormonas y progresar desde una etapa sensible a las hormonas hasta un tumor refractario a las hormonas después de la terapia anti-tumoral. 10 El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, 15 Sm153, Bi212, P32, e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. 20 Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXANMR) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; 25 aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, 5 colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novenbicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos 10 tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofílina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo- L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, 15 idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metrotexato y 5- 20 fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, tpmetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercatopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, 25 didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostañolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido 5 frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; 10 mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; 15 mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucil ; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; 20 metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT- 11; RFS2000 inhibidor 25 de topoisomerasa; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También incluidos en esta definición están los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como los anti-estrógenos incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4 (5) -imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Como se utiliza en la presente, el término "fármaco dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se enlaza a EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Los ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se enlazan a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se enlazan a EGFR incluyen MAb579 (ATCC CRL HB 8506) , MAb 455 (ATCC CRL HB8507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508) , MAb528 (ATCC CRL 8509) (ver, Patente de los Estados Unidos No. 4,943,533, Mendelsohn et al . ) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reconformado (H225) (ver, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se enlazan a EGFR mutante del tipo II (Patente de los Estados Unidos No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se enlazan a EGFR como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,891,996; y anticuerpos humanos que se enlazan a EGFR (ver WO98/50433, Abgenix) . El anticuerpo anti-EGFR puede ser conjugado con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (ver, por ejemplo, EP659,439A2, Merck Patent GMBH). Los ejemplos de moléculas pequeñas que se enlazan a EGFR incluyen ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSl/Pfizer) y AG1478. Un "agente ¡ anti-angiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere en cierto grado con el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o un anticuerpo que se enlaza a un factor de crecimiento o al receptor del factor de crecimiento involucrado en la promoción de la angiogénesis. El factor anti-angiogénico preferido en la presente es un anticuerpo que se enlaza al Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) . El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas están la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humano, N-metionil -hormona humana del crecimiento, y hormona bovina del crecimiento; hormona ^,,,!,^^,^^,, , ....^.^.^.^,,.. ,„ .—6—u-.^—?^,f*M paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas tales como hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; el factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor a y ß de necrosis tumoral; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor I y II de crecimiento similar a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón a, ß y ?; factores estimuladores de colonias (CSFs) tales como el CSF de macrófago (M-CSF) ; CSF de granulocitos- macrófagos (GM-CSF) ; y CSF de granulocitos (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-l'a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß, y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y ligando en equipo (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye las proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

El término "profármaco" como se utiliza en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a las células tumorales en comparación al fármaco progenitor, y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido a la forma progenitora más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy nBiochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no están limitados a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glucosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden ser convertidos al fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados a una forma de profármacos para el uso en esta invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante, que es útil para la administración de un fármaco (tales como los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los compuestos del liposoma están comúnmente acomodados en una formación bicapa, similar al arreglo lipídico de las membranas biológicas. El término "inserto de envase" es utilizado para referirse a las instrucciones acostumbradamente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de tales productos terapéuticos. Un "cardioprotector" es un compuesto o composición que previene o reduce la disfunción miocardiaca (por ejemplo cardiomiopatía y/o insuficiencia cardiaca congestiva) asociada con la administración de un fármaco, tal como un antibiótico de antraciclina y/o un anticuerpo de ErbB2 , a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir un efecto cardiotóxico mediado pro radicales libres y/o prevenir o reducir el daño por tensión oxidativa. Los ejemplos de cardioprotectores abarcados por la presente definición incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano -J^-*t*tAA ?_.t -. __. ,-»- ; i -» i * í * (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacotherapy 28: 1063-1072 (1994) ) ; un agente de disminución de lípidos y/o un antioxidante tal como probucol (Singal et al. J". Mol . Cell Cardiol . 27: 1055-1063 (1995)); amifostina (éster del 2-[(3-aminopropil) amino] etanotiol -fosfato diácido de aminotiol, también llamado WR-2721, y la forma de captación celular desfosforilada del mismo, llamada WR-1065) y el ácido S-3- (3-metilaminopropilamino) ropilfosforotioico (WR-151327) , ver Green et al. Cáncer Research 54: 738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. En: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease . Nueva York: Elsevier . 191-215 (1980) ) ; betabloqueadores tales como metoprolol (Hjalmarson et al. Drugs 47: Supl. 4: 31-9 (1994); y Shaddy et al. Am. Heart J. 129: 197-9 (1995) ) ; vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C) ; depuradores de radicales libres tales como ácido oleanólico, ácido ursólico y N-acetilcisteína (NAC) ; compuestos atrapadores de espín tales como la alfa-fenil-ter-butil-nitrona (PBN) ; (Paracchini et al., Anticancer Res . 13: 1607-1612 (1993)); compuestos selenoorgánicos tales como P251 (Elbesen) ; y similares. Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada a partir de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual está ordinariamente asociado en la fuente natural en el ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada está en otra forma diferente o en un ajuste diferente en el cual ésta es encontrada en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto son distinguidas de la molécula de ácido nucleico como ésta existe en las células naturales. No obstante, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que ordinariamente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un sitio cromosómico diferente de aquel de las células naturales. La expresión "secuencias control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada, en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y aumentadores . El ácido nucleico está "operablemente enlazado" cuando éste es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o guía secretora está operablemente enlazado al ADN para un polipéptido, si éste es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador esta operablemente enlazado a una secuencia de codificación si éste afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace al ribosoma está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si 5 éste está así colocado para facilitar la traducción. En general, "operablemente enlazado" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas y, en el caso de la guía secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los aumentadores no tienen que estar contiguos. 10 El enlace es logrado mediante la ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o los ligadores son utilizados de acuerdo con la práctica convencional. Como se utiliza en la presente, las expresiones 15 "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas las designaciones tales incluyen la progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo primaria y los cultivos derivados de ésta, sin importar el número de 20 transferencia. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones derivadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o la misma actividad biológica como se selecciona en la célula 25 originalmente transformada, es también incluida. Donde se •["-f-fr-*"^^^---" pretenden designaciones distintas, esto será claro a partir del contexto.

II. Producción de Anticuerpos anti-ErbB2 Enseguida se presenta una descripción de las técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. El antígeno ErbB2 que va a ser utilizado para la producción de los anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una porción del mismo, que contiene el epítope deseado. Alternativamente, las células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar ErbB2 ; o una línea de células de carcinoma tal como las células SK-BR-3, ver Stancovski et al. PNAS (EUA) 88: 8691-8695 (1991)) pueden ser utilizadas para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. (i) Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales son preferentemente producidos en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil el conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie que va a ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de la 5 tripsina de soya, utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoilo (conjugación a través de los residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o 10 R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados mediante la combinación, por ejemplo, de 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 15 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyección de la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o del conjugado en el adyuvante completo de Freund, mediante inyección subcutánea en sitios 20 múltiples. Siete a 14 días más tarde los animales son sangrados y el suero es evaluado para el título de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta los títulos máximos. Preferentemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una diferente 25 proteína y/o a través de un diferente reactivo de reticulación. Los conjugados también pueden ser elaborados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como alumbre son adecuadamente utilizados para mejorar la 5 respuesta inmune . (i i ) An ti cuerpos Monoclonal es Los anticuerpos monoclonales son obtenidos a partir 10 de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica el 15 carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser elaborados utilizando el método del hibridoma primeramente descrito por Kohier et al., Nature, 256: 495 20 (1975) , o pueden ser elaborados por métodos de AD? recombinante (Patente de los Estados Unidos ?o . 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describió anteriormente en la presente para producir 25 linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vi tro . Los linfocitos son luego fusionados con las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma preparadas de este modo son sembradas y desarrolladas en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el desarrollo o la supervivencia de las células de mieloma progenitoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias previenen el desarrollo de las células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable de alto nivel del anticuerpo por las células seleccionadas productoras de anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk lustitute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, y las células SP-2 o X63- Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas celulares de 5 heteromieloma de ratón-humano y de mieloma humano han sido también descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J". Immunol . , 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva Yor, 10 1987) ) . El medio de cultivo en el cual se están desarrollando las células de hibridoma es evaluado para la producción de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de 15 los anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas es determinada por la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de enlace in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RÍA) o el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) . 20 La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal . Biochem. , 107: 220 (1980). Después de que las células de hibridoma son identificadas las cuales producen anticuerpos de la 25 especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones ___ _^ÍUMÍÍ??ißál?l?¡___i__Í S. _i .»... i .M~á__i*.t t~MJ_________ii_, . .. ____. « . . . . :. -«.,»..- »-. '. - ». - ...?...«J»,t?t¡lJ. pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y desarrollados mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células hibridomas pueden ser desarrolladas in vivo como tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los sublcones son adecuadamente separados del medio de cultivo, del fluido de ascitis, o del suero mediante procedimientos convencionales de purificación de anticuerpo tales, por ejemplo, la A-Sepharose, o cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Las células hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, los cuales son luego transfectados dentro de las células huésped tales como células de E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Revisar los artículos sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica para el anticuerpo incluyendo Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol . 5: 256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130: 151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de bibliotecas de fago de anticuerpo, generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990), Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J". Mol . Biol . . , 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante entremezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para la construcción de genotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res . , 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal, para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN puede también ser modificado, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humana, en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati Acad. Sci . EUA 81: 6851 (1984)), mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina, de toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina. Típicamente, tales polipéptidos no inmunoglobulina están sustituidos por dominios constantes de un anticuerpo, o éstos son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad para un antígeno o para otro sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. iii) Anticuerpos Humanizados Los métodos para la humanización de anticuerpos no humanos han sido descritos en la técnica. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en éste a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son tt. . . ? _ J__ __. 1^ ^^J_í___l_____. . __ _,......_*.»._.„_--»-- - -_« - --.-»«*.<-•*-*•-frecuentemente denominados como residuos de "importación" , los cuales son típicamente tomados de un dominio variable de "importación" . La humanización puede ser esencialmente realizada siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988) ) , mediante la sustitución de las secuencias de la región hipervariable para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos ?o. 4,816,567) en donde sustancialmente ha sido sustituido menos de un dominio variable humano, intacto, por la secuencia correspondiente proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR están sustituidos con residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de tales dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para ser utilizados en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para producir la antigenicidad. De acuerdo al método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra la . i _. __.___. . - _&~? í.i^ ^i genoteca completa de las secuencias conocidas del dominio variable humano. La secuencia humana que es más parecida a aquella del roedor es entonces aceptada como la región estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims 5 et al . , J. Immunol . , 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol . Biol . , 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser 10 utilizada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati . Acad . Sci . EUA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . , 151: 2623 (1993)). Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de la alta afinidad con el 15 anticuerpo y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo a un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras 'y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales 20 de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los programas de computadora son disponibles, los cuales ilustran y muestran visualmente las probables estructuras 25 conformacionales, tridimensionales, de las secuencias de inmunoglobulina, candidatas, seleccionadas. La inspección de estas representaciones visuales permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de los residuos que incluyen la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados a partir de las secuencias del recipiente y de importación, de modo que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente, y lo más sustancialmente involucrados en influir el enlace al antígeno. El Ejemplo 3 siguiente describe la producción de los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados, ejemplares que se enlazan a ErbB2 y bloquean la activación del ligando de un receptor de ErbB. El anticuerpo humanizado de interés particular en la presente bloquea la activación de MAPK mediada por EGF, TGF-a y/o HRG, esencialmente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo) y/o se enlaza a ErbB2 esencialmente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo) . El anticuerpo humanizado en la presente puede, por ejemplo, comprender los residuos de la región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano y pueden además comprender una sustitución en la región estructural (FR) , en una posición seleccionada del grupo que consiste de 69H, 71H y 73H 5 utilizando el sistema de numeración del dominio variable descrito en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 81991) . En una modalidad, el anticuerpo humanizado que comprende las 10 sustituciones FR en dos o todas las posiciones 69H, 71H y 73H. Un anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente, comprende los residuos de determinación de la complementariedad del dominio pesado variable, GFTFTDYTMX, 15 donde X es preferentemente D o S (SEQ ID NO: 7) ; DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8); y/o NLGPSFYDY (SEQ ID NO: 9) , que comprende opcionalmente las modificaciones de aminoácidos de esos residuos de CDR, por ejemplo donde las modificaciones esencialmente mantienen o mejoran la afinidad 20 del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR pesadas, variables, anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden ser preparadas mediante 25 maduración por afinidad, por ejemplo, como se describe más iia?i ?ii-itíittate«a¿iMi,.?-iiaf¡ - - i . muí_*_ adelante. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio pesado variable, en la SEQ ID NO: 4. El anticuerpo humanizado puede comprender los 5 residuos de determinación de la complementariedad del dominio ligero variable KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10) ; SASYX^X3, donde X1 es preferentemente R o L, X2 es preferentemente Y o E, y X3 es preferentemente T o S SEQ ID NO: 11); y/o QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12) , por ejemplo además de aquellos residuos CDR del 10 dominio pesado variable, en el párrafo precedente. Tales anticuerpos humanizados comprenden opcionalmente las modificaciones de aminoácidos de los residuos CDR anteriores, por ejemplo donde las modificaciones esencialmente mantienen o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la 15 variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR ligeras variables, anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden ser preparadas mediante maduración por afinidad, por 20 ejemplo, como se describe más adelante. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio ligero variable en la SEQ ID NO: 3. La presente solicitud también contempla los anticuerpos madurados por afinidad que se enlazan a ErbB2 y 25 que bloquean la activación de un ligando de un receptor de r-HÉM¿iaÍaMMMBB itÉÉfc.Í,u«. U _?¡..__ _t_í?_?? -.i. j_ ..___... .. .. . ... ..-:.-__.¿ _ . . - . . ,_____• . <___._*U______m____.~ ErbB. El anticuerpo progenitor puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ejemplo uno que comprende las secuencias variables ligera y/o pesada de las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente por ejemplo variante 574) . El anticuerpo madurado por afinidad, preferentemente se enlaza al receptor de ErbB2 con una afinidad superior a aquella de 2C4 murino o de la variante 574 (por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro veces, hasta aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces mejorada la afinidad, por ejemplo como es evaluado utilizando un ELISA de dominio extracelular de ErbB2 (ECD) ) . Los residuos de las CDR pesadas, variables, ejemplares para la sustitución incluyen H28, H30, H34, H35, H64 , H96, H99, o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete de estos residuos) . Los ejemplos de los residuos CDR ligeros variables para la alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92 , L93, L94, L96, L97 o combinaciones de dos o más (por ejemplo' dos o tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos) . Diversas formas del anticuerpo humanizado o del anticuerpo madurado por afinidad son contempladas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, el cual está opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado.

Alternativamente, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. iv) Anticuerpos Humanos Como una alternativa a la humanización, pueden ser generados los anticuerpos humanos, por ejemplo, es ahora posible producir animales trangénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocitoga del gen de la región de unión a la cadena pesada del anticuerpo (JH) , en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, da como resultado la inhibición completa la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones" mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos después del reto con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Inmuno . , 7: 33 (1993); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. >. _A t ? í Alternativamente, la tecnología de representación visual de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede ser utilizada para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vi tro, a partir de los repertorios de los genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina, provenientes de donadores no inmunizados. De acuerdo a esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo son clonados intraestructuralmente ya sea en un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso tal como M13 o fd, y mostrado visualmente como los fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia del ADN de hebra simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que muestra esas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. La representación visual del fago puede ser realizada en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Jonson, Kevin S. Y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fuentes de segmentos del gen V pueden ser utilizadas para la representación visual del fago. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) aisló un arreglo diferente de anticuerpos anti-oxazolona provenientes de una genoteca combinatoria, aleatoria, pequeña, de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V provenientes de donadores humanos no inmunizados puede ser construido, y los anticuerpos para un arreglo diverso de antígenos (incluyendo los auto-antígenos) pueden ser aislados esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol . Biol . , 222: 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Ver, también, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discutió anteriormente, los anticuerpos humanos pueden también ser generados por las células B activadas in vi tro (ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,567,610 y 5,229,275) . Los anticuerpos humanos anti-ErbB2 son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,772,997 expedida el 30 de junio de 1998 y WO97/00271 publicada el 3 de enero de 1997. v) Fragmentos de Anticuerpo Han sido desarrolladas diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados vía la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) ) . Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las genotecas de fago de anticuerpo discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo a otro procedimiento, los fragmentos F(ab')2 pueden ser aislados directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Ver W093/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5,571,894; Patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos .

^^^A^^^^j^^^^^^^^^^^iÉi^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^l vi ) Anticuerpos Biespecíf icos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes epítopes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazarse a dos diferentes epítopes de la proteína ErbB2. Otros anticuerpos de este tipo pueden combinar un sitio de enlace a ErbB2 con el o los sitios de enlace para EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo anti-ErbB2 puede ser combinado con un brazo que se enlaza a una molécula de disparo sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2 o CD3) , o receptores Fc para IgG (Fc?R) , tales como Fc?RI (CD64) , Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa ErbB2. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser también utilizados para localizar los agentes citotóxicos para las células que expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace a ?rbB2 y un brazo que se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferon-a, alcaloide de vincapervinca, cadena A de la resina, metrotexato o hapteno con isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como fragmentos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

W096/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc?RIII y la Patente de los Estados Unidos No. 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc?RI biespecífico. Un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fca es mostrado en WO98/02463. la Patente de los Estados Unidos No. 5,821.337 enseña un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3. Los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa está basada en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales únicamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual es usualmente realizada por pasos de cromatografía de afinidad, es más bien problemático, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son descritos en WO93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655-3659 (1991). De acuerdo a un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de , _ .,4 ? ._ ?. .I . í.,%..¿. _i -J_. 0.1t*?r. -, M <_ ; t t .S enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) son fusionadas a las secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende 5 al menos parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de 10 inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina son insertados en los vectores de expresión separados, y son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos 15 polipeptídicos en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción, proporcionan rendimientos óptimos. No obstante, es posible insertar las secuencias de modificación para dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de 20 expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significancia particular. En una modalidad preferida de este procedimiento, 25 los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que 5 esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina únicamente en la mitad de la molécula biespecífica que proporciona una manera 10 fácil de separación. Este procedimiento es descrito en WO94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). De acuerdo a otro procedimiento descrito en la 15 Patente de los Estados Unidos No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser manipulada mediante ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de la célula recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una 20 parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños, provenientes de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo, son reemplazadas cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . Las "cavidades" 25 compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las __t _¿ i__ i___?_teti_ i -± _ .. _ A.:_ ^.J.^..... ...._.. _.. . - .. .. -ti u. cadenas similares grandes, son creadas sobre la interfaz de la molécula de la segunda molécula de anticuerpo mediante el reemplazo de las cadenas laterales de aminoácido grandes, con otras más pequeñas (alanina o treonina) Esto proporciona un 5 mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los 10 anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a la avidina, el otro a la biotina. Tales anticuerpos han sido por ejemplo propuestos para dirigir las células del sistema inmune a las células no deseadas (Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección 15 por el VIH (WO91/00360, WO92/200373 y EP-03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualesquiera métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de los Estados Unidos 20 No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Las técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo han sido también descritas en la literatura, por ejemplo, los 25 anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando el ^¡^^JÜ^^^^^j i . í ? m_tA. ^^¡^ enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son proteolíticamente escindidos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente de formación de complejo de escisión, el arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son luego convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB es luego reconvertido a Fab' -tiol por la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli , que pueden ser químicamente acoplados para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp . Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizada, F(ab')2. Cada fragmento Fab' fue separadamente secretado de E. coli y sujeto a acoplamiento químico dirigido, in vi tro, para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de este modo fue capaz de enlazarse a las células que sobreexpresan Í? $< . .$ .Í &. .. ..- -Ír.4 el receptor de ErbB2 y las células T humanas normales, así como también disparan la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumor de mama humano . Diversas técnicas para la elaboración y aislamiento de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos, directamente a partir del cultivo de células recombinantes, han sido también descritas, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina provenientes de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de bisagra para formar los monómeros y luego reoxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la elaboración de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. ... ~ ^_. Á.Á . i*.

En consecuencia, los dominios VH y V de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, con lo cual se forman los dos sitios de enlace al antígeno. Otra estrategia para la elaboración de 5 los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de los dímeros Fv de cadena simple (scFv) ha sido también reportada. Ver Gruber et al., J". Immunol . , 152: 5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficos 10 pueden ser preparados. Tutt et al. J. I munol . 147: 60 (1991) . vii ) Otras modificaciones en la secuencia de aminoácidos 15 La o las modificaciones en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente, son también contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/o las otras 20 propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 son preparadas mediante la introducción de los cambios apropiados en los nucleótidos dentro del ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2, o mediante síntesis de péptidos. Tales 25 modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones a partir -t?á_______________f^ ?_w_m i t, __ _. *. ? *_____ ___*.__-+. ?*L?~ de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución es realizada para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-ErbB2, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glucosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-ErbB2 que son sitios preferidos para la mutagénesis, es llamada "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, los residuos cargados tal como arg, asp, his, lys y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o negativamente cargado (más preferentemente alanina o polialani?a) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el antígeno ErbB2. Aquellos sitios de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son luego refinados mediante la introducción de variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación en la secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación é **. __& per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis de exploración de ala o aleatoria es conducida en el codón objetivo o en la región objetivo, y las variantes 5 de anticuerpo anti-ErbB2 expresadas, son seleccionadas para la actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales en el intervalo de longitud desde un residuo hasta polipéptidos que 10 contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un anticuerpo citotóxico. Otras 15 variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti- ErbB2 incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo anti-ErbB2 a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo. 20 Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti- ErbB2 reemplazada con un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las 25 regiones hipervariables, pero las alteraciones de FR son también contempladas. Las sustituciones conservadoras son mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe posteriormente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, pueden ser introducidos y los productos seleccionados.

TABLA 1 -.A * &.

Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu, val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo son logradas mediante la selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o de hélice, b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural son divididos en grupos con base en las propiedades de cadena lateral comunes: 1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; 2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; 3) ácidos: asp, glu; 4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; 5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y 6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras involucrarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase más . Cualquier residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo anti-ErbB2 también puede ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. De manera contraria, el o los enlaces de cisteína pueden ser agregados al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo anticuerpo humanizado o humano). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo progenitor a partir del cual éstas son generadas. Una manera conveniente para generar tales variantes de sustitución, involucra la maduración por afinidad utilizando la representación visual de fago.

Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo son mostradas visualmente 5 de una manera monovalente a partir de las partículas de fago filamentosas como fusiones para el producto del gen III de M13 empaquetado con cada partícula. Las variantes mostradas por el fago son luego seleccionadas por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace) , como se describe 10 en la presente. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable, para la modificación, puede ser realizada la mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de las regiones hipervariables que contribuyen significativamente al enlace con el antígeno. 15 Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico el analizar una estructura cristalina del complejo antígeno- anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el ErbB2 humano. Tales 'residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de 20 acuerdo a las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes de sujeta a selección como se describe en la presente, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes, pueden ser seleccionados para el desarrollo 25 posterior. ¡ **^^»« t-baA-ti a- Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alteración se entiende la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o 5 la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos es típicamente ya sea N-ligada u O-ligada. N-ligado se refiere al acoplamiento de la porción carbohidrato a la cadena principal 10 de un residuo de asparagina. La secuencia tripeptídica asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el acoplamiento enzimático de la porción carbohidrático a la cadena lateral de asparagina. De este 15 modo, la presencia ya sea de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Una glucosilación O-ligada se refiere al enlace o acoplamiento de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiácido, más comúnmente serina o 20 treonina, aunque puede también ser utilizada la 5- hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo es convenientemente lograda mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos tal que ésta contiene una o más de 25 las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para ^MMÜMM los sitios de glucosilación N-ligados) . La alteración puede también ser realizada mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de 5 glucosilación 0-ligados) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para las variantes de la de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErB2 son preparadas mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estas moléculas incluyen, 10 pero no están limitadas a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una 15 variante previamente preparada o una versión no variante del anticuerpo anti-ErB2. Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectuada, por ejemplo para aumentar la citotoxicidad mediada por las células 20 dependiente del antígeno (DAC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede ser logrado mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el o los residuos de 25 cisteína pueden ser introducidos en la región Fc, con lo cual **. ?^^^^¡^ ¡^g se permite la formación del enlace disulfuro intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener capacidad mejorada de internalización y/o muerte celular incrementada, mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo también incrementada (DAC) . Ver Carón y colaboradores J. Exp. Med 176:1191-1195 (1992) y Shopes , B . J. Immunol . 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral aumentada pueden también ser preparados utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolf y colaboradores Cáncer Research 53:2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado mediante ingeniería genética, el cual tiene regiones Fc dobles y puede con esto tener capacidades de lisis del complemento y DAC, mejoradas. Ver Stevenson y colaboradores Anti -Cáncer Drug Design 3:219-230 (1998). Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace al receptor, salvaje, en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítope de enlace al receptor, salvaje" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo IgGx, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del incremento de la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. (viii ) Selección para los anticuerpos con las propiedades deseadas Las técnicas para generar anticuerpos han sido descritas anteriormente. Se pueden ser seleccionar además los anticuerpos con ciertas características biológicas, como se desee. Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, puede ser determinada la habilidad del anticuerpo para bloquear el ligando ErbB que se enlaza a las células que expresan el receptor de ErbB (por ejemplo en conjugación con otro receptor de ErbB con el cual el receptor de ErbB de interés forma un hetero-oligómero de ErbB) . Por ejemplo, las células de expresión natural, o transfectadas 'para expresar, los receptores de ErbB del hetero-oligómero de ErbB pueden ser incubadas con el anticuerpo y luego expuestas al ligando ErbB marcado. La habilidad del anticuerpo anti-ErbB2 para bloquear el enlace del ligando al receptor de ErbB en el hetero-oligómero ErbB puede ser luego evaluada. Por ejemplo, la inhibición del enlace de HRG a las líneas de células tumorales de mama MCF7 por los anticuerpos !*--,«&*# -» al-- anti-ErbB2 puede ser realizada utilizando los cultivos MCF7 en monocapa sobre hielo en un formato de placa de 24 pozos esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 siguiente. Los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 pueden ser agregados 5 a cada pozo incubados por 30 minutos. Puede ser luego agregado rHRGß177_22 marcado con 125I (25 pm) , y la incubación puede ser continuada por 4 a 16 horas. Las curvas de dosis- respuesta pueden ser preparadas y puede ser calculado y valor de IC50 para el anticuerpo de interés. En un anticuerpo, el 10 anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB tendrá una IC50 para inhibir el enlace de HRG a las células MCF7 en este ensayo, de aproximadamente 50 nM o menos, más preferentemente 10 nM o menos. Donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un 15 fragmento Fab la IC50 para inhibir el enlace de HRG a las células MCF7 en este ensayo puede, por ejemplo, ser de aproximadamente 100 nM o menos, más preferentemente 50 nM o menos . Alternativamente, o adicionalmente, la habilidad 20 del anticuerpo-ErbB2 para bloquear la fosforilación de la tirosina estimulada por el ligando ErbB de un receptor de ErbB presente en un hetero-oligómero de ErbB, puede ser evaluada. Por ejemplo, las células que expresan endógenamente los receptores de ErbB o transfectadas para 25 expresarlos, pueden ser incubadas con el anticuerpo y luego evaluadas para la actividad de la fosforilación de tirosina dependiente del ligando ErbB, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-fofotirosina (el cual es opcionalmente conjugado con un marcador detectable) . El ensayo de activación del receptor de cinasa descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,766,863 es también disponible para determinar la activación del receptor de ErbB y el bloqueo de esa actividad por un anticuerpo. En una modalidad, se puede seleccionar un anticuerpo que inhiba la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 en células MCF7 esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Por ejemplo, las células MCF7 pueden ser sembradas en placas de 24 pozos y los anticuerpos monoclonales para ErbB2 pueden ser agregados a cada pozo incubados por 30 minutos a temperatura ambiente; luego puede ser agregado rHRGßl?77-244 a cada pozo a una concentración final de 0.2 nM, y la incubación puede ser continuada por 8 minutos. Los medios pue'den ser aspirados de cada pozo, y las reacciones pueden ser retenidas por la adición de 100 µl de amortiguador de muestra SDS (5% de SDS, DTT 25 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 6.8). Cada muestra de 25 ml puede ser sometida a electroforesis sobre un gel en gradiente de 4 a 12 % (Novex) y luego electroforéticamente transferida a la membrana de difluoruro de polivinilideno. Los inmunomanchados de anti-fosfotirosina (a 1 µg/ml) pueden ser revelados, y la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr aproximadamente 180,000 puede ser cuantificada mediante densitometría de reflectancia. El anticuerpo seleccionado inhibirá preferentemente de manera significativa la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 a aproximadamente 0-35% de control en este ensayo. Una curva de dosis-respuesta para la inhibición de la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 como se determina por la densitometría de reflectancia puede ser preparada y se puede calcular un IC5o para el anticuerpo de interés. En una modalidad, el anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB tendrá una IC50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación la tirosina pl80 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menos, más preferentemente 10 nM o menos. Donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como el fragmento Fab, la IC50 para inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 en este ensayo puede, p'or ejemplo, ser de aproximadamente 100 nM o menos, más preferentemente 50 nM o menos . Se pueden también evaluar los efectos inhibitorios del crecimiento del anticuerpo sobre las células MDA-MB-175, por ejemplo esencialmente como se describe por Schaefer y colaboradores Ocogene 15:1385-1394 (1997). De acuerdo a este ensayo, las células MDA-MB-175 pueden ser tratadas con un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (10 µh/ml) por 4 días, y teñidas con cristal violeta. La incubación con un anticuerpo anti-ErbB2 puede mostrar un efecto inhibitorio del crecimiento en esta línea celular, similar a aquella mostrada 5 por el anticuerpo monoclonal 2C4. En una modalidad adicional, el HRG exógeno no revertirá significativamente esta inhibición. Preferentemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 a un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y 10 opcionalmente a un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 7F3) , ambos en presencia y ausencia de HRG exógeno. En una modalidad, , el anticuerpo anti-ErbB2 de interés puede bloquear la asociación de ErbB2 con ErbB3 dependiente de la herregulina, en células MCF7 y SK-BR-3 como 15 es determinado en un experimento de co-inmunoprecipitación tal como aquel descrito en el Ejemplo 2, sustancialmente de manera más efectiva que el anticuerpo monoclonal 4D5, y preferentemente y sustancialmente de manera más efectiva que el anticuerpo monoclonal 7F3. 20 Para identificar los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del desarrollo o crecimiento, se pueden seleccionar los anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células cancerosas que sobre-expresan ErbB2. En una modalidad, el anticuerpo inhibidor del crecimiento, de 25 elección, es capaz de inhibir el crecimiento de las células _____________ÉÉt^t___Í___ k __l a.? ^? .i__?M .. _. ._ .-. .. « « , ..,, .- „ A*. «.* á SK-BR-3 en el cultivo celular por aproximadamente 20-100% y preferentemente por aproximadamente 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. Para identificar tales anticuerpos, el ensayo SD-BR-3 descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,677,171 puede ser realizado. De acuerdo a este ensayo, las células SK-BR-3 son desarrolladas en una mezcla 1:1 de medio F12 y DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina y penicilina-estreptomicina. Las células SK-BR-3 son sembradas en placa a 20,000 células en una caja de cultivo de células de 35 mm (2 ml/caja de 35 mm) . 0.5 a 30 µg/ml del anticuerpo anti-ErbB2 es agregado por caja. Después de 6 días, el número de células, en comparación a las células no tratadas son contadas utilizando un contador de células electrónico COULTERMR. Aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 por aproximadamente 20-100% o aproximadamente 50-100% pueden ser seleccionadas como anticuerpos inhibidores del crecimiento. ' Para seleccionar los anticuerpos que inducen la muerte celular, la pérdida de la integridad membranal como es indicada por, por ejemplo, Pl, azul de tripán o captación de 7AAD, pueden ser evaluados con relación al control. El ensayo preferido es el ensayo de captación de Pl utilizando las células BT474. De acuerdo a este ensayo, las células BT474 (que pueden ser obtenidas de la Colección . ¿ i A. i Norteamericana de Cultivos de Especie (American Type Culture Collection (Rockvile, MD) ) son cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) :Ham' s F-12 (50:50) suplementado con FBS al 10% inactivado con calor (Hyclone) y 5 L-glutamina 2 mM. (De este modo, el ensayo es realizado en ausencia de complemento y células efectoras inmunes) . Las células BT474 son sembradas en una densidad de 3 x 106 por caja en cajas de 100 x 20 mm y se dejan acoplar toda la noche. El medio es luego removido y reemplazado con medio 10 fresco solo o medio que contiene 10 µg/ml del anticuerpo monoclonal apropiado. Las células son incubadas por un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinización. Las células son luego centrifugadas a 1200 15 rpm por 5 minutos a 4°C, el botón se resuspende en 3 ml de amortiguador de enlace de Ca2+ enfriado con hielo (Hepes 10 mM, pH 7.4, cloruro de sodio 140 mM cloruro de calcio 2.5 mM) y se toman como alícuotas en tubos de 12 x 75 ml con tapón roscado (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) 20 para la eliminación de los cúmulos celulares. Los tubos reciben luego Pl (10 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCANMR y el programa CellQuest de FASCONVERTMR (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente 25 significativos de muerte celular como se determina por la captación de Pl, pueden ser seleccionados como anticuerpos inductores de la muerte celular. Con el fin de seleccionar los anticuerpos que inducen la apoptosis, es disponible un ensayo de enlace a la anexina, utilizando las células BT474. Las células BT474 son cultivadas y sembradas en cajas como se discute en el párrafo precedente. El medio es luego removido y reemplazado con medio fresco solo, o medio que contiene 10 µg/ml del anticuerpo monoclonal. Después de un periodo de incubación por tres días, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinización. Las células son luego centrifugadas, resuspendidas en amortiguador de enlace de Ca2+ y tomadas como alícuotas en tubos, como se discute anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos reciben luego la anexina marcada (por ejemplo anexina V-FTIC) (1 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FASCANMR y el programa FASCONVERTMR CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina con relación al control, son seleccionados como anticuerpos inductores de la apoptosis. Además del ensayo de enlace a la anexina, es disponible un ensayo de tinción de AD? utilizando las células BT474. Con el fin de realizar este ensayo, las células BT474 han sido tratadas con el anticuerpo de interés como se describe en los dos párrafos precedentes y se incuban con 9 µg/ml de HEOECHST 33342"* por dos horas a 37°C, luego se analizan sobre un citómetro de flujo ELITEMR (Coulter Corporation) utilizando el programa MODFITLTMR (Verity 5 Software House) . Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es el doble o mayor (y preferentemente triple o mayor) que las células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden ser seleccionados como anticuerpos apoptóticos utilizando este ensayo. 10 Para seleccionar los anticuerpos que se enlazan a un epítope sobre ErbB2 enlazado con un anticuerpo de interés, puede ser realizado un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como aquel descrito en Antibodies A . Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . 15 Alternativa o adicionalmente, el trazado del mapa del epítope puede ser realizado mediante los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo Figuras ÍA y IB en la presente) . (ix) Inmunoconj ugados 20 La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo un toxina de molécula pequeña o una 25 toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, liÜHIfftlItplll - _M -A.» a.-J- .fcrtat .a.,» -^.«.«.- . .-. ~ - ~. . . ..__- .. - -... *- ^ . -. . . ... ?? . * t--vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes del mismo) , o un isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado) . Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansina (Patente de los Estados Unidos No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 son también contemplados en la presente. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es conjugado a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitansina puede, por ejemplo, ser convertida a May-SS-Me que puede ser reducida a May-SH3y se hace reaccionar con el anticuerpo modificado (Chari y colaboradores Cáncer Research 52:127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado maitansinoide-anticuerpo . Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-ErbB2 conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de antibióticos son capaces de producir rompimientos de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolares . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, ?j.1, a21, a^, N-acetil-?n.1 PSAG y ?i1 (Hinman y colaboradores Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) y LODE y colaboradores Cáncer Research 58:2925-2998)). Ver también Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,587 y 5,773,001 expresamente incorporadas por referencia en la presente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser utilizadas incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos de no enlace de la toxina de la difteria, la cadena A de la endotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurí tis fordii , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver por ejemplo WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. La presente invención con'templa además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirubonucleasa; ADNasa) . Una variedad de isótopos radioactivos son disponibles para la producción de anticuerpo anti-ErbB2 radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden ser elaborados utilizando una variedad de agentes de complemento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , ciclohexan-4 -carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (clorhidrato del adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tales como bis- (azidobenzoil) -hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina, diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede ser preparada como se describe en Vitetta y colaboradores Science 238:1098 (1997). El ácido 1-isotiocinatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11206. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil al ácido enlazador sensible a la peptidasa, enlazador de frfl dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Cari y colaboradores Cáncer Research 52:127-131 (1992)) puede ser utilizado. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 y el agente citotóxico puede ser elaborado, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. En otra modalidad más, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como la estreptavidina) para la utilización en la predirección al tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por el retiro del conjugado no enlazado de la circulación, utilizando un agente de despejo y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . (x) Terapia de Pro fármaco Mediada por Enzima Dependiente del Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser utilizados en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidilo ver WO 81/01145) a un fármaco £ A-á & -anticanceroso activo. Ver por ejemplo WO 88/07378 y Patente de los Estados Unidos No. 4,975,278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT, incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de una manera tal como para convertirlo a su forma más activa, citotóxica. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero o están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa para convertir los profármacos que contienen sulfato a fármacos libres; citosina-desaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica al fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas de escisión de carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glucosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir los fármacos derivatizados con ß-lactamas en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tales como la amidasa de la penicilina V o amidasa de la penicilina G, útiles para convertir los fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina, con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la 5 técnica como "abzimas", pueden ser utilizados para convertir los profármacos de la invención a fármacos libres activos (ver por ejemplo Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden ser preparados como se describe en la presente para la distribución de la abzima a 10 una población de células tumorales. Las enzimas de esta invención pueden se covalentemente enlazadas a los anticuerpos anti-ErbB2 mediante técnicas bien conocidas en la materia, tales como el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales 15 discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace al antígeno de un anticuerpo de la invención enlazada al menos a una porción funcionalmente activa de J una enzima de la invención, pueden ser construidos utilizando las técnicas de 20 ADN recombinante bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo Neuberger y colaboradores, Nature 312-604-608 (1984) . 25 s«at a te»jaa&¡fe . . ..ui.?^_u,t^m? __ .^ ><ttm,„.. ______*.-. , -. --»_ . . «-. * - .. . - -- ». . ^.Í - J (ix) Otras modificaciones de anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo puede también ser atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) , respectivamente), en sistemas de distribución de fármacos, coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) , o microemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición Oslo, A., Ed. , (1980). Los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente pueden también ser formulados como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en la técnica, tales como se describe en Epstein y colaboradores Proc. Nati . Acad. Sci , E.U.A., 82:3688 (1985); Hwang y colaboradores Proc . Nati Acad. Sci, E.U.A., 77:4030 (1980); Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045, y 4,544,545; y W097/38731 publicada el 23 de Octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden ser 5 generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG- PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido, para producir liposomas con el 10 diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martín y colaboradores J. Biol. Chem. 257:286- 288 (1982) vía la reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro 15 del liposoma. Ver Gabizon y colaboradores J. National Cáncer Inst . 81(19)1984 (1989).

III. Vectores, Células Huésped y Métodos ' 20 La invención también proporciona el ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo humanizado anti- ErbB2 , los vectores y las células huésped que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas recombinantes para la producción de anticuerpo. ^'_ts_i__ ______ _ _____tí_____í? ,. ¡s-, ... .m^?__t_¿_? _j, ._. __í__^._, . . . „^_ .._._. ._. ^. ^ .. ^ *. _. ___. „ , - __. i ? Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica es aislado e insertado dentro de un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) . Muchos vectores son disponibles. Los componentes vectores incluyen en general, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. (i ) Componente de la secuencia de señal El anticuerpo anti-ErbB2 de esta invención puede ser producido recombinantemente no solo de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual es preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que es reconocida y procesada (por ejemplo escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del anticuerpo nativo anti-ErbB2, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o las guías de heterotoxina II estables al calor. Para la secreción en levadura la secuencia de señal nativa puede ser sustituida por ejemplo por la guía de invertasa de levadura, una guía del factor a (incluyendo las guías del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) , o la guía de fosfatasa acida, la guía de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En células de mamífero, la expresión celular, la secuencia de señal de mamífero así como las guías secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple, están disponibles. El ADN para tal región precursora es ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica para el anticuerpo anti-ErbB2. (ii) Origen del componente de replicación Los vectores de replicación y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación esa secuencia es una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación proveniente del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2 µ es adecuado para levaduras, y diversos orígenes de virales (SV40, polioma, adenovirus SVS, o BPV) son útiles para los vectores de clonación en las células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamífero (el origen SV40, puede típicamente ser utilizado solo debido a que éste contiene el promotor temprano) . (iii ) Componente del gen de Selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para las proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicma, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina-racemasa para Bacilos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el desarrollo de una célula huésped. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y de este modo sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo más de marcadores seleccionados adecuados para células de mamífero son aquellos que hacen posible la identificación de las células competentes para recoger el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2, tal como DHFR, la timidina-cinasa, metalotioneina-I y II, preferentemente los genes de metalotioneina de primate, adenosina-desaminasa, ornitina-descarboxilasa, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR son primeramente identificadas mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando es empleado DHFR de tipo silvestre es la línea de células de ovario de hámster Chino (CHO) deficientes en la actividad de DHFR. . ¿li á LA Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo anti-ErbB2 , la proteína DHFR de tipo silvestre, y otros marcadores seleccionables tales como la aminoglucósido-3 ' -fosforotransferasa (APH) pueden ser seleccionados mediante desarrollo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para el uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y colaboradores, Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura, que carece de la habilidad para desarrollarse en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por el desarrollo en ausencia de triptofano. Similarmente, las cepas de levadura deficientes en el Leu2 (ATCC 20,622 ó 38,626) son complementadas por plásmidos conocidos que poseen el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6 µm pueden ser utilizados para la transformación de las levaduras de Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de la quimiocina de ternera, recombinante, fue reportado para K. Lactis. Van der Berg. Bio/Technology, 8:135 (1990). Los vectores de expresión de copias múltiples, estables para la secreción de la albúmina sérica humana, recombinante, madura por cepas industriales de Kluyveromyces han sido también descritos. Fleer y colaboradores Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (iv) Componente promotor Los vectores de expresión y de clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y están operablemente enlazados al ácido -nucleico del anticuerpo anti-ErbB2. Los promotores adecuados por el uso con los huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. No obstante, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para el uso en los sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno *__ _ . _. ¡__ ?._ __ (S.D.) operablemente enlazada al ADN que codifica para el anticuerpo anti-ErbB2. Las secuencias promotoras son conocidas para los eucariotes. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen 5 una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases corriente arriba (5') del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba (5') del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier 10 nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia ATA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son adecuadamente insertadas dentro de los vectores de expresión 15 eucarióticos. Los ejemplos de secuencias de promoción adecuadas para el uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato- 20 deshidrogenasa, hexocmasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3- fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa, triosafosfato- isomerasa, fosfoglucosa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores 25 inducibles que tienen las ventajas adicionales de tTtifflim-ritB-ÜiftBTi?irflfc transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol -deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del hidrógeno, metalotioneina, 5 gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, y enzimas responsables para la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores o promotores adecuados para el uso en la expresión en levadura son además descritos en la patente Europea EP 73,657. Los aumentadores de levadura son 10 también ventajosamente utilizados con los promotores de levadura. La transcripción del anticuerpo anti-ErbB2 a partir de los vectores en células huésped de mamífero es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas 15 de los virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como el adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus 40 símico (SV40) , a partir de los 20 promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción SV40 que contiene también el origen de replicación viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamífero utilizando el virus del papiloma bovino como un vector, se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,419,446. Una modificación de este sistema es descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 4,601,978. Ver también Reyes y colaboradores, Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del interferón ß humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina-cinasa a partir del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous puede ser utilizado como el promotor. (v) Componente del elemento auméntador La transcripción de un ADN que codifica para el anticuerpo anti-ErbB2 de esta invención por eucariotes superiores es frecuentemente incrementada mediante la inserción de una secuencia aumentadora dentro del vector. Muchas secuencias aumentadoras son ahora conocidas de los genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a- .-^.. fetoproteína e insulina) . Típicamente, no obstante, se utilizará un aumentador proveniente de un virus de células eucarióticas. Los ejemplos incluyen el aumentador SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100-270) , el aumentador del promotor temprano del citomegalovirus, el aumentador del polioma sobre el lado tardío del origen de replicación, y los aumentadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre los elementos aumentadores para la activación de los promotores eucarióticos. El aumentador puede ser empalmado dentro del vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica para el anticuerpo anti-ErbB2, pero está preferentemente localizado en el sitio 5' desde el promotor. (vi) Componente de terminación de la transcripción Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (células de levadura, de hongos, de insectos, de vegetales, de animales, de humanos o nucleadas provenientes de otros organismos multicelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias son comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de los ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen los segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para el anticuerpo anti-ErbB2. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento. Ver WO94/11026 y el vector de expresión descrito en ésta. (vii) Selección de transformación de células huésped Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente, son la células de procariotes, de levadura o de eucariotes superiores descritas anteriormente. Los procariotes adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans y Shigella así como Bacillus tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. Coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31,537), y E. Coli W3110 (ATCC 27,325) son ; .. _ --- . ? * _*?t ikaa. i?__m adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes . Además de los procariotes, los microbios eucariotes tales como hongos filamentosos en levadura son huéspedes de 5 clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican para el anticuerpo anti-ErbB2. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común del panadero, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. No obstante, un número de otros 10 géneros, especies y cepas son comúnmente disponibles y útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como por ejemplo K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. 15 drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. arxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa ,- Scwanniomyces tales ' como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales, por ejemplo 20 Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus, tales como A . Nidulans y A . Níger. Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-ErbB2 glucosilado son derivadas de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebrados 25 incluyen células vegetales y de insecto. Han sido __? t .l .í .?. li ,¿ i identificadas numerosas cepas baculovirales y las variantes y las células huésped de insecto permisivas, correspondientes, provenientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , 5 Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori . Una variedad de cepas virales para la transfección son públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-l de Autographa california NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden ser 10 utilizados como el virus en la presente, de acuerdo a la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda . Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco pueden también ser 15 utilizadas como huéspedes. No obstante, ha sido generado un mayor interés en las células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares 20 huéspedes de mamífero, útiles, son la línea de riñon de mono CVl transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para el desarrollo en cultivo en suspensión, Graham y colaboradores, J. Gen Virol , 36:59 (1977); células 25 de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ^.^=te^ .^.. ^^^ ^^ . é__^,?1, . _.„_ _ , aafeí . . - „ ,.^-^->, - -. . --i, - .-. ..-. . faa-i J ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci E.U.A. 77:4216 (1980); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células 5 de riñon de mono verde africano (VERO- 76, ATCC CRL- 1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA. ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano 10 (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather y colaboradores, Annals N. Y. Acad. Sci . 383-44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células huésped son transformadas con los 15 vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo anti-ErbB2 y cultivadas en medios nutritivos convencionales modificados como sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican para las 20 secuencias deseadas. (viii) Cul tivo de las células huésped Las células huésped utilizadas para producir el 25 anticuerpo anti-ErbB2 de esta invención pueden ser cultivadas ¡¿¡ffjjJÜftiJíf -.-•»- i *- > en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como FIO de Ham (Sigma) , Medio Esencial Mínimo (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) , (Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y colaboradores, Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal . Biochem . 102:255 (1980), Patentes de los Estados Unidos No. 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de los Estados Unidos Re. 30,985 pueden ser utilizados como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden ser suplementados como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o el factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCINRM) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios pueden también ser incluidos a concentraciones apropiadas que podrían ser conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán aparentes para una persona de experiencia ordinaria en la técnica. (ix) Purificación del anticuerpo anti -ErbB2 Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado hacia el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como un primer paso, el desecho particulado, ya sea las células huésped o los segmentos lisados, es eliminado, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter y colaboradores, Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados hacia el espacio periplásmico de E. coli . En resumen, la pasta celular es congelada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en aproximadamente 30 minutos. El desecho celular puede ser eliminado mediante centrifugación. Donde el anticuerpo es secretado hacia el medio, los sobrenadantes provenientes de tales sistemas de expresión son en general primeramente concentrados utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de los pasos anteriores para la inhibir la proteólisis y pueden ser incluidos antibióticos para prevenir el desarrollo de contaminantes adventicios. 5 La composición de anticuerpo preparada a partir de la célula puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La 10 adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser utilizada para purificar los anticuerpos que están basados en las cadenas pesadas ?l , ?2 o ?4 (Lindmark 15 y colaboradores, J". Immunol . Meth . , 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 de humano (Guss y colaboradores, EMBO J. 5:15671575 (1986) ) . La matriz a la cual se acopla el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero son disponibles 20 otras matrices. Las matrices mecánicamente estables como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden ser logrados con la agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la 25 resina Bakerbond ABXRM (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía sobre SEPHAROSE*" sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio son también disponibles dependiendo del anticuerpo que va a ser recuperado. Después de cualesquiera pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sujeta a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizada a bajas concentraciones salinas (por ejemplo de aproximadamente 0-0.25 M de sal).

IV. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención son preparadas para el almacenamiento mediante la mezcla de un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, opcionales {Remington ' s Pharmaceutical Sciences .4.1 16*. Edición, Osol . A., Ed. (1980), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina, conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propil -parabeno, catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3 -pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol, contra-iones formadores de sales tales como sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN11", PLURONICS o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpo anti-ErbB2 liofilizadas, preferidas son descritas en WO 97/04801, expresamente incorporadas por referencia en la presente. La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para 5 la indicación particular que se trate, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa uno al otro. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se enlazan a EGFR, ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a un 10 epítope diferente sobre ErbB2), ErbB3 , ErbB4 , o el factor endotelial vascular (VEGF) en una formulación. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede además comprender un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, 15 agente anti -hormonal , fármaco dirigido a EGRF, agente anti- angiogénico, y/o cardioprotector. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos pueden también ser 20 atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación, o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) , respectivamente, en sistemas de 25 administración de fármacos coloidales (por ejemplo, ^^Ütt^^^_ liposomas, microesferas de aluminio, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Tales técnicas son descritas en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16a. edición. Osol , A. Ed. (1980). Se pueden diseñar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) , o poli (alcohol vinílico)), poliláctidos (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamina, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOTRM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico/ácido glícólico y acetato de leuprólido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones que van a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente logrado mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

V. Tratamiento con anticuerpos Anti-ErbB2 Se contempla que, de acuerdo a la presente invención, los anticuerpos anti-ErbB2 pueden ser utilizados 5 para tratar diversas enfermedades o desórdenes. Las condiciones o desórdenes ejemplares incluyen tumores benignos o malignos; leucemias y malignidades linfoides; otros desórdenes tales como desórdenes neuronales, guales, astrocitales, hipotalámicos, glandulares, macrofágicos, 10 epiteliales, estromales, blastocólicos, inflamatorios, angiogénicos, e inmunológicos. En general, la enfermedad o el desorden que va a ser tratado es el cáncer. Los ejemplos de cánceres que van a ser tratados incluyen en la presente, pero no están limitados 15 a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, 20 cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de 25 hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de la cabeza y el cuello. El cáncer comprenderá en general células que expresan ErbB2, tal que el anticuerpo anti-ErbB2 en la presente es capaz de enlazarse al cáncer. Mientras que el cáncer puede ser caracterizado por la sobreexpresión del receptor de ErbB2 , la presente solicitud proporciona además un método para tratamiento del cáncer que no se considera que sea un cáncer que sobreexprese ErbB2. Para determinar la expresión de ErbB2 en el cáncer, son disponibles diversos ensayos de diagnóstico/de pronóstico. En una modalidad, la sobreexpresión de ErbB2 puede ser analizada por IHC, por ejemplo utilizando HERCEPTEST® (Dako) . Las secciones tisulares incrustadas en parafina, provenientes de una biopsia tumoralm, pueden ser sujetas al " ensayo de IHC y de acuerdo a los criterios de intensidad de tinción de la proteína ErbB2 , como sigue: Calificación 0 No se observa ninguna tinción o la membrana que se tiñe es observada en menos del 10% de las células tumorales.

A.

Calificación 1+ Una tinción membranal leve/escasamente perceptible es detectada en más de 10% de las células tumorales. Las células son únicamente teñidas en parte de su membrana.

Calificación 2+ Se observa una tinción membranal débil a moderada completa en más del 10% de las células tumorales.

Calificación 3+ Se observa una tinción membranal moderada a completa fuerte en más del 10% de las células tumorales.

Aquellos tumores con calificaciones de 0 ó 1+ para la evaluación de la sobreexpresión de ErbB2 pueden ser caracterizados como que no sobreexpresan ErbB2 , mientras que aquellos tumores con calificaciones de 2+ ó 3+ pueden ser caracterizados como que sobreexpresan ErbB2. Alternativa o adicionalmente, el análisis de FISH tal como el INFORM*" (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION™ (Vysis, Illinois) puede ser llevado a cabo sobre tejido tumoral incrustado en parafina, fijado con formalina, para determinar el grado (si lo hay) de sobreexpresión de ErbB2 en el tumor.

En una modalidad, el cáncer será uno que exprese (y pueda sobreexpresar) EGFR. Los ejemplos de cánceres que puedan expresar/sobreexpresar EGFR incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y del cuello. El cáncer que va a ser tratado en la presente puede ser uno caracterizado por activación excesiva de un receptor de ErbB, por ejemplo, EGRF. Tal activación excesiva puede ser atribuible a la sobreexpresión o producción incrementada del receptor de ErbB o un ligando de ErbB. En una modalidad de la invención, será realizado un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si el cáncer del paciente está caracterizado por la activación excesiva de un receptor de ErbB. Por ejemplo, la amplificación del gen ErbB y/o la sobreexpresión de un receptor de ErbB en el cáncer puede ser determinada. Diversos ensayos para la determinación de tal amplificación/sobreexpresión son disponibles en la técnica e incluyen los ensayos IHC, FISH y antígeno difundido, descritos anteriormente. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de un ligando ErbB, tal como TGF-a, en o asociado con el tumor, pueden ser determinados de acuerdo a procedimientos conocidos . Tales ensayos pueden detectar la proteína y/o el ácido nucleico que lo codifica, en la muestra que va a ser probada. En una modalidad, los niveles del ligando ErbB en el tumor pueden ser determinados utilizando inmunohistoquímica (IHC) ; ver por ejemplo, Scher y colaboradores, Clin . Cáncer Research 1:545-550 (1995). Alternativamente o adicionalmente, se pueden evaluar los niveles del ácido de nucleico que codifica para el ligando ErbB en la muestra que va a ser probada, por ejemplo vía FISH, manchado de southern, o técnicas de PCR. Además, la sobreexpresión o' amplificación del receptor de ErbB o el ligando ErbB pueden ser evaluadas utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo por ejemplo, mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se enlaza a la molécula que va a ser detectada y es marcada con un marcador detectable (por ejemplo un isótopo radioactivo) y explorando externamente al paciente para la localización del marcador. i.iil Donde el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de hormonas, la expresión de la hormona (por ejemplo andrógeno) y/o su receptor cognado en el tumor pueden ser evaluados utilizando cualquiera de los diversos ensayos 5 disponibles, por ejemplo, como se describe anteriormente. Alternativamente o adicionalmente, el paciente puede ser diagnosticado como poseedor del cáncer independiente de hormona ya que éste no responde más a la terapia con anti- andrógenos . 10 En ciertas modalidades, un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 conjugado con un agente citotóxico es administrado al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado y/o la proteína ErbB2 a la cual éste se enlaza, es o son internalizados por la célula, dando como 15 resultado la eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la muerte de la célula cancerosa a la cual éste se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Los ejemplos de tales agentes citotóxicos 20 incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. Los anticuerpos anti-ErbB2 o los inmunoconjugados son administrados a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa, por 25 ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua en un -X-'.-x i ***»*.- -, ?,i * periodo de tiempo, mediante las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o de inhalación. La administración intravenosa subcutánea del anticuerpo es preferida. Otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con la administrados del anticuerpo anti-ErbB2. La administración combinada incluye la co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica simple, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un periodo de tiempo mientras que ambos agentes activos (o todos) simultáneamente ejercen sus actividades biológicas. En una modalidad preferida, el paciente es tratado con dos diferentes anticuerpos anti-ErbB2. Por ejemplo, el paciente puede ser tratado con un primer anticuerpo anti- ErbB2 el cual bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB o un anticuerpo que tiene una característica biológica del anticuerpo monoclonal 2C4 así como un anticuerpo anti-ErbB2 el cual es inhibitorio del desarrollo (por ejemplo, HERCEPTIN®) o un anticuerpo anti-ErbB2 el cual induce la apoptosis de una célula que sobreexpresa ErbB2 (por ejemplo, 7C2 , 7F3 o variantes humanizadas de los mismos). Preferentemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinérgico. Se puede, por ejemplo, tratar al paciente con HERCEPTIN® y después de esto tratarlo con rhuMAb2C4, por ejemplo donde el paciente no responde a la terapia con el HERCEPTIN®. En otra modalidad, el paciente puede ser primeramente tratado con rhuMAb2C4 y luego recibir la terapia con el HERCEPTIN®. En otra modalidad más, el paciente puede ser tratado con rhuMab2C4 y el HERCEPTIN® simultáneamente . Puede ser también deseable combinar la administración del anticuerpo anti-ErbB2 o los anticuerpos, con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado al tumor. El otro anticuerpo en este caso puede, por ejemplo, enlazarse a EGRF, ErbB3 , ErbB4 , o al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . En una modalidad, el tratamiento de la presente invención involucra la administración combinada con un anticuerpo anti-ErbB2 (o anticuerpos) y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del desarrollo incluyendo la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. Los esquemas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser utilizados de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes o como se determinen empíricamente por el experto en la técnica. Los esquemas de __ s, £. £ preparación y dosificación para tal quimioterapia son también descritos en Chemotherapy Service Ed. , M.C.; Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo puede ser combinado con un compuesto anti -hormonal; por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifeno: una anti-progesterona tal como onapristona (ver, patente Europea EP 616812) ; o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para tales moléculas. Donde el cáncer que va a ser tratado es cáncer independiente de hormona, el paciente puede haber sido previamente sujeto a terapia anti-hormonal y, posteriormente el cáncer se vuelve independientemente de hormona, el anticuerpo anti-ErbB2 (y opcionalmente otros agentes como se describen en la presente) pueden ser administrados al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también coadministrar un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocardiaca asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Se puede también coadministrar un fármaco dirigido a EGRF o un agente angiogénico. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sujeto a eliminación quirúrgica de las células cancerosas y/o terapia con radiación. Los anticuerpos anti-ErbB2 en la presente pueden también ser combinados con un fármaco dirigido a EGRF tales como aquellos discutidos anteriormente en la sección de .. t 4 i definiciones dando como resultado un efecto terapéutico complementario y potencialmente sinérgico. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente son aquellas actualmente utilizadas, y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-ErbB2. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo es administrado para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente de una sola vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo es una dosis candidata e inicial para la administración al paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para la administración repetida en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento sostenido hasta que ocurre ..A. ._t .&.-*-.&. . s i i una supresión deseada de los síntomas deseados. La dosis preferida del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. De este modo, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) pueden ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, tal que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo anti-ErbB2) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas pueden ser administradas. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis semanal de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es fácilmente verificado por' técnicas y ensayos convencionales . A parte de la administración del anticuerpo proteico al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia con genes. Tal administración del ácido nucleico que codifica para el anticuerpo es abarcada por la expresión "administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo" .

Ver, por ejemplo, WO096/07321 publicado el 14 de Marzo de 1996 concerniente al uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos procedimientos mayores para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo . Para la administración in vivo el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio donde es requerido el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son retiradas, el ácido nucleico es introducido en estas células aisladas y las células codificadas son administradas al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas en el paciente (ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponible para introducir ácidos nucleicos en las células viables, las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a las células cultivadas in vi tro o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector ^^j^^¡^^&¿¡¡^ comúnmente utilizado para la administración ex vivo del gen es un retrovirus. Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo, actualmente preferidas incluyen la transfección con 5 vectores virales (tales como adenovirus, virus del Herpes simple I, o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de 10 ácido nucleico con un agente que se dirige a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para una receptor sobre la célula objetivo, etc. Donde son empleados liposomas, las proteínas que se enlazan a 15 una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis, pueden ser utilizadas para dirigir y/o para facilitar la captación por ejemplo, las proteínas de capside o de fragmentos de las mismas, trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que sufren 20 internalización en el ciclo, y proteínas que se dirigen a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptores es descrita, por ejemplo, por Wu y colaboradores, J. Biol . Chem. 262_4429-4432 (1987); y Wagner y 25 colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 87:3410-3414 (1990) . Para una revisión de la marcación del gen actualmente conocida y de los protocolos de terapia con genes ver Anderson y colaboradores, Science 256:808-813 (1993). Ver también WO 93/25673 y referencias citadas en ésta. 5 VI. Artículos de Fabricación En otra modalidad más de la invención, es proporcionado un artículo de fabricación que contiene 10 materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos anteriormente. El artículo de fabricación contiene un recipiente y una etiqueta o inserto de envase sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los 15 recipientes pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución 20 intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de poder hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-ErbB2. La etiqueta o inserto de envase indica que la composición es utilizada para el tratamiento de la condición de elección, tal como el 25 cáncer. En una modalidad, la etiqueta o los insertos de f__M_____ú____¡__á_t_¡i _ . . ..... _. .. .i r,. . ... .... .. . . ..--..„-.t*i envase indican que la composición que comprende el anticuerpo que se enlaza a ErbB2 puede ser utilizada para tratar el cáncer que expresa un receptor de ErbB seleccionado de un grupo que consiste del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ErbB3 y ErbB4 , preferentemente EGFR. Además, la etiqueta o el inserto de envase pueden indicar que el paciente que va a ser tratado es uno que tiene cáncer caracterizado por activación excesiva de un receptor de ErbB seleccionado de EGBR, ErbB3 o ErbB4. Por ejemplo, el cáncer puede ser uno que sobreexpresa uno de estos receptores y/o que sobreexpresa un ligando ErbB (tal como TGF-a) . La etiqueta o el inserto de envase puede también indicar que la composición pueda ser utilizada tratar el cáncer, en donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor de ErbB2. Por ejemplo, mientras que el presente inserto de envase para el HERCEPTIN® indica que el anticuerpo es utilizado para tratar a pacientes con cáncer de mama metastático, cuyos tumores sobreexpresan' la proteína ErbB2 , el inserto de envase en la presente puede indicar que el anticuerpo o la composición es utilizada para tratar al cáncer no obstante del grado de sobreexpresión de ErbB2. En otras modalidades, el inserto de envase puede indicar que el anticuerpo o la composición pueden ser utilizados para tratar cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama metastático) , cáncer independiente de hormonas; cáncer de próstata (por l.i, tJ SÍ.?. A H*_. < - jm ._.:*. . i t ejemplo, cáncer de próstata independiente de andrógenos) ; cáncer pulmonar (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de colon, rectal o colorrectal; o cualquiera de las otras enfermedades o desórdenes descritos en la presente. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en ésta, en donde la composición comprende un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el desarrollo de las células de cáncer que sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de envase que indica que la primera y segunda composiciones de anticuerpo pueden ser utilizadas para tratar el cáncer. Además, el inserto de envase puede instruir al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB) para terapia de combinación con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección precedente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un fármaco dirigido a EGFR, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti-hormonal, un cardioprotector y/o una citocina) . Alternativamente, o adicionalmente, el artículo A fc.* ? i í *.--.* . . i. i de fabricación puede contener además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Este puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

VII. Usos no Terapéuticos para el Anticuerpo Anti-ErbB2 Los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados) de la invención tienen además aplicaciones no terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser utilizados como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos son inmovilizados sobre una base sólida tal como una resina Sephadex o papel filtro; utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado es puesto en contacto con una muestra que contiene la proteína ErbB2 (o fragmento de la misma) que va a ser purificada y después de esto el soporte es lavado con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra, excepto en la proteína ErbB2 , la cual se enlaza al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte es lavado con otro _.. **_ &* . solvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteína ErbB2 del anticuerpo. Los anticuerpos anti-ErbB2 pueden también ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína ErbB2 , por ejemplo, la detección de su expresión en células específicas, tejidos o suero. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente será marcado con una porción detectable. Son disponibles numerosos marcadores los cuales pueden ser en general agrupados en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H, y 131I. El anticuerpo puede ser marcado con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology. Volúmenes 1 y 2, Coligen y colaboradores, Ed. Wiley Interscience, Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radioactividad puede ser medida utilizando conteo de cintilación. (b) Los marcadores fluorescentes tales como los quelatos de las tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas, son disponibles. Los marcadores fluorescentes pueden ser conjugados al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocol in Immunology, supra, por ejemplo. La i & ? ? A £ í ..2 -g f fluorescencia puede ser cuantificada utilizando un fluorímetro. (c) Diversos marcadores de enzima-sustrato son disponibles y la Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunos de éstos. La enzima cataliza en general una alteración química del sustrato cromogénico, que puede ser medida utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede ser medido espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Se describen anteriormente las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente es excitado electrónicamente por una reacción química y puede luego emitir luz que puede ser medida (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa-oxidasa, galactosa-oxidasa, y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa) , oxidasas *^^» . ».Í i heterocíclicas (tales como uricasa y xantina-oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a los anticuerpos son descritas en 0' Sullivan y colaboradores, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis) . Academic Press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peróxido de hidrógeno como un sustrato, en donde el peróxido de hidrógeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3', 5,5'-tretametilbencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo,' p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-ß-D-galactosidasa. Son disponibles otras numerosas combinaciones enzima-sustrato para aquellos expertos en la técnica. Para una revisión general de éstas, ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,275,149 y 4,318,980.

Algunas veces, el marcador es indirectamente conjugado con el anticuerpo. El experto en la técnica estará enterado de las diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualquiera de las tres categorías amplias de marcadores mencionadas anteriormente pueden ser conjugados con avidina, o viceversa. La biotina se enlaza selectivamente a la avidina, y de este modo, el marcador puede ser conjugado con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo es conjugado con un hapteno pequeño (por ejemplo digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente es conjugado con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina) . De este modo, la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo puede ser lograda) . En otra modalidad más de la invención, el anticuerpo anti-ErbB2 no necesita ser marcado, y la presencia del mismo puede ser detectada utilizando un anticuerpo marcado al cual se enlaza el anticuerpo ErB2. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocido, tales como los ensayos de enlace competitivos, los ensayos de emparedado directos e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipitación. & a I. ft Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Para la inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser fresca o congelada o puede ser incrustada en parafina y fijada con un preservador tal como formalina, por ejemplo. Los anticuerpos pueden también ser utilizados para los ensayos de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo es marcado con un radionúclido (tales como ?:L1In, "Te, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor puede ser localizado utilizando inmunocintiografía. Como un asunto de conveniencia, los anticuerpos de la presente invención pueden ser proporcionados en un equipo, por ejemplo, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Donde el anticuerpo es marcado con una enzima, el equipo incluirá los sustratos y cofactores requeridos para la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, pueden ser incluidos otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden ser variadas ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la , .-.Aaasiü . -sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden ser proporcionados como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en solución proporcionarán una solución reactiva que tiene la concentración apropiada.

VIII Depósito de Materiales Las siguientes líneas de células hibridomas han sido depositadas con la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC) : Designación del ATTC No. Fecha de Depósito Anticuerpo 7C2 ATCC HB- 12215 17 Octubre 1996 7F3 ATCC HB- 12216 17 Octubre 1996 4D5 ATCC CRL 10463 24 Mayo 1990 2 C4 ATCC HB- 12697 8 Abril 1999 Los detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación son expresamente incorporadas por referencia en la presente.

^^J^^^^^^í^íjj^ Ejemplo 1 Producción y Caracterización del Anticuerpo Monoclonal 2C4 Los anticuerpos monoclonales murinos 2C4, 7F3 y 4D5 los cuales se enlazan específicamente al dominio extracelular de ErbB2 fueron producidos como se describe en Fendly y colaboradores, Cáncer Research 50:1550-1558 (1990). En resumen, las células NIH 3T3/HER2-340_ (que expresan aproximadamente 1 x 105 moléculas de ErbB2/célula) producidas como se describe en Hudziak y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . (EUA) 84:7158-7163 (1987) fueron cosechadas con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 25 mM y se utilizaron para inmunizar los ratones BALB/c. Los ratones fueron administrados con inyecciones i.p. de 107 células en 0.5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisueros que inmunoprecipitaron ErbB2 marcado con 32P fueron administrados con inyecciones i.p. de un extracto membranal de ErbB2 purificado con aglutinina de germen de trigo-Sefarosa (WGA) en las semanas 9 y 13. Esto fue seguido por una inyección intravenosa de 0.1 ml de la preparación de ErbB2 y los esplenocitos fueron fusionados con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes de hibridoma fueron seleccionados para el enlace de ErbB2 por ELISA y radioinmunoprecipitación. .1 ÍJt -t -t. -._ Los epítopes de ErbB-2 enlazados por los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 fueron determinados mediante análisis de enlace competitivo (Fendly y colaboradores, Cáncer Research 50:1550-1558 (1990)). Los estudios de reticulación fueron realizados sobre los anticuerpos mediante fluorescencia directa sobre células intactas utilizando la máquina de selección PANDEX" para cuantificar la fluorescencia. Cada anticuerpo monoclonal fue conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) , utilizando procedimientos establecidos (Wofsy y colaboradores, Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel y Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980) ) . Las monocapas confluentes de las células NIH 3T3/HER2-34oo fueron tripsinizadas, lavadas una vez, y resuspendidas a 1.75 x 106 células/ml en PBS frío que contenía 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0.1% de NaN3. Una concentración final de partículas de látex al 1% (IDC, Pórtland, OR) fueron agregadas para reducir el taponamiento de las membranas de la placa PANDEXRM. Las células en suspensión, 20 µl , y 20 µl de los anticuerpos monoclonales purificados (100 µg/ml a 0.1 µg/ml) fueron agregadas a los pozos de la placa PANDEX11" e incubadas sobre hielo por 30 minutos, se agregó una dilución predeterminada de anticuerpos monoclonales marcados con FITC en 20 µl , a cada pozo, se incubaron por 30 minutos, se lavaron, y la fluorescencia fue _i ___m___?___ ....... .. a -- . ?? cuantificada por PANDEX . Se consideró que los anticuerpos monoclonales compartían una epítope si cada uno bloqueó el enlace del otro por 50% o más, en comparación a un control de anticuerpo monoclonal irrelevante. En este experimento los 5 anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 fueron asignados con los epítopes I, G/F y F, respectivamente. Las características inhibitorias del desarrollo o crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5 fueron evaluadas utilizando la línea de células tumorales de 10 mama, SK-BR-3 (ver Hudziak y colaboradores, Molec . Cell . Biol . 9(3) .1165-1172 (1989)). En resumen, las células SK-BR- 3 fueron desprendidas mediante el uso de 0.25% de tripsina (vol/vol) y suspendidas en el medio completo a una densidad de 4 x 105 células por ml . Las alícuotas de 100 µl (4 x 104 15 células) fueron colocadas en placas de microdilución de 96 pozos, las células se dejaron adherir, y 100 µl del medio solo o el medio que contenía el anticuerpo monoclonal (concentración final de 5 µg/ml) fueron ' agregados . Después de 72 horas, las placas fueron lavadas dos veces con PBS (pH 20 7.5), teñidas con cristal violeta (0.5% en metanol), y analizadas para la proliferación relativa de células como se describe en Sugarman y colaboradores, Science 230:943-945 (1985) . Los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 inhibieron la proliferación celular relativa de SK-BR-3 por aproximadamente 25 20% y por aproximadamente 38%, respectivamente, en *"WW-atí'-l comparación a aproximadamente 56% de inhibición lograda con el anticuerpo monoclonal 4D5. Los anticuerpos monoclonales 2C4, 4D5 y 7F3 fueron evaluados para su habilidad de inhibir la fosforilación de la tirosina estimulada por HRG, de las proteínas en el intervalo de Mr 180,000 a partir de lisados de células completas, de células MCF7 (Lewis y colaboradores, Cáncer Research 56:1457-1465 (1996) ) . Se reporta que las células MCF7 expresan todos los receptores de ErbB conocidos, pero a niveles relativamente bajos. Ya que ErbB2 , ErB3 y ErbB4 tienen tamaños moleculares casi idénticos, no es posible discernir cuál proteína se está llegando a fosforilar en la tirosina cuando son evaluados los lisados de células completas por análisis de manchado de Western. No obstante, estas células son ideales para los ensayos de fosforilación de tirosina de HRG, debido a que bajo las condiciones de ensayo utilizadas, en ausencia del HRG exógenamente agregado, éstas muestran niveles bajos a indetectables de proteínas con fosforilación de tirosina en el intervalo de Mr de 180,000. Las células MCF7 fueron sembradas en placas de 24 pozos y se agregaron los anticuerpos monoclonales para el ErbB2 a cada pozo, y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente; luego se agregó rHRGßl?77.24 a cada pozo hasta una concentración final de 0.2 nM, y la incubación se ¿_ _»Ü.i ? i continuó por 8 minutos. Los medios fueron cuidadosamente aspirados de cada pozo, y las reacciones se detuvieron por la adición de 100 µl del amortiguador de muestra de SDS (5% de SDS, DTT 25 mM, y Tris-HCl 25 mM, pH 6.8). Cada muestra de 25 µl fue sometida a la electroforesis sobre un gel en gradiente de 4-12% (Novex) y luego se transfirieron electroforéticamente a la membrana de difluoruro de polivinilideno. Se desarrollaron inmunomanchados de antifosfotirosina (4G10, de UBI, utilizado a 1 µg/ml) y la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr aproximadamente de 180,000 fue cuantificada por densitometría de reflectancia como se describe previamente (Holmes y colaboradores, Science 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski y colaboradores, J. Biol . Chem . 269:14661-14665 (1995) ) . Los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5, inhibieron significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosina inducida por HRG, a Mr de 180,000. En ausencia de HRG, ninguno de estos anticuerpos fue capaz de estimular la fosforilación de tirosina de las proteínas en el intervalo de Mr de 180,000. Estos anticuerpos tampoco reaccionan cruzadamente con EFGR (Frendly y colaboradores, Cáncer Research 50:1550-1558 (1990)), ErbB3 o ErbB4. Los anticuerpos 2C4 y 7F3 inhibieron significativamente la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 yj^j^^^ ¿^¿¡^^ a <25% del control. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de bloquear la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina por aproximadamente 50%. La figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina pl80 como se determinó por densitometría de reflectancia. La evaluación de estas curvas de inhibición utilizando un ajuste de 4 parámetros, produjo una IC50 de 2.8 ± 0.7 nM y 29.0 ± 4.1 nM para 2C4 y 7F3 , respectivamente. La inhibición del enlace de HRG a las líneas celulares de tumor de mama MCF7 por los anticuerpos anti- ErbB2 fueron realizadas con cultivos en monocapas sobre hielo en un formato de placa de 24 pozos (Lewis y colaboradores, Cáncer Research 56:1457-1465 (1996)). Los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 fueron agregados a cada pozo y se incubaron por 30 minutos. El rHRGßl?77-224 marcado con 125I (25 pm) fue agregado, y la incubación fue continuada por 4-16 horas. La figura 2B proporciona las curvas de dosis- respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 del enlace HRG a las células MCF7. Concentraciones variantes de 2C4 o 7F3 fueron incubadas con las células MCF7 en presencia de rHRGßl marcado con 125I, y las curvas de inhibición son mostradas en la figura 2B. El análisis de estos datos produjo una IC50 de 2.4 ± 0.3 nM y 19.0 ± 7.3 nM para 2C4 y 7F3 , respectivamente. Una inhibición máxima de aproximadamente 74% para 2C4 y 7F3 estuvieron en concordancia con los datos de fosforilación de la tirosina. Para determinar si el efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 observados sobre las células MCF7 fue un fenómeno general, las líneas de células tumorales humanas fueron incubadas con 2C4 y 7F3 y se determinó el grado específico de enlace de rHRGßl marcado con 125I (Lewis y colaboradores, Cáncer Research 56:1457 1465 (1996)). Los resultados de este estudio son mostrados en la figura 3. El enlace de rHRGßl marcado con 121I pudo ser significativamente inhibido ya sea por 2C4 o 7F3 en todas las líneas celulares, con la excepción de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, que se ha reportado expresa poco o nada de ErbB2. Se reporta que las líneas celulares remanentes expresan ErbB2 , con el nivel de expresión de ErbB2 que varía ampliamente entre estas líneas celulares. De hecho, el intervalo de expresión de ErbB2 en las líneas celulares probadas, varía por más de 2 órdenes de magnitud. Por ejemplo, BT-20, MCF7' y Caov3 expresan aproximadamente 104 receptores de ErbB2/célula, mientras que BT-474 y SK-BR-3 expresan aproximadamente 106 receptores de ErbB2/célula. Dado el amplio intervalo de expresión de ErbB2 en estas células y los datos anteriores, se concluyó que la interacción entre ErbB2 y ErbB3 o ErbB4 , fue por sí misma una interacción de alta afinidad que tiene lugar sobre la superficie de la membrana plasmática.

Fueron evaluados los efectos inhibitorios del desarrollo o crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre las células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o ausencia de rHRGßl exógeno (Schaefer y colaboradores, Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Los niveles de ErbB2 en las células MDA-MB-175 son 4-6 veces más altos que el nivel encontrado en las células epiteliales de mama, normales y el receptor ErbB2-ErbB4 está constitutivamente fosforilado en la tirosina en las células MDA-MB-175. Las células MDA-MB-175 fueron tratadas con los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2, 2C4 y 4D5 (10 µg/ml) por 4 días. En un ensayo de tinción con cristal violeta, la incubación con 2C4 mostró un fuerte efecto inhibidor del crecimiento sobre esta línea celular (figura 4A) . El HRG exógeno no revertió significativamente esta inhibición. Por otra parte 2C4 no reveló efecto inhibitorio sobre la línea celular SK-BR-3 que sobreexpresa ErbB2 (figura 4B) . El anticuerpo monoclonal 2C4 fue capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 a un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5 en presencia y en ausencia de HRG exógeno. La inhibición de la proliferación celular por 4D5 es dependiente del nivel de expresión de ErbB2 (Lewis y colaboradores, Cáncer I munol . Immunother. 37:255-263 (1993)). Una inhibición máxima del 66% en las células SK-BR-3 pudo ser detectada (figura 4B) . No obstante, este efecto pudo ser superado por HRG exógeno.

Ejemplo 2 La Asociación de ErbB2 con ErbB3 , Dependiente de HRG, es Bloqueada por el Anticuerpo Monoclonal 2C4 5 La habilidad de ErbB3 para asociarse con ErbB2 fue probada en un experimento de co-inmunoprecipitación. 1.0 x 106 células MCF7 o SK-BR-3 fueron sembradas en seis placas de cultivo de tejidos en medio DMEM/F12 de Ham 50:50 que 10 contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) y HEPES 10 mM, pH 7.2 (medio de crecimiento), y se dejó acoplar toda la noche. Las células fueron sometidas a inanición por 2 horas en el medio de crecimiento sin suero antes del comienzo del experimento . 15 Las células fueron lavadas brevemente con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y luego incubadas ya sea con 100 nM del anticuerpo indicado diluido en albúmina sérica bovina al 0.2% p/v (BSA), medio RPMI , con HEPES 10 mM, pH 7.2 (amortiguador de enlace) , o con el amortiguador de enlace 20 sólo (control) . Después de una hora a temperatura ambiente, se agregó HRG hasta una concentración final de 5 mM a la mitad de los pozos (+) . Un volumen similar del amortiguador de enlace fue agregado a los otros pozos (-). La incubación fue continuada por aproximadamente 10 minutos.

Los sobrenadantes fueron removidos por aspiración y las células fueron lisadas en RPMI, HEPES 10 Mm, pH 7.2 , 1.0% v/v de TRITÓN X-lOO , 1.0% p/v de CHAPS (amortiguador de lisis), que contenía PMSF 0.2 mM, 10 µg/ml de leupeptina, y 10 TU/ml de aprotinina. Los lisados fueron despejados del material insoluble mediante centrifugación. ErbB2 fue inmunoprecipitado utilizando un anticuerpo monoclonal covalentemente acoplado a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Science) reconoce un epítope de dominio citoplásmico. La inmunoprecipitación fue realizada mediante la adición de 10 µl de la suspensión del gel que contenía aproximadamente 8.5 µg de anticuerpo inmovilizado a cada lisado y las muestras se dejaron mezclar hasta la temperatura ambiente por 2 horas. Los geles fueron luego recolectados mediante centrifugación. Los geles fueron lavados en lotes tres veces con amortiguador de lisis para eliminar el material no enlazado. El amortiguador' de muestra SDS fue luego agregado y las muestras fueron calentadas brevemente en un baño de agua a ebullición. Los sobrenadantes fueron corridos sobre geles de 4-12% de poliacrilamida y sometidos a electromanchados sobre membranas de nitrocelulosa. La presencia de ErbB3 fue evaluada mediante el sondeo de las manchas con un anticuerpo monoclonal contra un epítope del dominio citoplásmico del atu»*» . mismo (c-17, Santa Cruz Biotech.) Los manchados fueron visualizados utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL, Amersham) . Como se muestra en las bandas control de las 5 figuras 5A y 5B, para las células MCF7 y SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 estuvo presente en un inmunoprecipitado de ErbB2 únicamente cuando las células fueron estimuladas con HRG. Si las célula fueron primeramente incubadas con el anticuerpo monoclonal 2C4, la 10 señal de ErbB3 fue abolida en las células MCF7 (figura 5a, banda 2C4+) o sustancialmente reducida en las células SK-BR-3 (Figura 5B, banda 2C4+) . Como se muestra en las figuras 5A- B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociación de ErbB3 dependiente de herregulina con ErbB2 en células MCF7 y 15 SK-BR-3 sustancialmente de manera más efectiva que HERCEPTIN®. La preincubación con HERCEPTIN® disminuyó la señal de ErbB3 en los lisados de MCF7, pero tuvo poco o ningún efecto sobre la cantidad de Erb'B3 co-precipitado a partir de los lisados de SK-BR-3. La preincubación con un 20 anticuerpo con el receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) no tuvo efecto sobre la habilidad de ErbB3 para co- inmunoprecipitar con ErbB2 en cualquier línea celular.

Ejemplo 3 Anticuerpos 2C4 Humanizados 5 Los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino 2C4 fueron primeramente clonados dentro de un vector el cual permite la producción de un fragmento Fab quimérico de ratón/humano. El ARN total fue aislado de las células de hibridoma utilizando un equipo de extracción de ARN de 10 Stratagene siguiendo los protocolos del fabricante. Los dominios variables fueron aplicados mediante RT-RCR purificados en gel, e insertados dentro de un derivado de un plásmido basado en pUC119 que contenía un dominio constante kappa humano, y el dominio CH1 humano, como se describió 15 previamente (Cárter y colaboradores, PNAS (EUA) 89:4285 (1992); y la Patente de los Estados Unidos No. 5,821,337). El plásmido resultante fue transformado en E. coli cepa 16C9 para la expresión del fragmento Fab. El crecimiento de los cultivos, y la inducción de la expresión de la proteína y la 20 purificación del fragmento Fab fueron como se describió previamente (Werther y colaboradores, J". Immunol . 157:4986- 4995 (1996) ; Presta y colaboradores, Cáncer Research 57:4593:4599 (1997) ) . El fragmento Fab de 2C4 quimérico, purificado fue 25 comparado al anticuerpo progenitor murino 2C4 con respecto a ,^.-¿,-.-,a...alg|g su habilidad para inhibir el enlace de 125I-HRG a las células MCF7 e inhibir la activación de rHRG de la forsforilación de la tirosina pl80 en células MCF7. Como se muestra en la figura 6a, el fragmento Fab 2C4 es muy efectivo en perturbar la formación del sitio de enlace de ErbB2-ErbB3 de alta afinidad sobre la línea de células cancerosas de mama humanas, MCF7. El valor de IC50 relativo, calculado para 2C4 murino intacto es de 4.0 ± 0.4 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es de 7.4 ± 1.1 nM. Como se ilustra en la figura 6B, el fragmento 2C4 quimérico monovalente es muy efectivo en perturbar la activación de ErbB2-ErbB3 dependiente de HRG. El valor de IC50 calculado para el anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 es 6.0 + 2 nM, mientras el valor para el fragmento Fab es de 15.0 ± 2 nM. El secuenciamiento del ADN del clon quimérico permitió la identificación de los residuos de CDR (Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public. Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (figuras 7A y B) . Utilizando la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido, todas estas seis regiones de CDR fueron introducidas dentro de una estructura humana completa (subgrupo I de VL kappa y subgrupo III de VH) contenida en el plásmido VX4 como se describió previamente (Presta y colaboradores, Cáncer Research 57:4593-4599 (1997)). La proteína proveniente del "trueque de CDR" resultante fue expresada y purificada como se describe anteriormente. Los estudios en enlace fueron realizados para comparar las dos versiones. En resumen, una placa NUNC MAXISORP fue recubierta con 1 microgramo por ml del dominio extracelular del ErbB2 (ECD; producido como se describe en WO 90/14357) en amortiguador de carbonato 50 mM; pH 9.6, toda la noche a 4°C, y luego bloqueado con el diluyente de ELISA (0.5% de BSA, 0.05% de polisorbato 20, PBS) a temperatura ambiente por 1 hora. Diluciones en serie de las muestras en el diluyente de ELISA fueron incubadas sobre placas por 2 horas. Después del lavado, el fragmento Fab enlazado fue detectado con el anticuerpo anti-kappa humano, murino, biotinilado (ICN-63471) seguido por la peroxidasa de rábano conjugada a la extreptavidina (Sigma) y utilizando 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (Kirkergard and Perry Laboratories Gaithersburgt, MD) como un sustrato. La absorbancia fue leída a 450 nm. Como se muestra en la figura 8A, todo el enlace se perdió en la construcción del Fragmento Fab humano con trueque de CDR. Para restaurar el enlace del Fab humanizado, los mutantes fueron construidos utilizando el ADN proveniente del trueque de CDR como plantilla. Utilizando un modelo generado por computadora (Figura 9) , estas mutaciones fueron diseñadas para cambiar los residuos de la región estructural humana a sus contrapartes murinas en las posiciones donde el cambio ¿^^^^^^^^ . -i -i. t r t i puede afectar las conformaciones de CDR o la interfaz anticuerpo-antígeno. Los mutantes se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 Designación de las Mutaciones FR de 2C4 Las curvas de enlace para los diversos mutantes se muestran en las Figuras 8A-C. La versión 574 de Fab, humanizada, con los cambios ArgH71Val, AspH73Arg e IleH69Leu, parece tener enlace restaurado a aquel del fragmento Fab de 2C4 quimérico, original. Los residuos FR y/o CDR adicionales, tales como L2 , L54, L55, L56, H35 y/o H48, pueden ser modificados (por ejemplo sustituidos como sigue IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; y A,, a. a fri- a ValH48Ile) con el fin de refinar adicionalmente o mejorar el enlace del anticuerpo humanizado. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede ser madurado por afinidad (ver arriba) con el fin de mejorar adicionalmente o refinar su afinidad y/o las actividades biológicas. La versión 574 de 2C4 humanizado, fu madurada por afinidad utilizando un método de representación visual de fago. En resumen, el Fab 2C4.574 humanizado fue clonado dentro de un vector de representación visual de fago como una fusión del genlll. Cuando las partículas fago son inducidas por infección con el fago cooperador M13K07, esta fusión permite que el fab sea mostrado sobre el extremo N del geniII de la proteína de fibra de cola del fago (Baca et al., J". Biol . Chem. 272: 10678 (1997)). Se construyeron genotecas individuales para cada uno de las 6 CDRs identificadas anteriormente. En estas genotecas, los aminoácidos en las CDRs fueron identificados utilizando un modelo generado por computadora (Figura 9) que al ser potencialmente significativos en el enlace para ErbB2 , fueron aleatorizados utilizando los oligos que contienen "NNS" como sus codones. Las genotecas fueron luego representadas panorámicamente para ECD de ErbB2 recubiertos sobre placas NUNC MAXISORPMR con 3% de leche en polvo en PBS con 0.2% de TWEEN 20® (MPBST) utilizado en lugar de todas las ia.i soluciones de bloqueo. Con el fin de seleccionar el fago con afinidades más altas que aquellas de 2C4.574, en las rondas 3, 4 y 5 de representanción panorámica, el ECD de ErbB2 soluble o Fab 2C4.574 fue agregado durante los pasos de lavado, como competidor. Los tiempos de lavado fueron extendidos a 1 hora a temperatura ambiente . Después de 5 rondas de representación panorámica, los clones individuales fueron nuevamente analizados por ELISA de fago. Los clones individuales fueron desarrollados en placas de cultivo de tejido de fondo en U, de 96 pozos, Costar, y los fagos fueron inducidos por la adición del fago cooperador. Después del desarrollo de toda la noche, las células de E. coli fueron concentradas por centrifugación, y los sobrenadantes que contenían el fago fueron transferidos a placas de 96 pozos donde los fagos fueron bloqueados con MPBST por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas NUNC MAXIS0RPMR recubiertas con ErbB2 ECD fueron también bloqueadas con MPBST como se describió anteriormente. Los fagos bloqueados fueron incubados sobre las placas por 2 horas. Después del lavado, los fagos enlazados fueron detectados utilizando el anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado a peroxidasa de rábano (Amersam Pharmacia Biotech., Inc. '27-942-01) diluido 1:5000 en MPBST, seguido por 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina como sustrato. La absorbancia fue leída a 450 nm.

Los 48 clones provenientes de cada genoteca que dio las señales más altas, fueron secuenciados por ADN. Aquellos clones cuyas secuencias aparecían más frecuentemente fueron subclonados dentro del vector descrito anteriormente, el cual permite la expresión de los Fabs solubles. Estos Fabs fueron inducidos, las proteínas purificadas y los Fabs purificados fueron analizados para el enlace por ELISA como se describe anteriormente, y el enlace fue comparado a aquel de la versión 2C4.574 humanizada, inicial. Después de que se identificaron mutaciones interesantes en las CDRs individuales, los mutantes adicionales que fueron diversas combinaciones de éstos fueron construidas y probadas como se describe anteriormente. Los mutantes que dieron enlace mejorado con relación a 574 se describen en la Tabla 3.

TABLA 3 Designación de los mutantes derivados de la maduración por afinidad de 2C4.574 Nombre del Mutante Cambio de 574 Mutante/574* H3.A1 serH99trp, metH34leu 0.380 L2.F5 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu 0.087 H1.3.B3 thrH28gln, thrH30ser, metH34leu 0.572 L3. G6 tyrL92pro, ?leL93lys, metH34leu 0.569 L3.G11 tyrL92ser, ?leL93arg, tyrL94gly, 0.561 metH34leu L3.29 tyrL92phe, tyrL96asn, metH34leu 0.552 L3.36 tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro, 0.215 metH34leu 654 serL50trp, metH34leu 0.176 655 metH34ser 0.542 659 serL50trp, metH34ser 0.076 L2.F5.H3.A1 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, 0.175 serH99trp L3G6.H3.A1 tyrL92pro, ileL931ys, metH34leu, 0.218 serH99trp H1_3B3.H3.A1 thrH28gln, thrH30ser, metH34leu, 0.306 serH99trp L3.G11.H3.A1 tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly, 0.248 metH34leu, serH99trp 654.H3.A1 serL50trp, metH34leu, serH99trp 0.133 654.L3.G6 serL50trp, metH34leu, tyrL92pro, 0.213 ?leL931ys 654.L3.29 serl50trp, metH34leu, tyrL92phe, 0.236 tyrL96asn 654.L3.36 serL50trp, metH35leu, tyrL92phe, 0.141 tyrL94leu, tyrL96pro ±^ t^^j^é^^^^kto^ ??^¡^ * Proporción de la cantidad de mutante, necesaria para dar la DO intermedia de la curva estándar a la cantidad de 574 necesaria para dar la DO intermedia de la curva estándar en una ELISA para ErbB2-ECD. Un número menor de 1.0 indica que el mutante se enlaza a ERbB2 mejor que lo que se enlaza a 574.

Los siguientes mutantes han sido también construidos, y están actualmente bajo evaluación: 659.L3.G6 serL50trp, metH34ser, tryL92pro, ileL931ys 659. L3. Gil serL50trp, metH34ser, tryL92ser, ile93arg, tyrL94gly 659.L3.29 serL50trp, metH34ser, tryL92phe, tyrL96asn 659.L3.36 serL50trp, metH34ser, tryL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro L2F5.L3G6 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92?ro, ileL931ys L2F5.L3G11 serL50tr?, tyrL53gly, metH341eu, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly L2F5.L29 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn L2F5.L36 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrl96pro L2F5.L3G6.655 serL50trp, tyrL53gly, metH35leu, tyrL92pro, i lA ileL931ys L2F5.L3G11.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly L2F5.L29.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn L2F5.L36.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro Los siguientes mutantes, sugeridos por una exploración de homología, están siendo actualmente construidos : 678 thrH30ala 679 thrH30ser 680 lysH64arg 681 leuH96val 682 thrL97ala 683 thrL97ser 684 tyrL96phe 685 tyrL96ala 686 tyrL56ala 687 thrL56ala 688 glnL28ala 689 glnL28glu i»* -,^-^.j- El aminoácido preferido en H34 podría ser metionina. Un cambio a leucina puede ser realizado si se encontrara que existe oxidación en esta posición. AsH52 y asnH53 fueron encontrados como fuertemente preferidos para el enlace. Cambiando estos residuos a alanina o ácido aspártico se disminuye dramáticamente el enlace . Ha sido preparado un anticuerpo intacto que comprende los dominios ligero y pesado variables de la versión humanizada 574, con una región constante de cadena pesada de IgGl humana (ver Patente de los Estados Unidos No. 5,821,337). El anticuerpo intacto es producido por las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) . Esa molécula es designada rhuMAb 2C4 en la presente.

Ejemplo 4 El Anticuerpo Monoclonal 2C4 Bloquea la 'Activación de MAPK Mediada por EGF, TGF-a o HRG Muchos receptores del factor de crecimiento señalan a través de la vía de la cinasa proteica activada por mitógeno (MAPK) . Estas cinasas de especificidad doble son uno de los puntos finales clave en las vías de transducción de señal que al final disparan las células cancerosas para ^^^^^^¿^^l=^ a^^^jgág^g^ que se dividan. La habilidad del anticuerpo monoclonal 2C4 o HERCEPTIN® para inhibir la activación de MAPK mediada por EGF, TGF-a o HRG, fue evaluada de la siguiente manera. Las células MCF7 (105 células/pozo) fueron sembradas en placa en medios que contenían suero en placas de cultivo de células de 12 pozos. Al siguiente día, el medio celular fue retirado y el medio fresco que contenía 0.1% de suero fue agregado a cada pozo. Este procedimiento fue luego repetido al siguiente día y antes del ensayo el medio fue reemplazado con amortiguador de enlace libre de suero (Jones et al., J. Biol . Chem. 273: 11667-74 (1998); y Schaefer et al., J. Biol . Chem . 274: 859-66 (1999)). Las células se dejaron equilibrar hasta la temperatura ambiente y luego se incubaron por 30 minutos con 0.5 ml de HERCEPTIN® 200 nM o el anticuerpo monoclonal 2C4. Las células fueron luego tratadas con EGF 1 nM, TGF-a 1 nM o HRG 0.2 nM por 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la aspiración del medio celular y agregando luego 0.2 ml del amortiguador' de muestra de SDS-PAGE que contenía 1% de DTT. La activación de MAPK fue evaluada mediante manchado de Western utilizando un anticuerpo anti -MAPK activo (Promega) como se describió previamente (Jones et al., J. Biol . Chem. 273: 1667-74 (1998) ) . Como se muestra en la Figura 10, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea significativamente la activación de Jt & .?. Í. . m.il MAPK mediada por EGF, TGF-a, y HRG, a un grado mayor que HERCEPTIN®. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 2C4 se enlaza a una superficie de ErbB2 que es utilizada para su asociación ya sea con EGF y ErbB3 , y previene de este modo la formación del complejo receptor de señalización. Se mostró también que el anticuerpo monoclonal 2C4 inhibe la activación de Akt dependiente de la herregulina (HRG) . La activación de la vía de transducción de la señal de la cinasa PI3 es importante para la supervivencia de las células (Carraway et al., J. Biol . Chem. 270: 7111-6 (1995)). En células tumorales, la activación de la cinasa PI3 puede jugar un papel en el fenotipo invasor (Tan et al., Cáncer Research . 59: 1620-1625 (1999)). La vía de supervivencia es principalmente mediada por la serina/cinasa de treonina AKT (Bos et al., Trends biochem . Sci . 20: 441-442 (1995). Los complejos formados entre ErbB2 y cualquiera de ErbB3 o EGFR pueden iniciar estas vías en respuesta' a la herregulina o EGF, respectivamente (Olayioye et al., Mol . & Cell . Biol . 18: 5042-51 (1998); Karunagaran et al., EMBO Journal , 15: 254-264 (1996); y Krymskaya et al., Am. J. Physiol . 276: L246-55 (1999)) . La incubación de las células de cáncer de mama MCF7 con 2C4 inhibe la activación de AKT mediada por la herregulina. Además, el nivel basal de la activación de AKT presente en ausencia de la adición de herregulina es además I? i ? d. ^ .?.Jb?t? t.1 ^ J»JO» _ é. *-.£ -fc reducida por la adición de 2C4. Estos datos sugieren que 2C4 puede inhibir la activación del ligando ErbB2 de la cinasa PI3 y que esta inhibición puede conducir a la apoptosis. La sensibilidad incrementada a la apoptosis puede manifestarse en una mayor sensibilidad de las células tumorales a los efectos tóxicos de la quimioterapia. De este modo, el anticuerpo monoclonal 2C4 inhibe la señalización de ErbB iniciada por el ligando, a través de dos vías de transducción de señal mayores- cinasa MAP (una vía proliferativa mayor) y cinasa PI3 (una vía mayor de supervivencia/anti -apoptótica) .

Ejemplo 5 Combinación del Anticuerpo Monoclonal 2C4 y HERCEPTIN® in vivo Un modelo de xenoinjerto utilizando la línea de células de adenocarcinoma de pulmón, Calu-3, fue utilizado para evaluar la eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-HER2, ya sea solos o en combinación, para suprimir el desarrollo tumoral. Ratones desnudos NCR hembra fueron inoculados subcutáneamente con 20 x 106 células en 0.1 ml . Las mediciones tumorales fueron tomadas dos veces por semana y cuando los nodulos tumorales alcanzaron un volumen de 10 mm3, los animales fueron repartidos aleatoriamente a 7 grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron: a) anticuerpo monoclonal control, MAb 1766; b) HERCEPTIN®, 10 mg/kg; c) anticuerpo monoclonal 7c2, 10 mg/kg; d) anticuerpo monoclonal 2C4, 10 mg/kg; e) HERCEPTIN® y 7C2, cada uno a 10 mg/kg; f) HERCEPTIN® y 2C4, cada uno a 10 mg/kg; y g) anticuerpos monoclonales 2C4 y 7C2, cada uno a 10 mg/kg. Los animales fueron tratados dos veces por semana hasta el día 24. Los volúmenes tumorales fueron medidos dos veces por semana hasta el día 38. Como se muestra en el diagrama de barras en la figura 11, el tratamiento de los ratones que poseen el tumor Calu3 con 2C4 o HERCEPTIN® inhibieron significativamente el desarrollo de los tumores. La combinación de HERCEPTIN® y 2C4 o HERCEPTIN® y 7C2 fue superior a cualquier anticuerpo monoclonal administrado solo.

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Ejemplo 6 Tratamiento del Cáncer Colorectal con el Anticuerpo Monoclonal 2C4 Las líneas de células colorrectales humanas tales como HCA-7, LS174T o CaCo-2 son implantadas subcutáneamente en ratones desnudos atímicos como se describe en Sheng et al., J". Clin . Invest . 99: 2254-2259 (1997). Una vez que los tumores son establecidos a aproximadamente 100 mm3 en volumen, los grupos de animales son tratados con 10-50 mg/kg del anticuerpo monoclonal 2C4 administrado dos veces a la semana mediante inyección en la cavidad intraperitoneal . El anticuerpo monoclonal 2C4 suprime el desarrollo de los xenoinjertos colorectales in vivo .

Ejemplo 7 Tratamiento del Cáncer de Mama con 2C4 Humanizado El efecto de rhuMAb 2C4 o HERCEPTIN® sobre las células de cáncer de mama humano que no sobreexpresan ErbB2 , fue evaluado en un ensayo de azul Alamar de 3 días (Ahmed, S.A., J". Immunol . Methods 170: 211-224 (1994); y Page et al., Int. J. Oncol . 3: 473-476 (1994)). Las células utilizadas en este ensayo fueron las células de cáncer de mama humano MDA-175, que expresan ErbB2 a un nivel de 1+. Como se muestra en la Figura 12, el crecimiento de la línea de células de cáncer de mama, MDA-175, es significativamente inhibido de una manera dependiente de la dosis por la adición de rhuMAb 2C4 en comparación al tratamiento con HERCEPTIN®. Fue evaluada la eficacia de rhuMAb 2C4 contra los xenoinjertos de MCF7 que son positivos al receptor de estrógeno (ER+) y que expresan bajos niveles de ErbB2. Se utilizaron ratones hembra suplementados con estrógeno. Se administró rhuMAb 2C4 a una dosis de 30 mg/kg cada semana. Como se muestra en la Figura 13, rhuMAb 2C4 fue efectivo para inhibir el desarrollo del tumor de cáncer de mama in vivo, donde el cáncer de mama no estuvo caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2.

Ejemplo 8 Farmacocinética, Metabolismo y Toxicología de 2C4 rhuMAb 2C4 fue estable en suero humano. No se observó evidencia o agregados de la formación del complejo en las matrices biológicas. En ratones, rhuMAb 2C4 se despejó más rápido que HERCEPTIN®. Los estudios farmacocinéticos indican que la administración semanal de aproximadamente 2-6 ,, *& J * i __-.,. mg/kg de rhuMAb 2C4 debe dar como resultado concentraciones en suero similares a HERCEPTIN® como se dosifica actualmente. La exposición a 2C4 sérico, resultante debe exceder en gran medida la IC50 determinada in vi tro. Se llevó a cabo un estudio de toxicología en monos cynomolgus (2 hembras y 2 machos por grupo) . Se administró rhuMAb 2C4 intravenosamente a 0, 10, 50 ó 100 mg/kg dos veces a la semana por 4 semanas. Las mediciones del estudio de toxicología incluyeron los pesos corporales (-2, -1 semanas y semanalmente después de éstos) ; consumo de alimento (cualitativo, diariamente) ; exámenes físicos con evaluación de la presión sanguínea, electrocardiograma (ECG) , y temperatura corporal (-2, -1 semanas y las semanas 2 y 4, 4 horas después de la dosis después de esa segunda dosis semanal) ; evaluaciones cardiacas por ultrasonido (después de la semana 1 de dosis y al final del estudio, semana 4); patología clínica (línea base y fin de las semanas 2 y 4) ; análisis de orina (línea base y fin de 'las semanas 2 y 4) ; toma de muestra de análisis de anticuerpo (línea base y fin de las semanas 2 y 4) ; así como necropsia y análisis de histopatología . Todos los animales en todos los grupos sobrevivieron al final del estudio. No se notaron observaciones clínicas significativas o diferencias entre grupos. Los resultados de la necropsia no mostraron >t. i._? *.*.*. . ::.. ..... ... J..«. _, . ..Á anormalidades burdas significativas en órganos provenientes de cualesquiera animales. No se observaron anormalidades microscópicas significativas en tejidos provenientes de cualquiera de los animales. No se notaron cambios significativos en ECG desde el inicio hasta la terminación del estudio. Además, no se observaron diferencias entre los grupos .

Ejemplo 9 Elevación de Escala de la Dosis Pacientes con cáncer son administrados con una primera dosis de rhuMAb 2C4 a uno de cinco niveles de dosis (0.05, 0.5, 2.0, 4.0 ó 10 mg/kg; 6 sujetos por nivel de dosis), seguido por un lavado de cuatro semanas. A la semana 5 se les administra a los pacientes la misma dosis 4 veces por semana, seguido por un lavado adicional de 4 semanas. Los pacientes con respuesta completa, respuesta parcial o enfermedad estable son elegibles para los estudios de extensión. fa.i i— . ... i . í.,í.__... . ..a.

Ejemplo 10 Terapia de Cáncer de Próstata Metastático con Reincidencia o Refractario RhuMAb 2C4 es un anticuerpo monoclonal humanizado, de longitud completa (producido en células CHO) dirigido contra ErbB2. RhuMAb 2C4 bloquea la asociación de ErbB2 con otros miembros de la familia ErbB, con lo cual se inhibe la 10 señalización intracelular a través de la vía de ErbB. En contraste a HERCEPTIN®, rhuMAb 2C4 no solamente inhibe el crecimiento de los tumores que sobreexpresan ErbB2 , sino también bloquea el principio de los tumores que requieren señalización dependiente del ligando ErbB. 15 RhuMAb 2C4 es indicado como un agente simple para el tratamiento de los pacientes con cáncer de próstata refractario a las hormonas (independiente de andrógeno) . Los puntos finales primarios para la' eficacia incluyen la supervivencia completa en comparación al mejor cuidado 20 disponible (mitoxantrona (prednisona) , cuando se utiliza como un agente simple, y la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundarios incluyen: el tiempo para la progresión de la enfermedad, la velocidad de respuesta, la calidad de vida, el dolor y/o la duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 25 es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpos es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o una concentración más alta) . RhuMAb 2C4 es también indicado en combinación con la quimioterapia para el tratamiento de los pacientes con cáncer de próstata refractario a las hormonas (independiente de andrógenos) . Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la supervivencia completa comparada a la quimioterapia y a la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: el tiempo para la progresión de la enfermedad, la velocidad de respuesta, la calidad de vida, el dolor y/o la duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrado intravenosamente (IV) cada semana, o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples '(relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o una concentración más alta) . Los ejemplos de fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-ErbB2 (el cual bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB2) para tratar el cáncer de próstata (por ejemplo el cáncer de próstata independiente de andrógeno) incluyen un inhibidor de la farnesil-transferasa; un agente anti-angiogénico (un anticuerpo anti -VEGF) ; un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839) ; otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2 inhibitorio del crecimiento tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis tal como 7C2 o 7F3, incluyendo las variantes humanizadas y/o maduradas por afinidad de los mismos); una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); un anti-andrógeno (tal como flutamida o acetato de ciproterona) ; leuprolida; suramina; un agente quimioterapéutico tal como vinblastina, estramustina, mitoxantrona, liarozol (un agente bloqueador del metabolismo del ácido retinoico) , ciclofosfamida, antibióticos de antraciclina tales como doxorrubicina, un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel) , o metotrexato, o cualquier combinación de los anteriores, tales como vinblastina/estramustina o ciclofosfamida/doxorrubicina/metotrexato; predinosa; hidrocortisona; o combinaciones de los mismos. Las dosis estándares para estos diversos fármacos pueden ser administradas, por ejemplo, 40 mg/m2/semana de docetaxel (TAXOTERE®) ; 6 (AUC) de carboplatino; y 200 mg/m2 de paclitaxel (TAXOL®) . -i.t-, _i..¿. í í_,_.__í_....,.Ji? -..., . . • . -,««»«»^~. ••* >«.-•* . . *_. _. .fc k i . i ?...

Ejemplo 11 Terapia del Cáncer de Mama Metastático RhuMAb 2C4 es indicado como un agente simple para el tratamiento de los pacientes con cáncer de mama metastático, cuyos tumores no sobreexpresan ErbB2. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los puntos finales secundarios de eficacia incluyen: supervivencia completa, tiempo hasta la progresión de la enfermedad, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrado intravenosamente cada semana o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o más alta concentración) . RhuMAb 2C4 es también indicado' en combinación con la quimioterapia para el tratamiento de los pacientes con cáncer de mama metastáticos cuyos tumores no sobreexpresan ErbB2. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la supervivencia completa, en comparación a la quimioterapia sola, y la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: el tiempo hasta la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrado intravenosamente cada semana o cada tres semanas a 2 o 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación de líquida de dosis múltiples (relleno e 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta) . Los ejemplos de fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-ErbB2 (que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB2) para tratar el cáncer de mama (por ejemplo el cáncer de mama metastático el cual no está caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2) incluyen los agentes quimioterapéuticos tales como los antibióticos de antraciclina (por ejemplo doxorrubicina), ciclofosfamida, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel), navelbina, xeloda, mitomicina C, un compuesto de platino, oxaliplatino, gemcitabina, o combinaciones de dos o más de éstos, tales como doxorrubicina/ciclofosfamida; otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor del desarrollo tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis tal como 7C2 ó 7F3 , incluyendo las variantes humanizadas o maduradas por afinidad de los mismos; un anti-estrógeno (por ejemplo tamoxifeno); un inhibidor de la farnesil-transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF) ; un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo C255 o ZD1839) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); o combinaciones de los anteriores. Las dosis estándares para tales fármacos adicionales pueden ser utilizadas. RhuMAb2C4 es adicionalmente indicado en combinaciones con HERCEPTIN® para el tratamiento de pacientes con cáncer metastático de mama cuyos tumores sobreexpresan ErbB2. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: el tiempo hasta la progresión de la enfermedad, la supervivencia completa en comparación a HERCEPTIN® solo, la calidad de vida y/o la duración de la respuesta. RhuMAb2C4 es administrado intravenosamente cada semana o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta) . HERCEPTIN® es administrado IV como una dosis de carga inicial de 4 mg/kg seguido por una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg. La HERCEPTIN® es suministrado como un polvo liofilizado. Cada frasco de HERCEPTIN® contiene 440 mg de HERCEPTIN ®, 9.9 mg de clorhidrato de L-histidina, 6.4 mg de L-histidina, 400 mg de dihidrato de a-a-trehalosa, y 1.8 mg de polisorbato 20. La reconstitución con 20 ml de Agua Bacteriostática para Inyección (BWFI) que contiene 1.1% de alcohol bencílico como ^^^^^^^^^^^¡^^^¿^^ 5 un conservador, produce 21 ml de una solución de dosis múltiples que contiene 21 mg/ml de HERCEPTIN®, a un pH de aproximadamente 6.0.

Ejemplo 12 Terapia del Cáncer de Pulmón RhuMAb 2C4 es indicado como un agente simple para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas de etapa 11Ib o IV (NSCLC) . Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los puntos finales de eficacia, secundarios, incluyen: la supervivencia completa, el tiempo para la progresión de la enfermedad, la calidad de vida y/o la duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrada intravenosamente (IV) cada semana o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta) . RhuMAb 2C4 es también indicado en combinación con la quimioterapia de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, metastáticas. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la supervivencia completa en comparación a la terapia estándar, y la seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: el tiempo -gH^ . AA^A- --»--.! --.A-to^ > ** ****** -—----------- -- ' ~ "*- *»* **! &>* para la progresión de la enfermedad, la velocidad de respuesta, la calidad de vida y/o la duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrado intravenosamente (IV) cada semana o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta) . Los ejemplos de fármacos adicionales que pueden ser combinados con el anticuerpo (el cual se enlaza a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB2) para tratar el cáncer de pulmón, incluyen los agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel) , gemcitabina, navelbina, cisplatino, oxaliplatino, o combinaciones de cualquiera de éstos, tales como carboplatino/docetaxel ; otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2, inhibidor del crecimiento, tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 el cual induce la apoptosis tal como 7C2 o 7F3 , incluyendo las variantes humanizadas o maduradas por afinidad de los mismos) ; un inhibidor de la farnesil-transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF) ; un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); o combinaciones de los anteriores. fa»-, k .-. - ?, . í- Ejemplo 13 Terapia de Cáncer Colorrectal RhuMAb 2C4 es indicado como un agente simple para el tratamiento del cáncer colorrectal metastático. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los puntos finales de eficacia, secundarios: supervivencia completa, tiempo para la progresión de la enfermedad, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrada intravenosamente (IV) cada semana, o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta) . RhuMAb 2C4 es también indicado en combinación con la quimioterapia para el tratamiento de los pacientes con cáncer colorrectal metastático. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la supervivencia completa en comparación a la terapia estándar, y la seguridad. Los puntos finales de eficacia, secundarios, incluyen: el tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 es administrado intravenosamente (IV) , semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de dosis múltiples (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/ml o concentración más alta. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar el cáncer colorrectal, los cuales pueden ser combinados con el anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, incluyen 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorina (LV) , CPT-11, levamisol o combinaciones de cualquiera de dos o más de éstos, por ejemplo, 5-FU/LV/CPT-ll . Las dosis estándares de tales agentes quimioterapéuticos pueden ser administradas. Otros fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-ErbB2 para tratar el cáncer colorrectal, incluyen un inhibidor de la farnesil-transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti -VEGF) ; un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor del crecimiento tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti- ErbB2 que induce la apoptosis tal como 7C2 o 7F3, incluyendo las variantes humanizadas o maduradas por afinidad de los mismos); o combinaciones de los anteriores. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Listado de Secuencias <110> Genentech, Inc. <120> Anticuerpos Humanizados Anti-ErbB2 y Tratamiento con Anticuerpos Anti-ErbB2 <130> P1467R2PCT 10 <141> 2000-06-23 <150> US 60/141,316 <151> 1999-06-25 15 <160> 13 <210> 1 <211> 107 <212> PRT 20 <213> Mus MusCulus <400> 1 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys He Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15 25 Gly Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 He Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys 30 35 40 45 Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 35 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He 65 70 75 Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 40 Tyr Tyr He Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 He Lys 5 <210> 2 <211> 119 <212> PRT 0 <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 5 Thr Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 0 35 40 45 Glu Trp He Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser He Tyr 50 55 60 tt??. 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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 55 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 60 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser He Tyr 50 55 60 Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <400> 5 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser He Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 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Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly 40 110 115 120 Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly 125 130 135 45 Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu He Leu Lys 140 145 150 Gly Gly Val Leu He Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp 155 160 165 50 Thr He Leu Trp Lys Asp He Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala 170 175 180 Leu Thr Leu He Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys 55 185 190 195 Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu 200 205 210 60 Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala 215 220 225 Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys 245 250 255 Leu His Phe Asn His Ser Gly He Cys Glu Leu His Cys Pro Ala 260 265 270 Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro 275 280 285 Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro 290 295 300 Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys 305 310 315 Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg 320 325 330 Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu 335 340 345 Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn 350 355 360 He Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys He Phe Gly Ser Leu Ala 365 370 375 Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 380 385 390 Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu 395 400 405 He Thr Gly Tyr Leu Tyr He Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro 410 415 420 Asp Leu Ser' Val Phe Gln Asn Leu Gln Val He Arg Gly Arg He 425 430 435 Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly He 440 445 450 Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu 455 460 465 Ala Leu He His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 470 475 480 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His 485 490 495 Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala 500 505 510 Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 515 520 525 Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys 530 535 540 Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val 545 550 555 Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln 560 565 570 Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val 575 580 585 Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys 590 595 600 Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro He Trp Lys 605 610 615 Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro He Asn Cys 620 625 630 Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu 635 640 645

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes 5 reivindicaciones:

1. Un método de tratamiento de un cáncer en un humano, en donde el cáncer expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , caracterizado el método porque 10 comprende la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la activación 15 del ligando de un receptor de ErbB.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo bloquea el enlace del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2.

4. El método de conformidad con la reivindicación 20 1, caracterizado porque el cáncer se caracteriza por la activación excesiva de EGFR.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el cáncer sobreexpresa un ligando ErbB.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el ligando ErbB es el factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) .

7. El método de conformidad con la reivindicación 5 1, caracterizado porque el anticuerpo bloquea la activación de TGF-a de la cinasa proteica activada por mitógeno (MAPK) .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer no se caracteriza por la expresión del receptor de ErbB2. 10

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además la administración de 15 un agente quimioterapéutico al humano.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona el grupo que consiste de 5 -fluorouracilo (5-FU) , leucovorina (LV) , CPT-11 y levamisol. 20

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pulmón.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas. iiflii'^M^ giiiÉtti^at^M» , .Í ? ? ^ -,«^.^^,»to-->..- -. -- -.. a *~. ^-.»«»».. —y. -.-- - - -> ~ .»-A»* .l

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende además la administración de un agente quimioterapéutico al humano.

15. El método de conformidad con la reivindicación 5 14, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un taxano, gemcitabina, navelbina, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo tiene una 10 característica biológica del anticuerpo monoclonal 2C4.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 2C4 o el 2C4 humanizado.

18. El método de conformidad con la reivindicación 15 1, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab. 20

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo no está conjugado con un agente citotóxico.

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo no está 25 conjugado con un agente citotóxico. ^^^^n^m i? ^ _n .. su _.

22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico.

23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste de un segundo anticuerpo diferente, que se enlaza a ErbB2 , un agente quimioterapéutico, un fármaco dirigido a EGFR, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti-hormonal , un cardioprotector y una citocina.

24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la administración de al menos una dosis del anticuerpo al humano, en una cantidad de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende la administración de la dosis aproximadamente cada semana.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende la administración de la dosis aproximadamente cada tres semanas.

27. Un método de tratamiento del cáncer en un humano, en donde el cáncer no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor de ErbB2 , caracterizado el método porque comprende la administración al humano de una cantidad A, jJ terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama metastático.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además la administración de un agente quimioterapéutico al humano.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico de antraciclina, ciclofosfamida, un taxano, navelbina, xeloda, mitomicina C, oxaliplatino, gemcitabina, y un compuesto de platino.

32. Un método de tratamiento del cáncer en un humano, caracterizado porque comprende la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el desarrollo de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el primer anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 4D5 o 4D5 humanizado, y el segundo anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 2C4 o 2C4 humanizado.

34. Un método de tratamiento del cáncer en un humano, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal, caracterizado el método porque comprende la administración al humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB.

35. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, caracterizada la composición porque comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el cáncer que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) .

36. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, caracterizada la composición porque comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar el •'jt*JJ-1 ÍX?t?_?^ i cáncer, en donde el cáncer no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor de ErbB2.

37. Un artículo de fabricación, caracterizado porque comprende (a) un primer recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB.

38. El artículo de fabricación del artículo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque comprende un inserto de envase que indica que la primera y la segunda composiciones de anticuerpo pueden ser utilizadas para tratar el cáncer.

39. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en éste, caracterizada la composición porque comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, y que comprende además un inserto de envase que indica que la composición puede ser utilizada para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal. »-4 _t . t Ü.. n_t_?_M?... , __n_, .

40. Un anticuerpo humanizado, caracterizado porque se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB .

41. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque se enlaza a ErbB2 esencialmente tan efectivamente como el anticuerpo monoclonal murino 2C4.

42. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende un dominio de cadena variable (VH) que comprende los residuos de la región hipervariable no humana incorporados en un dominio VH humano, y que comprende además una sustitución de la región estructural (FR) , en una posición seleccionada del grupo que cosiste de 69H, 71H y 73H, utilizando el sistema de numeración descrito en Kabat (1991) .

43. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque comprende las sustituciones FR en las posiciones 69H, 71H y 73H.

44. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende los residuos de la región de determinación de la complementariedad (CDR) del dominio de VH, GFTFTDYTMX (SEQ ID NO: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8) y NLGPSFYDY (SEQ ID NO: 9) .

45. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VH en la SEQ ID NO: 4.

46. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende los residuos de la región de determinación de la complementariedad (CDR) del dominio (VL) ligero variable, KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10), SASYXXX (SEQ ID NO: 11); y QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12) .

47. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VL en la SEQ ID NO: 3.

48. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque es un anticuerpo IgGl intacto.

49. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.

50. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque es un fragmento Fab.

51. Un anticuerpo madurado por afinidad, caracterizado porque se enlaza a ErbB2 y porque bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB. .?.?.?*.-t, .__&_A___ ... 1. lil i.

52. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40, y un portador farmacéuticamente aceptable.

53. Un inmunoconjugado, caracterizado porque comprende el anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40 conjugado con un agente citotóxico.

54. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para el anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 40.

55. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 54.

56. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 55.

57. Un proceso para la producción de un anticuerpo humanizado, caracterizado porque comprende el cultivo de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, de modo que es expresado el ácido nucleico.

58. El proceso de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque comprende la recuperación del anticuerpo humanizado del cultivo de células huésped.

59. El proceso de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo humanizado es recuperado del medio de cultivo de células huésped.

60. El uso del anticuerpo que se enlaza a ErbB2 , en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un humano, en donde el cáncer expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) .

61. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB.

62. El uso de conformidad con la reivindicación 61, en donde el anticuerpo bloquea el enlace del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2.

63. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el cáncer se caracteriza por la activación excesiva de EGFR.

64. el uso de conformidad con la reivindicación 63, en donde el cáncer sobreexpresa un ligando ErbB.

65. El uso de conformidad con la reivindicación 64, en donde el ligando ErbB es el factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) .

66. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo bloquea la activación de TGF-a de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) .

67. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el cáncer no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor de ErbB2.

68. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal.

69. El uso de conformidad con la reivindicación 68, en donde el medicamento es para la administración con un agente quimioterapéutico.

70. El uso de conformidad con la reivindicación 69, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorina (LV) , CPT-11, y levamisol.

71. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.

72. El uso de conformidad con la reivindicación 71, en donde el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas.

73. El uso de conformidad con la reivindicación 71, en donde el medicamento es para la administración con un agente quimioterapéutico.

74. el uso de conformidad con la reivindicación 73, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un taxano, gemcitabina, navelbina, cisplatino, oxaliplatino, y carboplatino.

75. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo tiene una característica biológica sobre el anticuerpo monoclonal 2C4. „ _. ,é *>,* ,k _

76. El uso de conformidad con la reivindicación 75, en donde el anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 2C4 o 2C4 humanizado.

77. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

78. El uso de conformidad con la reivindicación 77, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.

79. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo no está conjugado con un agente citotóxico.

80. El uso de conformidad con la reivindicación 77, en donde el fragmento de anticuerpo no está conjugado con un agente citotóxico.

81. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico.

82. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el medicamento es para la administración al humano con una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste de un segundo anticuerpo diferente, el cual se enlaza a ErbB2 , un agente quimioterapéutico, un fármaco dirigido a EGFR, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti -hormonal, un cardioprotector y una citocina. .._*.. i .i Í,

83. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el medicamento es para la administración al menos de una dosis del anticuerpo al humano, en una cantidad de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

84. El uso de conformidad con la reivindicación 83, en donde el medicamento es para la administración de la dosis aproximadamente cada semana.

85. El uso de conformidad con la reivindicación 83, en donde el medicamento es para la administración de la dosis aproximadamente cada tres semanas.

86. El uso de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un humano, en donde el cáncer no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor ErbB2.

87. El uso de conformidad con la reivindicación 86, en donde el cáncer es cáncer de mama.

88. El uso de conformidad con la reivindicación 87, en donde el cáncer es cáncer de mama metastático.

89. El uso de conformidad con la reivindicación 87, en donde el medicamento es para la administración con un agente quimioterapéutico para el humano.

90. El uso de conformidad con la reivindicación 89, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico de antraciclina, ciclofosfamida, un taxano, navelbina, xeloda, mitomicina C, oxaliplatino, gemcitabina, y un compuesto de platino.

91. El uso de (a) un primer anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y que inhibe el desarrollo de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2 ; y (b) un segundo anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un humano.

92. El uso de conformidad con la reivindicación 91, en donde el primer anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 4D5 o 4D5 humanizado y el segundo anticuerpo comprende el anticuerpo monoclonal 2C4 o 2C4 humanizado.

93. El uso de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor de ErbB, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un humano, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, rectal y colorrectal.

94. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque es una célula de mamífero.

95. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque es una célula de ovario de hámster chino (CHO) . .**S a. * « i.

96. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque es una célula procariotica .

97. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 96, caracterizada porque es una célula de E. coli .

98. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-51, caracterizado porque se enlaza a un polímero no proteico.

99. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el polímero no proteico es polietilenglicol.

100. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un fármaco dirigido a EGFR.

101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el fármaco dirigido a EGFR es ZD1839, CP-358774 o AG1478.

102. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el fármaco dirigido a EGFR es un anticuerpo que se enlaza a EGFR.

103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza a EGFR es C225 o H225.

104. El uso de conformidad con la reivindicación 82, en donde el segundo agente terapéutico es un fármaco dirigido a EGFR.

105. El uso de conformidad con la reivindicación 104, en donde el fármaco dirigido a EGFR es ZD1839, CP-358774 o AG1478.

106. El uso de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el fármaco dirigido a EGFR es un anticuerpo que se enlaza a EGFR.

107. El uso de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza a EGFR es C225 o H225. lA.&ti. .?táa iááiimí** «.-a»--.. ¡=. , _^ --. ___^______ . _. . . <* _** * i i