MXPA00011456A - Analogos novedosos de insulina con union incrementada con zinc. - Google Patents
Analogos novedosos de insulina con union incrementada con zinc.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a analogos de insulina que tienen una capacidad incrementada de union con zinc, y a complejos de zinc estables de los mismos que, en comparacion con la insulina humana, tienen una actividad retardada. La invencion se refiere tambien a un metodo para la produccion de dichos analogos de insulina y a su uso, particularmente en preparaciones farmaceuticas para la terapia de diabetes mellitus de tipo I y de tipo II.
Description
ANÁLOGOS NOVEDOSOS DE INSULINA CON UNIÓN INCREMENTADA CON ZINC La presente invención se refiere a análogos de insulina que tienen una capacidad incrementada de unión con zinc, y a complejos de zinc estables de los mismos que, en comparación con la insulina humana, tienen un perfil de acción retardado, la invención se refiere también a un procedimiento para su preparación y a su uso, particularmente en preparaciones farmacéuticas para la terapia de diabetes mellitus de tipo I y también de tipo II. En el mundo entero, aproximadamente 120 millones de personas padecen de diabetes mellitus. Entre estas personas, aproximadamente 12 millones son diabéticos de tipo I, para quienes la sustitución de la falta de secreción endocrina de insulina es la única terapia posible actualmente. A las personas afectadas se les receta inyecciones de insulina, generalmente varias veces al dia, durante toda su vida. A diferencia de los diabéticos de tipo I, en el caso de los diabéticos de tipo II no existe fundamentalmente una falta de insulina sino que, en un gran número de_ casos, especialmente en la etapa avanzada, el tratamiento con insulina, en caso apropiado en combinación con un antidiabético oral, se considera como la forma más favorable de terapia. En personas sanas, la liberación de insulina por el páncreas se relaciona estrictamente con la concentración de glucosa en la sangre. Niveles incrementados de glucosa en la sangre, como por ejemplo después de las comidas, se compensan rápidamente por un incremento correspondiente de la secreción de insulina. En ayunas, el nivel de insulina plasmático baja hasta un valor basal que es suficiente para garantizar un suministro continuo de glucosa a órganos y tejidos sensibles a la insulina y para mantener baja la producción de glucosa hepática durante la noche. El reemplazo de la secreción endógena de insulina por la administración exógena, principalmente subcutánea, de insulina, en términos generales, no logra la calidad de la regulación fisiológica de la glucosa sanguínea descrita arriba. Frecuentemente, existen pérdidas de control de la glucosa sanguínea ya sea hacia arriba o hacia abajo, que, en sus formas más severas pueden poner en peligro la vida. Además, los niveles sanguíneos de glucosa, los cuales han estado elevados durante años sin síntomas iniciales, sin embargo, representan también un riesgo considerable para la salud. El estudio DCCT a gran escala efectuado en los Estados Unidos de América (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986) demostró claramente que niveles sanguíneos crónicamente elevados de glucosa son responsables en gran medida del desarrollo del daño diabético tardío. El daño diabético tardío es un daño microvascular y macrovascular que se manifiesta, en ciertas circunstancias, como retinopatia, nefropatia, o neuropatía y provoca seguir, insuficiencia renal y pérdida de las extremidades y es acompañado además por un alto riesgo de enfermedades cardiovasculares. Puede derivarse de esto que una terapia mejorada de la diabetes debe tener como propósito principal mantener la glucosa sanguínea lo más cerca posible del rango fisiológico. Según el concepto de la terapia con insulina intensificada, esto podria lograrse a través de varias inyecciones diarias de preparaciones de insulina de acción rápida y de acción lenta. Las formulaciones de acción rápida se administran con las comidas con el objeto de controlar el incremento post-prandial de la glucosa sanguínea. La insulina basal de acción lenta debe asegurar el suministro básico de insulina, particularmente durante la noche, sin provocar hipoglicemia. Las insulinas básales disponibles actualmente cumplen este requerimiento solamente de manera inadecuada. Las insulinas NPH frecuentemente empleadas tienen especialmente una acción máxima demasiado notable y tienen una acción global demasiado corta. En el caso de la administración en la noche, esto incluye el riesgo de hipoglicemia nocturna y de hiperglice ia matutina. El documento EP 0 821 006 divulga análogos de insulina que tienen una capacidad incrementada de enlace con zinc, que, en combinación con el zinc, tienen un perfil retardado de acción en comparación con la insulina humana. Estos análogos difieren de la insulina humana esencialmente por la variación del aminoácido en la posición A21 de la cadena A y por la adición de un residuo de histidina o de un péptido que tiene de 2 a 35 residuos de aminoácidos, que contiene de 1 a 5 residuos de histidina, en la posición B30 de la cadena B. Es el objeto de la presente invención ofrecer además análogos de insulina (análogos de la insulina humana o animal) , que tienen una capacidad incrementada de enlace con zinc, que forman un complejo estable que comprende un hexámero del análogo de insulina y zinc, y, en una preparación adecuada, hacen posible una terapia mejorada de la diabetes mellitus de tipo I y de tipo II en inyección subcutánea como resultado del perfil de acción, que es retardado en comparación con la insulina humana. Análogos de insulina se derivan de insulinas que ocurren naturalmente, a saber la insulina humana (ver SEQ ID NO: 1: A cadena de insulina humana y SEQ ID NO: 2 B cadena de insulina humana) o bien insulinas de animal mediante la sustitución o ausencia de por lo menos un residuo de aminoácido que ocurre naturalmente y/o mediante la adición de por lo menos un residuo de aminoácido a la cadena A y/o cadena B de la insulina que ocurre naturalmente. El objeto se logra a través de: 1. un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I
(A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21
0)
Z-R1-R2-R3-R4-His-Lßu-Cys- (B8-B18) Cys-(B20-829)-R30
en donde (A1-A5) son los residuos de aminoácido en las posiciones Al hasta A5 de la cadena A de insulina humana (ver SEQ ID NO:l) o insulina de animal, (A15-A19) son los residuos de aminoácidos en las posiciones
A15 hasta A19 de la cadena A de insulina humana (ver SEQ ID
NO:l) o bien insulina de animal, (B8-B18) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana (ver SEQ ID N0:2) o bien insulina de animal, (B20-B29) son los residuos de aminoácidos en las posiciones
B20 a B29 de la cadena B de insulina humana (ver SEQ ID NO: 2) o de insulina de animal, R8 es Thr o Ala, R9 es Ser o Gly, RIO es lie o Val, R14 es Tyr, His, Asp o Glu, R21 es Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu o Gln, Rl es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado, ausente, o un átomo de hidrógeno, R2 es Val, Ala o Gly, R3 es Asn, His, Glu o Asp, R4 es Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly o Glu, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseable o bien -OH, Z es un átomo de hidrógeno o un residuo de péptido que tiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His) , a condición que en el caso en el cual Z es un átomo de hidrógeno, Rl o R3 es His, Glu o Asp, donde R3 es His, si Rl es un residuo de aminoácido cargado negativamente o neutro, o bien a condición que en el caso en el cual Z es un átomo de hidrógeno, R14 es His, Asp o Glu y además a condición que el análogo de insulina o las sales fisiológicamente tolerables del mismo de la fórmula I difiere de la insulina humana no solamente por la variación de los residuos de aminoácidos en las posiciones R3 o R3 en combinación con R21 o R3 en combinación con R4 en la fórmula I (ver SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO: 2) . De preferencia, el análogo de insulina o la sal fisiológicamente tolerable del mismo es un análogo en donde 2. R8 es Thr, R9 es Ser y RIO es lie, 3. Rl es Phe, His, Asn, Asp o Gly, 4. R30 es Thr, Ala o Ser o bien 5. donde R21 es Asn y Rl es Phe. 6. Una modalidad preferida de la presente invención es un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I, donde R2 es Val, R3 es Asn y R4 es
Gln. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I se prefiere además el cual se distingue en la medida en que R14 es 7. Tyr, 8. His, 9. Asp o bien 10. Glu. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I se prefiere además el cual se distingue en la medida en que R30 es 11. Thr, 12. Ala, 13. Ser o bien 14. -OH.
Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I se prefiere además el cual se distingue en la medida en que Z es 15. His, 16. His-Ala- o bien 17. His-Ala-Ala-. Ejemplos de análogos de insulina de conformidad con la presente invención son 18. un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I, que se distingue porque la cadena B tiene la secuencia His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3), por ejemplo insulina humana His(BO), des (B30) , 19. un análogo de insulina o una sai fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I, que se distingue porque la cadena B tiene la secuencia His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4), por ejemplo insulina humana His(BO),
20. un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, de la fórmula I, que se distingue porque la cadena B tiene la secuencia His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5), por ejemplo, insulina humana His (B-l), Ala(BO) o bien 21. un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I, que se distingue porque la cadena B tiene la secuencia His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr , (SEQ ID NO: 6), por ejemplo, insulina humana His(B-2), Ala (B-l) , Ala(BO) . La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de análogo de insulina o de una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la presente invención, que comprende la construcción de un vehículo de expresión replicable que contiene una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina que tiene la secuencia de aminoácidos II- Met-X2m- (Arg)P-Z-Rl-R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18) -Cys- (B20- B29) -RSO-X^-Arg- (A1-A5) -Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14- (A15-A19)-Cys-R21 II, en donde X1n es una cadena de péptido que tiene n residuos de aminoácidos, donde n es un número entero de 0 a 34, X2m es una cadena de péptido que tiene m residuos de aminoácidos, donde m es un número entero de 0 a 20, p es 0, 1 o bien 2, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado o está ausente y Z está ausente o bien es un residuo de péptido que tiene de
1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His) y las demás variables tienen los significados mencicr.ados arriba en el número 1, donde las condiciones antes mencionadas aplican también, expresión en una célula huésped y liberación del análogo de insulina de su precursor empleando métodos químicos y/o enzimáticos. La célula huésped es de preferencia una bacteria, de preferencia la bacteria E. coli. La célula huésped es de preferencia una levadura, especialmente Saccharomyces cerevisiae. Durante la expresión en E. coli, las proteinas de fusión mencionadas (SEQ ID NO: 7 a 9) en general forman cuerpos de inclusión insolubles que pueden ser aislados por centrifugación después de trastorno celular y se disuelven otra vez empleando aditivos caotrópicos (por ejemplo, urea 8 M o bien cloruro de guanidinio 6 M) . La proteina de fusión disuelta puede ser sometida a sulfitolisis, en donde radicales SH son convertidos en sulfonatos S (por ejemplo, R.C. Marshall y A.S. Iglis en "Practical Protein Chemistry -A Handbook" editado por A. Darbre (1986), páginas 49-53). La solubilidad de la proteina de fusión es mejorada de esta forma y se facilita la purificación, por ejemplo, por medio de cromatografía de intercambio de aniones o permeación de gel. La conversión de la proteina de fusión derivada en preproinsulina con una estructura espacial nativa y puentes de disulfuro formados correctamente (doblado) se efectúa en solución acuosa diluida mediante la adición de una cantidad limitada de un reactivo SH como por ejemplo mercaptoetanoi, cisteina o glutationa y oxidación aérea subsecuente. Alternativamente, la proteina de fusión disuelta, no derivada, puede también doblarse directamente en condiciones similares (EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292) . La preproinsulina es después convertida en insulina biológicamente activa por disociación proteolitica limitada. Para esto, es posible emplear tripsina que remueve la presecuencia indicada en la fórmula II por Met-X2 m-(Arg)p y se disocia en la cadena de péptido indicado por X1 n-Arg y por consiguiente separa la cadena B de la cadena A. En términos generales, la secuencia X1 empieza con Arg, Arg: o bien no está presente (n=0) , de tal manera que después de la disociación se encuentra un derivado de insulina prolongado por Arg o Arg¿ en el extremo C de _ la cadena B. Estos aminoácidos pueden ser removidos empleando carboxipeptidasa B. La disociación triptica puede también efectuarse incrementando la concentración de tripsina o prolongando el tiempo de reacción de tal manera que la disociación se efectúa además en la lisina (B29) . En este caso, se obtiene un derivado de insulina des(B30). El análogo de insulina formado durante la disociación puede ser purificado por procedimientos estándares de cromatografía •(por ejemplo, cromatografía de 'intercambio de iones y cromatografía de fase reversa) y puede aislarse finalmente por precipitación, cristalización o bien liofilización simple. El precursor del análogo de insulina tiene de preferencia la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val' Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
Arg Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID N0:7), por ejemplo la secuencia de preproinsulina
His(BO), o bien la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln
Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID NO: 8), por ejemplo la secuencia de preproinsulina His (B-l), Ala(BO), o bien la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val
Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID NO: 9), por ejemplo la secuencia de preproinsulina His(B-2), Ala (B-l), Ala(B?). La invención se refiere también a los precursores antes mencionados de los análogos de insulina de conformidad con la presente invención, particularmente las preproinsulinas, las secuencias de ADN que codifican para un precursor del análogo de insulina de conformidad con la presente invención, los vehículos de expresión que contienen una secuencia de ADN que codifica para un precursor novedoso del análogo de insulina de conformidad con la presente invención, y una célula huésped transformada empleando un vehículo de expresión de este tipo. La presente invención se refiere además a una preparación farmacéutica que comprende por lo menos un análogo de insulina y/o por lo menos una sal fisiológicamente tolerable de conformidad con la presente invención. De preferencia, la preparación farmacéutica se distingue en la medida en que contiene el análogo de insulina de conformidad con la presente invención y/o la sal fisiológicamente tolerable del mismo en forma disuelta, amorfa y/o cristalina. La preparación farmacéutica contiene además de manera alternativa un auxiliar de depósito, de preferencia sulfato de protamina, el análogo de insulina y/o la sal fisiológicamente tolerable del mismo, de preferencia presente en un cocristalizado con el sulfato de protamina. La preparación farmacéutica de conformidad con la presente invención puede contener además, alternativamente, insulina humana no modificada y/o un análogo de insulina adicional, de preferencia insulina humana Gly (A21) -Arg (B31) -Arg (B32) . La presente invención se refiere además a una solución inyectable que tiene una actividad de tipo insulina, que contiene la preparación farmacéutica de conformidad con la presente invención en forma disuelta, de preferencia que contiene de 1 µg a 2 mg de zinc por ml, de manera especialmente preferible que contiene de 5 µg a 200 µg de zinc por ml . La presente invención se refiere además al uso del análogo de insulina y/o a su sal fisiológicamente tolerable de conformidad con la presente invención para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una actividad insulina que tiene un inicio de acción retardado. El objeto establecido al principio se logra además a través de un complejo insulina-zinc, que comprende un hexámero de insulina y 4 a 10 iones zinc por hexámero de insulina, donde el hexámero de insulina consiste de 6 moléculas de un análogo de insulina de la fórmula I
(A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21
(I)
Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18) Cys-(B20-B29)-R30
en donde (A1-A5) son los residuos de aminoácido en las posiciones Al hasta A5 de la cadena A de insulina humana o insulina de animal, (A15-A19) son los residuos de aminoácidos en las posiciones
Al5 hasta Al9 de la cadena A de insulina humana o bien insulina de animal, (B8-B18) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana o bien insulina de animal, (B20-B29) son los residuos de aminoácidos en las posiciones
B20 a B29 de la cadena B de insulina humana o de insulina de animal, R8 es Thr o Ala, R9 es Ser o Gly, RIO es He o Val, R14 es Tyr, His, Asp o Glu, R21 es Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu o Gln, Rl es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado, ausente, o un átomo de hidrógeno,
R2 es Val, Ala o Gly, R3 es Asn, His, Glu o Asp, R4 es Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly o Glu, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseable o bien -OH, Z es un átomo de hidrógeno o un residuo de péptido que tiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His) . El complejo insulina-zinc contiene de preferencia de 5 a 8 iones zinc por hexámero de insulina. El complejo insulina-zinc contiene de preferencia un hexámero de insulina que consiste de seis moléculas del análogo de insulina de la fórmula I descrito arriba de conformidad con la presente invención. El complejo insulina-zinc de conformidad con la presente invención es también de preferencia un complejo en el cual la cadena B del análogo de insulina de la fórmula I tiene la secuencia Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10), por ejemplo insulina humana His(B3) o bien donde la cadena B del análogo de insulina de la fórmula I tiene la secuencia Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO:ll), por ejemplo insulina humana Asp(B3). La presente invención se refiere también a una preparación farmacéutica, que comprende por lo menos un complejo insulina-zinc de conformidad con la presente invención y una preparación farmacéutica que comprende una solución acida de por lo menos un análogo de insulina y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo con una cantidad apropiada de iones zinc, que hace posible la formación de un complejo insulina-zinc de conformidad con la presente invención, el análogo de insulina y/o la sal fisiológicamente tolerable contiene de preferencia el análogo de insulina de la fórmula I de conformidad con la presente invención descrito arriba o un análogo de insulina de la fórmula I cuya cadena B tiene la secuencia con el número SEQ ID Nos: 3, 4, 5, 10 o bien 11.
La preparación farmacéutica es de preferencia una preparación farmacéutica que comprende el complejo insulina-zinc en forma disuelta, amorfa y/o cristalina. La presente invención se refiere también a una solución inyectable que tiene una actividad insulina, que comprende la preparación farmacéutica en forma disuelta y que contiene de preferencia de 1 µg a 2 mg de zinc por ml, que contiene de manera particularmente preferida de 5 µg a 200 µg de zinc por ml. La presente invención se refiere también al uso del complejo insulina-zinc para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una actividad insulina que tiene un inicio de acción retardado. Los análogos de insulina de conformidad con la presente invención son biológicamente activos y presentan una acción fuertemente retardada después de administración subcutánea en forma de una solución clara, levemente acida, que contiene 80 µg de Zn++/ml (zinc/ml) en el perro. En el caso del análogo de insulina prolongado en el extremo N de la cadena B por histidina, insulina humana His (B0) , des (B30) (ver SEQ ID NO: 3), el perfil de acción depende, por ejemplo, en gran medida, de la cantidad de iones zinc agregados. Una preparación sin zinc no tiene efecto de depósito (acción total: 6-8 horas, ejemplo 8) y apenas si difiere en cuanto a sus características farmacodinámicas de la insulina humana, mientras que después de la adición de iones zinc (80 µg/ml), se encuentra un retardo importante de acción (acción total: aproximadamente 16 horas, ejemplo 8) . El efecto de depósito observado es por consiguiente significativamente más notable que el efecto de insulina NPH. Además, este análogo tiene la ventaja que las características farmacodinámicas pueden ser controladas mediante la preespecificación del contenido de zinc dentro de un rango que no es posible con la insulina humana. Formulaciones que tiene un inicio de acción rápido pueden prepararse exactamente de la misma manera que las que tienen una acción moderada o fuertemente retardada con una sustancia activa variando solamente el contenido de zinc. Asi, el perfil de acción puede ser adaptado individualmente a las necesidades del paciente, empleando ya sea una preparación que tiene un contenido apropiadamente preestablecido de zinc o bien mezclando preparaciones que tienen un contenido de zinc alto y bajo por el médico o los pacientes mismos. Los análogos descritos aqui son además los análogos que tienen una afinidad incrementada para iones zinc en comparación con la insulina humana. En una solución acuosa neutra, la insulina humana forma hexámeros que, en cada caso, forman complejos de dos iones zinc a través de las cadenas laterales His (BIO). Estos iones zinc no pueden ser removidos por diálisis contra amortiguadores acuosos en solución neutra. En las mismas condiciones, los análogos descritos aquí unen más que 4 iones zinc. En el caso de insulina His (BO) -des (B30) - y His(B3) de conformidad con la presente invención, existen aproximadamente 7 iones zinc/hexámero; en el caso de la insulina Asp(B3), se midieron 4.2 iones zinc/hexámero (ejemplo 9) . Se sabe que en soluciones neutras el zinc provoca la formación de asociados con pesos moleculares relativamente altos y lleva a la precipitación de la insulina. Después de la Inyección de una preparación que contiene zinc, levemente acida, que contiene insulina disuelta para proporcionar una solución clara, la formación de complejos insulina-zinc y, como resultado, la precipitación de la insulina ocurren en el tejido subcutáneo debido a la neutralización. La insulina se forma en solución otra vez a partir de este depósito y después pasa en el torrente sanguíneo y hacia el sitio de acción con un retardo. Este retardo de acción es solamente ligero en el caso de la insulina humana, pero fuertemente desarrollado en el caso de los análogos descritos aquí debido a la afinidad incrementada para el zinc. El enlace incrementado con el zinc es por consiguiente la base de la prolongación de acción dependiente del zinc descrita arriba. La presente invención por consiguiente no solamente se refiere a los análogos de insulina descritos, sino que se refiere también a los complejos insulina-zinc asociados. Estos complejos difieren de los complejos insulina humana-zinc correspondientes en la medida en que tienen un mayor contenido de zinc firmemente unido. Por consiguiente es evidente que la adición al zinc de otros iones de metales de transición, como por ejemplo cobalto o cobre puede también emplearse para la formación de los complejos correspondientes . Ejemplo 1: construcción del plásmido pINT345d que codifica para la variante preproinsulina His(B3) La patente Norteamericana No. 5358857 describe el plásmido pINT90d. El ADN de este plásmido se emplea como material inicial para la construcción del plásmido pINT345d, que se caracteriza por dos nuevas propiedades en comparación con pINT90d. Por un lado, codifica para un análogo de preproinsulina que contiene el aminoácido histidina en vez de asparagina en la posición 3 de la cadena B, y por otra parte lleva una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción BssH2 inmediatamente antes del inicio de la secuencia que codifica para esta variante de preproinsulina, de tal manera que la secuencia de codificación para los 10 aminoácidos de extremo N del análogo de preproinsulina pueda ser fácilmente manipulada si el sitio de disociación Dra3 en el curso de la secuencia de preproinsulina se toma en cuenta. Para la construcción del plásmido pINT345d, se disocia el ADN del plásmido pINT90d en la posición 284 bp mediante la enzima de restricción Ncol y en la posición 351 bp mediante la enzima de restricción Dra3 en una mezcla de digestión doble de tal manera que se forman dos fragmentos. Después de la separación de la mezcla de disociación por electroforesis en gel, se aisla el fragmento de ADN de plásmido residual grande . Este fragmento de ADN reacciona después con el fragmento de ADN sintético de la fórmula % Ncol BSSH2 Bl B2 His B4 B5 B6
5 ' - C ATG GCA ACÁ ACÁ TCA ACÁ GGA AAT TCG GCG CGC T T GTG CAC CAG CAC CTG 3'- CGT TGT TGT AGT TGT CCT TTA AGC CGC GCG AAA CAC GTG GTC GTG GAC
B7 B8 B9 V. Dra3
TGC GGC TCC CAC CTA - 3' ACG CCG AGG GTG ~5'
en una reacción de T4- DN ligasa. Células K12 de E. coli competentes son transformadas con la mezcla de ligadura y la mezcla de transformación es colocada en placas de NA que contiene 20 mg/l de ampicilina. Las placas son incubadas a una temperatura dé 37°C durante la noche. El ADN de plásmido es aislado de las colonias resultantes y disociado empleando la enzima de restricción BssH2. El ADN de plásmido deseado es linearizado en el curso de esto y por consiguiente difiere del ADN de pINT90d que no contiene sitio de disociación BssH2 y por consiguiente no es disociado. El ADN de plásmido de un clon que se comparta correctamente se designa pINT345D. Se emplea como un material inicial para la construcción de las variantes de preproinsulina descritas abajo. Ejemplo 2: Construcción del plásmido pINT342d que codifica para la variante preproinsulina His(BO) El ADN del plásmido pINT345d es digerido doblemente con las enzimas BssH2 y Dra3 y se aisla el gran fragmento de plásmido residual después de separación por electroforesis en gel.
Este fragmento de ADN reacciona con el fragmento de ADN sintético de la forma
His Bl B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 BIO 5'- CG CGC CAC TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA - 3' 3'- G GTG AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - 5' tt BssH2 Hpal " Dra3
en una reacción de T4 ADN ligasa. El plásmido pINT342d se forma, el cual comprende un sitio de disociación Hpal adicional comparado con el plásmido inicial. El plásmido codifica para una variante de preproinsulina que tiene una histidina en la posición BO.
Ejemplo 3: Construcción del plásmido pINT343d que codifica para la variante preproinsulina His (B-l), Ala(BO) El ADN del fragmento de plásmido residual descrito en el ejemplo b reacciona con un fragmento de ADN sintético de la forma
His Ala Bl B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 BIO Bll 5'- CG CGC CAC GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA 3 '- G GTG CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG % BssH2 Hpal % Dra3
en una reacción de T4 ADN ligasa. El plásmido p?NT343d se forma, el cual, como pINT342d, contiene también un sitio de disociación Hpal adicional en comparación con el 'vector inicial. Ejemplo 4: Construcción del plásmido pINT344d que codifica para la variante preproinsulina His(B-2), Ala (B-l), Ala(BO) El ADN del fragmento de plásmido residual descrito en el ejemplo b reacciona con un fragmento de ADN sintético de la forma
His Ala Ala Bl B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 BIO Bll '- CG CGC CAC GCT GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA - 3 '- G GTG CGA CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG - 5 Un-1 V. Dra3 % BssH2 HPal en una reacción de T4 ADN ligasa. Se forma el plásmido pINT344d, que comprende un sitio de disociación Hpal adicional en comparación con el vector inicial. Ejemplo 5: Expresión de las variantes de insulina construidas Los plásmidos pINT 342d, 343d y 344d son transformados en cada caso en E. coli K12 W3110, a título de ejemplo. Bacterias recombinantes que contienen los plásmidos para la variante respectiva son después fermentadas de conformidad con el ejemplo 4 de la Patente Norteamericana No. 5227293 y se produce de esta forma la nueva materia prima deseada para la producción de la variante de insulina respectiva. Ejemplo 6: Preparación de insulina His(BO), des(B30) De conformidad con el ejemplo 5, la variante de preproinsulina es expresada en E. coli y aislada en forma de cuerpo de inclusión después de trastorno celular por centrifugación. Los cuerpos de inclusión se disuelven en urea
(8 mol/l), se someten a sulfitolisis y se purifican por intercambio de aniones (Q-Sepharose) y cromatografía por permeación en gel (Sephacryl S200) . Los amortiguadores empleados en la cromatografía contienen urea 4M y 50 mM de Tirs/HCl (tris (hidroximetil) aminometaño/HCl) , pH 8.5. La elusión fraccional en el intercambiador de aniones se lleva a cabo mediante la aplicación de un gradiente de 0 a 0.5 M NaCl. La concentración de la urea es después reducida a <1 M por ultrafiltración y dilución y se aisla preproinsulina-S-sulfonato por precipitación a un pH de 4 y finalmente se seca. Para la formación de los puentes correctos de disulfuro, como se encuentran en la proinsulina natural, se disuelve preproinsulina-S-sulfonato a un pH de 10.8, en un amortiguador que contiene 20 mM de glicina, a una concentración de 0.3 g/1, se trata con mercaptoetanoi (aproximadamente 25-50 mol/mol de preproinsulina) y se agita durante la noche a una temperatura de 4 C. El lote es después ajustado a un pH de 3.5 con ácido fosfórico y centrifugado. La preproinsulina contenida en el sobrenadante es ajustada a un pH de 8.2 para conversión en insulina después de adición de tris (25 mM) y tratada con tripsina (1.5 mg/g de preproinsulina) . El curso de la disociación proteolitica es monitoreado a través de HPLC de fase reversa. Después de aproximadamente 6 horas, el lote contiene un alto contenido de insulina His (B0) , des(B30). La reacción termina mediante la acidificación a un pH de 3.5. El análogo de insulina se purifica mediante cromatografía de intercambio de iones (S-Hyper-D, Sepracor) , y cromatografía de fase reversa (PLRP-S RP3000, Polymer Laboratories) . La cromatografía de intercambio de iones se lleva a cabo en un amortiguador que contiene 30% de 2-propanol y 50 mM de ácido láctico (pH 3.5) . la insulina unida es eluida por un gradiente lineal de 0 a 0.5 M NaCl. La cromatografía de fase reversa se efectúa en ácido trifluoroacético al 0.1% al cual se mezclan cantidades crecientes de acetonitrilo mediante elusión. El producto es aislado mediante precipitación a un pH de 5.4 y liofilizado. Ejemplo 7: Formulación de análogos de insulina para administración parenteral Las preparaciones contienen, por ml, 40 o 100 Ul de insulina (1 Ul corresponde a aproximadamente 6.2 nmol), 20 mg de glicerol al 85%, 2.7 mg de m-cresol, y, en caso apropiado, zinc++ (en forma de cloruro de zinc) en una solución estéril acuosa a un pH de 4. Ejemplo 8: Perfil de acción de insulina His(BO), des(B30) en el perro 6 perros (beagles) en cada caso recibieron administraciones subcutáneas de una preparación que contenía 40 U/ml (ejemplo 7) y el contenido indicado de zinc. La dosis fue de 0.3 Ul/kg. En el curso posterior del experimento, se midió la concentración de glucosa en la sangre después de los tiempos indicados. Los valores fueron estandarizados en porcentaje en el valor inicial respectivo y promediados. Tiempo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 (horas) Exento de 100 59 50 61 75 84 89 98 103 97 104 100 zinc 80 µg de 100 97 83 75 65 56 51 58 68 72 78 82 zinc++/ml Ejemplo 9: Enlace con zinc de análogos de insulina Una preparación de insulina (0.3 mM de insulina, NaCl 0.13 M, fenol al 0.1%, 100 µg/ml de zinc4"" (en forma de cloruro de zinc), 25 mM de tris/HCl, pH 7.4) fue dializada extensivamente contra un amortiguador neutro exento de zinc (3 horas contra NaCl 0.15 M, 10 mM tris/HCl, pH 7.4 a temperatura ambiente, 72 horas contra 10 M tris/HCl, pH 7.4 a una temperatura de 15°C y otra vez 16 horas contra 10 mM tris/HCl, pH 7.4, a una temperatura de 15°C) . Los dializados fueron después acidificados y analizados. La concentración de insulina fue determinada por HPLC de fase reversa y la concentración de zinc fue determinada por espectroscopia de absorción atómica. Los valores de zinc fueron corregidos empleando el contenido de zinc de un lote de control que no contenía insulina. Enlace de zinc Insulina mol de zinc/mol de hexámero Insulina humana 2.5 Insulina His (B3) 6.9 Insulina Asp(B3) 4.2 Insulina His (B0) , des(B30) 6.8 LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN. GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Hoechst Marión Roussel Deutschland GMBH (B) CALLE: - (C) CIUDAD: Frankfurt (D) ESTADO: - (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 65926 (G) TELEFONO: 069-305-5307 (H) FAX: 069-357175 (I) TELEX: - (ii) TITULO DE LA SOLICITUD: DERIVADOS NOVEDOSOS DE INSULINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA DIABETES MELLITUS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 11 (iv) FORMATO LEGIBLE EN COMPUTADORA : (A) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible con PC de IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMÁTICA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: • (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteina (B) UBICACIÓN: 1..21 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (Üi) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (iv) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteina (B) UBICACIÓN: 1..30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (v) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (vi) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (vii) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (viii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteina (B) UBICACIÓN: 1..31 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (ix) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (x) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteina (B) UBICACIÓN: 1..32 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 1 5 10 15
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (xi) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..33 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu 1 5 10 15
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 ' 25 30 Thr (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (xiü) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 98 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xiv) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteina (B) UBICACIÓN: 1..98 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln 1 5 10 15
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
20 25 30 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp ' 35 40 45 Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60 Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val 65 70 75 80 Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr 85 90 95
Cys Asn (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (xv) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xvi) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..99 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn 1 5 10 15 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
20 25 30 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu 35 40 45 Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly 50 55 60 Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He 65 70 75 80
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 85 90 95
Tyr Cys Asn (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 9 : (xvii) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 100 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xviii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : proteina (B) UBICACIÓN: 1..100 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val 1 5 10 15 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 20 25 30 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala
35 40 45 Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly 65 70 75 80
He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu 85 90 95 Asn Tyr Cys Asn 100 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (xix) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xx) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE CADENAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICAS: a. NOMBRE/CLAVE: proteina b. UBICACIÓN: 1..30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de la fórmula I S S (A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19) Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18) Cys-(B20-B29)-R30 en donde (A1-A5) son los residuos de aminoácido en las posiciones Al hasta A5 de la cadena A de insulina humana o insulina de animal, (A15-A19) son los residuos de aminoácidos en las posiciones Al 5 hasta Al9 de la cadena A de insulina humana o bien insulina de animal, (B8-B18) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana o bien insulina de animal, (B20-B29) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B20 a B29 de la cadena B de insulina humana o de insulina de animal, R8 es Thr o Ala, R9 es Ser o Gly, RIO es He o Val, R14 es Tyr, His, Asp o Glu, R21 es Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu o Gln, Rl es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado, ausente, o un átomo de hidrógeno, . R2 es Val, Ala o Gly, R3 es Asn, His, Glu o Asp, R4 es Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly o Glu, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseable o bien -OH, Z es un átomo de hidrógeno o un residuo de péptido que tiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His), a condición que en el caso en el cual Z es un átomo de hidrógeno, Rl o R3 es His, Glu o Asp, donde R3 es His, si Rl es un residuo de aminoácido cargado negativamente o neutro, o bien a condición que en el caso en el cual Z es un átomo de hidrógeno, R14 es His, Asp o Glu y además a condición que el análogo de insulina o las sales fisiológicamente tolerables del mismo de la fórmula I difiere de la insulina humana no solamente por la variación de los residuos de aminoácidos en las posiciones R3 o R3 en combinación con R21 o R3 en combinación con R4 en la fórmula I. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, donde R8 es Thr, R9 es Ser y RIO es He. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, donde Rl es Phe, His, Asn, Asp o Gly. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, donde R30 es Thr, Ala o bien Ser. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, donde R21 es Asn y Rl es Phe. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, donde R2 es Val, R3 es Asn y R4 es Gln. Un análogo de insulina o. una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, donde R14 es Tyr. 8. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, donde R14 es His. - 9 . Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, donde R14 es Asp. 10. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, donde R14 es Glu. 11. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, donde R3Q es Thr. 12. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, donde R30 es Ala. 13. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, donde R30 es Ser. 14. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, donde R30 es -OH. 15. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, donde Z es His. 16. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, donde Z es His-Ala-. Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, donde Z es His-Ala-Ala- . Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 15, donde la cadena B tiene la secuencia His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 3) . Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 15, donde la cadena B tiene la secuencia His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 4) . Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 16, donde la cadena B tiene la secuencia His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 5) . Un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 17, donde la cadena B tiene la secuencia His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 6) . n procedimiento para la preparación de un análogo de insulina o de una sal fisiológicamente tolerable del mismo, de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende la construcción de un vehículo de expresión replicable que contiene una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina que tiene la secuencia de aminoácidos II Met-X2m- (Arg)p-Z-Rl-R2-R3-R4-His-Leu-Cys- (B8-B18) -Cys- (B20-B29) -R30-?VArg- (A1-A5) -Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14- (A15-A19) -Cys-R21 II, en donde X1n es una cadena de péptido que tiene n residuos de aminoácidos, donde n es un número entero de 0 a 34, X2m es una cadena de péptido que tiene m residuos de aminoácidos, donde m es un número entero de 0 a 20, p es 0, 1 o bien 2, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado o está ausente y Z está ausente o bien es un residuo de péptido que tiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His) y las demás variables tienen los significados mencionados en la reivindicación 1, donde las condiciones mencionadas en la reivindicación 1 se aplican también, expresión en una célula huésped y liberación del análogo de- insulina de su precursor empleando métodos químicos y/o enzimáticos. 23. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, donde la célula huésped es una bacteria. 24 El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, donde la bacteria es E. coli. 25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, donde la célula huésped es una levadura. 26. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 25, donde la levadura es Saccharomyces cerevisiae. 27 El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 22 a 26 para la preparación de un análogo de insulina de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 19, donde el precursor del análogo de insulina tiene la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID NO: 7) . El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 22 a 26 para la preparación de un análogo de insulina, de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, donde el precursor del análogo de insulina tiene la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID NO: 8) . El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 22 a 26 para la preparación de un análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 21, donde el precursor del análogo de insulina tiene la secuencia Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg ' His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ans (SEQ ID NO: 9) . Un precursor del análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 22. Un precursor del análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 27. 32. Un precursor del análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 28. 33. Un precursor del análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 29. 34. Una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30. 35. Una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 31. 36. Una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32. 37. Una secuencia de ADN que codifica para un precursor del análogo de insulina de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 33. 38. Un vehículo de expresión que comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 34. 39. Un vehículo de expresión que comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 35. 40. Un vehículo de expresión que comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 36. 41. Un vehículo de expresión que comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 37. 42. Una célula huésped es transformada empleando un vehículo de expresión de conformidad con una de las reivindicaciones 38 a 41. 3. Una preparación farmacéutica que comprende por lo menos un análogo de insulina y/o por lo menos una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 21. 4. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, que contiene el análogo de insulina y/o la sal fisiológicamente tolerable del mismo en forma disuelta, amorfa y/o cristalina. 5. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43 o 44, que contiene además un auxiliar de depósito. 6. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 45, donde el. auxiliar de depósito es sulfato de protamina, el análogo de insulina y/o la sal fisiológicamente tolerable del mismo están presentes en un cocristalizado con el sulfato de protamina. 47. La preparación farmacéutica de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 43 a 46, que contiene además insulina humana no modificada. 48. La preparación farmacéutica de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 43 a 47, que contiene además un análogo de insulina. 49. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 48, donde el análogo de insulina es insulina humana Gly (A21) -Arg (B31) -Arg (B32) . 50. Una solución inyectable que tiene una actividad insulina, que comprende la preparación farmacéutica de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 43 a 49 en la forma disuelta. 51. La solución inyectable de conformidad con la reivindicación 50, que contiene de 1 µg a 2 mg de zinc por mi . 52. La solución inyectable de conformidad con la reivindicación 51, que contiene de 5 µg a 200 µg de zinc por ml . 53. El uso del análogo de insulina y/o su sal fisiológicamente tolerable de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 1 a 21 para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una actividad insulina con un inicio de acción retardado . 54. Un complejo insulina-zinc que comprende un hexámero de insulina y de 4 a 10 iones zinc por hexámero de insulina, donde el hexámero de insulina consiste de seis moléculas de un análogo de insulina de la fórmula I (A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-Rl4-(A15-A19)-Cys-R21 (I) I Z-R1-R2-R3-R4-H¡s-Leu-Cys (B8-B18) Cys-(B20-B29)-R30 en donde (A1-A5) son los residuos de aminoácido en las posiciones al hasta A5 de la cadena A de insulina humana o insulina de animal, (A15-A19) son los residuos de aminoácidos en las posiciones Al5 hasta Al9 de la cadena A de insulina humana o bien insulina de animal, (B8-B18) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana o bien insulina de animal, (B20-B29) son los residuos de aminoácidos en las posiciones B20 a B29 de la cadena B de insulina humana o de insulina de animal, R8 es Thr o Ala, R9 es Ser o Gly, RIO es He o Val, R14 es Tyr, His, Asp o Glu, R21 es Asn, Asp, Gly, Ser, Thr, Ala, Glu o Gln, Rl es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseado, ausente, o un átomo de hidrógeno, R2 es Val, Ala o Gly, R3 es Asn, His, Glu o Asp, R4 es Ala, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Gly, o Glu, R30 es cualquier residuo de aminoácido genéticamente codificable deseable o bien -OH, Z es un átomo de hidrógeno o un residuo de péptido que tiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos genéticamente codificables, que comprende de 1 a 4 residuos de histidina (His) . El complejo insulina-zinc de conformidad con la reivindicación 54, que comprende de 5 a 8 iones zinc por hexámero de insulina. El complejo insulina-zinc de conformidad con la reivindicación 54 o 55, donde el hexámero de insulina consiste de seis moléculas del análogo de insulina de la fórmula I de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 21. El complejo insulina-zinc de conformidad con la reivindicación 54 o 55, donde la cadena B del análogo de insulina de la fórmula I tiene la secuencia Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 10) . El complejo de insulina-zinc de conformidad con la reivindicación 54 o 55, donde la cadena B del análogo de insulina de la fórmula I tiene la secuencia Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO: 11) . Una preparación farmacéutica que comprende por lo menos un complejo de insulina-zinc de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 54 a 58. Una preparación farmacéutica que comprende una solución acida de por lo menos un análogo de insulina de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 54 a 58 y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo con una cantidad apropiada de iones zinc, que hace posible la formación de un complejo insulina-zinc de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 54 a 58. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60 que comprende una solución acida del análogo de insulina y/o sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 21 con una cantidad apropiada de iones zinc que hace posible la formación de un complejo insulina-zinc de conformidad con la reivindicación 56. 62. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60 que comprende una solución acida de por lo menos un análogo de insulina de conformidad con una de las reivindicaciones 57 o 58 y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo con una cantidad apropiada de iones zinc, que hace posible la formación de un complejo insulina-zinc de conformidad con una de las reivindicaciones 57 o 58. 63. La preparación farmacéutica de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 59 a 62, que contiene el complejo insulina-zinc en forma disuelta, amorfa y/o cristalina. 64. Una solución inyectable que tiene actividad insulina, que comprende la preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63 en forma disuelta. 65. La solución inyectable de conformidad con la reivindicación 64 que contiene de 1 µg a 2 mg de zinc por ml . 66. La solución inyectable de conformidad con la reivindicación 65, que contiene de 5 µg a 200 µg de zinc por ml. 67. El uso del complejo insulina-zinc de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 54 a 58 para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una actividad insulina que tiene un inicio de acción retardado.
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